Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное исследование липополисахаридов и структуры О-специфических полисахаридов бактерий рода Azospirillum

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное исследование липополисахаридов и структуры О-специфических полисахаридов бактерий рода Azospirillum"



На правах рукописи

КОННОВА Ольга Николаевна

сравнительное исследование липополисахаридов и структуры о-специфических полисахаридов бактерий

рода лгозрттим

03.00.04 -биохимия

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов—2006

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Кон нова С.А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Антонюк Л.II.

кандидат биологических наук Бухарова Е.Н.

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, г. Москва

Защита состоится «20» декабря 2006 г. в 14 ч. на заседании диссертационного совета Д002Л 46.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (410049, г. Саратов, лр. Энтузиастов, 13).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН и на сайте института www.ibppm.saralov.ru

Автореферат разослан «/*> ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, у____

доктор биологических наук Никитина В.Е.

введи

Актуальность темы. Исследования азотфиксирующен активности в корневой зоне небобовых растений и свойств микробов, за неё ответственных, стали основой отдельного направления в прикладной микробиологии, посвященного изучению явления ассоциативной азотфиксации. Наибольший интерес среди бактерий, осуществляю [щи ассоциативное взаимодействие с корнями растений, представляют Azospirillum spp. Эти микроорганизмы относятся к группе ризобактерий, стимулирующих рост растений, благодаря потенциально высокой азотфиксирую-щей активности, способности продуцировать фитогормоны и иные физиологически активные вещества (Okon and Vanderleyden, 1997). Начальным и важнейшим этапом формирования ассоциации является адсорбция микроорганизмов на корнях растений.

Известно, что в прикреплении бактерий к корням участвуют как неспецифическая сорбция, которая определяется зарядом и гндрофобностью бактериальной поверхности, так и специфические взаимодействия, которые на разных стадиях опосредуются поверхностно локализованными белками и полисахаридами (ПС) (MIchtds et al,, 1991; Steenhoucft and Vanderleyden, 2000). Выявление молекулярных механизмов «узнавания» и клеточного контакта корней злаков и бактерий рода Azospirillum требует изучения компонентов клеточной поверхности и материалов, секретируемых в окружающую среду, среди которых полисахаридам микроорганизмов отводится существенная роль (De! Gallo et а/., 1989; Del Gallo and Haegi, 1990; Konnova et al, 1994; Коннова с соавт, 1995; Skvortsov and Ignatov, 1998; Коннова с соавт., 1999; Коннова с соавт., 2001; Федоненко с соавт., 200); Fedonenko et al., 2002; Коннова с соавт., 2003; Федоненко с соавт., 2004; Коннова с соавт., 2005). Следовательно, одним из ключевых направлений в изучении этой проблемы следует признать анализ строения и функций различных структурных элементов клеточной поверхности почвенных ассоциативных микроорганизмов, так как они являются соединениями, непосредственно материализующими процесс взаимодействия.

Азоспиркллы продуцируют ряд ПС и полисахаридсодержащих полимеров, играющих важную роль во взаимодействии с растениями, и выполняющих ряд других биологических функций. Однако недостаток информации о структуре углеводных компонентов поверхности микроорганизмов препятствует формированию целостной картины взаимодействия бактерий с растениями на молекулярном уровне.

Особый интерес представляет исследование лютополисахаридов (ЛПС) — главного компонента внешней мембраны трамотрицательных бактерий. ЛПС, специфичность в контактных взаимодействиях которых определяют полисахаридные составляющие, играют важную роль в серотипнрован н и грамотрицательных бактерий (Rietschel et о/, 1994; Варбанец и Бинарская, 2002; Caroff and Karibian, 2003). Основываясь на строении О-специфических цепей, бактериальные штаммы одного рода разделяют на хемотипы (Kauffmann, 1960). В литературе большое

РГАУ-МСХА ~ ~ имени К.А. Тимирязева Ш1Б имени НИ. Железнова ФРИД нзтаныйлитературы

внимание уделено детальному серологическому анализу фнтопатогетшх бактерий (KaufEmann, 1957; Kauffmann et at, 1961; Книрель и Кочетков, 1994; Варба-нец, 1994; Pier, 2003), в то время как аналогичные аспекты изучения ассоциативных азотфиксаторов находятся на периферии исследовательских интересов.

Дальнейшее изучение структурных и серологических особенностей индивидуальных препаратов поверхностных полисахаридных антигенов бактерий рода AzospiriUvm остается актуальным как для таксономических исследований, так и для выяснения их роли в процессах взаимодействия с корнями растений.

В связи с этим цепью работы бьщо выявление структурных особенностей ли-попол исахаридов и серологического родства бактерий рода Azospirilium.

Для реализации цели в ходе исследования решали следующие задачи:

1. выделение гомогенных препаратов липополисахаридов внешней мембраны бактерий A, brasilense SR75, S17, Sp7, Cd, A. irakense КВС1 и A. iipoferum Sp59b,RG20a;

2. анализ биополимерного состава липополисахаридов названных выше микроорганизмов, а также состава жирных кислот лигтидов А;

3. проведение серологических исследований различных штаммов азоспирилл при помощи поликлональных кроличьих антител, полученных на препараты липополисахаридов;

4. выделение О-специфических полисахаридов ш липополисахаридов, и определение первичной структуры повторяющихся звеньев О-специфических полисахаридов бактерий: A. irakense КВС1, A. Iipoferum Sp59b, A. bras Heme Cd, SR75 и S17.

Научная новизна работы. Впервые установлена тонкая химическая структура ОПС, выделенных из ЛПС пяти штаммов трех видов азоспирилл, ю которых А. irakense КВС1 и A. Iipoferum Sp59b являются типовыми для соответствующих видов микроорганизмов.

Впервые продемонстрировано сходство повторяющихся звеньев ОПС бактерий рода Azospirillum, принадлежащих к разным штаммам одного вида (A. brasilense Sp245 и A. brasilense SR75), н К разным видам (A. Iipoferum Sp59b и A, brasilense Cd). На примере A. brasilense SI 7 установлено наличие й составе ЛПС двух существенно отличающихся по структуре О-спецнфическнх полисахаридов, в которых выявлено присутствие №ацетил-£>-глюкозамина и неуглеводного заместителя (5)-3-гидроскибутирата.

Проведено деление исследованных штаммов бактерий рода Azospirilium на се-рогруппы, а соответствующих ЛПС на хемотипы.

Научно-практическая значимость. Данные о структурах ОПС азоспирилл необходимы для понимания молекулярных механизмов формирования растительно-микробных ассоциаций.

Полученная нами информация о первичной структуре О-специфических полисахаридов A. irakense КВСI, A. brasilense Cd, A. Iipoferum Sp59b, A. brasilense SR75 и A. brasilense SI7, а также результаты серологического исследования могут быть использованы при устаноатении филогенетического родства с другими бактериальными видами.

Препараты ЛПС н 0Г1С A. brasikme, A. iipofemm,A. irakense, а также поликло-нальиые кроличьи антитела на препараты ЛПС применяются при проведении плановых НИР сотрудниками лаборатории биохимии, лаборатории физической химии клеточных структур, лаборатории микробиологии и микологии, лаборатории растительно-бактериальньк симбиозов Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН). Полученные антитела необходимы для дальнейшего серологического анализа коллекционных культур азоспи-рншт» а также вновь изолированных из природной среды микроорганизмов.

Результаты диссертационной работы используются в ходе преподавания студентам биологического и химического факультетов СГУ курсов: «Основы глико-логни» и «Методы химии и биохимии углеводов», а также при подготовке курсовых и дипломных работ учащимися этих факультетов.

Представленные в диссертации разработки включены в подготовленное для студентов и аспирантов, специализирующихся в области бактериохимии, учебно-методическое пособие: «Выделение и анализ гликополимеров растительного и бактериального происхождения» / Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2005 г, 40 е., (в соавторстве с СЛ. Конновой, Ю.П. Федоненко, О.А. СачковоЙ), одобренное Учебно-методической комиссией биологического факультета и Ученым советом СГУ им. КГ. Чернышевского.

Апробация работы. Материалы исследований, изложенные в диссертации, были представлены на 7-й, 8-й, 9-Й, 10-Й Международных Пущннских школах — конференциях молодых ученых «Биология — наука 21 века» (Пущина, Россия, 2003 - 2006 гг.), на 4-й, 5-й Всероссийских конференциях молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, Россия, 2003,2005), на 7-Й, 8-й Молодежных научных шкалах - конференциях по органической химии (Екатеринбург, Россия, 2004; Казань, Россия, 2005), на 3-й Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, Россия, 2004), на 2-Й, 3-й Региональных школах-конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2004, 2006), на Всероссийской конференции «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные н прикладные аспекты» (Саратов, Россия, 2005), на научной конференции студентов и аспирантов «Исследования молодых ученых и студентов в биологии» (Саратов, Россия, 2005), на 2-й конференции стран Балтии по микробным углеводам (Росток, Германия, 2006).

Доклад «Структурное и серологическое исследование О-антнгена бактерий Azospirtihm brasileme Cd», представленный на научной конференции студентов и аспирантов «Исследования молодых ученых и студентов в биологии» (Саратов, Россия, 2005) был удостоен диплома первой степени.

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории биохимии ИБФРМ PAR

Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 работы, в том числе 7 статей в отечественных и зарубежных научных изданиях.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

Липополисахариды бактерий рода АгохртИит на основании структурных исследований их О-слецнфическнх полисахаридов разделены на четыре хемотнпа. К первому отнесены ли попал псах зрнды штаммов А. ЬгсаИепзе Бр245,81175; ко второму - А, Про/егит Бр59Ь и А, ЬгазНеже Сё; к третьему - А. ¡гакепзе КВС1; и к четвертому - А. ЬгаяПете 517, Л, Про/егит 5рВг17.

Идентичные структуры повторяющихся звеньев характерны для О-специфических полисахаридов двух пар штаммов А. ЬгазИепзе Бр245, 5Я75 и для А. Про/егит 5р59Ь, А. ЬгшИепве С&

Бактерии рода АгозртИит на основании серологических исследований разделены иа две серогруллы. К первой отнесены А. Ъгсвйете 8р245, БЯ75 и А. Про/егит 1Ю20а, а ко второй - А. Про/егит Бр59Ь, А. ЬгавНеюе Сё, А. ЬгазПете 8р7, А. ¡гакете КВС1 и А. ЬгалИете 7.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 288 источников, в том числе - 225 зарубежных. Рабата изложена на 162 страницах машинописного текста, содержит 25 рисунков и 13 таблиц.

Работа выполнена в лаборатории биохимии ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой НИР «Структуры гликополимеров и их функции в растительно-микробных взаимодействиях» (№ госрегистрации 0120.0403358).

Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований: в 2002-2СКМ гг. «Структура липопоаисахаридов и О-спецнфнческнх полисахаридов бактерий рода АгохрггШит» № 02-04-48224, в 2005-2006 гт. «Сравнительное исследование структуры липополисахаридов и О-специфических полисахаридов серологически родственных штаммов бактерий рода АхозртИшт № 0504-48123, а также грантами Президента РФ на поддержку молодых российских ученых и ведущих научных школ на выполнение научных исследований НЩ-1529.2003.4 в 2003 - 2005 гг. и НШ-6177.2006.4 в 2006 г.

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю доктору биологических наук, профессору С.А. Конновой, а также заведующему лабораторией биохимии ИБФРМ РАН заслуженному деятелю науки Российской Федерации, доктору биологических наук, профессору В.В. Игнатову за неоценимую поддержку на всех ключевых этапах выполнения данной работы. Автор выражает благодарность за плодотворное сотрудничество коллегам из лаборатории биохимии — к.б.н., с. н. с. ЮЛ. Федоненко, к.б.н., н. с. ШЗ.Егоренковой, ст. лаб-иссл. О.А. Сачковой, сотрудникам ИБФРМ РАН д.б.н., в.н,с. Л.Ю. Матера, К.6.Н., н.с. ГЛ. Бурыгину, к.х.н., с.н.с. О.Е. Макарову, д.б.н., е.н.с. ЕЛ. Кацы, к.б.н., н.с. И.В. Борисову, а также сотрудникам лаборатории химии углеводов ИОХ РАН (Москва).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы н методы исследования

Микробные культуры и условия их выращивания. В работе были использованы бактерии рода Azospirillum: A. brasilense SR75 (Позднякова с соавт., 1988), A. brasilense Sp245 (Baldam et aL, 1983), Л. brasilense S17, A brasilense Cd (Eskew etal, 1977\A. brasilense Sp7 (Tarrand etal, 1978), A. irakenseKBC1 (Khammas et alt 1989), A. lipofenan Sp59b (Tanand et al, 1978), A, lipofenm RG20a (BaJdam et al, 1986). Для полунения ЛПС исследуемые микроорганизмы выращивали в ферментере АНКУМ 2М (СССР) в жидкой синтетической малатной среде, представляющей собой модификацию среды, предложенной Дэй и Доберейнер (Day and DSbereiner, 1976).

Микроорганизмы культивировали до окончания экспоненциальной фазы роста. С поверхности бактерий в течение 6 сут отмывали капсульный материал 0.15М раствором NaCl в 0.02 % NaN3, ежедневно переосаждая клетки центрифугированием и заменяя отмывающий раствор.

Выделение ЛПС проводили стандартным методом Вестфаля с разделением водного и фенольных слоев (Вестфаль и Янн, 1967). Водную фракцию экстракта диадизовали через мембрану (предел исключения 12-14 кДа). Экстракт концентрировали упариванием при пониженном давлении и фракционировали методом гель-фильтрации, используя носитель Sepharose CL-4B («Pharmacia», Швеция). Детекцию продуктов разделения в элюате проводили с помощью дифференциального проточного рефрактометра LKB 2142 (LKB, Швеция). Дополнительно строили элюционные профили по углеводам (Dubois et al., 1956). После хромато-графической очистки ЛПС концентрировали и лнофилизировали.

Определение содержания в ЛПС 2-кето-З-дезоксиокгоиовоЙ кислоты (КДО), белков, нуклеиновых кислот (НК), фосфора проводили по традиционным методикам (Berenblum and Chein, 1938; Спирин, 1958; Karkhanis et aL, 1978; Скоупс, 1985 соответственно).

Антитела (AT) получали иммунизацией кроликов растворами ЛПС. Фракции IgG выделяли нз антисывороток осаждением сульфатом аммония (Кэбот и Мейер, 1968).

Двойную иммунодиффузию препаратов ЛПС с кроличьими антителами проводили по стандартной методике (Ouchterlony and Nilsson, 1979).

Электрофорез препаратов ЛПС в полиакриламидном геле проводили с доде-цнлсульфатом натрия (Hitchcock and Brown, 1983). Визуализацию ЛПС осуществляли окрашиванием гелей красителем на основе азотнокислого серебра (Tsai and Frasch, 1982).

Иммуноферментный анализ (ELISA) проводили в полистироловых 96-ти луночных планшетах. В качестве ферментной метки использовали пероксидазу хрена, коньюгнрованную с козлиными анти-кроличьими антителами. В качестве субстратного реагента использовали орто-фен илендиам ин с перекисью водорода.

Измерения оптической плотности исследуемых проб проводили на иммунофер-ментном анализаторе АИФ-Ц-01С с последующей обработкой результатов с помощью программы ЛабАРМ (ЗАО ИЛИП, г. Санкт-Петербург).

ОПС язоспирнлл получали рутинным методом гидролиза ЛПС 1 % раствором CHjCOOH (Mufter-Seitz er а!., 1968). Выделенные препараты очищали хрома-тографически.

Определение состава жирных кислот ЛПС в виде метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) проводили с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ) на хроматографе «Биохром 1». Метилирование выполняли согласно методу, описанному в работе (Mayer et ai, 1985).

Определение моносахаридного состава ПС выполняли методом ГЖХ на хроматографе Hewlett-Packard 5890 с капиллярной колонкой Ultra 2 (Hewlett-Packard, США). Подготовку образцов осуществляли в соответствии с протоколом, представленным в работе (Savardecker et al., 1965).

Абсолютные конфигурации нейтральных Сахаров устанавливали ГЖХ в виде ацетшшрованных гликозидов с R-2-октанолом (Leontein et al, 11978).

Для определения типов замещения моносахаридных остатков ОПС были подвергнуты метилированию, гидролизу, ацетилированию и исследованию методом ГЖХ-масс-спектрометр и и в виде частично метилированных ацетатов пошюлов (Hakomori, 1964).

Спектры ЯМР снимали на спектрометре Bruker DRX-500 (Германия), используя стандартное математическое обеспечение фирмы Bruker. Для сбора и обработки данных использовали программу XWTNNMR 2.1.

Результаты всех экспериментов статистически обрабатывали (Лакнн, 1980). Данные представлены в виде средних значений (как минимум трех экспериментов, каждый из которых проводился в трех повторностях) со средней квадратичной ошибкой. Доверительные интервалы определены для надежности 95 %.

Результаты исследований и их обсуждение 1 Исследование химического состава липополисахаридов

В обеспечение выживания бактерий в почве, а также специфичности их взаимодействия с корнями растений вовлечены поверхностные структуры микробных клеток. Однако к настоящему времени отсутствует единое мнение относительно способа реализации этих взаимоотношений. В связи с чем, исследование молекулярных механизмов взаимодействия растений и азотфиксирутоших микроорганизмов остается актуальным на сегодняшний день. ЛПС являются одними из основных компонентов внешней мембраны грамотрицательных микроорганизмов. Они, несомненно, играют важную роль во взаимоотношениях бактериальной клетки с окружающей средой. Данный раздел работы посвящен исследованию химического состава липидных и полисахаридн ых компонентов ЛПС бактерии рода Axospirülum.

Были выделены, хроматографнчески очищены и охарактеризованы гомогенные препараты ЛПС бактерий A, brasifense SR75, SI 7, Sp7, Cd, A. irakense KJ3C], A. /;-poferum Sp59b и RG20a. Выход ЛПС варьировал от 1 до 3 % or веса сухой микробной массы в зависимости ог штамма (табл. I). При исследовании биополимерного состава было показано, что на долю углеводов в ЛПС приходилось от 20 до 60 % ОТ МЗССЫ Препаратов. Разброс в содержанки углеводов, учитывая, что по результатам дальнейших исследований все изучаемые препараты отнесены к S-форме, может быть объяснен штаммовымн различиями в соотношении гидрофильной и гидрофобной компонентов молекулы ЛПС. В составе всех выделенных препаратов ЛПС была идентифицирована КДО - единственный структурный элемент, который всегда присутствует в ЛПС, независимо от их бактериального происхождения. Для JUTCsR?;, ЛПСоь ЛПС^ и ЛПС|гс2а» ее содержание составило примерно 3 - 4 %, а для ЛПС^! и ЛПСзи - в 4 раза ниже (табл. 1). Небольшое количество КДО, как особенность ЛПС азоспирилл, было показано ранее для некоторых штаммов A. brasilense и A. Upoferwn (Choma et а!., 1984; Choma et a!., 1987; Федоненко с соавт., 2004). Кроме того, в наших исследованиях были выявлены значительные межштаммовае различия в содержании общего фосфора в вышеперечисленных ЛПС, что, как известно, оказывает существенное влияние на субмолекулярную организацию ЛПС в мембране (Соловьева и Оводов, 1992). Следует отметить, что использование хроматогрофических методов фракционирования экстракта позволило добиться высокой степени очистки ЛПС, о чем свидетельствует низкое содержание белка и НК.

В составе липидной части ЛПС были идентифицированы насыщенные, ненасыщенные и гадроксикислогы с длиной углеродной цепи от Сщ до Си (табл. 2).

Таблица I

Бно полимерный состав ЛПС бактерий рода Azospirillum

Выход Л ПС, Содержание, %

Штаммы % от веса \ сухих клеток Углеводы Белки НК КДО Фосфор

SR75 1.0 532 ± 0.2 2.1 ±0.1 0.1 ±0.1 33 ±0.1 0.1

Л. brosi- SI7 1.7 29.0 ± (3 0.8 + 0.4 сл. 03 3.3 ±0.2

feme Cd 12 28.4 ±2.1 0.310.1 сл. 3.510.1 i .9 ± 0.1

Sp7 2.S 21.9±0.3 0.6 ±0.1 сл. 0.6 2.5 ±0.2

A. irakense KBC1 1.1 62J12.7 0.9 ±0.1 сл. 0.7 ±0.0 3.4 ±0.8

A. lipofe- Sp59b 2.6 388 ± 1.4 2.4 ±0.2 02 ±0.1 4.4 ±0.1 0.S

rum RG20a 14 413 ±3 3 23 ± 0.1 сл. 2.810.1 0

Примечание: «сл.» - содержание компонентов менее 0.1 %.

Основными по содержанию в ЛПС большинства штаммов были 3-гидрокситетрадекановая (3-ОН-Смо). гексадекановая (Cim), 3-гидроксигексадекановая (З-ОН-С^л) и октадеценовая <C[ji) жирные кислоты.

Таблица 2

Соотношение жирных кислот в препаратах ЛПС бакгсрнй A. brasilense SR75, S17, Cd, Sp7, A irakense KBC1 к

Л iipoferum Sp59b, RGIOa

Жирные кислоты Содержание МЭЖК (в % от суммы плоишей вссх пиков)

лис*» ЛПС5|7 ЛПСс JinCs„, ЛПСкк! лпе^ ЛПСда^

дскаиовая (Сш) 0.6 ±0.1 7.8 ± 0.2 0,5 ±0.1 7.8 ±0.5 0,5 0.2 ±0.1 0.1

дидекановая (Сцл>) 0.2 сл. 6.1 0.1 1.7 ±0.1 21.9 ±0.6 0.1

2-гилроксидидекановая (2-011-Сцй) 1,5 0,2 ±0,1 1.8 ±0.4 0.6 ±0.1 - 82 ±0.2 сл.

3-гиароксидндекановая (З-ОП-С.м) O.J - 8-5 ± 0.5 сл. - 30.7 ±1.3 -

тстрадекановая ^Сио) 0.2 ±0.1 0,3 ±0.3 0.2 1.1 ±0.6 0.9 ±0.1 сл. сл.

З-пщрокситстрадскаковая (3-ОН-Сщ,) 42.3 ± 0.2 39.6 ±2.3 32.4 ± 0.4 40.9 ±3.9 30.2 ±0.8 12.6 ±0.2 544 ± 1.5

тетрадеценовая (С|4:1) - - - - 4.3 ±0.3 - •

гексадецсно&ая (Сш) сл. 0.8 ± 0.4 1.7 ±0,3 0.1 0.2 1.4 ±0.3 0.9

гексадекановая (С|6:|)) 9.7 ±0.3 4.0 ±0.6 3.9 ±0.3 4.9 ±0.7 1.6 ±0.3 13.0 ±0.1 3.2 ±0.7

2-гидроксигексадекаиовая (2-ОН-С16л) 0J - - 0.1 - - -

3-пшроксигексадскановая <3-ОН-С16Л) 33.2 ± 1,1 26.9 ±4.3 192 ± 2.7 30.3 ±3.6 25.8 ±2.4 - 36.4 ±0.6

октадекаиовая (Сщ-о) 0.2 ±0.1 0.5 сл. сл. 0.3 0.2 ±0.1 сл.

октадеценовая 7.4 ±1.) 18.0 ±5.1 20.1 ±0.5 8.7 ±0.1 8.4 ±0.1 10.1 ± 1.8 4.7 ±0.3

ианодекаиовая (Сто) - - - - 4.4 - -

Приыечшгия; «cju> - содержание компонентов менее 0.1 %; «-»- ЖК отсутствовали.

Исключение составил ЛПСзрян, где основными оказались дидекановая (С1М), 2-гидроксидидекановая (2-OH-C|io), 3 -гидроксидидекановая (З-ОН-Сца), 3-гидрокситетрадекановая (3-ОН-Сцл)> гексадекановая (Ci&o), окгадеценовая (Сц:|) кислоты. В составе ЛПС^т, ЛПС$1т было выявлено значительное количество (око* ло 8 %) декаиовой (С юл) кислоты. Было показано, что оксикислоты составляли 50 - 80 % от содержания МЭЖК, обнаруженных хроматографически, что согласуется с литературными данными о количестве оксикислот в липидах А (Красикова с со-авт., 1989), однако в составе ЛПС A. lipoferum RG20a на их долю приходилось 92 %. В исследуемых образцах также были обнаружены ненасыщенные ЖК (от 5 до 30%).

Данные по составу жирных кислот ЛПСзрт, ЛПС^л, ЛПСВСю» ЛПСквсь JITICsiî хорошо согласуются с результатами, приведенными в литературе для ли-пополисахаридов ряда штаммов A. brasilense, A, lipoferum (Chôma et alt 1984; Chôma et al, 1987; Федоненко с соавт., 2004), a также бактерий рода Rhizobium (Wilkinsoti, 1996). Вопреки мнению о том, что липца А эволюционно является наиболее консервативной частью молекулы ЛПС, в последние годы появились данные (Варбанец и Винарская, 2002), которые свидетельствуют о вариабельности его структуры, что также нашло подтверждение в полученных нами результатах.

Нужно отметить, что ненасыщенные жирные кислоты в составе липкда Л встречаются редко. Их появление связывают с проявлением компенсаторных явлений в мембранах, вызванных изменением температуры среды (Крепе, 1981; Бергельсон, 1982). Возможно, это позволяет азоспириллам выживать в неблагоприятных условиях и объясняет их распространение в различных климатических зонах.

2 Выявление обших антигенных детерминант в ЛПС различных штаммов

н видов азоспмрилл с использованием антител на ЛПС И. brasilense Cd, A. brasilense Sp7 и A. irakense КВС1

На хроматографически очищенные препараты ЛПС<д ЛПС^. ЛПСква иммунизацией кроликов были получены поликлональные антитела, которые характеризовались способностью к агглютинации убитых нагреванием гомологичных клеток. Данная работа проводилась совместно с сотрудниками лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН. Антисыворотка на ЛПС^ проявляла высокую активность по отношению, к клеткам A. brasilense Sp7, покрытым капсулой, и ее максимальное работающее разведение составило 1:640. На примере A. brasilense Cd было показано, что степень связывания гомологичных AT с макромолекулами поверхности покрытых капсулой клеток была в три раза ниже, чем бескапсульных. Взаимодействие АТлпсса. а также антисывороткн на ЛПС^т с капсулированными клетками, очевидно, обусловлено двумя причинами. Первая - это связывание с экспонированным на поверхности через капсулу ЛПС. Вторая - взаимодействие с локализованным в капсульном материале азоспнрилл липополнеахарид-белковым комплексом (ЛПБК) — экстраклеточной формой ЛПС Более высокая активность AT в отношении бескапсульных клеток связана, очевидно, с возможностью свободного экспонирования антигенных детерминант ЛПС внешней мембраны.

Необходимо отметить, что антисыворотка на ЛПСква не взаимодействовала с гомологичными капсул ированным и клетками. После отмывания бактерий от капсулы антитела агглютинировали клетки, но их активноть была невысокой. Максимальное разведение сыворотки в реакции агглютинации составило 1:160. Капсул ьный материал A. ¡rakense КВС1 не взаимодействовал с АТдпсква а тесте двойной радиальной иммунодиффузии, что позволяет сделать предположение о различиях в строении антигенных детерминант (а возможно и структуры ОПС) ЛПС внешней мембраны и ЛПС, входящего в состав полисахаридных комплексов капсулы.

Исходя из полученных результатов, мы предположили, что капсульный материал азоспирилл (который помимо Л ПЕК содержит полисахарид-л ипидный комплекс, свободные полисахариды и протеины), для некоторых штаммов полностью, для других - частично экранирует О-антиген внешней мембраны. При этом детерминанты экстраклеточного ЛПС, возможно, менее доступны для взаимодействия со специфическими АТ из-за образования комплекса с белком. Таким образом, эксперименты выявили различия между штаммами азоспирилл в степени экспонирования через капсулу О-антигенных цепей, и, как результат, штаммовую вариабельность в реализации различных механизмов контактных взаимодействий этих бактерий с растениями.

Все выделенные в ходе данной работы ЛПС были протестированы методами иммунодиффузии и иммуноферментного анализа на наличие серологических перекрестов. Предварительно были определены оптимальные концентрации АТ и антигенов, а также составлен соответствующий протокол твердофазного ИФА. В связи с тем, что фотографии стекол с двойными радиальными иммунодиффу-знями не передают всех деталей, видимых глазом, мы посчитали необходимым привести их схемы.

Методом иммунодиффузии с использованием соответствующих гомологичных антител было визуализировано не менее двух антигенных детерминант не белковой природы в составе ЛПСса, ЛПС^фис. 1 А, Б), и не менее трех в ЛПСква (рис. 1В). Результаты ИФА, демонстрирующие специфичность АТ к различным ЛПС, были выражены в процентах по аналогии с работой (Virginio et al., 2003) и представлены в таблице 3.

А Б В

Рис. I. Схемы двойных иммунодаффузий препаратов ЛПС A. brasihnse Sp245, Sp7, Cd, A. lipofe-rum Sp59b, RG20a н A. irakense KBCI с ATjincoi (А), АТщкзрт (Б), АТлпсквс! (В).

Таблица 3

Результаты прямого н перекрестного иммуноднффузионноп> (А) и иммунофермеитиою (Б) анализов ЛПС бактерий рода АгоьрШПит с антителами, полученными на ЛПСсл ЛПСяр?» ЛПСквси ЛПСки и целые клетки Бр245, обработанные глутаровым альдегидом

Серо-группы —Антитела Клетаиад^ ЛПСс JH1CSd7 ■ЛПСцва лпс51,

A Б A Б A Г. A Б A Б

I A. brasilense Sp24 5 + + 100 — 19 — - — - -

A. brasilense SR75 + + 80 — - — 9 — 7 -

A. iipoferum RG20a + 58 — - — - — - -

П A. brasilense Cd — - + + 100 + + 66 X 35 -

A. brasilense Sp7 — - + + 109 + + 100 + + 129 -

A, irakense KBCI — - — 24 X 13 + + + 100 - -

A. Iipoferum Sp59b — - + 50 — . — - - -

Контроль 13 18 7 7

A. brasilenseS\1 - - X 34 ... ± ,. 24 — 16 + + 100

Контроль 7 7 7 7

Примечания:«+»- соответствует одной полосе в тесте двойкой радиальной иммунодифузии;

«-*-» • соответствует частичному взаимодействию в тесте двойной радиальной иммунодиффузии; «—* - соответствует отсутствию полосы в тесте двойной радиальной иммунодифузии; «-»- тестирование не проводили.

За 100 % принято значение оптической плотности продуктов реакции АТ с гомологичным Аг в ИФА, зарегистрированное при 490 им.

В составе ЛПСврт и ЛПОрмь было показано наличие детерминант, содержащихся в ЛПСс<| давал серологический перекрест только с ЛПСса-АТгшссл реагировали с ЛПС^т активнее, чем с гомологичным ЛПС, что может объясняться большей представленностью специфических антигенных детерминант в ЛПСзрт {рис. 1 А, табл. 3). В ЛПС^ найдены антигенные детерминанты, которые помимо гомологичных АТ выявляются АТлпсква и АТлпсаь Для ЛПСква было показано слабое взаимодействие с АТдпсвр'). связанное, видимо, с наличием общих антигенных детерминант, причем АГлпсо) с ЛПСква не взаимодействовали (рис. 1А, Б, В, табл. 3).

Сравнительный иммунодиффузионный анализ ЛПС различных штаммов азос-пирилл с АТ, полученными на целые клетки А. ЬгсаИете 5р245, обработанные глутаровым альдегидом, выявляет серологамеское родство ЛПС штаммов А. Ьгсп1-1ете 5р245,51175 и А Ьро/етт НХ320а (рис. 2А). Причем, ЛПС$рИ5 антигенно более близок с ЛПСд175, чем с ЛПСкозог Полученные результаты коррелируют с данными ИФА (табл. 3).

ЛПСбп был тестирован на наличие комплементарных детерминант со всеми полученными АТ. В тесте иммунодиффузин (рис. 2Б) по форме полос преципитации можно предположить наличие общих антигенных детерминант с ЛПС штаммов Бр7 и С<1. Из результатов ИФА следует, что специфичность АТлпсо и АТлпс5р7 к ЛПСхп составила 34 и 24 % соответственно (при 7 % в контроле). ИФА демонстрирует очень слабое взаимодействие АТлпсква с ЛЛС^^ которое можно отнести к неспецифическому (табл. 3).

Рис. 2. Схемы двойных иммунодиффузкй препаратов ЛПС (А) А, ЪгюНеюе 5р245, ЭЯ75 и А. И-ро/егит 1Ш20а с АТгч^ (Б) ЛПС;и с АТ На ЛПС бактерий А, ЬгазИегке Б17, А. Ьгаяйеюе ,А. ЬпаНеже С4 А, ¡гакегхе КВС1.

На основании полученных результатов все исследуемые штаммы по нммунос-пецнфичности ЛПС могут быть разделены на две серо группы (табл. 2). Однако анализ результатов серологических исследований позволяет говорить о наличии гетерогенности антигенных детерминант в составе второй серо группы:

• А. Иро/егит 5р59Ь и А. ЬпкИепзе С<1;

• А. ЬгтИете 5р7, А. ¡ткете КВС1 и А. ЪгсчИеже С<1 (отличные от общих фрагментов с А. Иро/егит 5р59Ь);

• А. ЬгсяИегае 517, Л. ЬгазИетеБрУпА. ЬгазНегке С<±

А

Б

Как известно, антитела, образованные на ЛПС характеризуются специфичностью к его полисахаридкоЙ части, в связи с чем, можно утверждать, что выявленные серологические перекресты говорят о наличии общих структурных фрагментов в соответствующих ОПС.

3 Выделение О-слецифнческих полисахаридов бактерий A. brasiïense SI 7, Cd»

SR75.A îrakense KBC1 и A. ílpoferum Sp59b il исследование ШШЧКШ структур их повторяющихся звеньев

В связи с тем, что экспонированные в окружающую среду ОПС определяют специфичность межклеточных контактов н серологическую индивидуальность микроорганизмов, исследование структуры ОПС является насущной необходимостью для выявления молекулярного механизма формирования ассоциации азоспи-рилл с растениями. К началу наших исследований были определены структуры ОПС только для двух штаммов азоспирилл - A. lipoferum SpBrl7 (Chôma et al, 1992) и A. brasiïense Sp245 (Fedonenko et al., 2002). Авторами было показано, что ОПС A. lipoferum SpBrl7 является разветвленным и состоит из повторяющихся единиц, включающих три остатка рамнопираноз в главной цепи, одна из которых замещена глкжогдаранозой, а другая ацетилнрована. Все остатки рамнозы {Rba) -L-изомеры в с-конфигурации. Повторяющееся звено ОПС A. brasiïense Sp245 представлено лшейным пента-О-рамнаном.

Для получения ОПС A. brasiïense Cd, SR75, S17, A. lipoferum Sp59b и A. irakense КВС1 был проведен кислотный гидролиз соответствующих ЛПС. Структурные исследования проводились совместно с сотрудниками лаборатории химии углеводов Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН (г. Москва). Моносахаридный состав ОПС и абсолютные конфигурации Сахаров определяли методом ГЖХ в виде ацетатов пол иолов и ацетилированных окгилгли-коэидоз соответственно.

В препаратах ОПСкжъ ОПСо и OnCspj% было показано наличие L-Rha, D-маннозы (Man) и D-галактозы (Gal) в соотношении - 3:1:2. Анализ компонентов гидролизата OnCstm привел к идентификации только D-Rha. Наиболее разнообразным по набору моносахаридов был OnCstr, в составе которого были найдены остатки D-глкжозы (Glc), глюкозами на (GlcN). маннозамина (ManN), и д ва типа остатков L-Rha, неметилированной и метилированной в положении 2 (Rha20Me) в отношениях—1:1:1:3:1 соответственно.

На основании результатов ГЖХ-масс-спеюрометрии частично метилированных ацетатов полнолов были выявлены порядок замещения моносахаров, терминальные остатки и точки ветвления в исследуемых полисахаридах. Исходя из того, что одна из рамноз ОПС$п имела ОМе заместитель, метилирование данного полисахарида проводили CDjJ.

Идентичность продуктов метилирования ОПСси и ОПСз,^, позволила выдвинуть предположение о структурном подобии их повторяющихся единиц, которые были представлены гексасахаридом с 3,4-замешенноЙ галактозой в точке ветвления и концевым остатком Rha в боковой цепи. Повторяющееся звено ОПСква являлось также разветвленным гексасахаридом, но точкой ветвления была 3, 4-

замещенная Rha, а терминальным сахаром боковой цели - Gal в фуранозной форме. Все остальные сахара представляли собой пиранозиды. Таким образом, структуры OnCcd, OnCspMb и ОПСква различались, несмотря на сходный моносаха-рндный состав. Повторяющееся звено ОПСж; являлось линейным, и состояло из

2- и 3- замещенной Rha в пиранозной форме.

При проведении экспериментов, направленных на установление структур повторяющихся звеньев ОПС деструктивными химическими методами, мы столкнулись с рядом трудностей. Из-за сложной структуры повторяющегося звена OFICsu не полностью был определен состав ПС и конфигурации некоторых остатков. Невыясненными остались также вопросы, касающиеся установления моносахарид-ной последовательности в полисахаридаых цепях, типов связей между остатками моносахаридов и степени разветвления повторяющихся звеньев исследованных ОПС.

Для разъяснения вышеизложенных вопросов и подтверждения уже полученных данных были проведены исследования методом ,3С- и 'Н- ЯМР спектроскопией с использованием двумерных экспериментов.

На основании данных, полученных этим методом, было показано, что ОПСква является регулярным и состоит из разветвленных гексасахаридных повторяющихся звеньев (структура 1);

a-D-Gai/'-f I -^2>-a-L-Rhapl),-( I ->3)-í5-D-Manp-{ I -»SJ-a-L-Riiap11

1 i 3

-^4)-o-L.Rhap4l->3)-p-rb<jalp4l->

1

При установлении моносахарндной последовательности в повторяющемся звене, определяемой с использованием спектроскопии NOESY, наблюдалось перекрывание сигналов отдельных протонов, связанных с атомами углерода, что вызывало трудности в интерпретации спектра. Поэтому OnC^jci был подвергнут распаду по Смиту, который привел к окислению терминальной Gal и остатка 2-замещенной Rha в боковой цепи, а также образованию модифицированного полисахарида, структура которого была расшифрована нз ,3С- и 'Н- ЯМР спектров. Затем, учитывая данные, полученные о модифицированном ПС, были интерпретированы корреляции в NOESY спектре ОПСкеС1> вследствие чего структура его повторяющегося звена была полностью расшифрована (структура I).

Необходимо отметить, что для грам отрицательных бактерий, на примере A. irakense КВС1, впервые показано существование ОПС, основная цепь которого построена из дисахаридных повторяющихся единиц, а боковая цепь является нетипично длинной.

Аналогичные исследования ОПС типового штамма A. Upofenmi Sp59b позволили обнаружить сходный тип строения с ОПСква, т.е. короткая основная и длинная боковая цепи, однако структура ОПС была совершенно иной. ОПС^м, представляет собой дигалактан с маинорамнаиовоЙ боковой цепью (структура 2).

и 13С-ЯМР спектры ОПСса и соответственно значения химических сдвигов протонов и атомов углерода были близки к полученным для ОПСзрмт что позволило сделать вывод об идентичности структур их повторяющихся звеньев.

а-ЫУ1арш-( 1 ->3)-а-ьНЬар"-П-»2)-а-ьЮ13р1-( 1 -+3>|*-П-Ма1у>

1 X

4

->3)-Р-1>Сф"-( 1 ->3)-а-СнОа]р'Ч 1 2

Таким образом, в нашей работе впервые показана идентичность повторяющихся звеньев ОПС бактерий, принадлежащих к разным видам азоспирилл.

Комплексный анализ ОПСзют показал, что он состоит из одинаковых линейных пентасахаркдных повторяющихся звеньев, содержащих только остатки Ц-Мта, имеющих структуру 3, аналогичную структуре ОПС А. ЬгазНеюе 5р245, установленной ранее сотрудниками лаборатории биохимии ИБФРМ РАН (Ре<1опеп]со е! а!., 2002):

-►2)-рЧ>КЬ^К 1 -»3)-а-0-К11^Ч1 -*3 )-оы>К1]!¥>-( 1 ->2)-а-0-И1гу>( 1 -»2)-а-1>-1ицр-( I

3

На примере этих микроорганизмов выявлена межштаммовая идентичность ОПС азоспирилл одного вида.

Моносахарид рамноза в !>■ или Ь-форме широко представлен в составе ПС микроорганизмов, вступающих в различные взаимоотношения с растениями, что может быть показателем его важной роли в процессах растительно-микробных взаимодействий. Необходимо отметить, что практически во всех случаях в природных ПС 1-2-связанные остатки ИЬа имеют а-конфигурацию, что также обнаружено н в полисахаридах азоспирилл. У а-аиамеров гликозидная и англикозидная связи располагаются в транс-ориентации, вследствие чего полисахариды с такими звеньями могут формировать развернутые структуры, что важно для экспонирования антигенных детерминант на поверхности клетки (Липкинд и Кочетков, 1984).

В связи с тем, что структуры ОПС А. ЬгазИете 5Я75 и 5р245 оказались идентичными, мы посчитали необходимым провести изучение уровня генетического родства этих штаммов. Этот этап работы проводился совместно с сотрудниками лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН. В результате гидролиза тотальной клеточной ДНК бактерий штаммов 5Я75 и Бр245 эндонуклеазами рестрикции, были получены данные, которые свидетельствовали о существенных различиях в структуре геномов этих микроорганизмов, а в плазмндных профилях отсутствовали репликокы с одинаковой молекулярной массой. Тем не менее, были найдены высоко гомологичные локусы в тотальной ДНК и двух мегаплазмидах этих штаммов, по-видимому, определяющие продукцию ЛПС.

Приоритетные результаты были получены в ходе исследования структуры ОПС А. ЬпаЗете БП. Он представляет собой смесь из двух различных полисахаридов

(структура 4 и 41), что впервые выявлено для бактерий ■paz.z.Aiospirillum, Для того, чтобы подтвердить порядок соединения моносахаридов, ОПС подвергли распаду по Смиту, при котором произошло разрушение ПС41 до димеров и частичный раскол остатка GlcN Ас в ПС4, что в конечном итоге позволило упростить ЯМР спектр ПС и подтвердило порядок связывания в обоих полисахаридах.

На примере липополисахарида A. brasilense S17 впервые для азоспирилл показано присутствие в составе ОПС К-ацетил-1>гяюкозамина и неуглеводного заместителя (8)-3-гицроксибу1ирата. Известно, что GlcNAc является специфическим гаптеном лекгина пшеницы. Учитывая поверхностную локализацию ЛПС, а также способность азоспирилл экскретировать ЛПС в окружающую среду в виде ЛПБК, можно предположить его сродство к лектину пшеницы. Таким образом, согласно лектнн-углеводной теории, ОПС может выполнять рсшь специфического углеводного рецептора на ранних этапах взаимодействия бактерий с растениями. Необходимо отметить, что структура ПС41 сходна со структурой повторяющегося звена ОПС A. lipoferum SpBrl7 (Chôma et ai, 1992), за тем исключением, что одна из рамноз в ОПС$п не ацетилироаана.

p-D-GkpNAc I

44

—*3)-a-D-ManpNAcyKl-»4)-a-L-2-OMeRh3p(l~* , 4

где Асу! - (ОССН;СН(ОН)СН3)

-¿Ht-L-RlV-O—3>a-L-Rhqp4l 2 Т I

p-D-GJc/» 41

Суммируя сведения, полученные об этих штаммах, можно предположить, что, несмотря на различное происхождение, их развитие проходило конвергентно. Возможно, на этот процесс во многом повлияло обитание бактерий в сходных экологических нишах.

На основании результатов структурных исследований ЛПС бактерий рода AzospiriUutn были разделены на четыре хемотнпа. К первому (I) были отнесены бактерии A. brasilense Sp245 и SR75, ко второму (II) - A. lipoferum Sp59b и A. brasilense Cd. Исходя из моносах аридного состава, ко второму хемотилу также можно отнести и ЛПС А. irakense KBCI. Однако на основании структурной индивидуальности он был выделен в отдельный хемотшт (хемотип III). К четвертому (IV) - были отнесены ЛПС A. brasilense S17, а также A. lipoferum SpBrl7 (Chôma et al., 1992).

—»3)-a-L-Rhap-( 1 —»

Сравнительный анализ результатов исследований ОПС позволил обнаружить в их составе некоторые общие структурные фрагменты, по которым могли происходить выявленные иммунологические перекресты (рис. 3).

Рис. 3. Обшие структурные фрагменты ОПС исследуемых штаммов азосшрилл.

Вероятно, именно эти структуры полностью либо частично принимали непосредственное участие в иммунном ответе. Нужно отметить, что серологические перекресты были установлены для ЛПС как с одинаковыми, так и с разными структурами повторяющихся звеньев. Наши исследования также показали, что на основе иммунохимических исследований ЛПС не всегда удается провести штам-мовую идентификацию бактерий. Например, в случае штаммов A brasilense Sp245 и SR75 для этих целей необходимо было прибегнуть к генетическим исследованиям. Таким образом, только применение совокупности химических, физико-химических, серологических и генетических методов позволяет получить наиболее полную информацию о химическом строении ЛПС, а также определить принадлежность микроорганизмов к тому или иному штамму.

ВЫВОДЫ

1. Проведен сравнительный анализ биополимерного состава препаратов ЛПС семи штаммов аэоспирилл: A. brastlense SR75, S17, Sp7, Cd, A. irakense КВС1 и А. lipoferum Sp59b, RG20a. Профиль жирных кислот, входящих в состав липшолиса-харидов липидоа А, представлен насыщенными, ненасыщенными и гидроксикис-логгами. Основными по содержанию были З-гидрокситетрадекановая, гексадека-новая, 3-гидроксигексадекановая, октадеценовая жирные кислоты. Исключение составил липополисахарид A. lipoferum Sp59b, в составе которого доминирующими были дидекановая, 2-гидроксидндекановая, 3-гидроксидндекановая, 3-гидрокситетрадекановая, гексздекановая, октадеценовая кислоты.

2. Впервые для О-специфических полисахаридов азоспирнлл (на примере трех штаммов) показано наличие гексасахаридных повторяющихся звеньев с необычно длинной тетрасахаридной боковой цепью.

3. Выявлена идентичность повторяющихся звеньев О-специфических полисахаридов бактерий рода Azospirillum, принадлежащих к разным штаммам одного вида (A. brasilense Sp245 и A. brasilense SR75) и к разным видам (А, lipoferum Sp59b и A. brasilense Cd).

4. На примере липополисахаридов A. brasilense S17 впервые для азоспиршш продемонстрировано наличие двух существенно отличающихся по структуре О-слецифических полисахаридов, а также присутствие Ы-ацетнл-1)-глюкозамина и неуглеводного заместителя (5)-3-гидроскнбутирата.

5. На основании данных структурного анализа повторяющихся звеньев О-специфическнх полисахаридов, выделенных из липополисахаридов пяти штаммов азоспирилл (A. irakense КВС1, A. lipoferum Sp59b, A. brasilense Cd, SR75 и S17), соответствующие липоподисахариды разделены на четыре хемотипа.

6. На основании серологических анализов с использованием кроличьих антител на очищенные препараты липополисахаридов, исследованные штаммы бактерий рода Azospirillum разделены на две серогруппы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Федоненко ЮЛ., Кониова О.Н., Игнатов В.В., Коннова СА. Харзктерисшка химического состава и биологической активности мембранных и капсульных углеводных компонентов бактерий Azospirillum brasilense S17 // Биология — наука XXI века: сборник тезисов / 7-я Путинская школа конф, молодых ученых. Пущино, 14-18 апреля 2003. - Пущино, 2003. -С. 384.

2. Коннова О.Н, Федоненко ЮЛ, Коннова СА, Игнатов В.В. Исследование по-лнсахаридных составляющих липополисахарида Azospirillum irakense КВС1 // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: сборник тезисов / 4-я Всероссийская конференция молодых ученых. Саратов, 23-25 июня 2003. - Саратов: Изд-во Юл, 2003. - С. 76.

3. Fedonenko Yu.P., Kormova O.N., Zatonsky G.V., Shashkov A.S., Konnova S.A., Zdorovenko E.L., Ignatov V.V., Knîrei Yu.A. Structure of the O-polysaccharide of the Hpopolysaccharide of Azospirillum irakense KBC1 // Carbohydr. Res. - 2004. -Vof, 339.-P.1813-1816.

4. Коннова O.H., Федоненко ЮЛ Исследование структуры О-специфнческого полисахарида, полученного методом прямой экстракции бактериальной массы Azospirillum irakense КВС1 // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Сборник научных статей. — Саратов: Изд-во Научная книга, 2004.-С.4М6.

5. Коннова О.Н., Бобкова М.Д., Федоненко ЮЛ, Коннова СА., Игнатов ВЛ. Мембранные и экстраклеточные гликополимеры бактерий Azospirillum lipoferum Sp59b II Биология — наука XXI века: сборник тезисов / 8-я Пущинсхая школа конф. молодых ученых. Пущино, 17-21 мах 2004. - Пущино, 2004. - С. 150.

6. Коннова О.Н., Федоненко Ю.П., Коннова СЛ., Игнатов В.В. Исследование структуры днполисахарида бактерий Azospirilhm Upoferum Sp59b // Конференция по органической химии: сборник тезисов / VII Молодежная научная школа - конф. Екатеринбург, 22-26 июня 2004. - Екатеринбург, 2004. - С. 375.

7. Коннова ОЛ„ Федоненко Ю.П., Коннова СЛ., Игнатов BJ3. Состав глнкопо-лимеров поверхности бактерий Azospiriltum brasilense SI 7 // Химия и биохимия углеводов: сборник тезисов / 3-я Всероссийская школа-конф. Саратов, 9-11 сентября 2004. - Саратов: ООО "Ракурс", 2004. - С. 39.

8. Коннова О.Н., Бурыгин ГЛ., Федоненко Ю.П., Матора Л.Ю., Коннова СЛ., Игнатов В.В. Характеристика липолисахарида Azospirillum brasilense Cd и выявление серологического родства с липополисахаридом бактерий Azospirillum Upoferum Sp59b // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: сборник тезисов f 2-я Региональная школа-конф. молодых ученых. Саратов, 26-28 октября 2004. Саратов: Иэд-во Научная книга, 2004.-С. 18-19.

9. Коннова ОН., Федоненко Ю.П., Коннова СЛ., Игнатов В.В. Идентичность строения повторяющихся звеньев О-специфических полисахаридов двух

• штаммов бактерий AzospirÜíum brasilense Н Биология - наука XXI века: сборник тезисов / 9-я Путинская школа конф. молодых ученых. Пущино, 18-22 апреля 2005.-Пущино, 200S.-С. 195-196.

10.Fedonenko YuP., Konnova O.N., Zatonsky G.V„ Konnova S.A., KocharovaN.A., Zdorovenko E.L., Ignatov V.V. Structure of the O-polysaccharide from the Azospirillum Upoferum Sp59b lipopolysaccharide // Carbohydr. Res. - 2005. - Vol. 340. - P. 1259-1263.

11.Коннова O.H., Калашникова E.E., Федоненко Ю.П., Макаров О.Е, Коннова СЛ., Игнатов В.В. Характеристика поверхностных глнкополимеров бактерий Azospirillum brasilense SRI 5 // Стратегия и взаимодействие микроорганизов с окружающей средой: Сборник научных статей. - Саратов: Изд-во Научная книга, 2005. - С. 68-74.

12-Коннова ОЛ, Федоненко Ю.П., Борисов И.В., Здоровенко ЭЛ., Кацы Н.И., Коннова СЛ., Игнатов В.В. Установление строения повторяющегося звена О* специфического полисахарида Azospirillum brasilense SR75 и гомология LPS-локусов в плазмидах Azospirillum brasilense штаммов SR75 и SP245 // Микробиология.-2005. - Т. 74, №5. - С. 1-7.

13.Коннова СЛ., Федоненко Ю.П., Коннова O.R, Игнатов В,В. Современные представления о структуре и функциях липополисахарндов азоспирилл // Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов л растений: фундаментальные и прикладные аспекты: сборник тезисов / Всероссийская конференция. Саратов, 15-17 июня 2005. - Саратов: Изд-во Научная книга, 2005. - С. 14.

] 4. Коннова О.Н., Федоненко Ю.П., Коннова СЛ., Игнатов В.В. Идентичность О-специфическнх полисахаридов различных штаммов азоспирилл И Там же. - С. 20.

15. Борисов И.В., Коннова О.Н., Федоненко ЮЛ., Коннова СА., Кацы ЕИ. Выявление идентичности строения О-полисахаридов и гомологичных LPS-локусов в штмидах штаммов Azospiriilum brasilense 11 Там же. - С. 24.

16. Коннова О.Н., Федоненко Ю.П. Структурное я серологическое исследование О-антигена бактерий Azospiriilum brasilense Cd // Исследования молодых ученых и студентов в биологии: Сборник научных статей. - Саратов: Иэя-во Са-рат. ун-та, 2005. - Вып. 3. - С. 52-55.

17. Коннова О.Н., Зиновьева ЕИ-, Федоненко Ю.П., Штыков С.Н., Коннова С.А. Поверхностные гликополимеры бактерий Azospirillmt brasilense SRI 5 // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: сборник тезисов / V Всероссийская конференция молодых ученых. 22-24 июня 2005. -Саратов, 2005. - С. 28.

18.Коннова О.Н., Федоненко Ю.П., Коннова СЛ., Игнатов В.В. Характеристика полисахарида и О-специфического полисахарида бактерий Azospiriilum brasi• lerae Cd // Конференция по органической химии / VIII Молодежная научная школа-конференция. Казань, 22-26 июня 2005. — Казань, 2005. —С. 390.

19.Коннова О.Н., Бурыпш ГЛ., Федоненко ЮЛ, Матора Л.Ю., Панкин К.Е., Коннова СА, Игнатов В.В. Химический состав и иммунохимииеская характеристика липополисахарида аэотфиксируюших ризобактерий Azospiriilum brasilense Cd // Микробиология. - 2006. - Т. 75, № 3. - С 383-388.

20.Бойко А.С., Федоненко ЮЛ., Коннова O.R, Коннова СЛ., Игнатов В.В. Характеристика поверхностных гликополимеров ризобактерий Azospiriilum brasilense SR55 и S17 !1 Биология — наука XXI века: сборник тезисов / 9-я Путинская школа конф. молодых ученых. Пущиио, 17-21 апреля 2006. - Пущнно, 2006. - С183.

21.Fedonenko Yu.P., Boiko A.S., Konnova O.N., Zdorovenko El-., Konnova S.A^ Ig-natov V.V. Immunochemical characterization of the lipopolysaccharides from a group of Azospiriilum brasilense strains it 2-nd Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates. Rostock, 4-8 October 2006. - Rostock, 2006. - P. 25.

22.Коннова O.H., Бурыгин ГЛ., Федоненко Ю.П., Матора Л.Ю., Коннова СА., Игнатов ВВ. Выявление серологического родства в группе штаммов бактерий рода Azospiriilum // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: сборник тезисов / 3-я Региональная школа-конф. молодых ученых. Саратов, 10*12 октября 2006. - Саратов: Нзд-во Научная книга, 2006.-С. 14.

23.Бойко А.С., Бумагина З.М., Коннова О.Н., Федоненко Ю.П., Коннова СА., Игнатов В.В. Характеристика липополисахарида Azospiriilum brasilense SR55 // Тамже.-С.11.

Подписано в печать 14.102006 Фермат 60x841/16. Бумага офсетам. Партитура Times. Печать RISO. Объем 1,0 печ. л. Тире* 100 экз. Заказ J6 071.

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель Серман Ю.Б. Свидетельство № 3117 410600, Саратов, ул. Московская, д. 152, офис 19, тел. 26-18-19,51-16-28