Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние флавоноидов на состав и структуру гликополимеров поверхности азоспирилл

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние флавоноидов на состав и структуру гликополимеров поверхности азоспирилл"

На правах рукописи

Каневский Матвей Владимирович

ВЛИЯНИЕ ФЛАВОНОИДОВ НА СОСТАВ И СТРУКТУРУ ГЛИКОПОЛИМЕРОВ ПОВЕРХНОСТИ АЗОСПИРИЛЛ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

11 КАР 2015

Саратов-2015

005560273

005560273

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» (СГУ)

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Коннова Светлана Анатольевна

доктор биологических наук, профессор

Федеральное государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования

«Саратовский государственный университет

имени Н.Г. Чернышевского»,

кафедра биохимии и биофизики,

заведующая кафедрой

Грабович Маргарита Юрьевна

доктор биологических наук, профессор

Федеральное государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования

«Воронежский государственный университет»,

биолого-почвенный факультет

кафедра биохимии и физиологии клетки,

профессор кафедры

Заднова Светлана Петровна

доктор биологических наук

Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лаборатория патогенных вибрионов, ведущий научный сотрудник

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, г. Москва

Защита состоится «22» апреля 2015 года в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук по адресу: 410049 Саратов, пр. Энтузиастов, 13. Тел./факс (8452) 970383

Автореферат диссертации размещён на официальном сайте Минобрнауки РФ. Диссертация и автореферат размещены на сайте ИБФРМ РАН: http://ibppm.ni/dissertacionnyy-sovet/

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат разослан » 2015 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук ' H.H. Позднякова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Для управления процессом стимуляции бактериями роста и урожайности растений необходимо понимание механизма их взаимного влияния на молекулярном уровне. Наиболее изученным в этом плане является бобово-ризобиальный симбиоз, для которого известна схема обмена молекулярными сигналами между растениями и бактериями, приводящего к формированию клубеньков, заселённых селективными азотфиксирующими ризобиями (Lerouge, 1994; Cooper, 2004). В бобово-ризобиальном симбиозе при формировании симбиосом в качестве ключевых растительных сигнальных молекул выступают фенольные соединения - флавоноиды, а со стороны бактерий nod-факторы (Спайнк и др., 2002). Для ризобий показано изменение состава и структуры гликополимеров поверхности в процессе формирования симбиоза, а также в присутствии экссудатов корней растений, и эти изменения происходят под влиянием флавоноидов (Scotti et al., 1997; Broughton et al., 2006). В процессе адаптации к условиям окружающей среды, в том числе и при формировании другой формы растительно-бактериального симбиоза - ассоциации, важная роль принадлежит макромолекулам гликополимеров, представленным на поверхности клеток микроорганизмов. Преобладающими компонентами внешней мембраны грамотрицательных микроорганизмов, занимающими до 75% площади поверхности бактериальной клетки, являются липополисахариды (ЛПС) (Lerouge and Vanderleyden, 2001; Caroff and Caribian, 2003; Fraysse et al., 2003).

Для бактерий рода Azospirillum - типичных представителей ассоциативных азотфиксаторов - были получены результаты, подтверждающие участие ЛПС и капсульных полисахаридов (КПС) в формировании взаимоотношений с растением на стадиях узнавания микроорганизма корнями растения-ассоцианта, агрегации бактерий и прикрепления к поверхности корня (Konnova et al., 1994; Matora et al., 1995, 2001; Федоненко и др., 2001; Коннова и др., 2005). Ранее было обнаружено явление таксиса азоспирилл к ароматическим соединениям, в том числе и к флавоноидам (Lopez-de-Victoria and Lovell, 1993), но в отличие от

бобово-ризобиального симбиоза, не установлено строгой специфичности при формировании пары растение-бактерия, основанной на составе экскретируемых флавоноидов (Baldani and Debereiner, 1980; Rocha et al., 1981).

В научной литературе присутствуют единичные данные об изменении электрофоретического профиля ЛПС и состава экзополисахаридов (ЭПС) азо-спирилл, под влиянием корневых экссудатов пшеницы, содержащих флавонои-ды (Fischer et al., 2003). Однако роль флавоновых веществ в ассоциативных взаимоотношениях, в частности, особенности влияния флавоноидов на состав и структуру гликанов поверхности ассоциативных азотфиксаторов остаётся практически не изученной.

Цель работы — выявление изменений в составе, структуре и антигенных свойствах гликополимеров поверхности бактерий рода Azospirillum под влиянием флавоноидов.

Для реализации поставленной цели в ходе исследования решались следующие задачи:

1. Определение эффективных концентраций коммерческих препаратов флавоноидов (рутина и кверцетина), вызывающих изменения физико-химических и антигенных свойств поверхности бактерий A. brasilense Sp7, Sp245, SR55 и A. lipoferum Sp59b.

2. Сравнительное исследование биологической активности флавоноидов и экстрактов корней пшеницы в отношении исследуемых бактерий рода Azospirillum.

3. Изучение изменений химического состава гликополимеров поверхности азоспирилл, наблюдающихся при добавлении рутина и кверцетина в среду выращивания бактерий.

4. Анализ структуры ОПС бактерий A. brasilense SR55 и A. lipoferum Sp59b, культивируемых в присутствии флавоноидов.

Научная новизна работы. Впервые выявлены изменения состава и структуры гликополимеров поверхности азоспирилл, обусловленные присутствием в среде их выращивания флавоноидов. Определены штаммовые разли-

чия концентраций флавоноидов, индуцирующих изменения гидрофобности, антигенных, электрооптических свойств бактерий, а также электрофоретических характеристик гликанов поверхности азоспирилл.

Установлены структурные особенности О-специфического полисахарида (ОПС) азоспирилл, синтез которых индуцирован присутствием флавоноидов, идентифицированных в составе корневых экссудатов растений-ассоциантов. Выявленные изменения состава и структуры ЛПС азоспирилл, индуцированные кверцетином, могут свидетельствовать об участии флавоновых метаболитов в реализации ассоциативных взаимодействий, опосредованных гликополимерами микроорганизов.

Научно-практическая значимость.

Исследование структурных особенностей ЛПС бактерий рода А:озр1гШит, индуцированных влиянием растительных метаболитов, необходимы для понимания молекулярных процессов образования растительно-микробных ассоциаций. Показанные возможности модификации состава и структуры гликополимеров поверхности азоспирилл, повышения активности агрегации бактерий под влиянием вторичных метаболитов растений фенольной природы могут быть востребованы при оптимизации технологии создания микробных биоудобрений - альтернативы химическим удобрениям. Установлено, что проведение электрофоретического исследования ЭДТА-экстрактов клеток азоспирилл в сочетании с анализом физико-химических свойств суспензий клеток может быть использовано для скрининга изменений структуры ЛПС бактерий в ходе адаптации к условиям существования.

Материалы диссертации используются в учебном процессе на биологическом факультете СГУ имени Н.Г. Чернышевского в преподавании специальных курсов «Основы гликологии», «Взаимодействие растений и микроорганизмов», «Биологические мембраны». В соавторстве с сотрудниками кафедры биохимии и биофизики для студентов биологического факультета СГУ подготовлено учебно-методическое пособие: «Методы выделения и анализа флавоноидов высших растений и исследования их активности в отношении ризобактерий»,

рекомендованное к публикации Учебно-методической комиссией учёного совета биологического факультета СГУ. Работа выполнена при частичной поддержке фангами РФФИ (проекты 11-04-00533 2011-2013 г., 14-04-01658 2014-2016 г.).

Личный вклад соискателя. Автор участвовал лично в планировании и проведении экспериментов, обсуждении полученных результатов, формулировании выводов и подготовке публикаций. Автор проводил теоретические исследования и основные эксперименты, связанные с бактериальными культурами, выделением, очисткой и химическими анализами ЛПС, ОПС и КПС. Экстракты корней и результаты содержания в них суммы фенольных соединений были получены совместно с сотрудниками кафедры биохимии и биофизики Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского, иммуно-химические анализы выполнены в совместных исследованиях с сотрудниками лабораторий биохимии и иммунохимии Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН), анализы методом ГЖХ проводились совместно с сотрудниками лаборатории экологической биотехнологии ИБФРМ РАН, анализы электрооптических свойств бактериальных суспензий были проведены совместно с сотрудниками лаборатории физиологии микробной клетки ИБФРМ РАН, анализы методом ЯМР-спектроскопии выполнены в ходе совместной работы с сотрудниками лаборатории химии углеводов Института органической химии им. Н.Д. Зелинского Российской академии наук (ИОХ РАН). Автор выражает глубокую признательность всем коллегам за содействие в выполнении указанных исследований.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Флавоноиды - кверцетин и рутин - добавленные в среду выращивания в эффективных концентрациях, индуцируют изменения физико-химических и антигенных свойств бактериальной поверхности ассоциативных азот-фиксаторов рода А:о$р1гШит.

2. Действие флавоноидов на азоспириллы реализуется в изменении макромо-лекулярной организации, моносахаридного состава, соотношения и состава жирных кислот ЛПС бактерий.

3. Вторичный метаболит растений - кверцетин при воздействии на типовой штамм A. lipoferum Sp59b индуцирует синтез О-специфического полисахарида, идентичного по структуре капсульному полисахариду этих бактерий, выращенных в стандартных условиях.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 работ в отечественных и зарубежных научных изданиях, из них 4 статьи в журналах из Перечня, рекомендованного ВАК РФ для публикации результатов диссертационных исследований.

Апробация работы. Результаты исследований, изложенные в диссертации, были представлены на шести всероссийских и восьми международных конференциях: VIII Международном симпозиуме по фенольным соединениям растений «Фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, Россия, 2012 гг.); V и VI Всероссийских конференциях молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2010 и 2012 гг.); IV Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, Россия, 2011 г.); VI Молодёжной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, Россия, 2010 г.); 5-ой Конференции стран Балтии по микробным полисахаридам (Суздаль, Россия, 2012 г.); 3-ей Международной научно-практической конференции: «Перспективы развития науки в XXI веке» (Махачкала, Россия, 2013 г.); 17-ой и 18-ой Международных Пущинских школах-конференциях молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 2013 и 2014 гг.); Международной конференции «Адаптационные стратегии живых систем» (Новый Свет, Россия, 2014 г.); 2-ой Всероссийской конференции «Фундаментальная гликобиология» (Саратов, Россия, 2014 г.). Стендовый доклад «Влияние кверцетина на химический состав и структуру липопо-лисахарида Azospirillum lipoferum Sp59b» на VI всероссийской конференции молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2012 г.) удостоен диплома первой степени.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, 2-х глав с изложением результатов исследований и их обсуждением, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 241 источник, в том числе 58 - на русском языке. Работа изложена на 127 страницах, иллюстрирована 23 рисунками и 7 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1 Обзор литературы содержит сведения об азоспириллах, модельных объектах изучения ассоциативного симбиоза, и гликанах их поверхности, играющих важную роль в растительно-микробных отношениях. Приведена информация о классификации флавоноидов, а также их роли в симбиотических отношениях. Обзор включает актуальную информацию об известных структурах ОПС азоспирилл.

Глава 2 Материалы и методы

Бактерии A. lipoferum штамм Sp59b и A. brasilense штаммы Sp7, Sp245 и SR55, предоставленные коллекцией микробных культур ИБФРМ РАН, культивировали до окончания экспоненциальной фазы роста в жидкой синтетической среде с малатом натрия (контроль) и в присутствии флавоноидов. ЛПС с поверхности клеток выделяли ЭДТА-содержащим буфером (Leive et al., 1968) с последующим электрофоретическим разделением экстрактов в ПААГ (Hitchcock and Brown, 1983). Окрашивание гелей проводили нитратом серебра для визуализации углеводов (Tsai and Frasch, 1982) и белков (Bloom et al., 1987). Для исследования изменений антигенного состава гликанов поверхности применяли методы иммуноферментного анализа (ИФА), иммунодота и иммуноблоттинга с использованием поликлональных кроличьих антител к препаратам ЛПС и к капсульному компоненту - липополисахарид-белковому комплексу (ЛПБК) гомологичных культур. Исследование ориентационных спектров (ОС) клеток проводили в соответствии с методикой, описанной в работе Гулий с соавторами (2008). Исследование относительной гидрофобности поверхности бактериальных клеток выполняли с использованием теста солевой агрегации (Lindahl et al., 1981). Экстракты корней 10-суточных растений пшеницы сорта Саратовская

29 получали обработкой корневых гомогенатов убывающими концентрациями этанола (Лесовая и др., 2005). Определение суммы растворимых фенольных соединений осуществляли по методу Фолина и Чокальтеу в модификации Син-глетона и Росси (Сибгаттулина и др., 2011).

КПС азоспирилл получали с помощью гель-фильтрации на колонке с Se-pharose CL-4B капсульного материала, смытого с поверхности бактерий путём суспендирования в 0.15 М растворе NaCI в течение 5 суток с ежедневной заменой отмывающего раствора. ЛПС экстрагировали из высушенных ацетоном бескапсульных клеток горячим 45% фенолом (Кульшин и др., 1987). Определение в препаратах ЛПС углеводов, белков, фосфора и 2-кето-З-дезоксиоктоновой кислоты (КДО) выполняли колориметрическими методами аналогично (Коппо-va et al., 1994). ОПС получали мягкой кислотной деградацией ЛПС (2% АсОН, 4 ч, 100°С). Анализ жирных кислот (ЖК) проводили методом ГЖХ их метиловых эфиров (Mayer et al., 1985). Определение моносахаридного состава выполняли методом ГЖХ ацетатов полиолов (Savadecker et al., 1965) и ацетилирован-ных 2-окгилгликозидов (Leontein et al., 1978). Анализ методом спектроскопии ЯМР выполняли на спектрометре DRX-500 ("Bruker", Германия) в растворе 99.96% D20 при 27°С (внутренний стандарт - ацетон, 5Н 2.225, 5С 31.45). Результаты исследований подвергали статистической обработке (Лакин, 1980). Доверительный интервал рассчитывали для 95%-ного уровня значимости. Расчеты проводили с помощью стандартного пакета программ MS Exel 2007.

Глава 3 Исследование влняния флавоноидов на свойства поверхности бактерий рода Azospirillum

При выборе пары бактерия - метаболит растений исходили из того, что в составе корневых экссудатов злаковых растений присутствует (в числе прочих флавоноидов) кверцетин (Winkel-Shirley, 2001; Calzuola et al., 2004; Pothier et al., 2007; Matus et al., 2008), который является распространённым представителем вторичных метаболитов растений. Для сравнения были использованы широко представленный в почве гликозид кверцетина - рутин (Cezco et al., 2012), обладающий более гидрофильными свойствами, и нарингенин - более гидро-

фобное соединение. Эксперименты выполнялись на микроорганизмах, принадлежащих к 2 наиболее изученным видам азоспирилл: А. Про/егит штамм Яр59Ь и А. brasilen.se штаммы 8р7, Яр245 и 8Я55. Для всех четырёх штаммов ранее установлены структуры повторяющихся звеньев ОПС (Реёопепко <?/ а/., 2002, 2005; Воуко е/ а/., 2011; 81£1<1а et а!., 2013) и выявлена их принадлежность к 3 серогруппам (Бойко и др., 2010; Федоненко и др., 2011). А. Про/егит 8р59Ь и А. ЬгаяНепзе Бр7 являются типовыми штаммами соответствующих видов. Для штамма А. Про/егит Бр59Ь также установлены редкие для азоспирилл различия в составе и структуре КПС и ЛПС (Смолькина и др., 2010). А. ЬгахИете Бр245 отличается стратегией взаимодействия с растением-хозяином: он является эн-дофитным штаммом. А. ЬгаяИепье БЯ55 интересен тем, что изолирован из ризосферы твёрдой пшеницы, и повторяющееся звено его ОПС представлено разветвлённым октасахаридом, нетипичным для ассоциированных с пшеницей азоспирилл (Бойко и др., 2010).

Анализ литературных данных о содержании флавоноидов в почве и ризосфере, а также результаты предварительных экспериментов с бактериями, выращенными при различных концентрациях флавоноидов (кверцетина и рутина), а именно: изменения электрофоретических профилей ЛПС азоспирилл; антигенных свойств поверхности этих бактерий; электроориентрационных спектров их клеточных суспензий - позволили выбрать эффективные концентрации флавоноидов, при которых культуры по указанным скрининговым параметрам отличались от контрольных. Было показано, что под действием флавоноидов в определённых эффективных концентрациях происходит изменение соотношения молекул ЛПС с разной длиной Оцепи в мембранном пуле (Рисунок 1). Выявлена штаммовая вариабельность величин эффективных концентраций флавоноидов. Проводились эксперименты и со спиртовыми экстрактами корней (Рисунок 1, трек 5) 10-ти дневных растений пшеницы, содержащими комплекс фе-нольных соединений пшеницы в близких к эффективным концентрациях, которые позволили обнаружить изменения электрофоретического профиля ЭДТА экстрактов ЛПС А. Ьгазйете 5Я55, подобные, но не идентичные таковым, ин-

дуцированным кверцетином. Последнее, возможно, связано с синергетическим эффектом действия комплекса фенольных соединений корней на бактерии.

К 1 2 К 3 4 К 5 6 7 К 8 9

^чи^вяэд1 ИМ в" "*>' ЧИР ■»V ячг МШНКИ

К - Контроль 1 —(2 62.5 мкМ

2-Я 125 мкМ

3-(2 62.5 мкМ

4-Я 62.5 мкМ

5 - корневые экстракты

6-С>62.5 мкМ 7 - Я 125 мкМ 8-01мМ

9 - Я 500 мкМ

5р245

8р7

БЯ55

Бр59Ь

Рисунок 1 - Результат ДСН-ПААГ электрофореза ЛПС А. ЬгшИеше Зр245, 8р7, БЯ55 и А. Про/егит Йр59Ь, выращенных без флавонодов (К) и в присутствии различных концентраций (1-8) флавоноидов - рутина (Я), кверцетина (())

низмов, для стандартизации условий выращивания бактериальных культур для каждого штамма исследована динамика роста и установлено время, необходимое для достижения популяцией окончания экспоненциальной фазы на малат-но-солевой среде в присутствии эффективных концентраций флавоноидов.

Иммунохимические исследования выявили изменения антигенного состава ЛПС изучаемых культур под действием флавоноидов: ЛПС бактерий А. Ьро/егит 5р59Ь (ЛПСяр59ьк}), выращенных в присутствии кверцетина, в тесте иммунодота проявляли низкий уровень сродства к гомологичным антителам на препарат ЛПС5р59ь, но обнаруживали сродство к антителам на ЛПБК^ь контрольной культуры (Рисунок 2). Для остальных штаммов методом ИФА также показано достоверное снижение уровня сродства гомологичных к ЛПС интакт-ных культур Ат к поверхности клеток, выращенных в присутствии флавоноидов (Рисунок 3).

Учитывая, что состав гликополимеров зависит от фазы роста микроорга-

12 3 4

Атлпс вр59Ь АТдПБК Бр59Ь

Рисунок 2 - Результаты иммунодот-анализа ЭДТА-экстрактов ЛПС^'Л (1, 3) и ЛГ1С5Р5%+д(2, 4).

Визуализация антителами к ЛПС (Атлпс) и к ЛПБК (Атлпбк) бактерий А.Иро/егит Бр59Ь

Большая приспособленность к присутствию флавоноидов и как результат наименьшие изменения антигенных свойств были выявлены у культуры А. ЬгаьПете 5р245, что может быть связано с имеющей место адаптацией к известному для этого штамма эндофитному существованию.

Анализ ориентационных спектров клеточных суспензий показал, что культивирование азоспирилл в присутствии флавоноидов приводит к достоверному снижению показателя электрооптического эффекта, что свидетельствует об изменениях свойств поверхности бактерий, в частности заряда, в формировании которого существенным является вклад ЛПС. В тесте солевой агрегации установлено, что под действием кверцетина происходит возрастание относительной гидрофобности бактериальной поверхности, что может быть причиной повышенной, по сравнению с контрольными культурами, агрегации клеток уже на ранних стадиях роста культуры.

0,7БО 0,700 -О.бБО 0,600

О)

0,550

о

0,500 -О.ЛЪО -0,400 -

Рисунок 3 - Результаты ИФА клеточных суспензий А. ЬгайНегие контрольных и выращенных в присутствии эффективных концентраций флавоноидов с гомологичными Ат к препаратам

ЛПС

Также установлено, что под действием экстрактов корней пшеницы, содержащих флавоноиды, происходят изменения физико-химических свойств по-

верхности бактериальных клеток, подобные изменениям, произошедшим под действием отдельных флавоноидов. Таким образом, наблюдается согласованность эффектов воздействия флавоноидов на бактериальную поверхность по результатам исследования электрофоретических профилей ЛПС, антигенных, электрооптических свойств внешней мембраны азоспирилл, что указывает на структурные изменения гликополимеров внешней мембраны бактерий при действии флавоноидов и определяет логику дальнейших исследований.

Глава 4 Исследование состава и структуры гликополимеров поверхности A. lipoferum Sp59b и A. brasilense SR55, выращенных в присутствии эффективных концентраций флавоноидов

Исследование структурных изменений ЛПС азоспирилл под действием рутина и кверцетина проводили на культурах A. lipoferum Sp59b и A. brasilense SR55, у которых обнаружены существенные изменения физико-химических и антигенных свойств на первом этапе исследований. В препаратах ЛПС, выделенных водно-фенольной экстракцией из бескапсульных клеток бактерий, выращенных в присутствии эффективных концентраций флавоноидов, идентифицированы все компоненты, характерные для этого класса молекул: углеводы, КДО и 3-гидроксиалкановые кислоты. Исследования показали, что культивирование бактерий в присутствии кверцетина приводило к возрастанию относительного количества углеводов в составе ЛПС, в то время как под действием рутина наблюдался обратный эффект. Во всех препаратах ЛПС присутствовала КДО - обязательный, по сути, маркерный компонент этих макромолекул. В препарате JinCSp59b+Q выявлено снижение (на 46%) КДО по сравнению с контрольным ЛПС3р59Ь. Количество КДО в препаратах ЛПС^^, и ЛПС5К55+К существенно не отличалось от контрольного образца (Таблица 1).

Методом ГЖХ установлено, что состав ЖК экспериментального -nnCSp59b+Q существенно отличался от контрольного препарата отсутствием 3-гидроксидидекановой (3-ОН-12:0) и дидекановой кислот (12:0), доминирующих в ЛПС5р59ь. Преобладающими ЖК в липидной компоненте ЛПС5р59ьч? оказались 3-гидрокситетрадекановая (3-ОН-С14:0) и октадеценовая (С 18:1) кислоты (Таб-

лица 1). В образцах JIIICsrss+r и JIIICsrss+q при сохранении качественного состава ЖК установлено увеличение количества 3-ОН-С14:0 и 3-OH-C16ÍO кислот, а также снижение количества кислоты С 18:1 по сравнению с JIIICsrss-

При этом суммарное содержание 3-гидроксиалкановых кислот в составе JinCsR55+R не превышает 65%, что коррелирует с литературными данными о содержании гидроксикислот в липиде А азоспирилл (Игнатов и др., 2009).

В результате мягкого кислотного гидролиза препаратов ЛПС получены ОПС, для которых в ходе исследований методом ГЖХ ацетатов полиолов и (R)-2-октилгликозидов обнаружено существенное изменение моносахаридного состава. Установлено, что в отличие от контрольного образца OnCSp59b, представленного рамнозой, галактозой (Gal) и маннозой (Мал) в соотношении 3:2:1, соответственно (Fedonenko et ai2005), OnCsP59b+Q состоит из L-рамнозы (L-Rha) и D-глюкозы (D-Glc), находящихся в соотношении — 2.7:1

Таблица 1 - Химический состав препаратов ЛПС A. brasilense SRS5 и A. lipoferum Sp59b

Препараты

ЛПСэюз ЛПСБЮЗ+О ЛПС5Я55+Я ЛПС$р59Ь ЛПС$р59Ь+0

Углеводы 67.8±4.3 80.7±4.6 50.4±2.2 38.8±1.4 53.9±0.5

Белок 2.5±1.4 1.7±1.0 0.9±0.5 2.4±0.2 2.3±0.2

Фосфор 1.3±0.1 1.1±0.1 1.5±0.1 0.5±0.1 .

кдо 1.9±0.1 1.8±0.2 1.3±0.1 4.4±0.1 2.4±0.1

о и 12:0 - - - 22±0.6

m 2-ОН-12:0 - - - 8±0.2

к а 3-ОН-12:0 - - - 31±1.3 -

ed К ж л 3-ОН-14:0 25±1.4 36±0.9 39±2.3 13±0.2 52+1.3

о. и 16:0 - - - 13±0.1 9.7±0.4

о (J 3-ОН-16:0 13±0.5 18±0.1 23±1.2 - 14+0.6

18:1 50±0.4 36±0.2 27±2.0 10±1.8 22±0.3

19:0 11±0.2 8±1.1 9±0.5 - -

Примечание. В таблице представлены результаты в виде средних арифметических величин значений со средними квадратичными отклонениями

В |3С-ЯМР спектре ОПСбР59ь+о (Рисунок 4А) присутствовали сигналы четырех аномерных атомов углерода при 102.5-105.1 м.д., 17 атомов углерода моносахаридных циклов в области 62.8-81.3 м.д., а также трех метальных групп (С-6 ИЛа при 18 м.д.). Отсутствие сигналов в области 82-88 м.д., характерных для фуранозидов, свидетельствовало о том, что все остатки моносаха-

ридов находятся в пиранозной форме. Соответственно, в спектре 'Н-ЯМР (в автореферате не приведён) присутствовали сигналы четырех аномерных протонов при 4.67-5.15 м.д., а также сигналы группы протонов моносахаридных остатков при 3.35-4.49 м.д. и трех СН3-групп рамноз при 1.27-1.33 м.д. Сравнительный анализ показал, что 13С и 'Н ЯМР спектры ОПС^з^о были идентичны таковым для капсульного полисахарида этих микроорганизмов (Смолькина и др., 2010) (Рисунок 4Б), а, следовательно, и структуры их повторяющихся звеньев совпадали, что хорошо коррелирует с результатами иммунодота ЭДТА-экстрактов ЛПС (см. Рисунок 2).

Сигналы атомов углерода моносахаридных циклов

Рисунок 4 - "С-ЯМР спектры ОПС бактерий А. Иро/егит 5р59Ь, выращенных в присутствии кверцетина (А) и КПС А. Иро/егит Бр59Ь (Б).

Таким образом, установлено, что гексасахаридное повторяющееся звено ОПС бактерий А. Иро/егит 5р59Ь (1), выращенных без кверцетина, существенно отличается от тетрасахаридного звена в составе ОПС8р59ь+<з (П):

a-L-Rhap< 1 ->3)-a-L-Rha/H I ->2)-a-L-Rha/K 1 -+3>p-D-Manp

1

44

->3)-p-D-GaIp-(l->3)-a-D-GalíKl-> (I)

P-D-Glcp

1 OAc -20-25 %

* I

3 2

—►2)-a-L-Rh^p (I ->3)-a-L-Rhap (l->3)-a-L-Rh^>< 1-* (II)

В свою очередь, анализ моносахаридного состава KnCSp59b+Q выявил присутствие значительного количества D-Gal, в отличие от ранее исследованного препарата KnCsPs9b - глюкорамнана с соотношением моносахаридов 1 :3 (Смолькина и др., 2010). По результатам ГЖХ количество D-Gal приблизительно равно содержанию D-Glc (Рисунок 5).

Исследование методом ГЖХ ацетатов полиолов OnCsR55+Q бактерий А. brasilense SR55, выращенных в присутствии флавоноидов, показало наличие моносахаридных остатков Rha, Gal, Glc, ранее определённых в структуре ЛПС (Boyko et al., 2011). Отличие состояло в возрастании доли Glc и Rha относительно Gal. Для контрольного образца количество Glc было в 2 раза меньше Gal, в то время как в опытных

Рисунок 5 - ГЖХ-профиль ацетатов полно- образах они присутствовали в прибли-лов гидролизата KnCsP59t>+<3 бактерий А.

lipoferum Sp59b, выращенных в присут- зительно равных количествах. Также ствии кверцетина.

отмечено возрастание содержания Rha в 1.5 раза по сравнению с контролем. Всё это свидетельствует о серьёзных перестройках в структуре ЛПС под влиянием флавоноидов.

В 'Н-ЯМР спектрах наблюдались отличия препаратов OnCsR55+Q и ОП-Csr55+r от контрольного препарата OnCsRss, однако между собой спектры

О 8 9 10 II 12 13 14 13

опытных образцов были идентичны, поэтому на рисунке 6 представлен спектр только одного из них.

Сигналы протонов м о носахарндных ____ циклов

Сигналы а но мер пых протонов

Н-6

ОМ*

11

Н-6

Сигналы аномерных протонов

Сигналы протонов моносахаркзных циклов

< О Э-5 3.0 2.5 2.0 1.5

Рисунок 6 - 'Н-ЯМР спектры ОПС А. Ъга$!1еп$е котрольного (А) и выращенного в присутствии рутина (Б). В спектрах присутствуют сигналы различной интенсивности, что свидетельствует о структурной гетерогенности препаратов.

Наряду с сигналами, характерными для образца ОПСвмг, в спектрах ОП-С$к55»<з и ОПСз«55+к идентифицированы дополнительные пики моносахаридных колец, в том числе ЯЬа и терминальной С1с. Также в спектрах опьп-ных образцов обнаружены сигналы, характерные для аминогрупп в области 1.9-2.1 м.д. и возрастание количества сигналов метоксильных групп в области 3.4-3.6 мд.

Таким образом, по результатам проведенных исследований было установлено, что под воздействием флавоноидов у А. ЬгскИете 81*55 наряду с сохранением исходной структуры повторяющегося звена ОПС индуцируется синтез дополнительного моносахаридного звена.

Существенные изменения структур ОПС азоспирилл, как результат адаптации бактерий к условиям существования в присутствии вторичных метаболитов растений, выявлены для этих ассоциативных бактерий впервые.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование комплекса методов исследования физико-химических свойств поверхности бактериальных клеток, методов иммунохимии и структурного анализа позволило обнаружить изменения состава и структуры ЛПС азоспирилл, произошедшие при культивировании их в присутствии флавоноидов. Установлены индивидуальные эффективные концентрации флавоноидов для каждого из четырёх штаммов - представителей двух видов азоспирилл, что свидетельствует в пользу универсальности обнаруженного эффекта. Следует отметить, что рутин при сравнении с кверцетином проявлял либо аналогичный эффект на микроорганизмы, либо воздействие на анализируемые свойства бактерий было менее выражено. Полученные в ходе исследований результаты, такие как увеличение относительной гидрофобности поверхности бактериальных клеток, изменение моносахаридного состава, структуры и макромолекулярной организации ЛПС под действием флавоноидов коррелируют с литературными данными о влиянии флавоноидов на ризобии, для которых также показано возрастание доли дезоксисахаров, их метилирование, изменение состава и соотношения ЖК в присутствии экссудатов корней растений (Ргауэве е! а/., 2002; Broughton е1 а!., 2006). Происходящие модификации можно рассматривать как адаптацию микроорганизмов к существованию в условиях симбиоза с корнями растений, формирование эффективного для инокуляции фенотипа.

Выращивание А. Нро/егит вр59Ь в присутствии кверцетина индуцирует синтез ОПСзР59ыо со структурой, аналогичной идентифицированным ранее в КПС А. Нро/егит 8р59Ь и ЛПС штамма А. Нро/егит БЯбб (Федоненко и др., 2011).

Обнаруженная у ряда штаммов азоспирилл идентичность структур ОПС наводит на мысль о существовании универсального фактора - индуктора, присутствующего в молекулярном окружении этих микроорганизмов. Образование рамнанов как результата адаптации к условиям существования в определённой экологической нише в присутствии флавоноидов показано для псевдомонад -свободноживущих ассоциативных ризобактерий (Reuhs et al., 2005). Рамнаны в структуре ЛПС характерны для многих представителей азоспирилл, ассоциированных с пшеницей. Так наличие линейных полимеров D-рамнозы в ЛПС является химической основой серологического родства азоспирилл, отнесенных к серогруппе I (Бойко и др., 2010), а линейные три-ь-рамнановые основные повторяющиеся звенья ОПС выявлены у представителей серогруппы III азоспирилл (Федоненко и др., 2011). В нашем исследовании наименее подверженным воздействию флавоноидов оказался штамм А. brasilense Sp245, структура ОПС которого представлена гомополимером D-рамнозы и в ходе адаптации к условиям эндофитного существования формировалась при более высоких, чем в ризосфере, концентрациях флавоноидов. Учитывая тот факт, что выбранные нами флавоноиды являются представителями группы вторичных метаболитов злаковых растений, а ЛПС и КПС бактерий участвуют в осуществлении ранних стадий взаимодействия (Коннова и др., 2005), полученные данные могут дать основу для понимания механизма формирования оптимального для ассоциативных взаимодействий фенотипа бактерий.

ВЫВОДЫ

I. Впервые установлено, что при культивировании азоспирилл в присутствии флавоноидов, а также комплекса фенольных соединений экстрактов корней пшеницы, происходит возрастание гетерогенности мембранного пула ЛПС, изменение электрооптических свойств бактериальной суспензии, а также повышение относительной гидрофобности поверхности клеток. Наблюдается штаммовая вариабельность ответных реакций микроорганизмов на присутствие в среде флавоноидов.

2. Для антител, полученных к препаратам ЛПС интакгных культур А. brasilense SR55, Sp7, Sp245 и А. lipoferum Sp59b, выявлено снижение сродства к ЛПС гомологичных штаммов, выращенных в присутствии флавоноидов, что свидетельствует об изменении антигенных свойств поверхности бактерий.

3. Выявлено, что присутствие флавоноидов в среде выращивания индуцирует синтез ЛПС, отличных от контрольных по содержанию относительной доли углеводов, 2-кето-З-дезоксиоктоновой кислоты, составу и соотношению жирных кислот.

4. Для бактерий А. lipoferum Sp59b установлено, что под влиянием кверцети-на индуцируется синтез ОПС с отличной от ЛПС, но идентичной ЛПБК интактной культуры структурой повторяющегося звена.

5. Показано, что действие кверцетина на капсульные полисахариды А. lipoferum Sp59b реализуется в изменении моносахаридного состава — появлении дополнительного моносахарида галактозы.

6. Установлено, что под влиянием флавоноидов происходит изменение соотношения моносахаридов в ОПС А. brasilense SR55.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

*Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для защиты кандидатских и докторских диссертаций

1. *Каневский, М.В. Влияние кверцетина на структуру липополисахарида внешней мембраны бактерий Azospirillum lipoferum Sp59b / M.B. Каневский, C.A. Коннова, C.A. Бойко, Ю.П. Федоненко, B.B. Игнатов // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия Химия. Биология. Экология. - Саратов: Издательство Саратовского университета. - 2012. -Т. 12. Вып. 12.-С. 50-54.

2. * Каневский, М.В. Исследование влияния метаболитов растений феноль-ной природы на свойства поверхности и состав гликополимеров бактерий Azospirillum brasilense SR55 / М.В. Каневский, A.A. Петрунина, О.И. Гу-лий, Ю.П. Федоненко, С.А. Коннова // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. — 2014. - Т. 16, № 1. — С. 286-290.

* Каневский, M.B. Влияние флавоноидов на состав гликополимеров поверхности Azospirillum lipoferum Sp59b / M.B. Каневский, C.A. Коннова, A.C. Бойко, Ю.П. Федоненко, E.H. Сигида, В.В. Игнатов // Микробиология. -2014.-Т. 83, №2.-С. 143-151.

*Петрунина, A.A. Особенности физико-химических и антигенных свойств гликополимеров поверхности Azospirillum brasilense Sp7 и Sp245 при выращивании в присутствии флавоноидов / A.A. Петрунина, М.В. Каневский, Ю.П. Федоненко, О.И. Гулий, С.А. Коннова // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия Химия. Биология. Экология. - Саратов: Издательство Саратовского университета. - 2014. - Т. 14. Вып. 4. -С. 83-88.

Каневский, М.В. Влияние кверцетина и нарингенина на макромолекуляр-ную организацию липополисахарида бактерий Azospirillum lipoferum Sp59b / М.В. Каневский, C.A. Коннова, A.C. Бойко, B.B Игнатов. // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой / V Всероссийская конференция молодых учёных: материалы докладов, Саратов, Россия, 28 сентября - 1 октября 2010 г. - Саратов: издательский центр «Наука», 2010.-С. 96.

Каневский, М.В. Влияние кверцетина на макромолекулярную организацию и состав липополисахарида бактерий Azospirillum lipoferum Sp59b / М.В. Каневский, C.A. Коннова, A.C. Бойко, B.B. Игнатов II Актуальные аспекты современной микробиологии / VI молодёжная школа-конференция с международным участием: материалы докладов, Москва, Россия, 25 - 27 октября 2010 г. - Москва, Издательство «МАКС Пресс», 2010. - С. 28-30. Каневский, М.В. Влияние флавоноидов на состав гликополимеров поверхности Azospirillum lipoferum Sp59b / М.В. Каневский II Сборник научных трудов «Исследования молодых учёных в биологии и экологии»: материалы докладов, Саратов, Россия, 27 апреля 2010 г. - Саратов, Издательство Саратовского университета, 2010. - Выпуск 8. - С. 52-56. Каневский, М.В. Структурные особенности липополисахарида Azospirillum lipoferum Sp59b, выращенных в присутствии кверцетина / М.В. Канев-скнй, С.А. Бойко, С.А. Коннова, Ю.П. Федоненко, В.В. Игнатов // Химия и

биохимия углеводов: материалы докладов / IV Всероссийская школа-конференция, Саратов, Россия, 14 - 16 сентября 2011. - Саратов: ООО «Ракурс», 2011.-С. 59-60.

9. Каневский, М.В. Влияние кверцетина на химический состав и структуру липополисахарида Azospirillum lipoferum Sp59b / M.B. Каневский, C.A. Коннова, З.О. Алиева, С.А. Бойко, В.В. Игнатов // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой / VI Всероссийская конференция молодых учёных: материалы докладов, Саратов, Россия, 24-28 сентября 2012 г.-Саратов: Научная книга, 2012.-С. 71.

10. Каневский, М.В. Участие флавоновых соединений в адаптации бактерий Azospirillum lipoferum Sp59b к существованию в ассоциации с растениями / М.В. Каневский, С.А. Коннова, Ю.П. Федоненко, Г.Л. Бурыгин И Феноль-ные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты / VIII международный симпозиум по фенольным соединениям: материалы докладов, Москва, Россия, 2-5 октября 2012. - С. 301-304.

11. Konnova, S.A. The structures of the O-specific polysaccharides from bacteria Azospirillum grown under different conditions / S.A. Konnova, A.S. Boyko, S.A. Shashkov, A.K. Surkina, M.V. Kanevsky, Yu.P. Fedonenko, V.V. Ignatov // 5-th Baltic meeting on microbial carbohydrates, Suzdal, Russia, 2-6 September 2012.-P. P20.

12. Петрунина, A.A. Влияние флавоноидов на физико-химические свойства гликополимеров поверхности бактерий Azospirillum brasilense / A.A. Петрунина, М.В. Каневский // Сборник научных трудов «Исследования молодых учёных в биологии и экологии»: материалы докладов, Саратов, Россия, 15—18 апреля 2013 г. — Саратов, Издательство Саратовского университета, 2013.-Выпуск 11.-С. 86-91.

13. Каневский, М.В. Влияние флавоноидов на макромолекулярную организацию липополисахарида бактерий А. brasilense SR55 / М.В. Каневский, З.О. Алиева // Биология - наука XXI века / 17-ая Международная Пущин-ская школа-конференция молодых учёных: материалы докладов, Пущино, Россия, 21-26 апреля 2013 г. - С. 23-24.

14. Каневский, М.В. Структурные особенности липополисахарида азоспи-рилл, выращенных в присутствии флавоноида кверцетина / М.В. Каневский, Ю.П. Федоненко, Е.Н. Сигида, С.А. Коннова // Перспективы развития науки в XXI веке / 3-я международная научно-практическая конференция: сборник материалов конференции, Махачкала, Россия, 31 октября 2013 г. Махачкала: ООО «Апробация», 2013.-С. 26-31.

15. Каневский, М.В. Исследование влияния флавоноидов на физико-химические свойства липополисахарида бактерий Azospirillum brasilense Sp245 / М.В. Каневский, А.А. Петрунина // Биология - наука XXI века / 18-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных: сборник тезисов, Пущино, Россия 21-25 апреля 2014 г. - С. 209.

16. Kanevsky, M.V. Features of macromolecular organization of lipopolysaccha-rides of bacteria of the genus Azospirillum, grown in the presence of flavonoid quercetin / M.V. Kanevsky, A.A. Petrunina, Ju.P. Fedonenko, S.A. Konnova // Interdisciplinary scientific conference "Adaptation strategies of the living systems", Novy Svet, Ukraine 12-17 May 2014. - P. 16-17.

17. Коннова, С.А. Флавоноиды растений и гликаны бактерий в симбиотиче-ских взаимоотношениях / С.А. Коннова, М.В. Каневский, Ю.П. Федоненко, В.В. Игнатов // Фундаментальная гликобиология / 2-ая Всероссийская конференция: материалы докладов, Саратов, Россия, 7-11 июля 2014. -Саратов: ООО «Ракурс», 2014. - С. 12.

18. Каневский, М.В. Особенности антигенных свойств и макромолекулярной организации ЛПС бактерий рода Azospirillum, выращенных в присутствии флавоноидов / М.В. Каневский, А.А. Петрунина, Ю.П. Федоненко, С.А. Коннова // Фундаментальная гликобиология / 2-ая Всероссийская конференция: материалы докладов, Саратов, Россия, 7-11 июля 2014. -Саратов: ООО «Ракурс», 2014. - С. 33.

Подписано в печать 16.02.2015. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Печать RISO. Объем 1,0 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 025.

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель Серман Ю.Б. Свидетельство № 3117 410600, Саратов, ул. Московская, д.152, офис 19, тел. 26-18-19, 51-16-28