Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменения в структуре ДНК у мутантов ассоциативных альфапротеобактерий Azospirillum brasilense по жгутикованию и социальному поведению

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изменения в структуре ДНК у мутантов ассоциативных альфапротеобактерий Azospirillum brasilense по жгутикованию и социальному поведению"

Ковтунов Евгений Анатольевич

ИЗМЕНЕНИЯ В СТРУКТУРЕ ДНК У МУТАНТОВ АССОЦИАТИВНЫХ АЛЬФАПРОТЕОБАКТЕРИЙ Аг05Р1ШИ.иМВЯЛ511.Е№Е ПО ЖГУТИКОВАНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ ПОВЕДЕНИЮ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

27 НАР 2014

Саратов-2014

005546528

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Инстит биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФ РАН)

Научный руководитель: Петрова Лилия Петровна

кандидат биологических наук

Федеральное государственное бюджетное учрежден науки Институт биохимии и физиологии растений микроорганизмов Российской академии на лаборатория генетики микроорганизмов, старший научный сотрудник

Официальные оппоненты: Плешакова Екатерина Владимировна

доктор биологических наук, доцент

Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Саратовский

государственный университет им. Н.Г.

Чернышевского», кафедра биохимии и биофизики,

профессор кафедры

Ерошенко Галина Александровна

доктор биологических наук, старший научны

сотрудник

Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лаборатория молекулярной микробиологии, главный научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, г. Уфа

Защита состоится «23» апреля 2014 г. в 11:00 на заседании диссертационного сове Д 002.146.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Инстит биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук по адре 410049, Саратов, проспект Энтузиастов, 13. Тел./факс (8452) 970383.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки РФ.

Диссертация и автореферат диссертации размещены на сайте ИБФРМ РА

http://ibppm.ru/dissertacionnw-sovet/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат разослан (л марта 2014 г. Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Н.Н. Позднякова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ /

Актуальность темы. Объект исследовайия - стимулирующие рост растений почвенные альфапротеобактерии вида Azospirillum brasilense. Эти бактерии обладают разнообразными характеристиками, существенными для взаимовыгодного ассоциативного взаимодействия с растениями: способностью к азотфиксации и денитрификации, синтезу фитогормонов, аэротаксису и хемотаксису, индивидуальной (активное плавание в жидкостях) и социальной (роение или распространение по влажным поверхностям с образованием микроколоний) подвижности, формированию биопленок и др.

Посредством активного передвижения (A. brasilense имеют редко встречающееся смешанное жгутикование), используя межклеточную коммуникацию и микромодификацию внешней среды, азоспириллы заселяют новые территории, в том числе, фотосферу. Эти бактерии распространены в разнообразных климатических поясах и приспособлены как к" самостоятельному существованию, так и к формированию ассоциаций с широким кругом растений (Assmus et al., 1995; Bashan and Holguin, 1997; Molina-Favero et al., 2008; Spaepen et al., 2009, 2013; Fibach-Paldi et al., 2011; Helman et al., 2011). Достаточно давно известна способность азоспирилл и к существованию в организме человека (Cohen et al., 2004).

Геномом азоспирилл, как и многих других альфапротеобактерий, большого размера (до 8 миллионов пар нуклеотидов), состоит из одной или более хромосом и многочисленных плазмид. Это достаточно пластичная структура, что позволяет этим микроорганизмам свободно существовать в разнообразных экологических условиях (Martin-Didonet et al., 2000; Кацы, 2002; Петрова с соавт., 2005; Kaneko et al., 2010; Katsy, 2011; Wisniewski-Dye et al., 2011). С использованием разнообразных экспериментальных подходов наиболее хорошо изучены бактерии штаммов A. brasilense Sp7 (типовой) и Sp245 (факультативный эндофит, привлекающий особое внимание в связи со способностью к проникновению в корни пшеницы). Недавно были опубликованы данные о почти полной нуклеотидной последовательности хромосомы и шести плазмид (из семи известных) A. brasilense Sp245 (Wisniewski-Dye et al," 2011) и ряда других штаммов азоспирилл. Однако значительная часть предсказанных генов азоспирилл не имеет гомологов в существующих базах данных; функция лишь 60-67% генов может быть более или менее достоверно предсказана; и лишь очень небольшая фракция этих генов была исследована экспериментально.

В последние годы стало понятно, что бактерии могут собираться в организованные группы, обмениваться информацией, распределять задачи, учиться на прошлом опыте благодаря краткосрочной эпигенетической памяти и совместно выбирать наиболее оптимальные варианты взаимодействия с внешней средой и другими организмами, т.е. вести "социальную" жизнь, ранее считавшуюся привилегией только высших организмов (Ben-Jacob,

2008). Исследования разнообразных проявлений социального поведения микроорганизмо ("ощущение кворума", формирование биопленок, роение, тянущая подвижность и пр. способствуют развитию нового раздела микробиологии - социомикробиологии (Parsek an Greenberg, 2005).

Одним из факторов, определяющих адаптивные возможности азоспирилл, является и подвижность. Она обеспечивается наличием жгутиков, что позволяет посредством тактическ реакций перемещаться к наиболее благоприятным условиям, закрепляться на поверхност высших организмов, в том числе, растений. В жидких средах азоспириллы перемещаютс благодаря наличию единственного полярного жгутика, а на плотных и полужидких сред, подвижность обеспечивается синтезом многочисленных латеральных флагелл (Hall and Krie 1983, 1984; Falk et al., 1985; Khammas et al., 1989; Schloter et al., 1994). Коллективны перемещения микроорганизмов зависят не только от механизмов, обеспечивающих собственн движение, но и от межклеточных контактов, опосредуемых мажорными компонентам клеточной поверхности, продукции сурфактантов и ряда других факторов (Harshey, 2003).

Способность к колонизации корневой системы растений повышается благодар способности микроорганизмов переходить от индивидуальной подвижности к коллективно миграции (Дебабов, 1999; Олескин с соавт., 2000; VerStraeten et al., 2008). Следствием этог является увеличение приспособляемости бактерий, в том числе азоспирилл к обитанию гетерогенных экологических нишах.

При изучении механизмов становления ассоциативного симбиоза нельзя не учитыват наличие особого биологического явления - формирования бактериальных биопленок Биопленки с дифференцированными клетками бактерий, с гетерогенными микронишами водными каналами, представляющими примитивную циркуляторную систему, напоминаю организацию многоклеточных организмов (Гостев и Сидоренко, 2010). Форма существовал микроорганизмов в виде биопленок - это эволюционно выгодный способ надклеточно" организации как патогенных, условно-патогенных, так и ассоциативных представителе" прокариот.

Таким образом, альфапротеобактерии A. brasilense Sp245 являются удобным модельны объектом для экспериментального изучения феномена растительно-бактериальной ассоциативности и социального поведения бактерий. Использование в экспериментальны исследованиях не только штамма дикого типа, но и оригинальных мутантов определенных классов, по-видимому, может способствовать получению новой информации 0 генетических аспектах социального поведения этих бактерий.

Цель диссертационной работы заключалась в идентификации генетических локусов А. brasilense, мутагенез которых сопровождается существенными изменениями в жгутиковании и социальном поведении бактерий.

Задачи диссертационного исследования:

1. Анализ изменений в первичной структуре 85-МДа плазмиды (р85), произошедших в результате ее слияния с вектором для омегонового мутагенеза pJFF350 у производного штамма А. brasilense Sp245 с ускоренным роением.

2. Генетико-физиологическая характеристика нескольких омегоновых мутантов А. brasilense Sp245, имеющих дефекты в образовании полярного и латеральных жгутиков.

3. Мониторинг процесса формирования биопленок на абиотических поверхностях и корнях проростков пшеницы штаммом А. brasilense Sp245 и его мутантами по структуре гликополимеров клеточной поверхности и подвижности.

Научная новизна работы. Охарактеризованы изменения в первичной структуре плазмиды р85 у одного из дериватов штамма А. brasilense Sp245 с ускоренным роением; аннотированы несколько новых генов р85. На примере мутантов А. brasilense SK039 и А. brasilense Sp245.1610 впервые показано, что вставка инсерционного элемента в одну из копий генов липидного обмена, кодирующих 3-гидроксиизобутиратдегидрогеназу (mmsB) или 3-оксоацил-[ацил-переносящий белок]-редукгазу (fabG), не сказываясь на жизнеспособности бактерий, вызывает появление дефектов в жгутиковании и подвижности. На примере мутанта А. brasilense Sp245.1063 впервые описано негативное влияние инактивации лишь одной из копий гена ßhB, кодирующего компонент жгутикового экспортного аппарата, на сборку жгутиков двух видов - конститутивного полярного и индуцибельных латеральных. Выявлено влияние мутаций в генах flhB, mmsB или fabG на эффективность формирования биопленок А. brasilense Sp245 на гидрофильной и гидрофобной абиотических поверхностях. У деривата А. brasilense Sp245.5 с крупной плазмидной перестройкой и новым О-полисахаридом обнаружена способность к более активному, по сравнению с родительским штаммом, формированию биопленок на корнях растения-хозяина.

Научно-практическая значимость работы. Инсерционные мутанты А. brasilense Sp245, полученные в настоящей работе, могут быть использованы в новых работах по изучению механизмов регуляции социального поведения азоспирилл. Штаммы А. brasilense Sp245.1063 и А. brasilense Sp245.1610 депонированы в коллекции ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН под номерами IBPPM 521 и IBPPM 522, соответственно. Представленная в данной работе информация свидетельствует о необходимости более детального исследования вклада ферментов липидного метаболизма и мультисенсорной гибридной гистидинкиназы/регулятора ответа, кодируемой хромосомным локусом AZOBR_15Q176, в процессы, существенные для

успешной сборки жгутиков и обеспечения подвижности А. ЬгаяИете Бр245 в средах разно] плотности.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Определенные изменения первичной структуры 85-МДа плазмиды штамма ЛтхртЧип ЪгазИете Эр245 в результате интеграции чужеродной ДНК приводят к ускорению роени бактерий.

2. Инактивация только одной из копий гена АИВ, кодирующего компонент жгутиковог экспортного аппарата, у бактерий А. ЬгазИепхе Бр245 может сопровождаться дефектами образовании и конститутивного полярного жгутика, и индуцибельных латеральных жгутиков.

3. Вставка инсерционного элемента только в одну из копий генов ферментов липидног обмена 3-гидроксиизобутиратдегидрогеназы (тпиВ) и 3-оксоацил-[ацил-переносящий белок] редуктазы (/аЬС) может приводить к дефектам в подвижности и жгутикований А. Ъгаьйет 5р245.

4. У дефектных по жгутиковой подвижности )1ИВ, тт$В или /аЬй мутанто А. ЬгазИепяе Бр245 модифицирована способность к формированию биопленок на гидрофобнь и гидрофильных абиотических поверхностях.

5. Спонтанное изменение химической структуры О-полисахарида А. Ъгазйеюе 8р24 оказывает позитивное влияние на процесс формирования биопленок азоспирилл на корня проростков пшеницы.

Диссертационная работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФР РАН в рамках трех плановых тем НИР: "Изучение вклада плазмид в определение подвижност и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у почвенных ассоциативны бактерий АюяртИит ЬгазИепзе" (№ госрегистрации 01200606181), "Изучение генетическо" регуляции социальной подвижности и образования мажорных компонентов клеточно" поверхности у бактерий, ассоциированных с растениями" (№ госрегистрации 01200904390) "Генетический анализ социального поведения альфапротеобактерий АгояртИит ЬгазИепзе" (Л" госрегистрации 01201359055) (научный руководитель - д.б.н. профессор Е.И. Кацы). Исследования частично поддержаны грантами Российского фонда фундаментальны исследований 06-04-48204-а, 12-04-00262-а (руководитель - д.б.н. профессор Е.И. Кацы) и 13 04-01276-а (руководитель - к.б.н. Л .П. Петрова).

Личный вклад соискателя. Экспериментальные данные, на основе которых сформулированы положения и выводы, представленные к защите, получены лично автором. Соискатель принимал непосредственное участие в постановке задач исследования, подготовке и проведении экспериментальных работ, обработке и обсуждении полученных результатов, подготовке публикаций.

Отдельные эксперименты выполнялись при участии коллег из ИБФРМ РАН: д.б.н. проф. Е.И. Кацы, к.б.н. Л.П. Петровой, д.б.н. А.В. Шелудько, к.б.н. М.П. Чернышовой, к.б.н. Ю.А. Филипьечевой, Е.М. Телешевой, д.б.н. О.И. Соколова, к.б.н. М.К. Соколовой и к.х.н. A.M. Бурова. Секвенирование ДНК выполнено в лаборатории молекулярной генетики НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития РФ под руководством к.б.н. А.Г. Прилипова. Автор признателен всем коллегам за помощь в работе.

Апробация работы. Сделаны доклады на IV Межрегиональной конференции молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 2008); V и VI Всероссийских конференциях молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 2010, 2012); III, IV и VI Всероссийских с международным участием конгрессах студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз-Россия 2010" (Нижний Новгород, 2010), "Симбиоз-Россия 2011" (Воронеж, 2011; присужден Диплом оргкомитета конгресса за лучший доклад (1-е место) в подсекции "Микробиология") и "Симбиоз-Россия 2013" (Иркутск, 2013; присужден Диплом оргкомитета конгресса за лучший доклад (2-е место) в секции "Микробиология и биотехнология"; объявлена Благодарность оргкомитета конгресса за активное участие и большое количество заданных вопросов), VII Молодежной школе-конференции с международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва, 2011) и научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова" (Москва-Пущино, 2011; присужден Диплом лауреата конкурса молодых ученых на лучшую научно-исследовательскую работу). Диссертационная работа обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН 23.01.2014, протокол № 199.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе, 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата и доктора наук.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 107 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 21 рисунок. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 262 источников, из них 57 на русском и 205 на английском и немецком языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы дана краткая характеристика ассоциативного растительно микробного взаимодействия и бактерий рода Azospirillum; основных гликополимеро поверхности бактериальной клетки; структуры бактериальных жгутиков и социальног поведения бактерий.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы бактерии штамма A. brasilense Sp245 дикого типа (Baldani et al. 1983) и восемь его мутантов по образованию липополисахаридов (ЛПС, Lps), полисахаридов связывающих калькофлуор (ПССК; Cal), полярного (Fla) и латеральных (Laf) жгутиков плаванию (Mot) и роению (Swa): Lpsr Lpsir СаГ A. brasilense Sp245.5 (Петрова, 1998); LpsI Cal" Mot" Swa" KM018, Lpsir KM139 и Lpsr Cal" KM252 (Katzy et al., 1998); Swa'" BK57 (Кацы с соавт., 2001); leaky FlaTMot" Swa" SK039 (Scheludko et al., 1998); Fla" Laf Sp245.1063 leaky FlaTMof Laf Sp245.1610 (получены в данной работе); три штамма Escherichia coli и семь плазмид, две из которых, pOmegon-Km-Sp245.1063E и pOmegon-Km-Sp245.1610E, сконструированы в данной работе. У деривата Л. brasilense Sp245.5 (Петрова, 1998) спонтанная утрата 85-МДа (р85) и 120-МДа (р120) плазмид при одновременном образовании новой мегаплазмиды коррелировала с коренными преобразованиями в синтезе ЛПС и ПССК (Кацы с соавт., 2002). Са1+-штамм А. brasilense Sp245 одновременно синтезирует LpsI, несущий кислый олигосахарид кора/О-специфический полисахарид (ОПС), и LpsII, содержащий нейтральный олигосахарид кора/ОПС. При этом ОПС LpsI и LpsII - гомополимер, состоящий из остатков D-рамнозы. ОПС мутантного штамма построен из дисахаридных повторяющихся звеньев Л^-ацетил-Д-галактозамина и jV-ацетил-О-маннозаминуроновой кислоты (Федоненко с соавт., 2010). Культуры А. brasilense выращивали при 28-3 0°С на малатно-солевой среде (Döbereiner and Day, 1976) с NH4CI (1 г/л) (MSM) или среде LB (Sambrook et al., 1989); Е. coli - на LB при 37°С.

Плазмидный состав бактерий анализировали с использованием метода Eckhardt (1978). Препаративное выделение, анализ и клонирование ДНК выполняли с использованием стандартных методик (Sambrook et al., 1989). Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей осуществляли с использованием алгоритмов BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) и Fasta (http://www.ebi.ac.uk/fasta33). Положение инициирующих кодонов в открытых рамках считывания (prf) определяли в соответствии с расстоянием от предсказанных последовательностей Шайн-Дальгарно и по результатам выравнивания соответствующих аминокислотных последовательностей со сходными белками

из баз данных. Свойства белковых продуктов orf изучали с помощью инструментов, представленных на серверах Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk), PSORTb (http://www.psort.org/psortb), ProDom (http://www.toulouse.inra.fr/prodom.html), PredictProtein (http://www.predictprotein.org), SMART (http://smart.embl-heidelberg.de), SUPERFAMILY (http://supfam.org/SUPERFAMILY/hmm.html), SCOP (http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop) и SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP).

Подвижность бактерий оценивали при выращивании в жидкой и полужидкой среде, содержащей 0,4-0,5% Bacto агара, MSM. Предметные стекла просматривали в просвечивающий световой микроскоп Jenaval (Jena, Германия). Для определения скорости и траектории движения клеток проводили видеозапись при световой микроскопии препаратов жидких бактериальных культур. Видеофайлы анализировали способом, описанным ранее (Шелудько с соавт., 2006). В полужидкий агар бактериальные клетки вносили уколом петлей, инкубировали при 30°С, через 24 и 48 ч инкубации измеряли диаметр макроколоний. Клетки неподвижных клонов анализировали с использованием просвечивающей электронной микроскопии.

Формирование биопленок штаммом A. brasilense Sp245 и его мутантами на гидрофобной/гидрофильной поверхностях изучали по методике (Ferrière and Clarke, 2003). Использовали температуру 28°С, время инкубации 6 суток и питательную среду LB.

Для изучения бактериальной колонизации корней проростков пшеницы использовали семена мягкой яровой пшеницы (Triticiim aestivum сорта Саратовская 29), предоставленные сотрудниками НИИ сельского хозяйства Юго-Востока РАСХН (Саратов). Стерилизацию семян проводили по методике, приведенной в работе (Yegorenkova et al., 2001). Культивировали стерильные проростки на среде для выращивания растений (Sigma Cell Culture Catalogue, 1994).

Инокуляцию пшеницы проводили методом, описанным ранее (Шелудько с соавт., 2010). У трех растений (трех- или 10-суточных) отделяли корни, предварительно отмыв в стерильном растворе ФСБ, которые затем гомогенизировали используя тот-же буфер. Полученный гомогенат использовали для определения численности бактериальных клеток на корнях, методом подсчета количества колониеобразующих единиц (КОЕ). Количество бактерий, высеваемых с корней, пересчитывали на одно растение (Шелудько с соавт., 2010).

Распределение бактериальных клеток и образование биопленок на поверхности корней исследовали с использованием фазово-контрастного микроскопа Jenaval (Jena, Германия) и флуоресцентного микроскопа DMLB (Leica, Германия).

Для конфокальной сканирующей лазерной микроскопии корни 14-ти дневных проростков пшеницы фиксировали в растворе 4% формальдегида. Блокировку неспецифических сайтов связывания на корнях проводили в ФСБ, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,02% Твин-20 (pH 7,0). После этого корни инкубировали в растворе фаговых миниантител к

поверхностным антигенам A. brasilense Sp245 и отмывали в ФСБ (рН 7,0). Миниантитела, полученные к поверхностным антигенам A. brasilense Sp245 с использованием комбинаторной фаговой библиотеки антител овцы (Griffin.l, Великобритания), были любезно предоставлены коллегами из лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН (Dykman et al., 2012). Вторичное мечение проводили в течение 4-х ч антифаговыми кроличьими антителами. Окончательную окраску осуществляли ослиными антикроличьими антителами, меченными Alexa Fluor 594 (Molecular probes, США).

Электронно-микроскопические исследования проводили с использованием просвечивающего электронного микроскопа LIBRA 120 (Германия) при ускоряющем напряжении 120 кВ.

Экстракцию суммарных клеточных липидов азоспирилл проводили стандартным методом (Методы общей бактериологии, 1984). Метиловые эфиры жирных кислот (МЭЖК) из экстрактов анализировали на газовом хроматографе Shimadzu GC-2010 (Shimadzu, Япония) с использованием колонки Equity-1 (Supelco, США). Идентифицировали жирные кислоты (ЖК) по бактериальному стандарту метиловых эфиров жирных кислот. Относительное содержание определенных МЭЖК в препаратах выражали в процентах от суммы площадей пиков всех МЭЖК, обнаруженных хроматографически. Метилирование проводили по методу, описанному в работе (Mayer et al., 1985).

Все количественные результаты были получены в нескольких повторностях, по меньшей мере, в 4-х, а, как правило, в семи-девяти независимых экспериментах и подвергнуты статистической обработке с использованием пакета Microsoft Office Excel 2010. Доверительные интервалы определяли для 95% уровня значимости.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика кодирующих последовательностей р85, прилегающих к месту вставки вектора pJFF350 у мутанта A. brasilense ВК570 с ускоренным роением. Ранее были получены производные A. brasilense Sp245, содержащие коинтеграт p85::pJFF350, мигрирующие в полужидких средах примерно в 2,5 раза быстрее родительского штамма (Swa++ мутант ВК570) (Рисунок 1) или утратившие способность к роению (Swa" мутанты leaky Fia" Lar SK051 и Mot" SK248) (Кацы с соавт., 2001). В отличие от производных Л. brasilense SK051 и SK248, мутант ВК570 после слияния р85 с pJFF350 сохранил жгутикование дикого типа (Кацы с соавт., 2001).

Примечание: концентрация агара в среде 0,4%, время инкубации 48 ч. Масштабная линейка соответствует 10 мм.

Рисунок 1 - Колонии, сформированные клетками

A. brasilense Sp245 (а) и его Swa4^ мутанта ВК570 (б)

Слияние плазмид р85 и вектора для омегонового мутагенеза pJFF350 в клетках мутантов SK051/SK248 и ВК570 опосредовано IS-элементами р85 ISAzbal и ISAzba3, соответственно (Katsy and Prilipov, 2009).

В данной работе в результате анализа ДНК р85, прилегающей к месту слияния с pJFF350 у мутанта ВК570, кроме ISAzba3, гена фаговой интегразы int и orf246, кодирующей консервативный гипотетический белок (Katsy and Prilipov, 2009), выявлены еще четыре orf со свойствами кодирующих последовательностей (Рисунок 2).

Примечание: открытые рамки считывания и направление их транскрипции обозначены стрелками. Цифры в названиях orf соответствуют количеству аминокислотных остатков в предсказанных продуктах трансляции (orfl35x начинается, a orfl 19х заканчивается за пределами секвенированного фрагмента р85). Над картой показаны изменения в структуре р85 после ее слияния с ДНК pJFF350 (серый прямоугольник), опосредованного IS-элсментом р85 lSAzba3. Кроме 3.8-тпн омегона-Km и oriVиз pBR325, в состав pJFF350 входят опТ(серый ромб на схеме) и нетранспозируемыи IS/* (белый ромб). В скобках приведено название мутанта A. brasilense Sp245, несущего коинтеграт p85::pJFF350. Сайты рестрикции: X - Xhol; Е - £coRI. Масштабная линейка соответствует 1 т.п.н.

Рисунок 2 - Физико-генетическая карта -YTioI-фрагмента плазмиды р85 штамма A. brasilense Sp245, интеграция в который вектора pJFF350 (Fellay et al„ 1989) привела к изменениям в подвижности бактерий

Две из идентифицированных orf, неполная orfl35x и orfl 145, кодируют консервативные гипотетические белки. Еще две, orf319, прилегающая к месту слияния р85 с pJFF350, и соседняя с ней orfl 19х, на наш взгляд, представляют наибольший интерес для последующего экспериментального изучения.

По результатам PsortB анализа (http://www.psort.org/psortb) предсказанный продукт трансляции оф19 локализован за пределами цитоплазмы - в цитоплазматической мембране и/или периплазме. Этот белок относится к семейству 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат сульфотрансфераз (3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate, или PAPS, sulfotransferase.

Pfam00685). Сульфотрансферазы катализируют реакцию переноса сульфатной группы от универсального донора - 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфата - к акцепторным группам многочисленных субстратов. Реакции сульфатирования играют важную роль в осуществлении межклеточной коммуникации, в процессах роста и развития живых организмов (Negishi et al., 2001).

Предсказанный продукт трансляции orfU9x, по-видимому, также локализующийся вне цитоплазмы, относится к семейству белков толерантности к толуолу Ttg2 (Toluene tolerance, Ttg2, pfam05494). В данном контексте интересны косвенные данные других авторов о возможном влиянии флагеллярных генов Pseudomonas putida на устойчивость бактерий к органическим растворителям. Так, у мутантов псевдомонад по структурным белкам жгутиков и по белкам-экспортерам компонентов жгутика из клетки снижалась и устойчивость к толуолу | (Kieboom et al., 2001; Segura et al., 2001). Не исключено, что возможна и обратная ситуация, когда компоненты клеточных мембран, обусловливающие толерантность бактерий к растворителям, оказывают влияние на функционирование жгутиков, поскольку их базальное тело и компоненты мотора также имеют мембранную локализацию. Крупная структурная перестройка р85 у мутанта A. brasilense ВК570 (p85::pJFF350) могла отразиться на экспрессии orfll9 и orfll9x и, как следствие, на структуре и/или функционировании компонентов клеточных мембран и подвижности этих бактерий.

Генетико-физиологическая характеристика омегонового мутанта A. brasilense SK039, имеющего дефекты в образовании полярного жгутика и роении. В культурах полученного ранее омегонового leaky Fla"/Mot" Swa" мутанта (SK039) штамма A. brasilense Sp245 (Scheludko et al., 1998) до 21% клеток несут длинный Fla (но он парализован), —1,6% клеток - укороченную полярную органеллу, а остальные клетки полностью лишены полярного жгутика. Практически все клетки SK039 неподвижны в жидких средах (Mot" фенотип) и, несмотря на способность к образованию Laf, не роятся (Swa" фенотип), но могут мигрировать с образованием микроколоний (Рисунок 3).

Примечание: среда MSM содержит 0,4% агара. Время инкубации после точечной инокуляции бактериальных культур - 72 ч. I

Рисунок 3 - Роение (1) и распространение с образованием ; микроколоний (2) бактерий штаммов A. brasilense Sp245 (1) и SK039 (2) в полужидкой среде

Фрагмент хромосомной ДНК, в который произошло встраивание Omegon-Km, был ранее клонирован в виде рекомбинантной плазмиды pOmegon-Km-SK039E (Кацы с соавт., 2004).

Секвенирование ДНК 8К039, прилегающей к вставке, и соседних районов показало, что инсерция омегона локализуется в ог/{ог/293, или ттяВ), кодирующей предсказанный гомолог 3-гидроксиизобутиратдегидрогеназы и других дегидрогеназ 3-гидроксикислот (ферменты липидного обмена) (Рисунок 4). .

ССН302Г7, О; (Сонмцамггиниый

РАР'РМИ- ГИПОТ«ТИЧ»с*шй:

СОДФр-ОЩНЧ \\ { белок 1 Т П. И

OlfíSñx OIÍ293 ОГЮ7В orfTíí

COG20S4. С€И30в42,

Гметмдимкии»»*—т|мии«ад»ггс<»снгиг>п«в

Примечание: открытые рамки считывания и направление их транскрипции обозначены стрелками. Цифры в названиях от/ соответствуют количеству аминокислотных остатков в предсказанных продуктах трансляции (ог/15бх начинается за границей клонированной и секвенированной ДНК). Возможные функции белковых продуктов oif приведены на схеме. Место инсерции омегона (П) в orj29î (mmsB) у мутанта A. brasilense SK039 показано перевернутым треугольником.

Рисунок 4 - Схема сегмента хромосомной ДНК бактерий штамма A. brasilense Sp245, омегоновый мутагенез которого привел к появлению leaky Fla7Mot" Swa" мутанта A. brasilense SK039

С использованием алгоритма BLASTn было установлено, что в рекомбинантной плазмиде pOmegon-Km-SK039E (GenBank accession nos GQ168586-GQ168588, HM776586, HM776587) клонирован ¿coRI-фрагмент хромосомы Sp245 с координатами 2561173-2568444 (GenBank accession no. HE577327). Однако в нуклеотидной последовательности, депонированной в GenBank под номером НЕ577327, в позиции 2565187, 2565236 и 2567540 есть вставка "лишнего" G, С и С, соответственно. В связи с этим обстоятельством зарубежные коллеги описали псевдогены AZOBR_180076 и AZOBR_180077 вместо выявленной нами мембранной гибридной сенсорной гистидинкиназы/регулятора ответа (GenBank accession nos. GQ168588) и только фрагмент гена mmsB (в их обозначении - AZOBR_l 80080) вместо полной or/293 (mmsB) (GenBank accession no. HM776586).

В pOmegon-Km-SK039E омегон встроился за 479-м нуклеотидным остатком orf293hnmsB с дупликацией 9 п.н. (5-TAGCAGGCC-3). Таким образом, вставка омегона (имеющего длину 3.8 т.п.н.) локализуется примерно в середине orf293 (mmsB), и расчетная длина мутантного полипептида составляет 159 аминокислотных остатков вместо 293. Так как направление транскрипции orf293 и ближайших к ней orf не совпадает, возможный полярный эффект инсерции омегона на экспрессию генов предсказанной FAD/FMN-дегидрогеназы (orfl56x) и консервативного гипотетического белка (оф76) нами не рассматривался.

Предшественниками ряда ЖК (в том числе, гидроксиизобутирата) являются разветвленные аминокислоты валин, изолейцин и лейцин. Деградация этих аминокислот (АК) и

ЖК используется многими протеобактериями для выработки энергии. Было проведено сравнение способности штаммов A. brasilense Sp245 и SK039 к использованию разветвленных АК в качестве единственного источника азота и/или углерода и энергии. В результате обнаружены межиггаммовые различия в ответе A. brasilense на разветвленные АК при культивировании бактерий в жидких средах с аэрацией. Так, рост мутанта SK039 на среде с валином в качестве единственного источника углерода или лейцина в качестве источника N и (или) С был подавлен существенно сильнее, чем у Sp245. На среде с валином или изолейцином в качестве единственного источника С и N наблюдалась обратная картина. На плотных средах через 36 ч инкубации количество колоний на средах с АК не отличалось от этого показателя на среде с манатом и азотом, но на полужидких средах с АК (вместо маната) колонии были мельче.

Ранее была выявлена связь между ЖК профилем клеток некоторых грамотрицательных бактерий и их способностью к роению (возможно, из-за вариаций в текучести клеточных мембран). Жирные кислоты могут также выполнять функцию межклеточных сигналов коммуникации и входить в состав биосурфактантов, способствующих передвижению бактерий по поверхностям (Lindum et al., 1998; Lai et al., 2005; Huang et al., 2007). Нами была предпринята попытка выявления возможных различий в ЖК составе клеток A. brasilense Sp245 и SK039, выращенных на жидких или плотных, бедной (MSM) или богатой (LB) средах. С использованием газо-жидкостной хроматографии МЭЖК установлено, что качественный состав ЖК у исследованных штаммов одинаков. Характерными ЖК для азоспирилл (независимо от состава/типа среды) оказались элаидиновая (транс-9-октадекановая кислота), пальмитолеиновая (цис-9-гексадеценовая кислота) и пальмитиновая (гексадекановая) кислоты. Однако были выявлены небольшие различия в относительном содержании некоторых ЖК в экстрактах клеток A. brasilense Sp245 и SK039. Так, в клетках штаммов Sp245/SK039, цис-9-гексадеценовая и октадекановая (стеариновая) кислоты составляли соответственно 18,7/13,0% и 3,1/6,3% при культивировании бактерий в жидкой бедной среде MSM и 11,4/7,7% и 2,8/4,8% - в богатой среде LB. Вероятно, появление дефектов в жгутиковании и подвижности мутанта A. brasilense SK039 связано с трудно детектируемыми изменениями в липидном метаболизме клеток и ЖК составе клеточных мембран.

Получение и характеристика новых омегоновых мутантов A. brasilense Sp245 с изменениями в социальной подвижности. Для более детального изучения вклада отдельных генов в реализацию подвижности азоспирилл мы получили новых омегоновых мутантов Sp245 с использованием случайного омегонового мутагенеза Sp245 посредством скрещивания азоспирилл с донорным штаммом Е. coli S17-1 (pJFF350). Полученные 1714 KmR эксконъюгантов A. brasilense Sp245 проанализировали на способность к плаванию в жидкой среде и роению на полужидких средах. Количество клонов,

образовывавших макроколонии меньшего (5 мм), чем в случае дикого типа (-20 мм), диаметра составило 5,6%. Колонии, сформированные клетками мутанта Sp245.1610, инокулированного уколом в среды, содержащие 0,4% Bacto агара, в отличие от роящихся бактерий штамма Sp245, остаются на месте укола. Штамм Sp245,1063 образует зернистые зоны распространения, так же, как и полученный ранее мутант SK039 (Рисунок 5).

Сравнительный электронно-микроскопический анализ клеток штаммов A. brasilense Sp245 и Sp245.1063 выявил у мутанта полную утрату способности к образованию латеральных жгутиков и существенные дефекты в продукции полярного (Рисунок б). До 90% клеток мутанта Sp245.1063 из культур, выращенных в жидких (18 ч) или на плотных (42 ч) средах, лишены Fla; около 10% клеток несут очень короткую полярную органеллу.

Примечание: время инкубации 72 ч. Масштабная линейка соответствует 10 мм.

Рисунок 5 - Вид колоний штамма А. brasilense Sp245 (1), его мутантов Sp245.1610 (2), SK039 (3), Sp245.1063 (4) на полужидких (0,4% агара) средах MSM (верхний ряд) и LB (нижний ряд)

Примечание: бактерии выращивали в жидкой (1, 3) или на плотной (2. 4) MSM. Масштабная линейка соответствует ] мкм.

' ЩШг "\ЯКг Рисунок 6 - Электронные

5 ^^ « микрофотографии клеток штамма

ч^Нк ¡¡ИкЬ Л. brasilense Sp245 (1, 2) и его омегонового

^^Р Н HB мутанта A. brasilense Sp245.1063 (3, 4)

%...... . ЯР

У мутанта Л. brasilense Sp245.1610 произошла полная утрата способности к образованию латеральных жгутиков и наблюдались существенные дефекты в продукции полярного жгутика. Примерно 62% клеток мутанта Sp245.1610 из культур, выращенных в жидких (18 ч) или на плотных (42 ч) средах, лишены Fla; около 29% клеток несут очень короткую полярную органеллу; на остальных клетках в популяции выявляется длинный Fla. При этом около 2,5% клеток в популяции Sp245.1610 сохранили подвижность в жидких средах.

В результате проделанной работы отобран полностью обездвиженный Fla" Laf мутант А. brasilense Sp245.1063 и leaky Fla'/Mot" Laf A. brasilense Sp245.1610, большинство клеток в

* Щ

популяции которого неподвижны или "дрожат", а клетки, сохранившие подвижность, единичны. Значимых различий в среднем размере клеток, скорости роста и плазмидном профиле бактерий штаммов A. brasilense Sp245, Sp245.1063 и Sp245.1610 не обнаружено.

Для характеристики мутантного локуса было осуществлено клонирование £coRI-фрагмента геномной ДНК штамма A. brasilense Sp245.1063, несущего вставку омегона-Km - с отбором трансформантов Е. сой DH1, приобретших устойчивость к канамицину. В результате секвенирования полученной рекомбинантной плазмиды pOraegon-Km-Sp245.1063E установлено, что в ее составе клонирован 16,4-т.п.н. EcoRI-фрагмент хромосомы A. brasilense Sp245 с координатами 2337237-2353586, включающий локусы AZOBR150175-AZOBR 150194 (GenBank accession no. НЕ577327). У мутанта A. brasilense Sp245.I063 вставка омегона-Km локализована в районе 924-го нуклеотидного остатка хромосомной копии гена flhB. По концам омегона в ДНК штамма A. brasilense Sp245.1063 выявлен прямой повтор последовательности из 9 п.н. (5'-CTCCTCGGC-3'). Расположенные передай гены fliE-fliQ2-fliR кодируют соответственно белок крюка-базального тела FUE и участвующие в синтезе жгутика белки FliQ и FliR (GenBank accession nos YP_005032138, YP_005032137 и YP_005032136) (Рисунок 7).

Q

AZOBR 150175 AZOBR 150176 flhB fliR fliQ2 fliE

Примечание: горизонтальными стрелками обозначены кодирующие последовательности и направление их транскрипции; вертикальной стрелкой - место вставки омегона (í1) в ген flhB.

Рисунок 7 - Схема сегмента хромосомной ДНК мутанта A. brasilense Sp245.1063, содержащего вставку инсерционного элемента Omegon-Km

На расстоянии 51 п.н. от 3-конца гена flhB находится транскрибируемая в том же направлении orf AZOBR_150176, предполагаемым продуктом которой является гибридная мультисенсорная гистидинкиназа/регулятор ответа (GenBank accession no. YP_005032134). Orf \ AZOBR_150175, кодирующая гипотетический белок (GenBank accession no. YP_005032133), ' транскрибируется в противоположном направлении. Не исключено, что вставка омегона-Km недалеко от З'-конца гена flhB оказала влияние на экспрессию близлежащей AZOBR 150176. Перспективным представляется анализ возможного участия белкового продукта orf AZOBR 150176 в восприятии сигнала о попадании бактерий на плотные/вязкие среды и в передаче этого сигнала к генетическому аппарату синтеза латеральных жгутиков.

В плазмиде AZOBR_p4 A. brasilense Sp245 в составе кластера флагеллярных генов, включающего и структурный ген флагеллина Laf, локализуется вторая копия гена flhB (orf AZOBR_p410073) (GenBank accession no. HE577331) (назовем ее flhB2). Нуклеотидные

последовательности двух генов jlhB штамма Sp245 идентичны на 72%. Белки FlhBl и FlhB2 (GenBank accession nos YP_005032135 и YP_004986942), состоящие соответственно из 358 и 366 аминокислотных остатков, обладают 43% идентичностью/62% сходством. В составе белков FlhB выделяют мембранный N-концевой и цитоплазматический С-концевой домены (Soutourina et al., 2003; Anderson et al., 2010). Вставка омегона-Km в ген flhBl у деривата A. brasilense Sp245.1063, по-видимому, привела к укорочению белкового продукта этого гена на 50 аминокислотных остатков, входящих в состав большого дитоплазматического С-домена. Данная мутация могла негативно сказаться на взаимодействии FlhB с другими белками-экспортерами компонентов жгутика. Консервативный аминокислотный мотив NPTH (в позициях 270-273), по которому осуществляется авторасщепление полипептидной цепи FlhB (между остатками аспарагина и пролина), необходимое для конформационных изменений аппарата экспорта и смены субстратной специфичности в процессе последовательной сборки структурных элементов жгутика (Anderson et al., 2010), в мутантном белке FlhBl сохранился. Однако укорочение цитоплазматического домена, по-видимому, сделало надлежащее функционирование белка FlhB невозможным. Описанный эффект вставки омегона-Km в ген flhBl (появление Fla" La Г фенотипа у мутанта A. brasilense Sp245.1063) может объясняться участием FlhBl в сборке жгутиков двух типов. Поскольку к З'-концу гена flhBl прилегает транскрибируемая в том же направлении открытая рамка считывания AZOBR_150176, кодирующая гипотетическую мультисенсорную гибридную гистидинкиназу/регулятор ответа, не исключено участие этого белка в индукции синтеза Laf в ответ на повышение плотности окружающей среды.

С использованием аналогичного подхода (т.е. клонирования и секвенирования мутантного icoRI-фрагмента геномной ДНК) у штамма A. brasilense Sp245.1610 вставка омегона-Km выявлена за 462-м нуклеотидным остатком плазмидной копии гена fabG (назовем его fabGl) (локус AZOBR_p 1160043) (Рисунок 8).

а

AZOBRjllSOO« fab&l fttbm AZOBRJ.U40045

Примечание: горизонтальными стрелками обозначены кодирующие последовательности и направление их транскрипции, вертикальной стрелкой - место вставки Omegon-Km (О). Масштабная линейка соответствует 1 т.п.н.

Рисунок 8 - Схема участка плазмиды AZOBR_p] штамма A. brasilense Sp245, содержащего вставку Omegon-Km у leaky Fla"/Mot" LaF Swa" мутанта Sp245.1610

Ген fabGl кодирует компонент мультиферментного комплекса ЖК синтаз II типа 3-оксоацил-[ацил-переносящий-белок (АПБ)]-редуктазу (GenBank accession no. CCD01190). Данный фермент катализирует NADPH-зависимое восстановление 3-оксоацил-[АПБ] до 3-гидроксиацил-[АПБ] на первом восстановительном этапе циклического синтеза ЖК (ЕС по. 1.1.1.100). Находящиеся перед fabGl orf AZOBR_pl 160041 и AZOBR_pl 160042 кодирую соответственно консервативный белок с ацил-переносящим доменом (GenBank accession no. CCD01188) и О-сукцинилбензоил-СоА лигазу (GenBank accession no. CCD01189; EC no. 6.2.1.26).

Расчетная длина аминокислотной последовательности мутантного белка FabGl у штамм Sp245.1610 составляет 154 аминокислотных остатка, что меньше на 89 остатка, чем у дикого типа. Поскольку к З'-концу гена fabGl прилегает транскрибируемая в том же направлении or AZOBR_p 1160044 (fabHl) (Рисунок 8), кодирующая 3-оксоацил-[АПБ] синтазу III [GenBank accession no. CCD01191; ЕС no. 2.3.1.¡80], не исключен полярный эффект вставки омегона-Кт на синтез и этого фермента липидного обмена. То обстоятельство, что инактивация fabGl и, возможно, fabHl, не сказывается на жизнеспособности (в лабораторных условиях) мутанта A. brasilense Sp245.1610, свидетельствует о том, что данные гены не являются жизненно важными. К тому же, в почти полной нуклеотидной последовательности генома A. brasilense Sp245 (GenBank accession nos HE577327-HE577333) можно обнаружить, по меньшей мере, еще по два локуса, кодирующих ферменты FabG (GenBank accession nos. CCC97565 и CCC98133) и FabH (GenBank accession nos CCC98525 и CCD01176). К кластеру плазмидных генов A. brasilense Sp245 синтеза ЖК, в состав которого входят fabGl vi. fabHl, прилегает ot AZOBR_p 1160045, кодирующая гипотетический 65-кДа флагеллин. Поскольку между fabH и AZOBR_p 1160045 располагается последовательность из 142 п.н., содержащая четыре стоп-кодона трансляции в трех рамках считывания, можно предположить, что плазмидный ген флагеллина экспрессируется независимо от находящихся перед ним генов синтеза ЖК. Интересно, что в хромосоме штамма A. brasilense Sp245 (GenBank accession no. HE577327) есть еще один ген (локус AZOBR_70032) флагеллина (GenBank accession no. ССС97396), на 92% идентичного и на 96% сходного с флагеллином (GenBank accession no. CCD01192), кодируемым плазмидой AZOBR_pl.

Значимые различия в ЖК составе клеток штамма Sp245 дикого типа и его fabGl мутанта Sp245.1610 не выявлены. Специфичность соответствующего белка FabGl у азоспирилл in vitro пока не определена. Не исключено участие этого фермента в синтезе у азоспирилл сигналов межклеточной коммуникации или необходимых для роения сурфактантов. Изменение характеристик клеточных мембран, важных для нормальной сборки жгутиков азоспирилл, может быть еще одной из причин изменений фенотипа, наблюдаемых у мутанта fabGl. На

примере A. brasilense Sp245 впервые показано, что инактивация у бактерий одной из копий гена (fabGI), кодирующего 3-оксоацил-[АПБ]-редуктазу, не сказываясь на жизнеспособности бактерий, вызывает подавление их подвижности в жидких и полужидких средах, появление дефектов в продукции конститутивного полярного жгутика и полную утрату индуцибельных латеральных жгутиков.

Формирование биопленок на абиотических поверхностях штаммом A. brasilense Sp245 и его мутантами, дефектными по роению. Одним из примеров социального поведения A. brasilense на твердых поверхностях является способность к образованию биопленок. Начальные этапы прикрепления микроорганизмов к твердым поверхностям зависят от наличия жгутиковой подвижности, которая способствует образованию клеточного монослоя на субстрате (Blango, 2010). Учитывая то обстоятельство, что у полученных мутантов нарушены процессы нормальной сборки жгутиков, мы сравнили процесс образования биопленок клетками штамма A. brasilense Sp245 и его нероящихся мутантов на границе раздела фаз "водная среда -твердая гидрофильная поверхность" и "водная среда - твердая гидрофобная поверхность".

В ходе выполнения работы было установлено, что на гидрофобной поверхности

полистирола толщина пленок, формируемых, мутантами Fla" La Г Sp245.1063; leaky Fla7Mot"

La Г Sp245.1610 и leaky FlaTMot" SK039, не имеет существенных различий, но значительно

ниже по сравнению с родительским штаммом. На гидрофильной поверхности A. brasilense

Sp245.1063 и SK039 образуют примерно равноценные биопленки, но менее выраженные, чем у

штамма дикого типа. Биопленки, формируемые мутантом Sp245.1610 на стекле толще, чем у

штамма Sp245, но они менее прочные, что, вероятно, можно объяснить более слабыми

межклеточными контактами, образуемыми в матриксе этих биопленок (Рисунок 9).

Примечание: 1 — "жидкая LB - стекло" и 2 — "жидкая LB — полистирол". Доверительные интервалы определены для 95% уровня значимости.

Аж> 1.0

Sp245

Sp245.1063 Sp245.!«!0 шаш

. SK039

Рисунок 9 — Относительное количество биомассы в пленках А. Ьга5йеп5е Эр245 и его мутантов, сформированных за 6 суток на границе раздела фаз, определенное в результате окрашивания клеток

кристаллическим фиолетовым (Л590)

По-видимому, различия в морфологии биопленок, формируемых на гидрофильной поверхности клетками штаммов Sp245.1610 и Sp245, связаны не только с утратой подвижности, но и с возможным изменением ЖК состава клеточных мембран у мутантного штамма. На примере псевдомонад (Murray et al., 2010) было показано, что между роением (за счет синтеза латеральных жгутиков) и способностью образовывать биопленки существует обратная

зависимость: чем выше жгутиковая подвижность, тем ниже способность к образованию биопленок. Напротив, клетки неподвижных мутантных штаммов Salmonella typhimuriam неспособны к формированию биопленок (Романова с соавт., 2006). Практически все использованные в нашей работе мутанты с нарушением продукции и функционирования жгутиков могут использовать для перемещения по полужидким средам распространение с образованием микроколоний. Поэтому можно предположить, что подобное распространение компенсирует утрату жгутиковой подвижности у мутантов, и является одним из способов распространения клеток при формировании биопленок на абиотических поверхностях.

Колонизация корней проростков пшеницы бактериями штамма А. brasllense Sp245 и его мутантами с измененными полисахаридами. Так как основу биопленок составляют полисахариды, все, что влияет на их продукцию, может оказать влияние на способность бактерий образовывать биопленки. Одной из задач данной работы стало изучение особенностей колонизации корней проростков пшеницы ранее полученными в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН дериватами штамма Sp245, имеющими разные классы мутаций в структуре полисахаридов. Мы инкубировали инокулированные растения в течение 3 часов при равномерном покачивании, чтобы обеспечить штамму дикого типа и его мутанту КМ018 по подвижности равные шансы на контакт с поверхностью корня. Корни части проростков растирали, и определяли количество адсорбированных на них клеток методом высева серийных разведений на плотные среды и подсчета КОЕ (Рисунок 10, 1). Остальные растения выращивали на среде для растений в течение семи суток и определяли количество клеток, заселивших корни (Рисунок 10, 2).

КОЕкЮ'/растение 50т

А

Примечание: I — 3-х суточные проростки; 2 - 10-ти суточные проростки. Доверительные интервалы приведены для 95% уровня значимости.

Рисунок 10 - Результаты количественной оценки колонизации корней проростков мягкой яровой пшеницы сорта Саратовская 29 бактериями

А. ЬгаяНепве

Как оказалось, утрата одного из ЛПС с пента-£>-рамнановым ОПС приводит к уменьшению количества клеток, заселивших корни пшеницы (мутанты серии КМ). Хуже всего адсорбировался мутант, который утратил подвижность (КМ018). Можно предположить, что дефекты, связанные с утратой жгутиковой подвижности, негативно сказываются на

способности к адсорбции азоспирилл на корнях пшеницы. Самые лучшие колонизационные способности продемонстрировал мутант 8р245.5 (Рисунок 10).

Биопленки, образованные на корнях проростков пшеницы бактериями А. ЬгаьИете 8р245.5, толще, чем в случае штамма вр245 дикого типа (Рисунок 11). Поверхность корня более заселена, в отличие от корневых волосков. Необходимо отметить большое количество гелеобразного матрикса в составе биопленок, сформированных штаммом 5р245.5, в который погружены бактерии.

Примечание: образцы окрашивали кристаллическим фиолетовым (1а, 2а, 26) или конго-красным (16, 1в, 2в).

Рисунок 11 - Формирование биопленок

А. brasilen.se 8р245 (1) и Эр245.5 (2) в зоне всасывания корней 10-тидневных проростков пшеницы

Как показано ранее, дериват 5р245.5 образует гораздо более толстые пленки и на поверхности стекла и пластика (Шелудько с соавт., 2008). Можно предположить, что, благодаря геномным перестройкам, которые привели к изменениям состава и структуры ОПС штамма А. ЬгаяНеюе 8р245.5, биосинтез полисахаридов пошел по другому пути, может быть, более древнему. И новый ЛПС позволяет бактериям образовывать более толстые биопленки с большим количеством полисахаридного матрикса на любых поверхностях, что повышает их адаптивные свойства.

Самые низкие показатели колонизации были у мутантов штамма А. ЬгсиИепзе Эр245 серии КМ, у которых нарушился синтез одного из двух ЛПС, характерных для родительского штамма. Однако динамика колонизации проростков бактериями мутантных штаммов КМ 139 и КМ252 не отличалась от заселения корней бактериями дикого типа (в процессе заселения растущих корней количество высеваемых клеток снижалось) (Рисунок 10). Ранее была изучена способность этих мутантов к колонизации абиотических поверхностей. Только КМ018 имел менее выраженные биопленки, чем у дикого типа, на гидрофильной и гидрофобной поверхностях. Но ЬрэП" СаГ МоГ 8\уа~ мутант КМ018 утратил подвижность, что, по-видимому, также влияет на формирование биопленок. ЬрэГ СаГ мутант КМ252 образовывал даже более толстые биопленки на гидрофильной абиотической поверхности, чем Эр245 (Шелудько с соавт., 2008). Исходя из этого, можно предположить, что для формирования полноценных биопленок А. ЬгаяНепяе 5р245 на поверхности корней пшеницы необходимо наличие и Ьрэ!, и ЬрзИ.

Степень выраженности биопленок на поверхности корня в случае всех штаммо согласуется с численностью бактерий, заселивших корневую систему. Радикальные изменени в составе и структуре ОПС у штамма Sp245.5 приводят к активизации процессов бактериально адсорбции на корнях пшеницы и заселения корней с образованием мощных биоплено (Рисунок 11). Таким образом, синтез бактериями. полноценного ЛПС и ПССК во много определяет численность клеток штамма Sp245, колонизирующих корни и формирующ биопленки, степень выраженности биопленок и их расположение на корневой поверхности Радикальные изменения в составе и структуре ОПС у штамма Sp245.5 коррелируют активизацией процесса формирования биопленок не только в корневой системе проростко пшеницы. Очень перспективным партнером пшеницы может стать штамм А. brasilense Sp245.5 обладающий существенно более высоким колонизационным потенциалом, чем други изученные штаммы азоспирилл, и образующий хорошо сформированную биопленку н поверхности корня, в зоне всасывания и на кончике корня.

ВЫВОДЫ

1. У мутанта Azospirillum brasilense Sp245 с ускоренным роением (штамм ВК570) векто для омегонового мутагенеза pJFF350 интегрировал в ДНК 85-МДа плазмиды по соседству генами гипотетических экстрацитоплазматических белков из семейств З-фосфоаденозин-5' фосфосульфат сульфотрансфераз и белков толерантности к толуолу Ttg2.

2. Вставка искусственного транспозона Omegon-Km в хромосомную копию гена flh

(flhBl), кодирующего компонент жгутикового экспортного аппарата, сопровождается дефектами в образовании конститутивного полярного жгутика (Fla) и индуцибельных латеральных жгутиков (Laf) у соответствующего мутанта А. brasilense Sp245. Поскольку к З'-концу гена flhBl прилегает транскрибируемый в том же направлении ген мультисенсорной гибридной гистидинкиназы/регулятора ответа, не исключено участие этого белка в индукции синтеза Laf в ответ на повышение плотности окружающей среды.

3. Инсерция омегона-Кш в хромосомный ген mmsB, кодирующий 3-гидроксиизобутиратдегидрогеназу, сопровождается появлением у мутанта А. brasilense Sp245 значительных дефектов в образовании Fla и обездвиживанием Laf.

4. Вставка омегона-Km в расположенный в плазмиде AZOBR_pl А. brasilense Sp245 ген fabG, кодирующий 3-оксоацил-[ацил-переносящий белок]-редуктазу, приводит к существенным дефектам в сборке Fla и к полной утрате Laf и способности к роению.

5. У дефектных по синтезу или работе жгутиков flhBl, mmsB и fabG мутантов штамма А. brasilense Sp245 снижена способность к образованию биопленок на гидрофобных поверхностях. На абиотических гидрофильных поверхностях поведение мутантов различается:

в отличие от flhBl и mmsB штаммов, у fabGl мутанта А. brasilense Sp245 наблюдается активизация процесса формирования биопленок.

6. Дериват А. brasilense Sp245.5 с крупной плазмидной перестройкой и новым О-полисахаридом обладает повышенной, по сравнению с родительским штаммом Sp245, способностью к образованию биопленок на корнях ассоциативного партнера - растений пшеницы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Ковтунов, Е.А. Изменения в первичной структуре 85-МДа плазмиды, влияющие на жгутикование и подвижность бактерии Azospirillum brasilense Sp245 / Е.А. Ковтунов, A.B. Шелудько, Е.И. Кацы // Геиетика. - 2012. - Т. 48, № 1. - С. 138-141.

2. Ковтунов, Е.А. Инсерция транспозона в хромосомную копию гена flhB сопровождается дефектами в образовании полярного и латеральных жгутиков у бактерий Azospirillum brasilense Sp245 / Е.А. Ковтунов, Л.П. Петрова, A.B. Шелудько, Е.И. Кацы II Генетика. - 2013. - Т. 49, № 8.-С. 1013-1016.

3. Ковтунов, Е.А. Мутанты бактерии Azospirillum brasilense Sp245 со вставкой омегона в генах липидного метаболизма mmsB или fabG дефектны по подвижности и жгутикованию / Е.А. Ковтунов, A.B. Шелудько, М.П. Чернышева, Л.П. Петрова, Е.И. Кацы // Генетика. - 2013. - Т. 49, № 11.-С. 1270-1275.

Публикации в материалах конференций

4. Ковтунов, Е.А. Анализ внутригеномных различий у модельного штамма ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и его производных / Е.А. Ковтунов, Л.П. Петрова, ГЛ. Бурыгин, Е.И. Кацы II Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Матер. IV Межрегион, конф. мол. уч. - Саратов: Научная книга, 2008. - С. 58.

5. Ковтунов, Е.А. Получение мутантов ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense по образованию жгутиков, социальной подвижности и структуре поверхностных полисахаридов / Е.А. Ковтунов, Л.П. Петрова, A.B. Шелудько, Е.И. Кацы И Симбиоз-Россия 2010: Сб. тез. III Всеросс. с междунар. уч. конгр. студ. и аспир.-биологов. - Нижний Новгород, 2010. - С. 97.

6. Ковтунов, Е.А. Получение мутантов ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense с изменениями в социальном поведении / Е.А. Ковтунов, Л.П. Петрова, A.B. Шелудько, Е.И. Кацы // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Матер. V Всеросс. конф. мол. уч. - Саратов: Научная книга, 2010. - С. 24.

7. Ковтунов, Е.А. Колонизация корней проростков пшеницы ассоциативными бактериями Azospirillum brasilense и их мутантами с измененными полисахаридами / Е.А. Ковтунов, Л.П.

Петрова, A.B. Шелудько, Е.И. Кацы // Симбиоз-Россия 2011: Матер. IV Всеросс. с междунар участ. конгр. студ. и аспир.-биологов. - Воронеж: Издат.-полиграф. центр Воронеж, госуд. ун та, 2011.-Т. 1.-С. 70-73.

8. Ковтунов, Е.А. Особенности взаимодействия с корнями проростков пшеницы деривато ризобактерий Azospirillum brasilense с измененной структурой О-полисахаридов / Е.А Ковтунов. Л.П. Петрова, A.B. Шелудько, М.К. Соколова, О.И. Соколов, Е.И. Кацы / Актуальные аспекты современной микробиологии: Матер. VII Молодеж. шк.-конф. с междунар уч. - М.: Макс Пресс, 2011, -С. 25-27.

9. Ковтунов, Е.А. Мутагенез гомолога 3-гидроксиизобутиратдегидрогеназы приводит дефектам в жгутиковании и подвижности альфапротеобактерий A-ospirillwn brasilense Sp245 Е.А. Ковтунов, A.B. Шелудько, Е.И. Кацы // Науч. конф. по биоорган, химии и биотехнологи "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова": Сб. тез. - М.-Пущино, 2011. Т.2.-С. 33.

10. Телешева, Е.М. Влияние меди на формирование ассоциации азоспириллы - прорости пшеницы /ЕМ. Телешева, Ю.А. Филипьечева, Е.А. Ковтунов, О.Э. Варшаломидзе, Е.В. Любунь, A.B. Шелудько // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Матер. VI Всеросс. конф. мол. уч. - Саратов: Научная книга, 2012. - С. 112.

11. Шелудько, A.B. Влияние мутаций в синтезе липополисахаридов на формирование биопленок Azospirillum brasilense в условиях повышенного содержания ионов меди / A.B. Шелудько, Ю.А. Филипьечева, Е.А. Ковтунов, Е.М. Телешева, Е.В. Любунь, Л.П. Петрова // Экологические проблемы промышленных городов: Матер. 6-й Всеросс. научно-практич. конф. с междунар. участ. - Саратов: Сарат. госуд. технич. ун-т, 2013. - С. 171.

12. Ковтунов, Е.А. Формирование биоплёнок штаммом Azospirillum brasilense Sp245 и его мутантами, дефектными по роению / Е.А. Ковтунов, Л.П. Петрова, A.B. Шелудько, Ю.А. Филипьечева, Е.М. Телешева, B.C. Гринёв, Е.И. Кацы // Симбиоз-Россия 2013: Матер. VI Всеросс. с междунар. участ. конгр. мол. уч.-биологов. - Иркутск: Аспринт, 2013. - С. 79-80.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ковтунов, Евгений Анатольевич, Саратов

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ И МИКРООРГАНИЗМОВ

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК (ИБФРМ РАН)

Ковтунов Евгений Анатольевич

ИЗМЕНЕНИЯ В СТРУКТУРЕ ДНК У МУТАНТОВ АССОЦИАТИВНЫХ АЛЬФАПРОТЕОБАКТЕРИЙ АХОБРЖШ ИМВЯА81ЬЕЖЕ ПО ЖГУТИКОВАНИЮ

И СОЦИАЛЬНОМУ ПОВЕДЕНИЮ

03.02.03- микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук Л.П. Петрова

Саратов-2014

Содержание

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................................................................................4

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................................11

1.1 Краткая характеристика ассоциативного растительно-микробного взаимодействия и ассоциативных бактерий рода АговртПит........................11

1.2 Основные гликополимеры поверхности бактериальной клетки..................16

1.3 Бактериальные жгутики........................................................................................................................19

1.4 Социальное поведение бактерий................................................................................................22

Глава 2 ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 32

2.1 Бактериальные штаммы и плазмиды....................................................................................32

2.2 Питательные среды и условия культивирования бактерий..............................33

2.3 Растения, использованные в работе, и условия их выращивания..................34

2.4 Инсерционный мутагенез бактерий..........................................................................................35

2.5 Анализ плазмидного состава бактерий. Препаративное выделение плазмидной и тотальной ДНК. Клонирование ДНК................................................35

2.6 Секвенирование ДНК. Биоинформационный анализ нуклеотидных и предсказанных аминокислотных последовательностей......................................36

2.7 Анализ жирнокислотного состава бактериальных клеток..................................37

2.8 Изучение индивидуальной и социальной подвижности бактерий............37

2.9 Характеристика бактериальных биопленок....................................................................38

2.10 Изучение бактериальной колонизации корней проростков пшеницы... 38

2.11 Просвечивающая электронная микроскопия..................................................................40

2.12 Статистическая обработка результатов................................................................................................40

Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ........................................................................................41

3.1 Характеристика кодирующих последовательностей р85, прилегающих к месту вставки вектора рЛТ^О у мутанта

А. ЬгазИете ВК570 с ускоренным роением............................................................43

3.2 Генетико-физиологическая характеристика омегонового мутанта А.ЬгаяИете 8К039, имеющего дефекты в образовании полярного

жгутика и роении..................................................................................................................................45

3.2.1 Анализ первичной структуры ДНК, прилегающей к вставке омегона у мутанта А ЪгахИете 8К039, имеющего дефекты в образовании полярного жгутика и роении. Идентификация кодирующих последовательностей и характеристика предсказанных продуктов их

трансляции................................................................................................................................................47

3.2.2 Сравнение скорости роста бактерий A. brasilense Sp245 и SK039 в присутствии разных источников азота и (или) углерода....................................50

3.2.3 Характеристика жирнокислотного состава клеток A. brasilense Sp245 и SK039, выращенных на богатых и бедных средах разной плотности 52

3.3 Получение и характеристика новых омегоновых мутантов A. brasilense

Sp245 с изменениями в социальной подвижности........................53

3.3.1 Получение омегоновых мутантов A. brasilense Sp245 с дефектами в жгутиковании и подвижности и анализ их культурально-

морфологических свойств..............................................................................................................53

3.3.2 Анализ первичной структуры ДНК, прилегающей к вставке омегона у мутантов A brasilense Sp245.1063 и A. brasilense Sp245.1610. Идентификация кодирующих последовательностей и характеристика предсказанных продуктов их трансляции........................................................................59

3.3.2.1 Инсерционный мутагенез хромосомной копии генаflhB сопровождается дефектами в образовании полярного и латеральных жгутиков у бактерий штамма^, brasilense Sp245.1063....................................59

3.3.2.2 Инактивация плазмидного генаfabGl, кодирующего гомолог 3-оксоацил-[ацил-переносящий белок]-редуктазы, и блокирование образования латеральных жгутиков и работающего полярного жгутика у бактерий штамма A. brasilense Sp245.1610..........................................63

3.4 Формирование биопленок на абиотических поверхностях штаммом

A. brasilense Sp245 и его мутантами, дефектньми по роению..................65

3.5 Колонизация корней проростков пшеницы бактериями штамма A. brasilense Sp245 и его мутантами с измененными

полисахаридами........................................................................................................................................68

ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................................................................................................................76

ВЫВОДЫ........................................................................................................................................................................................83

Список сокращений и условных обозначений 85 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ..............................87

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Объект диссертационного исследования - стимулирующие рост растений почвенные альфапротеобактерии вида АгоэртИит ЪгаьИете. Эти бактерии обладают разнообразными характеристиками, существенными для взаимовыгодного ассоциативного взаимодействия с растениями: способностью к азотфиксации и денитрификации, синтезу фитогормонов, аэротаксису и хемотаксису, индивидуальной (активное плавание в жидкостях) и социальной (роение или распространение по влажным поверхностям с образованием микроколоний) подвижности, формированию биопленок на растениях и др.

Посредством активного передвижения (А. ЪгаБИете имеют редко встречающееся смешанное жгутикование), используя межклеточную коммуникацию и микромодификацию внешней среды, азоспириллы заселяют новые территории, в том числе, фитосферу. Эти бактерии распространены в разнообразных климатических поясах и приспособлены как к самостоятельному существованию, так и к формированию ассоциаций с широким кругом растений (АБвтш е1 а1., 1995; ВаБЬап, Но^шп, 1997; МоНпа-Рауего et а!., 2008; Браереп & а!., 2009, 2013; Р1ЬасЬ-Ра1с11 et а1., 2011; Не1тап ег а/., 2011). Достаточно давно известна способность азоспирилл и к существованию в организме человека (СоЬеп е( а1., 2004). Геномом азоспирилл, как и многих других альфапротеобактерий, большого размера (до 8 миллионов пар нуклеотидов), состоит из одной или более хромосом и многочисленных плазмид. Это достаточно пластичная структура, что позволяет этим микроорганизмам свободно существовать в разнообразных экологических условиях (Маг1и1-В1с1опе1 et а1., 2000; Кацы, 20026; Петрова с соавт., 2005а; Капеко ег а12010; К^у, 2011; №18ше\¥8кь Буё йг/., 2011). С использованием разнообразных экспериментальных подходов наиболее хорошо изучены штаммы А. ЬгаБПете Бр7 (типовой) и Бр245 (факультативный эндофит, привлекающий особое внимание в связи со способностью к проникновению в корни пшеницы). Недавно были опубликованы данные о почти полной нуклеотидной последовательности хромосомы и шести плазмид (из семи известных) А. ЪгазИете Бр245 (МзшешзкЬВуё е/ а1., 2011) и ряда других штаммов азоспирилл. Однако значительная часть предсказанных генов азоспирилл не имеет

гомологов в существующих базах данных, функция лишь 60-67% генов может быть более или менее достоверно предсказана; и лишь очень небольшая фракция этих генов была исследована экспериментально.

В последние годы стало понятно, что бактерии могут собираться в организованные группы, обмениваться информацией, распределять задачи, учиться на прошлом опыте благодаря краткосрочной эпигенетической памяти и совместно выбирать наиболее оптимальные варианты взаимодействия с внешней средой и другими организмами, т.е. вести "социальную" жизнь, ранее считавшуюся привилегией только высших организмов (Ben-Jacob, 2008). Исследования разнообразных проявлений социального поведения микроорганизмов ("ощущение кворума", формирование биопленок, роение, тянущая подвижность и пр.) способствуют развитию нового раздела микробиологии - социомикробиологии (Parsek, Greenberg, 2005).

Одним из факторов, определяющих адаптивные возможности азоспирилл, является их подвижность. Она обеспечивается наличием жгутиков, что позволяет посредством тактических реакций перемещаться к наиболее благоприятным условиям, закрепляться на поверхности высших организмов, в том числе, растений. В жидких средах азоспириллы перемещаются благодаря наличию единственного полярного жгутика, а на плотных и полужидких средах подвижность обеспечивается синтезом многочисленных латеральных флагелл (Tarrand et al., 1978; Hall, Krieg, 1983, 1984; Falk étal, 1985; Khammas etal., 1989; Schloter étal., 1994). Коллективные перемещения микроорганизмов зависят не только от механизмов, обеспечивающих собственно движение, но и от межклеточных контактов, опосредуемых мажорными компонентами клеточной поверхности, продукции сурфактантов и ряда других факторов (Harshey, 2003).

Способность к колонизации корневой системы растений повышается благодаря способности микроорганизмов переходить от индивидуальной подвижности к коллективной миграции (Дебабов, 1999; Олескин с соавт., 2000; Verstraeten et al., 2008). Следствием этого является увеличение приспособляемости бактерий, в т.ч. азоспирилл к обитанию в гетерогенных экологических нишах.

При изучении механизмов становления ассоциативного симбиоза нельзя не

учитывать наличие особого биологического явления - формирования бактериальных биопленок. Биопленки с дифференцированными клетками бактерий, с гетерогенными микронишами и водными каналами, представляющими примитивную циркуляторную систему, напоминают организацию многоклеточных организмов (Гостев, Сидоренко, 2010). Форма существования микроорганизмов в виде биопленок - это эволюционно выгодный способ надклеточной организации как патогенных, условно-патогенных, так и ассоциативных представителей прокариот.

Таким образом, альфапротеобактерии А. brasilen.se Бр245 являются удобным модельным объектом для экспериментального изучения феномена растительно-бактериальной ассоциативности и социального поведения бактерий. Использование в экспериментальных исследованиях не только штамма дикого типа, но и оригинальных мутантов определенных классов, по-видимому, может способствовать получению новой информации о генетических аспектах социального поведения этих бактерий.

Цель диссертационной работы заключалась в идентификации генетических локусов А. ЬгаяПете, мутагенез которых сопровождается существенными изменениями в жгутиковании и социальном поведении бактерий.

Задачи диссертационного исследования:

1. Анализ изменений в первичной структуре 85-МДа плазмиды (р85), произошедших в результате ее слияния с вектором для омегонового мутагенеза рШР350 у производного штамма А brasilen.se Бр245 с ускоренным роением.

2. Генетико-физиологическая характеристика нескольких омегоновых мутантов А. ЪгаяИете 8р245, имеющих дефекты в образовании полярного и латеральных жгутиков.

3. Мониторинг процесса формирования биопленок на абиотических поверхностях и корнях проростков пшеницы штаммом А. ЪгаьИете Бр245 и его мутантами по структуре гликополимеров клеточной поверхности и подвижности.

Научная новизна работы. Охарактеризованы изменения в первичной структуре плазмиды р85 у одного из дериватов штамма А. ЬгазИете 8р245 с ускоренным роением; аннотированы несколько новых генов р85. На примере мутантов А. ЬгаБПете 8К039 и А. ЪгазИете 8р245.1610 впервые показано, что вставка

инсерционного элемента в одну из копий генов липидного обмена, кодирующих 3-гидроксиизобутиратдегидрогеназу (mmsB) или 3-оксоацил-[ацил-переносящий белок]-редуктазу (fabG), не сказываясь на жизнеспособности бактерий, вызывает появление дефектов в жгутиковании и подвижности. На примере мутанта A. brasilense Sp245.1063 впервые описано негативное влияние инактивации лишь одной из копий гена flhB, кодирующего компонент жгутикового экспортного аппарата, на сборку жгутиков двух видов - конститутивного полярного и индуцибельных латеральных. Выявлено влияние мутаций в генах flhB, mmsB или fabG на эффективность формирования биопленок A. brasilense Sp245 на гидрофильной и гидрофобной абиотических поверхностях. У деривата A. brasilense Sp245.5 с крупной плазмидной перестройкой и новым О-полисахаридом обнаружена способность к более активному, по сравнению с родительским штаммом, формированию биопленок на корнях растения-хозяина.

Научно-практическая значимость работы. Инсерционные мутанты A. brasilense Sp245, полученные в настоящей работе, могут быть использованы в новых работах по изучению механизмов регуляции социального поведения азоспирилл. Штаммы A. brasilense Sp245.1063 и A. brasilense Sp245.1610 депонированы в коллекции ризосферных микроорганизмов Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН) под номерами IBPPM 521 и IBPPM 522, соответственно. Представленная в данной работе информация свидетельствует о необходимости более детального исследования вклада ферментов липидного метаболизма и мультисенсорной гибридной гистидинкиназы/регулятора ответа, кодируемой хромосомным локусом AZOBR 150176, в процессы, существенные для успешной сборки жгутиков и обеспечения подвижности A. brasilense Sp245 в средах разной плотности.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Определенные изменения первичной структуры 85-МДа плазмиды штамма Azospirillum brasilense Sp245 в результате интеграции чужеродной ДНК приводят к ускорению роения бактерий.

2. Инактивация только одной из копий гена flhB, кодирующего компонент жгутикового экспортного аппарата, у бактерий A. brasilense Sp245 может

сопровождаться дефектами в образовании и конститутивного полярного жгутика, и индуцибельных латеральных жгутиков.

3. Вставка инсерционного элемента только в одну из копий генов ферментов липидного обмена 3-гидроксиизобутиратдегидрогеназы {ттзВ) и 3-оксоацил-[ацил-переносящий белок]-редуктазы (/аЬС) может приводить к дефектам в подвижности и жгутиковании А. ЪгазИете 8р245.

4. У дефектных по жгутиковой подвижности АИВ, тпгпбВ или /аЬО мутантов А. ЬгаяИете Бр245 модифицирована способность к формированию биопленок на гидрофобных и гидрофильных абиотических поверхностях.

5. Спонтанное изменение химической структуры О-полисахарида А. ЬгаяИете Бр245 оказывает позитивное влияние на процесс формирования биопленок азоспирилл на корнях проростков пшеницы.

Диссертационная работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов (ЛГМ) ИБФРМ РАН в рамках трех плановых тем НИР: "Изучение вклада плазмид в определение подвижности и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у почвенных ассоциативных бактерий АгояртИит ВтяИете" (2006— 2008 гг., № госрегистрации 01200606181, научный руководитель - д.б.н. Е.И. Кацы); "Изучение генетической регуляции социальной подвижности и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у бактерий, ассоциированных с растениями" (2009-2012 гг., № госрегистрации 01200904390, научный руководитель - д.б.н. проф. Е.И. Кацы) и "Генетический анализ социального поведения альфапротеобактерий АгозртИит ЪгсяИетё" (2013-2015 гг., № госрегистрации 01201359055, научный руководитель - д.б.н. проф. Е.И. Кацы). Исследования частично поддержаны грантами Российского фонда фундаментальных исследований 06-04-48204-а, 12-04-00262-а (руководитель - д.б.н. проф. Е.И. Кацы) и 13-04-01276-а (руководитель - к.б.н. Л.П. Петрова).

Личный вклад соискателя. Экспериментальные данные, на основе которых сформулированы положения и выводы, представленные к защите, получены лично автором. Соискатель принимал непосредственное участие в постановке задач исследования, подготовке и проведении экспериментальных работ, обработке и обсуждении полученных результатов, подготовке публикаций.

Отдельные эксперименты выполнялись при участии коллег из ИБФРМ РАН: д.б.н. проф. Е.И. Кацы, к.б.н. Л.П. Петровой, д.б.н. А.В. Шелудько, к.б.н. М.П. Чернышовой, к.б.н. Ю.А. Филипьечевой, Е.М. Телешевой, д.б.н. О.И. Соколова, к.б.н. М.К. Соколовой и к.х.н. A.M. Бурова. Секвенирование ДНК выполнено в лаборатории молекулярной генетики ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития РФ под руководством к.б.н. А.Г. Прилипова. Автор признателен всем коллегам за помощь в работе.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на IV Межрегиональной конеренции молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 2008); V и VI Всероссийских конференциях молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 2010, 2012); III, IV и VI Всероссийских с международным участием конгрессах студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз-Россия 2010" (Нижний Новгород, 2010), "Симбиоз-Россия 2011" (Воронеж, 2011; присужден Диплом оргкомитета конгресса за лучший доклад (1-е место