Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эпидемиологическое маркирование бактерий, выделенных при гнойных верхнечелюстных синуситах

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Эпидемиологическое маркирование бактерий, выделенных при гнойных верхнечелюстных синуситах"

/Усы

На правах рукописи

ЛОВ ПАЧЕ ЗАРЕМА НУРИЙДИНОВНА

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ МАРКИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ПРИ ГНОЙНЫХ ВЕРХНЕЧЕЛЮСТНЫХ СИНУСИТАХ

03.00.07 - МИКРОБИОЛОГИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ростов-на-Дону - 1999

Работа выполнена в Кабардино-Балкарском государственном университете

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Габрилович И.М.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Герновская Л.Н.

кандидат медицинских наук Валиева С.З.

Ведущая организация: Ростовский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится 1999 г в /' час0в на заседании

диссертационного совета Д 084.53.01 при Ростовском государственном медицинском университете (344022. г.Ростов-на-Дону, пер. Нахичеван-ский,29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан "С*У" 1999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доцент

Корганов Н.Я.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Воспалительные заболевания околоносовых пазух занимают одно из ведущих мест в структуре заболеваемости J10P-органов. Эти заболевания повсеместно имеют высокие показатели распространенности, доходящие до 30% (А.Г.Шантуров, 1988). По имеющимся данным (Albegger,1982), хроническими синуситами (синунтами) страдают 10% населения. Среди синуситов наблюдается явное доминирование поражений верхнечелюстных пазух. Верхнечелюстные синуситы составляют 56-73% среди воспалительных процессов околоносовых пазух (М.А.Атамурадов и соавт.,1988; А.П.Петров, 1995). Эти заболевания распространены очень широко, нередко носят рецидивирующий характер, большинство из них сопровождается временной потерей трудоспособности.

Согласно современным представлениям об этиологии синуситов, ключевым звеном в их развитии является инфекционное поражение условно-патогенными микроорганизмами. Данные о видовом составе микрофлоры, высеваемой при гнойных синуситах, противоречивы, причем отмечается изменение состава доминирующих возбудителей. Если в 2030 годы отмечалось преобладание стрептококков (С.Л.Утевская и А.Е.Тамарина,1937; Surber,1956), то в последующем произошла смена возбудителей и повсеместно стали высеваться стафилококки (Laskiewicz,1962; Б.А.Дерюгина, 1972).

При изучении видового состава микрофлоры у больных синуситами выявлено явное преобладание грамположительных микроорганизмов (в основном стафилококков), реже высеваются грамотрицательные микробы (эшерихии, клебсиеллы, синегнойная палочка, гемофильные бактерии) (В.И.Гринчук,1968; В.Т.Пальчун и соавт.,1982; Stafford, 1990; О.В.Бухарин и соавт.,1998; Krasemann и соавт.,1999).

Состав микрофлоры и ее вирулентность сказываются на клиническом проявлении патологического процесса. Если при безлихорадочном Tf чении процесса высеваются в основном представители нейссерий, кор шебактерий, эшерихий, клебсиелл, то при более тяжелой клинической р артине заболевания чаще обнаруживаются стрептококки и стафилокок-I к (И.М.Будник и соавт.,1998).

Учитывая это, знание патогенных свойств микроорганизмов, высеваемых при гнойных верхнечелюстных синуситах, может способствовать прогнозу течения заболевания.

При установлении путей распространения микроорганизмов, вызывающих инфекционные заболевания или какие-либо патологические процессы, важную роль играет использование различных свойств бактерий -

так называемых эпидемиологических маркеров (Aber и Mackel,1981; Rubin,1985; Richard и Monteil,1987). Установление таких маркеров - эпидемиологическое маркирование - осуществляется различными методами.

В последние время учение о микробном типировашш усиленно развивается, регулярно проводятся международные конгрессы и конференции, посвященные этой проблеме. Разработаны многие молекулярные методы, основанные на полиморфизме рестрикционных фрагментов геномной ДНК разной длины, амплификации ПЦР, плазмидном и белковом профилях, профиле жирных кислот и т.д. (В.М.Бондаренко и соавт.,1982; Е.Н.Чернявская и З.П.Васюренко,1984; В.Д.Беляков и соавт.,1990; Grimont, 1990; Darini, 1994). Эти методы дополняют традиционные методы типирования и способствуют более глубокому пониманию путей распространения различных микроорганизмов. Методы эпидемиологического маркирования бактерий достаточно разнообразны, но универсальные методы отсутствуют. Важная роль придается стандартизации молекулярного эпидемиологического маркирования (Schwarzkopf, 1996).

В качестве эпидемиологического маркера бактерий может рассматриваться их потенциальная патогенная способность. Такая способность выражается в наличии у бактерий факторов вирулентности (патогенно-сти), которые разграничиваются по механизму действия на факторы адге-зивности, персистенции и токсичности (В.М.Бондаренко и В .Я.Прохоров, 1983; Cornelis, 1983; В.Г.Петровская, 1984; Brubaker,1985; В.Г.Петровская и В.М.Бондаренко, 1994).

Цель п задачи работы. Исходя из сказанного выше, целью настоящей работы было изучение патогенных свойств бактерий, вызывающих гнойный верхнечелюстной синусит, и отбор эпидемиологических маркеров их для прогнозирования хронизации процесса и рецидивов.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1.Изучить этиологическую структуру при острых и хронических гнойных верхнечелюстных синуситах.

2. Исследовать распространение факторов вирулентности у этих бактерий в зависимости от формы заболевания и источника их выделения.

3. Выявить эпидемиологические маркеры таких бактериальш i. -. штаммов для их быстрой идентификации в практических условиях.

Работа проводилась в соответствии с основными направлениям i НИР Кабардино-Балкарского государственного университета. Те ма: "Разработка методов эпидемиологического маркирования возбудителей внутрибольничных инфекций", зарегистрирована во ВНТИЦентре, N гос.регистрации 01.91.0044705.

Научная новизна. Проведен анализ распространения среди грам-положительных и грамотрицательных бактерий, выделенных при острых и хронических гнойных верхне-челюстных синуситах, факторов вирулентности (адгезивность, персистенция, токсичность). Выявлены различия в распространении указанных факторов среди штаммов разных систематических групп и выделенных при различных формах заболевания. Определены патовары выделенных культур. Эпидемиологическими маркерами исследованных бактерий являются множественная устойчивость к антибиотикам, наличие факторов вирулентности, наличие плазмид у бактерий, фаготип бактерий.

Практическая ценность. На основании комплекса свойств, характеризующих факторы вирулентности бактерий и их полирезистентность к антибиотикам, осуществлено патотипирование бактерий, выделенных при гнойных верхнечелюстных синуситах. Полученные результаты находят использование в практической работе учреждений системы санэпид-надзора Кабардино-Балкарской Республики. Материалы диссертации внедрены в учебный процесс в Кабардино-Балкарском государственном университете.

Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в б работах.

Полученные данные доложены:

1. Юбилейной научной конференции, посвященной 40-летию Кабардино-Балкарского госуниверситета, Нальчик, 1997.

2. На научной конференции молодых ученых "Достижения медицинской науки - практическому здравоохранению" (Нальчик, 1998).

3. На научной конференции "Актуальные вопросы биологии и медицины", посвященной 30-летию кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Кабардино-Балкарского госуниверситета (Нальчик, 1999).

Положения, выносимые на защиту.

1. При острых и хронических гнойных верхнечелюстных синуситах выделяются бактерии, в 88,2% случаев обладающие факторами вирулентности.

2. Типирование бактерий на основании комплекса факторов вирулентности позволяет установить патовары, распределение которых различается у разных систематических групп и при разных формах заболевания.

3. Эпидемиологическими маркерами бактерий, высеваемых при гнойных верхнечелюстных синуситах, могут служить факторы вирулентности, полирезистентность к антибиотикам, плазмидный профиль ДНК, а для некоторых бактерий - фаготип.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 154 страницах машинописи, иллюстрирована 58 таблицами и 10 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и указателя литературы, включающего 199 источников, из которых 106 отечественных и 93 зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования.

Материалом для исследования служили 127 штаммов аэробных и факультативно анаэробных бактерий, выделенных из различного патологического материала от 115 больных острыми и хроническими верхнечелюстными синуситами.

В работе использовались обычные питательные среды производства Дагестанского научно-производственного объединения "Питательные среды" (Махачкала): 1,5% и 0,7% питательный агар, а также питательный бульон. Для культивирования стрептококов использовались сахарный бульон, сахарный агар и кровяной агар. Культивирование бактерий проводилось в течение 18-24 часов при температуре 37°С.

Выделение и идентификацию бактерий проводили общепринятыми методами бактериологических исследований.

Идентификацию видов стафилококков проводили в реакции плаз-мокоагуляции. Лецитиназную активность определяли на желточно-солевом агаре, пигмент стафилококков - на молочном агаре. При подозрении риноскопически на наличие в отделяемом верхнечелюстных пазух стрептококковой флоры использовали быстрое выявление антигена стрептококков группы А с помощью тест-системы Strep A Test Concise производства фирмы RTD (США). Метод основан на цветном иммуно-хроматографическом исследовании, проводимом непосредственно на глоточных тампонах. Определение проводилось параллельно с бактериологическим исследованием.

Чувствительность бактерий к антибиотикам определяли методом диффузии в агаре с помощью стандартных дисков. Учет результатов проводился согласно соответствующей Инструкции.

Профиль плазмидной ДНК исследовали методом вертикального электрофореза в 0,7% агарозе (Eckhardt, 1978). При установлении молекулярной массы выявляемых плазм ид использовались реперные плаз-

миды: PR-4 (38 МД), Rmsl48 (95 МД), pBR 322 (2,8 МД), RSF1010 (5,5 МД).

Адгезивную способность бактерий определяли с использованием формалинизированных эритроцитов человека группы 0(I)Rh+ согласно методики В.И.Брилиса и соавт.(198б). Определяли средний процент адгезии, коэффициент участия эритроцитов и индекс адгезивности микроорганизмов (ИАМ), на основании чего бактерии дифференцировались на неадгезивные (ИАМ<1,75), низкоадгезивные (ИАМ=1,76-2,5), средне-адгезивные (ИАМ = 2,51-4,0) и высокоадгезивные (ИАМ > 4,0). Подсчет вели на 50 эритроцитах.

Гемагглютинирующую активность исследовали в реакции гемаг-глютинации на плексигласовых панелях с 3% взвесью свежих эритроцитов человека группы 0(I)Rh4 и барана. D-Маннозорезистентная гемаг-глютннация выявлялась при добавлении к взвеси эритроцитов 1,5% D-маннозы. Способность бактерий адсорбировать краситель конго красный устанавливалась на 1,5% питательном агаре с 0,02% казаминовых кислот н 0,01% конго красного.

Антилизоцимную активность исследовали по методике О.В.Бухарина и соавт.(1984), основанной на принципе "отсроченного антагонизма", в диапазоне концентраций от 1 до 8 мкг/мл. В качестве тест-культуры использовали штамм Micrococcus luteus var. lysodeikticus N2665. Для определения лизоцимной активности бактерий использовался тот же принцип "отсроченного антагонизма", тест-культурой служил тот же штамм микрококка.

Определение гемолитической активности бактерий проводили на питательном агаре с 3-5% отмытых в растворе Хенкса эритроцитов кролика. Тиолзависимые гемолизины выявляли на питательном агаре с 0,002% L-цистеина. Культуры засевались уколом, гемолиз учитывали через 24-48 часов.

Патотипирование бактерий проводили согласно рабочей схемы определения патоваров (И.М.Габрилович, 1996,1997). Учитывали факторы вирулентности, представляющие 3 различные группы по механизму их действия: факторы адгезивности, факторы персистенции и факторы токсичности бактерий. Адгезивность оценивали на основании комплексного изучения показателей этого процесса. Адгезивными считались культуры, обладавшие сочетанием по крайней мере 2 показателей адгезивных свойств, из которых один - ИАМ > 2,5, а второй - гемагглю-тинационная способность либо адсорбция конго красного. Кроме того, к адгезивным относили культуры только по величине ИАМ, если она превышала 4,0. Показателем персистенции бактерий служила антилизо-цимная активность не ниже уровня 3-4 мкг/мл. Токсичность оценивали

по гемолитической способности бактерий - образованию ими а- гемолизинов и тиолзависимых гемолизинов. При обнаружении тиолзависи-мых гемолизинов патовар обозначался знаком "t". Схема учитывает также полирезистентность, или множественную устойчивость бактерий к антибиотикам (г или s).

Фаготипирование стафилококков осуществляли с помощью международного набора стафилококковых бактериофагов согласно инструкции. При фаготипировании клебсиелл и энтеробактеров использовались схемы фаготипирования, предложенные Я.С.Усаевой (1995).

Полученные результаты при необходимости подвергались статистической обработке, для которой использовались общепринятые методики (Н.А.Плохинский,1989; Г.Ф.Лакин,1990). Определяли среднюю арифметическую, ошибку средней арифметической. При обработке по альтернативной изменчивости также вычисляли среднюю ошибку. Достоверность различий показателей определяли по критерию Стыодента.

Результаты и их обсуждение.

Этиология гнойных верхнечелюстных синуситов. При бактериологическом исследовании патологического материала, полученного от 115 больных с гнойным верхнечелюстным синуситом выделены 127 штаммов грамположигельных и грамотрицательных аэробных и факультативно анаэробных бактерий (у 3 больных выделены по 2 штамма, у 9 больных отмечено повторное выделение бактерий).

К грамположительным бактериям отнесены 73 штамма (57,5%). Они были представлены 58 штаммами стафилококков, 14 штаммами стрептококков и 1 штаммом Bacillus cereus.

Из 58 культур стафилококков 28 (22,1%) были коагулазопо-зитивными и отнесены к виду S.aureus. Среди них 18 штаммов (64,3%) продуцировали золотистый пигмент, 10 (35,7%) - белый, у 9 штаммов (32,1%) отмечена фибринолитическая способность, у 26 (92,8%) - леци-тиназная активность. К S.epidermidis принадлежали 30 штаммов стафилококков (23,6%), из которых золотистый пигмент обнаружен у 7 штаммов (23,3%), белый пигмент - у 23 (76,7%). Лецитиназной активностью обладали 17 культур S.epidermidis (56,7%).

Выделенные штаммы стрептококков идентифицированы как Str.pyogenes (7 штаммов) и Str.faecalis (7 штаммов). При диагностике стрептококков использовался быстрый диагностический тест StrepA Test, который проводился у 23 больных параллельно с бактериологическим исследованием. StrepA Test дал положительные результаты в 12 случаях,

из которых в 7 при бактериологическом исследовании были выделены культуры Зй-.руо^епеБ, а в 5 случаях чистые культуры стрептококков изолированы не были.

Грамотрицательные бактерии были представлены 40 штаммами эн-теробактерий и 14 - Рз.аеп^тоБа (рис.1).

Pseudomonas

Рнс.1. Этнология гнойных верхнечелюстных синуситов

Среди энтеробактерий чаще встречались представители протеев -15 культур, среди которых 12 штаммов Pr.mirabilis и 3 штамма Pr.vulgaris. Другие энтеробактерий составили: по б штаммов Escherichia и Enterobacter, по 5 - Citrobacter и Morganella и 3 - Klebsiella.

У больных с острыми и хроническими синуситами отмечены существенные различия в этиологической структуре Из 34 штаммов, выделенных при острых синуситах, 31 (91,2±4,9%) отнесен к грамположительным бактериям и лишь 3 (8,9+4,9%) - к грамотрииательным. В то же время при хронических процессах из 93 штаммов 42 (45,2±5,2%) принадлежали к грамположительным бактериям и 51 (54,8±5,2%) - к грамотрицатель-ным. Отмеченные различия являются существенными (Р<0,05).

Также существенные различия наблюдались между культурами, изолированными при острых и хронических синуситах, в частоте обнаружения стафилококков и энтеробактерий (67,6±9,7% и 37,6+8,2% для стафилококков и 3,0±2,9% и 41,9±7,9% для энтеробактерий).

Сравнение высеваемости различных бактерий из верхнечелюстных пазух и из полости среднего уха не выявило существенных различий в обнаружении грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Факторы вирулентности бактерий, выделенных при гнойных верхнечелюстных синуситах. Проведено исследование выделенных штаммов бактерий на наличие у них факторов вирулентности. Определялись фак-

торы вирулентности, относящиеся по механизму действия к 3 различным группам: факторы адгезивности, персистенции и токсичности.

Учитывая отсутствие единых критериев установления адгезивной способности бактерий, нами проводилось комплексное исследование свойств, определяющих эту важнейшую характеристику вирулентности бактерий.

У исследованных штаммов определяли адгезивность на эритроцитах человека группы 0(I)Rh+, наличие гемагглютинирующей способности в отношении эритроцитов человека и барана, а также способности бактерий адсорбировать краситель конго красный.

При рассмотрении результатов исследования адгезивности бактерий в отношении эритроцитов человека к адгезивноактивным культурам мы относили штаммы, для которых величины ИАМ составляли > 2,5, т.е. штаммы, которые можно рассматривать как среднеадгезивные. Такими штаммами оказались 80 исследованных культур, или 63+4,3%. У представителей разных систематических групп частота обнаружения адгезив-ноактивных штаммов колебалась в пределах от 40,0% до 100,0%.

Наиболее часто адгезивноактивные штаммы встречались среди протеев, псевдомонад и эшерихий - 93,3+6,4%, 92,8±6,9%, 83,3±15,2% соответственно. Реже всего такие штаммы были представлены у морга-нелл и стафилококков - 40±21,9% и 50±6,5% соответственно. Адгезивно-активные штаммы встречались у стафилококков достоверно реже, чем у эшерихий, псевдомонад и протеев (Р<0,05).

Высокоадгезивные штаммы, имеющие значения ИАМ > 4,0, среди исследованных культур составили 16,5%. Всего выявлен 21 такой штамм. Высокоадгезивные штаммы наиболее часто встречались среди культур Escherichia, Pr.mirabilis, Pseudomonas - на их долю приходилось соответственно 50, 41,7 и 28,6% среди всех исследованных штаммов, или 60, 45,4 и 30,8% среди адгезивноактивных культур. Обращает на себя внимание тот факт, что среди штаммов S.epidermidis высокоадгезивные штаммы составляли значительную часть культур - около 1/3 адгезивно-активных штаммов, превосходя в этом отношении штаммы S.aureus.

В то же время среди изученных культур выявлено лишь 8 штаммов, не обладавших адгезивной способностью в отношении эритроцитов человека (ИАМ < 1,75), что составляет 6,5%. Такие штаммы обнаружены среди культур S.aureus (4 штамма), S.epidermidis (3 штамма) и Pseudomonas (1 штамм).

Средние значения величины ИАМ у изученных культур составляли 2,94 ± 0,06 Эти значения соответствовали среднеадгезивным штаммам. Колебания средних значений показателя ИАМ у культур, представляющих разные систематические группы, составляли 2,31 - 3,46.

Наиболее высокие значения НАМ отмечены у протеев, псевдомонад и энтеробактеров, причем эти величины у протеев и энтеробактеров достоверно превышали аналогичные значения у стафилококков (Р<0,05). У штаммов Str.pyogenes и Б^.ГаесаПз наблюдались достоверные различия в величине ИАМ - культуры Зй.ГаесаНв имели более высокие значения этого показателя (Р<0,05).

Гемагглютинирующая способность у изученных культур была выражена слабее. Способностью агглютинировать эритроциты человека и барана обладали но 50 штаммов (39,4±4,3%). Результаты агглютинации бактериями эритроцитов человека и барана совпадали у 19 штаммов (14,9% исследованных культур), причем такие штаммы встречались среди различных бактерий. Выявленные у изученных бактерий гемагглюти-нины относились в большинстве случаев к маннозорезистентным - в отношении эритроцитов человека маннозорезистентные гемагглютинины обнаружены у 28 штаммов (56% гемагглютинирующих штаммов), а в отношении эритроцитов барана - у 31 штамма (62%). Маннозорезистентные гемагглютинины встречались у разных представителей изученных бактерий.

Способностью адсорбировать краситель конго красный обладали 58 штаммов (45,7 ± 4,4%). Это свойство было лучше всего выражено у стафилококков (75,8%) и энтеробактеров (66,7%), хуже всего - у морганелл, цнтробактеров, протеев.

При окончательном установлении адгезивной способности у изученных бактерий мы исходили из следующих критериев: адгезивными считались культуры, обладавшие сочетанием по крайней мере 2 показателей адгезивных свойств, из которых один - ИАМ > 2,5, а второй - гемагглютинирующая способность либо адсорбция конго красного. Кроме того, к адгезивным относили все штаммы, имевшие величины ИАМ 4,0 и выше. Исходя из указанных критериев, адгезивными признаны 70 штаммов, или 55,1% (таблица 1).

Адгезивные свойства бактерий, выделенных при острых и хронических гнойных верхнечелюстных синуситах, несколько различались между собой. Штаммы, выделенные при острых синуситах, характеризовались близкими значениями частоты обнаружения адгезивноактивных I ггаммов - 53,3-66,7%. У культур, изолированных при хронических си) уситах, наблюдались более значительные колебания показателя адге-• ивности - от 38,5% до 93,3%. Эти колебания были обусловлены в основном грамотрицательными бактериями.

Таблица 1

Факторы вирулентности бактерий, выделенных при гнойных верхнечелюстных синуситах

Бактерии Число штаммов Число / % штаммов, обладающих

адгезив-ностью антшшизо-цимной активностью гемолитическими свойствами

Staphylococcus 58 28/48,3 38/65,5 37/63,8

Streptococcus 14 8/17,1 2/14,3 7/50,0

Вас. cereus 1 0/0 1 1

Enterobacteriac eae 40 23/57,5 32/80,0 21/52,5

Pseudomonas 14 11/78,6 9/64,3 8/57,1

Всего: 127 70/55,1 82/64,6 74/58,2

Штаммы, выделенные при хронических гнойных верхнечелюстных синуситах, достоверно чаще агглютинировали эритроциты барана по сравнению со штаммами, изолированными при острых процессах (44,1±5,1% против 26,5+7,5%, Р<0,05). В то же время у культур, изолированных при острых гнойных верхнечелюстных синуситах, агглютинация эритроцитов человека отмечалась недостоверно чаще (52,9+8,5% против 34,4±4,9%, Р>0,05), чем у культур, выделенных при хронических гнойных верхнечелюстных синуситах.

Маннозорезистентные гемагглютинины в отношении эритроцитов человека резко преобладали у штаммов, выделенных при острых гнойных верхнечелюстных синуситах (72,2% гемагглютинирующих штаммов), тогда как у культур, изолированных при хронических процессах, такие штаммы составили 46,9%. Аналогичная картина отмечена и в отношении агглютинации эритроцитов барана - маннозорезистентные гемагглютинины выявлялись у культур, выделенных при острых и хронических гнойных верхнечелюстных синуситах, соответственно в 77,8% и 58,5% случаев.

Средние значения ИАМ у различных бактерий, выделенных при острых гнойных верхнечелюстных синуситах, были близкими и составляли 2,44-3,43.

В то же время штаммы, выделенные при хронических гнойных верхнечелюстных синуситах, характеризовались несколько более высокими значениями индекса адгезивности микроорганизмов как в целом

для всей совокупности бактерий, так и для отдельных представителей разных систематических групп.

Доля адгезивных штаммов, установленных по комплексу изученных характеристик, в обеих рассмотренных группах была близкой -53,8% и 58,8%.

Среди штаммов стафилококков, выделенных при острых процессах, адгезивными свойствами обладали в целом несколько больше штаммов, чем среди культур, выделенных при хронических процессах - 53,3-66,7% против 38,5-50% (рис.2).

Рнс.2. Распространение факторов вирулентности бактерий (в %%), выделенных при острых и хронических псрхпечслюстных синуситах

Представляло интерес сравнение характеристик бактерий, изолированных у больных с гнойными верхнечелюстными синуситами из разных полостей - из верхнечелюстных пазух и из полости среднего уха. Сравнение адгезивных свойств этих двух групп штаммов показало их близость.

Следует отметить, что у культур S.aureus, выделенных из верхнечелюстных пазух, адгезивность в отношении эритроцитов человека была выражена в большей степени, чем у штаммов, выделенных из полости среднего уха (у 63,1±10,0% штаммов против 20,0±17,8%, Р<0,05).

В целом распределение штаммов, обладающих адгезивными свойствами среди культур, выделенных из верхнечелюстных пазух и их полости среднего уха, было близким.

Полученные результаты показывают, что 55,1% штаммов, выделенных при гнойных верхнечелюстных синуситах, обладают выраженными адгезивными свойствами. Частота обнаружения таких свойств у бактерий

в целом не связана с их систематическим положением и источником их выделения.

Как показатель персистенции бактерий нами использована антили-зоцимная активность. В результате проведенных исследований установлено, что такой способностью обладают 82 штамма, или 64,6±4,2%. Среди представителей разных родов частота обнаружения антилизоцимак-тивных штаммов колебалась в широких пределах - от 14,3% до 100%. (таблица 1).

Антилизоцимная способность выявлена у всех исследованных штаммов Pr.mirabilis и Morganella. Это свойство было слабо выражено у культур стрептококков - способностью нейтрализовать лизоцим обладали лишь по 1 из 7 исследованных штаммов Str. pyogenes и Str.faecalis. У стафилококков в целом антилизоцимная активность обнаружена у 65,5% культур. Однако, отмечены существенные различия в распространениии этого свойства между культурами S.aureus и S.epidermidis. У штаммов S.aureus антилизоцимная активность встречалась достоверно чаще, чем у S.epidermidis - 78,6+7,7% против 53,3±9,1% (Р<0,05).

Средние значения уровня антилизоцимной активности у исследованных штаммов составили 2,75±0,26 мкг/мл, а у 82 антшшзоцимактив-ных штаммов - 4,26±0,28 мкг/мл. Наиболее высокие значения этого показателя наблюдались у морганелл, протеев, энтеробактеров - 6,2, 4,4, 4,0 мкг/мл соответственно. Наиболее низким уровнем антилизоцимной активности характеризовались штаммы стрептококков, эшерихий и цитро-бактеров - 0,57, 1,83 и 2,2 мкг/мл соответственно. При анализе среднего уровня антилизоцимной активности антилизоцимактивных штаммов существенных различий между представителями разных систематических групп бактерий не установлено.

У культур S aureus уровень антилизоцимной активности достоверно превышал таковой у штаммов S.epidermidis (3,32+0,51 мкг/мл против 1,83±0,47 мкг/мл, Р <0,05). Однако, при рассмотрении антилизоцимактивных штаммов этих бактерий различий между ними практически не отмечалось.

У большинства исследованных штаммов (75,6%) уровень антилизоцимной активности был средним и составлял 3-6 мкг/мл. Подобные соотношения отмечены почти у всех представителей исследованных бактерий. Лишь у эшерихий преобладали штаммы с низким уровнем антилизоцимной активности (1-2 мкг/мл), а у штаммов S.epidermidis такие культуры составили 50%.

Антилизоцимная активность отмечалась у штаммов, выделеных при острых и хронических процессах с близкой частотой - 64,7% и 64,5% (рис.2).

Антшшзоцимная способность у культур S.epidermidis, выделенных при острых гнойных верхнечелюстных синуситах, отмечалась достоверно чаще, чем у штаммов этих бактерий, выделенных при хронических процессах (75,0+15,3% против 45,4±10,6%, Р <0,05). Распространение лизоцимной активности у бактерий рассмотренных двух групп было близким.

При рассмотрении уровня антшшзоцимной активности у штаммов, выделенных при острых и хронических гнойных верхнечелюстных синуситах, отмечено, что большинство культур имели средний либо высокий уровень этой активности. Лишь у штаммов S.epidermidis, выделенных при острых процессах, культуры с низким уровнем антшшзоцимной активности составляли половину антилизоцимактивных штаммов.

Между культурами бактерий, выделенных из верхнечелюстных пазух и из полости среднего уха, по распространению антилизоцимактивных штаммов существенных различий не установлено. Средний уровень антшшзоцимной активности у бактерий, выделенных из верхнечелюстных пазух и из полости среднего уха, существенно не различался.

Некоторым исключением явились культуры S.aureus. Выделенные из полости среднего уха штаммы этого вида обладали достоверно более высоким уровнем антшшзоцимной активности, чем аналогичные штаммы, изолированные из верхнечелюстных пазух (5,6±1,34 мкг/мл против 2,83±0,49 мкг/мл, Р <0,05).

Рассмотренные штаммы, выделенные из разных полостей больных с гнойными верхнечелюстными синуситами, не различались по распределению культур с разным уровнем антилизоцимной активности.

Проведенные исследования показали, что 64,6% культур, выделенных от больных с гнойными верхнечелюстными синуситами, обладают антилизоцимной активностью.

В качестве факторов токсичности у выделенных бактерий проведено определение двух типов гемолизинов - а-гемолизинов и тиолзависи-мых гемолизинов. Гемолитические свойства обнаружены у 74 штаммов из 127 исследованных (58,2±4,4%). Среди выявленных гемолизинов отмечено резкое преобладание а- гемолизинов. Такие гемолизины обнаружены у 71 штамма (55,9±4,4%). Тиолзависимые гемолизины продуцировали лишь 3 штамма (2,4±1,3%). Один из этих штаммов принадлежал к S.aureus, второй - к Str.pyogenes, третий - к Enterobacter.

Существенных различий в частоте обнаружения гемолитических свойств между бактериями разных родов не выявлено. У стафилококков такими свойствами обладали 63,8±6,3% штаммов, у стрептококков -50,0+13,3%, у энтеробактерий - 52,5±7,9%, у псевдомонад - '57,1±13,2% (таблица 1).

У представителей разных видов стафилококков (Б.аигеиз и Б.ер1с1епшсИз) частота обнаружения гемолитической активности была близкой - 67,8 и 60,0% соответственно. У всех культур Str.pyogenes выявлены а-гемолизины, тогда как ни у одного штамма Б^.ГаесаПй такие свойства не были установлены.

У штаммов, выделенных при острых гнойных верхнечелюстных синуситах, гемолитические свойства были выражены несколько лучше, чем у культур, изолированных при хронических формах заболевания (рис.2).

У штаммов стафилококков, выделенных при острых процссаах, частота обнаружения гемолизинов была выше, чем у культур, изолированных при хронических процессах - 73,9+9,1% против 57,1+8,3, однако эти различия были недостоверными (Р>0,05). Аналогичная картина наблюдалась и у стрептококков.

Гемолитические свойства бактерий, выделенных из разных полостей, также не различались существенно между собой. Ни один из штаммов, выделенных из полости среднего уха, не обладал способностью продуцировать тиолзависимые гемолизины.

Эпидемиологические маркеры возбудителей при гнойных верхнечелюстных синуситов. В качестве возможных эпидемиологических маркеров исследованных бактерий рассматривались чувствительность к антибиотикам, факторы вирулентности, плазмидный профиль ДНК. Кроме того, проведено фаготипирование выделенных культур стафилококков, клебсиелл и энтеробактеров.

Все 127 выделенных штаммов исследованы на чувствительность к антибиотикам. Определяли чувствительность бактерий к 18 антибиотикам, представляющим 10 различных групп по химической структуре: 1 -беталактамные антибиотики группы пенициллина, 2 - беталактамные антибиотики группы цефалоспорина, 3 - антибиотики группы тетрациклина, 4 - аминогликозиды, 5 - макролиды, 6 - рифамицины, 7 - гликопепти-ды (группа ристомицина), 8 - нитробензолы (группа левомицетина), 9 -полипептиды (группа полимиксина) и 10 - линкомицин.

Исследование выделенных штаммов показало, что все они проявляют различную степень чувствительности к изученным препаратам. Наибольшая резистентность у изученных культур отмечена у линкоми-цину (77,2%) и к беталактамным препаратам группы пенициллина (69,376,4%). Наиболее низкая устойчивость наблюдалась в отношении ами-ногликозидов. Так, к канамицину были резистентными 32,3% штаммов, к неомицину - 30,7%, стрептомицину - 27,6%, а к гентамицину - 16,5%. К остальным использованным препаратам резистентные штаммы составля-

ли от 37% до 65,4%. Подобные соотношения отмечены и по отдельным систематическим группам бактерий.

Стафилококки проявляли наибольшую устойчивость к полимикси-пу, пенициллину, ампициллину, карбенициллину. У этих бактерий слабо была выражена устойчиворсть к аминогликозидам (13,8-29,3%) и рифам-пицину (12,1%). Штаммы Б.аигеиз характеризовались более низкой устойчивостью к линкомицину, гентамицину, оксациллину по сравнению со штаммами 8.ер5с1егш1с115.

У стрептококков устойчивость к антибиотикам выражена слабее. Лишь к полимиксину резистентными оказались более половины исследованных штаммов (64,3%), а к препаратам группы пенициллина - 50% штаммов.

Грамотрицательные бактерии были более устойчивыми к антибиотикам, чем грамположительные - устойчивые к антибиотикам штаммы составляли от 22,2% (к гентамицину) до 94,9% (к линкомицину). Наиболее выраженной устойчивостью к антибиотикам характеризовались штаммы протеев и энтеробактеров.

При сравнении чувствительности к антибиотикам культур, выделенных при острых и хронических гнойных верхнечелюстных синуситах, отмечены некоторые различия. Так, штаммы, выделенные при хронических процессах, характеризовались более высокой резистентностью к некоторым антибиотикам. Так, к цефалексину устойчивыми были 6б,7±4,9% исследованных штаммов, тогда как среди культур, выделенных при острых процессах - 35,3±8,2% (Р<0,05). Аналогичные соотношения отмечены и в отношении рифампицина (49,5±5,2% против 17,6±6,8%) и ристомицина (57,9±5,1% против 26,5±7,9%). В обоих случаях различия были также достоверными (Р<0,05).

Чувствительность к антибиотикам культур, выделенных из верхнечелюстных пазух и из полости среднего уха практически, не отличалась.

Анализ антибиотикограмм индивидуальных штаммов изученных бактерий показал чрезвычайно широкое разнообразие вариантов чувствительности к изученным антибиотикам, что не позволяет использовать эту характеристику в качестве эпидемиологического маркера. Однако, на основании результатов определения чувствительности бактерий к антибиотикам оказалось возможным установить множественную устойчивость их к антибиотикам - полирезистентность. К полирезистентным штаммам мы относили культуры, устойчивые не менее чем к 6 из 10 групп использованных антибиотиков. Результаты такого анализа представлены таблице 2.

Таблица 2

Полирезистентные штаммы исследованных бактерий

Бактерии Число штаммов Число полирезистентных штаммов % полирезистентных штаммов

Staphylococcus 58 12 20,7+5,3

Streptococcus 14 0 0

Bac.cereus 1 1 -

Enterobacteria- 40 28 70,0±7,2

ceae

Pseudomonas 14 11 78,6±10,9

Всего: 127 52 40,9±4,4

Исходя из принятых критериев, полирезистентностью обладали 52 штамма, или 40,9±4,4%. Среди грамотрицательных бактерий полирезистентные штаммы составили 68,4±6,3%, тогда как среди грамположи-тельных - 17,814,5%, что достоверно ниже (Р<0,05). У представителей отдельных систематических групп процент множественно устойчивых штаммов колебался в широких пределах - от 0 до 100,0%. Полирезистентными оказались все исследованные штаммы клебсиелл и Pr.vulgaris, подавляющее большинство штаммов энтеробактеров, псевдомонад, Pr.mirabilis.

Полирезистентные штаммы не обнаруживались среди культур стрептококков, а у стафилококков такие штаммы составили лишь 20,7%. Между культурами S.aureus и S.epidermidis не отмечено существенных различий в распространении таких штаммов.

Среди культур, выделенных при острых и хронических синуситах, установлены существенные различия в частоте обнаружения полирезистентных штаммов. Среди культур, выделенных при острых процессах, было лишь 6 полирезистентных штаммов (17,6±6,б%), среди которых 4 штамма стафилококков. При хронических острых гнойных верхнечелюстных синуситах полирезистентные штаммы обнаруживались достоверно чаще (49,5+5,2%, Р<0,05). В то же время сравнение культур, выделенных из разных полостей, не выявило различий в распространении полирезистентных культур

Таким образом, исследование чувствительности бактерий к антибиотикам показало возможность использования полирезистентности бактерий в качестве эпидемиологического маркера.

На основании критериев, приведенных выше, осуществлено пато-типирование выделенных бактерий, результаты которого представлены в таблице 3.

Таблица 3

Патовары исследованных штаммов

| Патовар S.aureus (28) S.epidermidis (30) Str.pyogenes (7) Str.faecalis(7) Вас. cereus (1) Escherichia (6) Klebsiella (3) Enterobacter (6) Citrobacter (5) Morganella (5) Pr.mirabilis (12) Pr.vulgaris(3) Pseudomonas (14) Общее число / процент штаммов (127)

I г 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 8 1 4 14/11,0

Is 4 3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8/6,3

1st 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1/0,8

2г 0 0 0 0 0 0 0 2 2 0 0 1 1 6/4,7

2s 2 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 6/4,7

Зг 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 4/3,2

3s 8 2 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 13/10,2

4г 1 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 7/5,5

4s 4 4 2 0 0 3 0 0 0 0 1 0 0 14/11,0

4rt 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1/0,8

5r 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 3 6/4,7

5s 0 3 0 3 0 0 0 0 1 0 1 0 0 8/6,3

6r 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 5/3,9

6s 2 2 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 6/4,7

7r 0 3 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 4/3,2

7s 1 4 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 8/6,3

7st 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1/0,8

8r 0 2 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 5/3,9

8s 2 3 0 3 0 0 0 0 2 0 0 0 0 10/7,9

Исследованные культуры отнесены к 19 из 24 возможных патова-ров. К отдельным патоварам принадлежали от 1 до 14 штаммов. Среди выявленных патоваров три характеризовались способностью бактерий продуцировать тиолактивируемые гемолизины (Ist, 4rt, 7st).

Наиболее часто выявлялись культуры патоваров lr, ls, Ist - 23 штамма (18,1%) Эти культуры продуцировали факторы вирулентности всех 3 групп, большинство этих штаммов были полирезистентными. Культуры патоваров 2, 3 и 4, характеризовавшиеся наличием двух факторов вирулентности, были представлены 51 штаммом (40,1%). Среди этих

культур преобладали штаммы, не обладавшие полирезистентностыо. (34 штамма).

Существенную часть исследованных культур составили штаммы, обладавшие только одним фактором вирулентности и принадлежавшие к патоварам 5, 6 и 7 - таких штаммов было 38 (29,9%). Культуры, относящиеся к патоварам 8г и Бб, у которых факторы вирулентности не выявлялись, составили 11,8% среди изученных штаммов.

Анализ распределения патоваров у культур, выделенных при острых и хронических процессах, показал, что при острых синуситах отмечается преобладание патоваров 4б (20,6%), Зэ (17,6%) и 911,8%), тогда как у культур, изолированных при хронических процессах распределение патоваров было более равномерным (рис.3).

Рис.З. Распределение патоваров у штаммов, выделенных при острых (а) и хронических (б) верхнечелюстных синуситах.

При острых гнойных верхнечелюстных синуситах выявлено 16 па-товаров, включавших от 1 до 7 штаммов; при хронических - 17 (от 1 до 13 штаммов). При хронических процессах отмечено достоверно более частое обнаружение культур патовара 1г (14,0±3,6%), чем при острых процессах (2,9+2,8%, Р<0,05).

Между штаммами, выделенными из разных полостей, существенных различий в распределении патоваров не обнаружено.

Среди представителей разных родов и видов выявлены определенные колебания патоваров. У стафилококков выявлены штаммы 15 различных патоваров, среди которых преобладали патовары 3s, 4s и Is (8, 8 и 7 штаммов соответственно из 58 исследованных), причем у культур S.aureus доминировали культуры патовара 3s, характеризовавшиеся антилизоцимной и гемолитической активностями.

Исследованные штаммы стрептококков принадлежали к 8 патова-рам, причем у культур Str.faecalis чаще отмечались штаммы патоваров 5s (обладали адгезивной способностью) и 8s (не продуцировали исследованные факторы вирулентности)- по 3 штамма из 7 изученных.

У энтеробактерий отмечены представители 14 патоваров. У культур Pr.mirabilis из 12 штаммов 8 принадлежали к патовару 1 г, характеризовавшемуся наличием всех изученных факторов вирулентности. У эшерихий из 6 изученных штаммов 3 принадлежали к патовару 4s, который характеризуется наличием адгезивной и гемолитической способности. У остальных энтеробактерий преобладания каких-либо патоваров не наблюдалось. Среди культур Ps.aeruginosa чаще встречались штаммы патоваров 1 г и 5г (соответственно 4 и 3 штамма), обладавшие полирезистентностью.

Таким образом, при анализе результатов патотипирования исследованных бактерий установлено, что хотя бы одним фактором вирулентности обладало подавляющее большинство культур - 112, или 88,2%. Штаммы, не продуцирующие факторы вирулентности, составили 11,8% (15 штаммов), причем 10 из этих штаммов не обладали полирезистентностью.

При электрофоретическом исследовании у 44 штаммов обнаружены плазмиды, что составляет 34,6±4,2%. Частота обнаружения плазмид у грамотрицателькых бактерий достоверно превышала этот показатель у грамположительных (51,8+6,8% против 21,9±4,6%, Р<0,05).

У представителей разных систематических групп частота выявления плазмид варьировала в пределах от 14,3% до 71,4%. Чаще всего плазмиды обнаруживались у культур Ps.aeruginosa и Str.faecalis - у 71,4% штаммов, реже всего - у Str.pyogenes, S.aureus, S.epidermidis (14,3-20,0%).

Различий между стафилококками разных видов в частоте обнаружения плазмид не было, тогда как у стрептококков культуры Str.faecalis содержали плазмиды достоверно чаще, чем штаммы Str.pyogenes (71,4±17,1% против 14,3±13,2%, Р<0,05).

У представителей энтеробактерий плазмиды выявлялись с близкой частотой - у 33.3 - 66,7% штаммов.

Из 44 плазм идосодержащих штаммов 42 содержали по 1 плазм иде и 2 - по 2 плазмиды. У 23 плазмидосодержащих штаммов выявлены плазмиды молекулярной массы 50-60 МД, что составляет 52,3% этих штаммов.

Штаммы, изолированные при острых и хронических процессах, мало отличались по илазмидному профилю ДНК. Ни один из 13 штаммов S.aureus, выделенных при хронических синуситах, не содержал плазмид, тогда как из 15 выделенных при острых процессах культур этого вида плазмиды выявлены у 4 (26,7%). Изолированные при хронических синуситах штаммы грамотрицательных бактерий содержали плазмиды достоверно чаще, чем культуры грамположительных бактерий (52,9+5,2% против 19,0±4,1%, Р<0,05). Также не отмечено существенных различий в распространении плазмид у культур, выделенных из разных полостей у больных гнойными верхнечелюстными синуситами.

Однако, грамотрицательные бактерии, выделенные из верхнечелюстных пазух и из полости среднего уха, содержали плазмиды достоверно чаще, чем грамположительные бактерии, выделенные из этих полостей, - 52,5±7,9% и 24,6±5,7% для культур, выделенных из верхнечелюстных пазух, и 50,0±9,1% и 12,5±6,0% для культур, высеянных из полости среднего уха (Р<0,05). Обращает на себя внимание тот факт, что все 5 штаммов Ps.aeruginosa, выделенные из полости среднего уха, содержали плазмиды молекулярной массы 40 и 60 МД.

Проведено фаготипирование бактерий, для которых имеются соответствующие схемы фаготипирования: стафилококки, клебсиеллы и энтеробактеры.

С помощью международного набора стафилококковых фагов установлено, что фагочувствительными являются 29 штаммов (50,0%) стафилококков. Отмечено, что штаммы S.aureus типируются фагами достоверно чаще, чем штаммы S.epidermidis (64,3±9,0% против 36,7±8,8%, Р < 0,05).

Фагочувствительные штаммы стафилококков принадлежали к разным фагогруппам. Чаще других встречались штаммы фагогруппы II -44,8% типируемых штаммов. Существенных различий в фаготипируе-мости стафилококков, выделенных при разных формах заболевания и из различных полостей, не отмечено.

Фаготигшрование клебсиелл проводилось с помощью типовых фагов Klebsiella: К113, 318, 3/85, Kcpl, Кф8, Кф25 и Кф44. Из 3 исследованных штаммов этих бактерий фагами типировался лишь 1 штамм.

Для типирования энтеробактеров использовались 5 типовых фагов этих бактерий: С14, 27, В, I, R. Этими фагами типировались 5 из 6 испытанных штаммов энтеробактеров. Среди типируемых культур энтеробактеров выявлены 3 фаготипа этих бактерий. К фаготипу 2 отнесены 3 штамма, к фаготипам 12 и 21 - по 1 штамму.

ВЫВОДЫ

1. Из патологического материала от 115 больных гнойными верхнечелюстными синуситами выделены 127 штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий. При острых процессах преобладали грам-положительные бактерии, при хронических - грамогрицательные. Различий в составе микрофлоры, выделенной из верхнечелюстных пазух и из полости среднего уха, не отмечено.

2. Факторы вирулентности продуцировали 88,2% выделенных штаммов бактерий. Адгезивными свойствами характеризовались 55,1% изученных культур, антилизоцимной активностью - 64,6%, гемолитической способоностью - 58,2%. Отмечены определенные различия в распределении факторов вирулентности у различных представителей исследованных бактерий. Грамотрицателыше бактерии чаще продуцировали факторы вирулентности по сравнению грамположительными.

3. Полирезистентностью к антибиотикам обладали 52 штамма, или 40,9+4,4%. У грамотрицательных бактерий полирезистентные штаммы встречались достоверно чаще (68,4+6,3%), чем у грамположительных (17,8±4,5%). При хронических процессах полирезистентные штаммы выделялись чаще, чем при острых процессах (49,5±5,2% против 17,6±6,5%). У представителей отдельных систематических групп процент полирезистентных штаммов колебался в широких пределах.

4. На основании совокупности факторов вирулентности у изученных бактерий осуществлено их патотипирование. Отмечены колебания в распределении патоваров у различных бактерий.

5. Определение плазмидного профиля ДНК выделенных штаммов обнаружило плазмиды у 44 штаммов (34,6±4,2%). Грамотрицателыше бактерии достоверно чаще содержали плазмиды по сравнению с грамположительными.

6. Проведено фаготипированне культур стафилококков, клебсиелл и энтеробактеров. Фагочувствительными оказались 50,0% стафилококков, 5 из б штаммов энтеробактеров и 1 из 3 штаммов клебсиелл.

7. Эпидемиологическими маркерами выделенных при гнойных верхнечелюстных синуситах штаммов могут служить факторы вирулентности, полирезистентность к антибиотикам, наличие плазмид, а для некоторых бактерий - фаготип.

Список опубликованных работ

1. Патогенные свойства микрофлоры, выделенной при хронических гнойных синуситах / Бакова Ф.Т., Солонченко В.В./-// Сб. Вопросы теоретической и клинической медицины. Нальчик, 1997. - С.20-21.

2. К вопросу о лечении хронического гнойного верхнечелюстного синусита. // Сб. Вопросы теоретической и клинической медицины. Нальчик, 1997. - С.77-78.

3. Местное применение гипохлорита натрия в лечении гнойного верхнечелостного синусита // Сб.Достижение медицинской науки - практическому здравоохранению, Нальчик, 1998. - С.46-48.

4. Этиологическая структура гнойных верхнечелюстных синуситов / Бугаева В.В./-// Сб.Актуальные вопросы биологии и медицины, Нальчик, 1999.-С. Ч

5. Чувствительность к антибиотикам микрофлоры, выделенной при гнойных верхнечелюстных синуситах / Хакешева Т.А.1-11 Сб.Актуальные вопросы биологии и медицины, Нальчик, 1999. - С. Ь 3

6. Факторы вирулентности возбудителей гнойного верхнечелюстного синусита // Сб.Актуальные вопросы биологии и медицины, Нальчик, 1999.-С. СЗ-