Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некоторые биологические свойства госпитальных штаммов KLEBSIELLA PNEUMONIAE в связи с их этиологическим значением

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Некоторые биологические свойства госпитальных штаммов KLEBSIELLA PNEUMONIAE в связи с их этиологическим значением"

Р Г 5 ОД

МЯНИПТЕГСТК) ЗДРАВООХРАНЕНИЯ W5 САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИ)! ХИМИКО-'ИР.М/ЛЕОТИЧЕСККЙ ИНСТИТУТ

на правах ру/юпиги

НЕКОТОРЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГОСПИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ Klebsiella pneumoniae В СВЯЗИ С ИХ ЭТИОЛОГИЧЕСКИМ ЗНАЧЕНИЕМ

03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена в Санкт-Петербургской государственной педиатрической медицинской академии и в Санкт-Петербургском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени Пастера.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор, действительный член

Петровской Академии наук и искусств Г.Я.Ценева; доктор медицинских наук, профессор Б. А.Цшзерлинг.

Научный консультант доктор медицинских наук, профессор В.М.Бондаренко.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Н.П.Блинов доктор медицинских наук, профессор Л.Б.Борисов

Ведущее учреждение - Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричесвского Министерства здравоохранения РФ

Защита состоится "¿¿'ф^Ж/гЁ^/1995 г. в часов на заседании специализированного совета К.084.63.01. при химико-фармацевтическом институте Ю РФ (197022, г.Санкт-Петербург, ул. проф.Попова,14).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке СПбХФИ

Автореферат разослан " 2Ч-" 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Н.В.Кириллова

Актуальность проблемы.

В последние годы наблюдается значительный рост инфекцисн пых заболеваний, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами. Среди них одно из ведущих мест занимают представители рола Klebsiella, в частности Klebsiella pneumoniae. Необходимость изучения клинических изолятов К. pneumoniae стоит наиОо-лее остро в связи с формированием очагов внутриОольничных инфекций. Известно, что внутрибольничные клебсиеллезные инфек-

in у »»л i» «угла mova RLIM mATtotnieu иРПРПКП ГРИР-

рализацисй инфекционного процесса и высотой летальностью (А.В.Панфилова и соавт.,1988; A. Hanbraeus et al. ,1991; J.L.Arredondo-Gars la et al.,1992).

Несмотря на большое число исследований, посвященных изучению этиологической значимости К.pneumoniae в развитии инфекционного процесса, в настоящее время отсутствуют четкие критерии оценки роли клебсиедл в возникновении специфического воспалительного процесса, особенно в случае микст-инфекции.

Современный лабораторный диашоз, базирующийся на традиционном способе обнаружения клебсиелл бактериологическим методом, является недостаточным для аргументации их этиологической значимости.

Для доказательства этиологической роли клинических штаммов К.pneumoniae в развитии инфекционного процесса необходимо установление их патогенных свойств. Из факторов патогенности К.pneumoniae наиболее полно изучены полисахаридная капсула, адгезины фимбриаяьной природы и энтеротоксины i,T и ЗТ типа, нммуиологнчески родственный аналогичным энтеротоксинам энтеро-токсигенньи кишечных палочек (ЕТЕС) ( F.A.Kllpsteln et al. .1983; M.Albert et. al.. 1092).

Данные о характере взаимодействия К. pneumoniae с эпити-ди альными клетками макроорганизма ограничены и нередко противоречивы, что d значительной степени связано с отсутствием адекватных экспериментальных моделей для их изучения (П.Пенчева и соавт.,1971; И.ГОтшарова, Р.МзриноваД981; F.r.W.Koo, М.Г>.Stein ,1980).

- ь -

Для изучения латогешюсти клебсиелл используют различных лабораторных животных: крыс, мышей и кроликов. Не удалось найти описания калебсиеллезной инфекции у морских свинок; отсутствуют данные сравнительного изучения клинических штаммов К.pneumoniae на чувствительных биологических моделях in vivo. Изложенное свидетельствует о необходимости дальнейшего поиска и разработки адекватных моделей для тестирования вирулентности К.pneumoniae различного происхождения, изучения биологических особенностей штаммов К.pneumoniae клинического происхождения и установления их роли в развитии патологического процесса.

Цель исследования:

Характеристика основных биологических свойств и профиля плазмидной ДНК клинических штаммов К.pneumoniae, выделенных от детей раннего возраста, и оценка их роли в развитии клебсиел-леэнсй инфекции.

Задачи исследования:

1. Изучить фенотипические и генетические особенности штаммов К.pneumoniae, циркулирующих в детском стационаре.

Z. Определить патогенные свойства К, pneumoniae на модели клеточных культур.

3. Разработать модель экспериментальной клебсиеллеэной инфекции на животных и дать оценку вирулентности клинических штаммов клебсиелл при микробиолого-морфологическом исследовании материала от инфицированных животных.

Положения, выносимые на защиту:

1.Наиболее информативной для тестирования вирулентности К. pneumoniae является модель заражения перевиваемых клеточных культур НЕр-2 и HeLa. На данной модели оценивается адгезия и колонизирующая активность бактерий по проценту "пораженных клеток" и адгезивному числу, а тагае цитотокстшость, определяемая но индексу гиОели клеток монослоя.

'¿. Из лайораторных животш« морские свинки характеризуют-

ьд высотой чувствительностью к патогенному действию К.рпсчпо die? при парентеральном их заражении. У инфицированных кивот ных наблгщяется проникновение клеосиелл в кроьь, их дпссешша-пия во внутренние органы и размножение, сопровождающееся гибелью животных.

Установлено, что адгезивная аетивность циркулирующих в детских стационарах ьнутригоспитальных ттанмов К. pneumonia» связана с наличием у бактерий плазмиды м.м. 05 MD, а цитотск сичность - с функцией плазмид 40 и 120 MD, оказывающих отяго-

»»"«»»» «Я mem, П t-.......11. Г.—~-----

а. . г., _ -'"" vatr ппянило.

носителями различных плазшвд, гетерогенных по молекулярной массе. Плаамидой мукоидности ICO WD обладают £8,4% изолируемых культур, плаамидой адгевии 55 MD - £5% культур. К так называемым внутригоспитальным плазмидам, обнаруживаемым у sot изоля-тов, можно отнести плазмиды 40 и 105 MD, несущие маркеры поли-антибиотикорезистентности.

Научная ношоиа:

Впервые на модели перепиваемой клеточной линии НЕр-2 описала цитотоксическлл активность К.pneumoniae. Лана сравнительная характеристика адгезивности и цитотоксичности штаммов К.pneumoniae различного происхождения и показана их роль в развитии клебсиеллезной инфекции у детей.

Сравнительное микробиолого-морфологическое изучение клебсиеллезной инфекции у разных видов животных показало наибольшую чувствительность к данному возбудителю морских, свинок. Впервые на предлагаемой модели клеОсиеллеаной инфекции у пороки» гттпк лана опенка вирулентности штаммов К. pneumoniae различного происхождения.

Представлены генетические особенности клинических ша.;мог< К.pneumoniae, обладающих оригинальными плззмипами,. связанными с вирулентностью возбудителя. Приведены данные, свидетельствующие о существовании п детской городской больнице Hi г.С-Ие-тербурга очага клебсиеллезной кнфекпии и ycT?Koi\rew» стягогачп-щее влияние циркулирующих штаммов К. pneumoniae, несущих внут-ригоспитальиые плазмиды, на течение и исход основного •-смл'Ч!

ческого заболевания.

Для оценки вирулентности предложен тест-штамм К.pneumoniae 691, обладающий плазмидой 120 MD и характеризующийся высокой вирулентностью. Штамм депонирован в коллекцию музея живых культур ГйСК им.Л.А.Тарасевича.

Практическая значимость:

Полученные результаты исследования показывают необходимость изучения биологических и генетических особенностей выделенных штаммов клебсиелл для доказательства их этиологической роли. Показана возможность использования модели перевиваемых клеточных линий НЕр-£ и НеLa для тестирования вирулентности клебсиелл.

Критерии, обосновывающие существование в детском стационаре очага клебсиеллезной инфекции, основанные на сопоставлении профиля плазмидной ДНК изолируемого штамма и его фенотипи-ческих характеристик, могут быть использованы для эпидемиологического анализа специалистами бактериологической службы са-нэпиднэдзора и клинических лабораторий.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на юбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летию института им.Пастора 25-27 мая 1993 г., а также на совместном ааседании кафедры патанатомии и лаборатории возрастной анатомии и инфектодогии НИЦ Санкт-Петербургской государственной педиатрической академии 29 августа 1994 года.

По материалам диссертации опубликовано б научных работ.

Структура и объем работы

Материалы диссертации изложены на 157 страницах машинописи. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 23 рисунками. Диссертация построена ио традиционному плану и состоит из введения, обзора литературы , 4 глав собственных исследований, гаключе-ния, выводов и у!сазателя литературы, включавшего 04 отечественных И 119 зарубежных источников.

- 7 -

МАТЕРИАЛЫ И ¡ШТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Итамми, методы культивирования.

В исследованиях били использованы 297 штаммов К.pneumoniae, выделенных от 255 детей в детских городских больницах Щ'Ю Ml и N17 г.Санкт-Петербурга в 1388-1931 г.г. Исследования по выделении и первичной идентификации клебснелл из биологического материала проводились на базе бактериологических ла-

KonwiVtnira м К N1 И (11 П 111! UIUWUV - Z — --""

Ф.Й.МЗПДРМШ. riy'AnTypn -l.""" "" «««•««»

из мокроты, крови, мочи, ликвора, фекалий, плевральных и брюшной полостей, гнойного отделяемого послеоперационных и ожоговых ран, пупочных ран, из носа, зева, глаз, из содержимого желудка, из секционного материала. Отдельные штаммы К.pneumoniae с описанными характеристиками были получены из лаборатории генетики вирулентности бактерий НЖЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН (зав.проф. В.М.Бондаренко) и использовались нами в качестве контрольных и/или для моделирования клебсиеллевной инфекции.

Выделение кдебсиелл проводили на плотных средах Эндо, Плоскирева и среде "Klebsiella-5 АСК", предложенной Е.П.Сиво-лодским; идентификацию культур проводили на основании общепринятых морфологических и биохимических тестов (С.И.Похил, Л.А.Кособуцкий, 199?.). В опытах использовали свелсевыделеннн? штамммы К.pneumoniae или хранящиеся короткое время (2-3 месяца) в полужидком (0,3-0,5%) и на скошенном агаре (7-10 дней)при температуре 4±1°С. Музейные штаммы сохраняли в лио-фильновысушеннем состоянии.

Серологическую идентификацию клинических итаммов К. pneumoniae проводили на базе НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН под руководством вед.н.с. А.П.Ватуро с использованием гипериммунных сывороток к К-антигенам 1-72,71,79-82. Реакцию агглютинации осуществляли на стекле и в объемной реакции по общепринятым методикам.

Чувствительность £22 штаммов К.pneumoniae к 10 антибактериальным препаратам определяли общедоступными метопами диффузии в агаре с помощью дисков, в некоторых случаях - метопом

- 8 -

серийных разведений в жидкой среде.

Генетические методы

Профиль плазмидных ДНК 116 штаммов К. pneumoniae определили экспресс- методом по Kado и Liu (1981).

Коныогационное скрещивание осуществляли в бульоне общепринятым методом.

Рестрикцию плазмидных ДНК проводили эндонуклеазой рестрикции Pst 1 в стандартных условиях (Маниатис, 1984).

Экспериментальное модели и биологические тесты.

Для воспроизведения клебсиеллезной инфекции было использование 27 беспородных белых крыс массой 250-300 г., 144 мыши линий BALB/c и СаНА массой 12-14 г., 411 морских свинок. Мышам обеих линий и морским свинкам при моделировании иммунодефицит-ного состояния вводили иммунодепрессант цшслофосфан (ЦФ) в/м в дозе 200 мг/кг веса за сутки до заражения.

Интрзтрахеальное заражение белых крыс осуществляли по методике З.Л.Гольаанд (1955) в дозе 108-109 КОЕ суточной культуры К. pneumoniae в физиологическом растворе. Опытных и контрольных животных исследовали на 3 сутки на пике процесса по описанной автором методике.

При парентеральном (в/б) заражении животным вводили 0,6 мл взвеси К.pneumoniae, содержащей 102 КОЕ для мышей и 103-10б КОЕ для морских свинок.

йитраназальное заражение морских свинок проводили по методике М.К.Войно-Ясенецкой (1957) в дозе 106 КОЕ суточной культуры в физиологическом растворе.

Опытных и контрольных животных исследовали в динамике инфекционного процесса через 1,3,5,10 и 15 суток. Генерализацию инфекционного процесса определяли по результатам юличествен-нш посевов крови из сердца, гомогенатов легких, печени, селе-ченки, почек, мейентериапьных лимфоузлов и тонкого кишечника по методике Т.А.Авдеевой (1961) в модификации Г.Я.Ценовой и соавт.(1982).

Продукция тюбоиеллами термолабильного энтероточеича (ST)

- О _

■■ыярляли путем интрагастрального врсления ультразьукопмх ли .»а юь иди супсриазгаатев четырехдневным юмгм-сосуиклм но "-голи к" В.Е.КФррмсва ( 1973), т^рмоста^пльюго знтеротоксина П,Т) -в тест« отека лапн белой мнвш массой ш-со г., согласно методике, описанной В.К.Клегановым и соаы. (1580).

Заражение однослойных клеточных культур проводили по Методике, СНИСЛВЬОЙ Г. Л. ¡1чН'-);ОЙ К СО.ТТ. М№0». ЛЛЯ Т'-" ГИрОГ-1 ния адгезии и цитотоксичности применяли перевиваемые глсточние "" гоптаии (НЕр-С). из карцшгомм пейкм

1И01Я1 чиливвчплм "

эмбриона крысы ОКЖ). Клеточные культуры укаго-цних липки получали из ЦИН РАЕН, ВНИИ гриппа, лаборатории вирусологии С-Пе-тербургской государственной педиатрической академии.

Мор§ологические метода

Для гистологических исследований легких, печени, селезенки,' почек, мезентериальных лимфоузлов, разных отделов кишечника иснольаопали срегы материала, фиксированного 10Х формалином или жидкостью Буэна и запитого в парафин. Парафиновые среяы (3-5мм) окрагаипали гематоксилином -полином и по Романовскому -Гимза.

Иммунологические методы

Фагоцитарную активность полиморфнолдерных лейкоцитов (ПМЧЛ) определяли по методике 31огзе1 Т.Р. (1977) в модификации Д.Н.Новикова и В.К.Новиковой (¡97й) при оценке Фагоцитоз* с использованием зимозана.

ДЛЯ ИЯУЧСИИЯ ЙЛЛО1п0и трппт^гт""'"'^ Лимфоцитов

(ГЯТЛ) в си.чпконирогешмие пробирки ¡гдерапп 0.Г- мл гопариниаи-рованной крови и дооаилнли неспецифпчсаае ю!тогвны фитоге-магглютинин (ФГА) и конканавалин А (Кои А) в конечной концентрации 3 мкг/мл, а также взвесь суточной культуры К.рпеитоп1ас в конечной концентрации ю9 КОЕ/мл. Спонтанную пролиферации изучали в порарцач л отсутствии антигенов, Пр^лн ит:Л«го®али «И ч при температур» -"У^С. Затем готогилт мдекп по стячл-чрти'ч'! методике, окрлп'иггп! по Лойячпчу и»и "о Романовскому-I имва.

При светооптической микроскопии (ув.90х7, масляная иммерсия) учитывали процент лимфобластов из числа сосчитанных лимфоцитов (не менее 300 лимфоцитов).

Антагонистическую активность лактобацнлд определяли методом отсроченного антагонизма. Штаммы рода Lactobacillus были подучены от проф. В.М.Бондаренко.

Анализ историй болезни проводили совместно с доцентом каф.педиатрии ФУВ С-Петербургской педиатрической академии к.м.н. С.Г.Войковым. Анализ секционного материала прозектуры ДГБ N1 проводили на кафедре патологической анатомии СПвПШ (зав.каф. проф.В.А.Цинзерлинг)

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили в соответствии в правилами вариационной статистики, определяя величины средней арифметической, среднего квадратичного отклонения, стандартной ошибки средней величины (Урбах В, ¡0. ,1975). Достоверность разности средних величин оценивали с помощью критерия Стыодента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выбор биологических моделей для изучения патогенных

свойств К. pneumoniae in vitro и in vivo.

При выборе адекватной модели in vitro для изучения адгезии и цитотоксичности в предварительных опытах на перевиваемых тканевых культурах НЕр-2, HeLa, ФЧ и ФЭК были отобраны паяболее чувствительные и доступные клетки линий НЕр-2 и HeLa, на которых в дальнейшем проводились основные опыты. Эксперименты . проводили с использованием ытамма К.pneumoniae К2 5055 (Копенгаген), обладающего плаамидой мукоидкости 120 MD (pMcv), и лабораторного штамма К.pneumoniae К1 1085, содержащего мобилизованную критическую плаамиду 65 MD.

При светооптической микроскопии клеточных пластов, вара-женных К.pneumoniae 6055, черев 1,6-2 ч можно было судить об

адгезии бактерий. Они прикреплялись к пдагмолемме 13": клстск иоиослоя и имели вид крупных биполярных палочек, обычно по 2-2 на 1 клетке НЕр-2 или HeLa. К 5 ч на 17Х клеток пласта можно было видеть более короткие полиморфные или кокковидные делящиеся бактерии. При этом в 32Z клеток прогрессировали цитопати-ческие изменения: увеличение вакуолей, вмбухание и отрмв периферических участков шкшлаэш, сморкиваиие, пакноэ ядер. Через 24 ч наолюдали оольшое количество бактерий (до 150 в поле anauuat п межклеточном пространстве. На этом сроке цитопати-

M^t^lC liomon^n,». С___----- ...»,» - Tf r.V7. Kjl^ivjr. ROMttwu-'.

округление, сморщивание и Е!Луханис у.-'л-^ип у

клеток монослоя - гибель. Индекс гибели пласта - число нежизнеспособных клеток монослоя по сравнению с их естественной гибелью в контроле - составляло 2,5.

Среднее число бактерий штамма К. pneumoniae 1085, прикрепившихся на 1 клетке монослоя через 2 ч инкубации составляло 3-4, при этом адгезию наблюдали на более чем 1/3 клеток пласта. R 5 ч количество микробных клеток увеличивалось в 1,8 раз и на плаз.молемме можно Сило видеть активно делящиеся полиморфные палочки. Витопатические изменения, вызванные штаммом 1035, были минимальны: отмечали неравномерную интенсивность окраски цитоплазмы отдельных клеток монослоя, а также бактерий, увеличение вакуолей, в некоторых клетках - пикноз ядер. Через 24 ч наблюдали активное размножение бактерий на плазмолемме жизнеспособных клеток и в межклеточном пространстве. Индекс гибели пласта на этом сроке составлял 1,6. Таким образом К.pneumoniae 5055 pMcv обладал слабой адгезивностью и выраженой цито-токсичностью, К.pneumoniae 1085 - выраженной адгсзивностыо и слабой цитотоксичностью.

При проведении onyxes срп2ККте.»ьчоЛ опенки моделей in vivo использовали различных лабораторных животных, инфицируемых высоковирудентнш итаыаал К.pneumoniae К2 5055 pMcv. Сравнительные данные изучения поведения К.pneumonias в. организме различных видов лабораторных животных при парентеральном введении показали наибольшую чувствительность к данному виду бактерий морских свинок. У этих животных наблюдали выраженную диссеминацию клебсиелл во все исследованные внутренние органы и накопление их в высоких концентрациях; высокую летальность.

Циклофосфан, использованный в опытах, усиления клинико-морфо-логической картины клебсиеллезной инфекции не обусловливал. При выраженном цитостатическом и иммунодепрессивном эффекте ЦФ не наблюдали усиления патоморфологических изменений, вызванных высоковирулентным штаммом К. pneumoniae S055 pMcv.

Результаты бактериологического исследования позволили обнаружить у мышей линии BALB/c, получавших ЦФ, диссеминацию клебсиелл в легкие и почки на более поздних сроках, а у мышей линии СзНА - существенно меньшую концентрацию микробных клеток во внутренних органах, чем при экспериментальной инфекции без применения ЦФ. Следует отметить, что, хотя и отмечалось значительное (в 3,1 раза) повышение летальности морских свинок, получавших ЦФ, но результаты бактериологического и гистоморфоло-гического исследований не выявили существенных отличий в характере взаимодействия клебсиелл с организмом животных получавших и не получавших циклофосфан.

Сравнительная характеристика патогенных свойств К. pneumoniae различного происхождения на биологических моделях.

Проведенная оценка адгезии, цито- и энтеротоксигенности госпитальных штаммов «.pneumoniae показала, что изученные культуры клебсиелл характеризуются разной степенью проявления этих свойств.

Установлено, что 78Х клинических штаммов К.pneumoniae, выделенных из различного материала, были слабо адгезивными. £0% оказались умеренно- и 2% - высокоадгезивными. При сопост-влении полученных результатов с клиническими данными установлено, что способность клебсиелл адгезироваться на клетках НЕ.р-2 отражает характер поражения органов макроорганизма. Так, слабоадгезивные штаммы были изолированы, icaK правило, из локализованного очага клебсиеллезной инфекции, а культуры К. pneumoniae с выраженной адгевивностью - из крови и секционного материала при генерализованных формах. 3 высокоадгезивных штамма, выделенных из мокроты в начале заболевания впоследствии явились причиной генерализованной инфекции.

Степень цитотоксического действия культур К.pneumoniae на клетки НКр-Е существенно варьировала у различных штаммов, что

- ГЗ -

«fcWKVh СИ'НОВОЙ для (•ЗЬряОиТКИ ¡.'РИТt-pifi-B OUvIlKII цитотоксичности клебсиедл. Распределение иьучишшх втациов К.рпо'.шюгиаи степени токсигенности позволило установить, что 53% изученных культур К. pneumoniae не обладали цитотоксичностью, 24 7. били умеренно питотоксичными, £3 Z - высокоцитогоксичными. Сопоставление экспериментальных и клинических данных показало, 11 го выраженность цитотоксической актныюстп у изученных итг^люв К.pneumoniae коррелирует с тяжестью инфекционного процесса у ппллннк. к», —. """«««иш ппи легких Формах

«пОшсшп™, ини пии мш^д „^.„.г^;:,

как правило, не обладали выраженной цитотоксичностьи. Штаммы, выделенные от больных с тяжелым течением с явлениями интоксикации, а также при генерализованных формах заболевания в монокультуре или в составе ассоциаций, при концентрации других микроорганизмов до 103 КОЕ/г, были умеренно или высокоцитоток-сичными. Все штаммы, изолированные из крови умерших детей, характеризовались высокой цитотоксичностью.

Проведение сравнительных экспериментов по заражению клеток Utlp-й суперна! актом и целыми бактериальными клетка.'.:;: К.pneumoniae позволило установить цитопатогенный з4Фект при внесении в монослой сулернатантов высокоцитотокслчного штамма. Вместе с тем показано, что цитопатичесг-ие изменения б клетках НЕр-2, зараженных цедаыи бактериями тоге же штата достоверно ьш«е. Таким образом, для тестирования вирулентности клеоеиелл на модели клеток НЕр-2 эффективно использование цельных бактериальных клеток клебсиелл. В специальных опытах с использованием генетически связанных пар штаммов показано, что цитоюк сическая активность к.рп«изагиа<? детерминируется коньтгатиьной R-плазмидой с м.м. 40 MD, а адгезивность связана с функцией плазмиды Ы> Mi).

На моделях ннтраг астрального заражения мю->А -сосункоь и отека лапы белой мыши выявлена способность син£е«»ироЕсдг энт-ротоксины у 15,6 X испытанных клинических штаммов клебсиелл. Сопоставление с клиническими данными показало, что знтероток-сигенные штаммы были выделены при ОКИ или при генерализованных кде^онеллез.чнх инфекциях, протекающих с явлениями энчероколи та. Культуры клебсиедл. изолированные из крови, мокроты, мочи, г'юйного отделяемого послеоперационных ран и ожоговых поверх-

- IK -

костей не синтевировали энтеротоксины.

В опытах парентерального еаражения морских свинок были описаны характеристики взаимодействия клебсиелл, отличающихся по вирулентности, с макроорганизмом.

Установлено, что адгезивные и цитотоксичные штаммы, выделенные лри генерализованных клебсиедлеаных инфекциях, диссеми-нировали во все внутренние органы и кровь уже на ранних сроках после заражения в высоких концентрациях. В то время, как штамм, изолированный ив фекалий без клинических проявлений инфекции и не обладающий адгезивностью и цитотоксичностью не диссеминировал в легкие, кровь и лимфатические узлы. Бактерии данного штамма обнаруживались в тонком кишечнике в течение всего периода насшидения (to суток), причем их концентрация оставалась постоянной.

Гибель морских свинок в эксперименте наблюдали лишь при заражении их цитотоксичным штаммом 4886, обладающим плазмидами 40 и 60 MD, и выделенным от умершего ребенка с генерализованной кл~"бсиелле8Ной инфекцией. Одновременно установлено, что клебсиеллы, способные к диссеыинаиии в органы и укани морских свинок, ке всегда вызывают выраженные патоморфологические изменения и гибель животных, что, вероятно, связано с различными механизмами, обеспечивающими эти феномены.

Для выяснения роли цитотоксина и установления зависимости характера инфекционного процесса от пути заражения клебсиелла-ми были проведены сравнительные эксперименты перорального и интранаэального заражения морских свинок штаммами К. pneumoniae, существенно отличающимися по происхождению и биологическим свойстваи.

При варажении морских свинок штаммом К. pneumoniae 691, обладающего плаэмидой 120 MD, выделенного от умершего ребенка при генерализованной клебсиеллезной инфекции и характеризующегося выраженной адгезией на клетках НЕр-2, высокой цитотоксичностью, вирулентностью для мышей (LD so Ю7 КОЕ) установлено, что при пероральном способе заражения наблюдается диссеминация клебсиелл во все органы уже на первые сутки после заражения в умеренных юнцентрациях и диссеминация в кровь на 3 сутки. Максимальное накопление клебсиелл происходило в крови, легких, печени, селеэеике, ыезентериалышх лимфоузлах на Б сутки после

заражения, ь тонком гамечнкке - на з сутки. Нл 15 сутки после заражения клебсиелл не высевали ни из одного органа. Максимальные патоморфологические изменения у морских свинок при не -реральном заражении штаммом К.pneumoniae 691 были выявлены на 3-5 сутки в тонком кишечнике, выражающиеся в значительной очаговой инфильтрации слизистой оболочки грзнулоцитами, местами со слущиьанием эпителиального пласта, реысом полнокровии сосудов, отеке, с формированием у одного животного криптаабсцес-гч-га Lnimjnn —— ^пво.иша ияйлппащ

отчет лйг>у«1 » __zz:zz. Г;""-"" »'«лгои» mm тптшвим

жекии штаммом 091 не наблюдали.

При интраназальном заражении морских свинок штаммом К.pneumoniae 691 на 1-е сутки клебсиеллы обнаруживали только й легких в умеренной концентрации. На 3 сутки после заражения наблюдали диссеминация клебсиелл в кровь, печень, селезенку, мезентериальные узлы, тонкий кишечник. При этом максимальная концентрация клебсиелл была в крови и легких, минимальная - в кишечнике. На 5 сутки сохранялась высокая концентрация клебсиелл б крови, а в других органах их количество значительно снижалось, причем мезентериальные лимфоузлы и тонкий кишечник на этом сроке были свободны от клебсиелл. Максимальные патоморфологические изменения выпилены в легких на 3 сутки, на этом сроке отмечалось также поранение других внутренних органов. При интраназальном заражении штаммом 691 наблюдали гибель 57 X животных на 5 сутки после заражения.

При пероральном заражении морских свинок штаммом К.pneumoniae 17-144, изолированном при диарее новорожденного в другом стационаре и характеризовавшимся энтеротоксигенноотью (ЬТ'), а также отсутствием адгезии на клетках НЕр-2 и цитоток-сичности, несущего плазмиды 2,6 и 96 на 1-е сутки клебсиелл обнаруживали только в тонком кишечнике в небольших концентрациях (1,1 lgKOE/r), к 3-м суткам концентрация их увеличивалась в 2 раза, а затем наблюдали постепенное ее снижение, однако, и на 15 сутки после заражения клебсиелл обнаруживали в телком кишечнике в концентрации 0,3 JgKOE/r. Отмечали однократное выделение клебсиелл из легких и печени на 3 сутки в концентрации l.S-1,5 lg КОЕ/г органа, и из мезентериальных лимфоузлов на 5 (1,3 lgKOE/r) И 10 сутют (1,6 lgKOE/r). соот-

ветственно. Диссеминацию клебсиелл в другие органы и кровь не наблюдали. При гистологических исследованиях максимальные изменения выявляли в кишечнике через 3 суток после заражения в виде распространенного энтероколита с очаговой нейтрофидьной инфильтрацией слизистой оболочки, дескзамацией эпителиальной выстилки, отеком и полнокровием.

При интраназальном заражении морских свинок штаммом К.pneumoniae 17-144 на 1-е сутки клебсиелл обнаруживали только в легких (0,4 IgKOE/r), где через 3 суток наблюдали накопление бактерий до 2,4 IgKOE/r, а затем их постепенную элиминацию, на 10 сутки клебсиелл из легких не высевали. На 3 сутки после заражения наблюдали диссеминацию клебсиелл во все органы и кровь в концентрациях, не превышающих 1,7 lgKOE/r, на 5 сутки их высевали только из легких и тонкой кишки (0,2 IgKOE/r).

При гистологических исследованиях максимально выраженью изменения были отмечены в легких через 1 сутки: в прикорневых отделах выявлена очаговая пневмония с преимущественной грану-лоцитарной реакцией и с примесью макрофагов.

Таким образом, штамм К.pneumoniae 691, несущий плазмиду 120 МО, обладающий адгезивной и цитотоксической активностью, диссеминировал во все органы и кровь морских сьинок, вызывая в них выраженные патоморфологические изменения. Причем при перо-раяьном заражении клебсиеллы данного штамма диссеминировали в легкие, печень, селезенку, почки, мезентериальные лимфоузлы и тонкую кишку уже на 1-е сутки, в кровь - на 3 сутки после заражения. Максимальные патоморфологические изменения при перо-ральном заражении наблюдали в кишечнике на 3-5 сутки.

При интраназальном заражении наблюдали диссеминацию во внутренние органы и крозь на 3 сутки, при этом максимальная концентрация клебсиелл в различных органах была в 1,2-1,5 раза выше, чем при пероральном заражений. Гистологические исследования позволили выявить Солее тяжелые поражения внутренних органов морских свинок при интраназальном заражении. Так, небольшие очаги воспалительной инфильтрации выявляли в легких у*е на 1-е сутки, на 3-й сутки в легких обнаруживали двустороннюю очаговую пневмонию с максимальными изменениями в области нижних долей, у одного животного - с фокусом некроза, при этом в пораженных участках отмечали большое количество бак^е-

рий в виде палочек, располагающихся по периферии, выявлено резкое расширение синусов селезенки на 3 сутки и умеренная гиперплазия лимфатического аппарата кишечника с расширением В-зависимых светлых центров на 5 сутки. На 5 сутки после заражения наблюдали также массовую гибель животных (до 577.), зараженных штаммом 691 иктраназальна.

Таким образом при интраназальном заражении имела ие^то диссеминация клебсиелл в более высоких концентрациях, выражении« патпипгл-шпгичяскив изменения и высокая летальность,

UOli ОШОПСППП vunl.vik witwiniv^ In > .

обладающим энтеротоксигенной активностью (LT), слабоььраленной адгезивной активностью, несущего пдазмиды с и.и. 2,6 и 96 МО. практически не выявляли диссеминации бактерий в органы животных. При пероральном заражении клебсиеллц персистировали в тонком кишечнике, вызывая распространенный энтероколит с очаговой кейтрофилькой инфильтрацией слизистой оболочки, десква-мацией эпителиальной выстилки, отеком и полнокровием, максимально выраженным на 3 сутки.

При интраназальном заражении наблюдали диссеминации jaicS-сиелл во все внутренние органы на 3 сутки с максимальной концентрацией в легких (2,4 Ц;К0Е/г). Однако, на & сутки после заражения их высевали только из легких (1,7 IgKOF/r) и из тонкой кишки (0,2 IgKOE/r). Максимальные патоморфологические изменения были выявлены в легких на 1-е сутки после заражения в вале очаговой пневмонии с преимущественной гранулоцитарной реакцией и примесью макрофагов.

Гаким образом, при заражении морских сыиюк штаммом 17 144 набятали выраженную зависимость локализации инфекционного процесса от пути инфицирования.

Сравнительная характеристика клиинческих ытзммов Прием

mtmiae в саяаи с их ахиаяагнчвскни апачсш:сц.

Изучение штаммов К.pneumoniae, выделенных от детей разного возраста в двух стационарах С-Петербурга показало, что

опасность возникновения клебсиеллезной инфекции наболит»:» ь прямей ззьисимости or возраста больного, характера it тяжести Рояникнсв^ние клеб^ио.мезной инфекцией ч«к> всего

нзйлпдается у детей первого месяца жизни, родившихся с разной степенью органных поражений г иммунодефицитных состояний. . Показано, что риск инфицирования К.pneumoniae существенно повышается при оперативном вмешательстве, искусственной вентиляции легких, трансфузиокяой терапии и проведении других медицинских манипуляций, приводящих к снижению иммунологической резистентности. Чаще всего наблюдали колонизацию клебсиеллами органов дыхания (54,67.), в ЗОХ случаев - генерализацию инфекционного процесса и бактериемию. Было установлено отягощающее влияние К.pneumoniae на течение и исход различных соматических заболеваний. Оно проявлялось в повышении уровня летальности и увеличении длительности пребывания в стационаре в 2 и более раз.

Серотюшрование по К-актигену клинических штеммов клебсиелл позволило типировать только 31Х испытанных культур, причем эти культуры были мозаичны по антигенной структуре, что не позволило использовать полученные данные для характеристики изученных штаммов.

Ивучение профилей гиазмидньи ДНК 116 клинических изолятов и сопоставление полученных данных с антибиотикоградаами, адгезией и цитотокснчностыо показало гетерогенность плазмид по молекулярной масс«. Пяавмвдой мугаидкости 120 МО <180 kb) обладают 33 (28,4Х) изолированных культур, плазмидой 65 MD - 29 (25%), сочетание плазмид 40 и 105 МО выявлено у 35 (30%) изученных штаммов. В 6 случаях было обнаружено изменение профиля плазмидньк ДНК у культур, выделенных от одного ребенка в динамике Оолезни. Штаммы, изолированные в более поздние сроки, как правило, были устойчивы к ряду антибиотиков и несли в своем составе две плаамиды с м.м.40 и 105 WD. Учитывая данные рестрикциониого анализа шшо предположить циркуляцию в стационаре внутригоспнталъных плазмид 40 и 105 Ш.

При изучении конкурентных взаимоотношений клинических штаммов шебсиелл и дактобащш было выявлено 2 штамма Lactobacillus (L.plantamm 38 и L. ferment™ 26), обладающих выраженным антагонистическим действием на К.pneumoniae. Данные штаммы предложены для дальнейшего изучения в качестве перспективных препаратов-проОиотиков, используемых для профилактики и лечения слебсиеляеаных инфекций.

BUBOJDJ:

1. Среди 297 клинических изолятов К.pneumoniae выявлено 20% штаммов, характеризующихся адгезивной и колонизирующей активностью, 47 X - были цитотоксичными, 3QX культур характеризовались способностью к транслокации в кровь и внутренние органы, обусловливая развитие генерализованного процесса.

2. Разработаны модели количественной оценки патогенных "■Н1™" " 'м-^птлгПал iKvii.Tvna клеток НЕр-2, парентеральное

аяпажрний мО(н:Кид utmmjKi . Uvjouvj-Wi^^.w г-•""■Л1"".'

по степени адгезиЕНости, цитотоксичности и инвазии во внутренние органы и ткани инфицируемых животных.

3.Установлено ведущее значение цитотоксичности К. pneumoniae в развитии патоморфологическик изменений, выявляемых как на экспериментальных моделях клебсиедлевной инфекции, так и при исследовании структурных изменений на секционном материале.

4. Впервые показана циркуляция в детском стационаре патогенных штаммов К.pneumoniae, несущих плазмиди мугаидности 120 MD, адгезивной (55 MD) и цитотоксической (40 MD) активности.

5. Показана возможность использования профиля плазмидкой ДНК К.pneumoniae и их рестрикционного акаяива для выявления внутригоспиталышх плазмид. К внутригоспитальным плазмидам можно отнести плазмиду цитотоксичности 40 MD и плазмиду 105 MD, несущих маркеры полиантибиотикорезистентности.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Hospital Plasmld Coding for Drug Reslstans and Cltotoxltl to HEp-2 Cells//Abstr. of the 17-th Internashlonal Congress of Chemotherapy.-No.131.-Berlin.-1991 (co-autors Kalnin K.V., Glatman L.I., Tereohov A.A., Anklrskaya A.S., Tseneva G.Ya.).

й.Плазмида резистентности Klebsiella pneumoniae, контролирующая цитотоксическую активность/Лйурн.микроби-ол.-1992.-N2.-C.12-14 (соавт. Калнин К.В., Глатман Л.И., Бондаренко В.М., Терехов А.А., Ценева Г. Я.).

З.Частсга встречаемости и характеристика штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных при инфекциях новорозденных//1урн.-микробиол.-1993.-N5.-С.18-22 (соавт.Ценева Г.Я., Бойков С.Г., Калнин К.В., Мандршо Ф.И.).

4.Проблема патогенности клебсиелл и вопросы лечения влебсиед-леэа//Твв.докл.научн.-пракг.конф. к 70-летио СПб НИИЭМ им. Пастера "Актуальн.нробл.инфекцион.патологии".-СПб,1993. -Ч.2.- С.66 (соавт.Руднев И.А., Штутина Е.А., Ценева Г.Я.).

6.Using of plasmld parameters of К. pneumoniae for the estimation of population heterogeneity In the neonatal are units// IX Mediterranean Congress Chemoter. .Mllano, Italy.-1994.-P.17 (co-autors Kalnin K.V., Glatman L.I., Tseneva G.Ya.).