Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Плазмиды вирулентности персистирующих штаммов клебсиелл

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Плазмиды вирулентности персистирующих штаммов клебсиелл"

На правах рукописи

РГВ од

У Гад

ПЛЛЗМИДЫ ВИРУЛЕНТНО СШ ПЕРСИСШРУЮЩИХ ШТАММОВ КЛЕБСИЕЛЛ

03.00.07 -' Микробиология

Автореферат диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996 год

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии ни. почетного академика Н. Ф.Гамалеи РАМН.

Научный руководитель:

действительный член Петровской академии наук и

искусств

доктор медицинских наук, профессор В.М.Бондарешсо.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук И.С.Тартаковский; доктор медицинских наук А.С.Анкирская.

Ведущая организация:

МНИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского

Защита диссертации состоится 1996 г. в часов

на заседании Диссертационного совета К001.07.01 в Научно-исследовательском .институте, эпидемиологии л микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (123098, Москва, ул. Гамалеи, 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан 1996 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук

Е.И.Коптелова

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность тет-нл. В настоящее время наблюдается значительный рост пгойно-воспалитепьных заболеваний, обусловленных условно-патогенными бактериями, развивающихся у лиц со сниженной иммунобиологической резистентностью. Повсеместно отмечается увеличение удельного веса внутрибольничных инфекций, вызываемых представителями семейства кишечных (Н.А.Семипа и др.,1995; - Л.Т.Мусина и др., 199S). Среди условно-патогенных бактерий одно из ведущих мест занимают представители рода Klebsiella, в частности Klebsiella pneumoniae (Л-А.Березкпа и др., 1993; В.М.Бондарешсо н др., 1994; 'В.М.Фролов и др., 1994; Ф.Тиссо-Геррае и др., 1995). Внутрибольничные инфекции, обусловленные К.pneumoniae, наблюдаются чаще всего в родовспомогательных учреждениях, в отделениях для недоношенных, урологических и хирургических клиниках. Довольно часто встречаются они и в отделениях реанимации и интенсивной терапии. Особенно актуальной данная проблема является в родо-вспомогательных отделениях и клиниках, когда клебсиеллы длительно выделяются от рожениц, родильниц, контаминируют организм новорожденных, обусловливая персисгетную инфекцию, "часто проявляю'попюся лишь затяжным бактерионосительством (H.A. Hirsch и др., 1985; F.Tissot-Gtierraz к др., 1990; О.П.Сельяикова н др., 1993; Л.И.Глаткан и др., 1994).

Факторы патогенвости клинических штаммов K.pneumoniae, связанные со способностью бактерий колонизировать эпителий открытых полостей организма и противостоять его защитным механизмам, изучены недостаточно. Известны фимбриальные структуры и белки наружной мембраны, сообщающие адгезивную активность K.pneumoniae (D.C.Old, R-A-Adegbola, 1981, 1983). Многие штаммы, вызывающие острых! инфекционный процесс, характеризуются наличием полисахаридной капсулы и мукоида (R. Wae haro tayankun н др., 1993; S.Favre-Bonte и др., 1995), продуцируют цитотоксин (К.В.Калнин и др., 1992), вещества, инактивирующие лизоцим (В.М.Бондаретсо и др., 1994) и бактерицидный компонент препарата интерферона (Е.В.Суржова, 1994). Для штаммов К.pneumoniae, обусловливающих сепсис или токсико-септическое состояние у новорожденных, которые отличаются крайней тяжестью и высокой летальностью, характерна

выраженная адгезивная активность ,и способность продуцирован тиолзависимый гемолизин (1Х.А1Ьега н др., 1985; И.А.Руднев, В.М.Бондареихо, 1993). Установлена хромосомная природа генетического контроля полисахарида капсулы, фимбриалышх адгезянов, тнолзавискмого гемолизина и связь синтеза мукоеда, антилнзоцимной активности и агрегативной адгезивной активности с функцией плазмид (Х.Накй и др., 1989; З.Рауге-Вог^е и др., 1935; В.М.Боцдарешю и др.,1988).

Персистирукнцие штаммы К.рпегипошае только начинают исследовать и данные об их фенологических и генетических характеристиках в литературе практически отсутствуют.

Пель настоящей работы - изучить биологические и генетические особенности персисгарующих штаммов клебсиелл, изолированных в динамике от рожениц, родильниц, новорожденных и детей раннего возраста с инапарашнон и рецидивирующей клебсиеллезной инфекцией.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) создать коллекцию клинических персисгарующих штаммов К.рпешпошае и охарактеризовать их по маркерам антибиотшсо-резистешносш н профилю плазмвдных ДНК; - ...

2) получил» генетически связанные пары штаммов, отличающиеся по наличию передаваемых в скрещивании или опытах мобилизации нлазмид, обнаруживаемых у персистирующнх штаммов К.рпеитогйлс;

3) в опытах на перевиваемых клеточных линиях и культуре перотокеальных макрофагов морской свинки определить связь между наличием у бахтерый передаваемых нлазмид и их адгезивной агрегирующей активностью и способностью к размножению в фаголизосомах профессиональных фагоцитов;

4) изучить яммуномодулирующие свойства штаммов путем оценки пролиферативной активности спленоцитов в присутствии В- и Т-митогенов и при имммуноморфалотическом исследовании органов лабораторных животных в процессе развитая клебсиеллезной инфекции.

Научная новизна • и практическая значимость работы. У клинических персистирующнх штаммов клебсиелл выявлены две оригинальные пдазшщы, связанные с патогенными свойствами этих условно-патогенных бактерий. Одна плазкида молекулярной массы 55

MD (обозначенная как pAdh-55) контролирует адгезивную агрегирующую активность возбудителя, определяющую дальнейшее развитие инфекционного процесса. Вторая плазмида, мол. массы 100 MD (обозначенная как Rdf-1Q0) связана с выраженным иммуносулрессирующим воздействием клебсиелл, устанавливаемым на основе расчета индексов пролиферации клеток селезенки мышей в присутствии Т-мнтогена (КонА) и В-митогеиа (ЛПС).

Наличие у персистиругощих штаммов K.pneumoniae плазмвд мол. массы 55 и 105 MD, связанных с вирулентностью указанных бактерий, свидетельствует о потенциальной опасности таких культур, что должно учитываться при оценке патогенетической значимости клинических бактериальных нзолятов, требующих верификации их этиологической значимости.

Публикации. Основные материалы диссертации отражены в 4 статьях и 3 тезисах.

Апробация работы. Диссертация апробирована на конференции отдела генетики и молекулярной биологии бактерий НИИМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН 8 апреля 1996 года.

Объем и сфуктура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы. Материал изложен на ... страницах.

Методы исследования. У селекционированных для исследования биологических и генетических характеристик штаммов клебсиелл определяли устойчивость к антибиотикам методами серийных разведений и дисков. Кокыогационное скрещивание и мобилизацию неконыогатшгаых плазмвд осуществляли общепринятым методом (Д.Миллер, 1976). Наличие в лпгммах плазмидной ДНК регистрировали с помощью метода Кадо (C.I.Kado, 1981). Препаративное выделение плазмидной ДНК бактерий проводили по методу H.C.Birnboim и J.A.DoIy (1979).

Определение молекулярной массы плазмвд осуществляли с учетом их электрофорегтической подвижности в 0.7-1.0% агарозном геле (F.A.Meyers и др., 1976). Элиминацию плазмвд осуществляли при выращивании бактерий в жидкой среде, содержащей сублетальные дозы этндиума бромида.

Биологтгтгстгке методы исследования. Адгезивную колонизирующую и цитотоксигеиную активность исследуемых штаммов оценивали на модели перевиваемых клеточных линий Нер-2 и £ по методу, олисашюму в работе В.ЭД.Боцдаренко и др. (1973). Опыты с мечеными 3Н-глюкозой бактериями проводили согласно методике, описанной - ранее (В.М.Бопдаренко и др., 1975). Для оценки способности бактерий размножаться в фаголизосомах-профессиональнкх фагоцитов использовали модель перитонеалышх макрофагов морских свинок (Т.Н.Маслока в др., 1973). Окраску препаратов осуществляли азур-эозином по Романошжому-Гпмае.

Экспериментальную инфекцию воспроизводили в опытах на мышах лишш СБА. В опытах использовано 1280 хашотшдх. На протяжении 76 суток на ранних сроках 1шфекциоиного процесса производили умерщвление животных эфиром и их вскрытие. Стерильно извлеченную селезенку гомогенизировали и делали высев гомогената на среду Эндо н Плоошрева.

Параллельно в селезенках исследуемых мышей определяли общее количество спленоцитов Т- и В-лимфоцатов в цитотоксическом тесте с помощью глтп-Т-глобулнпа и аятп-В-сысороткп, а также содержанке зрелых В-.иагфодитов (ЕАС-РОК). Количество В-незрелых' лимфоцитов рассчитывали по разнице всех В-клеток и В-зралых лимфоцитов (НАЛСрасшша и др., 1988). Параллельно исследовали количество антител к убитым нагреванием бактерий в РИГА. Гистологический анализ проводили путем морфометрического определения" величины фолликулов и размера герминативных В-зон селезенки на серийных срезах, окрашенных гематоксилин-зозином.

Исследования проводили в динамике на 1, 3, 7, 14, 21, 28 п 60 сут. после введения мышам бактерий теистически связанных пар штаммов. Результаты опытов обрабатывали статистически. Определяли средние арифметические и средние геометрические значения с. вычислением средних ошибок и доверительных интервалов. Достоверность различий- между группами и контролем определяли с помощью критерия Стьюдента.

Опыта на клеточной линии Нер-2 были выполнены совместно с к. м. н. Березиной Л. А. исследования на мышах лишш СБА с к. м. н. Николаевой Т. Н. ( НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи. Москва ).

йммуноморфологические исследованная были проведены совместно с к.м.н. А. И. Смолягиным и к.м.н. И. И. Чашшкосой (Медицинская академия, г.Оренбург).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Коллекция клинических персистирующих штаммов ILpneumoniae и их общая характеристика

Для проведения исследований была собрана коллекция из 3G0 хлиняческих изолятов K.pneumoniae, выделенных в роддомах и детских стационарах некоторых городов России (Москва, Санкт-Петербург, Нальчик) и Украины (Киев, Харьков), которая может быть условно разделена на 2 группы:

1-я, состоящая из 205 культур, от рожениц, родильниц, новорожденных и детей разного возраста;

2-я, состоящая из 154 культур, изолированных от недоношенных детей в динамике.

Изучение спектра резистентности культур 1-ой группы показало, что у 78% выявляется устойчивость к стрептомицину, карбенициллину, тетрациклину, хлорамфениколу, канамицину и гентамнцину. Штаммы характеризовались полиплазмидным составом и имели молекулярную массу ллазмид преимущественно от 20 до 140 MD.

Во 2-й группе большинство штаммов являлись полиантибиоггико-резистенгнкми (85%), отличаясь, в основном, по чуетвительности к гентамнцину и канамищшу и характеризовались наличием гетерогенных по мол. массе плазмид: 2, 6, 8, 40, 50, 55 н 60 MD и 40, 55, 105 и 120 MD.

Адгезивная агрегирующая активность клинических персистирующих штаммов K.pneumoniae

Используя метод инфицирования клеточных монослоев теревкваемых линий Нер-2 и L бактериями, вносимыми в концентрации 5x107 КОЕ/мл в пробирку с 48-часовыми однослойными пластами слеток и учетом результатов через 5 часов инкубации при 37°С и тараллелышм исследованием профиля плазмидвон ДНК изучаемых слинических ппаммов K.pneumoniae из 360 культур было отобрано 26,

характеризующихся адгезивной агрегирующей активностью. Среди выявленных культур 10 изолированы от рожениц и родильниц, 15 были представлены штаммами К.рпешпошае, выделенными от детей раннего возраста с вялотекущей рецидивирующей клебсиелидной инфекцией, как правило, поражающей респираторный и мочевыводящий тракт.

Один ■ штамм К.рпешпошае 22-110, был, охарактеризован в лаборатории генетики вирулентности бактерий ранее, изолированный при токсико-сеппщемическом процессе из крови ребенка, погибшего от генерализованной клебсиеллезной инфекции. Все штаммы обладали плазмидами мол. массы 55 МЛ и, как правило, несли 2, 3, 4 и более плазмид различной мол. массы.

В дальнейших исследованиях для установления связи между наличием у бактерий ллазмлды мол. массы 55 МО и их адгезивной агрегирующей активностью были использованы исходный штамм К.рпешпошае 22-110, несущий две плазмиды (55 и 60 МО) и его бесплазмидные производные: К.рпешпошае 1084 и 1085, полученные в результате обработки исходной культуры бромистым этидием.

Дополнительно в эксперименты была включена вторая генетическая пара штаммов: эталонный реципиентный бесплазмидный штамм К.рпешпошае 5054 №12^5 ЫхЧхр'пР и генетически связанный с ним мобилизангг №1088 Ыэ+р55 МО+, полученный путем мобилизации неконыогативной плазмиды 55 МО из штамма К.рпешпошае 22-110. Характеристика генетически связанных пар штаммов К.рпешпошае, отличающихся по наличию плазмид 55 МО, представлена в табл. 1.

Зависимость -агрегирующей адгезивной активности К.рпешпошае от наличия у бактерий плазмиды 55 МО, обозначенной нами рА<ЗЬ-55, представлен« в табл. 2.

Как видно из данных таблицы 2, утрата бактериями плазмиды рА<1Ь существенно отражалась на способности клебсиелл к адсорбции и. агрегации на клетках. Наиболее наглядно связь плазмиды 55 МО с адгезивной активностью демонстрируют опыты по приобретению ее реципнентным штаммом К.рпешпошае 5054, адгезивная способность которого, имевшая показатель 11.8Ю.5, достигает цифр 32.7±1.2 .

Опыты с изотопной меткой подтверждают эту взаимосвязь (табл. 2). При морфологическом исследовании монослоя клеток линии Нер-2,

инфищфовагагых бактериями мобилизанта К.рпеитошае К<5054 рАе1Ь-55, уже через 2 часа инкубации среднее число бактерий, фиксированных на одной клетке, составляло 3-4. При атом адгезию наблюдали более чем на 1/3 клеток монослоя. К 5-ти часам количество клебсиелл увеличивалось в 1.8 раза и на. плазмолемме можно было видеть активно делящиеся бактерии.

Цитопатические изменения, вызванные мобшшзантом, были минимальны: отмечали неравномерную интенсивность окраски цитоплазмы отдельных клеток монослоя, увеличение количества вакуолей, в некоторых клетках отмечали пикноз ядер.

Таблица 1

Характеристика штаммов К.рпеитошае, использованных в работе

_ ♦__

Штамм K.pneumoniae, №№ обозначения Наличие в клетке плазмидпой ДНК мол. массы Плазмндные . маркеры резистентности

Исходный 22-110 pAdh+ pAlz+ 55 и 60 МБ Km Тс Cm Sm Su

Клопы,.полученные . путем обработки бактерий БЭ: 22-110 (1084) pAdh" pAlzr отсутствует 55 МБ отсутствуют отсутствуют

22-110 (1085) pAdh+ --

Рециоиент К4 5054 his1 rip отсутствует отсутствуют

Мобилнгант 5054 his+ pAdb+ 55 МО отсутствуют

Транскопгьюгант 5054 (12-85) pAJzt 60 МО Km Тс Cm Sm Su

Обозначения: Km-канамицин; Тс-тетрациклин; Cm-хлорамфеникол; Sm-стрептомицин; Su-сульфаниламвды; his" - ауксотрофность по гистидину.

Через 24 часа наблюдали активное размножение клебсиелл на плазмолемме жизнеспособных клеток и в межклеточном пространстве. Индекс гибели пласта на этот срок составлял 2.4±0.3. Таким образом, реципментные бактерии характеризовались приобретением выраженной адгезивной способности и сохраняли слабую щиотоксичность исходной родительской культуры.

Таблица 2

Зависимость адгезивной активности ШеЬз^еНа ргхеитошае от наличия у бактерий плазмидк рАйЬ-55

Генетичгски связанные пары Адгезивная акпшаость Индекс Уровень изотопной метки

штаммов К.pneumoniae адгезивное число, 2 ч. (М±т) количество пораженных клеток (%) гибели пласта, 5 ч. (Mira) (в имп/мип X 10"2)

Исходный 22-110 pAdb+pAlz+ 4,2±0,8 32,711,2 5,4±0,5 368±2

Элиминанты:

1084 pAdh-pAlr 1,2±0,2 12,3±1,0 2,3±0,2 68±1

1085 pAlz" pAdh+ 3,8±0,5 30,4±1,8 2,5±0,4 302+2

Реципиент 5054 his- 1,4±0Т1 11,8±0,5 1,3±0,2 112±3

Мобплнзаят 1088 bis" pAdh+ 3,7±0,5 32,7±1,2 2,4±0,3 374±3

Траисконъюгалт 1285 pAlz+ 1,5±0,2 12,0±0,6 1,5±0,4 118±4.

Примечание: адгезивное число -Нер-2.

количество бактерий на одну клепсу

Штаммы K.pneumeniae, выделенные от детей раннего возраста с рецидивирующей клебсиеллезной инфекцией, обладающие ллазмидой 55 MD, через 2 часа инкубации, как правило, поражали 24.6±2.2% клеток линии Нер-2, при этом к одной клетке прикреплялось не менее 3-4 бактерий (адгезивное число - 3.6±0.4). Через 5 часов после заражения наблюдали активное агрегативное размножение бактерий на плазмолемме жизнеспособных клеток, их количество увеличивалось в 2.3-3.2 раза.

15 из 26 изученных штаммов характеризовались средней степенью агрегативной адгезивной активности. Обнаружить коныогативные плазмиды 55 MD в опытах скрещивания диких штаммов K.pneumoniae с рецшшентными штаммами E.coli дли K.pneumoniae 5054 нам не удалось. Необходимы дальнейшие исследования по доказательству связи выявленных в клинических штаммах K.pneumoniae плазмид 55 MD с их адгезивной агрегирую щей способностью.

2. Изучение роли плазмиды с молекулярной массой 100 MD, контролирующей полиантибиотикорезистентность и устойчивость бактерий к фагоцитозу

Для выживания и персистенции возбудителя в организме важную роль играют факторы патогенности, обеспечивающие защиту микробов от действия гуморальных и клеточных механизмов хозяина.

В процессе скрининга при изучении на модели культуры перитональных макрофагов морской свинки 86 лттзммоз K.pneumoniae, изолированных от детей первого года жизни, с рецидивирующей клебсиеллезной инфекцией при заражении макрофагов бактериями в отношении 1:1000 и учете результатов через 6 часов инкубации при 37°С, было обнаружено 18 культур, способных к размножению в их фаголизосомах.

Бактерии 18 указанных культур, как правило, обладали одной из крупномолекулярных плазмид мол.массой (96, 100, 105, 120 MD), содержащихся в бактериальной клетке с плазмндами средней (40, 55, £0 MD) или низкой (2, 4, 6, 8, 12 MD) мол.массы.

Как известно, способность бактерий к размножению внутри фаголизосом профессиональных фагоцитов является атрибутом патогенности. Особенно она важна для внутриклеточных паразитов, таких как сальмонеллы, листерии, иерсинки (В.Г.Петровская, В.М.Бондарешш, 1994). Способность сальмонелл к размножению внутри фагоцитоз связана, большей частью, с наличием собственных плаюзд вирулентности сальмонелл, в частности, с наличием плазмвды 60 МО у 8а1топе11а ¿урЬшшпит.

Таблица 3

Клеточный состав периферической крови (1, 2, 3 ) и количество

клеток

в тимусе (4), костном мозге (5) у мьппей при инфекции, вызванной штаммами 8ЛурЫтигшт Rdff и Rdf"

Штамм Срок Абсолютное содержание (М±т)

Б^урЫ-шипша инфекции (в днях) нейтро-фцлы 1 моноциты 2 лимфоциты 3 тимо-циты 4 миэлока-рпоциты 5

кат- 5 317126 ба±э* 596143* 321±64 118±14

кам 278±26 2414* 704119* 564±41 98±11

14 216124 50±9 725113* б05±58 149±11

каг* 190117 47±8 758+10* 614145 125±12

НЙГ- 21 181±15 4±1 81б±15 675±46 131±15

каг 149110 7±2 827120 636±23 135116

Контроль здоровые мыши 121121 4±1,5 874±19 570135 166418

Примечание: Ес1/ - геБ1£1апсе 1о defensшs;

достоверные различия.

В связи с указанным было сочтено целесообразным осуществить схришшг у К.рпеишопиш плазмвд, связанных со способностью

некоторых штаммов размножаться в перитонеальных макрофагах морской свинки. В опытах скрещивания 18 культур K.pneumoniae, обнаруживших такую активность, с реципиентным штаммом K.pneumoniae 5054, была выявлена одна конъюгативная R плазмида с мол. массой 100 MD, сообщающая бактериям устойчивость к бактерицидным компонентам полиморфноядерных лейкоцитов и макрофагов.

Так как эти компоненты ассоциируются с наличием у профессиональных фагоцитов катионных белков, носящих название микробиоцидзгых или белхов-дефеисинов (R.Lehrer н др., 19S3), обнаруженную плазмиду обозначили как Rdf-100 (resistance to defeasins). Ранее сотрудниками лаборатории генетики вирулентности бактерий НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН было показано, что в опытах с профессиональными фагоцитами оптимальными являются не шероховатые (как, например, бактерии Е. coli К12), а гладкие типы бактерий (В.М.Бопдаренко и др., 1988). В связи с этим обнаруженная плазмида была передана в гладкие бесплазмндные варианты S.typhimurium 189 (реципиентный штамм, утративший собственную плазмиду вирулентности 60 MD, получен в лаборатории Б.И.Маракушей) и S.flexneri 2а 516/4, лишенный плазмида инвазивности 140 MD (получен в лаборатории Ю.М.Романовой).

Детальная изученность бесплазмвдных вариантов S.typhimurium и S.flexneri 2а в опытах. на различных экспериментальных моделях инфекционного процесса позволяла в аналогичных экспериментах выявить влияние передаваемой плазмиды Rdf-100 на биологические свойства реципиентных бактерий.

В последующих опытах было использовано 2 штамма S.typhimurium:

• 1-й штамм S.typhimurium 189 являлся реципиентным;

• 2-й трансконыогант S.typhimurium 189/711 Rdf-100 получен путем передачи плазмиды мол. массы 100 MD рецшгаенгному штамму от донорского штамма Klebsiella pneumoniae Rdf 711, выделенного от больного ребенка с рецидивирующей формой клебсиеллезной инфекции.

Экспериментальную инфекцию воспроизводили на мышах гибридах (СВА х C56/BZ6) Ff обоего пола массой 16-18 г. Заражение

животных осуществляли внутрибрюшинно введением смыва суточной агаровой культуры в дозе 2 млн. на мышь. Наличие сальмонеллезной инфекции было подтверждено высевом бактерий из крови и внутренних органов и гибелью животных, йммуноморфологические исследования проводили на 5, 14, 21 сутки инфекции, используя по 12 мышей на каждый срок инфекции.

В указанные сроки определяли количество ддроссдержащих клеток в тимусе, селезенке, костном мозге, крови и их морфологический состав. Для исследования субпопуляциошюго состава лимфоцитов селезенки было проведено определение относительного и абсолютного содержания Т- и В-лннфоцитоа в цитотоксическом тесте с помощью аоти-Т-лобулина и антн-В-сыворотки. Генетически связанные пары штаммов отличались по способности инактивировать михробиоцвдные белки. У исходного реципиентного штамма этот признак отсутствовал, у трансконьюганта 189/711 КйМСО составлял 1.7 МБК.

Заражение мышей штаммами Б^урЫтилшп 189 1ЫГ" и 189/711

вызывало развитие инфекционного процесса и гибель яашотных, начиная с 6-7 дня после заражения, при атом уровень летальности к 14 суткам инфекции не превышал 10-12%. Во всех исследованных группах мыши, выжившие б течение первых двух недель после заражения, .в последующие сроки практически не погибали. Заражение изогенными штаммами 5.1урЫтцпит и ГЫГ1" приводило к длительной

персистенции данных возбудителей в организме мышей. При этом, однако, установлена разница в продолжительности высева из селезенки нзогешшх штаммов: бактерии высевались в течение 60 суток,

тогда как КЛГ" - только 36 суток. Начиная с 16 суток исследования, на всех сроках инфекции интенсивность высева МГ" особей преобладала над высевом

Анализ сдвигов уровня ядросодержащих клеток (табл. 3) по отношению контроля показал, в целом, однотипные изменения у мышей, экспериментальных групп. Это выражалось в увеличении числа лейкоцитов и, напротив, снижении уровня тимоцитов и миелокариоцитов, особенно на 5 сутки инфекции, т.е. срок начала -гибели животных. Выявленный уровень лейкоцитов был обусловлен возрастанием содержания зрелых и незрелых нейтрофшюв, моноцитов,

тогда как уровень лимфоцитов был снижен, особенно в первые 2 недели наблюдения.

Таблица 4

Динамика популяциошгого состава лимфоцитов в селезенке мышей, ннфнцированиш: генетически связанными парами штаммов Б.ЬурЫпитит К«1Г+ и К<1Г"

Штамм Срок Абсолютное содержание (М±ш)

S.typhimuriinn инфекции (в сутках) Т- лимфоциты В- лимфоциты нулевые лимфоциты

Rdf" 5 2б4±17* 595+20 141+18*

Rdf+ 239±14* 569±11 193±19*

Rdf" Rdf+ 14 306±22 290±14 б08±19 569±11 84±21* 193±19*

Rdf* Rdf+ 21 301113.. 294±14 576±20 610124 . 126±15* 96±20*

Контроль здоровые мыши . 321±11 659±14 20±7

Примечание: Rdf - resistance to defensins;

*- достоверные различия.

Указанные изменения наиболее характерны для мышей, зарззкешшх S.typhimurimn 189/711 Rdf+ на всех сроках инфекции и, в целом, были менее выражены по сравнению с мышами, гаракешшмя S.typhimisrinni 189 Rdf-. Особенно наглядно данные различия наблюдались на первой неделе после заражения и проявлялись в достоверных отличиях содержания тимоцигов, лимфоцитов, незрелых нейтрофилов, моношггов. К 14 суткам инфекции достоверные отличия у мышей зараженных S.typhimurium 189 Rdf" и 103/711 Rdf+ выраясались только в уровне лимфоцитов.

Исследования клеточного состава селезенки у мышей экспериментальных групп выявили по сравнению с контрольным уровнем, особенно на 5-14 сутки снижение содержания Т- и В-лямфоцитов при увеличении числа клеток нуллеров.(табл. 4).

Эти опыты показали возможность влияния плазмиды Rdf-100 на иммунный статус мышей, что более демонстративно было показано далее в экспериментах на другой генетически связанной паре штаммов, а именно на S.flemeri 2а 5Í6/4 Rdf-1QQ+ и Rdf 100\

3. Иммуносупрессирующее действие S.flexnerí 2а, наследующих шхаамиду Rdf-100 K.pneuuioniae

Было изучено иммуномодулирующее воздействие штаммов S.flexnerí 516/4 2а Rdf-100" и S.flexnerí 516/4 711 Rdf-100+ иммунокомпетенгаые Т- и В-ликфоцнты. Эта эксперименты выполнены на мышах СВА массой 18-20 грамм. Животных инфицировали виутрибрюппшным введением живых микробных клеток в дозе 5x107 КОЕ в 0,2 мл стерильного физиологического раствора.. Изучение функциональной активности иммунокомлетентных Т- и В-лимфоцитов проводили по оценке пролиферативной активности клеток селезенки (КС) в реакции бласпрансформации лимфоцитов (РБТЛ) в присутствии Т-митогена (Кон А) и В-мнгсогена (специфически!! ЛПС, выделенный методом водно-фенолыюй экстракции но Вестфалю из S.flexnerí 2а 516/4).

Клетки селезенки инфицированных иышей инкубировали в присутствии митогенов и без них в СО] инкубаторе при 5% COj при 37"С. За 16 часов до окончания инкубации вносили 1 мк\Ки 3Н тимвдина с удельной активностью 3,7x10 мБк/mM в 5 мкл. Меченые клетки переносили с помощью Харвестера на стекловолокнистые фильтры FG/c с последующим подсчетом радиоактивности. Исследования проведали на 1, 3, и 7 сутки после заражения.

Проведенные исследования показали выраженное иимуносупрессирующее воздействие S.flexnerí Rdf-100+ на пролиферацию клеток селезенки мышей в присутствии Т-митогена (КонА) и В-митогеаа (ЛПС). Уровень пролиферации Т-лимфоцитов мышей на 1-е сутки после заражения в 4 раза ниже такового по

сравнению с интактной группой (Р<0,05). На 3-й сутки пролиферативпый потенциал клеток селезенки увеличивается, вновь снижаясь к 7-му дню наблюдения (Р<0,05). На протяжении этого периода уровень включения 3Н тимидина в лимфоцы мышей, инфицированных S.flexneri Rtif-100+, был значительно ниже такового контрольной группы (Р<0,05). Пролиферация спленоцитов в присутствии специфического ЛПС максимально снижена на 1-е сутки (в 1,9 раза), увеличивается на 3-й и вновь снижаясь на 7-й день, не превышая уровень пролиферации интактной группы (Р<0,05).

При введении мышам бактерий исходного рецшшенпюго штамма S.flexneri 2а 516/4 (утратившего собственную плазмиду инвазивносги 140 MD) оказывало, как это было показано ранее Т.Н.Николаевой с соавт. (1995) и подтверждаемого в данных опытах, иммуностимулирующее воздействие на пролиферацию спленоцитов в присутствии КонА, уровень которой постепенно нарастает с 1 до 7 суток после инфицирования, значительно снижаясь к 14-м (срок наблюдения) (Р<0,05).

Наличие в среде инкубации клеток селезенки В-мнтогена вызывает усиление пролиферации спленоцитов на 1-е сутки после инфицирования. На 3-7 сутки уровень включения 3Н тимидина ниже или соответствует таковому интактной группы (Р>0,05). На 14 день наблюдения отмечена статистически значимая активация иммунокомпетентпых В-лимфоцитов (Р<0,05). Таким образом проведенные исследования выявили выраженное и продолжительное во времени иммуносупрессирующее воздействие бактерий, приобретающих " плазмиду Rdf-100, подтверждающие выше приведенные наблюдения,

продемонстрированные с этой же плазмидой на других видах бактерий.

Обсуждение

Бактерии рода Klebsiella относят к группе так. называемых условно-патогенных микробов; которые способны вызывать заболевания при снижении естественной резистентности макроорганизма и для которых характерно отсутствие нозологической специфичности. Факторы патогенвостн клебснелл и генетический контроль этих факторов изучены недостаточно. В последние годы внимание

исследователей привлекло изучение факторов патогенности бактерий рода Klebsiella, вызывающих инфекции различной локализации и токсико-септицемии. Наиболее часто клебсиеллы встречаются при внутрибольничных гнойно-воспалительных заболеваниях, особенно тяжело протекающих у лиц с иммунодефицитным состоянием, у недоношенных детей и новорожденных.

Так как K-pneumoniae относятся к группе условно-патогенных бактерий, то в случае выделения этих микробов из организма требуются доказательства их этиологической значимости. Определение у клинических изолятов вирулентных свойств является одним из важных критериев их патогенетической роли. Как известно, взаимодействие возбудителей с эпителием входных ворот инфекции начинается с фазы приближения, затем следует неспецифическая фаза взаимодействия -адсорбция, сменяющаяся специфическим лиганд-рецепгорным взаимодействием, то есть адгезией возбудителя, которая осуществляется только при наличии у инфекционного агента определенных лигандов.

Адгезивная активность К.рпешпошае ассоциируется с наличием у бактерий различного типа гемагглютинирующих и негемагглютинирующих поверхностных структур, морфологически определяемых в виде фимбриальных образований. Недавно обнаружена агрегирующая адгезивная активность ILpneumoniae, связанная с наличием у бактерий плазмиды (A.Darfenille-Michand и др., 1992; S.Favre-Bonte и др., 1995).

В вашей работе у клинических персистирующих штаммов K.pneumoniae выявлена неконыогативная плазмида с мол.массой 55 MD, обозначенная как pAdb-55, сообщающая бактериям адгезивную активность в отношении клеток линии Нер-2. На генетически связанных парах штаммов K.pneumoniae, отличающихся по наличию плазмиды pAdh-55, показано, что утрата бактериями' последней сопровождается снижением, а ее приобретение значительным увеличением количества, пораженных клебсиеллами клеток монослоя. Взаимосвязь между наличием у К.pneumoniae плазмиды pAdh-55 и адгезивной активностью . установлена как в опытах при морфологическом исследовании окрашенных азур-эозином препаратов, так и в экспериментах с мечеными изошпом бактериями. Недавно показано, что клебсиеллы способны повреждать мембраны микроворсинок эпителиоцитов

(В.К.Ковальчук и др., 1391), при этом уровень повреждения зависит от степени колонизации клеток бактериями, а также секреции возбудителем протеолитичестсих зизимов.

В штаммах К.рпешпошае серо типа К2 обнарузкена плазмида 120 5ГО, сообщающая бактериям большую мукоидность (Х.Маз.<пГ и др., 1389). Плазмида несет 2 гена: ппрА1 ппрА2, кодирующие увеличение синтеза капсульного полисахарида К2, выходящего за пределы капсулы (К.ТУасЬаго^иуапкип и др., 1993). Показано наличие ппрА2 гена у всех высоковирулентных мукоидных штаммов К.рпешпошае, но не слабо муковдных. Высказано предположение, что указанный ген относится к семейству транскрипционных регуляторов и сообщает высокую мукоидность штаммам клебсиелл, увеличивая синтез экстр акал сулярного полисахарида. В.М.Соркшшм я др. (1991) показано, что при формировании у клебсиелл капсулы больших размеров может происходить поглощение (экранирование) фимбриалышх структур и, как следствие этого, подавление их способности к гемагглютшшцш эритроцитов. В таком случае бактерии наиболее полно защищены от опосредованного комплементом бактерицидного действия нормальной сыворотки и фагоцитоза, хотя и менее адгезивны.

Особое место занимает и нуждается в расшифровке на молекулярном уровне проблема участия К.рпешпошае в патогенезе аутоиммунных заболеваний. Предполагают, что клебсиеллы, находящиеся в кишечнике, или их метаболиты адсорбируются на слизистой,/ вызывая иммунологический ответ путем простой или индуцируемой молехулярной мимикрии. Так, на примере анкилозирующего спондилита, наблюдающегося в основном (до 96%) у индивидуумов НЬа-В27 типа, обнаружены гомологичные последовательности :сак в структуре Н1д-В27 молекулы человека, так и в структуре гена бактериальной шпрогенредухтазы. Образующиеся к бактериальному компоненту антитела перекрестно реагируют с НЬа-В27 белком, что ведет к увеличению проницаемости слизистой, нарушению барьерной ее функции в отношении различных молекул и токсигенов. Теоретически в случае индуцированной молекулярной мимикрии предполагается, что участвующие во взаимодействии макромолекулы

Очевидна необходимость дальнейших исследований, в частности, значимости обнаруженного нами адгезина, поскольку синтез и интенсивное выделение метаболитов возможно только после адгезии и колонизации слизистой. Выявленная нами иммуносупрессирующая активность К.рпешпошае, связанная с наличием у бактерий оригинальной К-плазмиды с мол .массой 100 МО, несушей маркеры ангабиотикоустойчивости и резистентности к бактерицидному действию белков-дефенсинов, с нашей точки зрения, имеет значение в хронизации инфекционного процесса.

Полученные в результате работы данные позволяют расценивать клинические ппаммы К.рпешпошае, обладающие плазмидами рА<Ш-55 и йЖ-ЮО, как патогенные. Как известно, расшифровка факторов патогениосш лежит в основе разработки диагностических и профилактических препаратов. Проведенные исследования открывают возможность к их дальнейшему изучению в прикладном аспекте.

ВЫВОДЫ

• 1. Среди 350 клинических персйстйрующих штаммов К.рпешпошае выявлено 26 (7,2%) культур, характеризующихся агрегирующей адгезивной и колонизирующей активностью, связанной с наличием неконьютативной плазмвды с молекулярной массой 55 МО, обозначенной как pAdh-55.

2. Мобилизация плазмвды pAdh-55 в бесплазмвдный штамм-реципиент сообщает бактериям выраженную агрегирующую адгезивную активность, определяемую как в опытах при морфологическом исследовании окрашенных азур-эозином препаратов перевиваемых клеточных линий Нер-2 и L, так и в экспериментах с мечеными 3Н-1 глюкозой бактериями. .

3. Впервые у персистнрующих штаммов К.рпешпошае обнаружена коньютативная R-илазиида с мол. массой 100 MD, несущая маркеры антибиотикорезистешности и устойчивости к бактерицидному действию белков-дефенсинов, обозначенная как Rdf-100 (resistance to defensines), наследование которой реципиенпшми бактериями сообщает последним выраженное иммуносупрессирующее действие.

4. Установлено, что персистирующие штаммы К.рпеитошае в 23,8% случаев (85 из 350) обладали плазмидой 100 МП, в 16.1% (58 пз 360) случаев - плазмидой мукоидности с молекулярной .массой 120 МО, которая в 25% случаев сочеталась в одной бактериальной клетке с плазмидой рАёЬ-55 и в 18% случаев - с плазмидой 1Ы1"-100.

5. Показана перспективность исследования профиля плазмвдной ДНК циркулирующих среди больных штаммов К.рпеитошае, их адгезивной агрегирующей активности и способности к размножению в фаголизосомах профессиональных фагоцитов для обнаружения патогенных клонов, обусловливающих развитие персистирующей клебсиеллезной инфекции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Bondarenko V.M., Rudnev I.A., Wu Gang. Original plasmids of clinical Klebsiella pneumoniae strains // VII International Symposium on Microbial Ecology. Brazil,' 1995:- С. 11 (5.2).

2. Бондаренко В.М., У Ган. Генетические особенности клинических штаммов клебсиелл. В сборнике: Идеи И.И.Мечникова и развитие современного естествознания. Харьков. 1995.- с. 39-40.

3. Бондаренко В.М., У Ган, M.Barkus. Адгезивная активность клинических штаммов клебсиелл // Журн. "микробиол.- 1996.- №2.

- с. 104-109.

4. Чайникова И.И., Смолягин А.И., Бондаренко В.М., У Ган и др. Иммунобиологические особенности штамма Salmonella typhimurium, приобретшего ллаэмиду Rdf, контролирующую ашибиотикоустойчивость и антибахтерициднуго активность // Журн. микробная.- 1996.- №3. с .50 - 53.

, 5. Рищук C.B., Смолягин. А.И., У Ган и др. Роль инактивации сальмонеллами антибактериальной составляющей препарата интерферона при экспериментальном инфекционном процессе / / Журн. михробиол.- 1996.- №3. с.98 - 99.

6. Бондаренко В.М., Ценева Г.Я., Березина Л.А., У Ган. Адгезивная активность Klebsiella pneumoniae, связанная с плазмидой 55 МД // Журн. микробиол.- 1995. № 4. ( в печати ).

7. Bondarenko V.M., Kalnin K.V., Wu Gang. Virulence plasmids of Klebsiella strains isolated from blood and liquor of septic patients // VII International Congress for Infections Diseases. Hong Kong, June 10-13, 1996.- N10272.

&