Изучение роли плазмид Azospirillum Brasilense в образовании липополисахаридов, содержащих пента-D-рамнановый O-полисахарид

Кулибякина, Ольга Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение роли плазмид Azospirillum Brasilense в образовании липополисахаридов, содержащих пента-D-рамнановый O-полисахарид
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение роли плазмид Azospirillum Brasilense в образовании липополисахаридов, содержащих пента-D-рамнановый O-полисахарид"

На правах рукописи

Кулибякина Ольга Владимировна

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ПЛАЗМИД АгОБРтШШВНАБНЕЖЕ

В ОБРАЗОВАНИИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ

"■■""С- !

ПЕНТА-Б-РАМНАНОВЫЙ О-ПОЛИСАХАРИД

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2009

003480242

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН)

Научный руководитель: доктор биологических наук

Кацы Елена Ильинична

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Попов Юрий Алексеевич

доктор биологических наук, Цивилева Ольга Михайловна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии

наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Защита состоится «//» ноября 2009 г. в 11.00 ч. на заседании диссертационного совета Д 002.146.1 при Учреждении Российской академии наук Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (410049, г. Саратов, проспект Энтузиастов, 13). Факс (8452) 97 03 83.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат диссертации размещен на сайте института http://www.ibppm.saratov.ru/obyav_dis.html

Автореферат разослан «7» октября 2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

. ,7. Jfrh*..

Л.П. Антонюк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Анализ молекулярных механизмов взаимодействия растений с микроорганизмами является актуальным направлением современной биологии (Проворов, 2005; Тихонович и Проворов, 2005, 2007; Проворов с соавт., 2008). За примерно 40-летнюю историю активного исследования взаимовыгодных растительно-микробных ассоциаций бактерии, стимулирующие рост растений, были обнаружены в семействах Azotobacteriaceae, Bacillaceae, Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhodospirillaceae и др. (Dobereiner and Day, 1976; Tarrand et al., 1978; Baldani et al., 1997; Воронин, 1998; Bashan and Holguin, 1998; Hurek and Reinhold-Hurek, 2003). Сравнительно недавно описаны ассоциации клубеньковых бактерий со злаками (Marek-Kozaczuk et al., 2000; Tan et al., 2001; Perrine et al., 2005). С начала 1980-х гг. одним из наиболее интенсивно изучаемых ассоциативных партнеров растений стали альфа-протеобактерии рода Azospirillum из семейства Rhodospirillaceae, обладающие гибким метаболизмом и способностью к обитанию в разнообразных климатических поясах и экологических нишах (Bashan and Holguin, 1997; Steenhoudt and Vanderleyden, 2000; Bashan et al, 2004).

Основной формой существования микроорганизмов в природе, по-видимому, являются биопленки - пространственно и метаболически структурированные сообщества, заключенные в экстраклеточный полимерный матрикс (Романова с соавт., 2006; Николаев и Плакунов, 2007). Каких-либо сведений об особенностях формирования биопленок азоспирилл и роли в этом процессе их поверхностных полимеров к началу наших работ не было.

Среди полимеров клеточной поверхности азоспирилл доминируют липополисахариды (ЛПС, Lps), опосредующие первые этапы взаимодействия этих бактерий с растениями (Федоненко с соавт., 2001, 2004; Yegorenkova et al., 2001). ЛПС состоят из липида А, корового олигосахарида и О-специфического полисахарида (ОПС), или О-антигена (Книрель и Кочетков, 1993; Schnaitman and Klena, 1993). Выяснена структура повторяющегося звена ОПС (являющегося пента-Б-рамнаном) ЛПС штаммов A. brasilense Sp245, SR75 и Spl07 (Fedonenko et al., 2002; Федоненко с соавт., 2005; Бойко с соавт., 2008), а также ряда других штаммов азоспирилл (Fedonenko et al., 2004, 2005, 2008). Сведения о строении липида А и кора ЛПС A. brasilense в доступной литературе нами не найдены.

Для азоспирилл характерна способность к образованию полисахаридов, связывающих прижизненный краситель калькофлуор (ПССК) (СаГ фенотип). ПССК A. brasilense представлены экзополисахаридами (ЭПС) и капсульными полисахаридами (КПС) (Del Gallo et al., 1989). Отсутствие флуоресценции колоний на средах с калькофлуором (СаГ фенотип) использовано для отбора мутантов модельного штамма A. brasilense Sp245 по синтезу ПССК (Katzy et al., 1998).

п \

Работы, посвященные генетическим аспектам образования ЛПС и ПССК у азоспирилл, пока немногочисленны. Как у многих других апьфа-протеобактерий, существенную часть многокомпонентного генома азоспирилл составляют крупные плазмиды, по-видимому, значимые для обеспечения экологического успеха бактерий-хозяев (Martin-Didonet et al., 2000; Steenhoudt and Vanderleyden, 2000; Кацы, 2002, 2003, 2007). В пока единственной из секвенированных плазмид азоспирилл, 90-МДа плазмиде (pRhico) типового штамма A. brasilense Sp7, идентифицированы многочисленные открытые рамки считывания (open reading frames, или orf), предсказанные продукты которых, по-видимому, участвуют в биосинтезе и экспорте полисахаридов (ПС) (Vanbleu et al., 2004).

Использование омегонового мутагенеза позволило выявить в 120-МДа плазмиде (р120) A. brasilense Sp245 четыре локуса, существенных для образования LpsI и LpsII, имеющих различия в антигенной структуре и заряде, но содержащих ОПС с одинаковым повторяющимся звеном (Katzy et al., 1998; Федоненко с соавт., 2004). Мутагенез двух из этих локусов р120 привел к дефектам в образовании не только ЛПС, но и ПССК (Katzy et al., 1998). Более тонкий анализ функций и свойств р120 и других плазмид азоспирилл представляется одной из важнейших предпосылок выяснения молекулярных механизмов ассоциативного взаимодействия этих микроорганизмов с растениями.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилась идентификация в плазмидах A. brasilense новых последовательностей, кодирующих ферменты синтеза полисахаридов, и оценка влияния дефектов в образовании липополисахаридов и полисахаридов, связывающих калькофлуор, на формирование биопленок A. brasilense.

В соответствии с поставленной целью в ходе выполнения работы решались следующие задачи:

1. Анализ нуклеотидной последовательности 14-т.п.н. Xho\ фрагмента 120-МДа плазмиды A. brasilense Sp245, мутагенез которого сопровождается изменениями в структуре ЛПС.

2. Поиск генов, продукты которых могут участвовать в биосинтезе полисахаридов, в клонированном фрагменте 85-МДа плазмиды (р85) A. brasilense Sp245.

3. Характеристика предполагаемых продуктов экспрессии кодирующих последовательностей, выявленных в р120 и р85, с использованием методов биоинформатики.

4. Поиск локусов, гомологичных секвенированным фрагментам р120 и р85, в ДНК штаммов A. brasilense, ЛПС которых содержат ОПС с такой же, как у Sp245, или иной структурой повторяющегося звена.

5. Сравнительный анализ биопленок, формируемых на абиотических поверхностях штаммом A. brasilense Sp245 и его мутантами по образованию ЛПС и ПССК.

Научная новизна работы. В двух плазмидах модельного штамма А. ЬгсиИете Эр245 впервые идентифицированы гены предсказанных гликозилтрансфераз, участвующих в синтезе кора ЛПС, ОПС и ЭПС.

Установлено, что инсерционный мутагенез гена р120, кодирующего АДФ-гептоза:ЛПС-гептозилтрансферазу - один из ферментов синтеза корового олигосахарида ЛПС, приводит к утрате Ьрэ1 с кислой углеводной компонентой, но не влияет на образование ЬрБП с нейтральной углеводной компонентой и такой же, как у Ьрэ1, структурой повторяющегося звена ОПС (пента-О-рамнан).

В 120-МДа плазмиде штамма Л. Ьгайкте Бр 107, ОПС которого, как и у Бр245, является пента-Б-рамнаном, впервые выявлен высокий уровень гомологии с сегментом р 120, содержащим гены ферментов синтеза кора ЛПС, ОПС и ЭПС.

Впервые показано, что изменения состава и (или) структуры плазмид А. Ъгаз'йете 5р245 оказывают заметное влияние на социальную активность этих бактерий, проявляющуюся, в частности, в формировании биопленок. Установлено, что ЛПС и ПССК участвуют в структурной организации биопленок А. ЪгавИете на границе раздела фаз "водная среда - твердая гидрофильная поверхность" и "водная среда - твердая гидрофобная поверхность".

Научно-практическая значимость работы. Результаты мутагенеза плазмидного гена АДФ-гептоза:ЛПС-гептозилтрансферазы, свидетельствующие о наличии у А. ЬгазИете 5р245, по меньшей мере, двух гликоформ кора ЛПС, могут быть учтены в работах по анализу структуры коровых олигосахаридов азоспирилл.

Данные об одинаковой организации у А. ЪгазИете Бр245 и 8р107 локусов 120-МДа плазмид, кодирующих гликозилтрансферазы, и о высоком уровне идентичности двух генов р85 из Бр245 с плазмидными генами гликозилтрансфераз из широкого круга микробов могут найти применение при анализе горизонтального распространения генов в популяциях бактерий, колонизирующих растения.

Новые знания о генетических аспектах биогенеза мажорных углеводсодержащих полимеров клеточной поверхности и о роли этих полимеров в формировании биопленок ассоциативных бактерий, стимулирующих рост и развитие растений, будут полезны при разработке аграрных биотехнологий.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. В плазмиде р120 из штамма Л. ЪгавИете Бр245 идентифицированы четыре гена предсказанных гликозилтрансфераз. Результаты инсерционного мутагенеза одного из этих генов, АДФ-гептоза:ЛПС-гептозилтрансферазы, свидетельствуют об участии данного фермента в образовании Ьрз1.

2. В 120-МДа плазмиде штамма А. ЬгтИепяе Бр107, ОПС которого, как и у Бр245, является пента-О-рамнаном, выявлен высокий уровень гомологии с фрагментом р 120, кодирующим предсказанные ферменты синтеза кора ЛПС, ОПС и ЭПС. Гомология другому сегменту р120, не связанному с образованием ЛПС, в ДНК А. ЬгазИеюе БрЮ7 отсутствует.

3. Несмотря на сходство пяти белков, кодируемых секвенированным фрагментом р120, с гипотетическими продуктами генов 90-МДа плазмиды (pRhico) из типового штамма А. brasilense Sp7, этот район р120 не содержит протяженных участков гомологии pRhico.

4. Выявленные в 85-МДа плазмиде А. brasilense Sp245 orf414 и orf4l8, обладающие высоким уровнем идентичности с генами гликозилтрансфераз и консервативных мембрансвязанных белков из широкого круга почвенных бактерий, не существенны для образования ЛПС с пента-й-рамнановым ОПС.

5. Дефекты в образовании ЛПС и ПССК, вызванные мутациями в р120, оказывают влияние на формирование биопленок производных А. brasilense Sp245 на гидрофобной и гидрофильной поверхностях.

Работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН в рамках плановой темы НИР "Изучение вклада плазмид в определение подвижности и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у почвенных ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense" (№ госрегистрации 01200606181; научный руководитель - д-р биол. наук Е.И. Кацы). Исследования частично поддержаны грантом Российского фонда фундаментальных исследований 06-04-48204-а (руководитель - д-р биол. наук Е.И. Кацы) и грантами Президента РФ НШ-6177.2006.4, НШ-3171.2008.4 (руководитель - заслуженный деятель науки РФ, д-р биол. наук, проф. В.В. Игнатов).

Личный вклад соискателя. Экспериментальные данные, на основе которых сформулированы положения и выводы, представленные к защите, получены лично автором. Секвенирование ДНК осуществлено в лаборатории молекулярной генетики ГУ НИИВ РАМН, а анализ полученных последовательностей - автором совместно с сотрудниками лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН. Иммуноферментный анализ биопленок азоспирилл выполнен совместно с сотрудниками лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН. Соискатель принимала непосредственное участие в постановке всех задач исследования, подготовке и проведении экспериментальных работ, обработке и обсуждении полученных результатов, подготовке публикаций.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III и IV Межрегиональных конференциях молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой" (Саратов, 2006, 2008), Международной школе-конференции "Генетика микроорганизмов и биотехнология", посвященной 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна (Москва-Пущино, 2006), Всероссийской конференции с международным участием "Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем" (Саратов, 2007), 11-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология -наука XXI века" (Пущино, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), отчетной научной конференции ИБФРМ РАН (Саратов, 2008), 5-м Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2009).

Диссертационная работа обсуждена и рекомендована к защите на расширенном заседании лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН 14.09.2009, протокол № 167.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 24 работы, в том числе, 2 работы в журналах, включенных ВАК в "Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук".

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы с изложением и обсуждением собственных результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 257 источников. Объем диссертации составляет 108 машинописных страниц. Работа содержит 16 рисунков и 6 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы

В обзоре литературы обсуждены современные данные о бактериях рода Azospirillum как модельном объекте в исследовании молекулярных основ ассоциативного взаимодействия бактерий и растений; о мажорных полисахаридных компонентах клеточной поверхности грамотрицательных бактерий; об образовании биопленок как важнейшей стратегии приспособления микроорганизмов к окружающей среде.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы исследования

В работе использованы штаммы A. brasilense Sp7, Spl07, SR75 и Sp245 дикого типа; семь мутантов A. brasilense Sp245; три штамма Escherichia coli; пять рекомбинантных плазмид. Бактерии выращивали на среде Luria-Bertani (LB) (Sambrook et al., 1989), картофельной (РМ), малатно-солевой (Döbereiner et ah, 1976) (MSM) или глицериново-солевой (GSM) (Петрова с соавт., 2005) среде.

Плазмиды азоспирилл анализировали с использованием метода Eckhardt (1978). Для препаративного выделения и гидролиза ДНК эндонуклеазами рестрикции, переноса ДНК из гелей на нейлоновые мембраны применяли общепринятые методы (Sambrook et al., 1989). Мечение ДНК пероксидазой хрена и нерадиоактивную Southern-гибридизацию с использованием ECL набора проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя (Amersham Pharmacia Biosciences). Секвенирование осуществляли посредством праймерной "прогулки" по ДНК (Sambrook et al., 1989). Полученные нуклеотидные последовательности транслировали в шести возможных рамках считывания и анализировали свойства всех orf длиной более 100 п.н. Положение стартовых кодонов трансляции в индивидуальных orf предсказывали по результатам выявления перед ними боксов Шайн-Дапьгарно (SD) (Shine and Dalgarno, 1974) и

выравнивания продуктов orf и сходных белков из баз данных (когда это было возможно). Поиск белков, гомологичных белковым продуктам orf осуществляли на сервере Национального центра биотехнологической информации США (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) (Wheeler et al, 2003) с использованием программы локального выравнивания последовательностей (Basic Local Alignment Tool, или BLAST); базы данных о кластерах ортологичных групп белков (Clusters of Orthologous Groups, или COGs) (Tatusov et al., 2003) и базы данных о консервативных доменах (Conserved Domain Database, или CDD) (Marchler-Bauer et al., 2007). Исследование аминокислотных последовательностей осуществляли и с помощью алгоритма Fasta (Pearson and Lipman, 1988) на сервере, поддерживаемом Европейским союзом (http://www.ebi.ac.uk/fasta33). Свойства предсказанных белков анализировали на серверах SignalP (Bendtsen et al, 2004), LipoP (Juncker et al., 2003), PSORTb (Gardy et al., 2005), SCOP (Andreeva et al.,

2004), SMART (Letuniô et al., 2004), Pfam (Bateman et al., 2000), ProDom (Bru et al,

2005), SUPERFAMILY (Wilson et al, 2007) и PredictProtein (Rost and Liu, 2003).

Для ПЦР-амплификации определенных участков секвенированных фрагментов

р120 и р85 подобрали семь пар прямых и обратных праймеров.

Способность бактерий к формированию биопленок изучали, опираясь в основном на работу Ferrière and Clarke (2003). Относительную гидрофобность бактериальных клеток определяли методом высаливания (Lindahl étal., 1981).

Статистическую обработку количественных результатов экспериментов проводили с использованием пакета Microsoft Office Excel 2003 (11.6355.6360) SP 1. Доверительные интервалы определяли для 95% уровня значимости.

Результаты исследований и их обсуждение

Общая характеристика нуклеотидной последовательности двух фрагментов 120- и 85-МДа плазмид A. brasilense Sp245. В данной работе был осуществлен анализ первичной структуры 14-т.п.н. А7го1-фрагмента р120 (р120-//wKM348X), ранее клонированного в составе pOmegon-Km-//?.s348X (Katzy et al, 1998), и 3.3-т.п.н. фрагмента р85 из рекомбинантной плазмиды рЕК248Х (Кацы с соавт., 2001 ). Поиск кодирующих последовательностей привел к идентификации в р120-//иКМ348Х девяти orf - с pl20-/psKM348X-o/// по pl20-//»KM348X-w;/9 (далее для краткости будем называть их просто orfl-orß), а в 3.3-т.п.н. фрагменте р85 - orf4l4 и orf418 (названных в соответствии с количеством аминокислотных остатков в их белковых продуктах) (рис. 1).

Соотношение кодонов в идентифицированных orf удовлетворяет условию [PuNPy]>[PuNPu]/[PyNPy]>[PyNPu] (где Pu - пуриновый, Ру - пиримидиновый, а N - любой нуклеотид) (Shepherd, 1981). Перед инициирующими ко донами всех orf есть SD-боксы длиной 4—5 нуклеотидов, комплементарные З'-концу 16S рРНК. В позиции с +4 по +21 п.н. выявлены участки из не менее трех следующих подряд нуклеотидов, представленных в последовательности ТСАААСТСТТСААТТТ, комплементарной 5'-концу 16S рРНК (Petersen et al., 1988). Общее содержание GC

в orf примерно соответствует таковому в кодирующих последовательностях А. brasilense (Nakamura et ah, 2000). В случае синонимичных кодонов преимущественно используются те из них, которые несут в 3-й позиции G или С. Относительное количество G/C в каждой из трех позиций кодонов orf типично для бактерий с высоким процентом [G+C] в геноме (у азоспирилл этот показатель составляет -69-71%) (Krieg et ah, 1984; Muto and Osawa, 1987): в 3-й позиции количество G/C выше, чем в первой, а в первой позиции выше, чем во второй.

Be Е ЕР EH Р ЦяГХ

I I н

I f................ .................к.............1,к ............И

V"* 1-V*-У"-к1—у

or1§ etil oris ort»

or11 orfi 3 4 oriS

..А...л*.. .ж

P1 Р2 PS P4PS Рв

1TJ1JI.

ВвЕ В§

огНи оМП

Рис. 1. Физико-генетическая карта 14-т.п.н. ХИо\ фрагмента 120-МДа плазмиды А. ЪгавИете 5р245 из рОгг^оп-Кт-//и'348Х (А) и 3.3-т.п.н. сегмента 85-МДа плазмиды А. brasilen.se Бр245 из рЕК248Х (Б). Горизонтальными стрелками обозначены размер и направление транскрипции ог/ со свойствами кодирующих последовательностей. Вертикальной стрелкой показано место вставки омегона-Кш в р120 у мутанта А. ЪгавИете КМ348 (ЬрБГ). Двунаправленными стрелками отмечены целевые участки ПЦР-амплификации с использованием специфических пар прямых и обратных праймеров (Р1-Р7). Сайты рестрикции: X - ХИо1, Е -ЕсоШ, - Bgll\, Р - Рхй, Н - НшЛИ. Масштабная линейка соответствует 1 т.п.н.

В ДНК р120-/р.$КМ348Х также обнаружены три района с аномально низким содержанием [О+С]: между оф и оф (478 п.н., 46% [О-С]), ог/4 и оф (1847 п.н., 40% [С+С]), огрн оф (684 п.н., 54% [й+С]). Эти легкоплавкие обогащенные А/Т межгенные районы содержат многочисленные прямые и инвертированные повторы нуклеотидов. Подобная организация ДНК, возможно, влияет на уровень экспрессии прилегающих генов и повышает вероятность генетических перестроек. На протяжении нескольких сотен п.н. вокруг ог/414/оф418, локализованных в р85, протяженных А/Т богатых участков не найдено.

Свойства белковых продуктов вышеназванных ог/, предсказанные с высокой степенью достоверности (значение Е-уа1ие <10 °5), суммированы в табл. 1.

Идентификация генов гликозилтрансфераз в плазмидах р120 и р85 А. brasilense Sp245. In silico анализ продуктов трансляции orf, выявленных в pi20 и р85, привел к идентификации шести генов предсказанных гликозилтрансфераз (ГТ): orfl, orß, orß и orß в р 120; orf414 и orf418 - в р85 (см. табл. 1). Следует заметить, что важная в функциональном плане вторичная и третичная структура ГТ (растворимых, часто положительно заряженных белков, ассоциированных с внутренней стороной цитоплазматической мембраны), относящихся к одному семейству, сходна у разных бактерий, но уровень гомологии аминокислотных последовательностей этих ферментов обычно не высок (Breton et al., 2006).

Осуществлено сравнение предсказанных продуктов трансляции orf с белками, представленными в базе данных COG. Белки, входящие в состав того или иного COG, предположительно, эволюционировали от общего белка-предшественника (т.е. являются ортологами) и выполняют одинаковую функцию (Tatusov et al., 2003). Проведенный анализ позволил отнести ORF1, ORF7 и ORF8 к COG0438, Predicted Glycosyltransferases (Предсказанные ГТ), а кодируемые р85 ORF414 и ORF418, соответственно, к COG1819, Glycosyltransferases, related to UDP-glucuronosyltransferase (ГТ, родственные УДФ-глюкуронозилтрансферазе) и COGÛ438, Predicted glycosyltransferases (Предсказанные ГТ). Продукт orß родственен COG0859, ADP-heptose:LPS heptosyltransferase (АДФ-гептоза:ЛПС-гептозилтрансфераза).

Продукт orfl содержит два консервативных домена RfaG (УДФ-гликозилтрансфераза/гликогенфосфорилаза), присутствующих в ферментах, участвующих в биогенезе клеточной оболочки (Marchler-Bauer et al., 2006), и два домена Glycostransfl (ГТ группы 1). ГТ группы 1 переносят УДФ-, АДФ-, ГДФ-или ЦМФ-связанные сахара на разнообразные субстраты, в том числе, гликоген, фруктозо-6-фосфат и ЛПС (Marchler-Bauer et ai, 2007). Два сегмента ORF1 обладают наибольшим сходством с разными ГТ (см. табл.1). Весьма вероятно, что orfl кодирует бифункциональный фермент. Белком из COG0438, наиболее сходным с С-концевой частью ORF1, оказалась рамнозилтрансфераза WbpY (375 ак) из P. aruginosa PAOl (31% идентичных и 43% подобных аминокислот из 208 выровненных аминокислотных остатков (ак); E-value = 2e~ß8).

К суперсемейству RfaG и группе 1 ГТ принадлежат также ORF7 и ORF8. Несмотря на то, что белок ORF8 сходен с предсказанными маннозилтрансферазами из альфа-протеобактерии R. palustris (см. табл. 1) и ряда других бактерий, мы не отнесли его к маннозилтрансферазам. Так, ORF8 обладает значимым сходством (21% идентичности и 36% подобия; E-value = 2е~26) и с рамнозилтрансферазой WbpY из гамма-протеобактерии Pseudomonas aeruginosa (GenBank accession no. NP 254135). WbpY осуществляет перенос двух al—>3-связанных остатков D-Rha на ОПС Р. aeruginosa, являющийся D-рамнаном. D-рамноза - это 6-дезокси производное D-маннозы; поэтому WbpY и, например, маннозилтрансферазы Е. coli 09а, осуществляющие синтез D-маннана, могут иметь схожую структуру (Rocchetta et al., 1999).

Таблица 1. Характеристика белковых продуктов orf, локализованных в плазмидах A.brasilense Sp245 р120 (orfl-orß) и р85 (ог/414, ог/418)

ORF Характеристика ORF

Положение домена в аминокислотной последовательности ORF, его название; E-value1 Genbank accession по., название наиболее сходного белка; % идентичности/% подобия (координаты выровненных аминокислотных последовательностей) ORF и сходного белка; E-value

ORF1 (20-204) и (239-590) Суперсемейство ГТ2 RfaG; Зе~°9 -09 и е (107-149) и (411-573) ГТ группы 1, pfam00534; 8е"°3 и 2е-07 ZP 01116121, Фермент биосинтеза О-антигена из Reinekea sp.; 34/55 (1204:307-517); бе-27 YP 376137, ГТ-подобный белок из Synechococcus sp.; 28/44 (225-587:3373); Зе"28

ORF2 (14-102) Семейство Аланиндегидрогеназа/пиридинн уклеотид-трансгидрогеназа, N-концевой домен, pfam05222; 9е-04 NP 214669, Альфа-субъединица возможной НАДФ-трансгидрогеназы PntAa из Mycobacterium tuberculosis', 34/48(14-102:28-107); 9е"°5

ORF3 ^ 1—23) сигнальный пептид (85-220) Ошр-подобный белок Q6QW91 AZOBR, PDA0E7B0; 4е"и Q6QW91, Omp-подобный белок pRhicoOll из A. brasilense Sp7; 33/50 (70-220:307-450); 4е"07

ORF4 (1-99) Q6QW90 AZOBR, PD940841; Зе~20 Q6QW90, Гипотетический белок pRhico012 из A. brasilense Sp7; 49/63 (1100:1-99); бе"15

ORF5 (28-804) Суперсемейство TolB, С-концевой домен, SCOP 1.69; 1.2е-°6 Q6J7Z7, Предсказанная 0-метилтрансфераза Pas34 фага Actinoplanes p/ii"Asp2; 29/42 (6-162:294455); бе"64 Q2DZR5, Аланил-дипептидилпептидаза (транспорт и метаболизм аминокислот) из Acidothermus cellulolyticus 1 IB; 32/45 (398-541:214-355); е"40 Q1NBG2, Олигогалактуронат-лиаза (периплазматический компонент То1 системы транспорта биополимеров) из Sphingomonas sp.; 24/38 (600-804:208430); 4е~75

ORF6 H.o.J И.о.

ORF Характеристика ORF

ORF7 (7-326) ГТ, RfaG; бе"10 (186-389) ГТ группы 1, pfam00534; бе"09 ABQ91728, ГТ семейства 2 из Roseijlexus sp.; 20/42 (19-337:335-610); 2е~09

ORF8 (123-364) ГТ, RfaG; 9e~2J (179-345) ГТ группы 1, pfam00534; 2е~21 NP 948682, Возможная маннозилтрансфераза из Rhodopseudomonas palustris; 33/48 (6353:11-350); 2е"38

ORF9 (1-310) Суперсемейство АДФ-гептоза:ЛПС- гептозилтрансфераз, RfaF; 2е"19 (57-291) ГТ семейства 9 (гептозилтрансфераза), pfam01075; е-09 Q7M8S5, АДФ-гептоза:ЛПС-гептозилтрансфераза из Wolinella succinogenes-, 23/51 (1-308:1-328); 2.2е"°6

ORF414 (10-391) Предсказанная ГТ, COG4671; 2е~100 ZP 02190374, Предсказанная ГТ из Slappia aggregata\ 59/72 (9-393:7-394); бе"127

ORF418 (1-397) ГТ, RfaG, Зе"34 (212-385) ГТ группы 1, pfam00534; 4.6е"30 ZP 01545197, Возможная ГТ из S. aggregate 59/73 (3-406:4-405); 3e"m

Примечания: Ожидаемое количество чисто случайных совпадений с таким же весом. Свидетельством высокой достоверности предсказания является значение Е-уа1ие <е~°5; результатами с Е-уа1ие >е~°3 обычно пренебрегают. 2Гликозилтрансфераза. 3Не обнаружено.

Белок ORF9 отнесен к суперсемейству RfaF (АДФ-гептоза:ЛПС-гептозилтрансферазы) и семейству 9 ГТ, включающему гептозилтрансферазы и ЛПС-Д-ацетил-глюкозаминтрансферазы (см. табл. 1). Ген ГТ RfaF, участвующей в синтезе внутреннего кора ЛПС, был впервые охарактеризован у представителей Enterobacteriaceae, а позднее и у многих других бактерий. Известно, что мутагенез rfaF приводит к полной утрате ОПС и образованию ЛПС R-типа (Schnaitman and Klena, 1993). Омегоновый мутагенез orJ9 позволил выявить функциональную активность ее продукта в клетках A. brasilense. Как нами установлено, у LpsI" мутанта A. brasilense КМ348 вставка омегона-Кш начинается за 594-й п.н. оф. У двух других LpsI" мутантов, КМ127 и КМ134, одиночные вставки омегона были

картированы в том же районе р120 (Katzy et al., 1998). Интересно, что транспозиция омегона-Km в orJ9 вызвала утрату лишь одного из ЛПС (Katzy et al., 1998). Сохранение полноразмерного ОПС в LpsII у мутантов КМ348, КМ 127 и КМ 134 (Katzy et al., 1998) с поврежденной orJ9 можно объяснить возможным образованием, по меньшей мере, двух разных акцепторов О-полисахарида.

Среди многочисленных гомологов ORF1, ORF7 и ORF8 обнаружены и предсказанные белки, кодируемые pRhico из A. brasilense Sp7: возможная маннозилтрансфераза, содержащая 371 ак (GenBank accession no. Q6QW84; 21% идентичности и 33% подобия в 343-ак выравнивании с ORF1, E-value = Зе-29; 22% идентичности и 32% подобия в 355-ак выравнивании с ORF8, E-value = 2е~30) и ГТ-подобный белок из 435 ак (GenBank accession no. Q6QW13; 17% идентичности и 26% подобия в 218-ак выравнивании с ORF7, E-value = 9е~19; 17% идентичности и 26% подобия в 314-ак выравнивании с ORF8, E-value = 2е-26).

Выявлен высокий уровень идентичности (65-69%) нуклеотидных последовательностей orf414 и orf418 из р85 и генов ГТ и консервативных связанных с мембраной белков, локализованных в плазмидах pRLll из R. leguminosarum bv. viciae (Genbank accession no. AM236085), p42e из Rhizobium etli (Genbank accession no. CP000137), pSymB из Sinorhizobitim meliloti (Genbank accession no. AL591985) и др. Представляется весьма вероятным горизонтальный перенос соответствующих плазмид или генных кластеров между бактериями разных родов и видов, населяющими ризосферу. В этой связи можно отметить, что анализ последовательности рЕК248Х (Katsy and Prilipov, 2009) привел к обнаружению в ДНК р85 нового IS элемента, ISAzbal, расположенного на расстоянии 1616 п.н. от З'-конца orf418. IS Azbal, опосредующий слияние р85 с плазмидными векторами, два других IS элемента и ген фаговой интегразы, также обнаруженные в р85 (Katsy and Prilipov, 2009), по-видимому, обеспечивают мобильность этой плазмиды и/или ее сегментов.

Характеристика предсказанных продуктов экспрессии or/2, orf3 и orf4, выявленных в р120. Продукт orJ2 (10.8 кДа, pi 5.0) отнесен к семейству "N-концевой домен аланиндегидрогеназы/пиридин-нуклеотидтрансгидрогеназы" (pfam05222) и COG3288, НАД/НАДФ-трансгидрогеназа, альфа-субъединица (см. табл. 1). Аланиндегидрогеназа катализирует Н АД-зависимое обратимое восстановительное аминирование пирувата до аланина, а пиридиннуклеотид-трансгидрогеназа - восстановление НАДФ+ до НАДФН с сопутствующим окислением НАДН до НАД+. Оба фермента содержат сходные участки и наиболее консервативны на N-конце и в центральном обогащенном глицином районе, являющемся частью сайта связывания НАД(Н) (Delforge et al., 1993). Наличие в ORF2 последовательности 29L(X)2GXGKT36, сходной с Walker А боксом, [AG](X)2GXGK[ST] (Walker et al., 1982), свидетельствует в пользу возможного участия продукта orf2 в связывании нуклеотидов. Поскольку этот белок А. brasilense Sp245, состоящий из 106 аминокислотных остатков, намного меньше

сходных белков из баз данных, предсказание его возможной функции является предварительным.

оф кодирует предсказанный секретируемый белок (22.1 кДа, pi 6.2), имеющий лидерную последовательность 'MTAPYTLSLISTPPVNLTPYAAKA24 с наиболее вероятным сайтом расщепления сигнальной пептидазой I (Perlman and Halvorson, 1983; Bendsen et al., 2004) между 23-м и 24-м аминокислотным остатком. Белок содержит мотив mGXG135 и l42GXGXG146, возможно, вовлеченный в связывание нуклеотидов (Wierenga and Hoi, 1983). Продукт оф гомологичен С-концевой части предсказанного белка pRhicoOll, подобного белкам внешней мембраны (Отр) и кодируемого pRhico из A. brasilense Sp7. ORF3 содержит два внутренних повтора из 35 ак, обладающих взаимными 54%-ной идентичностью и 71%-ным сходством. Эти повторы на 41-45% идентичны и на 64-62% подобны двум сегментам pRhicoOll. Таким образом, гомологичные белки, кодируемые разными плазмидами A. brasilense, имеют схожие аминокислотные повторы в своей первичной структуре.

Гипотетический продукт orf4 (10.4 кДа, pi 5.1) гомологичен гипотетическому белку pRhico012 из A. brasilense Sp7, функция которого не была предсказана (см. табл. 1).

Несмотря на выявленное нами сходство ORF1, ORF3, ORF4, ORF7 и ORF8, кодируемых р120 из A. brasilense Sp245, с гипотетическими продуктами генов pRhico из A. brasilense Sp7 (pRhico GenBank accession no. AY523973), в ДНК pl20-//мКМ348Х есть лишь короткие участки гомологии pRhico. Последовательность, включающая последние 171 п.н. orf2 и первые 6 п.н. оф, на 71% идентична н.о. 220-402 pRhicoOll. Последовательность, включающая последние 154 п.н. оф и первые 81 п.н ог/4, на 66% идентична участку из последних 151 п.н. pRhicoOll и первых 81 п.н. pRhico012, соответственно. Таким образом, pRhicoOll из р90 штамма Sp7 соответствует orf2 и оф из р 120 штамма Sp245. Других участков значимой гомологии между ДНК р 120-//м'КМ348Х и pRhico нами не обнаружено.

Характеристика предсказанных продуктов экспрессии orfS и ог/6, локализованных в р120. ORF5 обладает структурным сходством с С-концевым доменом модельного периплазматического белка TolB Е. coli (см. табл. 1). То1 белки существенны для поддержания целостности внешней мембраны и переноса ряда высокомолекулярных компонентов внешней мембраны к месту их дислокации (Lazzaroni et al., 1999).

С помощью алгоритма PSI (position-specific iterated)-BLAST (Altschul et al., 1997) выявлено значимое сходство трех сегментов ORF5 с О-метилтрансферазой, аланил-дипептидилпептидазой и олигогалактуронат-лиазой (табл. 1). В этой связи следует отметить, что у ряда бактерий одним из контрольных механизмов регуляции длины ОПС является О-метилирование концевых гликозидных остатков. Например, у Е. coli 08 и 09 добавление З-О-метильной группы к D-маннану необходимо для окончания полимеризации, регуляции длины цепи и

экспорта ОПС из цитоплазмы (Clarke et al., 2004). У A. brasilense Sp245 при электрофорезе ЛПС визуализируется небольшое количество высокомолекулярных полос, что свидетельствует о достаточно строгой регуляции длины цепей D-рамнана (Katzy et ai, 1998, Кацы с соавт., 2002). Представляет интерес выяснение вопроса о том, не является ли ORF5 полифункциональным белком, например, метилтрансферазой и компонентом Toi системы транспорта, участвующим в модификации ЛПС, регуляции длины ОПС и транспорте ОПС на поверхность клеток A. brasüense.

Поиск в базах данных не привел к обнаружению белков со значимым сходством с продуктом orf6. Однако в ORF6 выявлены четыре аминокислотных мотива Е(Х)7Е (где X может быть любой аминокислотой), 208EAFALKTPE216, 293ELLGPQGAE301, 393EIELEFHYE401, 425ELQTVQTPE433, присутствующих практически во всех ферментах биосинтеза ЛПС (Breton et al., 2006; Geremia et al., 1996). Такие же мотивы Е(Х)7Е есть в ORF1 (127EGGPMCVLE135, 347EDGLRGEPE355, 503EGAPLAALE5H, 616EKAAAETGE624), ORF7 (298EGFGGPIIE306), ORF8 (277EGFGVPLLE285), ORF9 (130EAFYTDRLE138) и ORF5 (64ENHGIRPME72, 194EKLLTLAAE202, 3ISEVLRTFETE323). Не исключено, что продукт orfô, входящей в состав предполагаемого оперона orfó-orf7-orJ8, так же, как и продукты ог/7 и orf8, участвует в биогенезе ЛПС.

Поиск последовательностей, гомологичных фрагментам р120 и р85 из А. brasilense Sp245, в геномах A. brasilense Sp7, Spl07 и SR75. Охарактеризовав нуклеотидные последовательности фрагментов р 120 и р85 из A. brasilense Sp245, мы осуществили поиск гомологичных ДНК в геномах штаммов A. brasilense Sp7, Spl07 и SR75. Ранее было показано, что существует гомология между ДНК р 120, клонированной в составе pOmegon-Km-/pi348X, и плазмидами с молекулярной массой 120 и более 300 МДа штамма Л. brasilense SR75, ОПС которого идентичен ОПС Sp245 (Федоненко с соавт., 2005).

В нашей работе с помощью реакции Саузерн-гибридизации ДНК р 120-//мКМ348Х с плазмидами A. brasilense Spl07 также был обнаружен сильный позитивный сигнал в 120-МДа репликоне Spl07 (рис. 2).

Рис. 2. Выявление гомологии фрагменту р 120 из А. brasilense Sp245 в плазмидной ДНК A. brasilense Spl07. Обозначения: А - плазмидный профиль штаммов А. brasilense Sp245 (1) и Spl07 (2); Б - результаты Саузерн-гибридизации геля с панели (А) с меченным пероксидазой 14-т.п.н. Ват HI фрагментом р 120 из pOmegon-Km-//«348X.

Напротив, при гибридизации плазмид и тотальной ДНК штаммов SR75 (Федоненко с соавт., 2005) и Spl07 (данная работа) с зондами на основе фрагментов р 120 и р85, не

несущих гены синтеза ПС (с 8.3-т.п.н. ВатШ фрагментом р 120 из рОгг^оп-Кт-/7а048Х и 2.4-т.п.н. ЕсоКI фрагментом р85 из рЕК248Х), были получены негативные результаты.

Для более детального сравнения ДНК А. ЬгаьИете 8р245, 8р107, 8Я75 и Бр7 были поставлены ПЦР с праймерами, специфичными к нескольким сегментам р120-//«КМ348Х и к ог/414 из р85 (рис. 3). Негативные результаты ПЦР на ДНК 5Я75 и 8р107 с праймерами Р7 (рис. ЗЖ), говорят о том, что ГТ, кодируемая ог/414, не играет значимой роли в биосинтезе ЛПС. В ДНК штамма Бр7 выявлен локус, гомологичный ог/414 (рис. ЗЖ), что согласуется с данными о родстве р85 из 8р245 и 115-МДа плазмиды из штамма Бр7 (Кацы, 1992; Кацы с соавт., 2002).

Ни одна из шести ПЦР на ДНК А. ЫшИете 8р7 с праймерами, специфичными к определенным участкам р120, не дала позитивных результатов (рис. ЗА-Е). Данное обстоятельство не удивительно, так как 8р245 и 8р7 серологически не родственны, а ОПС штамма 8р7 является гетерополимером, содержащим не только рамнозу, но и ксилозу, галактозу и фукозу (УапЫеи е/ а/., 2005).

а б в г д е ж

Рис. 3. Результаты ПЦР с праймерами, специфичными к р120 и р85, на

тотальных ДНК A. brasilense Sp245, Sp 107, SR75 и Sp7. Дорожки: (1) маркерная ДНК, 100 bp+ DNA ladder; продукты ПЦР-амплификации на ДНК штаммов Sp245 (2), Sp 107 (3), SR75 (4) и Sp7 (5) с использованием праймеров PI (А), Р2 (Б), РЗ (В), Р4 (Г), Р5 (Д), Р6 (Е) и Р7 (Ж), специфичных к р120 (Р1-Р6) и р85 (Р7). Длина ряда маркерных фрагментов ДНК приведена слева.

Все ПЦР на ДНК A. brasilense Sp245 и Spl07 с праймерами, специфичными к pl20-//wKM348X, привели к образованию ампликонов практически одинаковой длины (рис. ЗА-Е). Появление двух ампликонов в ПЦР с Р1 и Р2 (рис. ЗА-Б) свидетельствует о наличии у Sp245 (и Sp 107) гомологичной ДНК и за пределами pl20-//wKM348X. В ПЦР на ДНК SR75 позитивные результаты были получены только с праймерами Р4 и Р5 к участкам, локализованным перед/в ог/5 (рис. ЗГ-Д). Отсутствие продуктов ПЦР на ДНК SR75 с праймерами PI, Р2, РЗ и Р6, специфичными к некодируюшим районам р120-/ртКМ348Х, подтвердило выявленные ранее различия в физической организации р120-/ртКМ348Х и высоко гомологичного плазмидного сегмента SR75 (Федоненко с соавт., 2005).

Таким образом, с помощью ДНК-гибридизации и ПЦР-амплификации показана практически одинаковая организация гомологичных сегментов 120-МДа плазмид у штаммов A. brasilense Sp245 и Spl07, имеющих идентичную структуру повторяющегося звена ОПС.

Анализ влияния мутаций в синтезе липополисахаридов и полисахаридов, связывающих калькофлуор, на формирование биопленок A. brasilense Sp245. Мы провели эксперименты по изучению образования биопленок на гидрофильных и гидрофобных поверхностях (стекло, полистирол) культурами A. brasilense Sp245 и его мутантов LpsI" LpsII" СаГ Sp245.5; LpsII" СаГ Mot" Swa" KM018; LpsI" KM 127, KM 134 и KM348; LpsII'KM139 и LpsI" СаГКМ252.

Предварительно был осуществлен подбор температуры, времени инкубации и питательной среды (испытывались РМ, MSM, GSM и LB), оптимальных для формирования прочно закрепленных на границе между жидкостью и твердой гидрофильной или гидрофобной поверхностью биопленок штамма дикого типа. Наиболее подходящим для анализа биопленок A. brasilense Sp245 оказалось 96-часовое культивирование бактерий в среде LB при 28°С. В течение 24^8 ч инкубации наблюдали формирование микроколоний, после 72-96 ч инкубации -образование достаточно прочной и плотной пленки.

Осуществили сравнение относительной гидрофобности планктонных клеток А. brasilense Sp245 и его мутантов, инкубированных -20 ч в жидкой среде LB при 28°С, определяя минимальную концентрацию сульфата аммония, при которой наблюдалась агрегация бактерий. Чем более низкая концентрация соли вызывает агрегацию, тем более гидрофобны клетки. Это может объясняться меньшей плотностью отрицательных зарядов (гидрофильных групп) или повышенной плотностью гидрофобных сайтов на более гидрофобных поверхностях. У А. brasilense Sp245.5 выявлено небольшое, но статистически достоверное, увеличение гидрофобности клеточной поверхности, вероятно, связанное с крупной плазмидной перестройкой (приведшей и к реорганизации сегмента р120-/¿«КМ348Х (Кацы с соавт., 2002)), после которой произошло изменение структуры ЛПС. Гидрофобность клеточной поверхности штамма Sp245 и его омегоновых мутантов КМ018, КМ127, КМ134, КМ139, КМ252, КМ348, выращенных в жидкой LB, примерно одинакова (рис. 4). Не исключено, что в случае мутанта Sp245.5 начальный этап взаимодействия с гидрофобной средой протекает быстрее, чем у других штаммов.

С помощью окрашивания кристаллическим фиолетовым оценили количество биомассы в пленках, формируемых штаммом Sp245 и его мутантами за 96 ч на границе раздела фаз "жидкость (LB) - твердая гидрофильная поверхность (стекло)" и "жидкость (LB) - твердая гидрофобная поверхность (полистирол)".

Установлено, что на гидрофильной поверхности мутанты A. brasilense КМ127, КМ 134, КМ348 (мутанты класса LpsI") и КМ252 (мутант класса СаГ LpsI") формируют примерно равноценные биопленки, однако по сравнению со штаммом

дикого типа они лучше выражены, вероятно, из-за того, что у вышеперечисленных мутантов при утрате кислого Ьрэ! происходит изменение заряда клеток.

Концентрация (NH4J2SO4, % 20

-f-

5 -

0 ———1———1———1———1———I—-—I———I———I

Йр245 КМ018 КМ 127 КМ134 КМ 139 КМ252 КМ348 8р245.5

Штамм

Рис. 4. Относительная гидрофобность поверхности планктонных 20-ч культур А. ЪгазНете Бр245 и его мутантов, выращенных в среде ЬВ, определенная методом солевой агрегации.

Толщина пленок, формируемых бактериями штаммов 8р245, КМ124, КМ134, КМ 139 и КМ348 на гидрофобной твердой среде, не имеет существенных различий (рис. 5), что согласуется с примерно одинаковой гидрофобностью их клеток.

Л570 или Л590

2.0 г

1.6

1.2 0.8 0.4

rfi

-ь

1 ¿

ri-

ríl

ril

Ь ¿

-fl

Sp245 KM018 KM 127 KM134 KM .139 KM252 KM348 Sp245.5

Штамм

Рис. 5. Относительное количество биомассы в пленках штаммов A. brasilense, формируемых на границе раздела: 1 - "жидкая LB - полистирол" (А570) и 2 -"жидкая LB - стекло" (Asgo), определенное в результате окрашивания клеток кристаллическим фиолетовым.

Более тонкие пленки образует СаГ LpsII" Mot" Swa" мутант КМ018 и Cal" LpsI" мутант КМ252 на поверхности полистирола, в отличие от других штаммов (рис. 5). Возможно, это объясняется характерной для этих мутантов особенностью: потеря полисахарида, связывающего калькофлуор. Штамм КМ018 проявил сниженную способность формировать биопленки, что, вероятно, связано с его неподвижностью (парализованы жгутики) (рис. 5).

По сравнению с другими исследованными штаммами, СаГ LpsI" LpsII" мутант Sp245.5 формировал более толстые биопленки на гидрофильной и гидрофобной поверхностях (рис. 5).

Для сравнения количества полисахаридных и белковых антигенов в биопленках A. brasilense Sp245 и его мутантов использовали иммунофлуоресцентный анализ (ИФА) с антителами на поверхностные полисахаридные (Ат 1) и белковые (Ат 2) антигены азоспирилл (рис. 6). Данный вид экспериментов был выполнен совместно с сотрудниками лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН д-ром биол. наук Л.Ю. Матора и канд. биол. наук A.A. Широковым.

На гидрофобной поверхности Sp245, LpsI" мутанты КМ127, КМ134, КМ348 и СаГ LpsI" мутант КМ252 образуют равноценные биопленки. Возможно, у данных штаммов активируется синтез полисахаридов в клетках при формировании структурированных сообществ на гидрофобной поверхности (рис. 6). Если рассматривать уровень продукции полисахаридов у Cal" LpsI' мутанта КМ252, то он повышается, т.к. биопленка, формируемая им на полистироле более тонкая, чем у других LpsI" мутантов (рис. 5). Количество полисахаридных антигенов, продуцируемых LpsII" мутантом КМ 139, значительно выше, чем у всех остальных штаммов (рис. 6).

Рассматривая Cal" LpsI" LpsII" мутант Sp245.5, нужно учитывать то, что его ЛПС практически не взаимодействуют с Ат 1 (Кацы с соавт., 2002), и поэтому результаты иммуноферментного анализа не являются достоверными. Незначительный уровень иммуноферментного выявления Sp245.5, вероятно, основан на неспецифическом прикреплении антител.

Количество белковых антигенов, выявляемых с помощью Ат 2, в биопленках мутантов КМ018 и КМ 134 ниже, чем у других штаммов (рис. 6). У КМ018 это связано с меньшей толщиной биопленки (рис. 5). Между биопленками Sp245, КМ 127, КМ139, КМ252, КМ348 и Sp245.5 существенных различий в этом показателе (количество белковых антигенов) нет (рис. 6).

^490

0.5 г

0.4 -

о.з -

.......... .......юна I пиииаи . ципыяй . шита I IIIIIMÜM I нимшз I пития

Sp245 КМ018 КМ 127 КМ.31 КМ 139 КМ252 КМ348 Sp245.5

Штамм

Рис. 6. Сравнение количества полисахаридных и белковых антигенов в биопленках А. ЬгачИете, формируемых на границе раздела "жидкая ЬВ -полистирол", с помощью ИФА: 1 - с антителами на ЛПС штамма Бр245 (Ат 1); 2 -с антителами на интактные клетки Сс1 (Ат 2).

Таким образом, штаммы А. ЪгазИете, утратившие кислый полисахаридный антиген, образуют более толстые биопленки на гидрофильной поверхности. Менее выраженные биопленки на твердой гидрофобной среде, образуют мутанты, неспособные к продукции ПССК. При утрате жгутиковой подвижности, по-видимому, происходит снижение способности бактерий закрепляться на поверхности. Показано, что ЛПС и ПССК участвуют в структурной организации биопленок А. brasilen.se на границе раздела фаз "водная среда - твердая гидрофильная поверхность" и "водная среда - твердая гидрофобная поверхность".

ВЫВОДЫ

1. В 14-т.п.н. сегменте 120-МДа плазмиды А. brasilense Sp245, р120-/psKM348X, локализованы гены, кодирующие четыре предсказанные гликозилтрансферазы, три из которых (ORF1, ORF7, ORF8) относятся к группе 1 УДФ-гликозилтрансфераз/гликогенфосфорилаз, а четвертая (ORF9) - к семейству 9 (гептозилтрансферазы) АДФ-гептоза:ЛПС-гептозилтрансфераз. Инсерционный мутагенез гена АДФ-гептоза:ЛПС-гептозилтрансферазы приводит к утрате Lpsl с кислой углеводной частью, но не влияет на образование LpsII с незаряженной углеводной компонентой и такой же, как у Lpsl, структурой повторяющегося звена ОПС (пента-О-рамнан).

2. С помощью Саузерн-гибридизации и полимеразной цепной реакции с праймерами, специфичными к нескольким участкам р120-//иКМ348Х, показана практически одинаковая организация гомологичных сегментов 120-МДа плазмид у штаммов A. brasilense Sp245 и Spl07, имеющих идентичную химическую структуру ОПС. Гомология другому сегменту р120, 8.4-т.п.н. pl20-//aSK048X, не связанному с образованием ЛПС, в ДНК A. brasilense Spl07 не выявлена.

3. Несмотря на структурное и функциональное сходство пяти белков (ORF1, ORF3, ORF4, ORF7, ORF8), кодируемых pl20-/p.sKM348X, с гипотетическими продуктами генов pRhico из типового штамма A. brasilense Sp7, в данном районе р120 обнаружены лишь короткие участки гомологии pRhico (в orfl-orf4).

4. В 85-МДа плазмиде A. brasilense Sp245 локализованы сцепленные orf414 и orf418, обладающие высоким уровнем идентичности генам гликозилтрансфераз и консервативных мембрансвязанных белков из широкого круга почвенных бактерий. Данный локус р85 не существенен для образования ЛПС, содержащих пента-О-рамнановый ОПС.

5. Дефекты в образовании ЛПС и ПССК, вызванные мутациями в р120, влияют на поведение производных A. brasilense Sp245 на абиотических поверхностях. Мутанты Sp245, утратившие LpsI, образуют более толстые биопленки на гидрофильной поверхности. Мутанты, неспособные к продукции ПССК, формируют менее выраженные биопленки на гидрофобной среде. Утрата ПССК и жгутиковой подвижности негативно сказывается на способности азоспирилл к закреплению и на гидрофильной поверхности. Отсутствие LpsII практически не отражается на поведении мутантов на гидрофобной среде. Утративший рамнан и ПССК мутант A. brasilense Sp245.5, несущий новый ОПС, формирует наиболее толстые биопленки на гидрофильной и гидрофобной поверхностях.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

* - публикация в издании из перечня ВАК

1*. Шелудько A.B., Кулибякина О.В., Широков A.A., Петрова Л.Л., Матора Л.Ю., Кацы Е.И. Влияние мутаций в синтезе липополисахаридов и полисахаридов, связывающих калькофлуор, на формирование биопленок Azospirillum brasilense II Микробиология. 2008. T. 77, № 3. С. 358-363.

2*. Кацы E.K, Шелудько A.B., Петрова Л.П., Варшаломидзе О.Э., Кулибякина О.В., Шульгин C.B. Спонтанные и индуцированные изменения в социальной подвижности ассоциативной бактерии Azospirillum brasilense II Бюлл. Моск. об-ва испыт. природы. Отдел биол. 2009. Т. 114, № 2, прил. 1. С. 132-133.

3. GenBank accession no. EU194338. Azospirillum brasilense strain Sp245 plasmid pl20-/psKM348X, partial sequence. Reference 1 (bases 1 to 13984): Katsy Е.1., Prilipov A.G., Borisov I.V., Kulibyakina O.V., Petrova LP. Region of a 120-MDa plasmid of Azospirillum brasilense Sp245 coding for the lipopolysaccharide core and exopolysaccharide biosynthesis enzymes: [Электронный документ] (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/164685061). Released 01.11.2008.

4. GenBank accession no. ABY66541. Putative group 1 glycosyltransferase [Azospirillum brasilense]. Reference 1 (residues 1 to 630): Katsy E.I., Prilipov A.G., Borisov I.V.,

Kulibyakina O.V., Petrova L.P.: [Электронный документ] (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ protein/164685062). Released 01.11.2008.

5. GenBank accession no. ABY66542. NAD/NADP transhydrogenase alpha subunit-like protein [Azospirillum brasilense], Reference 1 (residues 1 to 106): Katsy E.I., Prilipov A.G., Borisov I.V., Kulibyakina O.V., Petrova L.P.: [Электронный документ] (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/164685063). Released 01.11.2008.

6. GenBank accession no. ABY66543. Hypothetical protein [Azospirillum brasilense]. Reference 1 (residues 1 to 221): Katsy E.I., Prilipov A.G., Borisov I.V., Kulibyakina O.V., Petrova L.P.: [Электронный документ] (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/164685064). Released 01.11.2008.

7. GenBank accession no. ABY66544. Hypothetical protein [Azospirillum brasilense]. Reference 1 (residues 1 to 100): Katsy E.I., Prilipov A.G., Borisov I.V., Kulibyakina O.V., Petrova L.P.\ [Электронный документ] (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/164685065). Released 01.11.2008.

8. GenBank accession no. ABY66545. Hypothetical protein [Azospirillum brasilense]. Reference 1 (residues 1 to 811): Katsy E.I., Prilipov A.G., Borisov I.V., Kulibyakina O.V., Petrova L.P.\ [Электронный документ] (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/164685066). Released 01.11.2008.

9. GenBank accession no. ABY66546. Hypothetical protein [Azospirillum brasilense]. Reference 1 (residues 1 to 484): Katsy E.I., Prilipov A.G., Borisov I.V., Kulibyakina O.V., Petrova LP.: [Электронный документ] (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/164685067). Released 01.11.2008.

10. GenBank accession no. ABY66547. Putative group 1 glycosyltransferase [Azospirillum brasilense]. Reference 1 (residues 1 to 430): Katsy E.I., Prilipov A.G., Borisov I.V., Kulibyakina O.V., Petrova LP.: [Электронный документ] (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/164685068). Released 01.11.2008.

11. GenBank accession no. ABY66548. Putative group 1 glycosyltransferase [Azospirillum brasilense]. Reference 1 (residues 1 to 365): Katsy E.I., Prilipov A.G., Borisov I.V., Kulibyakina O.V., Petrova L.P.: [Электронный документ] (http://www.ncbi.nlm.nih.gov /protein/164685069). Released 01.11.2008.

12. GenBank accession no. ABY66549. Heptosyltransferase [Azospirillum brasilense]. Reference 1 (residues 1 to 349): Katsy Е.1., Prilipov A.G., Borisov I.V., Kulibyakina O.V., Petrova LP.: [Электронный документ] (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/164685070). Released 01.11.2008.

13. Кулибякина O.B., Борисов И.В., Петрова Л.П., Шелудько А.В., Великое В.А., Кацы Е.И., Матора Л.Ю., Широков А.А. Роль липополисахаридов Azospirillum brasilense в формировании биопленок // Математическая биология и биоинформатика: Докл. 1-й Междунар. конф. / Ред. В.Д. Лахно. М.: Макспресс, 2006. С. 35-36.

14. Кацы Е.И., Петрова Л.П., Шелудько А.В., Кулибякина О.В., Борисов И.В., Макрушин К.В., Широков А.А., Матора Л.Ю., Соколова М.К., Соколов О.И., Хлебцов Б.Н. Изменения в структуре клеточной поверхности, социальная активность и взаимодействие Azospirillum brasilense с пшеницей // М1жнар. наук. конф. "Мжробш бттехнологн" (Одесса, Украина, 11-15 сентября 2006 г.): Тез. доповид. Одесса: Астропринт, 2006. С. 65.

15. Кулибякина О.В., Шелудько А.В., Петрова Л.П., Широков А.А., Матора Л.Ю., Кацы Е.И. Роль липополисахаридов Azospirillum brasilense в формировании биопленок // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой / 111 Межрегион, конф. мол. уч.: Сб. матер. Саратов: Научная книга, 2006. С. 15.

16. Шелудько A.B., Широков A.A., Кулибякина О.В., Петрова Л.П., Хлебцов Б.Н., Соколова М.К., Матора Л.Ю., Кацы Е.И. Изменения в социальной активности и взаимодействие Azospirillum brasilense с проростками Triticum aestivum H Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой / III Межрегион, конф. мол. уч.: Сб. матер. Саратов: Научная книга, 2006. С. 18.

17. Широков A.A., Шелудько A.B., Кулибякина О.В., Соколова М.К., Кацы Е.И., Щеголев С.Ю., Матора Л.Ю. Использование иммунохимических подходов в исследовании роли липополисахаридов бактерий Azospirillum brasilense в реализации социального поведения бактерий // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой / III Межрегион, конф. мол. уч.: Сб. матер. Саратов: Научная книга, 2006. С. 30.

18. Кулибякина О.В. Генетические аспекты образования липополисахаридов у Azospirillum brasilense и оценка вклада этих полимеров в формирование биопленок // Сб. тез. Междунар. шк.-конф. "Генетика микроорганизмов и биотехнология", посвященной 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна (Москва-Пущино, 28 ноября-1 декабря 2006 г.). Пущино, 2006. С. 192-193.

19. Katsy E.I., Prilipov A.G., Petrova L.P., Borisov I.V., Sehe lud'ko A. V., Kulibyakina O.V. Properties and functions of the Azospirillum brasilense Sp245 and Sp7 plasmids relevant to associative interactions of these bacteria with plants // Abstr. Intern. Sei. Conf. "S.P. Kostychev and Contemporary Agricultural Microbiology" (Yalta, Ukraine, October 8-12, 2007). Chernihiv: CSTEI, 2007. P. 14.

20. Кацы Е.И., Прилипов А.Г., Кулибякина O.B., Борисов И.В., Петрова Л.П. Идентификация генов 120-МДа плазмиды Azospirillum brasilense Sp245, определяющих образование экзополисахаридов, коровой области липополисахаридов и подвижность // Сб. матер. Всеросс. конф. с междунар. участием "Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем" (Саратов, 25-27 сентября 2007 г.). Саратов: Научная книга, 2007. С. 54.

21. Шелудько A.B., Широков A.A., Кулибякина О.В., Пономарева Е.Г., Тугарова A.B., Никитина В.Е., Антонюк Л.П., Матора Л.Ю., Кацы Е.И. Внутрипопуляционные и внешние факторы, определяющие изменения в социальной активности Azospirillum brasilense // Сб. матер. Всеросс. конф. с междунар. участием "Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем". Саратов: Научная книга, 2007. С. 42.

22. Кулибякина О.В., Прилипов А.Г., Кацы Е.И. Гены 120-МДа плазмиды Azospirillum brasilense Sp245, определяющие синтез коровой области липополисахаридов и полисахаридов, связывающих капькофлуор // Сб. тез. 11-й Междунар. Пущинской шк.-конф. мол. уч. "Биология - наука XXI века" (Пущино, 29 октября-2 ноября 2007 г.). Пущино, 2007. С. 94.

23. Кулибякина О.В., Прилипов А.Г., Кацы Е.И. Идентификация генов гликозилтрансфераз, участвующих в биосинтезе экзополисахаридов и коровой области липополисахаридов, в 120- и 85-МДа плазмидах PGPR Azospirillum brasilense Sp245 // Сб. тез. IV съезда Росс, об-ва биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, IIIS мая 2008 г.). Новосибирск, 2008. С. 494.

24. Кацы Е.И., Петрова Л.П., Шелудько A.B., Варишломидзе О.Э., Кулибякина О.В., Прилипов А.Г. Изменения в структуре плазмид и вариации в проявлении признаков, значимых для взаимодействия ассоциативной бактерии Azospirillum brasilense с растениями // Матер. 5-го Моск. междунар. конгр. "Биотехнология: состояние и перспективы развития", ч. 1 (Москва, 16-20 марта 2009 г.). М.: ЗАО "Экспо-биохим-технологии", РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2009. С. 283.

Подписано в печать 01.10.2009. Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Уч.-изд. л. 1.1. Тираж 100 экз.

Отпечатано с готового оригинал-макета в ИБФРМ РАН. 410049, Саратов, просп. Энтузиастов, 13.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кулибякина, Ольга Владимировна

Список сокращений и условных обозначений

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Бактерии рода Azospirillum как модельный объект в исследовании молекулярных основ ассоциативного взаимодействия бактерий и растений

1.2 Мажорные полисахар идные компоненты клеточной поверхности грамотрицательных бактерий

1.2.1 Структура и биологическая роль липида А ЛПС

1.2.2 Структура и биологические функции кора ЛПС

1.2.3 Структура, биосинтез и биологическая роль О-специфического полисахарида ЛПС

1.2.4 Получение и характеристика мутантов A. brasilense по продукции липополисахаридов и полисахаридов, связывающих калькофлуор

1.3 Образование биоплеиок как важнейшая стратегия приспособления микроорганизмов к окружающей среде

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Штаммы и плазмиды

2.2 Питательные среды и условия выращивания бактерий

2.3 Препаративное выделение плазмидной ДНК

2.4 Выделение тотальной ДНК из бактерий

2.5 Манипуляции с ДНК и блоттинг-гибридизация ДНК

2.6 Секвенирование ДНК. Анализ открытых рамок считывания и характеристика предполагаемых продуктов их экспрессии

2.7 Полимеразные цепные реакции

2.8 Оценка способности бактерий к формированию биопленок

2.9 Определение относительной гидрофобности бактериальной поверхности

2.10 Получение антител и иммуноферментный анализ биопленок

2.11 Статистическая обработка результатов

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Использование методов биоинформатики и молекулярной генетики для изучения функций плазмид A. brasilense

3.1.1 Общая характеристика нуклеотидной последовательности 14-т.п.н. Xhol фрагмента 120-МДа плазмиды и 3.3-т.п.н. сегмента 85-МДа плазмиды A. brasilense Sp

3.1.2 Идентификация шести генов гликозилтрансфераз в плазмидах

A.brasilense Sp245 pi20 и р

3.1.3 Характеристика предсказанных продуктов экспрессии orf2, or/3 и orf4, выявленных в р

3.1.4 Характеристика предсказанных продуктов экспрессии orf5 и ог/6, локализованных в р

3.1.5 Поиск последовательностей, гомологичных фрагментам р120 и р из A. brasilense Sp245, в геномах A brasilense Sp7, Spl07 и SR

3.2 Анализ влияния мутаций в синтезе липополисахаридов и полисахаридов, связывающих калькофлуор, на формирование биопленок A. brasilense Sp

3.2.1 Относительная гидрофобность клеточной поверхности A. brasilense

Sp245 и его мутантов по образованию ЛПС и ПССК

3.2.2 Оценка выраженности бактериальных пленок, образуемых штаммом А. brasilense Sp245 и его мутантами, на поверхности стекла и пластика

3.2.3 Сравнение биопленок, формируемых A. brasilense Sp245 и его мутантами, с использованием иммуноферментного анализа

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение роли плазмид Azospirillum Brasilense в образовании липополисахаридов, содержащих пента-D-рамнановый O-полисахарид"

Актуальность проблемы. Анализ молекулярных механизмов взаимодействия растений с микроорганизмами является актуальным направлением современной биологии (Проворов, 2005; Проворов с соавт., 2008; Тихонович и Проворов, 2005, 2007). За примерно 40-летнюю историю активного исследования взаимовыгодных растительно-микробных ассоциаций бактерии, стимулирующие рост растений, были обнаружены в семействах Azotobacteriaceae, ВасШасеае, Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhodospirillaceae и др. (Воронин, 1998; Baldani el al., 1997; Bashan and Holguin, 1998; Dobereiner and Day, 1976; Hurek and Reinhold-Hurek, 2003; Tarrand el al., 1978). Сравнительно недавно описано ассоциативное взаимодействие клубеньковых бактерий со злаками (Marek-Kozaczuk et al., 2000; Perrine et al., 2005; Tan el al., 2001). Одним из наиболее интенсивно изучаемых ассоциативных партнеров растений стали альфа-протеобактерии рода Azospirilhim из семейства Rhodospirillaceae. Азоспириллы обладают разнообразными двигательными органеллами и тактическими реакциями, очень гибким метаболизмом, способностью к обитанию в разнообразных климатических поясах и экологических нишах (в почве, воде, на подземных и надземных органах растений, в корнях и др.) (Баканчикова с соавт., 1989; Кацы, 2003, 2007; Шелудько и Кацы, 2001; Alexandre et al., 2000; Bashan and Holguin, 1997; Steenhoudt and Vanderleyden, 2000; Zhulin and Armitage, 1992).

Основной формой существования микроорганизмов в природе, по-видимому, являются биопленки - пространственно и метаболически структурированные сообщества, заключенные в экстраклеточный полимерный матрикс (Николаев и Плакунов, 2007; Романова с соавт., 2006). Каких-либо сведений об особенностях формирования биопленок азоспирилл и роли в этом процессе их экстраклеточных полимеров к началу наших работ не было.

Klena, 1993). Выяснена структура повторяющегося звена ОПС (являющегося пента-D-рамнаном) ЛПС штаммов A. brasilense Sp245, SR75 и Sp 107 (Бойко с соавт., 2008; Федоненко с соавт., 2005; Fedonenko et al., 2002), а также ряда других штаммов азоспирилл (Fedonenko et al2004, 2005, 2008). Сведения о строении липида А и кора ЛПС A. brasilense в доступной литературе нами не найдены.

Для азоспирилл характерна способность к образованию полисахаридов, связывающих прижизненный краситель калькофлуор (ПССК) (Са1+ фенотип). ПССК A. brasilense представлены экзополисахаридами (ЭПС) и капсульными полисахаридами (КПС) (Del Gallo et al., 1989). Отсутствие флуоресценции колоний на средах с калькофлуором (СаГ фенотип) использовано для отбора мутантов А. brasilense Sp245 по синтезу ПССК (Katzy et al., 1998).

Работы, посвященные генетическим аспектам образования ЛПС и ПССК у азоспирилл, пока немногочисленны. Как у многих других альфа-протеобактерий, существенную часть многокомпонентного генома азоспирилл составляют крупные плазмиды, по-видимому, важные для обеспечения экологического успеха бактерий-хозяев (Martin-Didonet et al., 2000; Steenhoudt and Vanderleyden, 2000; Кацы, 2002, 2003, 2007). В 90-МДа плазмиде (pRhico) типового штамма A. brasilense Sp7 (пока единственной из секвенированных плазмид азоспирилл) идентифицированы многочисленные открытые рамки считывания (open reading frames, или orj), предсказанные продукты которых, по-видимому, участвуют в биосинтезе и экспорте полисахаридов (ПС) (Vanbleu et al., 2004).

Использование омегонового мутагенеза позволило выявить в 120-МДа плазмиде (р 120) A. brasilense Sp245 четыре локуса, существенных для образования LpsI и LpsII, имеющих различия в антигенной структуре и заряде, но содержащих ОПС с одинаковым повторяющимся звеном (Katzy et al., 1998; Федоненко с соавт., 2004). Мутагенез двух из этих локусов р120 привел к дефектам в образовании не только ЛПС, но и ПССК (Katzy et al., 1998). Более тонкий анализ функций и свойств р120 и других плазмид азоспирилл представляется одной из важнейших предпосылок выяснения молекулярных механизмов ассоциативного взаимодействия этих микроорганизмов с растениями.

В соответствии с поставленной целью в ходе выполнения работы решались следующие задачи:

1. Анализ нуклеотидной последовательности 14-т.п.н. Xhol фрагмента 120-МДа плазмиды A. brasilense Sp245, мутагенез которого сопровождается изменениями в структуре ЛПС.

5. Сравнительный анализ биопленок, формируемых на абиотических поверхностях штаммом A brasilense Sp245 и его мутантами по образованию ЛПС И" ПССК.

Научная новизна работы. В плазмидной ДНК модельного штамма А. brasilense Sp245 впервые идентифицированы гены предсказанных гликозилтрансфераз, участвующих в синтезе кора ЛПС, ОПС и ЭПС.

Установлено, что инсерционный мутагенез гена р120, кодирующего АДФ-гептоза:ЛПС-гептозилтрансферазу — один из ферментов синтеза корового олигосахарида ЛПС, приводит к утрате LpsI с кислой углеводной компонентой, но не влияет на образование LpsII с нейтральной углеводной компонентой и такой же, как у LpsI, структурой повторяющегося звена ОПС (пента-О-рамнап).

В 120-МДа плазмиде штамма A. brasilense Spl07, ОПС которого, как и у Sp245. является пента-О-рамнаном, впервые выявлен высокий уровень гомологии с сегментом р120, содержащим гены ферментов синтеза кора ЛПС, ОПС и ЭПС.

Впервые показано, что изменения состава и (или) структуры плазмид А. brasilense Sp245 оказывают заметное влияние на социальную активность этих бактерий, проявляющуюся, в частности, в формировании биопленок. Установлено, что ЛПС и ПССК участвуют в структурной организации биопленок A. brasilense на границе раздела фаз "водная среда - твердая гидрофильная поверхность" и "водная среда - твердая гидрофобная поверхность".

Научно-практическая значимость работы. Результаты мутагенеза плазмидного гена АДФ-гептоза:ЛПС-гептозилтрансферазы, свидетельствующие о наличии у A. brasilense Sp245, по меньшей мере, двух гликоформ кора ЛПС, могут быть учтены в работах по анализу структуры коровых олигосахаридов азоспирилл.

Данные об одинаковой организации у A. brasilense Sp245 и Spl07 локусов 120-МДа плазмид, кодирующих гликозилтрансферазы, и о высоком уровне идентичности двух генов р85 из Sp245 с плазмидными генами гликозил грансфераз из широкого круга микробов могут найти применение при анализе горизонтального распространения генов в популяциях бактерий, колонизирующих растения.

Новые знания о генетических аспектах биогенеза Мажорных углеводсодержащих полимеров клеточной поверхности и о роли этих полимеров в формировании биопленок ассоциативных бактерий, стимулирующих- рост и развитие растений, будут полезны при разработке аграрных биотехнологий.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. В плазмиде р120 из штамма A. brasilense Sp245 идентифицированы четыре гена предсказанных гликозилтрансфераз. Результаты инсерционного мутагенеза одного из этих генов, АДФ-гептоза:ЛПС-гептозилтрансферазы, свидетельствуют об участии данного фермента в образовании Lpsl.

2. В 120-МДа плазмиде штамма A. brasilense Spl07, ОПС которого, как и у Sp245, является пента-Э-рамнаном, выявлен высокий уровень гомологии с фрагментом р120, кодирующим предсказанные ферменты синтеза кора ЛПС, ОПС и ЭПС. Гомология другому сегменту р120, не связанному с образованием ЛПС, в ДНК A. brasilense Spl07 отсутствует.

3. Несмотря на сходство пяти белков, кодируемых секвенированным фрагментом р120, с гипотетическими продуктами генов 90-МДа плазмиды (pRhico) из типового штамма A. brasilense Sp7, этот район р120 не содержит протяженных участков гомологии pRhico.

4. Выявленные в 85-МДа плазмиде Л. brasilense Sp245 orf414 и orf418, обладающие высоким уровнем идентичности с генами гликозилтрансфераз и консервативных мембрансвязанных белков из широкого круга почвенных бактерий, не существенны для образования ЛПС с пента-О-рамнановым ОПС.

5. Дефекты в образовании ЛПС и ПССК, вызванные мутациями в р120, оказывают влияние на формирование биопленок производных A. brasilense Sp245 на гидрофобной и гидрофильной поверхностях.

Работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН в рамках плановой темы НИР "Изучение вклада плазмид в определение подвижности и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у почвенных ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense" (№ госрегистрации 01200606181; научный руководитель - д-р биол. наук Е.И. Кацы). Исследования, частично поддержаны грантом Российского фонда фундаментальных исследований 06-04-48204-а (руководитель - д-р биол. наук Е.И. Кацы) и грантами Президента РФ НШ-6177.2006.4, НШ-3171.2008.4 (руководитель - заслуженный деятель науки РФ,- д-р биол. наук, проф. В.В. Игнатов).

100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна (Москва-Пущино, 2006), Всероссийской конференции с международным участием "Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем" (Саратов, 2007), 11-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология -наука XXI века" (Пущино, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), отчетной научной конференции ИБФРМ РАН (Саратов, 2008), 5-м Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2009).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Кулибякина, Ольга Владимировна

выводы

1. В 14-т.п.н. сегменте 120-МДа плазмиды A. brasilense Sp245, р120-/psKM348X, локализованы гены, кодирующие четыре предсказанные гликозилтрансферазы, три из которых (ORF1, ORF7, ORF8) относятся к группе 1 УДФ-гликозилтрансфераз/гликогенфосфорилаз, а четвертая (ORF9) - к семейству 9 (гептозилтрансферазы) АДФ-гептоза:ЛПС-гептозилтрансфераз. Инсерционный мутагенез гена АДФ-гептоза:ЛПС-гептозилтрансферазы приводит к утрате LpsI с кислой углеводной частью, но не влияет на образование LpsII с незаряженной углеводной компонентой и такой же, как у LpsI, структурой повторяющегося звена ОПС (пента-Б-рамнан).

2. С помощью Саузерн-гибридизации и полимеразной цепной реакции с праймерами, специфичными к нескольким участкам pl20-/p,sKM348X, показана практически одинаковая организация гомологичных сегментов 120-МДа плазмид у штаммов A. brasilense Sp245 и Spl07, имеющих идентичную химическую структуру ОПС. Гомология другому сегменту р120, 8.4-т.п.н. pl20-/7aSK048X, не связанному с образованием ЛПС, в ДНК A. brasilense Spl07 не выявлена;'

3. Несмотря на структурное и функциональное сходство пяти белков (ORF1, ORF3, ORF4, ORF7, ORF8), кодируемых р120-//иКМ348Х, с гипотетическими продуктами генов pRhico из типового штамма A. brasilense Sp7, в данном районе р120 обнаружены лишь короткие участки гомологии pRhico (в orf2-orf4).

4. В 85-МДа плазмиде A. brasilense Sp245 локализованы сцепленные ог/414 и orf418, обладающие высоким уровнем идентичности генам гликозилтрансфераз и консервативных мембрансвязанных белков из широкого круга почвенных бактерий. Данный локус р85 не существенен для образования ЛПС, содержащих пента-Б-рамнановый ОПС.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю доктору биологических наук Елене Ильиничне Кацы за помощь и поддержку на всех этапах выполнения работы.

Соискатель искренне благодарит сотрудников лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН кандидата биологических наук Лилию Петровну Петрову и кандидата биологических наук Андрея Вячеславовича Шелудько, сотрудников лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН докгора биологических наук Ларису Юрьевну Матора и кандидата биологических наук Александра Александровича Широкова, сотрудника лаборатории биохимии ИБФРМ РАН кандидата биологических наук Юлию Петровну Федоненко за совместную работу и обсуждение полученных результатов; директора ИБФРМ РАИ доктора химических наук, профессора Сергея Юрьевича Щеголева - за поддержку внедрения методов биоинформатики в НИР ИБФРМ РАН.

Диссертант признательна заведующему лабораторией молекулярной генетики Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, кандидату биологических наук Алексею Геннадьевичу Прилипову за секвенирование ДНК.

Заранее благодарю всех оппонентов и рецензентов данной работы за замечания и предложения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одной из перспективных моделей для изучения ассоциативного растительно-микробного взаимодействия являются бактерии рода Azospirillum (Bashan and Holguin, 1997; Katupitiya et al., 1995; Levanony et al., 1989), обладающие крупным геномом и многочисленными плазмидами. f

К началу наших исследований усилиями ученых из Бельгии, Франции и России было показано участие 90- и 115-МДа плазмид типового штамма A. brasilense Sp7, а также 85- и 120-МДа плазмид модельного штамма A. brasilense Sp245 в определении признаков, важных для формирования и функционирования ризоценозов (Кацы, 2002, 2002а, 20026, 2003; Кацы и Шелудько, 1999; Кацы с соавт., 2001, 2002; Федоненко с соавт., 2005; Katzy et al., 1998; Matora et al., 1990; Michiels et al., 1989, 1994; Steenhoudt and Vanderleyden, 2000; Vanbleu et al., 2004, 2005). При этом пока только 90-МДа плазмида (pRhico) типового штамма А. brasilense Sp7 была недавно полностью секвенирована и детально охарактеризована in silico; в этой плазмиде обнаружены многочисленные открытые рамки считывания, по-видимому, ответственные за синтез углеводных полимеров клеточной поверхности азоспирилл (Vanbleu et al., 2005).

У штамма A. brasilense Sp245 ранее были выявлены LpsI и Lpsll с. тонкими различиями в структуре и заряде ОПС и/или кора, детектируемыми посредством иммунохимических реакций с поликлональными антителами на ЛПС и ионообменной хроматографии (Федоненко с соавт., 2004; Katzy et al., 1998). С использованием поликлональных антител на ЛПС штамма Sp245 в LpsI и Lpsll выявлен общий эпитоп и дополнительный эпитоп - в Lpsll. При этом ОПС LpsI и Lpsll содержат идентичные повторяющиеся звенья из пяти остатков D-рамнозы: —>2)-P-D-Rha/7- (1 —>3 )-a-D-Rha/?-( 1 —>3 )-a-D-Rha/?-( 1 -*2)-a-D-Rha/?-( 1 —^-a-D-Rha/?-(1—* (Федоненко с соавт., 2004; Fedonenko et al., 2002).

Для характеристики новых плазмидных локусов A. brasilense, кодирующих ферменты синтеза полисахаридов, мы воспользовались созданной в лаборатории генетики микроорганизмов (ЛГМ) ИБФРМ РАН коллекцией мутантов A. brasilense Sp245, не способных к синтезу LpsI или Lpsll: LpsI" СаГ КМ252; LpsI" КМ127, КМ134, КМ348; Lpsll" КМ139 и СаГ LpsIF Mot" Swa" KM018. У всех мутантов одиночные вставки Omegon-Km локализованы в разных сайтах 120-МДа плазмиды A. brasilense Sp245. Для определения нуклеотидной последовательности фрагментов р120 и р85 были использованы сконструированные в ЛГМ ИБФРМ РАН рекомбинантные плазмиды.

С целью идентификации в секвенированной плазмидной ДНК кодирующих последовательностей и получения новых знаний о функциях их продуктов А. brasilense мы обратились к находящимся в открытом доступе базам биоинформационных данных и инструментам in silico анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей. Полученные in silico результаты были сопоставлены со сведениями о тех изменениях в фенотипе бактерий, к которым привели мутации в плазмидной ДНК A. brasilense Sp245. Кроме того, были разработаны олигонуклеотидные праймеры, использование которых в полимеразной цепной реакции (наряду с плазмидоспецифичными зондами в реакциях Саузерн-гибридизации) позволило провести сравнение определенных участков плазмид из нескольких штаммов A. brasilense дикого типа.

В р120 впервые идентифицированы гены, ответственные за синтез ОПС, коровой области ЛПС и ЭПС. Так, в 14-т.п.н. Xhol фрагменте р120, р120-//>sKM348X, идентифицированы четыре предполагаемых гена гликозилтрансфераз. Инсерционный мутагенез одного из них, кодирующего предсказанную АДФ-гептоза:ЛПС-гептозилтрансферазу, приводит к утрате Lpsl и не влияет на образование LpsII.

В последнее время большое внимание исследователей привлекает горизонтальный генетический перенос, очевидно, служащий средством генерации внутрипопуляционного разнообразия бактерий и расширения их адаптационных возможностей. Генетический материал может передаваться не только от одного поколения к другому при репродукции (так называемый вертикальный генетический перенос), но и посредством горизонтального переноса между одновременно живущими организмами, не связанными друг с другом отношениями непосредственного родства.

Почва является естественным резервуаром ДНК, поступающей из отмерших клеток животных, растений, микроорганизмов, а также в результате активной экскреции некоторыми микробами. Эта ДНК может трансформировать клетки других микроорганизмов. Высокая концентрация экссудатов вокруг корня и гипокотиля, а также повышенная влажность вокруг корней растений способствуют поддержанию высокой локальной концентрации доноров и реципиентов, по-видимому, благоприятной для горизонтального конъюгативного переноса ДНК.

С использованием зондов на основе фрагментов плазмид A. brasilense Sp245 нами был проведен поиск гомологичных последовательностей в геномах штаммов A. brasilense SR75, Sp245, Spl07 и Sp7, выделенных из ризосферы и корней растений в России (SR75) и Бразилии (остальные штаммы). Полученная информация была дополнена данными ПЦР. В результате выявлена практически одинаковая организация гомологичных сегментов 120-МДа плазмид у штаммов А. brasilense Sp245 и Spl07, имеющих идентичную химическую структуру О-полисахарида (пента-Б-рамнан). Гомологии с другим сегментом р120, 8.4-т.п.н. pl20T/7aSK048X, не имеющим отношения к образованию ЛПС, в ДНК A. brasilense Spl07 не обнаружено.

В р85 идентифицированы гены с высоким уровнем гомологии плазмидным генам гликозилтрансфераз и консервативных мембрансвязанных белков из широкого круга почвенных бактерий.

Из вышесказанного можно сделать вывод, что, наиболее вероятно, возникновение гомологии происходит за счет горизонтального переноса генов между бактериями, находящимися в ризосфере. Для подтверждения этого предположения необходим анализ соответствующих генетических локусов у более представительной выборки штаммов почвенных и ризосферных бактерий.

Полученные нами результаты могут послужить фундаментом для конструирования новых инсерционных Lps мутантов азоспирилл с целью идентификации более широкого спектра генов, определяющих синтез О-специфических и связывающих калысофлюор полисахаридов; а также скрининг широкого спектра штаммов A. brasilense и A. lipoferum на наличие гомологии генам р120, необходимый для ответа на вопрос о том, насколько типична локализация генов, кодирующих синтез ЛПС, в плазмидных ДНК азоспирилл.

В нашей работе показано также, что ЛПС и ПССК участвуют в структурной организации биопленок A. brasilense на границе раздела фаз "водная среда-твердая гидрофильная поверхность" и "водная среда-твердая гидрофобная поверхность".

Как оказалось, спонтанные (как у мутанта Sp245.5) или индуцированные (как у штаммов КМ018, КМ127, КМ134, КМ139, КМ252 и КМ348) изменения состава и (или) структуры плазмид A. brasilense Sp245 оказывают заметное влияние на социальную активность этих бактерий, проявляющуюся, в частности, в формировании биопленок.

Установлено, что производные A. brasilense Sp245 с мутациями в плазмидных генах, утратившие LpsI, образуют более толстые биопленки на гидрофильной поверхности. Мутанты, неспособные к продукции ПССК, формируют менее выраженные биопленки на твердой гидрофобной поверхности. Дефекты в продукции ПССК в совокупности с утратой жгутиковой подвижности негативно сказываются на способности азоспирилл к закреплению на гидрофобной и гидрофильной поверхности. Утрата LpsII при сохранении ПССК практически не влияет на поведение мутантов на гидрофобной среде, по-видимому, за счет компенсаторного повышения общего уровня продукции полисахаридов. Радикальная перестройка в структуре полисахаридных антигенов, сопровождающаяся появлением ЛПС, более гетерогенных по длине, коррелирует с активизацией процесса формирования биопленок соответствующего мутанта на разнообразных твердых поверхностях.

По-видимому, скоординированная экспрессия полного набора плазмидных генов, влияющая на широкий спектр клеточных структур и функций, важна для более быстрой адаптации A. brasilense Sp245 к новой среде обитания и для успешной реализации комплексной программы развития микробного сообщества -биопленки. Для получения новых знаний о влиянии наследственности и внешних условий на разнообразные проявления социальной активности бактерий (образование биопленок, роение, коллективная миграция с образованием микроколоний) необходим анализ особенностей адаптации к гетерогенной среде обитания разнообразных производных A. brasilense с изменениями в структуре плазмид, ЛПС и коллективной подвижности.

Оригинальность работы заключается, на наш взгляд, в использовании в качестве объектов исследования не только штаммов дикого типа, но и уникальных мутантов A. brasilense по структуре углеводных полимеров клеточной поверхности, а также плазмидоспецифичных ДНК-зондов для гибридизационного анализа и разработанных олигонуклеотидов для ПЦР-амплификации целевых районов ДНК. С помощью молекулярных зондов, использованных в работе, можно, в частности, дифференцировать генетические перестройки у родственных штаммов.

Новые знания о генетических факторах, влияющих на формирование мажорных структур клеточной поверхности у ассоциативных бактерий, стимулирующих рост и развитие растений, будут полезны при разработке аграрных биотехнологий и конструировании бактерий, перспективных для использования в биотехнологии.

Автор надеется, что выполненная работа послужит хорошим фундаментом для продолжения изучения генетической регуляции биосинтеза и функционирования полисахаридов клеточной поверхности у ассоциированных с растениями бактерий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кулибякина, Ольга Владимировна, Саратов

1. Андреева И.Н., Редькина Т.В., Исмаилов С.Ф. Роль индолилуксусной кислоты в стимулирующем действии Azospirillum brasilense на бобово-ризобиальный симбиоз // Физиология растений. 1993. - Т. 40, № 6. - С. 901-906.

2. Баканчикова Т.Н., Мякиньков А.Г., Павлова-Иванова Л.К., Майсурян А.Н. Участие генов хемотаксиса в установлении ассоциативных взаимоотношений между Azospirillum brasilense и пшеницей // Молекуляр. генетика. 1989. - № 4. -С. 24-32.

3. Басилашвили Л.А., Нуцубидзе Н.Н. Распространение азоспирилл в некоторых почвах Грузии // Сообщ. АН Грузинской ССР. 1984. - Т. 114, № 3. - С. 617-620.

4. Бойко А.С. Структурные особенности липополисахаридов азоспирилл в связи с их участием в коммуникации микроорганизмов в ризосфере: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Саратов: ИБФРМ РАН, 2009. - 23 с.

5. Бойко А.С., Федоненко Ю.П., Коннова О.Н., Коннова С.А., Игнатов В.В. Характеристика липополисахаридов азоспирилл I серогруппы // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Матер, конф. Саратов: Научная книга, 2008. - С. 47.

6. Воронин A.M. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений // Сорос, образоват. журн. 1998. - № 10. - С. 25-31.

7. Бурыгин Г.Л., Широков А.А., Шелудько А.В., Кацы Е.И., Щеголев С.Ю., Матора Л.Ю. Выявление чехла на поверхности полярного жгутика Azospirillum brasilense II Микробиология. 2007. - Т. 76, № 6. - С. 822-829.

8. Васюк Л.Ф., Боровков А.В., Хальчицкий А.Е., Ионкова С.В., Чмелева З.В. Бактерии рода Azospirillum и их влияние на продуктивность небобовых растений // Микробиология. 1989. - Т. 58, № 4. - С. 642-652.

9. Гельфанд М.С. Апология биоинформатики // Биофизика. 2005. - Т. 50, № 4. - С. 752-776.

10. Гельфанд М.С., Лгабецкий В.А. Биоинформатика: от эксперимента к компьютерному анализу и снова к эксперименту // Вестник РАН. 2003. - Т. 73, № 11.-С. 987-994.

11. Егоренкова И.В., Коннова С.А., Федоненко Ю.П., Дыкман Л.А., Игнатов В.В. Роль полисахаридсодержащих компонентов капсулы Azospirillum brasilense в адсорбции бактерий на корнях проростков пшеницы // Микробиология. 2001. - Т. 70, № 1.-С. 45-50.

12. Зубова С.В., Иванов А.Ю., Прохоренко И.Р. Влияние состава кора липополисахаридов Escherichia coli К-12 на поверхностные свойства клеток // Микробиология. 2008. - Т. 77, № 3. - С. 336-341.

13. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика. 2004. - Т. 40, № 11.-С. 1445-1456.

14. Иммуноферментный анализ: Пер. с англ. / Под ред. Нго Т., Ленхоффа Г. -М.: Мир, 1988.-С. 172-192.

15. Кацы Е.И. Плазмида р85 Azospirillum brasilense Sp245: Изучение круга возможных хозяев и несовместимости с плазмидами Azospirillum brasilense Sp7 // Молекуляр. генетика. 1992. - № 9-10. - С. 8-11.

16. Кацы Е.И. Генетико-биохимические и экологические аспекты подвижности и хемотаксиса у фитопатогенных, симбиотических и ассоциированных с растениями бактерий // Усп. соврем, биол. 1996. - Т. 116, № 5. - С. 579-593.

17. Кацы Е.И. Свойства и функции плазмид ассоциированных с растениями бактерий рода Azospirillum II Усп. соврем, биол. 2002. - Т. 122, № 4. - С. 353-364.

18. Кацы Е.И. Характеристика генов, выявленных в ДНК 120-МДа плазмиды у мутанта бактерии Azospirillum brasilense Sp245, дефектного по продукции полярного жгутика и роению // Генетика. 2002а. - Т. 38, № 1. - С. 22-32.

19. Кацы Е.И. Молекулярно-генетические процессы, влияющие на ассоциативное взаимодействие почвенных бактерий с растениями / Под ред. Игнатова В.В. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2003. - 169 с.

20. Кацы Е.И. Молекулярная генетика ассоциативного взаимодействия бактерий и растений: состояние и перспективы исследований / Под ред. В.В. Игнатова. М.: Наука, 2007. - 86 с.

21. Кацы Е.И., Борисов И.В., Машкина А.Б., Панасенко В.И. Влияние плазмидного состава на реакции хемотаксиса у ассоциированных со злаками бактерий Azospirillum brasilense Sp245 // Молекуляр. генетика. 1994. - № 2. - С. 29-32.

22. Кацы Е.И., Борисов И.В., Шелудько А.В. Влияние интеграции вектора pJFF350 в 85-МДа плазмиду Azospirillum brasilense Sp245 на жгутикование и подвижность бактерий // Генетика. 2001. - Т. 37, № 2. - С. 183-189.

23. Кацы Е.И., Шелудько А.В. Картирование локуса fla в плазмиде с молекулярной массой 120 МДа у бактерии Azospirillum brasilense Sp245 // Генетика. 1999. - Т. 35, № 10. - С. 1367-1372.

24. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. И. Структура кора // Биохимия. 1993. - Т. 58, № 2. -С. 182-201.

25. Коннова С.А., Макаров О.Е., Скворцов И.М., Игнатов В.В. Экзополисахариды бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и Spl07 // Микробиол. журнал. 1992. - Т. 54, № 2. - С. 31-42.

26. Марусина А.И., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П., Кравченко И.К., Гальченко В.Ф. Система олигонуклеотидных праймеров для амплификации геновnifH прокариот из разных таксономических групп // Микробиология. 2001. - Т. 70, № 1.-С. 73-78.

27. Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И., Щеголев С.Ю. Иммунохимический анализ О-специфических полисахаридов почвенных азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilense II Микробиология. 1998. - Т. 67, № 6. - С. 815-820.

28. Матора Л.Ю., Щеголев С.Ю. Антигенная идентичность липополисахаридов, капсулы и экзополисахаридов Azospirillum brasilense II Микробиология. 2002. - Т. 71, № 2. - С. 211-214.

29. Николаев Ю.А., Плакунов В.К. Биопленка "город микробов" или аналог многоклеточного организма? // Микробиология. - 2007. - Т. 76, № 2. - С. 149-163.

30. Петрова Л.П. Генетические аспекты продукции компонентов клеточной поверхности у ассоциативных азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilense: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Саратов: РосНИПЧИ "Микроб", 1998. - 22 с.

31. Позднякова Л.И., Каневская С.В., Леванова Г.Ф., Барышева Н.Н., Пилипенко Т.Ю., Богатырев В.А., Федорова Л.С. Таксономическое -изучение азоспирилл, выделенных из злаков Саратовской области // Микробиология. 1988. -Т. 57, №2.-С. 275-278.

32. Проворов Н.А. Молекулярные основы симбиогенпой эволюции: от свободноживущих бактерий к органеллам // Журн. общ. биол. 2005. - Т. 66, № 5. -С. 371-388.

33. Проворов Н.А., Воробьев Н.И., Андронов Е.Е. Макро- и микроэволюция бактерий в системах симбиоза // Генетика. 2008. - Т. 44, №. 1. - С. 12-28.

34. Романова Ю.М., Смирнова Т.А., Андреев А.Л., Ильина Т.С., Диденко Л.В., Гинцбург А.Л. Образование биопленок пример "социального" поведения бактерий // Генетика. - 2006. - Т. 75, № 4. - С. 556-561.

35. Сафронова И. Ю., Ботвиненко И. В. Межклеточный матрикс Bacillus subtilis 271: полимерный состав и функции // Микробиология. 1998. - Т. 67, № 1. - С. 5560.

36. Тихонович И.А., Проворов Н.А. Принципы селекции растений на взаимодействие с симбиотическими микроорганизмами // Вестник ВОГиС. 2005. -Т. 9, № 3. - С. 295-305.

37. Тихонович И.А., Проворов Н.А. Кооперация растений и микроорганизмов: новые подходы к конструированию экологически устойчивых агросистем // Усп. соврем, биол. 2007. - Т. 127, № 4. - С. 339-357.

38. Федоненко Ю.П., Егоренкова И.В., Коннова С.А., Игнатов В.В. Участие липополисахаридов азоспирилл во взаимодействии с поверхностью корней пшеницы // Микробиология. 2001. - Т. 70, № 3. - С. 384-390.

39. Федорова Л.С., Позднякова Л.И., Каневская С.В. Выделение азоспирилл из культурных и дикорастущих злаков Саратовской области // Микробиология. -1985. Т. 54, № 4. - С. 684-685.

40. Чернышева М.П., Игнатов В.В. Внеклеточные протеолитические и пектинолитические ферменты бактерий рода Azospirillum в процессе ассоциативного взаимодействия с растениями // Сб. докл. XII юбил. конф. "Ферменты микроорганизмов". Казань, 2001. - С. 48-49.

41. Шелудько А.В., Кацы Е.И. Образование на клетке Azospirillum brasilense полярного пучка пилей и поведение бактерий в полужидком агаре // Микробиология. 2001. - Т. 70, № 5. - С. 662-667.

42. Achouak W., Pages J.M., De Mot R., Molle G., Heulin T. A major outer membrane protein of Rhanella aquatilis fimctions as a porin and root adhesion // J. Bacteriol. 1995. - V. 180.-P. 909-913.

43. Alexandre G., Greer S.E., Zhulin I.B. Energy taxis is the dominant behavior in Azospirillum brasilense II J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 6042-6048.

44. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 3389-3402.

45. Andreeva A., Howorth D., Brenner S.E., Hubbard T.J., Chothia C., Murzin A.C. SCOP database in 2004: refinements integrate structure and sequence family data // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32. - P. 226-229.

46. Arsene F., Katupitiya S., Kennedy I.R., Elmerich C. Use of lacZ fusions to study the expression of Azospirillum brasilense in association with plants // Mol. Plant-Microbe Interact. 1994. - V. 7. - P. 748-757.

47. Aspinall G.O., Lynch C.M.' Pang H., Shaver R.T., Moran A.P. Chemical structures of the core region of Campylobacter jejuni 0:3 lipopolysaccharide and an associated polysaccharide //FEBS J. 1995. - V. 231. - P. 570-578.

48. Aspinall G.O., McDonald A.G., Pang H., Kurjanczyk L.A., Penner J.L. Lipopolysaccharide of Campylobacter coli serotype 0:30. Fractionation and structure of liberated core oligosaccharide // J. Biol. Chem. 1993. - V. 268. - P. 6263-6268.

49. Baldani V.L., Baldani J.I., Dobereiner J. Effects of Azospirillum inoculation on root infection and nitrogen incorporation in wheat // Can. J. Microbiol. 1983. - V. 29. -P. 924-929.

50. Baldani J.I., Caruso L., Baldani V.L.D., Goi S.R., Dobereiner J. Recent advances in BNF with non-legume plants // Soil Biol. Biochem. 1997. - V. 29. - P. 911-922.

51. Barak R., Nur I., Okon Y. Aerotactic response of Azospirillum brasilense // J. Bacteriol. 1982. -V. 52. - P. 643-649.

52. Barak R., Nur I., Okon Y. Detection of chemotaxis in Azospirillam brasilense II J. Appl. Bacteriol. 1983. - V. 54. - P. 399-403.

53. Barbierio С., Zanelli Т., Galli E., Zanetti G. Wheat inoculation with Azospirillum brasilense Sp6 and some mutants altered in nitrogen fixation and indole-3-acetic acid production // FEMS Microbiol. Lett. 1986. - V. 36. - P. 87-90.

54. Bartling C.M., Raetz C.R. Steady-state kinetics and mechanism of LpxD, the N-acyltransferase of lipid A biosynthesis // Biochemistry. 2008. - V. 13. - P. 5290-5302.

55. Barton L.L., Johnstone G.V., Miller S.O. The effect of Azospirillum brasilense on iron adsorption and translocation by sorghum // J. Plant Nutr. 1986. - V. 9. - P. 557-565.

56. Bashan Y., Holguin G. Inter-root movement of Azospirillum brasilense and subsequent root colonization of crop and weed seedlings growing in soil // Microb. Ecol. 1995.-V. 29.-P. 269-281.

57. Bashan Y., Holguin G. Azospirillum-plant relationships: environmental and physiological advances (1990-1996) // Can. J. Microbiol. 1997. - V. 43. - P. 103-121.

58. Bashan Y., Holguin G. Proposal for the division of plant growth-promoting rhizobacteria into two classifications: biocontrol-PGPB (plant growth promoting bacteria) and PGPB // Soil Biol. Biochem. 1998. - V. 30. - P. 1225-1228.

59. Bashan Y., Levanony H. Current status of Azospirillum inoculation technology: Azospirillum as a challenge for agriculture // Can. J. Microbiol. 1990. - V. 36. - P. 591-608.

60. Bashan Y., Levanovy H., Girma M. Changes in proton efflux of intact wheat roots induced by Azospirillum brasilense Cd // Can. J. Microbiol. 1989. - V. 39. - P. 691-697.

61. Bateman A., Birney E., Durbin R., Eddy S.R., Howe K.L., Sonnhammer E.L.L. The Pfam protein families database // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - P. 263-266.

62. Bendtsen J.D., Nielsen H., von Heijne G., Brunak S. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0 // J. Mol. Biol. 2004. - V. 340. - P. 783-795.

63. Beveridge T.G., Graham L.L. Surface layers of bacteria // Microbiol. Rev. -1991.-V. 55.-P. 684-705.

64. Bhat U.R., Carlson R.W. Chemical characterization of pH-dependent structural epitopes of lipopolysaccharides from Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli II J. Bacteriol. 1992. - V. 174. - P. 2230-2235.

65. Bhat U.R., Forsberg L.S., Carlson R.W. Structure of lipid A component of Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli lipopolysaccharide // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269.-P. 14402-14410.

66. Bhat U.R., Krishnaiah B.S., Carlson R.W. Re-examination of the structures of the lipopolysaccharide core oligosaccharides from Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli II Carbohydr. Res. 1991a. - V. 220. - P. 219-227.

67. Bhat U.R., Mayer H., Yokota A., Hollingsworth R.I., Carlson R.W. Occurrence of lipid A variants with 27-hydroxyoctacosanoic acid in lipopolysaccharides from members of the family of Rhizobiaceae U J. Bacteriol. 1991b. - V. 176. - P. 2155— 2159.

68. Brand S.S., Vik A., Friedman L., Kolter R. Biofilms: the matrix revisited // Trends Microbiol. 2005. -V. 13. - P. 20-26.

69. Brandenburg K., Andra J., Miiller M., Koch M.H.J., Garidelc P. Physicochemical properties of bacterial glycopolymers in relation to bioactivity // Carbohydr. Res. 2003. - V. 338. - P. 2477-2489.

70. Breton C., Snajdrova L., Jeanneau С., Коса J., Imberty A. Structures and mechanisms of glycosyltransferases // Glycobiology. 2006. - V. 16. - P. 29R-37R.

71. Brozek K.A., Raetz C.R.H. Biosynthesis of lipid A in Escherichia coli. Acyl carrier protein-dependent incorporation of laurate and myristate // J. Biol. Chem. 1990. -V. 265.-P. 15410-15417.

72. Brzocka P.M., Signer E.R. IpsZ, a lipopolysaccharide gene involved in symbiosis of Rhizobium meliloti II J. Bacteriol. 1991. - V. 173. - P. 3235-3237.

73. Bru C., Courcelle E., Carrere S., Beausse Y., Dalmar S., Kahn D. ProDom database of protein domain families: more emphasis on 3D // Nucleic Acids Res. 2005. -V. 33.-P. 212-215.

74. Buetow L„ Smith Т.К., Dawson A., Fyffe S., Hunter W.N. Structure and reactivity of LpxD, the N-acyltransferase of lipid A biosynthesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. - Y. 104. - P. 4321-4326.

75. Burdman S., Dulguerova G., Okon Y., Jurkevitch E. Purification of the outer membrane protein of Azospirillum brasilense, its affinity to plant roots and its involvement in cell aggregation II Mol. Plant-Microbe Interact. 2001. - V. 14. - P. 555-561.

76. Cacciari I., Lippi D., Pietrosanti W. Phytohormone-like substances produced by single and mixed diazotrophic cultures of Azospirillum and Arthrobacter II Plant Soil. -1989.-V. 115.-P. 151-153.

77. Carlson R.W., Reuhs В., Chen T-B., Bhat U.R., Noel K.D. Lipopolysaccharide core structures in Rhizobium etli and mutants deficient in 0-antigen // J. Biol Chem. -1995. V. 270. - P. 11783-11788.

78. Choma A., Komaniecka I. Characterization of a novel lipid A structure isolated from Azospirillum lipoferum lipopolysaccharide // Carbohydr. Res. 2008. - V. 343. - P. 799-804.

79. Choma A., Sowinski P., Mayer H. Structure of the O-specific polysaccharide of Mesorhizobium huakii IF015243 // Carbohydr. Res. 2000. - V. 329. - P. 459-464.

80. Costacurta A., Keijers V., Vanderleyden J. Molecular cloning and sequence analysis of an Azospirillum brasilense indole-3-pyruvate decarboxylase gene // Mol. Gen. Genet. 1994. - V. 243. - P. 463-472.

81. Croes C.L., Moens S., Van Bastelaere E., Vanderleyden J., Michiels K.W. The polar flagellum mediates Azospirillum brasilense adsorption to wheat roots // J. Gen. Microbiol. 1993. - V. 139. - P. 2261-2269.

82. Davey M., Caiazza N.C. Rhamnolipid surfactant production affect biofilm architecture in Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriol. 2003. - V. 185. - P. 10271036.

83. Davey M.E., O'Toole G.A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. - V. 64. - P. 847-867.

84. De Castro C., Bcdini E., Nunziata R., Rinaldi R., Mangoni L., Parrilli M. Elucidation of the O-chain structure from the lipopolysaccharide of Agrobacterium tumefaciens strain C58 // Carbohydr. Res. 2003. - V. 338. - P. 1891-1894.

85. De Castro C., Carannante A., Lanzetta R., Nunziata R., Piscopo V., Parrilli M. Elucidation of two O-chain structures from the lipopolysaccharide fraction of Agrobacterium tumefaciens strain F/l // Carbohydr. Res. 2004. - V. 339. - P. 24512455.

86. De Castro C., De Castro O., Molinaro A., Parrilli M. Structural determination of the O-chain polysaccharide from Agrobacterium tumefaciens, strain DSM30205 // Eur. J. Biochem. 2002. -V. 269. - P. 2885-2888.

87. Del Gallo M., Negi M., Neyra C.A. Calcofluor- and lectin-binding exocellular polysaccharides of Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum И J. Bacteriol. -1989.-V. 171.-P. 3504-3510.

88. Dobbelaere S., Croonenborghs A., Thys A., Vande Broek A., Vanderleyden J. Phytostimulatory effect of Azospirillum brasilense wild type and mutant strains altered in IAA production on wheat//Plant Soil. 1999.-V. 212. - P. 155-164.

89. Dommelen A.V., Bastelaere E.V., Keijers V., Vanderleyden J. Genetics of Azospirillum brasilense with respect to ammonium transport, sugar uptake, and chemotaxis // Plant Soil. 1997. -V. 194. - P. 155-160.

90. Dunn A.K., Klimowicz A.K., Handelsman J. Use of a promoter trap to identify Bacillus cereus genes regulated by tomato seed exudate and a rhizosphere resident, Pseudomonas aureofaciens // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. - P. 1197— 1205.

91. Eckert В., Weber O.B., Kirchhof G., Halbritter A., Stoffes M., Hartmann A. Azospirillum doebereinerae sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with the C4-grass Miscanthus II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. - V. 51. - P. 17-26.

92. Eckhardt T. A rapid method for the identification of plasmid deoxyribonucleic acid in bacteria // Plasmid. 1978. - V. 1. - P. 584-588.

93. Falk E.C., Dobereiner J., Johnston J.L., Krieg N.R. Deoxyribonucleic acid homology of Azospirillum amazonense Magalhaes et al. 1984 and emendation of the description of the genus Azospirillum // Intern. J. Syst. Bactcriol. 1985. - V. 35. - P. 117-118.

94. Fedonenko Y.P., Konnova O.N., Zatonsky G.V., Konnova S.A., Kocharova N.A., Zdorovenko E.L., Ignatov V.V. Structure of the O-polysaccharide from the Azospirillum lipoferum Sp59b lipopolysaccharide // Carbohydr. Res. 2005. - V. 340. -P. 1259-1263.

95. Fedonenko Y.P., Zatonsky G.V., Konnova S.A., Ignatov V.V. Structure of the O-specific polysaccharide of the lipopolysaccharide of Azospirillum brasilense Sp245 // Carbohydr. Res. 2002. - V. 337. - P. 869-872.

96. Fedonenko Y.P., Zdorovenko E.L., Konnova S.A., Kachala V.V., Ignatov V.V. Structural analysis of the O-antigen of the lipopolysaccharide from Azospirillumlipoferum SR65 // Carbohydr. Res. 2008. - Epub ahead of print. - PMID 18561903.

97. Fellay R., Krisch H.M., Prentki P., Frey J. Omegon-Km: a transposable element designed for in vivo insertional mutagenesis and cloning of genes in Gram-negative bacteria // Gene. 1989. - V. 76. - P. 215-226.

98. Ferriere L., Clarke D.J. The RcsC sensor kinase is required for normal biofilm formation in Escherichia coli K-12 and controls the expression of a regulon in response to growth on a solid surface // Mol. Microbiol. 2003. - V. 50. - P. 1665-1682.

99. Frazzon J., Schrank I.S. Sequencing and complementation analysis of the nifUSV genes from Azospirillum brasilense II FEMS Microbiol. Lett. 1998. - V. 159. -P. 151-158.

100. Geremia R.A., Petroni E.A., Ielpi L., Henrissat B. Towards a classification of glycosyltransferases based on amino acid sequence similarities: prokaryotic a-mannosyltransferases // Biochem. J. 1996. - V. 318. - P. 133-138.

101. Greer-Phillips S.E., Stephens B.B., Alexandre G. An energy taxis transducer promotes root colonization by Azospirillum brasilense I I J. Bacteriol. 2004. - V. 186. -P. 6595-6604.

102. Gudlavalleti S.K., Forsberg L.S. Structural characterization of the lipid A component of Sinorhizobium sp. NGR234 rough and smooth form lipopolysaccharide // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - P. 3957-3968.

103. Hall-Stoodley L., Costerton J., Stoodley P. Bacterial biofilm: from the natural environment to infection diseases // Microbiology. 2004. - V. 2. - P. 95-108.

104. Halverson L.J., Stacey G. Signal exchange in plant-microbe interaction // Microbiol. Rev. 1986. -V. 50. - P. 193-225.

105. Harari A., Kigel J., Okon Y. Involvement of IAA in the interaction between Azospirillum brasilense and Panicum miliaceum roots // Plant Soil. 1988. - V. 110. - P. 275-282.

106. Hauwaerts D., Alexandre G., Das S.B., Vanderleydcn J., Zhulin I.B. A major chemotaxis gene cluster in Azospirillum brasilense and relationships between chemotaxis operons in alpha-proteobacteria // FEMS Microbiol. Lett. 2002. - V. 208. - P. 61-67.

107. Heinrich D., Hess D. Chemotactic attraction of Azospirillum lipoferum by wheat roots and characterization of some attractants // Can. J. Microbiol. 1985. -V. 31. -P. 26-31.

108. Heinrichs D.E., Yethon J.A., Whitfield C. Molecular basis for structural diversity in the core regions of the lipopolysaccharides of Escherichia coli and Salmonella enterica // Mol. Microbiol. 1998. - V. 30. - P. 221-232.

109. Hurek Т., Reinhold-Hurek B. Azoarcus sp. strain BH72 as a model for nitrogen-fixing grass endophytes // J. Biotechnol. 2003. - V. 106. - P. 169-178.

110. Jain D.K., Patriquin D.G. Root hair deformation, bacterial attachment and plant growth in wheat-Azospirillum association // Appl. Environ. Microbiol. 1984. - V. 48. -P.1208-1213.

111. Jain D.K., Patriquin D.G. Characterization of a substance produced by Azospirillum which causes branching of wheat root hairs // Can. J. Microbiol. 1985. -V.31.-P. 206-210.

112. Jain N., Wyckoff Т., Raetz C., Prestegard J. Rapid analysis of large protein-protein complexes using NMR-derived orientational constraints: The 95 kDa complex of LpxA with acyl carrier protein // J. Mol. Biol. 2004. - V. 343. - P. 1379-1389.

113. Jayaraj J., Muthukrishnan S., Liang G.H. Transfer of a plant chitinase gene into a nitrogen-fixing Azospirillum and study of its expression // Can. J. Microbiol. 2004. -V. 50.-P. 509-513.

114. Jefferson K.K. What drives bacteria to produce a biofilm? // FEMS Microbiol. Lett. 2004. - V. 236. - P. 163-173.

115. Jofre E., Lagares A., Mori G. Disruption of dTDP-rhamnose biosynthesis modifies lipopolysaccharide core, exopolysaccharide production, and root colonization in Azospirillum brasilense II FEMS Microbiol. Lett. 2004. - V. 231. - P. 267-275.

116. Juncker A.S., Willenbrock H., von Heijne G., Nielsen H., Brunak S., Krogh A. Prediction of lipoprotein signal peptides in Gram-negative bacteria // Protein Sci. 2003. -V. 12.-P. 1652-1662.

117. Kadrmas J.K., Raetz C.R.H. Enzymatic synthesis of lipopolysaccharide in Escherichia coll II J. Biol. Chem. 1998. - V. 273, No. 5. - P. 2799-2807.

118. Kapulnik Y., Okon Y., Henis Y. Changes in root morphology of wheat caused by Azospirillum inoculation И Can. J. Microbiol. 1985. -V. 31. - P. 881-887.

119. Karpati E., Kiss P., Ponyi Т., Fendrik I., de Zamaroczy M., Orosz L. Interaction of Azospirillum lipoferum with wheat germ agglutinin stimulates nitrogen fixation 11 J. Bacteriol. 1999. - V. 181.-P. 3949-3955.

120. Katzy E.I., Matora L.Yu., Serebrennikova O.B., Scheludko A.V. Involvement of a 120-MDa plasmid of Azospirillum brasilense Sp245 in production of lipopolysaccharides // Plasmid. 1998. - V. 40. - P. 73-83.

121. Katsy E.I., Prilipov A.G. Mobile elements of an Azospirillum brasilense Sp245 85-MDa plasmid involved in replicon fusions // Plasmid. 2009. - V. 62. - P. 22-29.

122. Keenleyside W.J., Whitfield C. A novel pathway for O-polysaccharide biosynthesis in Salmonella enterica serovar Borreze // J. Biol. Chem. 1996. — V. 271. -P.28581-28592.

123. Khammas K.M., Ageron E., Grimont P.A., Kaiser P. Azospirillum irakense sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with rice roots and rhizosphere soil // Res. Microbiol. 1989. -V. 140. - P. 679-693.

124. Kim S.-H., Jia W., Bishop R.E., Gyles C. An msbB homologue, carried on plasmid p0157 encodes an acyltransferase involved in lipid A biosynthesis in Escherichia coli 0157:H7 // Infect. Immun. 2004. - V. 72. - P. 1174-1180.

125. Koch A.L. The biophysics of gram-negative periplasmic space // Crit. Rev. Microbiol. 1998. -V. 24. - P. 23-59.

126. Koch A.L., Woeste S.W. The elasticity of the sacculus of Esherichia coli // J. Bacteriol. 1992. - V. 174. - P. 4811^1819.

127. Kosma P., Reiter A., Zamyatina A., Wimmer N., Gluck A., Brade H. Synthesis of inner core antigens related to Chlamydia, Pseudomonas and Acinetobacter LPS // J. Endotoxin Res. 1999.-V. 5.-P. 157-163.

128. Krieg N.R., Dobereiner J. Genus Azospirillum (Tarrand, Krieg and Dobereiner, 1979) // Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / Eds. Krieg N.R., Holt J.G. -Baltimore, 1984. P. 94-104.

129. Lagares A., Caetano-Anolles G., Niehaus K., Lorenzen J., Ljunggren H.D., Ptihler A., Favelukes G.A. Rhizobium meliloti lipopolysaccharide mutant altered in competiveness for nodulation of alfalfa // J. Bacteriol. 1992. - V. 174. - P. 5941-5952.

130. Lazzaroni J.C., Germon P., Ray M.C., Vianney A. The Tol proteins of Escherichia coli and their involvement in the uptake of biomolecules and outer membrane stability // FEMS Microbiol. Lett. 1999. -V. 177. - P. 191-197.

131. Lepek V.C., D'Antuono A.L. Bacterial surface polysaccharides and their role in the rhizobia-legume association // Lotus Newsletter. 2005. - V. 35. - P. 93-105.

132. Lerouge I., Vanderleyden J. O-antigen structural variation: mechanisms and possible roles in animal-plant-microbe interactions // FEMS Microbiol. Rev. 2002. - V. 26.-P. 17-47.

133. Letunic I., Copley R.R., Schmidt S., Ciccarelli F.D., Doerks Т., Schultz J., Ponting C.P., Bork P. SMART 4.0: towards genomic data integration // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32. - P. 142-144.

134. Levanony H., Bashan Y., Romano В., Klein E. Ultrastructural localization and identification of Azospirillum brasilense Cd on and within wheat root by immuno-gold labeling // Plant Soil. 1989. - Y. 117. - P. 207-218.

135. Lin S.Y, Young C.C., Hupfer H., Siering C., Arun A.B., Chen W:M., Lai W.A., Shen F.T., Rekha P.D., Yassin A.F. Azospirillum picis sp. nov. isolated from discarded tar // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2009. - V. 59. - P. 761-765.

136. Lin W., Okon Y., Hardy R. Enhanced mineral uptake by Zea mays and Sorghum bicolor roots inoculated with Azospirillum brasilense II Appl. Environ. Microbiol. 1983. - V. 45. - P. 1773-1779.

137. Lindahl A., Faris A., Wadstrom Т., Hjerten S. A new test based on 'salting out' to measure relative surface hydrophobicity of bacterial cells // Biochim. Biophys. Acta.1981.-V. 677.-P. 471-476.

138. Lopez de Victoria G., Lovell C.R. Chemotactic behavior of Azospirillum species to aromatic compounds // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V. 59. - P. 29512955.

139. Luderitz O., Freudenberg M.A., Galanos C., Lehmann V., Rietschel O.T., Shaw D.H. Lipopolysaccharides of Gram-negative bacteria // Curr. Topics Membr. Transport.1982.-V. 17.-P. 79-151.

140. Malhotra M., Srivastava S. An ipdC gene knock-out of Azospirillum brasilense strain SM and its implications on indole-3-acetic acid biosynthesis and plant growth promotion // Antonie Van Leeuwenhoek. 2008. - V. 93. - P. 425-433.

141. Mandimba G., Heulin Т., Bally R., Guckert A., Balandreau J. Chemotaxis of free living bacteria towards maize mucilage // Plant Soil. 1986. - V. 90. - P. 129-139.

142. Marolda C.L., Vicarioli J., Valvano M.A. Wzx proteins involved in biosynthesis of O-antigen function in association with the first sugar of the O-specific lipopolysaccharide subunit. // Microbiology. 2004. - V. 150. - P. 4095-4105.

143. Martin-Didonet C.C.G., Chubatsu L.S., Souza E.M., Kleina M., Rego F.G., Yates M.G., Pedrosa F.O. Genome structure of the genus Azospirillum II J. Bacteriol. -2000.-V. 182.-P. 4113-4116.

144. Matora L.Yu., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Katzy E.I., Schwartsburd B.l. Effect of plasmid content on cell-surface antigens of Azospirillum brasilense Sp245 // Abstr. 5th Intern. Sympos. N2 Fixation with Non-Legumes. Florence, Italy, 1990. - P. 97.

145. Matora L.Yu., Serebrennikova O.B., Shchyogolev S.Yu. Structural effects of the Azospirillum lipopolysaccharidcs in cell suspension // Biomacromolecules. 2001. -V. 2. - P. 402-406.

146. Matora L., Sumaroka M., Dykman L., Serebrennikova O., Shchyogolev S. Revealing a cap on the polar flagellum of Azospirillum brasilense Sp245 // Abstr. Xllth Intern. Congr. N2-fixation. Parana, Brazil, 1999. - P. 99.

147. Maxam A.M., Gilbert W. A new method of sequencing DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - V. 74. - P. 560-564.

148. Mehnaz S., Weselowski В., Lazarovits G. Azospirillum canadense sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from corn rhizosphere // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2007. V. 57. - P. 620-624.

149. Meyer A.L. Prospects and challenges of developing new agents for tough Gram-negatives // Curr. Opin. Pharmacol. 2005. - V. 5. - P. 490-494.

150. Michiels K., De Troch P., Onyeocha I., Van Gool A., Elmerich C., Vanderleyden J. Plasmid localization and mapping of two Azospirillum brasilense loci that affect exopolysaccharide synthesis // Plasmid. 1989. - V. 21. - P. 142-146.

151. Michiels K., Vanderleyden J., Elmerich C. Genetics and molecular biology of Azospirillum H Azospirillum plant associations / Ed. Okon Y. Boca Raton: CRC, 1994. -P. 41-56.

152. Mori E., Fulchieri M., Indorato C., Fani R., Bazzicalupo M. Cloning, nucleotide sequencing, and expression of the Azospirillum brasilense Ion gene involved in iron uptake // J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - P. 3440-3446.

153. Muto A., Osawa S. The guanine and cytosine content of genomic DNA and bacterial evolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V. 84. - P. 166-169/

154. Nakamura Y., Gozobori Т., Ikemura T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000 // Nucleic Acids Res. -2000.-V. 28.-P. 292.

155. Netea M.G., van Deuren M., Kullberg В J., Cavaillon J.M., Van der Meer J.W.a

156. Does the shape of lipid A determine the interaction of LPS with Toll-like receptors? // Trends Immunol. 2002. - V. 23. - P. 135-139.

157. Newman M.A., Dow J.M., Molinaro A., Parrilli M. Priming, induction and modulation of plant defence responses by bacterial lipopolysaccharides // J Endotoxin Res. 2007. - V. 13. - P. 69-84.

158. Newman M.A., von Koepenack-Lahaye E., Parr A., Daniels M.J., Dow J.M. Prior exposure to lipopolysaccharide potentiates expression of plant defenses in response to bacteria // Plant J. 2002. - V. 29. - P. 487-495.

159. Noel K.D., Duelli D.M., Neumann V.J. Rhizobium etli lipopolysaccharide alterations triggered by host exudates compounds // Biology of Plant-Microbe Interactions / Eds. Stacey G., Mullin В., Gresshoff P.M. St. Paul, 1996. - P. 337-342.

160. Okon Y., Kapulnik Y. Development and function of Azospirillum inoculated roots // Plant Soil. 1986. - V. 90. - P. 3-16.

161. Okon Y., Labandera-Gonzalez C.A. Agronomic applications of Azospirillum: an evaluation of 20 years worldwide field inoculation // Soil Biol. Biochem. 1994. - V. 26.-P. 1591-1601.

162. O'Neill A.J. New antibacterial agents for treating infections caused by multidrug resistant Gram-negative bacteria // Expert. Opin. Investig. Drugs. 2008. - V. 17. -P. 297-302.

163. Pacovsky R.S. Metabolic differences in Zea-Glomus-Azospirillum symbioses // Soil Biol. Biochem. 1989. - V. 21. - P. 953-960.

164. Pagnier I., Raoult D.E., La Scola B. Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure // Environ. Microbiol. 2008. - V. 10. - P. 1135-1144.

165. Palme K., Hesse Т., Moorne I., Campos N., Feldwisch J., Garbers C.- Hesse F., Schell J. Hormonal modulation of plant growth: the role of auxin perception // Mech. Develop. 1991.-V. 33.-P. 97-106.

166. Patriquin D.G., Dobereiner J., Jain D.K. Sites and process of association between diazotrophs and grasses // Can. J. Microbiol. 1983. - V. 29. - P. 900-915.

167. Patten C.L., Glick B.R. Role of Pseudomonas putida indoleacetic acid in development of the host plant root system // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V. 68. -P. 3795-3801.

168. Pearson W.R., Lipman D.J. Improved tools for biological sequence comparison // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. -V. 85. - P. 2444-2448.

169. Peng G., Wang H., Zhang G., Hou W., Liu Y., Wang E.T., Tan Z. Azospirillum melinis sp. nov., a group of diazotrophs isolated from tropical molasses grass // Int J. Syst. Evol. Microbiol. -2006. V. 56.-P. 1263-1271.

170. Perlman D., Halvorson H.O. A putative signal peptidase recognition site and sequence in eukaryotic and prokaryotic signal peptides // J. Mol. Biol. 1983. - V. 167. -P. 391-409.

171. Perrine F.M., Hocart C.H., Hynes M.F., Rolfe B.G. Plasmid-associated genes in the model micro-symbiont Sinorhizobium meliloti 1021 affect the growth and development of young rice seedlings // Environ. Microbiol. 2005. - V. 7. - P. 18261838.

172. Petersen G.B., Stockwell P.A., Hill D.F. Messenger RNA recognition in Escherichia coli: A possible second site of interaction with 16S ribosomal RNA // EMBO J. 1988. - V. 7. - P. 3957-3962.

173. Que N.L., Lin S., Cotter R.J., Raetz C.R. Purification and mass spectrometry of six lipid A species from the bacterial endosymbiont Rhizobium etli // J. Biol. Chem. -2000a. V. 275. - P. 28006-28016.

174. Que N.L., Ribeiro A.A., Raetz C.R. Two-dimensional NMR spectroscopy and structures of six lipid A species from Rhizobium etli CE3 // J. Biol. Chem. 2000b. - V. 275.-P. 28017-28027.

175. Raetz C., Reynolds M., Trent S., Bishop R. Lipid A modification systems in gram-negative bacteria // Annu. Rev. Biochem. 2007. - V. 76. - P. 295-329.

176. Raetz C.R.H., Whitfield C. Lipopolysaccharide endotoxins // Annu. Rev. Biochem. -2002. -V. 71. P. 635-700.

177. Reinhold В., Hurek Т., Fendrik I. Strain-specific chemotaxis of Azospirillum spp.//J. Bacteriol. 1985.-V. 162.-P. 190-195.

178. Rocchetta H.L., Burrows L.L., Lam J.S. Genetics of O-antigen biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa//Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. -V. 63. - P. 523-553.

179. Rost В., Liu J. The PredictProtein Server // Nucleic Acids Res. 2003. - V. 31. - P. 3300-3304.

180. Rothballer M., Schmid M., Fekete A., Hartmann A. Comparative in situ analysis of ipdC-gfpmut3 promoter fusions of Azospirillum brasilense strains Sp7 and Sp245 // Environ. Microbiol. 2005. - V. 7. - P. 1839-1846.

181. Russa R., Urbanik-Sypniewska Т., Lindstrom K., Mayer H. Chemical characterization of two lipopolysaccharide species isolated from Rhizobium loti NZP2213 //Arch. Microbiol.- 1995.- V. 163.-P. 346-351.

182. Sanger F., Coulson A.R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed syntesis with DNA polymerase // J. Mol. Biol. 1975. - V. 94. - P. 444-448.

183. Sanger F., Niclein S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - V. 74. - P. 5463-5467.

184. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. New York: Cold Spring Harbor Lab., 1989. - V. 1-3.

185. Sarig S., Blum A., Okon Y. Improvement of the water status and yield of field-grow grain sorgum (Sorghum bicolor) by inoculation with Azospirillum brasilense // J. Agric. Sci. 1988. -V. 110. -P. 271-277.

186. Sarig S., Kapulnik Y., Okon Y. Effect of Azospirillum inoculation on nitrogen fixation and growth of several winter legumes // Plant Soil. 1986. - V. 90. - P. 335342.

187. Schnaitman C.A., Klena J.D. Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in enteric bacteria // Microbiol. Rev. 1993. - V. 57. - P. 655-682.

188. Shah S., Karhanis V., Desai A. Isolation and characterization of siderophore, with antimicrobial activity, from Azospirillum lipoferum M // Curr. Microbiol. 1992. -V. 25.-P. 347-351.

189. Shepherd J.C.W. Method to determine the reading frame of a protein from the purine/pyrimidine genome sequence and its possible evolutionary justification // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. - V. 78. - P. 1596-1600.

190. Shine J., Dalgarno L. The З'-terminal sequence of Escherichia coli 16S ribosomal RNA: Complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. - V. 71.-P. 1341-1346.

191. Silipo A., De Castro C., Lanzetta R., Molinaro A., Parrilli M. Full structural characterization of the lipid A components from the Agrobacterium tumefaciens strain C58 lipopolysaccharide fraction // Glycobiology. 2004. - V. 14. - P. 805-815.

192. Simon R. High frequency mobilization of gram-negative bacterial replicons by the in vivo constructed Tn5-Mob transposon // Mol. Gen. Genet. 1984. - V. 196. - P. 413-420.

193. Skvortsov I.M., Ignatov V.V. Extracellular polysaccharides and polysaccharide-containing biopolymers from Azospirillum species: properties and the possible role in interaction with plant roots // FEMS Microbiol. Lett. 1998. - V. 165. - P. 223-229.

194. So J.-S. Molecular cloning of gene region from Bradyrhizobium japonicum essential for lipopolysaccharide synthesis // FEMS Microbiol. Lett. 1991. - V. 83. - P. 299-304.

195. Song S.D., Park G., Lee K.B. Increases of nitrogen and phosphorum in Gramineae plants inoculated with Azospirillum amazonense YI // Abstr. 8th Intern. Congr. Nitrogen Fixation. Knoxville, USA, 1990. - P. 19.

196. Stancheva I., Dimitrov I., Kaloyanova N., Dinev N., Poushkarov N. Improvement of the nitrogen uptake and nitrogen content in maize (Zea mays L.) by inoculation with Azospirillum brasilense // Agrochimica. 1995. - V. 39. - P. 299-306.

197. Steenhoudt О., Vanderleyden J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects // FEMS Microbiol. Rev. 2000. - V. 24. - P. 487-506.

198. Stephens B.B., Loar S.N., Alexandre G. Role of CheB and CheR in the complex chemotactic and aerotactic pathway of Azospirillum brasilense // J. Bacteriol. -2006.-V. 188. P. 4759-4768.

199. Stoodley P., Sauer K., Davies D.G., Costerton J.W. Biofilms as complex differentiated communities // Ann. Rev. Microbiol. 2002. - V. 56. - P. 187-209.

200. Tal S., Okon Y. Production of the reserve material poly-p-hydroxybutyrate and its function in Azospirillum brasilense II Can. J. Microbiol. 1985. - V. 31. - P. 608613.

201. Tefsen В., Geurtsen J., Beckers F., Tommassen J., de Cock FI. Lipopolysaccharide transport to the bacterial outer membrane in spheroplasts // J. Biol. Chem. 2005. - V. 280. - P. 4504-4509.

202. Thirumalapuraa N.R., Morton R.J., Ramachandran A., Malayer J.R. Lipopolysaccharide microarrays for the detection of antibodies // J. Immunol. Meth. -2005.-Y. 298.-P. 73-81.

203. Tien T.M., Diem PI.G., Gaskins M.H., Hubell D.H. Polygalacturonic acid transeliminase production by Azospirillum species // Can. J. Microbiol. 1981. - V. 27. -P. 426-431.

204. Umali-Garcia M., Hubbel D.H, Gaskins M.H., Dazzo F.B. Associative of Azospirillum with grass roots // Appl. Environ. Microbiol. 1980. - V. 39. - P. 219-226.

205. Vanbleu E., Choudhury B.P., Carlson R.W., Vanderleyden J. The nodPO genes in Azospirillum brasilense Sp7 are involved in sulfation of lipopolysaccharides // Environ. Microbiol. 2005. - V. 7. - P. 1769-1774.

206. Vanbleu E., Marchal K., Lambrecht M., Mathys J., Vanderleyden J. Annotation of the pRhico plasmid of Azospirillum brasilense reveals its role in determining the outer surface composition // FEMS Microbiol Lett. 2004. - V. 232. - P. 165-172.

207. Van Rhijn P., Vanstockem M., Vanderleyden J., de Mot R. Isolation of behavioral mutants of Azospirillum brasilense by using Tn5lacZ II Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56. - P. 990-996. ■

208. Vedam V., Kannenberg E. L., Haynes J. G., Sherrier D. J., Datta A., Carlson R. W. A Rhizobium leguminosarum AcpXL mutant produces lipopolysaccharide lacking 27-hydroxyoctacosanoic acid// J. Bacteriol. -2003. V. 185.-P. 1841-1850.

209. Walker J.E., Saraste M., Runswick M.J., Gay N.J. Distantly related sequences in the alpha- and beta-subunits of ATP synthase, myosin, kinases and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide binding fold // EMBO J. 1982. - V. 1. -P. 945-951.

210. Wang Y., Hollingsworth R.I. The structure of the O-antigenic chain of the lipopolysaccharide of Rhizobium trifolii 4s // Carbohydrate Res. 1994. - V. 260. - P. 305-317.

211. Wheeler D.L., Church D.M., Federhen S., Lash A.E., Madden T.L., Pontius J.U. Database resources of the National Center for Biotechnology // Nucleic Acids Res. -2003.-V. 31.-P. 28-33.

212. Whitfield C. Biosynthesis of lipopolysaccharide О antigen // Trends Microbiol. 1995. - V. 3. - P. 178-185.

213. Wierenga R.K., Hoi W.G. Predicted nucleotide-binding properties of p21 protein and its cancer-associated variant // Nature. 1983. - V. 302. - P. 842-844.

214. Wilkinson S.G. Bacterial lipopolysaccharides themes and variations // Prog. Lipid Res. - 1996. - V. 35. - P. 283-343.

215. Wilson D., Madera M., Vogel C., Chothia C., Gough J. The SUPERFAMILY database in 2007: families and functions // Nucleic Acids Res. 2007. - V. 35. - P. 308313.

216. Xie C.H., Yokota A. Azospirillum oryzae sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium isolated from the roots of the rice plant Oryza sativa // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2005. V. 55. - P. 1435-1438.

217. You C.B., Lin M., Fang X.J., Song W. Attachment of Alcaligenes to rice roots II Soil Biol. Biochem. 1995. - V. 27. - P. 463-466.

218. Young C.C., Hupfer H., Siering С., Ho M.J., Arun A.B., Lai W.A., Rekha P.D., Shen F.T., Hung M.H., Chen W.M., Yassin A.F. Azospirillum rugosum sp. nov., isolated from oil contaminated soil // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. - V. 58. - P. 959-963.

219. Zhulin I.B., Armitage J.P. The role of taxis in the ecology of Azospirillum II Symbiosis. 1992. - V. 13. - P. 199-206.

220. Zimmer W., Roeben K., Bothe H. An alternative explanation for plant growth promotion by bacteria of the genus Azosp' ' -1988.-V. 176. P. 333-342.

Информация о работе

Кулибякина, Ольга Владимировна
кандидата биологических наук
Саратов, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Изучение роли плазмид Azospirillum Brasilense в образовании липополисахаридов, содержащих пента-D-рамнановый O-полисахарид - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Изучение роли плазмид Azospirillum Brasilense в образовании липополисахаридов, содержащих пента-D-рамнановый O-полисахарид - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы