Сравнительное исследование липополисахаридов и структуры О-специфических полисахаридов бактерий рода Azospirillum

Коннова, Ольга Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительное исследование липополисахаридов и структуры О-специфических полисахаридов бактерий рода Azospirillum
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное исследование липополисахаридов и структуры О-специфических полисахаридов бактерий рода Azospirillum"

На правах рукописи

КОННОВА Ольга Николаевна

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ И СТРУКТУРЫ О-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПОЛИСАХАРИДОВ БАКТЕРИЙ РОДА лгоэрты им

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов-2006

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Коннова С.А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Антон юк Л.П. кандидат биологических наук Бухарова E.H.

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, г. Москва

Защита состоится «20» декабря 2006 г. в 14 ч. на заседании диссертационного совета Д002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (410049, г. Саратов, пр. Энтузиастов, 13).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН и на сайте института www.ibppm.saratov.ru

Автореферат разослан «М> ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, / ___

доктор биологических наук ^У&г^ Никитина В.Е.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Исследования азотфиксирующей активности в корневой зоне небобовых растений и свойств микробов, за неё ответственных, стали основой отдельного направления в прикладной микробиологии, посвященного изучению явления ассоциативной азотфиксации. Наибольший интерес среди бактерий, осуществляющих ассоциативное взаимодействие с корнями растений, представляют Azospirillum spp. Эти микроорганизмы относятся к группе ризобактерий, стимулирующих рост растений, благодаря потенциально высокой азотфиксирующей активности, способности продуцировать фитогормоны и иные физиологически активные вещества (Okon and Vanderleyden, 1997). Начальным и важнейшим этапом формирования ассоциации является адсорбция микроорганизмов на корнях растений.

Известно, что в прикреплении бактерий к корням участвуют как неспецифическая сорбция, которая определяется зарядом и гидрофобностью бактериальной поверхности, так и специфические взаимодействия, которые на разных стадиях опосредуются поверхностно локализованными белками и полисахаридами (ПС) (Michiels et al., 1991; Steenhoudt and Vanderleyden, 2000). Выявление молекулярных механизмов «узнавания» и клеточного контакта корней злаков и бактерий рода Azospirillum требует изучения компонентов клеточной поверхности и материалов, секретируемых в окружающую среду, среди которых полисахаридам микроорганизмов отводится существенная роль (Del Gallo et al., 1989; Del Gallo and Haegi, 1990; Konnova et al, 1994; Коннова с соавт., 1995; Skvortsov and Ignatov, 1998; Коннова с соавт., 1999; Коннова с соавт., 2001; Федоненко с соавт., 2001; Fedonenko et al., 2002; Коннова с соавт., 2003; Федоненко с соавт., 2004; Коннова с соавт., 2005). Следовательно, одним из ключевых направлений в изучении этой проблемы следует признать анализ строения и функций различных структурных элементов клеточной поверхности почвенных ассоциативных микроорганизмов, так как они являются соединениями, непосредственно материализующими процесс взаимодействия.

Азоспириллы продуцируют ряд ПС и полисахаридсодержащих полимеров, играющих важную роль во взаимодействии с растениями, и выполняющих ряд других биологических функций. Однако недостаток информации о структуре углеводных компонентов поверхности микроорганизмов препятствует формированию целостной картины взаимодействия бактерий с растениями на молекулярном уровне.

Особый интерес представляет исследование липополисахаридов (ЛПС) — главного компонента внешней мембраны грамотрицательных бактерий. ЛПС, специфичность в контактных взаимодействиях которых определяют полисахаридные составляющие, играют важную роль в серотипировании грамотрицательных бактерий (Rietschel et al., 1994; Варбанец и Винарская, 2002; Caroff and Karibian, 2003). Основываясь на строении О-специфических цепей, бактериальные штаммы одного рода разделяют на хемотипы (Kauffinann, 1960). В литературе большое

внимание уделено детальному серологическому анализу фитопатогенных бактерий (Kauffinann, 1957; Kauffmann et al, 1961; Книрель и Кочетков, 1994; Варба-нец, 1994; Pier, 2003), в то время как аналогичные аспекты изучения ассоциативных азотфиксаторов находятся на периферии исследовательских интересов.

Дальнейшее изучение структурных и серологических особенностей индивидуальных препаратов поверхностных полисахаридных антигенов бактерий рода Azospirillum остается актуальным как для таксономических исследований, так и для выяснения их роли в процессах взаимодействия с корнями растений.

В связи с этим целью работы было выявление структурных особенностей ли-пополисахаридов и серологического родства бактерий рода Azospirillum.

Для реализации цели в ходе исследования решали следующие задачи:

1. выделение гомогенных препаратов липополисахаридов внешней мембраны бактерий A. brasilense SR75, SI7, Sp7, Cd, A. irakense KBC1 и A. lipoferum Sp59b, RG20a;

2. анализ биополимерного состава липополисахаридов названных выше микроорганизмов, а также состава жирных кислот липидов А;

3. проведение серологических исследований различных штаммов азоспирилл при помощи поликлональных кроличьих антител, полученных на препараты липополисахаридов;

4. выделение О-специфических полисахаридов из липополисахаридов, и определение первичной структуры повторяющихся звеньев О-специфических полисахаридов бактерий: A. irakense КВС1, A. lipoferum Sp59b, A. brasilense Cd, SR75 и S17.

Научная новизна работы. Впервые установлена тонкая химическая структура ОПС, выделенных из ЛПС пяти штаммов трех видов азоспирилл, из которых А. irakense КВС1 и A. lipoferum Sp59b являются типовыми для соответствующих видов микроорганизмов.

Впервые продемонстрировано сходство повторяющихся звеньев ОПС бактерий рода Azospirillum, принадлежащих к разным штаммам одного вида (A. brasilense Sp245 и A. brasilense SR75), и к разным видам (A. lipoferum Sp59b и A. brasilense Cd). На примере A. brasilense S17 установлено наличие в составе ЛПС двух существенно отличающихся по структуре О-специфических полисахаридов, в которых выявлено присутствие Ы-ацетил-О-глюкозамина и неуглеводного заместителя (8)-3-гидроскибутирата.

Проведено деление исследованных штаммов бактерий рода Azospirillum на се-рогруппы, а соответствующих ЛПС на хемотипы.

Научно-практическая значимость. Данные о структурах ОПС азоспирилл необходимы для понимания молекулярных механизмов формирования растительно-микробных ассоциаций.

Полученная нами информация о первичной структуре О-специфических полисахаридов A. irakense KBCI, A. brasilense Cd, A. lipoferum Sp59b, A. brasilense SR75 и A. brasilense SI7, а также результаты серологического исследования могут быть использованы при установлении филогенетического родства с другими бактериальными видами.

Препараты ЛПС и ОПС А. ЬгазИете, А. Про/егит, А. пакете, а также поликло-нальные кроличьи антитела на препараты ЛПС применяются при проведении плановых НИР сотрудниками лаборатории биохимии, лаборатории физической химии клеточных структур, лаборатории микробиологии и микологии, лаборатории растительно-бактериальных симбиозов Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН). Полученные антитела необходимы для дальнейшего серологического анализа коллекционных культур азоспи-рилл, а также вновь изолированных из природной среды микроорганизмов.

Результаты диссертационной работы используются в ходе преподавания студентам биологического и химического факультетов СГУ курсов: «Основы глико-логии» и «Методы химии и биохимии углеводов», а также при подготовке курсовых и дипломных работ учащимися этих факультетов.

Представленные в диссертации разработки включены в подготовленное для студентов и аспирантов, специализирующихся в области бактериохимии, учебно-методическое пособие: «Выделение и анализ гликополимеров растительного и бактериального происхождения» / Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2005 г. 40 е., (в соавторстве с С.А. Конновой, Ю.П. Федоненко, О.А. Сачковой), одобренное Учебно-методической комиссией биологического факультета и Ученым советом СГУ им. Н.Г. Чернышевского.

Апробация работы. Материалы исследований, изложенные в диссертации, были представлены на 7-й, 8-й, 9-й, 10-й Международных Путинских школах -конференциях молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, Россия, 2003 — 2006 гг.), на 4-й, 5-й Всероссийских конференциях молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, Россия, 2003,2005), на 7-й, 8-й Молодежных научных школах - конференциях по органической химии (Екатеринбург, Россия, 2004; Казань, Россия, 2005), на 3-й Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, Россия, 2004), на 2-й, 3-й Региональных школах-конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2004, 2006), на Всероссийской конференции «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты» (Саратов, Россия, 2005), на научной конференции студентов и аспирантов «Исследования молодых ученых и студентов в биологии» (Саратов, Россия, 2005), на 2-й конференции стран Балтии по микробным углеводам (Росток, Германия, 2006).

Доклад «Структурное и серологическое исследование О-антигена бактерий АгозршИит ЪгавИете Сё», представленный на научной конференции студентов и аспирантов «Исследования молодых ученых и студентов в биологии» (Саратов, Россия, 2005) был удостоен диплома первой степени.

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории биохимии ИБФРМ РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 работы, в том числе 7 статей в отечественных и зарубежных научных изданиях.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

Липополисахариды бактерий рода АгозртЫит на основании структурных исследований их О-специфических полисахаридов разделены на четыре хемотипа. К первому отнесены липополисахариды штаммов А. ЬгазИете Бр245, 51175; ко второму - А. Нро/егит Бр59Ь и А. ЬгсиИепзе С&, к третьему - А. пакете КВС1; и к четвертому - А. Ъгаьйете Б17, А. Нро/егит 8рВг17.

Идентичные структуры повторяющихся звеньев характерны для О-специфических полисахаридов двух пар штаммов А. ЬгазИете Бр245, 81175 и для А. Нро/егит Бр59Ь, А. ЪгсяИете С&

Бактерии рода АгохртИит на основании серологических исследований разделены на две серогруппы. К первой отнесены А. ЪгаяИете Бр245, 81175 и А. Нро/егит 1Ю20а, а ко второй - А. Нро/егит Бр59Ь, А. ЬгазИеюе С<1, А. ЪгеяИете Бр7, А. Iгакете КВС1 и А. ЬгоэИете 817.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 288 источников, в том числе - 225 зарубежных. Работа изложена на 162 страницах машинописного текста, содержит 25 рисунков и 13 таблиц.

Работа выполнена в лаборатории биохимии ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой НИР «Структуры гликополимеров и их функции в растительно-микробных взаимодействиях» (№ госрегистрации 0120.0403358).

Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований: в 2002-2004 гг. «Структура липополисахаридов и О-специфических полисахаридов бактерий рода АгозртПит» № 02-04-48224, в 2005-2006 гг. «Сравнительное исследование структуры липополисахаридов и О-специфических полисахаридов серологически родственных штаммов бактерий рода АгозртИит» № 0504-48123, а также грантами Президента РФ на поддержку молодых российских ученых и ведущих научных школ на выполнение научных исследований НШ-1529.2003.4 в 2003 - 2005 гт. и НШ - 6177.2006.4 в 2006 г.

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю доктору биологических наук, профессору С.А. Конновой, а также заведующему лабораторией биохимии ИБФРМ РАН заслуженному деятелю науки Российской Федерации, доктору биологических наук, профессору В.В. Игнатову за неоценимую поддержку на всех ключевых этапах выполнения данной работы. Автор выражает благодарность за плодотворное сотрудничество коллегам из лаборатории биохимии — к.б.н., с. н. с. Ю.П. Федоненко, к.б.н., н. с. И.В. Егоренковой, ст. лаб-иссл. О.А. Сачковой, сотрудникам ИБФРМ РАН д.б.н., е.н.с. Л.Ю. Матора, к.б.н., н.с. Г.Л. Бурыгину, к.х.н., с.н.с. О.Е. Макарову, д.б.н., е.н.с. Е.И. Кацы, к.б.н., н.с. И.В. Борисову, а также сотрудникам лаборатории химии углеводов ИОХ РАН (Москва).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследования

Микробные культуры и условия их выращивания. В работе были использованы бактерии рода Azospiriîlunr. A. brasilense SR75 (Позднякова с соавт., 1988), A. brasilense Sp245 (Baldani et al, 1983), A. brasilense S17, A. brasilense Cd (Eskew et al, 1977), A. brasilense Sp7 (Tarrand et al, 1978), A. irakenseKBC1 (Khammas et al., 1989), A. lipoferum Sp59b (Tarrand et al, 1978), A. lipoferum RG20a.(Baldani et al., 1986). Для получения ЛПС исследуемые микроорганизмы выращивали в ферментере АНКУМ 2М (СССР) в жидкой синтетической малатной среде, представляющей собой модификацию среды, предложенной Дэй и Доберейнер (Day and Döbereiner, 1976).

Микроорганизмы культивировали до окончания экспоненциальной фазы роста. С поверхности бактерий в течение 6 сут отмывали капсульный материал 0.15М раствором NaCl в 0.02 % N¿N3, ежедневно переосаждая клетки центрифугированием и заменяя отмывающий раствор.

Выделение ЛПС проводили стандартным методом Вестфаля с разделением водного и фенольных слоев (Вестфаль и Янн, 1967). Водную фракцию экстракта диализовали через мембрану (предел исключения 12-14 кДа). Экстракт концентрировали упариванием при пониженном давлении и фракционировали методом гель-фильтрации, используя носитель Sepharose CL-4B («Pharmacia», Швеция). Детекцию продуктов разделения в элюате проводили с помощью дифференциального проточного рефрактометра LKB 2142.(LKB, Швеция). Дополнительно строили элюционные профили по углеводам (Dubois et al., 1956). После хромато-графической очистки ЛПС концентрировали и лиофилизировали.

Определение содержания в ЛПС 2-кето-З-дезоксиоктоновой кислоты (КДО), белков, нуклеиновых кислот (НК), фосфора проводили по традиционным методикам (Berenblum and Chein, 1938; Спирин, 1958; Karkhanis et al, 1978; Скоупс, 1985 соответственно).

Антитела (AT) получали иммунизацией кроликов растворами ЛПС. Фракции IgG выделяли из антисывороток осаждением сульфатом аммония (Кэбот и Мейер, 1968).

Двойную иммунодиффузию препаратов ЛПС с кроличьими антителами проводили по стандартной методике (Ouchterlony and Nilsson, 1979).

Электрофорез препаратов ЛПС в полиакриламидном геле проводили с доде-цилсульфатом натрия (Hitchcock and Brown, 1983). Визуализацию ЛПС осуществляли окрашиванием гелей красителем на основе азотнокислого серебра (Tsai and Frasch, 1982).

Иммуноферментный анализ (ELISA) проводили в полистироловых 96-ти луночных планшетах. В качестве ферментной метки использовали пероксидазу хрена, конъюгированную с козлиными анти-кроличьими антителами. В качестве субстратного реагента использовали орто-фенилендиамин с перекисью водорода.

Измерения оптической плотности исследуемых проб проводили на иммунофер-ментном анализаторе АИФ-Ц-01С с последующей обработкой результатов с помощью программы ЛабАРМ (ЗАО ИЛИП, г. Санкт-Петербург).

ОПС азоспирилл получали рутинным методом гидролиза ЛПС 1 % раствором СН3СООН (Muller-Seitz et al., 1968). Выделенные препараты очищали хрома-тографически.

Определение состава жирных кислот ЛПС в виде метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) проводили с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ) на хроматографе «Биохром 1». Метилирование выполняли согласно методу, описанному в работе (Mayer et al, 1985).

Определение моносахаридного состава ПС выполняли методом ГЖХ на хроматографе Hewlett-Packard 5890 с капиллярной колонкой Ultra 2 (Hewlett-Packard, США). Подготовку образцов осуществляли в соответствии с протоколом, представленным в работе (Savardecker et al., 1965).

Абсолютные конфигурации нейтральных Сахаров устанавливали ГЖХ в виде ацетилированных гликозидов с R-2-октанолом (Leontein etal., 1978).

Для определения типов замещения моносахаридных остатков ОПС были подвергнуты метилированию, гидролизу, ацетилированию и исследованию методом ГЖХ-масс-спектрометрии в виде частично метилированных ацетатов полиолов (Hakomori, 1964).

Спектры ЯМР снимали на спектрометре Bruker DRX-500 (Германия), используя стандартное математическое обеспечение фирмы Bruker. Для сбора и обработки данных использовали программу XWINNMR 2.1.

Результаты всех экспериментов статистически обрабатывали (Лакин, 1980). Данные представлены в виде средних значений (как минимум трех экспериментов, каждый из которых проводился в трех повторностях) со средней квадратичной ошибкой. Доверительные интервалы определены для надежности 95 %.

Результаты исследований и их обсуждение 1 Исследование химического состава липополисахаридов

В обеспечение выживания бактерий в почве, а также специфичности их взаимодействия с корнями растений вовлечены поверхностные структуры микробных клеток. Однако к настоящему времени отсутствует единое мнение относительно способа реализации этих взаимоотношений. В связи с чем, исследование молекулярных механизмов взаимодействия растений и азотфиксирующих микроорганизмов остается актуальным на сегодняшний день. ЛПС являются одними из основных компонентов внешней мембраны 1рамотрицательных микроорганизмов. Они, несомненно, играют важную роль во взаимоотношениях бактериальной клетки с окружающей средой. Данный раздел работы посвящен исследованию химического состава липидных и полисахаридных компонентов ЛПС бактерии рода Azospirillum.

Были выделены, хроматографически очищены и охарактеризованы гомогенные препараты ЛПС бактерий A. brasiîense SR75, S17, Sp7, Cd, A. irakenseKBCl, A. li-poferum Sp59b и RG20a. Выход ЛПС варьировал от 1 до 3 % от веса сухой микробной массы в зависимости от штамма (табл. 1). При исследовании биополимерного состава было показано, что на долю углеводов в ЛПС приходилось от 20 до 60 % от массы препаратов. Разброс в содержании углеводов, учитывая, что по результатам дальнейших исследований все изучаемые препараты отнесены к S-форме, может быть объяснен штаммовыми различиями в соотношении гидрофильной и гидрофобной компонентов молекулы ЛПС. В составе всех выделенных препаратов ЛПС была идентифицирована КДО - единственный структурный элемент, который всегда присутствует в ЛПС, независимо от их бактериального происхождения. Для ^QTICsr75, ЛПСссь ЛПС$р59ь и ЛПСяагоа ее содержание составило примерно 3 - 4 %, а для ЛПСква и ЛПСзп - в 4 раза ниже (табл. 1). Небольшое количество КДО, как особенность ЛПС азоспирилл, было показано ранее для некоторых штаммов A. brasiîense и A. lipoferum (Chôma et al., 1984; Chôma et al., 1987; Федоненко с соавт., 2004). Кроме того, в наших исследованиях были выявлены значительные межштаммовые различия в содержании общего фосфора в вышеперечисленных ЛПС, что, как известно, оказывает существенное влияние на субмолекулярную организацию ЛПС в мембране (Соловьева и Оводов, 1992). Следует отметить, что использование хроматогрофических методов фракционирования экстракта позволило добиться высокой степени очистки ЛПС, о чем свидетельствует низкое содержание белка и НК.

В составе липидной части ЛПС были идентифицированы насыщенные, ненасыщенные и гидроксикислоты с длиной углеродной цепи от Сю до С« (табл. 2).

Таблица 1

Биополимерный состав ЛПС бактерий рода Azospirillum

Штаммы Выход ЛПС, % от веса сухих клеток Содержание, %

Углеводы Белки НК кдо Фосфор

A. brasiîense SR75 1.0 53.2 ±0.2 2.1 ±0.1 0.1 ±0.1 3.3 ±0.1 0.1

S17 1.7 29.0 ±1.3 0.8 ±0.4 сл. 0.3 3.3 ±0.2

Cd 3.2 28.4 ±2.1 0.3 ±0.1 сл. 3.5 ±0.1 1.9 ±0.1

Sp7 2.8 21.9 ±0.3 0.6 ±0.1 сл. 0.6 2.5 ±0.2

A. irakense KBC1 1.1 62.3 ±2.7 0.9 ±0.1 сл. 0.7 ±0.0 3.4 + 0.8

A lipoferum Sp59b 2.6 38.8 ±1.4 2.4 ± 0.2 0.2 ±0.1 4.4 ±0.1 0.5

RG20a 1.4 48.3 ±3.3 2.3 ±0.1 сл. 2.8 ±0.1 0

Примечание: «сл.» - содержание компонентов менее 0.1 %.

Основными по содержанию в ЛПС большинства штаммов были 3-гидрокситетрадекановая (З-ОН-Сил), гексадекановая (С^о), 3-гидроксигексадекановая (З-ОН-С^о) и окгадеценовая (Сил) жирные кислоты.

Таблица 2

Соотношение жирных кислот в препаратах ЛПС бактерий A. brasilense SKIS, S17, Cd, Sp7, A. irakense KBC1 и

A. lipoferum Sp59b, RG20a

Жирные кислоты Содержание МЭЖК (в % от суммы площадей всех пиков)

лпс5[175 ЛПС5|7 ЛПСС(1 ЛПС5п7 ЛПСква ЛПС$п59Ь ЛПСяагоа

декановая (Сю:о) 0.6 ±0.1 7.8 ± 0.2 0.5 ±0.1 7.8 ±0.5 0.5 0.2 ± 0.1 0.1

дидекановая (С^о) 0.2 сл. 6.1 0.1 1.7 ±0.1 21.9 ±0.6 0.1

2-гидроксидидекановая (2-ОН-С|2;0) 1.5 0.2 ±0.1 1.8 ±0.4 0.6 ±0.1 8.2 ±0.2 сл.

3-гидроксидидекановая (З-ОН-С120) 0.1 - 8.5 ±0.5 сл. - 30.7 ± 1.3 -

тетрадекановая (Сцо) 0.2 ±0.1 0.3 ±0.3 0.2 1.1 ±0.6 0.9 ±0.1 сл. сл.

3-гидрокситетрадекановая (3-ОН-С14;0) 42.3 ±0.2 39.6 ±2.3 32.4 ±0.4 40.9 ±3.9 30.2 ±0.8 12.6 ±0.2 54.4 ± 1.5

тетрадеценовая (CI4:i) - - - - 4.3 ±0.3 - -

гексадеценовая (Ci6;i) сл. 0.8 ±0.4 1.7 ±0.3 0.1 0.2 1.4 ±0.3 0.9

гексадекановая (Ci6:o) 9.7 ±0.3 4.0 ± 0.6 3.9 ±0.3 4.9 ±0.7 1.6 ±0.3 13.0 ±0.1 3.2 ±0.7

2-гидроксигексадекановая (2-ОН-С1б:0) 0.3 - - 0.1 - - -

3-гидроксигексадекановая (3-ОН-С[б.о) 33.2 ±1.1 26.9 ±4.3 19.2 ±2.7 30.3 ±3.6 25.8 ±2.4 - 36.4 ±0.6

октадекановая (С]8:о) 0.2 ±0.1 0.5 сл. сл. 0.3 0.2 ±0.1 сл.

октадеценовая (Cig:|) 7.4 ±1.1 18.0 ±5.1 20.1 ±0.5 8.7 ±0.1 8.4 ±0.1 10.1 ±1.8 4.7 ±0.3

нанодекановая (С^о) - - - - 4.4 - -

Примечания: «сл.» - содержание компонентов менее 0.1 %; «-»- ЖК отсутствовали.

Исключение составил jmCsP59b> где основными оказались дидекановая (С^о), 2-гидроксидидекановая (2-ОН-С|2:о), 3-гидроксидидекановая (З-ОН-С^о)» 3-гидрокситетрадекановая (3-ОН-Сн:о), гексадекановая (Cifro), октадеценовая (Cis:i) кислоты. В составе JITlCsp?» HTlCsi7 было выявлено значительное количество (около 8 %) декановой (Сю.о) кислоты. Было показано, что оксикислоты составляли 50 - 80 % от содержания МЭЖК, обнаруженных хроматографически, что согласуется с литературными данными о количестве оксикислот в липидах А (Красикова с со-авт., 1989), однако в составе ЛПС A. Hpoferum RG20a на их долю приходилось 92 %. В исследуемых образцах также были обнаружены ненасыщенные ЖК (от 5 до 30%).

Данные по составу жирных кислот jmCsP7, JITICsr75, ЛПСКС20а> ЛПСквсь JinCsi7 хорошо согласуются с результатами, приведенными в литературе для ли-пополисахаридов ряда штаммов A. brasilense, A. lîpoferum (Chôma et al, 1984; Chôma et al, 1987; Федоненко с соавт., 2004), а также бактерий рода Rhîzobium (Wilkinson, 1996). Вопреки мнению о том, что липид А эволюционно является наиболее консервативной частью молекулы ЛПС, в последние годы появились данные (Варбанец и Винарская, 2002), которые свидетельствуют о вариабельности его структуры, что также нашло подтверждение в полученных нами результатах.

Нужно отметить, что ненасыщенные жирные кислоты в составе липида А встречаются редко. Их появление связывают с проявлением компенсаторных явлений в мембранах, вызванных изменением температуры среды (Крепе, 1981; Бергельсон, 1982). Возможно, это позволяет азоспириллам выживать в неблагоприятных условиях и объясняет их распространение в различных климатических зонах.

2 Выявление общих антигенных детерминант в ЛПС различных штаммов

и видов азоспирилл с использованием антител на ЛПС A. brasilense Cd, A. brasilense Sp7 и A. irakense KBCl

На хроматографически очищенные препараты ЛПСса, ЛПС5р7, ЛПСква иммунизацией кроликов были получены поликлональные антитела, которые характеризовались способностью к агглютинации убитых нагреванием гомологичных клеток. Данная работа проводилась совместно с сотрудниками лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН. Антисыворотка на ЛГО^ проявляла высокую активность по отношению, к клеткам A. brasilense Sp7, покрытым капсулой, и ее максимальное работающее разведение составило 1:640. На примере A. brasilense Cd было показано, что степень связывания гомологичных AT с макромолекулами поверхности покрытых капсулой клеток была в три раза ниже, чем бескапсульных. Взаимодействие АЛлпсйь а также антисыворотки на .JinCsp7 с капсулированными клетками, очевидно, обусловлено двумя причинами. Первая - это связывание с экспонированным на поверхности через капсулу ЛПС. Вторая — взаимодействие с локализованным в капсульном материале азоспирилл липополисахарид-белковым комплексом (ЛПБК) - экстраклеточной формой ЛПС. Более высокая активность AT в отношении бескапсульных клеток связана, очевидно, с возможностью свободного экспонирования антигенных детерминант ЛПС внешней мембраны.

Необходимо отметить, что антисыворотка на ЛПСква не взаимодействовала с гомологичными капсулированными клетками. После отмывания бактерий от капсулы антитела агглютинировали клетки, но их активноть была невысокой. Максимальное разведение сыворотки в реакции агглютинации составило 1:160. Кап-сульный материал A. irakense КВС1 не взаимодействовал с АТлпсква в тесте двойной радиальной иммунодиффузии, что позволяет сделать предположение о различиях в строении антигенных детерминант (а возможно и структуры ОПС) ЛПС внешней мембраны и ЛПС, входящего в состав полисахаридных комплексов капсулы.

Исходя из полученных результатов, мы предположили, что капсульный материал азоспирилл (который помимо ЛПБК содержит полисахарид-липидный комплекс, свободные полисахариды и протеины), для некоторых штаммов полностью, для других - частично экранирует О-антиген внешней мембраны. При этом детерминанты экстраклеточного ЛПС, возможно, менее доступны для взаимодействия со специфическими АТ из-за образования комплекса с белком. Таким образом, эксперименты выявили различия между штаммами азоспирилл в степени экспонирования через капсулу О-антигенных цепей, и, как результат, пггаммовую вариабельность в реализации различных механизмов контактных взаимодействий этих бактерий с растениями.

Все выделенные в ходе данной работы ЛПС были протестированы методами иммунодиффузии и иммуноферментного анализа на наличие серологических перекрестов. Предварительно были определены оптимальные концентрации АТ и антигенов, а также составлен соответствующий протокол твердофазного ИФА. В связи с тем, что фотографии стекол с двойными радиальными иммунодиффу-зиями не передают всех деталей, видимых глазом, мы посчитали необходимым привести их схемы.

Методом иммунодиффузии с использованием соответствующих гомологичных антител было визуализировано не менее двух антигенных детерминант не белковой природы в составе ЛПССа, ЛПС5Р7 (рис. 1 А, Б), и не менее трех в ЛПСква (рис. 1В). Результаты ИФА, демонстрирующие специфичность АТ к различным ЛПС, были выражены в процентах по аналогии с работой (Virginio et al., 2003) и представлены в таблице 3.

А Б В

Рис. 1. Схемы двойных иммунодиффузий препаратов ЛПС A. brasilense Sp245, Sp7, Cd, A. lipofe-rum Sp59b, RG20a и A. irakense KBC1 с ATjmccd (A), ATmcsp? (Б), АТлпсква (В).

Таблица 3

Результаты прямого и перекрестного иммунодиффузионного (Л) и иммуноферментного (Б) анализов ЛПС бактерий рода Аго$рЫ11ит с антителами, полученными на ЛПСоь ЛПС5р7, ЛПСквсь ЛПСвп и целые клетки 5р245, обработанные глутаровым альдегидом

Серо-группы Антитела Клетки5р245глуг ЛПСсс! ЛПС5о7 ЛПСква ЛПС517

A Б A Б A Б А Б А Б

I A. brasilense Sp245 + + 100 — 19 — - — - - -

A. brasilense SR75 + + 80 — - — 9 — 7 - -

A. lipoferum RG20a + 58 — - — - — - - -

II A. brasilense Cd — - + + 100 + + 66 _L 35 - -

A. brasilense Sp7 — - + + 109 + + 100 + + 129 - -

A. irakense KBC1 — - — 24 X 13 + + + 100 - -

A. lipoferum Sp59b — - + 50 — - — - - -

Контроль 13 18 7 7 -

A. brasilense S17 - - -L 34 J- 24 — 16 + + 100

Контроль 7 7 7 7

Примечания:«+»- соответствует одной полосе в тесте двойной радиальной иммунодифузии;

«-Ц - соответствует частичному взаимодействию в тесте двойной радиальной иммунодиффузии; «—»- соответствует отсутствию полосы в тесте двойной радиальной иммунодифузии; «-»- тестирование не проводили.

За 100 % принято значение оптической плотности продуктов реакции АТ с гомологичным Аг в ИФА, зарегистрированное при 490 нм.

В составе ЛПС$Р7 и ЛПСб^ь было показано наличие детерминант, содержащихся в ЛПСсл ЛПС5р59Ь давал серологический перекрест только с ЛПСса-АТлпсса реагировали с ЛШ^ активнее, чем с гомологичным ЛПС, что может объясняться большей представленностью специфических антигенных детерминант в ЛПС5р7 (рис. 1А, табл. 3). В ЛПС$Р? найдены антигенные детерминанты, которые помимо гомологичных АТ выявляются АТлпсквс! и АТлпсса- Для ЛПСква было показано слабое взаимодействие с АТлпс5р7> связанное, видимо, с наличием общих антигенных детерминант, причем АТлпсса с ЛПСквс 1 не взаимодействовали (рис. 1 А, Б, В, табл. 3).

Сравнительный иммунодиффузионный анализ ЛПС различных штаммов азос-пирилл с АТ, полученными на целые клетки А. ЪгазИете Бр245, обработанные глутаровым альдегидом, выявляет серологическое родство ЛПС штаммов А. Ьгсяи 1ете 8р245, БК75 и А. Иро/егит 1Ю20а (рис. 2А). Причем, ЛПС$р245 антигенно более близок с ЛПС5я75, чем с ЛПСКО20а. Полученные результаты коррелируют с данными ИФА (табл. 3).

ЛПСэп был тестирован на наличие комплементарных детерминант со всеми полученными АТ. В тесте иммунодиффузии (рис. 2Б) по форме полос преципитации можно предположить наличие общих антигенных детерминант с ЛПС штаммов Бр7 и С<1 Из результатов ИФА следует, что специфичность АТлпсса и АТлпс5р7 к ЛПС8,7 составила 34 и 24 % соответственно (при 7 % в контроле). ИФА демонстрирует очень слабое взаимодействие АТлпсква с ЛПСзп, которое можно отнести к неспецифическому (табл. 3).

Рис. 2. Схемы двойных иммунодиффузий препаратов ЛПС (А) А. brasilen.se 8р245, БЯ75 и А. И-ро/егит 1Ю20а с АТ245; (Б) ЛПСбп с АТ на ЛПС бактерий А. ЬгазИете Б17, А. Ьгш'йеже 5р7, А. ЪгазНеюе (Д А. Iгакегае КВС1.

На основании полученных результатов все исследуемые штаммы по иммунос-пецифичности ЛПС могут быть разделены на две серогруппы (табл. 2). Однако анализ результатов серологических исследований позволяет говорить о наличии гетерогенности антигенных детерминант в составе второй серогруппы:

• А. Иро/егит Бр59Ь и А. ЬгсяИеюе С<1;

• А. ЪгазИете Бр7, А. ггакете КВС1 и А. ЬгаяИете Сё (отличные от общих фрагментов с А. Иро/егит Бр59Ь);

• А. ЪгазИете Б17, А. Ъгсяйете Бр7 и А. Ъгавйете Сё.

Как известно, антитела, образованные на ЛПС характеризуются специфично^ стью к его полисахаридной части, в связи с чем, можно утверждать, что выявленные серологические перекресты говорят о наличии общих структурных фрагментов в соответствующих ОПС.

3 Выделение О-специфических полисахаридов бактерий A. brasilense S17, Cd,

SR75,v4. irakense KBC1 и A. lipoferum Sp59b и исследование химических структур их повторяющихся звеньев

В связи с тем, что экспонированные в окружающую среду ОПС определяют специфичность межклеточных контактов и серологическую индивидуальность микроорганизмов, исследование структуры ОПС является насущной необходимостью для выявления молекулярного механизма формирования ассоциации азоспи-рилл с растениями. К началу наших исследований были определены структуры ОПС только для двух штаммов азоспирилл - A. lipoferum SpBrl7 (Chôma et al, 1992) и A. brasilense Sp245 (Fedonenko et al2002). Авторами было показано, что ОПС A. lipoferum SpBrl7 является разветвленным и состоит из повторяющихся единиц, включающих три остатка рамнопираноз в главной цепи, одна из которых замещена глюкопиранозой, а другая ацетилирована. Все остатки рамнозы (Rha) -L-изомеры в а-конфигурации. Повторяющееся звено ОПС A. brasilense Sp245 представлено линейным пента-О-рамнаном.

Для получения ОПС A. brasilense Cd, SR75, S17, A. lipoferum Sp59b и A. irakense KBC1 был проведен кислотный гидролиз соответствующих ЛПС. Структурные исследования проводились совместно с сотрудниками лаборатории химии углеводов Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН (г. Москва). Моносахаридный состав ОПС и абсолютные конфигурации Сахаров определяли методом ГЖХ в виде ацетатов полиолов и ацетилированных окгилгли-козидов соответственно.

В препаратах ОПСквсь ОПСса и OnCsP59b было показано наличие L-Rha, D-маннозы (Man) и D-галактозы (Gal) в соотношении ~ 3:1:2. Анализ компонентов гидролизата OnCsiw привел к идентификации только D-Rha. Наиболее разнообразным по набору моносахаридов был ОПС$п» в составе которого были найдены остатки D-глюкозы (Glc), глюкозамина (GlcN), маннозамина (ManN), и два типа остатков L-Rha, неметилированной и метилированной в положении 2 (Rha20Me) в отношениях ~ 1:1:1:3:1 соответственно.

На основании результатов ГЖХ-масс-спектрометрии частично метилированных ацетатов полиолов были выявлены порядок замещения моносахаров, терминальные остатки и точки ветвления в исследуемых полисахаридах. Исходя из того, что одна из рамноз ОПС5п имела ОМе заместитель, метилирование данного полисахарида проводили CD3J.

Идентичность продуктов метилирования ОПСса и OnCSp59b позволила выдвинуть предположение о структурном подобии их повторяющихся единиц, которые были представлены гексасахаридом с 3,4-замещенной галактозой в точке ветвления и концевым остатком Rha в боковой цепи. Повторяющееся звено ОПСква являлось также разветвленным гексасахаридом, но точкой ветвления была 3, 4-

замещенная Rha, а терминальным сахаром боковой цепи - Gal в фуранозной форме. Все остальные сахара представляли собой пиранозиды. Таким образом, структуры OnCcd, OnCSp59b и ОПСква различались, несмотря на сходный моносаха-ридный состав. Повторяющееся звено OnCsR75 являлось линейным, и состояло из 2- и 3- замещенной Rha в пиранозной форме.

При проведении экспериментов, направленных на установление структур повторяющихся звеньев ОПС деструктивными химическими методами, мы столкнулись с рядом трудностей. Из-за сложной структуры повторяющегося звена OnCsi7 не полностью был определен состав ПС и конфигурации некоторых остатков. Невыясненными остались также вопросы, касающиеся установления моносахарид-ной последовательности в полисахаридных цепях, типов связей между остатками моносахаридов и степени разветвления повторяющихся звеньев исследованных ОПС.

Для разъяснения вышеизложенных вопросов и подтверждения уже полученных данных были проведены исследования методом |3С- и 'Н- ЯМР спектроскопией с использованием двумерных экспериментов.

На основании данных, полученных этим методом, было показано, что ОПСква является регулярным и состоит из разветвленных гексасахаридных повторяющихся звеньев (структура 1):

a-I>Gal/"-(1^2)-a-L-Rh^,I4l^3)-j5-D-MaivJ-(l->3)-a-L-Rhap11

1 i 3

-»4)-a-L-Rhap,-(l->3>p-D-Ga]pl-(l->

При установлении моносахаридной последовательности в повторяющемся звене, определяемой с использованием спектроскопии NOESY, наблюдалось перекрывание сигналов отдельных протонов, связанных с атомами углерода, что вызывало трудности в интерпретации спектра. Поэтому ОПСква был подвергнут распаду по Смиту, который привел к окислению терминальной Gal и остатка 2-замещенной Rha в боковой цепи, а также образованию модифицированного полисахарида, структура которого была расшифрована из ,3С- и 'Н- ЯМР спектров. Затем, учитывая данные, полученные о модифицированном ПС, были интерпретированы корреляции в NOES Y спектре ОПСква» вследствие чего структура его повторяющегося звена была полностью расшифрована (структура 1).

Необходимо отметить, что для грамотрицательных бактерий, на примере A. irakense КВС1, впервые показано существование ОПС, основная цепь которого построена из дисахаридных повторяющихся единиц, а боковая цепь является нетипично длинной.

Аналогичные исследования ОПС типового штамма A. lipoferum Sp59b позволили обнаружить сходный тип строения с ОПСква» т.е. короткая основная и длинная боковая цепи, однако структура ОПС была совершенно иной. ОПС$Р59ь представляет собой дигалактан с маннорамнановой боковой цепью (структура 2).

'Н- и 13С-ЯМР спектры ОПС« и соответственно значения химических сдвигов протонов и атомов углерода были близки к полученным для ОПСзр59ь> что позволило сделать вывод об идентичности структур их повторяющихся звеньев.

—>3)- (5-1>Са1/А( 1 -»З^а-О-Са^'-С 1 2

Таким образом, в нашей работе впервые показана идентичность повторяющихся звеньев ОПС бактерий, принадлежащих к разным видам азоспирилл.

Комплексный анализ ОГК^го показал, что он состоит из одинаковых линейных пентасахаридных повторяющихся звеньев, содержащих только остатки О-Ш^а, имеющих структуру 3, аналогичную структуре ОПС А. ЬгшИете Бр245, установленной ранее сотрудниками лаборатории биохимии ИБФРМ РАН (Ре<1опепко а1, 2002):

->2)-р-Г>КЬа/?-( 1 -»3)-а-1>Ю1ар-( 1 ->3)-а-0-Ш1а/>( 1 ->2)-а-1>КЬар-( 1 ->2Уа-0-ВЪар-( 1 -»

На примере этих микроорганизмов выявлена межштаммовая идентичность ОПС азоспирилл одного вида.

Моносахарид рамноза в Э- или Ь-форме широко представлен в составе ПС микроорганизмов, вступающих в различные взаимоотношения с растениями, что может быть показателем его важной роли в процессах растительно-микробных взаимодействий. Необходимо отметить, что практически во всех случаях в природных ПС 1-2-связанные остатки ИЬа имеют а-конфигурацию, что также обнаружено и в полисахаридах азоспирилл. У а-анамеров гликозидная и англикозидная связи располагаются в транс-ориентации, вследствие чего полисахариды с такими звеньями могут формировать развернутые структуры, что важно для экспонирования антигенных детерминант на поверхности клетки (Липкинд и Кочетков, 1984).

В связи с тем, что структуры ОПС А. ЬгазИете 51175 и Бр245 оказались идентичными, мы посчитали необходимым провести изучение уровня генетического родства этих штаммов. Этот этап работы проводился совместно с сотрудниками лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН. В результате гидролиза тотальной клеточной ДНК бактерий штаммов БЯ75 и Бр245 эндонуклеазами рестрикции, были получены данные, которые свидетельствовали о существенных различиях в структуре геномов этих микроорганизмов, а в плазмидных профилях отсутствовали репликоны с одинаковой молекулярной массой. Тем не менее, были найдены высоко гомологичные локусы в тотальной ДНК и двух мегаплазмидах этих штаммов, по-видимому, определяющие продукцию ЛПС.

Приоритетные результаты были получены в ходе исследования структуры ОПС А. Ъгазйете Б17. Он представляет собой смесь из двух различных полисахаридов

(структура 4 и 41), что впервые выявлено для бактерий рода Azospirillum. Для того, чтобы подтвердить порядок соединения моносахаридов, ОПС подвергли распаду по Смиту, при котором произошло разрушение ПС41 до димеров и частичный раскол остатка GlcNAc в ПС4, что в конечном итоге позволило упростить ЯМР спектр ПС и подтвердило порядок связывания в обоих полисахаридах.

На примере липополисахарида A. brasilense SI7 впервые для азоспирилл показано присутствие в составе ОПС Ы-ацетил-О-глюкозамина и неуглеводного заместителя (8)-3-гидроксибутирата. Известно, что GlcNAc является специфическим гаптеном лекгина пшеницы. Учитывая поверхностную локализацию ЛПС, а также способность азоспирилл экскретировать ЛПС в окружающую среду в виде ЛПБК, можно предположить его сродство к лектину пшеницы. Таким образом, согласно лектин-углеводной теории, ОПС может выполнять роль специфического углеводного рецептора на ранних этапах взаимодействия бактерий с растениями. Необходимо отметить, что структура ПС41 сходна со структурой повторяющегося звена ОПС A. lipoferum SpBrl7 (Chôma et al., 1992), за тем исключением, что одна из рамноз в ОПС517 не ацетилирована.

p-D-GIcpNAc 1

—»3 )-a-D-Mary?NAcyl-( 1 -+4)-a-L-2-OMeRhap ( 1 —» , 4

где Acyl - (ОССН2СН(ОН)СН3)

—>2)-a-L-Rhapn-( 1 —OJ-ct-L-Rhap'-í 1 —*3)-a-L-RhapUI-( 1 —» 2 Î 1

p-D-Glc/? 41

Суммируя сведения, полученные об этих штаммах, можно предположить, что, несмотря на различное происхождение, их развитие проходило конвергентно. Возможно, на этот процесс во многом повлияло обитание бактерий в сходных экологических нишах.

На основании результатов структурных исследований ЛПС бактерий рода Azospirillum были разделены на четыре хемотипа. К первому (I) были отнесены бактерии A. brasilense Sp245 и SR75, ко второму (II) - A. lipoferum Sp59b и A. brasilense Cd. Исходя из моносахаридного состава, ко второму хемотипу также можно отнести и ЛПС A. irakense КВС1. Однако на основании структурной индивидуальности он был выделен в отдельный хемотип (хемотип III). К четвертому (IV) - были отнесены ЛПС A. brasilense S17, а также A. lipoferum SpBrl7 (Chôma et al, 1992).

Рис. 3. Общие структурные фрагменты ОПС исследуемых штаммов азоспирилл.

Вероятно, именно эти структуры полностью либо частично принимали непосредственное участие в иммунном ответе. Нужно отметить, что серологические перекресты были установлены для ЛПС как с одинаковыми, так и с разными структурами повторяющихся звеньев. Наши исследования также показали, что на основе иммунохимических исследований ЛПС не всегда удается провести пггам-мовую идентификацию бактерий. Например, в случае штаммов Л. brasilense Sp245 и SR75 для этих целей необходимо было прибегнуть к генетическим исследованиям. Таким образом, только применение совокупности химических, физико-химических, серологических и генетических методов позволяет получить наиболее полную информацию о химическом строении ЛПС, а также определить принадлежность микроорганизмов к тому или иному штамму.

ВЫВОДЫ

1. Проведен сравнительный анализ биополимерного состава препаратов ЛПС семи штаммов азоспирилл: А. brasilense SR75, S17, Sp7, Cd, А. irakense КВС1 и А. lipoferum Sp59b, RG20a. Профиль жирных кислот, входящих в состав липополиса-харидов липидов А, представлен насыщенными, ненасыщенными и гидроксикис-лотами. Основными по содержанию были 3-гидрокситетрадекановая, гексадека-новая, 3-щдроксигексадекановая, октадеценовая жирные кислоты. Исключение составил липополисахарид А. lipoferum Sp59b, в составе которого доминирующими были дидекановая, 2-гидроксидидекановая, 3-гидроксидидекановая, 3-гидрокситетрадекановая, гексадекановая, октадеценовая кислоты.

2. Впервые для О-специфических полисахаридов азоспирилл (на примере трех штаммов) показано наличие гексасахаридных повторяющихся звеньев с необычно длинной тетрасахаридной боковой цепью.

3. Выявлена идентичность повторяющихся звеньев О-специфических полисахаридов бактерий рода Azospirillum, принадлежащих к разным штаммам одного вида (A. brasilense Sp245 и A. brasiîense SR75) и к разным видам (A. lipoferum Sp59b и A. brasilense Cd).

4. На примере липополисахаридов A. brasilense S17 впервые для азоспирилл продемонстрировано наличие двух существенно отличающихся по структуре О-специфических полисахаридов, а также присутствие Ы-ацетил-О-глюкозамина и неуглеводного заместителя (8)-3-гидроскибутирата.

5. На основании данных структурного анализа повторяющихся звеньев О-специфических полисахаридов, выделенных из липополисахаридов пяти штаммов азоспирилл (A. irakense КВС1, A. lipoferum Sp59b, A. brasilense Cd, SR75 и S17), соответствующие липополисахариды разделены на четыре хемотипа.

6. На основании серологических анализов с использованием кроличьих антител на очищенные препараты липополисахаридов, исследованные штаммы бактерий рода Azospirillum разделены на две серогруппы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Федоненко Ю.П., Коннова О.Н., Игнатов В.В., Коннова С.А. Характеристика химического состава и биологической активности мембранных и капсульных углеводных компонентов бактерий Azospirillum brasilense S17 // Биология -наука XXI века: сборник тезисов / 7-я Путинская школа конф. молодых ученых. Пущино, 14-18 апреля 2003. - Пущино, 2003. - С. 384.

2. Коннова О.Н., Федоненко Ю.П., Коннова С.А., Игнатов В.В. Исследование по-лисахаридных составляющих липополисахарида Azospirillum irakense КВС1 // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: сборник тезисов / 4-я Всероссийская конференция молодых ученых. Саратов, 23-25 июня 2003. - Саратов: Изд-во Юл, 2003. - С. 76.

3. Fedonenko Yu.P., Konnova O.N., Zatonsky G.V., Shashkov A.S., Konnova S.A., Zdoroveriko E.L., Ignatov V.V., Knirel Yu.A. Structure of the O-polysaccharide of the lipopolysaccharide of Azospirillum irakense KBC1 // Carbohydr. Res. - 2004. -Vol. 339. -P.l 813-1816.

4. Коннова O.H., Федоненко Ю.П. Исследование структуры О-специфического полисахарида, полученного методом прямой экстракции бактериальной массы Azospirillum irakense КВС1 // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Сборник научных статей. - Саратов: Изд-во Научная книга, 2004. - С. 41-46.

5. Коннова О.Н., Бобкова М.Д., Федоненко Ю.П., Коннова С.А., Игнатов В.В. Мембранные и экстраклеточные гликополимеры бактерий Azospirillum lipoferum Sp59b // Биология - наука XXI века: сборник тезисов / 8-я Путинская школа конф. молодых ученых. Пущино, 17-21 мая 2004. - Пущино, 2004. - С. 150.

6. Коннова О.Н., Федоненко Ю.П., Коннова СЛ., Игнатов В.В. Исследование структуры липолисахарида бактерий Azospirillum lipoferum Sp59b // Конференция по органической химии: сборник тезисов / VII Молодежная научная школа - конф. Екатеринбург, 22-26 июня 2004. - Екатеринбург, 2004. - С. 375.

7. Коннова О.Н., Федоненко Ю.П., Коннова С.А., Игнатов В.В. Состав гликопо-лимеров поверхности бактерий Azospirillum brasilense S17 // Химия и биохимия углеводов: сборник тезисов / 3-я Всероссийская школа-конф. Саратов, 9-11 сентября 2004. - Саратов: ООО "Ракурс", 2004. - С. 39.

8. Коннова О.Н., Бурыгин ГЛ., Федоненко Ю.П., Матора Л.Ю., Коннова С.А., Игнатов В.В. Характеристика липолисахарида Azospirillum brasilense Cd и выявление серологического родства с липополисахаридом бактерий Azospirillum lipoferum Sp59b // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: сборник тезисов / 2-я Региональная школа-конф. молодых ученых. Саратов, 26-28 октября 2004. Саратов: Изд-во Научная книга, 2004.-С. 18-19.

9. Коннова О.Н., Федоненко Ю.П., Коннова С.А., Игнатов В.В. Идентичность строения повторяющихся звеньев О-специфических полисахаридов двух штаммов бактерий Azospirillum brasilense И Биология - наука XXI века: сборник тезисов / 9-я Путинская школа конф. молодых ученых. Пущино, 18-22 апреля 2005. - Пущино, 2005. - С. 195-196.

10.Fedonenko Yu.P., Konnova O.N., Zatonsky G.V., Konnova SA., Kocharova N.A., Zdorovenko E.L., Ignatov V.V. Structure of the O-polysaccharide from the Azospirillum lipoferum Sp59b lipopolysaccharide // Carbohydr. Res. - 2005. - Vol. 340. - P. 1259-1263.

11. Коннова O.H., Калашникова E.E., Федоненко Ю.П., Макаров О.Е, Коннова С.А., Игнатов В.В. Характеристика поверхностных гликополимеров бактерий Azospirillum brasilense SRI 5 // Стратегия и взаимодействие микроорганизов с окружающей средой: Сборник научных статей. - Саратов: Изд-во Научная книга, 2005. - С. 68-74.

12.Коннова О.Н., Федоненко Ю.П., Борисов И.В., Здоровенко Э.Л., Кацы Е.И., Коннова С.А., Игнатов В.В. Установление строения повторяющегося звена О-специфического полисахарида Azospirillum brasilense SR75 и гомология LPS-локусов в плазмидах Azospirillum brasilense штаммов SR75 и SP245 // Микробиология. - 2005. - Т. 74, №5. - С. 1-7.

13.Коннова С.А., Федоненко Ю.П., Коннова О.Н., Игнатов В.В. Современные представления о структуре и функциях липополисахаридов азоспирилл // Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты: сборник тезисов / Всероссийская конференция. Саратов, 15-17 июня 2005. - Саратов: Изд-во Научная книга, 2005. - С. 14.

14.Коннова О.Н., Федоненко Ю.П., Коннова С.А., Игнатов В.В. Идентичность О-специфических полисахаридов различных штаммов азоспирилл // Там же. - С. 20.

1 З.Борисов И.В., Кониова О.Н., Федоиенко Ю.П., Коннова С.А., Кацы Е.И. Выявление идентичности строения О-полисахаридов и гомологичных LPS-локусов в плазмидах штаммов Azospirillum brasilense // Там же. - С. 24.

16. Коннова О.Н., Федоненко Ю.П. Структурное и серологическое исследование О-антигена бактерий Azospirillum brasilense Cd // Исследования молодых ученых и студентов в биологии: Сборник научных статей. - Саратов: Изд-во Са-рат. ун-та, 2005. - Вып. 3. - С. 52-55.

17.Коннова О.Н., Зиновьева Е.И., Федоненко Ю.П., Штыков С.Н., Коннова С.А. Поверхностные гликополимеры бактерий Azospirillum brasilense SRI 5 // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: сборник тезисов / V Всероссийская конференция молодых ученых. 22-24 июня 2005. — Саратов, 2005.-С. 28.

18.Коннова О.Н., Федоненко Ю.П., Коннова С А., Игнатов В.В. Характеристика полисахарида и О-специфического полисахарида бактерий Azospirillum brasilense Cd // Конференция по органической химии / VIII Молодежная научная школа-конференция. Казань, 22-26 июня 2005. - Казань, 2005. - С. 390.

19.Коннова О.Н., Бурыгин ГЛ., Федоненко Ю.П., Матора Л.Ю., Панкин К.Е., Коннова С.А., Игнатов В.В. Химический состав и иммунохимическая характеристика липополисахарида азотфиксирующих ризобактерий Azospirillum brasilense Cd // Микробиология. - 2006. - Т. 75, № 3. - С. 383-388.

20.Бойко А.С., Федоненко Ю.П., Коннова О.Н., Коннова СЛ., Игнатов В.В. Характеристика поверхностных гликополимеров ризобактерий Azospirillum brasilense SR55 и S17 // Биологая - наука XXI века: сборник тезисов / 9-я Пущин-ская школа конф. молодых ученых. Пущино, 17-21 апреля 2006. - Пущино, 2006.-С 183.

21.Fedonenko Yu.P., Boiko A.S., Konnova O.N., Zdorovenko E.L., BConnova S.A., Ig-natov V.V. Immunochemical characterization of the lipopolysaccharides from a group of Azospirillum brasilense strains // 2-nd Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates. Rostock, 4-8 October 2006. - Rostock, 2006. - P. 25.

22.Коннова O.H., Бурыгин Г.Л., Федоненко Ю.П., Матора Л.Ю., Коннова С.А., Игнатов В.В. Выявление серологического родства в группе штаммов бактерий рода Azospirillum И Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: сборник тезисов / 3-я Региональная школа-конф. молодых ученых. Саратов, 10-12 октября 2006. - Саратов: Изд-во Научная книга, 2006. - С. 14.

23.Бойко А.С., Бумагина З.М., Коннова О.Н., Федоненко Ю.П., Коннова С.А., Игнатов BJB. Характеристика липополисахарида Azospirillum brasilense SR55 // Там же.-С. 11.

Подписано в печать 14.10.2006 Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Печать RISO. Объем 1,0 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 071.

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель Серман Ю.Б. Свидетельство № 3117 410600, Саратов, ул. Московская, д.152, офис 19, тел. 26-18-19,51-16-28

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Коннова, Ольга Николаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Ассоциативные азотфиксирующие ризобактсрии рода Azospirillum

1.2 Взаимодействие бактерий рода Azospirillum с корнями растений и роль отдельных метаболитов в этом процессе

1.3 Липополисахариды грамотрицательпых бактерий и их роль во взаимодействии с растениями

1.3.1 История исследования липополисахаридов грамотрицательпых бактерий

1.3.2 Липополисахариды грамотрицательпых бактерий, их топология в клетке и функции 20 1.3.2.1 Роль липополисахаридов в реализации растительномикробных взаимодействий

1.3.3 Особенности первичной структуры липополисахаридов и связанные с пей функции

1.3.3.1 Структура и функции липида А

1.3.3.2 Структура и функции олигосахарида кора

1.3.3.3 Структура и функции О-специфических полисахаридных цепей

1.4 О-аптигеппые свойства и серологическая классификация липополисахаридов различных видов бактерий 38 1.4.1 Серологические исследования бактерий рода Azospirillum

1.5 Характеристика методов исследования липополисахаридов

1.5.1 Выделение и очистка липополисахаридов

1.5.2 Разделение липидного и углеводного компонентов липо-полисахарида

1.5.3 Изучение строения О-специфических полисахаридов

1.5.3.1 Деструктивные химические методы с применением газожидкостной хроматографии и масс-спектрометрии

1.5.3.2 Структурный анализ полисахаридов методом ядерного магнитного резонанса

1.6 Липополисахариды и О-специфические полисахариды бактерий рода Azospirillum 53 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Микробные культуры и условия их выращивания и хранения

2.2 Приборы и материалы

2.3 Методы исследования липополисахаридов бактерий рода Azospirillum

2.3.1 Экстракция липополисахаридов азоспирилл

2.3.2 Хроматографические методы

2.3.2.1 Гель-фильтрация

2.3.2.2 Ионообменная хроматография

2.3.2.3 Газо-жидкостная хроматография

2.3.2.3.1 Определение состава жирных кислот липополисахаридов

2.3.2.3.2 Определение моносахаридного состава полисахаридов

2.3.2.3.3 Определение абсолютных конфигураций моносахаридов

2.3.3 Колориметрическое определение состава углеводсодержащих полимеров

2.3.4 Получение антител

2.3.5 Реакция агглютинации

2.3.6 Встречная двойная иммунодиффузия

2.3.7 Электрофорез в полиакриламидном геле

2.3.8 Иммуноферментный анализ (ELISA)

2.3.9 Выделение О-полисахаридов кислотным гидролизом липополисахаридов

23.10 Распад по Смиту

2.3.11 Анализ полисахарида методом метилирования по Хакомори

23.12 Масс-спекгрометрия частично метилированных ацетатов полилов

2.3.13 ЯМР - спектроскопия

2.3.14 Методы работы с ДНК 69 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Выделение, хроматографическая очистка и исследование химического состава липополисахаридов

3.2 Выделение и исследование липидов А

3.3 Получение и характеристика антител па Л ПС бактерий

A. brasilense Cd, A. brasilense Sp7 и A. irakense КВС

3.4 Выявление общих антигенных детерминант у ЛПС различных штаммов и видов азоспирилл с использованием полученных антител

3.5 Сравнительное исследование О-специфических полисахаридов бактерий A. brasilense SI 7, Cd, SR75, A. irakense КВС1 и

A. lipoferum Sp59b

3.5.1 Выделение О-специфических полисахаридов, определение их моносахаридного состава и абсолютных конфигураций нейтральных моносахаров методом ГЖХ

3.5.2 Определение характера замещения моносахаридных остатков методом метилирования с последующей ГЖХ-масс-спектрометрией

3.5.3 Выявление структур повторяющихся звеньев О-специфических полисахаридов бактерий A. brasilense SI7, Cd, SR75, A. irakense КВС1 и A. lipoferum Sp59b методом !H и 13C-ЯМР-спекгроскопии

3.5.3.1 Исследование структуры повторяющегося звена О-специфического полисахарида A. irakense КВС

3.5.3.2 Исследование структуры повторяющегося звена О-специфических полисахаридов бактерий A. lipoferum Sp59bHA brasilense СА

3.5.3.3 Исследование структуры повторяющегося звена 0-специфического полисахарида A. brasilense SR

3.5.3.4 Исследование структуры повторяющегося звена Оспецифического полисахарида A. brasilense S17 117 3.6 Деление липополисахаридов бактерий A. brasilense Sp245, SR75, Cd,

Sp7, S17, A. lipoferum RG20a, Sp59b и A. irakense KBC1 на хемотипы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительное исследование липополисахаридов и структуры О-специфических полисахаридов бактерий рода Azospirillum"

Известно, что в прикреплении бактерий к корням участвуют как неспецифическая сорбция, которая определяется зарядом и гидрофобностыо бактериальной поверхности, так и специфические взаимодействия, которые на разных стадиях опосредуются поверхностно локализованными белками и полисахаридами (ПС) (Michiels et al., 1991; Steenhoudt and Vanderleyden, 2000). Выявление молекулярных механизмов «узнавания» и клеточного контакта корней злаков и бактерий рода Azospirillum требует изучения компонентов клеточной поверхности и материалов, секретируемых в окружающую среду, среди которых полисахаридам микроорганизмов отводится существенная роль (Del Gallo et al., 1989; Del Gallo and Haegi, 1990; Konnova et al., 1994; Копнова с соавт., 1995; Skvortsov and Ignatov 1998; Кон-нова с соавт., 1999; Коннова с соавт., 2001; Федоненко с соавт., 2001; Fedonenko et al, 2002; Коинова с соавт., 2003; Федоненко с соавт., 2004; Коннова с соавт., 2005). Следовательно, одним из ключевых направлений в изучении этой проблемы следует признать анализ строения и функций различных структурных элементов клеточной поверхности почвенных ассоциативных микроорганизмов, так как они являются соединениями, непосредственно материализующими процесс взаимодействия.

Особый интерес представляет исследование липополисахаридов (ЛПС) -главного компонента внешней мембраны грамотрицательных бактерий. ЛПС, специфичность в контактных взаимодействиях которых определяют полисахаридные составляющие, играют важную роль в серотипировании грамотрицательных бактерий (Rietschel et al., 1994; Варбанец и Винарская, 2002; Caroff and Karibian, 2003). Основываясь на строении О-специфических цепей, бактериальные штаммы одного рода разделяют на хемотипы (Kauffmann, 1960). В литературе большое внимание уделено детальному серологическому анализу фитопатогенных бактерий (Kauffmann, 1957; Kauffmann et al., 1961; Книрель, Кочетков, 1994; Варбанец, 1994; Pier, 2003), в то время как аналогичные аспекты изучения ассоциативных азотфиксато-ров находятся на периферии исследовательских интересов.

В связи с этим целью работы было выявление структурных особенностей липополисахаридов и серологического родства бактерий рода Azospirillum.

Для реализации цели в ходе исследования решали следующие задачи:

1. выделение гомогенных препаратов липополисахаридов внешней мембраны бактерий A. brasilense SR75, S17, Sp7, Cd, A. irakense КВС1 и A. li-poferum Sp59b, RG20a;

4. выделение О-специфических полисахаридов из липополисахаридов, и определение первичной структуры повторяющихся звеньев Оспецифических полисахаридов бактерий: A. irakense КВС1, A. lipoferum Sp59b, A. brasilense Cd, SR75 и SI7.

Научная новизна работы. Впервые установлена тонкая химическая структура ОПС, выделенных из ЛПС пяти штаммов трех видов азоспирилл, из которых A. irakense КВС1 и A. lipoferum Sp59b являются типовыми для соответствующих видов микроорганизмов.

Впервые продемонстрировано сходство повторяющихся звеньев ОПС бактерий рода Azospirillum, принадлежащих к разным штаммам одного вида (A. brasilense Sp245 и A. brasilense SR75), и к разным видам (A. lipoferum Sp59b и A. brasilense Cd). На примере A. brasilense S17 установлено наличие в составе ЛПС двух существенно отличающихся по структуре О-специфических полисахаридов, в которых выявлено присутствие И-ацетил-О-глюкозамина и неуглеводного заместителя (8)-3-гидроскибутирата.

Проведено деление исследованных штаммов бактерий рода Azospirillum на серогруппы, а соответствующих ЛПС на хемотипы.

Полученная нами информация о первичной структуре О-специфических полисахаридов A. irakense КВС1, A. brasilense Cd, A. lipoferum Sp59b, A. brasilense SR75 и A. brasilense SI7, а также результаты серологического исследования могут быть использоваиы при установлении филогенетического родства с другими бактериальными видами.

Препараты ЛПС и ОПС A. brasilense, A. lipoferum, A. irakense, а также поли-клональные кроличьи антитела на препараты ЛПС применяются при проведении плановых НИР сотрудниками лаборатории биохимии, лаборатории физической химии клеточных структур, лаборатории микробиологии и микологии, лаборатории растительно-бактериальных симбиозов Института биохимии и физиологии • растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН). Полученные антитела необходимы для дальнейшего серологического анализа коллекционных культур азоспирилл, а также вновь изолированных из природной среды микроорганизмов.

Результаты диссертационной работы используются в ходе преподавания студентам биологического и химического факультетов СГУ курсов: «Основы гли-кологии» и «Методы химии и биохимии углеводов», а также при подготовке курсовых и дипломных работ учащимися этих факультетов.

Представленные в диссертации разработки включены в подготовленное для студентов и аспирантов, специализирующихся в области бактериохимии, учебно-методическое пособие: «Выделение и анализ гликополимеров растительного и бактериального происхождения» / Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2005 г. 40 е., (в соавторстве с С.А. Конновой, Ю.П. Федоненко, О.А. Сачковой), одобренные Учебно-методической комиссией биологического факультета и Ученым советом СГУ им. Н.Г. Чернышевского.

Апробация работы. Материалы исследований, изложенные в диссертации, были представлены на 7-й, 8-й, 9-й, 10-й Международных Пущинских школах -конференциях молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, Россия, 2003 - 2006 гг.), на 4-й, 5-й Всероссийских конференциях молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, Россия, 2003, 2005), на 7-й, 8-й Молодежных научных школах - конференциях по органической химии (Екатеринбург, Россия, 2004; Казань, Россия, 2005), на 3-й Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, Россия, 2004), на 2-й, 3-й Региональных школах-конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2004, 2006), на Всероссийской конференции «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты» (Саратов, Россия, 2005), на научной конференции студентов и аспирантов «Исследования молодых ученых и студентов в биологии»(Саратов, Россия, 2005), на 2-й конференции стран Балтии по микробным углеводам (Росток, Германия, 2006).

Доклад «Структурное и серологическое исследование О-антигена бактерий Azospirillum brasilense Cd», представленный на научной конференции студентов и аспирантов «Исследования молодых ученых и студентов в биологии» (Саратов, Россия, 2005) был удостоен диплома первой степени.

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории биохимии ИБФРМ РАН.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

Липополисахариды бактерий рода Azospirillum на основании структурных исследований их О-специфических полисахаридов разделены на четыре хемотипа. К первому отнесены липополисахариды штаммов A. brasilense Sp245, SR75; ко второму - A. lipoferum Sp59b и A. brasilense Cd; к третьему - A. irakense КВС1; и к четвертому - Л. brasilense SI7, A. lipoferum SpBrl7.

Идентичные структуры повторяющихся звеньев характерны для О-специфических полисахаридов двух пар штаммов Л. brasilense Sp245, SR75 и для А. lipoferum Sp59b, A. brasilense Cd.

Бактерии рода Azospirillum на основании серологических исследований разделены на две серогруппы. К первой отнесены A. brasilense Sp245, SR75 и А. lipoferum RG20a, а ко второй - A. lipoferum Sp59b, A. brasilense Cd, A. brasilense Sp7, A. irakense KBC1 и A. brasilense SI7.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Коннова, Ольга Николаевна

выводы

1. Проведен сравнительный анализ биополимерного состава липополисахаридов семи штаммов: A. brasilense SR75, SI7, Sp7, Cd, A. irakense KBC1 и A. lipoferum Sp59b, RG20a. Профиль жирных кислот, входящих в состав липолисахаридов липидов А, представлен насыщенными, ненасыщенными и гидроксикислотами. Основными по содержанию были 3-гидрокситетрадекановая, гексадекановая, 3-гидроксигексадекановая, октадеценовая жирные кислоты. Исключение составил липополисахарид A. lipoferum Sp59b, в составе которого доминирующими были додекановая, 2-гидроксидодекановая, 3-гидроксидодекановая, 3-гидрокситетрадекановая, гексадекановая, октадеценовая кислоты.

2. На основании данных структурного анализа повторяющихся звеньев 0-специфических полисахаридов, выделенных из липополисахаридов пяти штаммов азоспирилл (A. irakense КВС1, A. lipoferum Sp59b, A. brasilense Cd, SR75 и SI7), соответствующие липополисахариды разделены на четыре хемотипа.

3. Впервые для О-специфических полисахаридов азоспирилл (на примере трех штаммов) показано наличие гексасахаридных повторяющихся звеньев с необычно длинной тетрасахаридной боковой цепью.

4. Выявлена идентичность повторяющихся звеньев О-специфических полисахаридов бактерий рода Azospirillum, принадлежащих к разным штаммам одного вида (A. brasilense Sp245 и A. brasilense SR75) и к разным видам (A. lipoferum Sp59b и А. brasilense Cd).

5. На примере ЛПС A. brasilense S17 впервые для азоспирилл продемонстрировано наличие двух существенно отличающихся по структуре О-специфических полисахаридов, а также присутствие Ы-ацетил-В-глюкозамина и неуглеводного заместителя (З)-З-гидроскибутирата.

6. На основании серологических исследовании с использованием кроличьих антител на очищенные препараты липополисахаридов, исследованные штаммы бактерий рода Azospirillum разделены на две серогруппы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что особенности структуры (хемотип) ОПС липополисахарида и иммуиоспецифичность (серотип) являются консервативными фенотипическими характеристиками микроорганизмов, которые имеют важное таксономическое значение. Долгое время исследования поверхностных гликанов азоспирилл были направлены в основном на изучение состава и функций ЭПС и КПС. Исследования строения ЛПС проводили лишь иммунохимическими методами, но серологическая классификация бактерий этого рода на основе строения О-антигена разработана не была. Сведения, касающиеся структурных и функциональных особенностей ЛПС, оставались малочисленными. Например, структуры повторяющихся звеньев ОПС были определены только для двух штаммов азоспирилл: A. lipoferum SpBrl7 (Choma et al., 1992) и A. brasilense Sp245 (Fedonenko et al., 2002). В связи с этим перед нами стояла задача: выделить ЛПС различных видов азоспирилл и провести изучение тонких химических структур их ОПС, а также на основе серологического анализа разделить исследованные штаммы на серогруппы, что может послужить начальным этапом серологической классификации бактерий этого рода.

На первом этапе нашей работы мы провели выделение и хроматографическую очистку ЛПС бактерий A. brasilense SR75, S17, Sp7, Cd, A. irakense КВС1, A. lipoferum Sp59b и RG20a. Было показано, что они отличались выходами от 1 до 3 %. Разный выход ЛПС при одинаковом методе экстракции, возможно, свидетельствует о различиях в организации наружной мембраны рассматриваемых культур. Было показано, что на долю углеводов в ЛПС приходилось от 20 до 60 % от массы препарата. Разброс в содержании углеводов, учитывая, что по результатам дальнейших исследований все изучаемые препараты отнесены к S-форме ЛПС, может быть объяснен штаммовыми различиями массы липидной составляющей ЛПС. Все ЛПС характеризовались низким содержанием белка и НК, что свидетельствовало о высокой степени их очистки. В составе ЛПС также было обнаружено присутствие КДО - единственного структурного элемента, который всегда присутствует в ЛПС, независимо от их бактериального происхождения. Кроме того, были выявлены значительные межштаммовые различия в содержании общего фосфора в вышеперечисленных ЛПС, что, как известно, оказывает существенное влияние на субмолекулярную организацию ЛПС в мембране (Соловьева и Оводов, 1992).

В составе фракций, соответствующих липидам А, нами были идентифицированы насыщенные, ненасыщенные и гидроксикислоты с длиной углеродной цепи от С10 до С19. Данные по составу жирных кислот ЛПС8р7, ЛПС5я75, ЛПС^гоа, ЛПСКВС1, ЛПСвп хорошо согласуются с результатами, приведенными в литературе для липополисахаридов ряда штаммов A. brasilense (Федоненко с соавт., 2004; Choma et al., 1987), A. lipoferum (Choma et al, 1987; Choma et al., 1984), а также бактерий рода Rhizobium (Wilkinson, 1996). Исключение составил ЛПС5р59ь, профиль жирных кислот которого значительно отличался. Вопреки мнению о том, что липид А эволюционно является наиболее консервативной частью молекулы ЛПС, в последние годы появились данные (Варбапец и Винарская, 2002), которые свидетельствуют о вариабельности его структуры, что нашло подтверждение и в полученных нами результатах.

На следующем этапе нашей работы были проведены серологические исследования всех выделенных препаратов ЛПС при помощи поликлональных AT, которые мы получили на ЛПСС(1, ЛПС5р71 ЛПСквсь a также AT на целые клетки А. brasilense Sp245, обработанных глутаровым альдегидом. При выявлении максимального работающего разведения антисывороток в реакции агллютинации было замечено, что антисыворотка на ЛПСКва не взаимодействовала с гомологичными капсулированными клетками, однако после отмывания бактерий от капсулы она вступала во взаимодействии в разведении 1:160. Смытый с клеток капсульный материал не образовывал преципитата с АТЛпсквс1 в тесте двойной радиальной иммунодиффузии, что позволило сделать предположение о различиях в строении антигенных детерминант (а, возможно, и структуры ОПС) ЛПС внешней мембраны и ЛПС, входящего в состав полисахаридных комплексов капсулы. На примере A. brasilense Cd было показано, что степень связывания AT с макромолекулами поверхности покрытых капсулой клеток была в три раза ниже, чем бескапсульных. Антисыворотка на ЛПС$Р7 проявляла активность по отношению к клеткам, покрытым капсулой, и ее максимальное разведение составило 1:640.

Взаимодействие антисывороток с капсулированными клетками, очевидно, обусловлено двумя причинами. Первая - это связывание с экспонированным на поверхности через капсулу ЛПС. Вторая - взаимодействие с локализованным в капсулыюм материале азоспирилл ЛПБК - экстраклеточной формой ЛПС. Более высокая активность AT в отношении бескапсульных клеток может быть объяснена различием в экспонировании антигенных детерминант ЛПС во внешней мембране и капсуле. Исходя из полученных результатов, мы также предположили, что капсульный материал азоспирилл (который, помимо ЛПБК, содержит полисахарид-липидный комплекс, свободные полисахариды и протеины) экранирует О-антиген внешней мембраны. При этом детерминанты экстраклеточного ЛПС, возможно, менее доступны для взаимодействия со специфичными AT из-за образования комплекса с белком. Таким образом, эксперименты выявили различия между штаммами азоспирилл в степени экспонирования через капсулу О-антигенных цепей, и, как результат, штаммовую вариабельность в реализации различных механизмов контактных взаимодействий этих бактерий с растениями.

С использованием полученных AT методом иммунодиффузии было визуализировано не менее двух антигенных детерминант небелковой природы в составе ЛПСса, ЛПС5р7, и не менее трех в ЛПСКва

По результатам перекрестных реакций в ИФА и иммунодиффузии была выявлена некоторая специфичность AT по отношению к отдельным препаратам ЛПС, в соответствии с которой в ЛПС$Р7 и ЛПС5Р59ь было показано наличие детерминант, содержащихся в ЛПСса- ЛПС5р59ь давал иммунологические перекресты только с ЛПСссь В ЛПС$Р7 были найдены антигенные детерминанты, которые, помимо гомологичных AT, выявляются АТлпсквс! и АТдпсхм- ЛПСКвс1 имел серологические перекресты с ЛПС$Р7 и ЛПСса, причем АТЛпссс1 с ЛПСКва не взаимодействовали. В ЛПСвп также были обнаружены детерминанты, содержащиеся в ЛПСса и ЛПС8р7. Антителами на целые клетки A. brasilense Sp245, обработанные глутаровым альдегидом, было выявлено серологическое родство ЛПС штаммов A. brasilense Sp245, SR75 и A. lipoferum RG20a, причем ЛПС5р245 оказался антигенно более близок с ЛПС5я75, чем с ЛПСКС2оа- Нахождение серологических перекрестов у названых видов азоспирилл является тем более примечательным, что они получены с разных материков и разных растений.

На основании полученных результатов все исследуемые штаммы по иммуноспецифичности ЛПС были разделены на две серогруппы. К первой мы отнесли штаммы A. brasilense Sp245, SR75 и A. lipoferum RG20a, а ко второй -A. brasilense Sp7, Cd, SI7, A. lipoferum Sp59b и A. irakense KBC1.

Однако анализ результатов серологических исследований позволяет говорить о наличии гетерогенности антигенных детерминант в составе второй серогруппы:

•A. lipoferum Sp59b и A. brasilense Cd;

•A. brasilense Sp7, A. irakense КВС1 и A. brasilense Cd (отличные от общих фрагментов с A. lipoferum Sp59b);

•A. brasilense S17, A brasilense Sp7 и A. brasilense Cd.

Как известно, антитела образуются на полисахаридную часть ЛПС, в связи с этим можно утверждать, что выявленные серологические перекресты говорят о наличии общих структурных фрагментов в соответствующих ЛПС.

Третьим этапом нашего исследования стало сравнительное изучение 0-специфических полисахаридов бактерий A. brasilense SI 7, Cd, SR75, A. irakense КВС1 и A. lipoferum Sp59b. После получения ОПС кислотным гидролизом ЛПС был исследован их моносахаридый состав и абсолютные конфигурации методом ГЖХ в виде ацетатов полиолов и ацетилированных октилгликозидов. Нами было отмечено, что ОПСс<ь ОПСква и ОПС5р59ь имели идентичный моносахаридный состав, при одинаковом соотношении Сахаров (Rha:Man:Gal ~ 3:1:2). Наиболее разнообразным по составу оказался ОПСбп, который содержал остатки Glc, GlcN, ManN, и два типа остатков Rha, неметилированной и метилированной в положении 2 (Rha20Me) в отношениях ~ 1:1:1:3:1 соответственно. Анализ компонентов гидролизата OnCsR75 в виде ацетатов полиолов привел к идентификации только Rha.

ГЖХ-масс-спекгрометрией в виде частично метилированных ацетатов полиолов были выявлены идентичные продукты метилирования ОПСса и OnCsP59b> что позволило выдвинуть предположение о структурном подобии их повторяющихся единиц. Было также показано, что, несмотря на сходный моносахаридный состав, структура повторяющегося звена ОПСква отличалась от структур ОПСса и ОПС5р59ь. Кроме того, в отличие от всех Сахаров, которые представляли собой пиранозиды, терминальная Gal ОПСКВа имела фуранозную форму. Повторяющееся звено 0nCSR75 являлось линейным и состояло из 2- и 3- замещенной Rha в пиранозной форме.

OnCsi7 не полностью был определен состав ПС и конфигурации некоторых остатков. Невыясненными остались также вопросы, касающиеся установления моносахаридной последовательности в полисахаридных цепях, типов связей между остатками моносахаридов, степени разветвления повторяющихся звеньев исследованных ОПС. Для разъяснения возникших вопросов и подтверждения уже полученных результатов были проведены исследования методом |3С- и 'Н- ЯМР спектроскопии с использованием двумерных экспериментов.

На основании данных, полученных этим методом, было показано, что ОПСква является регулярным и состоит из разветвленных гексасахаридных повторяющихся звеньев. Необходимо отметить, что для грамотрицательных бактерий на примере A. irakense КВС1 впервые показано существование ОПС, основная цепь которого построена из дисахаридных повторяющихся единиц с нетипично длинной боковой цепью.

Аналогичные исследования ОПС типового штамма A. lipoferum Sp59b позволили обнаружить сходный тип строения с ОПСквсь который также представлял собой разветвленный гексасахарид, а именно дигалактан с маннорамнановой боковой цепью. *Н- и |3С-ЯМР спектры ОПСС(1 и, соответственно, значения химических сдвигов протонов и атомов углерода были близки к полученным для OnCsP5%> что позволило сделать вывод о сходстве структур их повторяющихся звеньев. Таким образом, в нашей работе впервые показана идентичность повторяющихся звеньев ОПС бактерий, принадлежащих к разным видам азоспирилл.

Комплексный анализ с применением ГЖХ, ГЖХ-масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии показал, что OnCsR75 состоит из одинаковых линейных пентасахаридных повторяющихся звеньев, содержащих только остатки D-Rha, имеющих структуру, аналогичную структуре ОПС A. brasilense Sp245, установленной ранее сотрудниками лаборатории биохимии ИБФРМ РАН (Fedonenko et al, 2002). На примере этих микроорганизмов показана межштаммовая идентичность ОПС азоспирилл одного вида.

В связи с тем, что структуры ОПС A. brasilense SR75 и Sp245 оказались идентичными, мы посчитали необходимым провести изучение уровня их генетического родства. В результате гидролиза тотальной клеточной ДНК штаммов SR75 и Sp245 эндонуклеазами рестрикции были получены данные, которые свидетельствовали о существенных различиях в структуре геномов этих штаммов. Но, тем не менее, были найдены высоко гомологичные локусы, по-видимому, определяющие продукцию ЛПС.

Приоритетные результаты мы получили в ходе исследования структуры ОПС A. brasilense SI7. Он представлял собой смесь из двух различных полисахаридов, что впервые выявлено для бактерий рода Azospirillum. На примере липополисахарида А. brasilense SI7 впервые для бактерий этого рода было показано присутствие в составе ОПС К-ацетил-О-глюкозамина и неуглеводного заместителя (З)-З-гидроксибутирата. Известно, что GlcNAc является специфическим гаптеном лектина пшеницы. Учитывая поверхностную локализацию ЛПС, а также способность азоспирилл экскретировать ЛПС в окружающую среду в виде ЛПБК, можно предположить его сродство к лектину пшеницы. Таким образом, согласно лектин-углеводной теории, ОПС может выполнять роль специфического углеводного рецептора на ранних этапах взаимодействия бактерий с растениями. Интересно, что структура одного из ПС имела сходство со структурой повторяющегося звена ОПС A. lipoferum SpBrl7 (Choma et al., 1992) за тем исключением, что одна из рамноз в ОПС5и не ацетилирована.

Необходимо отметить, что Rha в D- или L-форме широко представлены в составе ПС микроорганизмов, вступающих в различные взаимоотношения с растениями, что может быть показателем её важной роли в процессах растительно-микробных взаимодействий.

Суммируя сведения, полученные о структурах ОПС рассматриваемых в данной работе штаммов азоспирилл, мы предположили, что, несмотря на различное происхождение, их развитие проходило конвергентно. Возможно, на этот процесс во многом повлияло обитание бактерий в сходных экологических нишах.

Основываясь на строении О-специфических цепей, бактериальные штаммы одного рода разделяют на хемотипы (Kauffmann, 1960). В связи с этим, на основании результатов структурных исследований проанализированные ЛПС бактерий рода Azospirillum были разделены нами на четыре хемотипа. К первому были отнесены бактерии A. brasilense Sp245 и SR75, ко второму - A. lipoferum Sp59b и A. brasilense Cd. Исходя из моносахаридного состава, ко второму хемотипу также можно было отнести и ЛПС A. irakense КВС1. Но на основании структурной индивидуальности ЛПСКВа выделили в отдельный хемотип (хемотип III). К четвертому - были отнесены ЛПС A. brasilense SI7, а также A. lipoferum SpBrl7 (Choma et al., 1992).

Сравнительный анализ результатов исследований ОПС позволил обнаружить в их составе некоторые общие структурные фрагменты, по которым могли происходить выявленные иммунологические перекресты. Наличие идентичных фрагментов в ОПС бактерий разных штаммов и видов позволило сделать предположение о том, что, вероятно, именно эти моносахара полностью либо частично принимали участие в иммунном ответе. Нужно отметить, что серологические перекресты были установлены для ЛПС как с одинаковыми, так и с разными структурами повторяющихся звеньев. Полученные результаты также показали, что на основе иммунохимических методов анализа ЛПС не всегда удается провести штаммовую идентификацию бактерий. Например, в случае штаммов A. brasilense Sp245 и SR75 для этих целей необходимо было прибегнуть к генетическим исследованиям. Таким образом, только применение совокупности химических, физико-химических, серологических и генетических методов может дать наиболее полную информацию о химическом строении ЛПС, а также определить принадлежность микроорганизмов к тому или иному штамму.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор искренне благодарен за плодотворное сотрудничество коллегам из лаборатории биохимии - кандидату биологических наук, старшему научному сотруднику Ю.П. Федоненко, кандидату биологических наук, научному сотруднику И.В. Егоренковой, старшему лаборанту-исследователю О.А. Сачковой, сотрудникам ИБФРМ РАН доктору биологических наук, старшему научному сотруднику Л.Ю. Матора, кандидату биологических наук, научному сотруднику Г.Л. Бурыгину, кандидату химических наук, старшему научному сотруднику О.Е. Макарову, доктору биологических наук, старшему научному сотруднику Е.И. Кацы, кандидату биологических наук, научному сотруднику И.В. Борисову, а также другим сотрудникам ИБФРМ РАН и сотрудникам лаборатории химии углеводов ИОХ РАН (Москва), на разных этапах проявивших интерес к теме и принимавших участие в представленном исследовании.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коннова, Ольга Николаевна, Саратов

1. Бергельсон Л.Д. Мембраны, молекулы, клетки. М.: Наука, 1982. - 183 с.

2. Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Матора Л.Ю., Шварцбург Б.И. Твердофазный иммуноанализ с использованием коллойдного золота в серотипировании азоспирилл // Микробиол. 1991. - Т. 60. - Вып. 3. - С. 524 - 529.

3. Варбанец Л.Д. Эндотоксины грамотрицательных бактерий: структура и биологическая роль // Микробиол. жури. 1994. - Т. 56, №3. - С. 76 - 97.

4. Варбанец Л.Д., Винарская Н.В. Структура, функция, биологическая активность эндотоксинов грамотрицательных бактерий // Токсини М1крооргашзм1в. 2002. -С. 1-7.

5. Василенко И.А., Шамшин Д.В., Маликова Н.Н., Алексеева С.Г., Швец В.И. Синтез амфифильных аналогов нуклеозидов и изучение их взаимодействия с модельными мембранами // Биологические мембраны. 2005. - Т. 22. - № 5. - С. 408 - 412.

6. Волкогон В.В. Ассоциативные азотфиксирующие организмы // Микробиол. журн. -2000.-Т. 62, №2.-С. 51-68.

7. Егоренкова И.В., Коннова С.А., Скворцов И.М. Игнатов В.В. Исследование начальных этапов взаимодействия бактерий Azospirillum brasilense с корнями проростков пшеницы: адсорбции, деформации корневых волосков // Микробиол. -2000.-Т. 69,№1.-С. 120- 126.

8. Жемеричкин Д.А., Макаров О.Е., Скворцов И.М., Игнатов В.В. Выделение, фракционирование и моносахаридный состав О-специфических полисахаридов S-формы Azospirillum brasilense II Микробиол. 1989. - Т. 58, № 2. - С. 236 - 239.

9. Ю.Захарова И.Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. Киев: Наук, думка, 1982.- 192 с.

10. Здоровенко Г.М. Внеклеточный липополисахарид грамотрицательных бактерий // Микробиол. журн. 1988. - Т. 50, № 4. - С. 98 - 107.

11. Здоровенко Г.М., Веремейченко С.Н. Сравнительная характеристика липополисахаридов различных штаммов Pseudomonas fluorescens (биовар I) // Микробиол. 2001. - Т. 70, № 4. - С. 509 - 518.

12. Здоровенко Г.М., Соляник Л.П., Яковлева Л.М., Парамонов Н.А. Характеристика о-антигенов различных штаммов Pseudomonas syrringae pv. tabaci // Биохимия. -1997.-Т. 62.-Вып. 1.-С 36-46.

13. Кагава Я. Биомембраны. М.: Высшая школа, 1985. - 303 с.

14. Карпунина Л.В., Мельникова У.Ю., Коннова С.А., Аброськина О.М. Роль агглютинирующих белков бацилл и ризобий в межбактериальных взаимодействиях // Микробиол. 2001. - Т. 70, №4. - С. 519 - 524.

15. Кац Л.Н. Поверхностные структуры бактериальной клетки // Успехи совр. биологии. 1973. - Т. 76, № 1-3.- С. 395-414.

16. Кашкин П.Н., Блинов Н.П., Кашкин К.П. Микробиология. Ленинград: Медицина, 1968. - 367 с.

17. Книрель 10.А. Липополисахариды грамотрицательных бактерий // Прогресс химии углеводов / Под ред. И.В. Торгова М.: Наука, 1985. - С. 54 - 71.

18. Книрель Ю.А., Здоровенко Г.М., Яковлева Л.М., Шашков А.С., Соляник Л.П., Захарова И.Я. Антигенные полисахариды бактерий // Биоорган. Химия. 1988. -Т. 14,№2.-С. 166-171.

19. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий //Биохимия. 1993. - Т. 58, вып. 2. - С. 166 - 181.

20. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. III. Структура О-специфических полисахаридов // Биохимия. 1994. -Т. 59,№12.-С. 1784- 1851.

21. Книрель Ю.А., Шашков А.С., Дмитриев Б.А., Кочетков Н.К., Касянчук Н.В., Захарова И.Я. Антигенные полисахариды бактерий. 11. Структура и спектр 13С-ЯМР о-специфического полисахарида из Pseudomonas cepacia // Биоорг. химия. -1980.-Т. 6,№12.-С. 1851 1859.

22. Командрова Н.А., Томшич С.В., Исаков В.В., Романенко JI.A. Структура сульфатированного О-специфического полисахарида морских бактерий Pseudoalteromonas marinoglutinosa КММ232 // Биохимия. 1998. - Т. 63. - Вып. 10. -С. 1410-1416.

23. Коннова С.А., Брыкова О.С., Сачкова О.А., Егоренкова И.В., Игнатов В.В. Исследование защитной роли полисахаридпых компонентов капсулы бактерий Azospirillum brasilense 11 Микробиол. 2001. - Т. 70. - С. 503 - 508.

24. Коннова С.А., Рогова Т.А., Макаров О.Е., Скворцов И.М., Игнатов В.В. Исследование внеклеточных полисахаридсодержащих комплексов и полисахаридов бактерий Azospirillum brasilense Cd // Микробиол. 1999. - Т. 68, №2.-С. 164-171.

25. Кочетков Н.К. Необычные моносахариды компоненты О-антигенных полисахаридов микроорганизмов // Успехи химии. - 1996. - Т. 65, № 9. - С. 799 - 835.

26. Красикова И.Н., Бахолдина С.И., Соловьева Т.Ф. Новый способ выделения О-специфического полисахарида из грамотрицательных бактерий Yersinia pseudotuberculosis II Биоорг. химия. 1998. - Т. 24, № 7. - С. 549 - 553.

27. Красикова И.Н., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Структура и свойства липида А -компонента эндотоксинов грамотрицательных бактерий // Химия природных соединений. 1989. - № 5. - С. 601 - 616.

28. Крепе Е.М. Липиды клеточных мембран. Л.: Наука, 1981. - 339 с.

29. Кульшин В.А., Яковлев А.П., Аваева С.Н., Дмитриев Б.А. Улучшенный метод выделения липополисахаридов из грамотрицательных бактерий // Мол. генетика, микробиология и вирусология. 1987. - № 5. - С. 44 - 46.

30. КэботЕ., Мейер М. Экспериментальная иммунохимия. М.: Медицина, 1968. - 684 с.

31. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш. школа, 1980. - 293 с.

32. Липкинд Г.М., Кочетков Н.К. Конформационный анализ и ядерный эффект Оверхаузера в 1-2-связанных дисахаридах с а-манно и а- рамно-конфигурацией восстанавливающего остатка // Биоорг. химия. 1984. - Т. 10, № 12. - С. 1670 -1679.

33. Липкинд Г.М., Шашков А.С., Кочетков Н.К. Структурный анализ полисахаридов с линейнам повторяющимся звеном на ЭВМ по данным спектров 13С-ЯМР // Биоорг. химия. 1987. - Т. 13, № 6. - С. 833 - 841.

34. Матора Л.10., Серебренникова О.Б., Перова Л.П., Бурыгин Г.Л., Щеголев С.Ю. Нетипичный характер R-S диссоциации Azospirillum brasilense // Микробиол. -2003.-Т. 72,№ 1.-С. 60-63.

35. Матора Л.Ю., Шварцбург Б.И., Щеголев С.Ю. Иммунохимический анализ О-специфических полисахаридов почвенных азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilense II Микробиол. 1998. - Т. 67, № 6. - С. 815 - 820.

36. Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Антигенная идентичность липополисахаридов, капсулы и экзополисахаридов Azospirillum brasilense II Микробиол. 2002. - Т. 71, №2.-С. 211-214.

37. Мишустин Е.Н., Шильникова В.К. Биологическая фиксация атмосферного азота. -М.: Наука, 1968.-531 с.

38. Назаренко Е.Л., Зубков В.А., Шашков А.С., Книрель Ю.А., Горшков Р.П., Иванова Е.П., Оводов Ю.С. Структура повторяющего звена кислого полисахарида Alteromonas macleodii 2ММ6 // Биоорг. химия. 1993. - Т.19, № 7. - С. 740 - 751.

39. Никитина В.Е., Пономарева Е.Г., Алепькина С.А., Коннова С.А. Участие бактериальных лектинов клеточной поверхности в агрегации азоспирилл // Микробиол. 2001. - Т. 70, №4. - С. 471-476.

40. Овод В.В., Здоровенко Э.Л., Шашков А.С., Кочарова Н.А., Книрель Ю.А. Структурное разнообразие О-полисахаридов и серологическая классификация

41. Pseudomonas syringae pv. garcae и других штаммов геномотипа 4 // Микробиол. -2004.-Т. 73,№6.-С. 777-789.46.0нофраш Л.Ф., Якимова М.Ф., Ковальжиу А.И., Волоскова М.М. Симбиотическая азотфиксация и пути ее повышения. Кишинев: Штиинца, 1992. - 146 с.

42. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука. - 1985. - 536 с.

43. Петрова Л. П., Матора Л.Ю., Бурыгип Г.Л., Борисов И.В., Кацы Е.И. Анализ ДНК, ряда культурально-морфологических свойств и структуры липополисахаридов у близкородственных штаммов Azospirillum brasilense II Микробиол. 2005. - Т. 74, № 2. - С. 224 - 230.

44. Позднякова Л.И., Каневская С.В., Леванова Г.Ф., Барышева Н.Н., Пилипенко Т.Ю., Богатырев В.А., Федорова Л .С. Таксономическое изучение азоспирилл, выделенных из злаков Саратовской области // Микробиол. 1988. - Т. 57, №2.-С. 275-278.

45. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / под ред. Н.С. Егорова. М.: Изд-во МГУ, 1983. С. 115 -116.

46. Самуэльсон О. Ионообменные разделения в аналитической химии: Пер. с англ. -М.: Химия, 1966.-416 с.

47. Сим Э. Биохимия мембран: Пер. с англ. М: Мир, 1985. - 110 е., ил.

48. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. - 342 с.

49. Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Физические свойства липополисахаридов граммотрицательных бактерий // Биол. мембраны. 1992. - Т. 9, № 3.- С. 245 - 258.

50. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот// Биохимия. 1958. - Т. 23, № 5. - С. 656 - 662.

51. Федоненко Ю.П., Егорепкова И.В., Коннова С.А., Игнатов В.В. Участие липополисахаридов азоспирилл во взаимодействии с поверхностью корней пшеницы // Микробоиол. 2001. - Т. 70, № 3. - С. 384 - 390.

52. Чижов О.С., Шашков А.С. Масс-спектрометрия и ЯМР-спектроскопия в установлении структуры полисахаридов // Успехи химии углеводов / под ред. И.В. Торгова. М.: Наука, 1985. - С. 30 - 54.

53. Шашков А.С. Конформационная зависимость химического сдвига аиомерных атомов углерода в олиго и полисахаридах // Биоорг. химия. 1983. - Т. 9, № 2. -С. 246-253.

54. Шашков А.С., Здоровенко Г.М., Даева Е.Д., Яковлева JI.M., Соляник Л.П., Гвоздяк Р.И., Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Антигенные полисахариды бактерий // Биоорг. химия. 1990. - Т. 16, № 1. - С. 90 - 97.

55. Шашков А.С., Чижов О.С. Спектроскопия 13С-ЯМР в химии углеводов и родственных соединений // Биоорг. химия. 1976. - Т. 2, № 4. - С. 437 - 497.

56. Эрнст Р., Боденхаузен Дж., Вокаун А. ЯМР в одном и двух измерениях: Пер. с англ.-М.: Мир, 1990.-709 с.

57. Яковлев М.Ю. «Эндотоксииовая агрессия» как предболезпь или универсальный фактор патогенеза заболеваний человека и животных // Успехи современной биологии. 2003. - Т. 123. - С. 31 - 40.

58. Adams G.A. Extraction of lipopolysaccharides from gram-negative bacteria with dimethyl sulfoxide // Can. J. Biochem. 1967. - Vol. 45. - P. 422 - 426.

59. Agrawal P.K. NMR spectroscopy in the strucrural elucidation of oligosaccharides and glycosides // Phytochem. 1992. - Vol. 31. - P. 3307 - 3330.

60. Alexander C., Rietschel E.Th. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity // J. Endotox. Res. 2001. - Vol. 7, N 3. - P. 167 - 202.

61. A1-Qutub M.N., Braham P.H., Karimi-Naser L.M., Liu X., Genco C.A., Darveau R.P. Hemin-Dependent Modulation of the Lipid A Structure of Porphyromonas gingivalis Lipopolysaccharide // Infection and Immunity. 2006. - Vol. 74, N 8. - P. 4474 - 4485.

62. Arata S., Hirayama Т., Kasai N. Isolation of 9-hydroxy-d-tetradecalactone from lilpid A from Pseudomonas diminuta and Pseudomonas vesicularis// FEMS Microbiol. Lett. -1989.-Vol. 60,№2.-P.219-222.

63. Aspinall G.O. Chemical characterization and structure determination of polysaccharides // The Polysaccharides / Ed. G.O. Aspinall. New York: Acad. Press, 1982. Vol. 1. -P. 35 -131.

64. Aucklen H.M., Wilkinson S.G., Pitt T.Z. Immunochemical characterization of two new serotypes of Serratia marcescens (027 and 028) // FEMS Microbiol. Lett. 1996. -Vol. 138.-P. 74 - 82.

65. Baldani J.I., Baldani V.L.D. History on the biological nitrogen fixation research in graminaceous plants: special emphasis on the Brazilian experience // Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 2005. - Vol. 77, N 3. - P. 549 - 579

66. Baldani J.I., Baldani V.L.D., Seldin L., Dobereiner J. Caracterization of Herbaspirillum seropedicae gen. nov., sp. nov., a root-associated nitrogen-fixing bacterium // Int. J. Sist. Bacteriol. 1986. - Vol. 36. - P. 86 - 93.

67. Baldani J.I., Caruso L., Baldani V.L.D., Gop S.R., Dobereiner J. Recent advances in bnf with non-legume plants // Soil Biol. Biochem. 1997. - Vol. 29, N 5/6. - P. 911 - 922.

68. Baldani V.L.D., Baldani J.I., Dobereiner J. Effects of Azospirillum inoculation on root infection and nitrogen incorporation in wheat // Can. J. Microbiol. 1983. - Vol. 29. -P. 924 - 929.

69. Baldani V.L.D., Dobereiner J. Host-plant specificity in the interaction of cereals with Azospirillum spp. // Soil Biol. Biochem. 1980. - Vol. 12. - P. 433 - 439.

70. Bashan Y., Holguin G. Azospirillum plant relationships: environmental and physiological advances (1990-1996). // Can. J. Bacterid. -1997. - Vol. 43. - P. 103-121.

71. Bashan Y., Levanony H. Current status of Azospirillum inoculation technology: Azospirillum as challenge for agriculture // Canad. J. Microbiol. 1990. - Vol. 36, N 9. -P. 591 -608.

72. Bax A, Lerner L. Two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy // Science. 1986. - Vol. 232, N 4753. - P. 960 - 967.

73. Becking J.H. Fixation of molecular nitrogen by an aerobic Vibrio or Spirillum II J. Microbiol. Serol. 1963. - Vol. 29. - P.326.

74. Bejerinck M.W. Uber ein Spirillum, welches freien Stickstoff binden kann // Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infectionkr. Hyg. Abt. 1925. - Bd. 63. - S. 353 - 359.

75. Bekri M.A., J. Desair, V. Keijers et al. Azospirillum irakense produces a novel type of pectate lyase // J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181. - P. 2440 - 2447.

76. Berenblum, Chein. An improved method for colorimetric determination of phosphate // Biochim. J. 1938. - Vol. 32, №2. - P. 295 - 298.

77. Beveridge T.J. Uitrastructure, chemistry and function of the bacterial cell wall // Int. Rev. Cytol. -1981. Vol. 72. - P. 229-317.

78. Beveridge T.J., Graham L.L. Surface layers of bacteria // Microbiol. Rev. 1991. -Vol. 55. - P. 684 - 705.

79. Beynon L.M., Cox A.D., Taylor C.J., Wilkinson S.G., Perry M.B. Characterization of a lipopolysaccharide containing two different trisaccharide repeating units from Burkholderia cepacia sertype E (02) // Carbohydr. Res. 1995. - Vol. 272. - P. 231 - 239.

80. Bock K., Pedersen C. Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy of monosaccharides // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1983. - Vol. 41. - P. 27 - 66.

81. Boddey R.M., Baldani V.L.D., Baldani J.I., Dobereiner J. Effect of inoculation of Azospirillum spp on the nitrogen assimilation of field grown wheat // Plant Soil. 1986. -Vol. 95.-P. 109-121.

82. Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Matora L.Yu., Schwartsburd B.I. The serotyping of Azospirillum spp. by cell-gold immunoblotting // FEMS Microbiol. Lett. 1992. -Vol. 96.-P. 115-118.

83. Borneleit P., Blechschmidt В., Blasig R., Franke P., Gunter P., Kleber H.-P. Preparation of I R-type lipopolysaccharides of Acinetobacter calcoaceticus by EDTA-salt extraction // Curr.

84. Microbiol. 1989. - Vol. 19. - P. 77 - 81.

85. Borregaard N., Elsbach P., Ganz Т., Garred P., Svejgaard A. Innate immunity: from plants to humans // Immunol. Today. 2000. - Vol. 21. - P. - 68 - 70.

86. Brandenburg K., Andra J., Miiller M., Koch M.H.J., Garidelc P. Physicochemical properties of bacterial glycopolymers in relation to bioactivity // Carbohydr. Res. -2003. Vol. 338. - P. 2477 - 2489.

87. Brandenburg K., Seydel U. Investigation into the fluidity of lipopolysaccharide and free lipid A membrane systems by Fourier-transform infrared spectroscopy and differential scanning calorimetry//Eur. J. Biochem. 1990.-Vol. 191.-P. 229-236.

88. Bredford M. A rapid and sentive method for protein analysis the principe of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - Vol. 72. - P. 248 - 254.

89. Brink B.A., Miller J., Carlson R.W., Noel K.D. Expression of Rhizobium leguminosarum CFN42 genes for lipopolysaccharide in strains derived from different Rhizobium leguminosarum soil isolates // J. Bacteriol. 1990. - Vol. 172. - P. 548 - 555.

90. Brisson J.R., Sue S.C., Wu W.G., Mc Manus G., Nghia P.T., Uhrin D. // In NMR Spectroscopy of Glycoconjugates / Eds. Jimenez-Barbero J., Peters T. Wiley-VCH: Weinhem, 2002. - P. 59-93.

91. Burdman S., Jurkevitch E., Schwartsburd В., Hampel M., Okon Y. Aggregation in Azospirillum brasilense: effects of chemical and physical factors and involvement of extracellular components // Microbiol. 1998. - Vol. 144. - P. 1989 - 1999.

92. Burdman S., Jurkevitch E., Schwartsburd В., Окоп Y. Involvement of outer-membrane proteins in the aggregation of Azospirillum brasilense II Microbiol. 1999. -Vol. 145.-P. 1145- 1152.

93. Caroff M., Karibian D. Structure of bacterial lipopolysaccharides // Carbohydr. Res. 2003. - Vol. 338. - P. 2431 - 2447.

94. Castellanos Т., Ascencio F., Bashan Y. Cell-surface lectins of Azospirillum spp. // > Curr. Microbiol. 1998. - Vol. 36. - P. 241 - 244.

95. Choma A., Lorkiewicz Z., Russa R. Analysis of Azospirillum lipopolysaccharides // Abstracts of the 9th International Congress of Nitrogen Fixation. Cancur, Mexico. -1992.-P. 125.

96. Choma A., Russa R., Lorkiewicz Z. Chemical composition of lipopolisaccharide from Azospirillum lipoferum IIFEMS Microbiol. Lett. 1984. - Vol. 22. - P. 245-248.

97. Choma A., Russa R., Mayer H., Lorkiewicz Z. Chemical analysis of Azospirillum lipopolysaccharides //Arch. Microbiol. 1987. - Vol. 146. - P. 341 - 345.

98. Clover R.H., Kieber J., Singer E.R. Lipopolysaccharide mutants of Rhizobium meliloti are not defective in symbiosis//J. Bacterid.- 1989.-Vol. 171.-P. 3961 -3967.

99. Cox A.D., Wilkinson S.G. Ionizing groups in lipopolysaccharides of Pseudomonas cepacia in relation to antibiotic resistance // Mol. Microbiol. -1991. Vol. 5. - P. 641 - 646.

100. Cuicanu I., Kerek F. A simple and rapid method for the permetylation of carbohydrates//Carbohydr. Res. 1984.-Vol. 131.-P. 209-217.

101. Dazzo F.B., Brill W.J. Bacterial polysaccharide which binds Rhizobium trifolii to clover root hairs // J. Bacterid. 1979. - Vol. 137. - 1362 - 1373.

102. Dazzo F.B., Milam J.B. Serological studies of Spirillum lipoferum // Soil. Crop. Sci. Soc. Florids Proc. 1976. - 35. - P. 122 - 126.

103. De Troch P., Vanderleyden J. Surface properties and motility of Rhizobium and Azospirillum in relation to plant root attachment // Microbiol. Ecol. 1996. - Vol. 32. -P. 149- 169.

104. Del Gallo M., Fendrik I. The rhizosphere and Azospirillum II In: Azospirillum / Plant Associations / Ed. Okon Y. Boca Raton: CRC Press, 1994. P. 57 - 76.

105. Del Gallo M., Haegi A. Characterization and quantification of exocellular polysaccharides in Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum II Symbiosis. -1990.-Vol. 9.-P. 155- 156.

106. Del Gallo M., Negi M., Neyra C. A. Calcofluor- and lectin-binding exocellular I polysaccharides of Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum II J. Bacteriol.1989.-Vol. 171.-P. 3504-3510.

107. De-Polli H., Bohlool B.B., Dobereiner J. Serological differentiation of Azospirillum species to different host-plant specificity groups // Arch. Microbiol.-1980. 126. -P. 217 -222.

108. Dobereiner J. History and new perspectives of diasotrophs in associations with non-leguminous plants // Symbiosis. 1992a. - Vol. 13. - P. 1 - 13.

109. Dobereiner J. Recent changes in concepts of plant bacteria interactions: Endophytic N2 fixing bacteria // Ciencia e Cultura. 19926. - Vol. 44. - P. 310 - 313.

110. Dobereiner J., Day J.M. Associative symbiosis in tropical grasses: characterisation of microorganisms and dinitrogen-fixing sites // Proc. I Intern. Symp. Nitrogen Fixat / Ed. W.E. Newton, C.J. Nyman. Washington. - 1976. - P. 518 - 537.

111. Dubois M., Gilles K. A., Hamilton J. K., Rebers P. A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Anal. Chem. 1956. -Vol. 28, №3.-P. 350-356.

112. Eckert В., Weber O.B., Kirchhof G., Halbritter A., Stoffels M., Hartmann A. Azospirillum doebereinerae sp. Nov. a diazotrofic bacterium associated with Miscanthus sinesis "giganteus" // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2001. Vol. 51. -P. 17 - 26.

113. Eskew D.L., Focht D.D., Ting I.P. Nitrogen fixation, denitrification, and pleomorphic growth in a highly pigmented Spirillum lipoferum 11 Appl. Environ. Microbiol. 1977. - Vol. 34. - P. 582-585.

114. Fani R., Bandi C., Bazzicalupo M., Ceccherini M.T., Fancelli S., Gallori E., GeraceL., Grifoni A., Miclaus N., Damiani G. Phylogeny of the genus Azospirillum based on 16S rDNA sequence // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - Vol. 129. - P. 195 - 200.

115. Fedonenko Y.P., Zatonsky G.V., Konnova S.A., Zdorovenko E.L., Ignatov V.V. Structure of the O-specific polysaccharide of the lipopolysaccharide of Azospirillum brasilense Sp245 // Carbohydr. Res. 2002. - Vol. 337. - P. 869 - 872.

116. Fischer S.E., Miguel M.J., Mori G.B. Effect of root exudates on the exopolysaccharide composition and the lipopolysaccharide profile of Azospirillum brasilense Cd under saline stress // FEMS Microbiol. Lett. 2003. - Vol. 219. - P. 53 - 62.

117. Fontaine Т., Stephan M.P., Debarbieux L., Previato J.O., Mendon^a-Previato L.

118. Lipopolysaccharides from six strains of Acetobacter diazotrophicus II FEMS

119. Microboil. Lett. 1995. - Vol. 132, Issue 1 - 2. - P. 45 - 50.

120. Galanos C., Luderitz 0. Electrodialysis of lipopolysaccharides and their conversion to uniform salt forms //Eur. J. Biochem. 1975. - Vol. 54. - P. 603 - 610.

121. Galanos C., Luderitz O., Rietschel E.T. Synthetic and natural Escherichia coli free lipid A express identical endotoxic activities // Eur. J. Biochem. 1985. - Vol. 148. - P. 1 - 5.

122. Garcia-del Portillo F., Stein M.A., Finlay B.B. Release of lipopolysaccharide from intracellular compartments containing Salmonela typhimurium to vesicles of the host epithelial cell // Infect. Immun. 1997. - Vol. 65. - P. 24 - 34.

123. Gervig G.J., Kamerling J.P., Vliegenthart J.F.G. Determination of the D and L configuration of neutral monosaccharides by high-resolution capillary g.l.c. // Carbohydr. Res. 1978. - Vol. 62. - P. 349 - 357.

124. Goldman R.C., Leive L. Electroforetic separation of lipopolysaccharide monomers differing in polysaccharide length // Meth. Enzymol. 1987. - Vol. 138. - P. 267 - 275.

125. Goldstein I.J., Hay J.W., Lavis B.A., Smith F. Controlled degradation of polysaccharides by periodate oxidation, reduction, and hydrolysis // Meth. Carbohydr. Chem. 1965. - Vol. 5. - P. 361 - 370.

126. Golenbock D.T., Hampton R.Y., Raetz C.R., Wright S.D. Human phagocytes have multiple lipid A-binding sites // Infect. Immun. 1990. - Vol. 58. - P. 4069 - 4075.

127. Goodman J.W. Antigenic determinants and antibody combining sites // The Antigens / Ed. M. Sela.- New York: Academic Press, 1975. Vol. 3. - P. 127 - 187.

128. Gorshkova R.P., Isakov V.V., Zubrov V.A., Ovodov Y.S. Structure of the O-specific polysaccharide of lipopolysaccharide from Yersinia bercovieri 0:10 // Bioorg. Chem. -1994.-Vol. 20.-C. 1231 1235.

129. Graham T.L., Sequeira L., Huang T.S. Bacterial lipopolysaccharides as inducers of disease resistance in tobacco // Appl. Environ. Microbiol. -1977. Vol. 34. - 424 - 432.

130. Grimmecke H.D., Voges M., Knirel Yu.A., Shashkov A.S., Lauk W., Kiesel B.

131. Structure of the capsular polysaccharide and the O-side-chain of the lipopolysaccharidefrom Acetobacter methanolicus MB 135 (IMET 11402) // Carbohydr. Res. 1994. -Vol. 253.-P. 283 -286.

132. Hakomori S.-I. A rapid permetylaion of glicolipids and polysaccharides catalyzed by methylsulfinyl carbanion in dimethylsulfoxide // J. Biochem. 1964. - Vol. 55. - P. 205 - 208.

133. Heike R.U.S., Freudenberg M., Weckesser J., Mayer H. Lipopolysaccharide of Rhodospirillum salinarum 40: structural studies on the core and lipid A region // Arch. Microbiol. 1995. - Vol. 164. - P. 280 - 289.

134. Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stain polyacrylamide gels // J. Bacteriol. -1983.-Vol. 154.-P.269-277.

135. Hoist O., Ulmer A.J., Brade H., Flad H.D., Rietschel E.T. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. - Vol. 16. - P. 83 - 104.

136. Hrabak E.M., Urbano M.R., Dazzo F.B. Growth-phasedependent immunodeterminants of Rhizobium trifolii lipopolysaccharide which bind trifoliin A, a white clover lectin // J. Bacterid. 1981.-Vol. 148.-P. 697-711.

137. Ishii J., Nakae T. Lipopolysaccharide promoted opening of the porin channel // FEBS. 1993.-Vol. 320, N 3. - P. 251 - 255.

138. Jain D., Patriquin D. Root hair deformation, bacterial attachment and plant growth in wheat-Azospirillum associations // Appl. Environ. Microbiol. 1984. - Vol. 48, N 6. -P. 1208- 1213.

139. Jansson P.E., Kenne L., Leigren H., Lindberg В., Lonngren J. A practical guide to the methylation analysis of carbohydrates // Chem. Commun. Univ. Stockholm. 1976. -Vol. 8.-P. 1-75.

140. Jansson P.E., Kenne L., Widmalm G. Computer-assisted structural analysis of ^ polysaccharides with an extended version of CASPER using 1H- and 13C-n.m.r. data //

141. Carbohydr. Res.- 1989.-Vol. 188.-P. 169 191.

142. Jofre E., Lagares A., Mori G. Disruption of dTDP-ramnose biosynthesis lipopolysaccharide core, exopolysaccharide production, and root colonization in A. brasilense IIFEMS Microbiol. Lett. 2004. - Vol. 231, N 2. - P. 267 - 275.

143. Kabat E.A. Basic principles of antigen-antibody reaction // Meth. Enzymol. Immunochemical Techniques. New York: Acad. Press, 1980. - Vol. 70. - P. 3 - 49.

144. Karibian D., Deprun C., Caroff M. Use of PDMS in Structure Analysis of Endotoxins // In Bacterial Endotoxins. Lipopolysaccharides from Genes to Therapy Use of PDMS in Structure Analysis of Endotoxins. Wyley-Liss, 1995. - P. 103 -111.

145. Karlsson C., Jansson P.E., Wollin R. Structure of the O-polysaccharide from the LPS of a Hafnia alvei strain isolated from a patient with suspect yersinosis // Carbohydr. Res. 1997. - Vol. 300. -P. 191 - 197.

146. Karpati E., Kiss P., Ponyi Т., Fendrik I., Zamaroczy M., Orosz L. Interaction of Azospirillum lipoferum with Wheat Germ Agglutinin Stimulates Nitrogen Fixation // J Bacterid.- 1999. -Vol. 181, N 13.-P. 3949-3955.

147. Kato G., Maruyama Y., Nakamura M. Role of bacterial polysaccharides in the adsorption process of the Rhizobium-pea symbiosis // Agric. Biol. Chem. 1980. -Vol. 44.-P. 2843 -2855.

148. Katsura S., Isogai A., Onabe F., Usuda M. NMR analysis of polysaccharide containing amine groups // Carbohydr. Polym. 1992. - Vol. 18. - P. 283 - 288.

149. Katzy E.I., Matora L.Yu., Serebrennikova O.B, Sheludko A.V. Involvement of a 120-MDa plasmid of Azospirillum brasilense Sp245 in the production of lipopolysaccharides // Plasmid. 1998. - Vol. 40. - P. 73 - 83.

150. Kauffmann F. The Kaufmann-White schema; diagnostic Salmonella antigen schema // Ergeb. Mikrobiol. Immunitatsforsch. Exp. Ther. 1957. - 30. - P. 160 - 216.

151. Kauffinann F., Kruger L., Luderitz 0., Westphal 0. Zur Immunchemie der O-Antigene der fc Enterobacteriaceae. VI. Verleich der Zuckerbausteine von Polysachariden aus Salmonella

152. S- und R-Fonnen // Zentralbl. Bacteriol. Parasitenk. Abt. I Orig. -1961. -182. S. 57 - 66.

153. Kauffmann F., Luderitz 0., Stierlin H., Westphal 0. Zur Immunchemie der 0-Antigene der Enterobacteriaceen. I. Analyse der Zuckerbausteine von Salmonella-O-antigenen // Zentralbl. Bakt. I Orig. 1960. - 178. - S. 442 - 458.

154. Keenleyside W.J., Perry M., Mac Lean L., Poppe C., Whitfield C. A plasmid-encoded rfb 0:54 gene cluster is required for biosynthesis of the 0:54 antigen in Salmonella enterica serovar Borreze // Mol. Microbiol. 1994. - Vol. 11. - P. 437 - 448.

155. Khammas K.M., Ageron E., Grimont P.A.D., Keiser P. Azospirillum irakense sp. Nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with rise roots and rhizosphere soil // Res. Microbiol. 1989. - Vol. 140. - P. 679 - 693.

156. Kloepper J.W., Beauchamp C.J. A review of issues related to measuring colonization of plant roots by bacteria // Can. J. Microbiol. -1992. Vol. 38. - P. 1219 - 1232.

157. Knirel Yu.A. Polysaccharide antigens of Pseudomonas aeruginosa // CRC Crit. Rev. Microbiol. 1990. - Vol. 17. - P. 273 - 304.

158. Knirel Yu.A., Ovod V.V., Paramonov N.A., Krohn K.J. Structural heterogeneity in the О polysaccharide of Pseudomonas syringae pv. coriandricola GSPB 2028 (NCPPB 3780, W-43) // Eur. J. Biochem. 1998. - Vol. 258, N 2. - P. 716 - 721.

159. Knirel Yu.A., Vinogradov E.V., Mort A.J. Applicatoin of anhydrous hydrogen fluoride for the structural analysis of polysaccharides // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1989. - Vol. 47. - P. 167 - 202.

160. Koch A.L. The biophysics of gram-negative periplasmic space // Crit. Rev. Microbiol. 1998. - Vol. 24. - P. 23 - 59.

161. Koch A.L., Woeste S.W. The elasticity of the sacculus of Esherichia coli // J. Bacteriol. 1992. - Vol. 174. - P. 4811 - 4819.

162. Kocharova N.A., Blaszczyk A., Zatonsky G.V., Torzewska A., Bystrova O.V., Shashkov A.S., Knirel Yu.A. Structure and cross-reactivity of the O-antigen of

163. Providencia stuartii 018 containing 3-acetamido-3,6-dideoxy-D-glucose and Antoni \ Rozalskib // Carbohydr. Res. 2004. - Vol. 339. - P. 409 - 413.

164. Kondo S., Hisatsune K. Rapid preparation of samples for compositional sugar analysis of the "degraded polysaccharide" fraction of lipopolysaccharides from Vibrio cholerae II Microbiol. Immunol. 1988. - Vol. 32. - P. 907 - 915.

165. Kosslak R.M., Blohlool B.B. Prevalence of Azospirillum spp. In the rhizosphere of tropical plants // Can. J. Microbiol. 1983. - 29. - P. 629 - 639.

166. Krieg N.R., Dobereiner J. Genus Azospirillum II Bergey's manual of systematic bacteriology / Eds. Krieg N.R, Holt J.G. Baltimore: Williams and Wilkins, 1984. -P. 94- 104.

167. Kuhn H.M., Meier-Dieter U., Mayer H. ECA, the enterobacterial common antigen // FEMS Microbiol. Rev. 1988. Vol. 4, N 3. - P. 195 - 222.

168. Lagares A., Caetano-Anolles G., Niehaus K., Lorenzen J., Ljunggren H.D., Puhler A., Favelukes G.A Rhizobium meliloti lipopolysaccharide mutant altered in competitiveness for nodulation of alfalfa I I J. Bacterid. 1992. - Vol. 174. - P. 5941 - 5952.

169. Lanyi В., Bergan T. Serological characterization of Pseudomonas aeruginosa II In Methods in Microbiology / Eds. Bergan Т., Norris J.R. Vol. 10. - Academic Press, Inc: London, 1978.-P. 94 - 168.К

170. Lebbar S., Haeffner-Cavaillon N., Karibian D., Le- Beyec Y., Caroff M. 252Cf-plasma desorption mass spectrometry analysis of lipids A obtained by an elimination reaction under mild conditions // Rapid. Commun. Mass Spectrom. 1995. Vol. 9. -P. 693-696.

171. Leontein K., Lindberg В., Lonngren J. Assigment of absolute configuration of sugars by g.l.c. of their acetylated glycosides formed from chiral alcohols // Carbohydr. Res. 1978.-Vol. 62.-P. 359-362.

172. Lerouge I., Vanderleyden J. O-antigen structural variation and possible roles in animal/plant-microbe interactions // FEMS Microbiol. Rev. 2001. - Vol. 26. - P. 17-47.

173. Levanony H., Bashan Y., Kahana Z.E. Enzyme-linked immunosorbent assay for specific identification and enumeration of Azospirillum brasilense Cd in cereal roots // Appl. Environ. Microbiol. 1987. - V. 53. - P. 358 - 364.

174. Leve L., Shovlin V.K., Mergenhagen S.E. Physical, chemical and immunological properties of lipopolysaccharides released from Escherichia coli by ethylenediaminetetraacetate // J. Biol. Chem. 1968. - Vol. 243. - P. 6384 - 6391.

175. Lindberg A.A., Holme T. Evaluation of some extraction methods for the preparation of bacterial lipopolysaccharides for structural analysis // Microbiol. Immunol. 1972. -Vol. 80.-P. 751 -759.

176. Lipkind G.M., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Vinogradov E.V., Kochetkov N.K. A computer-assisted structural analysis of regular polysaccharides on the basis of I3C-n.m.r. data // Carbohydr. Res. 1988. - Vol. 175. - P. 59 - 75.

177. Lipkind G.M., Shashkov A.S., Mamyan S.S., Kochetkov N.K. The nuclear Overhauser effect and structural factors determining the conformations of disaccharide glycosides // Carbohydr. Res. 1988. - Vol. 181. - P. 1 - 12.

178. Luderitz 0., Freudenberg M.A., Galanos C., Zehmann K., Rietschel E.T., ShawD.H. Lipopolysaccharide of gram-negative bacteria // Curr. Top. Membr. Transport. 1982. - Vol. 17. - P. 79 - 134.

179. Luderitz O., Jann K., Wheat R. Somatic and capsular antigens of gram-negative bacteria // In: Comprehensive Biochemistry / Eds. Florkin M., Stotz E.H. Amsterdam: Elsevier Publishing Company. - 1968. - P. 105 - 228.

180. Luderitz O., Staub A.M., Westphal 0. Immunochemistry og О and R antigens of Salmonella and related Enterobacteriaceae II Bacteriol. Rev. 1966. - P. 192.

181. Magalhaes F.M., Baldani J.I., Souto S.M., Kuykendall J.R., Dobereiner J. A new acid-^ tolerant Azospirillum species // An. Acad. Bras. Cienc. 1983. - Vol. 55. - P. 417 - 430.

182. Magalhaes F.M., Dobereiner J. Ocorrencia de Azospirillum amazonense em alguns ecossistemas da Amazonia // Rev. Microbiol. 1984. - Vol. 15. - P. 246 - 252.

183. Maitra S.K., Nachum R., Pearson F.C. Establishment of beta-hydroxy fatty acids as chemical marker molecules for bacterial endotoxin by gas chromatography-mass spectrometry// Appl. Environ. Microbiol. 1986. - Vol. 52. - P. 510-514.

184. Matora L.Yu., Serebrennikova O.B., Shchyogolev S.Y. Structural effects of the Azospirillum lipopolysaccharides in cell suspensions // Biomacromol. 2001. -Vol. 2, N2.-P. 402-406.

185. Mayer H., Tharanathan R.N., Weckesser J. Analysis of lipopolysaccharides of Gram-negative bacteria // Meth. Microbiol. 1985. - Vol. 18. - P. 157 - 207.

186. Medzhitov R., Janeway Jr., C. The Toll receptor family and microbial recognition // Trends Microbiol. 2000. - Vol. 8. - P. 452 - 456.

187. Michiels K.W., Crors C.L., Vanderleyden J. Two different modes of attachment of Azospirillum brasilense Sp7 to wheat roots // J. Gen. Microbiol. 1991. - Vol. 137. -P. 2241 -2246.

188. Milla M.E., Raetz C.R.H. Assotiation of lipid A disaccharide synthase with aerobic glycerol-3-phosphate degydrogenase in extracts of Escherichia coli // Biochim. Biophys. Acta. 1996. - 1304. - C. 245 - 253.

189. Moens S., Michiels K., Keijers V., Van Leuven F., Vanderleyden J. Cloning, ^ sequencing and phenotypic analysis of lafl, encoding flagellin of the lateral flagella of

190. Azospirillum brasilense Sp7 // J. Bacteriol. 1995. - Vol. 177. - P. 5419 - 5429.

191. Moens S., Vanderleyden J. Function of bacterial flagella // Crit. Rev. Microbiol. -1996.-Vol. 22.-P. 67- 100.

192. Morgan W.T.J., Partridge S.M. Studies in immunochemistry. 6. The use of phenol and of alkali in the degradation of antigenic material isolated from Bad. dysenteriae (Shiga)//Biochem. J. 1941. - Vol. 35. - P. 407 - 417.

193. Munford R.S., Varley A.W. Shield as Signal: Lipopolysaccharides and the Evolution of Immunity to Gram-Negative Bacteria // PLoS Pathogens. 2006. - Vol. 2, Issue 6.-P. 467 -471.

194. Newman M.A., Dow J.M., Daniels M.J. Bacterial lipopolysaccharides and plant-pathogen interactions // Eur. J. Plant Pathol. 2001. - Vol. 107. - P. 95 - 102.

195. Newman M.A., Van Roepenack E., Daniels M., Dow M. Lipopolysaccharides and plant responses to phytopathogenic bacteria // Plant Pathol. 2000. - Vol. 1. - P. 25 - 31.

196. Nikaido H., Vaara M. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability // Microbiol. Rev. 1985. - Vol. 49. - P. 1 - 32.

197. Noel K.D., Forsberg L.S., Carlson R.W. Varying the abundance of О antigen in Rhizobium etli and its eject on symbiosis with phaseolus vulgaris // J. Bacteriol. 2000. -Vol. 182.-P. 5317- 5324.

198. Noel K.D., Vanden Bosch K.A., Kulpaca B. Mutations in Rhizobium phaseoli that lead to arrested development of infection threads // J. Bacteriol. 1986. - Vol. 168. -P. 1392- 1401.

199. Okon Y., Vanderleyden J. Root-associated Azospirillum species can stimulate plants // ASM News. -1997. Vol. 63. - P. 366 - 370.

200. Old L.J. Der Tumor-Nekrose-Faktor // Spektrum Wiss.- 1988.-Vol. 7.-P. 42-51.

201. Ouchterlony O., Nilsson L.-A. // Handbook Experimental Immunology / Ed. Weiz D.M. Oxford: AldenPress, 1979.-Vol. 1.-P. 19-33.Щ

202. Ovod V.V., Knirel Yu.A., Samson R., Krohn K.J. Immunochemical } Characterization and taxonomic evaluation of the О Polysaccharides of thelipopolysaccharides of Pseudomonas syringae serogroup 01 strains // J. Bacteriol. -1999.-Vol. 181.-P. 6937-6947.

203. Parker J.H., Smith G.A., Fredrickson H.L., Vestal J.R., White D.C. Sensitive assay, based on hydroxy fatty acids from lipopolysaccharide lipid A, for Gram-negative bacteria in sediments II Appl. Environ. Microbiol. 1982. - Vol. 44. - P. 1170 - 1177.

204. Patriquin D.G., Dobereiner J., Jain D.K. Sites and processes of association between diazotrophs and grasses // Can. J. Microbiol. 1983. - Vol. 29. - P. 900 - 915.

205. Peng G., Wang H., Zhang G., Hou W., Liu Y., Wang E. Т., Tan Z. Azospirillum melinis sp. nov., a group of diazotrophs isolated from tropical molasses grass // Int J. Syst.Evol. Microbiol.-2006.-Vol. 56.-P. 1263 1271.

206. Perepelov A.V., Babicka D., Shashkov A.S., Arbatsky N.P., Senchenkova S.N., Rozalsky A., Knirel Yu.A. Structure and cross-reactivity of the O-antigen of Proteus vulgaris 08 // Carbohydr. Res. 1999.- Vol. 318. -P. 186- 192.

207. Pfeiffer R. Untersuchungen uber das Choleragift // Z. Hygiene. 1892. - 11. - S. 393 - 412.

208. Pier G.B. Promises and pitfalls of Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharideas a vaccine antigen // Carbohydr. Res. 2003. - Vol. 338. - P. 2549 - 2556.

209. Plasinsky J., Rolfe B.G. Analysis of pectolytic activity of Rhisobium and Azospirillum strains isolated from Trifolium repens // J. Plant. Physiol. -1985. -Vol. 120.-P. 181-187.

210. Reeves P.R., Hobbs M., Valvano M.A., Skumik M., Whitfield C., Coplin D., KidoN., Kiena J., Macskell D., Raetz C.R.H., Rick P.D. Bacterial polysaccharide synthesis and gene nomenclature // Trends Microbiol. 1996. Vol. 4, N12. - P. 495 - 503.

211. Rietschel E.T., Brade L. Bakterielle Endotoxine // Spektrum Wiss. 1993. -Vol. l.-P. 34-42.

212. Rietschel E.T., Westphal O. Endotoxin: historical perspectives // Entoxin in Health and Disease / Eds. H. Brade, S.M. Opal, S.N. Vogel, D.C. Morrisson. New York: Marcel Dekker, 1999.-P. 1 - 30.

213. Rivera M., McGroaty E.J. Analysis of a Common-Antigen Lipopolysaccharide from Pseudomonas aeruginosa // J. Bacteriol. 1989. - Vol. 171, N 4. - P. 2244 - 2248.

214. Roppll J., Mayer H., Weckesser J. Identification of a 2,3-diamino-2,3-dideoxyhexose in the lipid A component of lipopolysaccharides // Carbohydr. Res. -1975.-Vol. 40, №1.-P. 31 -40.

215. Russa R., Urbanic-Sypniewska Т., Lindstrom K., Mayer H. The structure of the homopolymeric O-specific chain from the phenol soluble LPS of the Rhizobium loti type strain NZP 2213 // Carbohydr. Polym. 1995. - Vol. 27. - P. 299 - 303.

216. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. -2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

217. Savardecker J.S, Sloneker J.H., Jeans A. Quantitative determination of monosaccharides as their alditol acetates by gas liquid chromatography // Anal. Chem. -1965.-Vol. 37.-P. 1602-1603.

218. Schloter M., Bode W., Hartmann A. Characterization of monoclonal antibodies against cell surface structures of Azospirillum brasilense Sp 7 using ELISA Techniques // Symbiosis. 1992. - Vol. 13. - P. 37 - 45.

219. Schloter M., Hartmann A. Production and characterization of strain specific monoclonal antibodies against outer membrane components of Azospirillum brasilence Sp245 // Hybridoma. 1996. - 15. - P. 225 - 232.

220. Sequeira L. Mechanisms of induced resistance in plants // Annu. Rev. Microbiol. -1983. Vol. 37. - P. 51 - 79.

221. Shashkov A.S., Lipkind G.M., Knirel Yu.A., Kochetkov N.K. Stereochemical13factors determining the effects of glycosylation on the С chemical shifts in carbohydrates // Magn. Reson. Chem. 1988. - Vol. 26. - P. 735 - 747.

222. Shear M.J., Turner F.C. Chemical treatment of tumors. V. Isolation of the hemorrage-producting fractions from Serratia marcescens {Bacillus prodigiosus) culture filtrate // J. Natl. Cancer Inst. 1943. - 43. - P. 81 - 97.

223. Skurnik M., Bengoecheab J.A. The biosynthesis and biological role of lipopolysaccharide O-antigens of pathogenic Yersiniae // Carbohydr. Res. 2003. -Vol. 338.-P. 2521 -2529.

224. Skvortsov I.M., Ignatov V.V. Extracellular polysaccharides and polysaccharide-containing biopolymers from Azospirillum species: properties and the possible role in interaction with plant roots // FEMS Microbiol. Lett. 1998. - Vol. 165. - P. 223 - 229.

225. Sletmoen M., Maurstad G., Sikorski P., Paulsen B.S., Stokke B.T. Characterisation of bacterial polysaccharides: steps towards singlemolecular studies // Carbohydr. Res. -2003. Vol. 338. - P. 2459 - 2475.

226. Sly L.I., Stackebrandt E. Description of Skermanella parooensis gen. Nov. sp. Nov. to accommodate Congrlomeromonas largomobilis subsp. Largomobilis to the genus Azospirillum II Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. - Vol. 49. - P. 541 - 544.

227. Stead D.E. Grouping of plant-pathogenic and some other Pseudomonas spp. by using cellular fatty acid profiles // Int. J. Syst. Bacteriol. 1992. - Vol. 42, № 2. - P. 281 - 295.

228. Steenhoudt O., Vanderleyden J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects // FEMS Microbiol. Rev. 2000. - Vol. 24. - P. 487 - 506.

229. Sutherland I.W. Bacterial exopolysaccharides // Adv. Microbiol. Physiol. 1972. -Vol. 8.-P. 143-210.

230. Sutherland I.W. Biosynthesis of microbial exopolysaccharides // Adv. Microbiol. Physiol. 1982 - Vol. 23. - P. 79 - 150.

231. Tien T.M., Diem H.G., Gaskins M.H., Hubbell D.H. Polygalacturonic acid transeliminase production by Azospirillum species // Can. J. Microbiol. 1981. -Vol. 27.-P. 429 -431.

232. Tien T.M., Gaskins H.M., Hubbell D.H. Plant growth substances prodused by Azospirillum brasilense and their effect on the growth of Pearl millet II Appl. Environ. Microbiol.- 1979.-Vol. 37.-P. 1016- 1024.

233. Tsai C.M., Frasch C.E. A sensitive silver stain for delecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels // Anal. Biochem. 1982. - Vol. 119. - P. 115 - 119.

234. Tsang V.C.W., Peralta J.M., Simons A.R. Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot technique (ELISA) for studying the specificities of antigens and antibodies separated by gel electrophoresis // Meth. Enzymol. 1983. - 92. - P. 377 - 391.

235. Umali-Garsia M., Hubbel D.H., Gaskins M.H., Dazzo F.B. Association of Azospirillum with grass roots // Appl. Environ. Microbiol. 1980. - Vol. 39. - P. 219-226.

236. Van Loon L.C., Bakker P.A.H.M., Pieterse C.M.J. Systemic resistance induced by rhizosphere bacteria // Annu. Rev. Phytopathol. 1998. - Vol. 36. - P. 453 - 483.

237. Vande Brock A., Lambrecht A., Vanderleyden J. Bacterial chemotactic motility is p important for the initiation of wheat root colonization by Azospirillum brasilense II

238. Microbiol. 1998. - Vol. 144. - P. 2599 - 2606.

239. Vinogradov E.V., Brade L., Brade H., Holstb 0. Structural and serological characterisation of the O-antigenic polysaccharide of the lipopolysaccharide from Acinetobacter baumannii strain 24 // Carbohydr. Res. 2003a. - Vol. 338. - P. 2751 - 2756.

240. Vinogradov E., Korenevsky A., Beveridge T.J. The structure of the O-specific polysaccharide chain of the Shewanella algae BrY lipopolysaccharide // Carbohydr. Res. 20036. - Vol. 338. - P. 385 - 388.

241. Vinogradov E.V., Bock K., Hoist 0., Brade H. The structure of the lipid A-core region of the lipopolysaccharides from Vibrio cholerae 01 smooth strain 569B (Inaba) and rough mutant strain 95R (Ogawa)//Eur. J. Biochem. 1995.- Vol. 233.-P. 152- 158.

242. Wang Z., Li J., Vinogradov E., Altman E. Structural studies of the core region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide // Carbohydr. Res. -2006.-Vol. 341.-P. 109-117.

243. Weckesser J., Mayer H. Different lipid A types in lipopolysaccharides of phototrophic and related non-phototrophic bacteria // FEMS Microbiol. Rev. 1988. -Vol. 54, N 2. - P. 143 - 154.

244. Weintraub A. Immunology of bacterial polysaccharide antigens // Carbohydr. Res. -2003. Vol. 338. - P. 2539 - 2547.

245. Westphal 0., Jann К. Bacterial lipopolysaccharides. Extraction with phenol-water and further applications of the procedure // Meth. Carbohydr. Chem. 1965. - Vol. 5. -P. 83-91.

246. Westphal 0., Liideritz 0. Chemische Erforschung von Lipopolysacchariden Gram-negativer Bacterien // Angew. Chem. 1954. - Vol. 66. - P. 407 - 417.

247. Westphal 0., Liideritz 0., Bister F.Z. Uber die Extraktion von Bakterien mit Phenol/Wasser // Z. Naturforsh: Anorg. Chem., Org. Chem., Biochem., Biophys., Biol.-1952.-Bd.7B.-S. 148 155.

248. Whitfield C., Paiment A. Biosynthesis and assembly of Group 1 capsular polysaccharides in Escherichia coli and related extracellular polysaccharides in other Bacteria// Carbohydr. Res. 2003. - Vol. 338. - P. 2491 - 2502.

249. Wiese A., Seydel U. Interaction of peptides and proteins with bacterial surface glycolipids: a comparison of glycosphingolipids and lipopolysaccharides // J. Ind. Microbiol. & Biotechnol. 1999. - Vol. 23. - P. 414 - 424.

250. Wilkinson S.G. Bacterial lipopolysaccharides themes and variation // Prog. Lipid Res. - 1996. - Vol. 35, N 3. - P. 283 - 343.

251. Xie C.H., Yokota A. Azospirillum oryzae sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from the roots of the rice plant Oryza sativa // Int. Syst. Evol. Microbiol. 2005- Vol. 55, Pt 4.-P. 1435- 1438.

252. Yokota A., Rodrigues M., Yamata I. Lipopolysaccharides of chemolithotrophic bacteria Thiobacillus species containing lipid A with 2,3-diamino-2,3-didideoxyglucose //Arch. Microbiol. 1987. - Vol. 149, N2. - P. 106 - 111.

253. Zdorovenko E.L., Varbanets L.D., Zatonsky G.V., Ostapchuk A.N. Structures of two putative O-specific polysaccharides from the Rahnella aquatilis 3-95 lipopolysaccharide//Carbohydr. Res. -2006. Vol. 341. - P. 164 - 168.

Информация о работе

Коннова, Ольга Николаевна
кандидата биологических наук
Саратов, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Сравнительное исследование липополисахаридов и структуры О-специфических полисахаридов бактерий рода Azospirillum - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы