Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Популяционная экология AZOSPIRILLUM BRASILENSE

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Популяционная экология AZOSPIRILLUM BRASILENSE"

на правах рукописи

Р Г 5 ОД

1 з. МАЙ 131'5

МАЙОРОВА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА ПОПУЛЯЦИОННАЯ ЭКОЛОГИЯ АгОБРШШМ ВКАБИЖЕ Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского Государственного Университета им. М. В. Ломоносова.

Научный руководитель -

Доктор биологических наук

Д. Г. Звягинцев

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Кандидат биологических наук

Д. И. Никитин М. Е. Додзин

Ведущая организация - Московская Сельскохозяйственная академия им. К. А. Тимирязева

Защита диссертации состоится " ¡1 " СС1СШ1 1996 года в 1530 на заседании диссертационного совета К.053.05.86 МГУ по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, факультет почвоведения, аудитория М-2.

С диссертацией можно . .-.ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ.

Автореферат разослан 1995 года

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ассоциативные диазотрофы рода Azospirillum лекают внимание исследователей благодаря своей способности благоп-но воздействовать на растения, увеличивая биомассу, обилие и по-ность корней, улучшая минеральный обмен за счет азотфиксации, син-, фитогормонов, бактериоцинов. сидерофоров и других механизмов .Han. Levanony, 1988; Elmerich et al., 1992; Fages. 1992; Doberei-Pedrosa, 1992). • "

Однако до настоящего времени относительная значимость многих ме-¡змов взаимодействия между растением и азоспириллами не определена, затрудняет управление данной ассоциацией при решении прикладных 14 ÍDobereiner, 1989). Нерешенной остается проблема обеспечения ншьности результатов при инокуляции растений азоспириллами (Лукин )., 1989; Caballero-Melado, 1992; Fages, 1992). В-некоторых экспертах увеличение урожая составляет 200 % и более, а с другой сторо-в ряде случаев интродукция азоспирилл _ ведет к снижению . уроная shan, Levanony, 1990; 1988; Fages, 1992; Коаевин и др., 1995). При íhx равных условиях повышение или снижение урожая зависит от сук-;ионных событий в естественном почвенном микробном комплексе в мог проведения интродукции и посева семян (Коаевин, 1989). Поэтому гояние естественной микрофлоры следует рассматривать как самостоя-ьный фактор в общей проблеме применения бактериальных удобрений зеррег et al., 1989). Из практики применения традиционных бактери-кых препаратов (клубеньковые бактерии) ясна необходимость рассмот-ия и других факторов, вкгочая функциональные характеристики итеммов инамики их численности в конкретных условиях природного местообита-(Thies et al.. 1991).

В классических работах по изучения бактерий рода АгозрхгШии о мечено недостаточное понимание экологии азоспирилл. что сдерживггт р шение многих проблем в этой области ШоЬеге1пег, 1989; 1992).

Цель работа - анализ популяционной экологии АгоБр1гШиш Ь. ^ 1епзе в почвах и ризосфера растений на основе изучения динамики чи ленности, экологической стратегии, функциональной активности.

Задачи иссладоваша: .

1. Выявлешге, количественный унет и изучение динамики различи штаммов азоспирилл в почвах и ризосфере растений при интродукции разных этапах микробной сукцессии.

2. Определение значимости.шташсвой вариабельности азоспирилл г инокуляции растений.

3. Оценка влияния стадии микробной сукцессии в почве на эффект! ность интродукции азоспирилл.

4. Изучение воздействия азоспирилл на растения на разных фон 'минеральных'и органических'удобрений. - - • • ■ -

5. Определение функциональных показателей активности азоспири. включая азотфиксацию, продуцирование индолил-уксусной кислоты, В1 действие на спектр- потребления субстратов почвенным микробным С01 щсством.

Научная новизна:

показана зависимость популяционной динамики азоспирилл и их фективности от стадии микробной сукцесии в почве, характеристик шта и уровня внесения:

определены причины нестабильности воздействия азоспирилл на р тения при интродукции-бактерий -б ризосферу и в почву. Показано, бактеризация азоспириллами в неблагоприятных условиях может привол

ачительному снижению биомассы растений ( на 10-50 %): установлена зависимость эндоризосферной колонизации корней ячменя пириллами от состояния почвенного микробного комплекса в момент ва инокулированных семян;

с помощью мультисубстра'тного тестирования показано изменение тра потребления субстратов почвенным микробным комплексом на раз-стадиях микробной сукцессии при интродукции азоспирилл; определены оптимальные условия для поиска и выделения азоспирилл' ернсво-подзолистой почвы.

Практическая ценность. Выявленные закономерности поведения попу-;и азоспирилл в ризосфере растений позволяют оптимизировать приме-[5 азоспирилл в качестве бшсгериального удобрения с обеспечением ¡имального стабильного эффекта в условиях конкретного местообитания.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены :v Всесоюзной конференции "Микроорганизма в сельском хозяйстве" [ино, -1992), на совместном заседании кафедры биологии почв факуль-i почвоведения МГУ и Российского общества почвоведов (1995). Публикации. Материалы диссертационной работы изложены в i печат-работах.. 4

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора фатуры, описания материалов и методов исследования, результатов и эбсувдения, заключения и выводов, списка цитируемой литературы. Ра-1 содержит /¿О страниц такста, иллюстрированна' «¿4"~рп'сунками и.7 У тицами. Список литературы содержитнаименований из wyJT-O запасных авторов.

Автор Быраяает глубокую признательность к.й.н. Лукину A.C. за доставление птаммов азоспирилл, к. б. н. Скворцозой И. Н., к. б. н. Сте-эву А.Л., к.б.н. Добровольской Т.Г. за консультации и содействие в

- А -

работе, а также Егорову B.C. за предоставление возможности провел полевого опыта.на базе АБС "Чашниково". ..

ОБЪЕКТЫ И НЕГОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы 6 шташов Azosplrillua brasil, имеющих генетические маркировки по устойчивости к антибиотикам (ст томицину (Sm),■ рифампицину (Rií), тетрациклину (Тс), канамицину ( аыпицилину (Ар), налидиксовой кислоте (Мх)(табл. 1).

Штаммы S94-3, S94-RP4. UBI, UB3 обладали способностью к азот сации (219-290 нмоль С2Н2/10°кл*час). Штамм UB3 представлял папул? азотфиксирущая способность которой не зависела от концентрации аммония (ОтМУмл Ш4+). Шташ UB9 бьш не способен к азотфиксг Штамм S9á(RP4). содержал коныогативную плазмиду RP4 (донор Pseucior aeruginosa). Выявление и количественный учет популяций в почве i зосфере растений"проводили с помощью генетической маркировки по у< чивости к антибиотикам.

Основные эксперименты с интродукцией азоспирилл проводились i бораторных условиях с образцами гумусовых горизонтов дерново-подз< той слабоокультуренной почвы (1.3 % гумуса, рн 6.0, Московская i Агробиостанция МГУ), серой лесной почвы среднёмощной, среднесуглин: на лессовидном бескарбонатном суглинке ( 3.5 % гумуса, рН 5.9, ' екая обл.), чернозема типичного, мощного, тяжелосуглинистого на л видном суглинке (4.8 % гумуса, рН 6.В. Курская обл.).

Для работы с культурами A.brasilense использовали среду LD ( тон -1%, дрожжевой экстракт 0,5%, NaCl 0,25%), а так же среду из к фельного .отвара.' \

Таблица 1

Характеристики популяций

Штамм

294-3 Б94-3 ■ ' 894-ЗНР4 2р7(ЦВ1) Бр7(ШЗ) 8р7(ЦВ9)

Источник I

Ч

- институт генетики I АН России !

!

факультет бактериологии I университета г. Медисо- I на (США) I

К - устойчивость популяции к антибиотику

Численность популяций азоспирилл в почве, ризосфере и ризоплане астений определяли методом посева на твердые питательные среды указного состава с антибиотиками. Антибиотики использовали в следующих энцентрациях: 500 мкг/мл для стрептомицина (5а). 50 мкг/мл для рифам--щина (ИГ), 25 мкг/мл дач акпицялша (Ар), 3 гжг/мл для налидиксовой зелоты (Мх), 10 мкг/мл для канамицина (Кш).

Предварительную обработку почвенной суспензии (1:100) образцов эчз и ризосферы проводили ультразвуком { 22 кГц, 0,4 А. 2 мин., ЗДН-2).

В качестве инокулируемых растений использовали кресс-салат,ячмень рокь. В лабораторных экспериментах процент проросших семян определяли а 10-е сутки, а длину корней, растений и массу -.на 14-е сутки разви-ия. ч

Сукцессия почвенных.микроорганизмов инициировали увлажнением воз-

- б -

душно-сухих образцов почва до 602 от обчей влагоежости. Образцы mv бировали определенное время (0, 7, 30 сут) при постоянной темпс-рат> (20° ). так что в иоизнт посева инокулирозанных семян они предстоят разные зташ сукцессии почвенных микроорганизмов (Кожевин. 1989).

В полевых условиях интродукции азоспирилл проводили в 1993 гс на базе агробиостанции "Чашшково". Бактеризации4седан ячменя (с: "Дина") производилась на уровне 107-10акл/сег,м. Бактернзованна; контрольные растения выращивались на делянках размером 1.5 х 7 м ( трех повторностях ) на 7 агрохимических фонах: 1) без удобрений; навоз - 20 т/га; 3) навоз - 90 т/га; 4) навоз - 10 т/га, аммиачная i литраШ)- 30 кг д.б./га, двойной суперфосфат(Р), хлористый калий(К 125 кг д. в. /га; 5) навоз - 45 т/га, N - 45 кг д. в./га. Р, К - 250 д. в./га; 6) ÎJ - 60 кг д. в./га. Р, К - 225 кг д. в./га; 7) N - 120 д. в./га. Р. К - 500 кг д. в./га.

Для изучали последствий интродукции азоспирилл на спектр потр ления субстратов почвенным микробным сообществом, а такие для выяв ния интродуцкрованной популяции в дерново-подзолистой почве к ризос ре ячменя на разных этапах микробной сукцессии был использован ме мультисубстратного тестирования (Горленко, Колевин. 1994). Для выяв ния эндоризосферной популяции бактерий использовали метод окрадива корней хлоридом тетрозолня (Patriquin, Dobereiner, 1978). Определе азотфиксируюцей активности чистых культур азоспирилл проводили, хрс тографическим ыетодо:л (Умаров, 1986). Для измерения продукции долил-уксусной кислоты чисты,м культурами азоспирилл использовали лориметричэскш ыегод с реагентом Банковского (Bric et al.. iЭ£ Идентификации бактерий рода Azospirillun проводили на основе кличе тестов, данного рода {Добровольская и др.,- 198Э; Penot et .al, IS Bhattarai. Hess. 1993) vi мультисубстратного тестирования.

Полученные данные обрабатывали на персональном кскпьптере типа !И. с помощью пакетов "STATGRAPHICS" . "STATEX", " EXCEL", "HARVARD-iAPHICS".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Особенности динамики азоспирилл

При интродукции азоспирилл на трех уровнях популяционной плотнос-i 108,10s,104 кл/г почвы наблюдалась тенденция к достижению единого ровня численности за счет выраяенного сокращения обилия в вариантах с асокой начальной плотностью (рис.1). На 10-15 сутки после интродукции нсленность азоспирилл в ризосфере растений составляла ~105 кп/r почвы не зависела от уровня инокуляции. Однако эффект от внесения азоспи-илл регистрировался только, если начальная численность бактерий пре-ывала 105 кл/семя. Интродукция на разных этапах микробной сукцессии оказала, что влияние сукцессионного фактора на выживаемость азоспи-илл наиболее зачетно в вариантах с обильным внесением, причем наилуч-. :ие условия для популяции складываются при интродукции в момент инициации сукцессии.

Дисперсионный анализ данных по численности азоспирилл в ризосфере и 15-е сутки после инокуляции показал, что состояние почвенного мик-юбного комплекса в момент посева инокулированиых семян так ке, как и ггаммовыа различия оказывают значимое влияние на обилие азоспирилл. Акцессионный Фактор определяет численность популяций примерно на 31%.

На 15-е сутки численность шташов с азотфиксируспрш потенциалом JB1, UB3, S94 в варианте с интродукцией в "зрелую" микробную систему (30 -суток сукцессии) превышала плотность тех же популяций, внесенных в точву на 7-е сутки сукцессии (рис.2). Таким образом, условия 7-дневно-

Рис.1 Динамика азоспирилл в зависимости от уровня внесения и стадии сукцессии

1д N

Рис.2 Средние значения численности азо-спирилл на 15-е сутки после интродукции на разных стадиях микробной сукцессии

М(млн.кл/г)

обозначения а.:, в тексте

микробного комплекса неблагоприятны для колонизации растений азос-эиллами. Исключение составлял штамм иВ9, неспособный к азотфиксации. эрее всего уменьшение плотности популяции ЦВ9 при интродукции в -дневный микробный комплекс объясняется дефицитом азота в этих усло-ях.

В работе изучалась не только динамика раздельно интродуцированных пуляции, но и смешанная инокуляции птаммов 594(5тк) и Б94(НР4). На е сутки после интродукции численность Б94ШР4) была на порядок ниже, м плотность популяций без плазмиды и штаммов, инокулированных по от-льности, в том числе и 394(Р.Р4). Таким образом, итамм с апазмидой 4 "проигрывает" в процессе конкуренции бесплазмидным популяциям.

Воздействие азоспирилл на растения в зависимости от условий интродукции Реакция растений на азоспириллы существенно зависит от состояния чвенной микробной системы в момент посева инокулированных семян, ичем интродукция азоспирилл. во. всех случаях усиливает значимость кцессионного фактора. Во всех исследованных почвах зарегистрированы ютоверные положительные и отрицательные эффекты. Знак эффекта опре-¡ляется стадией микробной сукцессии в-почве в момент посева семян, («лучшие условия для прорастания складывались при посеве инокулиро-шных семян одновременно с началом микробной сукцессии, т.е. в "моло-;й" микробной системе, а наихудшие в том случае, если посев проводили :рез 7-10 суток после увлажнения почвы, т.е. на более позднем этапе ¡кробиой.сукцессии (рис. 3,г). В конечном счете в контрольных вариан-IX прорастало 60-70% семян, тогда как бактеризация повышала этот податель -до 90-95% на.дервом этапе .микробной сукцессии и снижала его ) 37-50% при посевечинокулированных семян на 7-е сутки после инициа-

ции сукцессии.

Аналогичные тенденции прослеживались по показателям длины кор.1 и массы растений. Инокуляция семян увеличивала длину корней на ¿Он в условиях "шлодой" почвенной микробной.системы. Те же азоспг'ши интродуцированные в почвенный кошлекс 7-дневной зрелости, уме. .ьп; этот показатель в среднем на 20-30% (рис. 3,6).

Наиболее показательные закономерности видны при-анализе данных биомассе на 14-е сутки развития растений (рис.3,в). Во всех экспе: ментах с разными типами почв наблюдались сходные результаты. Знак : фекта зависит от стадии микробной сукцессии в почве в момент пос седан. Влияние азоспирилл оказывается положительным при инокуляции новременно с инициацией сукцессии, но приводит к резкому уменьше биомассы растений при внесении в неблагоприятные условия - на 7-е с ки микробной сукцессии.

Данные по биомассе растений, представленные на рис. 4, показы ют, что максимальные положительные и отрицательные эффекты были за

7 &

гистрированнн при уровне инокуляции 10 -10 кл/семя. Более низкая пуляционная плотность приводила к менее выраженным -изменениям уроя Таким образса, бактеризация азоспирилпами является усилителем как логлтельных, так и отрицательных тенденций, связанных с этапом ыикг ной сукцессия в почве.

Исследование реакции растений на азоспярилш на фоне 7 разли1 органо-минзрзльньгх удобрений в полевом эксперименте показало следу] закономерности. Достозернае положительные эффекты отмечались в 4-х риантах с бактеризацией азосгшриллами по показатели об^ей массы лосьев, и во всех вариантах с бактеризацией по показателю средней I си колоса (ряс. 5, а,©.Заметно, • что кривые изменения урогая в-кштро. в варианте с бактеризацией шаит сходную форму. Бактеризация азо

-м -

Рис.0 ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИЗАЦИИ АЗОСШРИЛЛАШ НА РАЗНЫХ ЭТАПАХ МИКРОБНОЙ СУКЦЕССИИ на прорастание семян

юяр. ЭОсу!

70 7.

<0%

на длину корней

«. о еу>

Ш1.

на биомассу растений

БМ. & егт

591. 7 с* I

кипрол. 0 су)

Рис.4 Изменение биомассы кресс—салата" в зависимости от уровня интролукции азоспирилл и стадии сукцессии

Биомас со,?»

О, 7, 30 суток—стадия сукцессии высокия,ниЗ|<ий—уровни интродукции

-13-

Рис.5а УРОЖАЙ ЗЕРНА ЯЧМЕНЯ

варианты о ргако-мине рольных удобрений

ЕЭ копра* £23 бапериэалм

обозначения вариантов сы. в тексте' •

Р=957-

Рис.5б СРШЯЯ МАССА КОЛОСА ЯЧМЕНЯ

шагграл Зоггвризаде

Р=95Г.

Рие.Бв СОДЕРЖАНИЕ АЗОТА В ЗЕРНЕ ЯЧМЕНЯ

л-зрмотн органо-ымнгральтд удобряв*

аю-рогъ

Р- 95%

риллами "приподнимает" эту кривую на более высокий уровень. Результаты химических анализов зерна ячменя показали, что варианты с бактеризацией без внесения удобрений и на фоне низких доз органических и минеральных удобрений достоверно отличается от контрольных по процентному содерканию азота (рис.5.в). Наибольшее увеличение уроаая на 31% наблюдалось в варианте 4 (орг.в-ва10т/га+Кз0РК125) (рис.5.а) и составило ¿3,4 ц/га. Минимальная -прибавка кассы зерна отмечалось в варианте с обильным внесением ЫРК и органического вещества.

Данные дисперсионных анализов показали, что на конечный урозай и на параметры растений значимое влияние оказывают как фактор бактериза-. ции азоспириллами, так и внесение органо-мннеральных удобрений.

По данным Доберейнер и других исследователей азоспириллы способны к колонизации межклеточного пространства эпидермиса, кортекса, стелы. Однако, внутренняя колонизация отмечается далеко не во всех случаях инокуляции растений. В нашей работе изучалась зависимость внутренней колонизации корней ячменя от возраста микробной системы в момент интродукции; Исследовались три" стадии сукцессии 0, 10; 30 суток и '5 штаммов азоспирилл. Сравнительная оценка эндоризосферной популяции проводилась с помощью окраски хлоридом тетрозеотш поверхностно стерилизованных корней. После экстракции формазана спиртом определяли интенсивность окраски на спектрофотометре. Интенсивность окраски корней ячменя з вариантах с молодой микробной системой превышала в 2-3 раза таковую для растений, посаженных на более поздних этапах микробной сукцессии. Только в вариантах с интродукцией в "молодую" микробную систему удалось выделить азоспириллы из эндоризосферы на уровне К^-Ю3 кл/г корня.

50

Рис.б Факторный анализ функциональной структуры микробного комплекса дерново-подзолистой понвы (ДПП)

1ГК (коиоза,на!еинаг,валер«мат,ыала1,храл мал)

а о

-50

-100

к

■ агозр

ДЛПсио2 -

ДПЛаго4 ДППаго!

-даз-

ДПП4

ДПП1 *

ДГШ-1неселя мняубаиии ДПП

ШП2-2жсе/м итеувшии "ДПП

Дт4-4жгот! ижубоцих ДПП

дтагоЬШТНАгмрИИмя

датаг-длги-лотриЯют

аПпо4-ППП+Агозр!гй1цт

Аговр-АгмрИПип)

-12-10-8 -5 -4 -2 0 2 4 6 8 ' 2ГК (креатин)

!,2 -греия иихуСзихи рСртим (неае/м) 1ГК - первая глознся кметодакга 2ГК — второя гвдвнся коилоиенга

Факторный анализ функциональной структуры микробного комплекса ризосферы ячменя

1 ГК (+рояноза,4-сахароэа,~!иал2ннат,-ос[лин,-'&о^еРиаиат-иолот)

Агоф-лгоггМЧит суг>. , 1 ?Аг с? р ? .т - 2 л^'. •<•' у. 1 озр

-1&-14-12-10-3-6-4-2 0 2 4 3 3 10 2ГХ (крахмал) 1,2 - вр?.'.(я туВот сбркия (недели)

Функциональная характеристика микробных сообществ при интродукции азоспирилл

Для изучения воздействия интродуцированной популяции азоспирилл на спектр потребления субстратов почвенным микробным сообществом, а так же для выявления интродуцированной популяции в дерново-подзолистой почве и ризосфере ячменя на разных этапах микробной сукцессии был использован метод мультисубстратного тестирования (МСТ).

Факторный анализ данных показал, что интродукция азоспирилл на

о

уровне 3*10 кл/г почвы приводит к достоверному изменению характеристик микробного комплекса дерново-подзолистой почвы. Несмотря на значительное снижение обилия азоспирилл в процессе инкубации, достоверное отличие инокулированной почвы от контроля отмечалось и на 30-ые сутки в конце эксперимента (рис.6.а). Инокулированные сообщества располагаются в области между естественной дерново-подзолистой почвой (ДПП) и внесенной культурой, т.е. интродукция приближает функциональные характеристики исходного микробного, комплекса к чертам, характерным для интродуцента.

Изменения в почвенном микробном комплексе наиболее заметны на 7-е и 14-е сутки, а к 30-м суткам воздействие внесенной популяции уменьшается. Возможно, снижение влияния интродуцента связано с уменьшением численности азоспирилл. Результаты кластерного анализа такке показали, что отличия инокулированкых образцов от исходной почвы больше в первые две недели по сравнению с 30-ми сутками. Это наблюдение согласуется с результатами экспериментов по инокуляции растений азоспириллаш. согласно которым воздействие азоспирилл на растения наиболее сильно проявляется в первые .7г10 дней после 'интродукции..

Достоверные различия функциональных характеристик инокулированной

и контрольной почв позволят1 судить о наличии или отсутствии кизнеспо-собнон интродуцированной популяции, т. е. по уровню потребления ряда ;слзчевых субстратов мозно судить о судьбе внесенной популяции.

При интродукции азоспирилл микробные сообщества дерново-подзолистой почвы на всех этапах сукцесии отличались повышенным потреблением валерианата, малата. малеината, ксилозы, арабинозы и меннее активным потреблением лактата, глшозо-6-P. креатина. Эти признаки являются ключевыми для микробного сообщества дерново-подзолистой почвы, содержащего интродуцированную популяцию азоспирилл.

Исследовалась также возможность выявления популяции азоспирилл, кнтродуцированной в ризосферу ячменя. Бактеризация семян проводилась на уровне 6*1О7 кл/семя. Факторный анализ показал, что популяция азоспирилл выживает и оказывает активное влияние на ризосферное сообщество (рис.6,б). Воздействие интродуцента на сообщество проявляется в повышении потребления валерианата, малата, малеината, валина и понижении потребления рамнозы, рафшозы, сахарозы, крахмала.

• Результаты компонентного анализа-показали, " что в нашем эксперименте наименьпим являлось таксономическое расстояние ыегду проекциями характеристик чистой культуры к. brasilense и микробного сообщества дерново-подзолистой почвы на 14-е сутки' сукцессии. Таким образом, именно услозия данного сукцессионного этапа наиболее соответствуют экологии азоспирилл. Это наблпдение' может быть полезным при оптимизации выделения аборигенных азоспирилл из почвы и объясняет эффективность некоторых эмпирических рекомендаций по выделении этих микроорганизмов (Penot et al, 1992; Bhattaral, Hess. 1993).

В работе предпринята попытка выделить азостглр'.шлы из дерново-подзолистой • почвы на разных стадиях микробной сукце :ат. Различные концентрации почвенной суспензии дерново-подзолистой почвы вкосились в

стерильный песок, куда высаливались растения ячменя. Через две недели корни растений окрашивали раствором хлорида тетрозолия и определяли численность почвенной бактериальной популяции, способной к колонизации эндоризосферы по' биотесту на основе метода предельных разведений. Максимальная интенсивность наблюдалась для растений, обработанных суспензией 14-ти суточной почвы.

По результатам мультисубстратного тестирования и литературным данным известно, что для выделения диазотрофов и азоспирилл в частности, используют метод накопительных культур или инкубацию почвенных образцов в течение 1-2 недель. Именно на этом этапе сукцессии происходит увеличение численности бактериального комплекса почвы и диазотрофов в том числе.' Интродукция азоспирилл на первых этапах микробной сукцессии приводит к наилучшим результатам, поскольку внесенная в молодую микробную систему популяция имеет преимущество для колонизации внутренней и внешней поверхности корней, а интродукция на 7-14-е сутки приводит к повышенной конкуренции с аборигенной микрофлорой.

Из-поверхностно стерилизованных корней растений, обработанных суспензией 14-ти суточной дерново-подзолистой почвы, а также из самой дерново-подзолистой почвы на 14-е сутки сукцессии был выделен ряд культур, сходных с азоспириллами по морфологическим признака!!. Результаты биохимических тестов и факторный анализ результатов МСТ показали, что две из девяти выделенных культур можно отнести к роду А20эр1гШит (рис.7). Обе культуры были выделены из.эндоризосферы ячменя, обработанного суспензией 14-дневной дерново-подзолистой почвы, хотя из самой дерново-подзолистой почвы азоспириллы выделить не удалось. По видимому, благодаря способности азоспирилл активно передвигаться к растениям в корнях ячменя произошло "концентрирование" бактерий.

Рис.7 Факторный анализ функциональной структуры микробных популяций

1 ГК(арабиноза, — сахароза, — валерианат, —валин,-палат,-мс!/1еинат)

100

50

-50

Р

Azosg2 Агозр 1 ^ „фХ4

:р . „

ж х х

Лл

£ А X

X

ВасШи:

Х2

Pseudomonаs

-Фь •

* А2ог:р1 —А.ЬгаЗ(1еп5в

□ Агозр2—А.ЬгазИепЕе

X XI"

0 Х2 — определяемые 1

А ХЗ культуры из 1

X Х<1

-80 -60 -40 -20 О '20 40 60 80 2ГК( — глицерин, — ксилоза', — сорбит, — гисти л ин) 1ГК — первая главная компонента 2ГК — вторая главная компонента

Подходы к оптимизации интродукции азоспирилл

Интерес к экологии бактерий рода Агозр1гШш2 в значительной степени связан с выяснением возможностей и ограничений при использовании популяций азоспирилл в качестве бактериального удобрения. На основе выявленных закономерностей модно предложить основные .подходы к применению азоспирилл в качестве бактериального удобрения. Интродукция азоспирилл может оказывать как шлоаительное, так и отрицательное воз- ■ действие на растения. Знак эффекта зависит от стадии микробной сукцессии в почве в момент посева семян. Внесение азоспирилл приводит к значительному увеличению урожая на 30-80% при интродукции одновременно с инициацией сукцессии, но вызывает уменьшение биомассы на 10-50% при внесении в неблагоприятные условия - на 7-14 сутки микробной сукцессии. Двухфакторный дисперсионный анализ показал, что фактор микробной сукцессии и взаимодействие этого фактора и уровня бактеризации определяют урожай на 34% и 27% соответственно. Таким образом, эффект .при интродукции азоспирилл. определяется не только и даже не столько действием внесенной популяции в чистом виде, но и состоянием почвенного микробного комплекса в момент посева растений. Последний фактор должен обязательно рассматриваться в оптимизационной процедуре наряду с характеристикой популяции и уровнем ее внесения.

Для наглядного представления полученной информации воспользуемся сглаживанием полученных данных плоскостью г=ах+Ьу+с с обеспечением минимума квадрата ошибки (рис.8). В качестве факторов рассматривается индекс уровня внесения азоспирилл 1вК0 и показатель состояния почвенной микробной системы К, определяемый как отношение численности бактерий по данным микроскопии и посева. Уравнение зависимости урожая от 1бЫ0 и К в данном случае имеет вид Ъ = 0.10?1^о + 0.004К - 0.334.,

- г\ ~

Рис. 8 Зависимость биомассы кресс-салата от начальной численности азоспирилл (Н0) и состояния почвенного микробного комплекса (К)

отношение численности бактерий по данным микроскопии и посева .

где Z - показатель уроаая ( по отношению к контролю). При наличии подобных уравнений появляется возможность практической постановки оптимизационной задачи. г .

• ВЫВОДЫ

1.Динамика популяций азоспирилл после интродукции в образцы почв разных типов характеризуется снижением популяционной плотности в течение .месяца до уровня 105 кл/г и-определяется в первую очередь • особенностями штаммов и состоянием почвенной микробной системы. Полученные данные указывает на относительно низкую приспособленность азоспирилл к обитании в почве без растений. ' . ' • ■

2. С помощью ' мультисубстратного тестирования и количественного учета азоспирилл определены основные характеристики их зкониши и сук-цессионный этап, наиболее благоприятный для выделения аборигенных азоспирилл. Для дерново-подзолистой почвы наилучшие условия для выделения азоспирилл создаются на 14-е сутки сукцессии, причем даже в этом случае расчетная численность, азоспирилл не превышает l(f кл/г почвы.

3. Показано, что при интродукции азоспирилл в почву и ризосферу ратений регистрируются как положительные, так и отрицательные аффекты на продуктивность растений. Установлений, что среди причин нестабильности эффекта помимо ¡¡¡ташовых особенностей и уровня внесения популяции следует рассматривать состояние почвенного микробного комплекса в момент посева растений.

4. При инициации сукцессии увлажнением сухой почвы максимальное благоприятное влияние азоспирилл на растения регистрируется в молодой микробной системе, а интродукция на более поздних стадиях микробной сукцессии приводит к снижению урожая на 10-50%.

Материалы диссертации опубликована в работах:

1. Кожевин П. А.. Корчмару С. С.. Майорова Т. Н.. Горленко Н. В., Сомова Н. Г. Неопределенности при применении инородных популяций в качестве бактериального удобрения // Тез. докл. IV Всесоюзной конференции микробиологов "Микроорганизмы в сельском хозяйстве". Пущкко; 1992.

2. Майорова Т.Н. Особенности применения азоспирилл в качестве бактериального удобрения //.Тез. докл. конференции молодых ученых факультета почвоведения МГУ "Современные проблемы почвоведения и экологии". Красновидово, 1993.

3.Майорова Т.Н. Условия интродукции азоспирилл // Тез. докл. к II съезду почвоведов. Санкт-Петербург, 1996 (в печати).

4.Майорова Т.Н.. Кожевин П.А., Звягинцев Д.Г. Подходы к применению азоспирилл в качестве бактериального удобрения // Микробиология, 1996, Т. 65. вып. 2, .297-301.