Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Типирование стафилококков в системе эпидемиологического надзора за гнойно-воспалительными инфекциями в родо-вспомогательных учреждениях

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Типирование стафилококков в системе эпидемиологического надзора за гнойно-воспалительными инфекциями в родо-вспомогательных учреждениях"

егг

МИНСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

УДК 316. 98-616. 002. 3-035. 2. 004. 58]: 618. 2. -081. 215

ШШРОВАНИЕ СТАФИЛОКОККОВ В СИСТЕМЕ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА ЗА ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫМИ ИНФЕКЦИЯМИ В РОДОВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ УЧРЕЖДЕНИЯХ

03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

СУЩЕВИЧ Виктор Викторович

МИНСК 1998

Работа выполнена на кафедре эпидемиологии и микробиологии Белорусского ордена Трудового Красного Знамени государственной института усовершенствования врачей

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук, доцент A.A. Кукулянский

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор H.A. Израитель доктор медицинских наук, профессор В.М. Семенов

Оппонирующая организация:

Гродненский государственный медицинский институт

Защита состоится "/У7 1998 г. вЛ-"Часов

на заседании совета Д. 03.18*05 ^по защите диссертаций при Минском ордена Трудового Красного Знамени государственном медицинском институте по адресу: 220798, г. Минск, проспект Дзержинского, 83

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Минского медицинского института.

Автореферат разослан января 1998 г.

Ученый секретарь

совета по защите диссертаций

кандидат медицинских наук.

доцент

Крылов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации.

Проблема внутрибольничных инфекций, вызываемых различными видами патогенной и условно-патогэннсй микрофлоры, не теряет своей актуальности, так как уровень заболеваемости ими остается высоким (А. П. Красильникоз, 1996; А. А. Кукулянский 1996; М.И. Рим-жа 1996). В родовспомогательных учреждениях чаще всего этиологическим фактором являются микроорганизмы рода Staphylococcus (В. Д. Беляков, Р.Х. Яфаев, 1989; В. И. Покровский 1993; М.И.Римжа 1994). Высокая социальная значимость внутрибольничных инфекций (ВБИ), а также отсутствие надежных методов типирования стафилококков, требует дальнейшего изучения этой проблемы в целом, и, в частности, разработки и применения новых более эффективных методов эпидемиологического маркирования стафилококков.

В последнее десятилетие раскрыты молекулярно-генетические механизмы жизнедеятельности микробных клеток, получены материалы о гетерогенности микробной популяции, обоснована концепция саморегуляции паразитарных систем, вскрывшая сущность внутренних механизмов регуляции эпидемического процесса.

Сейчас на основе этих новых представлений закономерно встает вопрос о совершенствовании методов типирования в системе эпидемиологического надзора за ВБИ.Сравнительная оценка полезности и эффективности типирувщих систем и методов основывается на трех главных критериях: дискриминантность, воспроизводимость, область применения (P. Huter, М. Gaston. 1988; H.J. Struelens, 1992).

В странах СНГ для эпидемиологического типирования стафилококков используются методы фаготипирования и определения антибио-тикограммы. На сегодняшний день эти методы не удовлетворяют требованиям практического здравоохранения: они недостаточно стандартизованы для повседневной эпидемиологической практики, часто дают ошибочные плохо воспроизводимые результаты, что снижает чувствительность титрующих систем (В.Д. Беляков. 1990; Г.К. Дегтева 1990). Вместе с тем в настоящее время существует возможность расширить систему типирования стафилококков за счет более детальной характеристики антибиотикорезистентности на биохимическом уровне.

Одним из главных и наиболее распространенных факторов резистентности микроорганизмов к широко применяемым антибиотикам (бета--лактамам) является синтез ферментов бета-лактамаз. гидролизирую-щих бета-лактамное ядро пенициллинов и цефалоспориков с образова-

- г -

нием лишенных антибактериальной активности дериватов. Вместе с тем существует и другой тип резистентности к бета-лактамным антибиотикам, который не связан с продукцией микроорганизмами бета-лак-тамаз, а обусловлен структурной модификацией белков, связывающих бета-лактамы, изменением проницаемости стенки микробной клетки, образованием слизи и другими причинами неферментного характера (Т. Sawal, 1982; G. Bröks, 1988).

Широкое распространение бета-лактамаз, общность их синтеза и кинетики у грамположительных бактерий, видовые и штаммовые различия продуцирования данных ферментов - все это позволяет использовать синтезируемые микроорганизмами ферменты как эпидемиологически значимый маркер штамма и разработать, адаптированный к практическим целям, метод маркирования стафилококков по механизму резистентности к бета-лактамным антибиотикам и типу бета-лактамаз.

Связь работы с научными программами.

Работа выполнена на кафедре эпидемиологии и микробиологии Белорусского государственного института усовершенствования врачей (БелГИУВ) и являлась частью научных исследований по теме отраслевой научно-технической программы Министерства здравоохранения СССР в области медицины С-23 "Разработать и внедрить в практику здравоохранения эффективные меры борьбы и профилактики внутрибольничных инфекций и сепсиса"(N госрегистрации 01.9.10.043507),запланированной кафедрой эпидемиологии и микробиологии БелГИУВ на 1991-1995 г.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы - усовершенствование системы типирова-ния стафилококков путем определения механизма резистентности к бета-лактамным антибиотикам и типа синтезируемой бета-лактамазы.

Задачи иследования:

1. Дать сравнительную характеристику информативности методов дифференцирования стафилококков, выделенных в различных эпидемиологических условиях родильных домов.

2. Изучить механизм резистентности к бета-лактамным антибиотикам и тип бета-лактамаз у стафилококков с учетом их биотопа.

3. Выявить стабильные эпидемиологические метки внутрибольничных штаммов стафилококков с учетом их видовой принадлежности.

4. Разработать методику дифференциации стафилококков с целью

слежения за циркуляцией эпидемически значимых штаммов и определения вероятного риска внутрибольничной стафилококковой инфекции в акушерском стационаре.

Научная новизна полученных результатов.

Впервые показано, что механизм резистентности к бета-лактамным антибиотикам и тип бета-лактамазы являются сравнительно стабильной меткой позволяющей маркировать все виды стафилококков.

Впервые установлено, что тип бета-лактамаз, синтезируемых стафилококками и механизм выявленной резистентности к бета-лактамным антибиотикам являются прогностическим признаком в отношении вероятности возникновения гнойно-воспалительных заболеваний в акушерском стационаре.

Изучение типа синтезируемых бета-лактамаз у различных групп стафилококков (негоспитальных, госпитальных, эпидемически значимых) позволило впервые разработать эпидемиологическую классификацию бета-лактамаз с учетом степени вероятного риска возникновения внутрибольничной стафилококковой инфекции в акушерском стационаре.

Предложен метод позволяющий одновременно определять механизм резистентности (ферментный или неферментный) к бета-лактам-ным антибиотикам и тип синтезируемых бета-лактамаз, а также определять механизм резистентности у всех видов стафилококков к любому бета-лактамному антибиотику.

Практическая значимость полученных результатов.

Полученные данные позволяют рекомендовать данный метод маркирования стафилококков, в структуре системы эпидемиологического ти-пирования, с целью слежения за циркуляцией стафилококков и своевременного выявления предвестников ухудшения эпидситуации в отношении внутрибольничной стафилококковой инфекции в акушерском стационаре.

Разработанный метод может найти широкое применение в центрах гигиены и эпидемиологии для повышения качества проводимого эпидемиологического надзора за ВБИ. По результатам исследования подготовлены методические рекомендации "Типирование стафилококков по профилю бета-лактамаз в системе эпидемиологического надзора за

внутрибольничной стафилококковой инфекцией", утвержденные Министерством здравоохранения Республики Беларусь 11 июня 1997 года.

Материалы диссертации используются в учебном процессе БелГИУВ на циклах усовершенствования врачей-бактериологов и эпидемиологов и практической работе ряда центров гигиены и эпидемиологии РБ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Методика одновременного определения механизма резистентности стафилококков к бета-лактамным антибиотикам (ферментный или неферментный), наличия бета-лактамазы и типа синтезируемого фермента, что невозможно получить другими методами;

2. Механизм резистентности к бета-лактамным антибиотикам и тип синтезируемых бета-лактамаз являются устойчивой эпидемиологической меткой всех видов циркулирующих в акушерском стационаре стафилококков;

3. Одновременное использование резистенстипирования по анти-биотикограмме и механизму резистентности к бета-лактамным антибиотикам повышает дискриминантность типирования коагулазоположитель-ных и коагулазоотрицательных стафилококков.

Личный вклад соискателя.

Работа выполнена лично автором на базе кафедры эпидемиологии и микробиологии БелГИУВ. Автору принадлежат организация и проведение экспериментальных исследований, статистическая обработка полученных данных, теоретическое обобщение результатов, выводы и написание работы.

Апробация результатов диссертации.

Результаты исследования и основные положения диссертации доложены и обсуждены:

- на заседании Республиканского общества эпидемиологов и микробиологов (сентябрь 1989 г.);

- на научно-практической конференции кафедры эпидемиологии ЦОЛИУВ (г.Москва) 30.01.90 г.);

- на Республиканской научно-практической конференции "Актуальные проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилакти-

ки внутрибольничной инфекции" 1-2.06.95 г.

Опубликованность результатов.

По результатам исследования опубликований 12 научных работ, в т. ч. в рецензируемых журналах 2, в сборниках съездов и научных конференций 10 работ. Разработаны и утверждены МЗ Республики Беларусь методические рекомендации по маркированию стафилококков в системе эпидемиологического надзора за внутрибольничной инфекцией.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 99 страницах машинописи, иллюстрирована 28 таблицами и 4 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, пяти глав собственных исследований. обсуждения полученных результатов, выводов и списка использованной литературы, включающего 59 отечественных и 70 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

Было изучено 508 штаммов стафилококков, среди которых 390 S.aureus (76.8 %) и 118 S. epidermldis (23.5 %). Штаммы были получены из Могилевского ГЦГЭ, Минского ГЦГЭ, Столбцовского райДГЭ, Дорожного ЦГЭ БелЖД.

Все штаммы были разделены на три эпидемиологические группы по месту изоляции штамма, (биотопу).

В I группу были включены 135 штаммов S. aureus и 55 штаммов S. epidermidis, выделенных от рожениц, медицинского персонала и из объектов внешней среды в различных акушерских стационарах в период эпидемического благополучия по ВБИ.

II группа состояла из 129 штаммов S.aureus выделенных в акушерских стационарах в период регистрации в них ВБИ. Эту группу мы назвали - "группа эпидемически значимых штаммов".

В III группу было собрано 126 штаммов S.aureus и 63 штамма S.epidermldis, изолированных вне стационаров в результате случайной выборки - "группа внегоспитальных штаммов".

Забор материала из носоглотки медперсонала, эксудатов и гнойного отделяемого ран у больных, бактериологическое исследование воздушной среды и смывы с предметов окружающей среды, а также иде-

нтификацию микроорганизмов проводили общепринятыми методами. (М. 0. Биргер 1982; А.П.Красильников, 1986).

Фаготипирование проводили международным набором стафилококковых диагностических типовых бактериофагов, изготовленным институтом эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи.Спектр резистентности к наиболее широко используемым в клинике антибиотикам: пенициллину, ампициллину, карбенициллину, оксациллину, стрептомицину, тетрациклину, канамицину, гентамицину, эритромицину, левомицетину, цефазолину и бета-лактамным антибиотикам фирмы "0X0ID" (ФРГ), не применявшихся ранее в наблюдаемых стационарах и поэтому являющихся новыми для микрофлоры данных стационаров (мезлоциллин, апалциллин. пиперациллин. цефсулодин. цефоперазон, цефокситин) определяли стандартным методом диффузии в агар с использованием бумажных дисков. Дифференцирование стафилококков по спектру антибиотикорезистентно-сти проводили по утвержденной методике к антибиотикам: пенициллину (П), оксациллину (Ок), стрептомицину (С), эритромицину (Э), моно-мицину (М). олеандомицину (Ол), тетрациклину (Т).

Наличие бета-лактамаз выявляли микробиологическим методом инактивации антибиотиков в собственной модификации.

Статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми вычислениями удельного веса величины, ее статистической ошибки, достоверность различий определяли по критерию Сть-дента, дискриминантную способность методов оценивали способом соотношения количества разнообразных групп и по индексу Симпсона (D).

1. Характеристика эпидемиологических маркеров в системе надзора за внутрибольничной стафилококковой инфекцией в родовспомогательных учреждениях

В качестве эпидемиологических маркеров стафилококков в практике используется резистентность к антибиотикам, чувствительность к фагам, активность плазмокоагулазы, наличие белка А.

Мы исследовали частоту и спектр этих признаков (маркеров) у 508 штаммов нашей коллекции.

1.1. Спектр антибиотикорезистентности у стафилококков различных эпидемиологических групп В 1-ой группе (госпитальных) штаммов S.aureus отмечена резистентность к 2-6 антибиотикам. Чувствительных ко всем антибиотикам

штаммов в данной группе было 5.93 ± 2.04 %. что достоверно ниже (Р<0.05) удельного веса полирезистентных штаммов. Во 11-ой группе штаммов S. aureus такне преобладали итачмы с резистентностью к 2-6 антибиотикам. Достоверных различий среди количества штаммов, чувствительных ко всем антибиотикам, з сравнении с I группой штаммов нет. d=3.4+3.3 %, Р>0.С5. В III группе штаммов преобладали чувствительные ко всем анту.биотикам культуры - 55.56+4.4 % .

У штаммов 1-й группы S.epidernidis установлена резистентность к 2-5 антибиотикам. Наибольшее число штаммов среди резистенсваров было резистентно одновременно к двум (20.О %) и трем антибиотикам (22.2%). С максимальным спектром резистентности одновременно к пяти антибиотикам было выявлено 4 штамма (8.9 %). Всего резистентных штаммов в данной груше было 81.8+5.3 % .Среди S.epldermldis в III груше также преобладали штаммы с множественной резистентностью одновременно к 2-5 антибиотикам. Наибольшее число штаммов было резистентно одновременно к 2 антибиотикам (36.2 %). Всего резистентных штаммов в данной группе было 47, (74.6+5.5 %).

1.2. Исследование фаголизабельности, наличия белка А и степени активности плазмокоагулазы у S. aureus Частота фаголизабельных штаммов у зсех трех групп S.aureus колебалась от 19.8+3.6 % (III группа) до 24.0+3.8 % (II группа). Достоверных различий по удельному весу среди всех трех групп нет (Р>0.05). В I группе число фаголизабельных культур было 20.0+3.4%.

Количество штаммов, содержащих белок А в I и II группах S.aureus было одинаковым: d=10.09+5.1 %. Р>0.05. Доля штаммов содержу-щих белок А, в III группе (93.7+2.2 %). была достоверно выше.

При изучении свойств плазмокоагулазы было выявлено, что штаммы II группы имели повышенную активность фермента. В 88.4 % случаев стафилококки данной группы свертывали плазму за 30-90 минут,что не было отмечено в других группах исследуемых культур. В I и III группах время свертывания плазмы было 120 и более минут.

1.3. Дифференциация стафилококков по спектру антибиотикорезистентности.

Была установлена высокая степень гетерогенности штаммов в каздой группе. В I груше был выявлен 21 резистенсвар, во II - 27 и в III - 16. В I и II группах доминировали полирезистентные штам-

мы, имеющие резистентность к 2-7 антибиотикам, 76.1 %. Только в I и II группах стафилококков были выявлены штаммы, имеющие резистентность ко всем испытанным антибиотикам. Однако в 1,11 и III группах бактерий среди резистенсваров с общими профилями примерно у каждого третьего варианта не выявлено статистических различий от числа аналогичных штаммов другой группы.Так у культур I и II групп таких культур было 71.4%. I и III - 66.7% и II - III 33.3%. Достоверные различия (Р<0.05) среди числа штаммов с общими спектрами в I и II группах (госпитальные и эпидемически значимые) выявлены только по четырем вариантам, (П, ПТ, ПМ, ПЭОл), что несколько усложняет интерпретацию полученных результатов.

Исследование спектра резистентности у S.epidermidls также выявило высокую степень гетерогенности штаммов по этому признаку. В I группе было выявлено 12 резистенсваров, в III - 16. Но различия между группами были выявлены только по 6 вариантам,(П, ПМ, СМ. ЭОл, ЭОлТ, ПСТ).

Проведенные исследования показали, что применение традиционных методов для эпидемиологического титрования стафилококков не в полной мере соответствует предъявляемым требованиям и имеет ряд существенных недостатков: низкий удельный вес фаголизабельных культур, сложности в анализе полученных результатов дифференцирования по спектру антибиотикорезистентности из-за большого удельного веса штаммов одинаковых резистенсваров. различающихся местом выделения и, следовательно, имеющих разную степень эпидемиологической опасности в отношении возникновения ВБИ. общности других биологических свойств.

В связи с этим остается актуальной проблема поиска новых маркеров и новых методов типирования стафилококков. При проведении дальнейших экспериментов мы исходили из предположения, что одним из таких маркеров может быть механизм резистентности к бета-лакта-мным антибиотикам и тип бета-лактамазы.

2. Разработка методики маркирования стафилококков по механизму зистентности к бета-лактамным антибиотикам и типу бета-лактамаз

Для типирования стафилококков по спектру активности бета-лактамаз использовали два метода качественного определения ферментов гидролизирующих пенициллины.

1. Модифицированный экспресс-метод обнаружения бета-лактамаз.

основан на принципе ацидометрии - определении кислоты, образующейся из пенициллина при глдролизе его молекул бета-лактамазой. Для тестирования культур использовали индикаторные бумажки, содержащие йод-крахмальный комплекс, обесцвечивающийся при действии кислоты. Результаты тестирования з 100 % случаев совпадали с результатами, полученный! другими методами, (Н.И.Гивенталь, Л.Ф.Богданова, 1978; 1.0гз:ау1к, А. 01^аагЗ, 1981). Это позволяет рекомендовать данный метод для применения з клинической практике и использовать его для скрининга стафилококков на первом этапе эпидемиологического типи-рования с целью выбора набора антибиотиков, используемых для определения резистенсграчмы штамма - эпидемиологической метки.

2. Модифицированный нами метод определения вероятного механизма резистентности к бета-лактамным антибиотикам, который в отличие от прототипов (Н.И.Гивенталь. Л.Ф.Богданова), позволяет одновременно определять наличие и тип субстратной специфичности бета--лактамазы, а также отличать резистентность,основанную на ферментном механизме резистентности (Ф) от резистентности связанной с действием других факторов (например, с изменением проницаемости клеточных мембран или модификацией пенициллин-связывающих белков; (неферментнкй механизм резистентности - Н). Синтез ферментов обусловлен наличием у бактерий трансмиссивных генов-транспозонов или плазмид. которые обуславливают тип синтезируемой бета-лактамазы определяющий субстратную специфичность фермента.

Постановка теста состоит из следующих этапов:

1.Посев "газоном" индикаторной культуры Bac.subtl.lis АТСС 6633 на поверхность агаровой среды двух чашек (опытной и контрольной).

2.Посев исследуемой культуры четырьмя перекрещивающимися штрихами на опытную чашку поверх посеянной Вас. зиЬШ1з. В места пересечения штрихов на опытной чашке и на контрольную чашку клали 4 диска с антибиотиками: пенициллином (П). ампициллином (А), карбе-нициллином (К), оксациллином (0). Чашки инкубировали в термостате при 35' С 16 часов.

3.Учет результатов исследования проводили по характеру роста индикаторного штамма и наличию или отсутствию роста по ходу штриха испытуемого штамма. Заглавными буквами названий антибиотиков в выше приведенной последовательности (ПАКО) отмечали те из них, к которым выявлена полная резистентность исследуемого штамма,т.е. рост по ходу зсего штриха до краев диска с антибиотиком. В случае заде-

ржки роста исследуемой культуры любой степени (неполный рост по ходу штриха) она считалась чувствительной к данному антибиотику. Затем, в той же последовательности, регистрировали механизм выявленной резистентности к каждому из применяемых в тесте антибиотиков (Ф - ферментный, при меньшей, чем з контроле зоне задержки роста индикаторной культуры и по форме, отличающейся от круга); Н --неферментный, если зона задержки роста индикаторной культуры по размеру такая же как и в контроле и имеет форму круга).

4. Оценку результатов типирования проводили по кодограмме составленной с соблюдением последовательности заглавных букв используемых в тесте антибиотиков (ПАКО) и выявленного механизма резистентности к ним. По кодограмме, в соответствия с предлагаемой классификацией бета-лактамаз, определяли тип синтезируемого фермента.

Классификация бета-лактамаз и характеристика бактериальной экосистемы стационара с учетом вероятного риска возникновения ВБИ.

Группа Тип бета-лакта-мазы Механизм резистентности к антибиотикам Степень риска возникновения ВБИ

ПАКО

1 0 + + + + Н + + + н н + + н н н + н н н н низкая

I ф + + + ф ф + + Ф н + + Ф н н + Ф н н + ФИНН Ф Ф н + Ф Ф н н

2 II ф Ф ф + ф Ф Ф н высокая

3 III ф ф ф ф очень высокая

Примечание: |+| - чувствительный штамм,

Ф - ферментный механизм резистентности, Н - неферментный механизм резистентности.

3. Механизм резистентности к бета-лактамным антибиотикам 2 стафилококков

В 1-ой группе в структуре резистентных S. aureus преобладали (PCO.05) штаммы с ферментным механизмом резистентности 82.96 %. Со смешанным механизмом резистентности (ферментным и неферментным) было выявлено 8.9% штаммов, следовательно, бета-лактамазы обнаружены у 91.6% госпитальных штаммов.

У S.aureus II-ой группы в 93.81 % случаев в структуре резистентных штаммов, был выявлен ферментный механизм резистентности; 1.77 % имели смешанный механизм резистентности к данным антибиотикам и 4.42 % имели неферментный механизм резистентности.

В III-ей группе S. aureus ферментный механизм резистентности был выявлен только у 4 штаммов, (7.14+3.47 %, Р<0.05). Смешанный механизм резистентности к разным антибиотикам был выявлен у 13 штаммов, (23.21+5.69 %. Р<0.05).

У S. epldermidis 1-ой группы преобладали штаммы с ферментным механизмом резистентности (74.55 %).Со смешанным механизмом резистентности было выявлено только 2 штамма, 3.64 % от числа штаммов данной группы. В III-ей эпидемиологической группе стафилококков в структуре резистентных культур 68.18 % штаммов имели ферментный и 31.82 % смешанный механизм резистентности.

Таким образом, выявлены достоверные отличия по механизму резистентности у госпитальных штаммов в сравнении с внегоспиталь-ными (Р<0.05). Преобладание примерно в 7 раз числа штаммов, синтезирующих бета-лактамазы в I (91.85 %) и II (83.72 %) грушах стафилококков ( в III - 13.49 %), подтверждает тезис о бета-лак-тамазе как маркере госпитальных штаммов.

Был выявлен высокий удельный вес резистентных штаммов к новым бета-лактамным антибиотикам - к пенициллиновой группе - 85.4%, к цефалоспоринам несколько ниже - 41.7 % . Резистентность в большинстве случаев была обусловлена бета-лактамазами - 97.7 %, в оставшейся доле - неферментный механизм резистентности.

У метициллинорезистентных штаммов II-ой группы преобладали стафилококки с ферментным механизмом резистентности к оксациллину. (92.31 %) и только один штам имел неферментный механизм резистентности. Среди S.aureus 1-ой группы доля стафилококков с ферментным механизмом резистентности к оксациллину (47.6+11.2%) и неферментным (52.4+11.2 %) была одинаковой (d=4.8+15.8 %. Р>0. 05).

У всех штаммов, выделенных из гнойного содержимого больных и резистентных к оксациллину, выявлен только ферментный механизм резистентности, который был обусловлен бета-лактамазой Ш-го типа.

4. Сравнительные исследования методов эпидемиологического типирования стафилококков

В сравнительном анализе была выявлена высокая (100%) воспроизводимость и дискриминантность предлагаемого способа: при трехкратном повторении результаты тестов полностью совпадали, причем воспроизводились тип антибиотикорезистентности одних и тех же штаммов и совпадал ее механизм. Воспроизводимость результатов типирования этих же штаммов по способу антибиотикотипирования была несколько ниже. (70.0 %).

При оценке методов типирования, важным показателем служит дискриминантность метода (индекс Симпсона), т.е. способность различать неродственные штаммы. Дискриминантность является качественной характеристикой метода типирования и характеризует чувствительность используемой методики.

Резистенстипирование стафилококков по антибиотикограмме выявило высокую дискриминантность метода. В эпидемиологических группах стафилококков было выделено 26 резистенсваров в 1-й группе. 27 во II-й и 20 в Ш-й. Индекс Симпсона (D) по группам составил:

а) среди S. aureus: Dl=0.732, D2=0.898. D3=0.674, D ср. =0.768;

б) среди S. epldermldls: D1 = 0.855. D3 = 0.891. D cp.= 0.873.

Т.е. индекс разнообразия популяций штаммов был высоким и составил в среднем 0.825.

Дифференцирование стафилококков по механизму резистентности к бета-лактамным антибиотикам не выявило высокого разнообразия популяций штаммов в эпидемиологических группах. (1-8, II - 9. III - 7 подгрупп). Но индекс Симпсона среди S.aureus (D1 = 0.573, D2 = 0.613, D3 = 0.640, D ср. = 0.609 ) и среди S. epldermldls (D1 = 0.710, D3 = 0.541, D ср. = 0.626) характеризует данный метод как имеющий среднюю степень дискриминантности.

Таким образом высокая воспроизводимость и стабильность данного маркера у всех видов стафилококков позволяет использовать его для эпидемиологического маркирования штаммов.

5. Применение комплексной методики резистенстипирования стафилококков в системе эпидемиологического надзора за внутрибольни-чной инфекцией.

Для повышения качества мониторинга за возбудителями ВБИ предложена комплексная характеристика стафилококков по спектру антиби-отикорезистентности, механизму резистентности к бета-лактамным антибиотикам и типу бета-лактамаз. Как показали проведенные исследования сочетанное использование этих показателей повышает дискри-минантность типирущей системы в 1.3-1.5 раза. При комплексном ти-пировании индекс Симпсона составил:

а) среди S. aureus: D1=0.825, D2=0. 936, D3=0.682, Dep. =0.814;

б) среди S.epldermldls: D1=0.886. D3=0.904. D cp. =0.895.

Среднее значение индекса разнообразия популяций S.aureus и

S.epldermldls равно 0.855, т.е. комплексный метод обладает большей дискриминантной способностью в сравнении с резистенстипирова-нием по антибиотикограмме (D ср. = 0.825), методом - обладающим максимальной степенью дискриминантности.

Анализ штаммов, выделенных из гнойного содержимого больных, также выявил увеличение их дискриминантности (неоднородности), индекс (D) по антибиотикотипированию равен 0.929. по комплексному методу - 0.958. Число резистенсваров возросло в 1.49 раза.

Для повышения качества мониторинга за ВБИ предлагаем систему эпидемиологического типирования стафилококков, которая состоит из пяти взаимосвязанных этапов микробиологических исследований, результат каждого из которых служит критерием для последующего этапа исследования.

Этапы типирования стафилококков.

На 1-ом этапе с помощью экспресс-метода определения наличия бета-лактамаз делают скрининг всех исследуемых культур, по результатам которого выбирают антибиотики для определения профиля ан-тибиотикорезистентности стафилококков (II этап).Предлагаемый новый набор антибиотиков для антибиотипирования, по литературным данным является более информативным чем антибиотики используемые сегодня практическим здравоохранением.При подборе антибиотиков был использован принцип "класс-дисков", когда один антибиотик характеризует отношение культуры к группе антибиотиков. В случае отсутствия синтеза бета-лактамаз изучаемым штаммом используют полный набор антибиотиков, с учетом используемой среды - АГВ или Мюллер-Хинтон агара.

При использовании среды АГВ: пенициллин, ампициллин, оксацил-лин, цефалексин, эритромицин, хлорамфеникол, тетрациклин, гентами-цин, рифампицин, линкомицин.

При использовании Мюллер-Хинтон агара: пенициллин, ампициллин, оксациллин, цефалотин, эритромицин, хлорамфеникол, тетрациклин, гентамицин, рифампицин. котримоксазол.

В случае синтеза бета-лактамаз стафилококком, что выявляется на I этапе, исключают диски с пенициллином и ампициллином, а результат записывается - резистентность к пенициллину и ампициллину.

На III этапе определяют механизм резистентности к бета-лактам-ным антибиотикам (ПАКО). По полученной кодограмме механизма резистентности в соответствии с классификацией бета-лактамаз определяют тип синтезируемого фермента (IV этап). После чего составляют общую кодограмму штамма, включающую в себя маркеры, полученные на предыдущих этапах исследования (спектр антибиотикорезистентности, механизм резистентности к ПАКО, тип синтезируемой бета-лактамазы).

На V этапе определяют степень вероятного риска возникновения ВБИ в стационаре, критерием которого служит тип бета-лактамазы как один из значимых факторов вирулентности штамма.

Методика позволяет типировать все виды коагулазоположительных и коагулазоотрицательных стафилококков с целью мониторинга за ВБИ, а также делать вывод о состоянии бактериальной экосистемы стационара в отношении вероятного риска возникновения гнойно-септических заболеваний в родовспомогательных учреждениях.

ВЫВОДЫ.

1. Механизм резистентности к бета-лактамным антибиотикам и и тип бета-лактамаз синтезируемых стафилококками являются устойчивой эпидемиологической меткой штаммов.

2. Доминирующий тип бета-лактамаз, синтезируемых стафилококками, является прогностическим признаком в отношении вероятного риска возникновения гнойно-воспалительных заболеваний в акушерском стационаре.

3. Разработанная эпидемиологическая классификация бета-лактамаз позволяет определять степень вероятного риска возникновения внутрибольничной стафилококковой инфекции в акушерском стационаре по типу бета-лактамазы синтезируемой изолированными штаммами стафилококков.

4. Одновременное определение антибиотикограммы. механизма резистентности у стафилококков к бета-лактамным антибиотикам, наличия и типа бета-лактамазы синтезируемой штаммом повышает дискрими-наятность результатов типирования в 1.3 - 1.5 раза.

5. Высокий удельный вес госпитальных штаммов резистентных к новым бета-лактамным антибиотикам обусловлен в подавляющем большинстве случаев бета-лактамазами, (к апалциллину 75.О %, к мезло-циллину 79.17 %, к пиперациллину 83.3 % ).

6. Резистентность к оксациллину у стафилококков выделенных из гнойного отделяемого была обусловлена только ферментным механизмом резистентности - бета-лактамазой III типа.

Практические рекомендации.

Разработанный комплексный подход к эпидемиологическому ти-пированию стафилококков в системе надзора за ВБИ в родовспомогательных учреждениях может быть рекомендован для практической работы бактериологических лабораторий.

С целью повышения чувствительности и надежности типирущей системы рекомендуется использование комплекса взаимосвязанных методов (экспресс-метод определения наличия бета-лактамаз, резистен-стапирование по спектру антибиотиков, определение механизма резистентности к бета-лактамным антибиотикам и типа синтезируемых ферментов). Комплексная система типирования позволяет маркировать все виды коагулазотложительных и коагулазоотрицательных стафилококков, а также делать вывод о вероятном риске возникновения гнойно-септических заболеваний.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Оценка разных методов эпидемиологического типирования золотистых стафилококков // II Всесоюз. конф. " Актуальные вопросы клинической микробиологии в неинфекционной клинике": Тез. докл.-- М., 1988.- 4.1. С. 37-38. (в соавторстве).

2. Определение профиля бета-лактамаз с целью эпидемиологического типирования S. aureus // III Респуб. конф. мол. уч. "Медико-бислогические аспекты повреждения и компенсации. Проблемы алкоголизма и здоровый образ жизни": Тез. докл. - Гродно..1989.- С. 68.

3. Активность бета-лактамазы у стафилококков выделенных в акушерских стационарах // V съезд Бел. науч. мед.общества акуш.-ген.

и неонатологов. Тез. докл. - Брест.. 1991.- С. 213-214. (в соавторстве) .

4. Резистентность госпитальных стафилококков к бета-лактам-ным антибиотикам // Журн. Антибиотики и химиотерапия. - 1991. -т.36. N 9. - С. 9-11. (в соавторстве).

5. Изучение эпидемиологических маркеров у госпитальных штаммов S.aureus // VIII Респ. объединенный съезда эпид., микроб., и паразитологов."Актуальные вопросы гигиены и эпидемиологии в РБ." : Тез. докл. - Пинск., 1991.- Т.2. С.81-82. (в соавторстве).

6. Сравнительная оценка методов определения бета-лактамаз у стафилококков // Всесоюз. конф. "Госпитальные инфекции и лекарственная устойчивость микроорганизмов": Тез. докл. - М., 1992. - С. 83-84. (в соавторстве).

7. Аутомикрофлора детей и матерей, проживающих на загрязненных радионуклидами территориях // Сов. науч. мед. общ. "Проблемы инфекций и здоровья в современной медицине": Тез. докл. - Минск., 1994. - С.147 - 152. (в соавторстве).

8. Ферментный механизм резистентности к бета-лактамным антибиотикам как эпидемиологический маркер типирования S.aureus // Журн. Здравоохранение Беларуси. - 1994., N 8. - С. 17-20.

9. Метод микробиологического типирования золотистого стафилококка // Респ. науч. практич. конф. "Актуальные проблемы эпидемиологии. диагностики, лечения и профилактики внутрибольничных инфекций": Тез. докл. - Минск., 1996. - С.56-57. (в соавторстве).

10. Система микробиологического типирования S. aureus при госпитальной инфекции // Респ. науч. практич. конф. "Актуальные проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики внутри-больничных инфекций": Тез. докл. - Минск., 1996. - С.76-78. (в соавторстве) .

11. Применение комплексной методики резистенстипирования стафилококков в родовспомогательных учреждениях // Респ. науч. практич. конф. "Актуальные проблемы профилактики внутрибольничных инфекций. Дезинфекция и стерилизация.": Тез. докл. - Минск., 1996. -С. 49-50.

12. Механизм устойчивости к антибиотикам у стафилококков изолированных с кожных покровов новорожденных // Респ. науч. практич. конф. "Актуальные проблемы профилактики внутрибольничных инфекций. Дезинфекция и стерилизация.": Тез. докл. - Минск., 1996. -С. 50-51.

РЭЗЮМЭ

Сушчэв1ч В1ктар В1ктарав1ч

Тьшаванне стаф1лакокау у спстэме эп1дэм1ялаг1чнага нагляду за гнойна-запаленчьш 1нфекцыям1 у родадапаможных установах.

Ключавыя словы: унутрыбальн1чная 1нфекцыя. стаф1лакок, тыпа-ванне, ман1торынг, рэз1стэнтнасць, механ1зм рэз!сгэнтнасц1, анты-51етык1, бэта-лактамаза.

3 мэтай удасканалення тыпавання у с1стэме эп1дэм1ялаг1чнага нагляду за гнойна-запаленчым1 1нфекцыям1 у родадапаможных установах 1 пошуку новых больш эфектыуных метадау марк1равання каагула-застаноучых 1 каагулазанегатыуных стаф1лакокау даследвал1ся тры калекцы! штамау S.aureus 1 S.epldermldls, вылучаных у розных эп1-дэм1ялаг1чных умовах у аднос1нах да рэг1страцы1 унутрыбальн1чных 1нфекцый у родадапаможных установах. Вывучана 1 прыведзена характа-рыстыка эп1дэм1ялаг1чных метак (антыб1ётыкатыпаванне, фагатыпаван-не. вызначэнне актыунасц! плазмакаагулазы, наяунасць бялку А, меха-н1зму рэзЮтэнтнасц! да бэта-лактамных антыб1ётыкау 1 тылу с1нтэ-зуемых бэта-лактамаз). Даследванне праводз1лася у адпаведнасц1 з зацверджаным! методикам!, а таксама мадыф1каваных метадау: экс-прэс-метада вызначэння бэта-лактамаз; вызначэнне механ1зму рэзЮтэнтнасц! да бэта-лактамных антыб!ётыкау. Выяуленыя дадзеныя апра-цаваны метадам! варыяцыйнай статыстык1.

Выяулена, што механ1зм рэз1стэнтнасц1 да бэта-лактамных анты-б1етыкау i тыл бета-лактамаз з'яуляюцца устойл1вай эп1дэм1ялаг1ч-най меткам yclx в!дау стаф1лакокау. Тыл бэта-лактамаз з'яуляецца прагнастычнай прыкметай у аднос1нах да магчымасц! узн!кнення выпа-дкау гнойна-запаленчых захворванняу у акушэрск1м стацыянары. Вып-рацавана эп1дэм1ялаг1чная клас1ф1кацыя бэта-лактамаз з ул!кам маг-чымай рызык! узн!кнення унутрыбальн!чнай стаф!лакокавай 1нфекцы! у акушэрск!м стацыянары. Прапанаваны комплексны метад тыпавання ста-ф1лакокау у структуры ман!торынга за унутрыбальн!чнай 1нфекцыяй у акушэрск1м стацыянары.

Паказана. што прапанаваны метад марк!равання каагулазастаноу-чых и каагулазанегатыуных стаф!лакокау у комплексе з друг1м! бак-тэрыялаг1чным1 метадам! узвышвае дыскрым1нантнасць !, так!м чы-нач. ступень надзейнасц! за унутрыбальн1чнай стаф!лакокавай 1нфек-цыяй у акушэрск1м стацыянары.

Вобласць прымянення: м!краб!ялог1я, эп1дэм1ялог1я.

- 18 -РЕЗЮМЕ

Сущевич Виктор Викторович Типирование стафилококков в системе эпидемиологического надзора за гнойно-воспалительными инфекциями в родовспомогательных учреждениях.

Ключевые слова: внутрибольничная инфекция, стафилококк, типирование, мониторинг, резистентность, механизм резистентности, антибиотики, бета-лактамазы.

С целью совершенствования титрования в системе эпидемиологического надзора за гнойно-воспалительными инфекциями в родовс-помагательных учреждениях и поиска новых более эффективных методов маркирования коагулазоположительных и коагулазоотрицательных стафилококков исследовались три коллекции штаммов S.aureus и S.eplde-rmldis, выделенные в разных эпидемиологических условиях в отношении регистрации внутрибольничных инфекций в родовспомогательных учреждениях. Изучена и дана характеристика эпидемиологических маркеров (антибиотикотипирование, фаготипирование, определение активности плазмокоагулазы, наличия балка А, механизма резистентности к бета-лактамным антибиотикам и типа синтезируемых бета-лактамаз). Исследования проводились согласно утвержденных методик,а также модифицированных методов: экспресс-метод определения бета-лактамаз; определение механизма резистентности к бета-лактамным антибиотикам. Полученные данные обработаны методами вариационной статистики.

Установлено, что механизм резистентности к бета-лактамным антибиотикам и тип бета-лактамаз являются устойчивой эпидемиологической меткой всех видов циркулирующих в акушерских стационарах стафилококков. Тип бета-лактамаз является прогностическим признаком в отношении вероятности вспышки гнойно-воспалительных заболеваний в акушерском стационаре.Разработана эпидемиологическая классификация бета-лактамаз с учетом вероятного риска возникновения внутрибольничной стафилококковой инфекции в акушерском стационаре. Предложен комплексный метод типирования стафилококков в структуре мониторинга за внутрибольничной инфекцией в акушерском стационаре.

Показано, что предлагаемый метод маркирования коагулазоположительных и коагулазоотрицательных стафилококков в комплексе с другими бактериологическими методами повышает дискриминантность, а следовательно степень надежности мониторинга за внутрибольничной стафилококковой инфекцией в акушерском стационаре.

Область применения: микробиология, эпидемиология.