Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности некоторых биологических свойств штаммов Escherichia coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности некоторых биологических свойств штаммов Escherichia coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями"

На правах рукописи

Бишлов Фапиль Ca шмович /

ОСОБЕННОСТИ НЕКОТОРЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ С ИНФЕКЦИОННЫМИ ОСЛОЖНЕНИЯМИ

03 00 07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени капли laid медицинских наук

□ОЗОБЭБТВ

Челябинск - 2007

003059578

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусолоши и иммунологии Государс!венного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федеральною агентства по здравоохранению и социальному развитию» и в лаборатории молекулярной биологии и биотехнолен ии Института биохимии и 1енетики Уфимского научного цешра Российской Академии наук

Научный р\ доводите 1ь

доктор медицинских наук, профессор Туигунов Марсель Маратович Официальные оппоненты

доктор медицинских паук, профессор Бурмистрова Александра Леонидовна доктор биологических на) к, профессор Каргашова Ольга Львовна

Ведущая организация

Институт экологии и генетики микроорганизмов УроРАП, г Пермь

Защита состоится « ;¿с'/; > '_ 2007 г на заседании

диссертационного совета Д 208 117 03 при I ОУ В1Ю «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу 454092, г Чечябинск, 5 ч Воровского, 64

С диссертацией можно ознакомиться в биб [потеке ГОУ ВПО «Чечябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальном) развитию»

Автореферат разослан « » о':.;?/:/.. _2007 г

Ученыи сскрс!арь диссертационного совста

доктор медицинских на) к, профессор /2/Р Телешова Л Ф

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Одной из актуальных проблем современной онкологии является разработка эффективных методов профилактики и лечения инфекционных осложнений [Дмитриева Н В и соавт 2001, Волкова 3 В , 2005, Boogaerts М А , 1995], поскольку это связано повышением риска присоединения инфекционно-воспалительных осложнении бактериальной природы у онкологических больных В основе механизмов развития инфекционных осложнений, по мнению многих исследователей, лежит угнетение иммунной системы, повреждение естественных защитных барьеров организма, наличие обструктивных изменении, интоксикация и обширные оперативные вмеша1ельства, часто сопровождаемые массивной кровопотерей [Смоляпская A3, 1986, 1упицын НН, 1999, Дмшриева HB и соавт 2001, Митрохин С Д , 2003, Волкова 3 В , 2005]

В спектре осложнений, наблюдаемых у онкологических больных, бактериальные инфекции встречаются примерно в 50% случаев и часто носят хронический рецидивирующий характер и являются причиной ранней гибели больных [Беляков В Д , 1989, Orskov 1, 1995, Hilah F , 2000]

В последние годы произошли значительные изменения в спектре возбудителен, вызывающих инфекционные осложнения у онкологических больных Но данным литера1-уры известно, что в 60-70-х годах прошлого стотетия возникновение инфекционных осложнений у онкологических больных было обусловлено грамположительпыми бактериями, в частности стафилококками и стрешококкачи, а в настоящее рремя преобладаю! условно-патогенные 1рамотрицательные зптеробактсрии (кишечные палочки, синеишипыс палочки, протеи, цигробактсры эшеробактеры, серрации, клебеие ьчы) [Смочярская А 3 , 1986, Дмитриева Н В , 2001, Ахдюва PK, 2003, Кассичь HB, 2006] Особый ингерсс в изучении причин инфекционных осложнений у онкологических бочьпых заслуживает Escherichia coli, которая, будучи кишечным комменсалом, является частой причиной инфекций кишечного тракта, мочевыделительной и дыхательной систем, ЛОР-органов, кожи и мягких тканей [Беюбородов В Ь , 2000, Бондаренко В М , 2003, Яковлев С В , 2004, Johnson J, 2003]

По мнению многих исследователей Е coli, выделенные при инфекционных процессах у онкологических больных несут комплекс генетически

детерминированных кластеров (pap, hly, Ith, stx, eae, ehxA, astA, eaf plasmid, bfp), локализованных в структурных элементах хромосомной природы и в конъюгативных плазмидах, и являются этиологически значимыми [Мавзютов АР, 2001, David G, 1998, Suh J-K, 1998, Yvonne ML, 2004] В связи с этим, возрастает интерес к изучению этиологической роли условно-патогенных энтеробакггерий, в частности Е coli, при инфекционных осложнениях у онкологических больных

Чувствительность к развитию инфекционного процесса связана не только с изменением иммунно1 о статуса opi анизма, но и с изменением биологических свойств бактериальной флоры [Воробьев АА, 2003, Ахатова PK, 2003] Поэтому для эффективного лечения больных с осложнениями бактериальной природы помимо поиска новых эффективных антибактериальных препаратов возникает необходимость одновременного выяснения биологических свойств выдетенпых бактерий, кохорые позволяют в каждом конкретном случае определить этиологическую причинность возбудителя в инфекционно-ассоциироваиных процессах [Булгаков АК, 2001, Mellata M , 2003] Особенно большое внимание заслуживают клоны микроорганизмов с множественной лекарственной резистентностью, которые одновременно могут обладать комплексом факторов патогенности Расхождения результатов в изучении генетических детерминант и феногипических признаков у Е coli, требуют более детального рассмотрения этих аспектов в исследовании этиологической значимости возбудителей инфекционных осложнений у онкологических больных

Исходя из выше из юженного, возникает насктельная необходимость проведения комплексных исследований, направленных на профилактику и лечение инфекционных осложнений у онкотогических больных, на основе изучения некоторых биологических свойств условно-патогенных энгеробактерий, в частности Е coli

Цель исследования

Провести изучение некоторых биотогичсских свойств бактерий Е coli, выде тенных у онкологических больных при инфекционных осложнениях Задачи исследования 1 Изучить частоту встречаемости штаммов Е coli при инфекционных осложнениях у онкологических и неонколад ичсских больных

2 Дать сравнительную характеристику некоторых биологических свойств штаммов Е coli, выделенных от онкологических и неонкологических больных с инфекционными осложнениями

3 Определить спектр лекарственной устойчивости выделенных штаммов Е coli и провести поиск перспективных антибактериальных биологических препаратов, на примере поливалентных фагов

4 Изучить природу генетических детерминант, контрочирующих адгезивную, 1емо1итичсскую, LT-энтерогоксигенную акгивносги Е coli, выдетенных от онкологических и неонкологических больных с инфекционными осложнениями различной локализации

Научная новизна

Изучение микробного пейзажа, выделенных микроорганизмов, показало превалирование этнологически значимых штаммов Е coli у онкологических больных при инфекционных осложнениях

Клинические штаммы баюерий Е coli, выделенные от онкологических больных с инфекционными осложнениями обладают, широким спектром лекарственной устойчивости

Штаммы бактерий Е coli, выделенные от онкологических больных при инфекционных осложнениях, чаще обладали персистирующими (AJIA, АИА, АКА), ад1езивной, ЬГ - энтеротоксигенной, а-, тиот - зависимой гемолитической, лецитиназной активностями, что доказывает их этиологическую значимость

Гены адгезивности (рарС), ЛТ--штеротоксигенной (IthB), а-гемолитической активностец (hlyA) у Е coli вчодят в состав «островов натогенности» и локализованы на хромосомах и плазмидах Детекция юнов вирулентности показала превалирование час гош их встречаемо;, у штаммов Е coli, выделенных от онкологических бо 1ьных при инфекционных оевджнениях, чем у неонкологических больных

Штаммы Escherichia coli №280 и Escherichia coli №281, выделенные от онкологических больных с инфекционннми осложнениями в ассоциации с Serratia marcacens и Staphylococcus aureus обладающие комплексом факторов патогенности, бьии депонированы в Ф1 УН ГНИИСК им Л А Тарасевича (справки №01 - 07/472 oi 13 12 2005i и №01 - 07/473 or 13 12 2005i ) и запатентованы в Ф1 У ФИПС (патенты №2293764 и №2293765 от 26 01 2006)

Практическая и теоретическая значимость

Отработаны оптимальные подходы выяснения этиологической значимости бактерий Е сок, выделенных от онкологических больных при инфекционных осложнениях, которые внедрены в работу бактериологической лаборатории Республиканского онкологического диспансера Опредетение генетических маркеров вирулентности у бактерий, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями, позволяют дифференцировать патовары среди условно-пагогенной флоры и решить вопрос необходимости назначения эффективной антибактериальной терапии В качестве антиэшерихиозиою препарата рекомендован «Поливалентный пиобаглериофаг жидкий» произволе 1ва ФГУП НПО «Микроген «Иммунопрепарат» г Уфа Депонированные в ФГУН ГНИИСК имени JIЛ Тарасевича штаммы Е coli могут быть испотьзованы в качестве эталонных культур и суперпродуценгов термолабильною JIT - онтсротоксина при получении биологических препаратов (сывороток и анатоксинов)

Положения, выносимые на защиту.

1 Штаммы бактерий Е coli чаще встречаются у онкологических больных при инфекционных осложнениях, чем у неонкологических больных, и обладают более выраженной адгезивной, антилизоцимнои, антиинтерфероновой, антикомплементарной, JIT - энтеротоксигенной, а-, тиол-зависимой гемолитической, прогистоцидной активностями и вирулентностью

2 У штаммов Еcoli генетическими детерминантами вирулентности являются структурные этементы хромосомной природы, a JTT - энтеротокешенности -конъюгативпая птазмида массой 60 МДа

3 «Поливалентный пиобактериофаг очищенный жидкии», выпускаемый ФГУП «НПО «Микроген» фитиал «Иммунопрепарат» г Уфа является перспективным антиэтерихиозным биологическим препаратом

Апробация работы

Диссертация обсуждена на совместном заседании кафедр микробиологии, вирусологии и иммунологии БГМУ, общей гигиены, биологии и медицинской генетики, инфекционных болезней с курсом эпидемиологии, ЦПИЛ БГМУ, ведущих научных сотрудников ФГУП НПО «Микроген» филиал «Иммунопрепарат», научных

сотрудников лаборатории мопекулярной биологии и биотехнологии Института биохимии и генетики УНЦ РАН и правления Башкирского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Уфа (2007) Материалы диссертации доложены на Всероссийской научной конференции с международным участием «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке разработка производство и применение», посвященная 100-летию «Иммунопрепарат», г Уфа (2005), на 70-й юбилейной итоговой Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины» Уфа (2005), на VI Общероссийской научной конференции с международным учасшем «Успехи современною естествознания», «Дагомыс» г Сочи (2005), на X международной научной конференции «Здоровье семьи-ХХ1 век», Бангкок-Патайя, Таиланд (2006), на 4-й ежегодной конференции «Инфекции и сопроводительная терапия в онкологии» Москва (2006) Внедрение результатов в практику

Материалы исследований, освещающие биологические свойства штаммов Е colt и генетический контроль факторов пато1 енноети, внедрены в практические и лекционные курсы на кафедре микробиотогии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО «БГМУ» Росздрава и в работу бактериологической лаборатории Республиканской клинической больницы им Г Г Куватова Публикации

Но материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 127 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 9 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего 221 источников, из них 101 отечественных и 120 иностранных авюров и приложения Работа иллюстрирована 17 рисунками, 15 таблицами

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Работа была выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» (ректор чл -корр РАМН, д м н Гимербулатов В М ), в лаборатории молекулярной

s

биологии и биотехнологии Института биохимии и генетики УНЦ РАН (директор профессор, д б н Вахитов В А )

Объектом исследования бьпи 56 штаммов Е coli, выделенные от 148 онкологических больных с инфекционными осложнениями и 67 культур от 152 неонколо! ических больных с гнойно-воспалительными заболеваниями В качестве контроля были использованы 10 штаммов Escherichia coli, выделенных от онкологических больных Биохимическую идентификацию культур проводили с использованием тест - систем «Enterotcst» фирмы «Lachema» Чехия, содержащей ячейки с высушенными питательными средами и на компьютерной биохимической тест-системе типа API фирмы «ВюМегиюх» А-пезивную активность изучали в реакции гемагглютинации с эр!ггроцита\ш различных животных, птиц и цыпленка (Габидуллин ЗГ и соавт, авюрское свидетельство №1312098, 1987), а -гемолитическую активность бактерии изучали п>тем посева на МПА, содержащий 5% суспензию эритроцитов кролика (Габидулчин ЗГ рац предл №168, 1978), тиол-зависимый гемолизин определяли путем посева суточных агаровых культур на среду, содержащую цистеин и эритроциты кролика (Appclbaum Р С , Prozecky О W ,1973), определение лецитиназной активности проводили на желточном агаре Чистовича (1961), аитилизоцимную активность (АЛА) штаммов определяли по методу Бухарина О В и соавт (1984), антиинтерфероновую активность (АИА) исследовали по методу Соколова BIO и соавт (1990), изучение ангикомплементарной активное™ (АКА) проводили по методу Бухарина OB и соавт (1992), изучение антибиотикочувствитетьности выделенных культур проводили с помощью дисков в соответствии с инструкцией МЗ СССР (1984), допотнительно использовали питагетьньтс среды с определенной концентрацией антибиотиков по Дж Миллер (1976), фагочувсгвигельность изучали по общепринятым методам, протисгоцидпую активность изучали на инфузориях туфетьках по Ппексеву XJI (1987), вирулентность т vivo изучали методом интраназалыюго заражения мышей массой 1618 I по Войно-Ясснецкой (1957), определение токсигенности культур проводили на изолированной петле тонкого кишечника кролика и в Tecie «огех лап» мышей (Вартанян Ю II и соавт 1978), кожно-пекротическую пробу проводили по методу Гимранова МГ (1967), выявление конъюгативных плазмид проводили по методическим рекомендациям Мамонтова ТН и соавт (1983) Лабораторные

животные белые мыши (615шт), кролики (10шт), полученные из питомника лабораторных животных ГУП «Иммунопрепарат» г Уфа, а так же кролики из питомника БГМУ, содержались на стандартном рационе вивария Амплификацию фрагментов генов вирулентности (hlyA, рарС, IthB) проводили стандартным методом полимеразно-цепной реакции с подбором праимеров по данным «Genbank» (www ncbi nih gov~) и использования пакета прикладных программ фирмы Lasergene (DNAStar Inc ), для статистической обработки результатов применяли общепринятые формулы по Ашмарину ИП и Воробьеву А А (1962) и пршрамму Statistica for Windows 5 0

Результаты исследовании и их обсуждение Анализ частоты обнаружения микроорганизмов показал, чю штаммы Еcoli выделяются чаще от онколем ических больных с инфекционными осложнениями, чем от неонкологических больных Анализ данных микробного пейзажа выделенных микроорганизмов, показал, что от онкологических больных чаще выделялись условно-патогенные грамотрицательные энтеробакгерии, чем от неонкологических больных с гнойно-воспалительными процессами В частности превалировали Е coli, Proteus spp, Klebsiellae spp, Citrobacter spp, а также больую долю составляли бактерии родов Stafylococcus, Streptococcus и грибов рода Candida Выделенные клинические штаммы Е coli, на поверхности МПА в течение суток вырастали в виде полупрозрачных колонии с гладкой поверхностью и ровными краями размером окочо 3-4 мм На среде Эндо они давали рост в виде красно-малиновых колоний с металлическим блеском

При изучении биохимических свойств на "Enterotest" фирмы «Lachema» быто выявлено, что все изучаемые к> льтуры относились к Е coli

Бактерии Е coli обладают весьма пестрой антигенной структурой Для внутривидовой дифференциации штаммов разработаны ряд схем, основанных на изучении О-тсрмостабилькых, К- и Н-тсрмолабильных антигенов Изучение антигенной нринадтежности мы проводили путем применения коммерческих поливалентных лиерихиозных ОК-сыворогок и типовых О-сывороток (НПО «Биомед») в реакции агглютинации на стекле Реакцию агглютинации ставили на 56 штаммах, выделенных от онкологических и 67 культурах неонколотических больных с инфекционными осложнениями По проведенным исследованиям реакции

агглютинации поливалентными сыворотками можно сказать, что наибольшую эпидемиологическую значимость в развитии инфекционных осложнений у онкологических больных представляют ОКА и ОКЕ серогруппы, тогда как у неонкологических бочьных - ОКА и ОКД серогруппы Возможно, шгаммы этих серогрупп являются доминирующими и обладают необходимым комплексом факторов пато! енности для развития инфекционного процесса

При изучении реакции аплюгинации с типовыми эшерихиозными О-сыворотками было выявлено что среди штаммов Е coli, выделенных от онкопогических больных с инфекционными осложнениями, 12 штаммов относились к серогруппе Об, 8 - к 08, 4 - к 080, 3 - к 025, по I - к 0128ас, 085, Olli 0119 соответственно, тогда как среди культур Е coli, шотированпых от неонкологических больных, 10 штаммов относились к серогруппе 055, 8 - 085, 5 - к 025, 4 - 0128ав, 2 - к 08, 2 - 06 и 1 к 027 (р<0,05)

Естественный образ жизни большинства микроорганизмов связан со способностью к прикреплению на каких-либо субстратах [Бондаренко ВМ, 1999, Сидоренко С В , 2001, Белобородое В Б , 2002] Учитывая, что у патогенных бактерии первым этапом развития инфекционного процесса является лиганд - рецепторное взаимодействие, обусловтенное адгезией микроорганизмов на специфических рецепторах чувствительных клеток макроорганизма, для выявления адгезинов у бактериальных клеток используют реакцию гемагглютинации с эритроцитами разтичных видов животных и птиц [Габидуллин 3 Г , 1990]

Исходя из этою, мы сочти необходимым провести сравнительное изучение адгезивности Еcoli, вылеченных от опкотогических ботьных и неонкотогических больных В качестве клеток-мишенеи дпч вчявле»ия атп >инов, и вияенени» природы структур бактериальной клетки очредь *ющих у L coli адгезичную активность, использовали эритроциты цыпленка Было выявлено что из 56 культур Е coli, выделенных oi онкологических бо н>ных с инфекционными осложнениями, 41 (73,2±5,9%) обладали способностью давать Д-маннозочувсгвшельную реакцию гемагглютинации (MS), тогда как среди 67 культур Ecoli, изолированных от неоиколо! ических больных, 31 (46,2±6,1%) давали положительную реакцию (р<0,05) Изучение Д-маннозорезистентнои re\iaiглюгинирующей активности (MR) показато, что среди 56 штаммов Е coli, выделенных при инфекционных осложнениях от

онкологических больных 32 (57,1±6,6%) обладали этим свойством, в то время как из 67 культур, изолированных от неонкологических больных лишь 24 (35,8±5,8%) штамма вызывали MR - гемагглютинацию (р<0,05)

Одновременно нами была проведена оценка адгезивной активности штаммов Е coli в опытах на формалинизированных эритроцитах 1(0) группы крови человека, при микроскопическом учете результатов в соответствии с методом, описанным Брилисом В И и соавторами (1986)

Результаты исследования среднего показатечя адгезивной (СПА) активности показали, что среди 56 штаммов Е coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями 23 (41,1±6,5%) культуры проявляли высокии уровень адгезивной активности, 12 (21,4±5,4%) - средний, 6 (10,7±4,1) % - низкий и 15 (26,8-ь5,9%) - не проявтяли адгезивную активность тогда как среди 67 культур, выделенных от неонкочогических больных 10 (14,9±4,2%) штаммов проявляли высокий уровень адтезивной активности, 11 (16,5±4,5%) - средний, 10 (14,9±4,2%) -низкий и 36 (53,8±6,1%) - не проявили адгезивную активность (р< 0,05)

Для преодотения иммунобиологического барьера многие бактерии приспособились продуцировать ряд продуктов жизнедеятельности, которые способствуют их проникновению, выживанию и колонизации в тканях макроорганизма [Бухарин О В , 2005, Yvonne М Lee , 2004] Исследования последних лет показывают, что к числу таких продуктов относятся бактериальные гемолизины [Ьондаренко В М, 1986, Сидоренко С В , 2002, Jorgenson, S Е , 1975, Mackraan, N , 1984] Функционально опредспяют несколько групп тсмочизинов, среди которых у энтсробакчерии превалир>ет а - , и тиотзависимый гемолизины, а также -энтерогемолизин [Бондаренко ВМ, 1997, Beutin L 19881 Данные по изучению а-гемолизина представлены на рисунке 1, где видно, что а - 1емочитическои активностью чаще обладают штаммы, выделенные от онкологических больных

p Ecnli, выделенные от отологических больная 0 vuti в ы де;;Mu от нсокн логических. болышх

иыеок&я средняя слабая гемо;гитн чески

гемолитическая гемолитическая гемолитическая неактиияые

»КТНВНОСТЪ РКГИИНОСТЬ активность ыггзммы

Рис. 1. и- гемолитическая активность штаммов E.coli (р<0,05).

Наряду с а - гемолизином некоторые бактерии кишечной группы синтезируют тиол-зависямый гемолизин. который визирует эритроциты в присутст вии цистеина и может быть использован при изучении патогенного потенциала возбудителя (Габидуллин З.Г., 1990; Tomita Т, 1996]. Среди 56 штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных 29 (5 i ,8±6,6%) штаммов обладали способностью синтезировать тиол-зависимый гемолизин, в то время как среди 67 культур E.coli, выделенных от нсонкологических больных - 26 (38,7i5,9%) (р<0,05).

Лецигиназпая активность - это способность бактерий растворять лшшдные мембраны, наряду с гемолитическими и протсол ¡этическими активностями м икроорганиз м ов, относится к факторам патогенное™, в связи, с чем является важным показателем вирулентности высеваемых клинических штаммов условно-патогенных энтеробактерий, в том числе и E.coli [Ильинская Ь.В.. Керащрва С.И., 1979]. Сравнительный анализ между двумя труппами E.coli показал, что из 56 штаммов, выделенных от онкологических больных 24 (42,9^6,6%) обладали лецитиназной активностью, тогда как среди 67 культур, изолированных от неонкологических больных этот признак встречался у 19 (28,4±5,5%) культур (р<0,05). .

В целях сохранения возбудителя, находящегося в организме, от бактерицидных факторов сыворотки или фагоцитов микробная клетка располагает также средст вами

дистанционного действия, которые представляют многочисленную группу секрегируемых бактериальных субстанций, направленных на инактивацию механизмов иммунитета [Бухарин О В , 2005]

Результаты исследований показали, что среди 56 штаммов Е coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями 17 (30,4±6,1%) - обладали высокой AJIA, 7 (12,5±4,4%) - средней АЛА, 6 (10,7±4,1%) - низкой АЛА, в ю время как из 67 культур Е coli, выделенные от неонкологических больных 10 (14,9±4,4%) -обладали высокой АЛА, 8 (11,9±4,0%) - средней AJIA, 9 (13,4±4,2%) - низкой АЛА (р<0,05)

«Антиингерфероновая» активность (АИА) - эю автономное свойство микроорганизмов, предназначенное для целенаправленного, специфического инакгивирования бактерицидной фракции человеческого лейкоцитарного интерферона В результате исследований АИА было выявлено, что штаммы, выделенные от онкологических больных, чаще обладали высокой АИА, чем культуры, выделенные от неонкологических больных, что свидетельствует о высокой антиинтерцидной активности и значимости этого фактора патогенности при оценке вирулентности этих бактерий Так, среди 56 штаммов Е coli, выделенных от онкологических больных АИА проявлялась у 27 (48,2±5,1%), в то время как у 67 культур, изолированных от неонкологических больных тгот признак выявлялся у 22 (32,8±3,1%) культур (р<0,05) что говорит о частой встречаемости АИА у штаммов Е coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями

Антикомплементарная активность (АКА) - признак, обеспечивающий персистирование микробной клетки и характеризующий способность инактивировазь комплсмеш Изучение частоты встречаемости АКА среди клинических штаммов бактерий Е coli выделенных от онкологических больных при инфекционных осложнениях, показало, что из 56 штаммов антикомптементарной активностью обладали 34 (60,7-6,5%) клинических штамма, в го время как среди штаммов Е coli, выделенных от неонколо1ических больных jtot признак присутствовал у 27 (40,3*4,9%) ипаммов (р<0,05)

По мнению некоторых авторов, вирулентность Е coli, как условно-патогенного представителя нормальной микрофлоры, тесным образом связана со способностью продуцировать токсин и токсические вещества [Goyal J ,1987, May А К , 2000] Путем

и

интраназального заражения белых мышей были изучены все штаммы Е colt, выделенные от онкологических и неонкологических больных Из 56 исследованных штаммов, изолированных от онкологических больных 33 (57,8±6,59%) шгамма проявляли вирулентность, причем из них 3 (9,1±3,84%) - высокую, 4 (12,1±4,35%) -среднюю и 26 (78,8t5,46%) - низкую, в то время как среди 67 кульгур, выделенных от неонкологических больных 10 (15,0±3,7%) штаммов проявляли слабую вирулентность, 57 (85,1±3,9 %) штаммов были авирулентными (р<0,05)

По данным некоторых исследователей [Габидуллин ЗГ , 1990, Туигунов ММ, 2003] среди устовно-патогенпых энтеробактерий, к которым относится и Ecoh, существует прямая корретяция между вирулентностью и способностью продуцировав LT- энтеротоксин В связи, с чем, мы провели сравнительное изучение способности продуцировать LI - энтеротоксин у штаммов Ecoli, вылеченных от онкологических больных с инфекционными осложнениями различной локализации и кучьтур Ecoh, выделенных от неонкочогичьхкил больных При этом мы использовали тест отека лап белых мышей (плантарный тсст) [Вартанян ЮП, 1978], где было выявлено, что из 56 культур Е coli, выделенных от онкологических больны! с инфекционными осложнениями 16 (28,57±6,14%) проявчяли JIT-энтеротоксигенную активность, в то время как из 67 штаммов Е coli, изолированных от неонкологических больных 11 (16,41±4,52%) обладали огим свойством, чю необходимо учитывать при оценке этиологической значимости клинических штаммов (р<0 05)

LT-эитеротоксин продуцирующую способность у клинических шшммов Ecoh, также проводили на модели лигированной петли тонкого кишечника кролика Резучьтаты показали, что центрифугаты бучьонпых культуры Е coli при введении в просвет тонкого кишечника, вызывали накопление экссудата и отношение V/L (объема экссудат к дтине лигированного участка) варьировала от 1,1 до 1,6, которое исчезало при нагревании супернатанта бучьочных культур при 56°С, что являлось подтверждением нашчия 1Т-энтеротоксич продуцирующей способности Было выявлено, чю из 56 культур Ecoh, выделенных oi онколо!ичес^их бо гьных с инфекционными осложнениями 22 (39,28±6,52 %) штамма взвывали накопление экссудат в просвете тонкою кишечника крочика V/L 1,1-1,3, в то время как у 67 кулыур Ecoh, изолированных от пеонкологических больных 11 (16,41±4,52%) штаммов обладали способностью к накопчению экссудата WL 1,0-1,2 Необходимо

также отметить, что из всех исследованных культур 4 штамма, выделенные при кишечных инфекциях, вызывали накопление серозно-геморрагического экссудата Этот факт некоторые исследователи объясняют наличием у штаммов способности синтезировать новый тип гемолизина-энтерогемолизин

При введении центрифугага прогретой (при 5б°С) бульонной культуры накопление жидкости не наблюдалось, что свидетельствовало о термолабичьности токсина При введении гретых (56°С) центрифугатов, у 5 штаммов Е coli, продуцирующих высокоактивный JI 1-энтеротоксин, соотношение V/L уменьшилось в двое (до 0,6), а ценгрифугаты 8 штаммов Ecoh, продуцирующих ЛТ-энтерогоксин гретых при 85°С в течение 10 минут и вовсе не вызывали накопление жидкости и соотношение V/L составило не более 0,4

Еще одни Vi давно известным способом детекции токсических субстанций условно-пагогенных энтеробактерий является кожно-некротическая проба Результаты сравнительного изучения дермато-некротического действия штаммов Ecoh выявило, что культуры выдетенные от онкологических больных были способными вызывать некроз кожи и формирование гнойника у кроликов в ботее короткие сроки с характерной тяжелой клинической картиной, в отличии от культур, изолированных от неонкологических больных

Таким образом, проведенные исследования на биологических моделях (интраназалыюс заражение, отаптарныи тест, петля тонкого кишечника кролика, кожно-некрошческая проба) показали, что штаммы Е coli, выделенные от онкотогичсских ботышх чаще обладали этими свойствами, чем культуры, изолированные от неоикотогичсских больных

Проведенные нами исследования на различных биологических модетях экспериментальной инфекции показали, чю интрачазалыюе заражение, птантарный ieci, петля юнкото кишечника кролика, кожно-пекрогическая проба требуют значительною копичества эксперимешальных животных и не всегда выполнимы в условиях бактериологической лаборатории

В связи с этим мы испотьзовати более простой и доступный протистоцидньш тест для выявления вирулентных свойств Е coli Результаты исследований показали, что из 56 штаммов Е coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями, 16 (28,5±6,0%) обладали протистоцидной активностью, тогда как

среди 67 культур, выделенных от неонкологических больных этот иризнак встречался у 13 (19,1±4,8%) (р<0,05) Наибольшую вирулентность на инфузориях туфельках оказывали штаммы, синтезирующие гемолизины, под действием которых замедлялось и останавливалось движение простейших Так из 29 штаммов, обладающих протистоцидной активностью II (37,9±2,3%) штаммов продуцировали а - гемолизин, б (20,7±1,4%) - тиол-зависимый гемолизин, 4 штамма обладали способностью продуцировать LT-знтероюксин На наш взьтяд, возможно, это связано с тем, что гемолизины и токсины формируют микропоры на клеточной мембране и нарушают полупроницаемоегь мембраны для ионов, чю приводит к осмотическому шоку простейших Такая биологическая активность в отношении простейших сопряженно сочетается и гибелью интраназально зараженных лабораторных мышей, что может слулсить дополнительным показателем в бактериологических лабораюриях при оценке этиологической значимосш выделенных штаммов

Широкое и не всегда рациональное использование антибактериальных препаратов в медицинской практике способствует уменьшению чувствительных и увеличению резистентных штаммов микроорганизмов Успехи антибактериальной терапии и профилактики у онкологических больных зависят от чувствительности микроорганизмов к назначаемым антибактериальным препаратам [Дмитриева Н В и соавт, 2001, Сидоренко СВ, 2003, Эйделышейн MB, 2001] Имеющиеся литературные данные о множественной лекарственной устойчивости бактерий Е coli не подвергаются сомнению [Ьелобородов В Б и соавт 2002, Яковлев С В 2004, Bischoff К М et al 2004], тем не менее, знаьие спектра лекарственной устойчивости являе1ся важным в плане выбора этиогропного лечения

Анализ изучения ашибиотикеграммы показал, что культуры Ь coli, выделенные от онкологических больных с инфекционными осложнениями, были чувствительными к 15 антибактериальным препаратам у меренно-чуьс тигельными -к 18, и устойчивыми - к 16 Штаммы Е coli, изо шрованные от неонкологичсских больных, были чувствительными к 20 антибактериальным препаратам, умеренно-чувствительными — к 19, и усюйчивыми - к 10

Среди штаммов Е coli, выделенных от онкологических больных и неонкологитсских больных, максимальная резистентность была ошечена к эритромицину, олеандомицину, ристомицину, бепзилпенициллину, ампициллину и

оксациллину, что вероятно обусловлено циркуляцией и селекцией штаммов, продуцирующих различного рода ферменты биодеградации антибиотиков

Поскольку большинство штаммов обладали антибиотикорезистентностью ко многим антибаюериальным препаратам, применяемым в практической медицине, мы сочли целесообразным изучить фагочувствительность к «Поливалентному пиобактериофагу очищенному жидкому» производства ФГУП НПО «Микрогеп» филиала «Иммунопрепарат» г Уфа «Пиобактериофаг поливалентный очищенный жидкий» (pyobacteriophagum polyvalentum purum liquidum) представляет собой стерильную смесь очищенных фипьтратов фаголизатов бактерий стафилококков, стрептококков, клебсиелл пневмонии эгаерихий коли, синегнойной палочки, протея в виде прозрачной жидкости желтого цвета различной степени интенсивности с зеленоватым оттенком В целях использования пиобаетериофага поливалентного очищенного жидкого в лечении инфекционных осложнений у онкологических больных, мы провели изучение фагочувствитсыюсти 56 штаммов Е coli, выделенных от онкологических и 67 культур изолированных от неонкологических больных «Пиобактериофаг поливалентный очищенный жидкий» производства ФГУП «НПО «Микроген» «Иммунопрепарат» г Уфа был любезно предоставлен профессором, д м н Ворошиловой Н Н

Результаты показали, что из 56 штаммов Е сок, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями, 33 (58,9±6,6%) были чувствительными к поливалентному пиобактериофагу, 7 (12,5±4,4%) - умеренночувствительными, 16 (28,6±6,0%) - нечувствительными, в то время как среди 67 штаммов, изолированныл от неоикологических больных 38 (56,7±2,0%) культур оказались чувствительны к этому препарату, 8 (11,9^4,0%) - умеренночувствительными и 21 (31,3±3,1%) -нечувс гви 1 ел ьн ы ми

При проведении сравнитетыюго анализа фагочувствигельпосги штаммов с антибиогикочувствительностью было выявлено, что из 23 (41,1±6,6%) кучыуры Е coli, выделенных от oiikotoi ических (обладающих множественной лекарственной устойчивостью к 14 антибиотикам) 19 (82,6±4,2%) оказались чувствительными к поливалентному пиобактериофагу, 3 (13,0±2,1%) - умеренночувствительными и 1 (4,3±0,2%) - нечувствительным В группе штаммов Е coli, изолированных от неонкологических больных из 20 (29,8-fc5,6%) полирезистентных культур, которые

были устойчивы к 9 и более антибактериальным препаратам, 16 (80±4,0%) были чувствительными к поливалентному пиобактериофагу, 3 (15±2,3%) умеренночувствительпыми, 1 (10±1,1%)- нечувствительными

Данные этих исследований дают основание полагать, что «Поливалентный пиобактериофаг жидкий» может быть использован в комплексной антибактериальной терапии инфекционных осложнений у онкологических и неонколох ических больных, вызванных полирезистенгными штаммами Ecoli Необходимо также отметить, что этот препарат сочетает в себе фа! и к широком) спектру микроорганизмов, что является важным аргументом для его использования при моно - и ассоциированных бактериальных инфекциях, обусловленных устойчивыми к антибактериальным препаратам штаммами

Для подтверждения данных биологических свойств шгаммов Еcoli мы сочли необходимым провести изучение генетических детерминант факторов патогенности выделенных тшаммов В связи с этим мы изучили профиль плазмидной ДНК у штаммов Ecoh, выделенных от онкологических и неонкологических больных и их способности давать MS и MR реакции гемагглтогинации с эритроцитами цыпленка (Габидуллин ЗГ и соавт, АС № 1312098, 1987) Фенотипический признак адгезивности штаммов Ecoli, выделенных как у онкологических, так и неонкологических больных был более выражен в реакции гемагглютинации с использованием эритроцитов птиц Мы отобрали штаммы, обладающие MS и MR i емагглютиниругощеи активностью, и изучили профиль их плазмидной ДНК При эюм 23 штамма оказались бесплазмидными 3 штамма имели 4 нчазмиды (120 МД, 60 МД 3,2 МД, 1,4 МД), 3 штамма - по 3 плазмиды (60МД, 38МД, 1,4МД), 10 штаммов - но 2 плазмиды (120МД, 60МД), 8 штаммов - по 1 птазмиде 3 цпамма (60МД) и (1,4МД), 2 штамма - 40МД Для оценки зависимости адгезивной активности от наличия плазмид мы провели следующую серию опытов по их эчиминированию со штаммами, имеющими плазмиды Тестирование изогенных пар на их способность дава!Ь MS- и MR-реакнии гемагглютинации с эритроцитами цыпленка показало, что штаммы в одинаковой степени аплютинирукн эритроциты шиц Полученные результаты наших исследовании дают нам основание полагав, что генетической детерминантои, контротирующей MS и MR реакцию i ема! i лютинации с

эритроцитами цыпленка у E.coli, возможно являются структурные элементы хромосомной природы.

Для выявлений природы генетической детерминанты, Контролирующей синтез LT- эитеротокейна, были отобраны 2 группы штаммов: первую группу составили штаммы суперпродуценты ЬТ->нтеротоксиио, способные вызывать "»тек лап" мышей 95 мг и более, вторую - культуры, не продуцирующие LT-энтеротоксин и в опытах "отек лайки'' белых мышей разницу давали не более 35 мг, В профиле плаэмидной ДНК у 3 изученных штаммов первой группы было выявлено, что два (173, 587) оказались несущими ллйзмиду 60 МД и 120МД, 1 штамм (26) — 60 и 3,2 МД и I штамм (123) - 60. 40 и 1,4 МД. Среди 6 штаммов второй группы ЩИ, 769, 795. 843, 532. 258) не было выявлено культур, несущих плазм иды массой 60 МД, Опыты но элиминированию плазм ид у штаммов, продуцирующих высокоактивный LT-энтеротоксии, показали, что бесплазм иди ые изогйнные пары токси генных штаммов не вызывали отек лапки у мышей.

В следующей серии опытов изучали возможность конъюгативиой передачи F.nt плазмиды между бактериями E.coli и от E.coli к E.coli KjiRif. В качестве донора брали E.coli (Ent+, Str:, Amp*) и реципиента E.coli (Eni', Sir1 , Amp'). В качестве селективной среды использовали, 2% мяеопетггонный агар, содержащий SOO мкт/мл, стрептомицина и 300 м к г/мл. ампициллина. Во всех комбинациях передачи плазмиды массой 60 МД полученные трансконъюгаты б гл.tu йГюсобны давать «отек лап» 95 МГ и более и обнаруживалась на электрофора рамме (рие.2).

шштяшищт

■s--¡mes- w trn т лт -,

fiO МД-..........

ХромОСОМ КЕМ

ДНК...........

2Ь МД-.....—

14 МД-..........

Рис. 2. Электрофорегра м ма профиля плазм ид пой ДНК и изогениых пар клонов E.coli , способных продуцировать ЕТ-энтеротоксип.

Полученные данные дают нам основание полагать, что генетической детерминантой, контролирующий у бактерий Е coli продукцию LT - знтеротоксина, возможно, является конъюгативная плазмида массой 60 МД, выявляемая у ряда бактерий, вызывающих «отек лай» 95мг и более

Опыты по фенотипическому определению гемолитической активности Е coli указывают на то, что 1емолизины явтяются одним из ведущих факторов патогенности клинических штаммов Для выяснения роли плазмиды, контролирующей гемолитическую активность Е coli, нами был изучен плазмидный профиль а -I емолитически активных культур Исследование проводити на 22 штаммах Е coli, обладающих а - гемочитической активностью, и 6 штаммах, не способных продуцировать а - гемолизин В качестве эталона использовали штамм Proteus vulgaris Rtb-1, обладающий гемолитической активностью и несущий плазмиду с массой 120 МД Результаты исследовании плазмидного профиля показали, что среди 22 штаммов, обладающих а-гемолшической активностью, у 8 - обнаруживалась плазмида массой 120 МД, что указывало на возможную роль данной плазмиды в продукции а-гемолизина

Для уточнения роли 120 МД плазмиды в следующей серии опытов элиминировали у бактерий плазмиду по общепринятым методикам и у полученных клонов изучали профиль плазмидной ДНК При этом клоны 8 штаммов потеряли способность продуцировать а-юмочизин, а клопы штаммов Е coli №661 и Е coli №171 сохраняли свойство продуцировать а-гемолизин Данные этих исследований, на наш вз1ляд, свидетечьствугот о вероятности существования у Е coli генетической детерминанты иной природы, контролирующий продукцию а-гемочизип Не исключено, чю часть штаммов способны продуцировав биологически активные вещества, вызывающие гемолиз эритроцитов, но по с^оеи природе не относящиеся к а-1емочизину

Все наши попытки осуществить конъгативную передачу птазмиды массой 120 МД между бактериями рода Е coli к универсальному реципиенту Е coli K^Rif не увенчались успехом Это, возможно, связано с бочьшой массой плазмиды, контролирующей i емолигическую активность В дальнейшем с целыо конкретизации роли 120 МД нлазмиды в а-гемолитической активности изучали изогениые пары штаммов При этом у большинства гемолитически активных штаммов 22, ¡31, 586 на

2t

фореграмме наблюдали наличие плазмиды массой 120 МД, а у мутантов 22-э, 131-э, 586-э не проявляющих гемолитической активности, плазмиды массой 120 МД не обнаруживались Все эти данные являются дополнительным подтверждением роли 120 МД в а-гемолитической активности бактерий рода Е coli

Резулыаты исследований фрагментов некоторых генов патогенности позволили установить факт превалирования чамогы встречаемости генов рарС (пили адгезии Pap), hlyA (а-гемолизин) и UhB (L Г-энтеротоксин) у штаммов Е coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями Так у штаммов Е coli, выделенных от опколо1 ических больных ген РарС обнаруживался у 21 (37,5Ii6,46%) шгамма, ген hlyA - у 17 (30,35±6,14%), ген LthB - у 13 (23,21±3,67%), в то время как у культур Е coli, изолированных oi пеонкологических больных 1cii РарС обнаруживался 12 (17,9Ь4,68%), ген hlyA - у 11 (16,41±4,52%), ген LthB - у 7 (10,44± 2,31%) (р<0,05) Частота встречаемости комбинации нескольких генов у штаммов Е coli, выделенных от онкологических больных была выше, чем у культур, изолированных от неонкологических больных Вероятно, это обусловлено эколо1 ической экспансией наиболее патогенных сероваров Ecoli у онкологических больных, что необходимо учитывать при оценке этиологической значимости штаммов Е coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями

Совокупность полученных результатов дают нам основание полагать, что от онкологических больных с инфекционными осложнениями наиболее часто выделяются штаммы условно-патогенных энтеробакгерии, в том числе и Е coli, обладающие выраженными свойс1вами адгезивностн, JIT - онтероюксигенносш, а- и тиол-зависимой-гемолитической лецитиназной, антилизоцимноп,

«антиишерфероновоп», антикомплсмснтарной активностями и вирулентностью, что необходимо учитывать при оценке их этиологической значимости Определение феношггаческих и генетических маркеров патогенности Е coli, позволяет дифференцированно подойти к проблемам профилактики и лечения инфекционных осложнении, вызванных условно-паюгенными энтеробактериями При эгом выделенные штаммы F coli от онкологических больных с инфекционными остолгаениями чаще обладали устойчивостью ко многим применяемым в пракшке антибактериальным препаратам, и изучение фагочувствительности выделенных

штаммов к поливалентному пиобактериофагу служит теоретическим обоснованием для его применения при антибактериальной терапии не только моно-, но и ассоциированных инфекций, что является важным аргументом для его использования в практическом здравоохранении

ВЫВОДЫ

1 Штаммы Escherichia coli чаще выделяются от онкологических больных с инфекционными осложнениями, чем от неонкологических больных При этом культуры, выделенные от онкологических больных преимущественно принадлежали к Об, 08, 080, 025 серогруппам, тогда как ннаммы, изолированные от неонкологических больных - к 055, 085, 025, 0128ав что необходимо учитывать при оценке их эгиолотческой и эпидемиологической значимости

2 Штаммы Escherichia coli, изолированные при инфекцнонных осложнениях у онкологических по сравнению с неонко ioi ичсскими больными, чаще обладают выраженной адгезивно», JIT - энтеротоксигенной, а- и тиол-зависимой-1 емолитической, антилизоцимной, «антиинтерфероновой», аптикомплементаряой активностями и вирулентностью

3 Штаммы Escherichia coli, выделенные от онкологических больных, чаще обладают множественной лекарственной устойчивостью и чувствительностью к «Поливалентному пиобактериофагу жидкому» производства ФГУП НПО «Микрогеп» филиал «Иммунопрепарат» г Уфа

4 У штаммов Е coli, выделенных от онкологических и неонкотогических больных с инфекционными осложнениями генетическими детерминантами адгезнвности являются структурные элементы хромосомной природы, продукции LT-эшерогоксина - плазмида массой 60 МД а-гемолшина -хромосома н нлазмада массой 120 МД

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Резулыаш исследований рекомендуется исполтзовать при оценке утиоло1 ичсской значимости штаммов Е coli, вылеченных ог онко югическнх больных с инфекционными осложнениями Изучение фагочувствительносш дают нам основание рекомендовать использование ^Поливалентного пиобатериофага жидкого» (пр-во ФГУП НПО «Микроген» филиал «Иммунопрепарат», г Уфа) для лечения инфекционных осложнений у онкологических больных, вызванных не только Е coli,

но другими микроорганизмами Штаммы Е coli №280 и N°281 депонированные в

ФГУН ГНИИСК имени Л А Тарасовича могут быть исиотьзованы в качестве

эталонных культур при идентификации выделенных штаммов от больных и в

биотехнологии в качестве суперпродуцентов термолабильного энтеротоксина СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Бмалов Ф С Изучение гемолитическои активности штаммов L coli, выделенных у онколо1 ических больных с инфекционными осложнениями / Ф С Билалов, 3 Г Габидуллин, M M Туйгунов, Р X Кудакаева, В И Горшкова, С Г Хасанова / Ж Здравоохранение Башкортостана Спец вып -2005 -№3 - С 321 -322

2 Билалов Ф С Антилизоцимная, антиинтерфероновая активности и некоторые факторы патогенности штаммов Е coli, выделенных от онкологических бочьных с инфекционными осложнениями / Ф С Билалов, 3 Г Габидуллин, M M Гуйгунов, Ю 3 Габидуллин, Э Ф Мамбетова, Р X Кудакаева // Естествознание и гуманизм сб науч работ - Томск, 2005 - Г 2, № 4 - С 81-82

3 Ахтариева А А Изучение влияния термолабильного энтеротоксина некоторых представителей бактерий семейства ENTEROBACTER1ACEAE на лизосомальную активность перитонеальных макрофагов в эксперименте / А А Ахтариева, Э Ф Мамбетова, 3 Г I абидуллин, Ф С Билалов // Здоровье семьи-XXl век матер X международ науч конф - M , 2006 - С 25-26

4 Билалов ФС Протистоцидная активность штаммов Е coli, выделенных у онкологических больных / Ф С Бшалов, 3 Г Габидуллин, M M Туш-упов, Э Ф Мамбетова, H H Гибазов, А А Ахтариева II Фундаментальные исследования -2006 - № 1 -С 102

5 Билалов Ф С, Частота встречаемости бактерий Е coli, выдетенпых при инфекционных осложнениях у онкологических больных / Ф С Билалов, ВI Туйгунова, 3 Г Габидуллин, M M Туйтупов // Перспективы и пути развития неошожной педиатрии, посвященная 120 - летию Общества детских врачей России матер науч -практ конф стран СНГ - СПб, 2006 http //www airspb ru/persp 12 shtml

6 Билалов Ф С Адгезивность бактерий Е coli, выделенных у онкологических больных при инфекционных остожнениях / Ф С Билалов // Ломоносов-2006

магер XIII междуиарод науч конф студентов, аспирантов и молодых ученых -М , 2006 - Т IV - С 490

7 Билалов Ф С Некоторые факторы пагогенности Е coli, выделенных от онколо!ических больных с инфекционными осложнениями / ФС Билалов, ЗГ Габидуллин, М М Туйгунов, Ю 3 Габидуллин, Э Ф Мамбетова, А А Ахтариева, В Г Туйгунова // Известия Челябинского научного центра - 2006 - Г 32, № 2 -С 121-126

8 Билалов Ф С Escherichia coli у иммунокомпроми тированных лиц / Ф С Билалов, М М Туйгунов, 3 Г 1 абидуллин, Э Ф Мамбетова, Р А Амиигв Р Медицинская иммунология -2006 -1 8, № 2-3 - С 332-333

9 Габидуллин 3 Г Харак1еристика свойств, определяющих перснстенцию моно- и ассоциированных культур условно-иагогенных энтсробактерий / 3 Г Г абидуллин, Ю 3 Габидуллин, А А Ахтариева, М М Алсынбаев, Э Ф Мамбетова, М М Туйгунов, Д Т Гашимова, Ф С Билалов, Н Н Гибазов, Р М Ахмадссв, А К Бул1аков // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунобиологии - 2006 - № 4 - С 62-64

10 Пат 2293764 Российская Федерация, МПК C12N 1/00, А61К 39/108 Штамм бактерий Escherichia coli ГЙСК №281, обладающий способностью продуцировать 1ермотабильный ЛТ-энтеротоксин 2006 / Ф С Билалов, 3 Г Габидуллин, М М Алсынбаев и др, заявитель и нагентообладатеть IОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию - №2006105030/13, заявл 26 01 06, опубл 20 02 07, Бют № 5 - 444 с

11 Пат 2293765 Российская Федерация, МПК С12Ч 1/20, А61К 39/108 Штамм бактерий Escherichia coli ГИСК №280, обладающий способностью продуцировать термолабильный ЛТ-энтеротоксин 2006 / ФС Билалов, 3 Г Габидуллин, ММ Алсынбаев и др, заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинскии университет» федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию - №2006105030/13, заявл 26 01 06, опубл 20 02 07, Бюл № 5 - 444 с

Билалов Фаниль Салимовнч

ОСОБЕННОСТИ НЕКОТОРЫХ ЫЮЛ01 ИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI, ВЫДЕЛЕННЫХ Ol ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ С ИНФЕКЦИОННЫМИ ОСЛОЖНЕНИЯМИ

03 00 07 - Микробио югия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандида!а медицинских па>к

Лицензия № 0177 от 10 Об 96 г

Подписано в печать «_»__2007!

Бумага офсе! ная 01 печатано на риюграфе ФормаI 60x84 '/|6 Уст-печ л 1,7 Уч -изд л 1,9 Тираж 100 эм Заказ 423

450000,1 Уфа ум Ленина, 3, ГОУ ВПО «Ьашюсмедуниверсигег РОСЗДРАВА»

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Билалов, Фаниль Салимович

ВВЕДЕНИЕ.4

1.0 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.10

1.1. Этиологическая роль штаммов Escherichia coli при инфекционных осложнениях у онкологических больных.10

1.2. Факторы патогенности бактерий Escherichia coli.14

2.0 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.29

3.0 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Частота встречаемости штаммов E.coli у онкологических больных с инфекционными ослоэюнениями.41

3.2. Серологический пейзаж штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями.44

4.0 Факторы патогенности штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями.45

4.1. Адгезивные свойства.45

4.2. а-гемолитическая активность.47

4.3. Тиол-зависимая гемолитическая активность.49

4.4. Лецитиназная активность.50

5.0 Персистирующие свойства штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями.52

5.1. Антилизоцимная активность.52

5.2. «Антиинтерфероновая» активность.53

5.3. Антикомплементарная активность.55

6.0 Тестирование факторов вирулентности штаммов E.coli, выделях. б. 1. Легочная модель

6.2. Отек лапки мышей.58

6.3. Лигированная петля тонкого кишечника кролика. 59

6.4. Кожно-некротическая проба.61

6.5. Протистоцидный тест.65

7.0 7.7. Устойчивость штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями к антибактериальным препаратам.66

7.2. Фагочувствителъность штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями.70

8.0 Генетические детерминанты некоторых факторов патоген-ности штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями.72

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности некоторых биологических свойств штаммов Escherichia coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями"

Актуальность проблемы.

Одной из актуальных проблем современной онкологии является разработка эффективных методов профилактики и лечения инфекционных осложнений [6,46,47,49], поскольку это связано повышением риска присоединения инфекционно-воспалительных осложнений бактериальной природы у онкологических больных. В основе механизмов развития инфекционных осложнений, по мнению многих исследователей, лежит угнетение иммунной системы, повреждение естественных защитных барьеров организма, наличие об-структивных изменений, интоксикации и обширных оперативных вмешательств, что часто сопровождается массивной кровопотерей [50,114,180].

В спектре осложнений, наблюдаемых у онкологических больных, бактериальные инфекции встречаются примерно в 50% случаев и часто носят хронический рецидивирующий характер и являются причиной ранней гибели больных [15,68,180].

В последние годы произошли значительные изменения в спектре возбудителей, вызывающих инфекционные осложнения у онкологических больных. По данным литературы известно, что в 60-70-х годах прошлого столетия возникновение инфекционных осложнений у онкологических больных было обусловлено грамположительными бактериями, в частности стафилококками и стрептококками, а в настоящее время частой причиной инфекционных осложнений являются условно-патогенные грамотрицательные энтеробактерии (кишечные палочки, синегнойные палочки, протеи, цитробактеры, энтеро-бактеры, клебсиеллы) [6,43,69,89,180]. Особый интерес в изучении причин инфекционных осложнений у онкологических больных заслуживает Escherichia coli, которая часто, является причиной инфекций кишечного тракта, мочевыделительной и дыхательной систем, JIOP-органов, кожи и мягких тканей [43,117,121,143,180,186].

По мнению некоторых исследователей E.coli, выделенные при инфекционных процессах у онкологических больных несут комплекс генетически детерминированных кластеров (pap, hly, Ith, stx, eae, ehxA, astA, eaf plasmid, bfp), локализованных в структурных элементах хромосомной природы и коньюга-• тивных плазмидах, относятся к патоварам и являются этиологически значимыми [61,147,155,207]. В этой связи, возникает настоятельная необходимость изучения этиологической роли условно-патогенных энтеробактерий, в частности E.coli при инфекционных осложнениях у онкологических больных.

Чувствительность к развитию инфекционного процесса связана не только с изменением иммунного статуса организма, но и с изменением биологических свойств бактериальной флоры [6,221]. Поэтому для эффективного лечения больных с осложнениями бактериальной природы помимо поиска новых эффективных антибактериальных препаратов возникает необходимость изучить биологические свойства выделенных бактерий, которые позволяют в каждом конкретном случае определить этиологическую значимость возбудителя [21,33,172]. Особенно большое внимание заслуживают клоны микроорганизмов с множественной лекарственной резистентностью, которые одновременно обладают комплексом факторов патогенности. Комплексное изучение генетических детерминант и фенотипических признаков у E.coli будут способствовать более детальному выяснению этиологической значимости возбудителей инфекционных осложнений у онкологических больных.

Исходя из выше изложенного, возникает настоятельная необходимость проведения комплексных исследований, направленных на профилактику и лечение инфекционных осложнений у онкологических больных, на основе изучения некоторых биологических свойств условно-патогенных энтеробактерий, в частности E.coli.

Цель исследования.

Изучение некоторых биологических свойств штаммов E.coli, выделенных у онкологических больных с инфекционными осложнениями.

Задачи исследования.

1. Изучить частоту встречаемости штаммов E.coli при инфекционных осложнениях у онкологических и неонкологических больных.

2. Дать сравнительную характеристику некоторых биологических свойств штаммов E.coli, выделенных от онкологических и неонкологических больных с инфекционными осложнениями.

3. Определить спектр лекарственной устойчивости, выделенных штаммов E.coli и провести поиск перспективных антибактериальных биологических препаратов, на примере поливалентных фагов.

4. Изучить природу генетических детерминант, контролирующих адгезивную, гемолитическую, LT-энтеротоксигенную активности E.coli, выделенных от онкологических и неонкологических больных с инфекционными осложнениями.

Научная новизна.

При изучении частоты встречаемости E.coli, у онкологических и неонкологических больных с инфекционными осложнениями выявлено превалирование E.coli этиологически значимых штаммов у онкологических больных.

Установлено, что штаммы бактерий E.coli, выделенные от онкологических больных с инфекционными осложнениями обладают широким спектром лекарственной устойчивости.

Бактерии E.coli, выделенные от онкологических больных с инфекционными осложнениями, чаще обладали персистирующими (АЛА, АИА, АКА), адгезивной, LT- энтеротоксигенной, а-, тиол-зависимой гемолитической, лецитиназной активностями, что доказывает их этиологическую значимость.

Гены JlT-энтеротоксигенной, а-гемолитической активностей у E.coli входят в состав «островов патогенности», локализованных в хромосоме и плазмидах. Детекция фрагментов генов факторов патогенности показала превалирование их частоты встречаемости у штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями, чем у неонкологических больных.

Штаммы Escherichia coli №280 и Escherichia coli №281, выделенные от онкологических больных с инфекционными осложнениями в ассоциации с Serratia marcescens и Staphylococcus aureus, обладающие комплексом факторов патогенности были депонированы в ФГУН ГНИИСК им. JI.A. Тара-севича (соответственно положительная справка №01 - 07/472 от 13.12.2005г. и №01 - 07/473 от 13.12.2005г.) и запатентованы в ФГУ ФИПС (патенты №2293764 и №2293765 от 26.01.2006).

Практическая и теоретическая значимость.

Отработаны оптимальные подходы выяснения этиологической значимости бактерий E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями.

Выяснение маркеров вирулентности у штаммов E.coli позволяют целенаправленно провести профилактику и лечение инфекционных осложнений у онкологических больных.

В качестве антиэшерихиозного препарата рекомендован «Поливалентный пиобактериофаг жидкий» производства ФГУП НПО «Микроген «Иммунопрепарат» г. Уфа.

Результаты исследований внедрены в практические и лекционные курсы кафедры микробиологии, вирусологии иммунологии ГОУ ВПО «Башкирского государственного медицинского университета» Росздрава.

Депонированные в ФГУН ГНИИСК имени J1.A. Тарасевича штаммы E.coli рекомендуются в качестве эталонных культур и суперпродуцентов термолабильного ЛТ — энтеротоксина при получении биологических препаратов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Штаммы бактерий E.coli чаще выделяются у онкологических больных при инфекционных осложнениях, чем у неонкологических больных, и обладают более выраженными адгезивной, антилизоцимной, антиинтерфероновой, антикомплементарной, JIT - энтеротоксигенной, а-, тиол-зависимыми гемолитическими активностями и вирулентностью.

2. У штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных генетическими детерминантами вирулентности являются структурные элементы хромосомной природы и конъюгативная плазмида массой 60 МДа.

3. «Поливалентный пиобактериофаг очищенный жидкий», выпускаемый ФГУП «НПО «Микроген» филиал «Иммунопрепарат» г. Уфа является перспективным антиэшерихиозным биологическим препаратом.

Апробация работы.

Диссертация обсуждена на совместном заседании кафедр микробиологии, общей гигиены, биологии и медицинской генетики, инфекционных болезней с курсом эпидемиологии, ЦНИЛ БГМУ, ведущих научных сотрудников ФГУП «НПО «Микроген» филиал «Иммунопрепарат», Института биохимии и генетики УНЦ РАН и правления Башкирского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Уфа (2006). Материалы диссертации доложены на Всероссийской научной конференции с международным участием «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка производство и применение» посвященная 100-летию «Иммунопрепарат», г. Уфа (2005); на 70-й юбилейной итоговой Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины» Ч. 1. Уфа (2005); на VI Общероссийской научной конференции с международным участием «Успехи современного естествознания», «Дагомыс» г. Сочи (2005); на X международной научной конференции «Здоровье семьи-ХХ1 век», Бангкокк-Паттайя, Тайланд (2006).

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО «Башкирского государственного медицинского университета» Росздрава (ректор, член-корр. РАМН, д.м.н. Тимербулатов В.М.), и в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН (директор, профессор, д.б.н., Вахитов В.А.).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 127 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего 221 источника, из них 101 отечественных и 120 иностранных авторов и приложения. Работа иллюстрирована 17 рисунками, 11 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Билалов, Фаниль Салимович

выводы.

1. Штаммы E.coli чаще выделяются от онкологических больных с инфекционными осложнениями, чем от неонкологических больных. При этом культуры, выделенные от онкологических больных преимущественно принадлежали к Об, 08, 080, 025 серогруппам, тогда как штаммы изолированные от неонкологических больных - к 055, 085, 025, 0128ав, что необходимо учитывать их роль при оценке этиологической и эпидемиологической значимости.

2. Штаммы E.coli, изолированные при инфекционных осложнениях у онкологических по сравнению с неонкологическими больными, чаще обладают выраженной адгезивной, JIT - энтеротоксигенной, а- и тиол-зависимой-гемолитической, антилизоцимной, «антиинтерфероновой», антикомплементарной активностями и вирулентностью, что характеризует их более выраженную этиологическую значимость.

3. Штаммы E.coli, выделенные от онкологических больных чаще обладали множественной лекарственной устойчивостью и чувствительностью к «Поливалентному пиобактериофагу жидкому» производства ФГУП НПО «Микроген» филиал «Иммунопрепарат» г. Уфа, что указывает на возможное его использования в качестве антиэшерихиозного препарата.

4. У штаммов E.coli, выделенных от онкологических и неонкологических больных с инфекционными осложнениями генетическими детерминантами адгезивности являются структурные элементы хромосомной природы, продукции LT-энтеротоксина - плазмида массой 60 МД, а-гемолизина -возможно хромосома и плазмида массой 120 МД.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

1. Полученные результаты позволяют в каждом конкретном случае оценить этиологическую значимость штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями.

2. Материалы исследований, освещающие некоторые биологические свойства штаммов E.coli и их генетический контроль, внедрены в лекционные курсы на кафедре микробиологии, вирусологии иммунологии ГОУ ВПО «Башкирского государственного медицинского университета» Росздрава.

3. В виду широко распространенной лекарственной устойчивостью среди штаммов E.coli, «Поливалентный пиобактериофаг очищенный жидкий» (пр-во ФГУП НПО «Микроген» филиал «Иммунопрепарат», г. Уфа) рекомендуется для лечения инфекционных осложнений у онкологических больных.

4. Штаммы E.coli №280 и №281 депонированные в ФГУН ГНИИСК имени JI.A. Тарасевича могут быть использованы в качестве эталонных культур при идентификации выделенных штаммов от больных и в биотехнологии в качестве суперпродуцентов термолабильного энтеротоксина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На фоне успешного лечения многих онкологических заболеваний в последние годы повсеместно отмечается увеличение удельного веса инфекционных осложнений и особенно возрастание роли последних в смерти больных. Выраженный клинический полиморфизм, связанный со вторичным иммунодефицитом у онкологических больных, определяет большую значимость изучения биологических свойств возбудителей инфекционных осложнений [6,43,46,47,49,161].

Бактериальный сепсис и септический шок являются, безусловно, основной причиной летальности среди онкологических больных. Инфекционные осложнения значительно чаще развиваются у онкологических больных на III-IV стадиях заболевания. Причём, особую роль в этиологической структуре занимают условно-патогенным энтеробактерии, к которым относится и E.coli [70,80,216,220].

Этиологическая роль кишечной палочки в инициации ряда инфекцион-но - воспалительных заболеваний у человека показана многими исследователями [43,49,155]. Появление E.coli в вышележащих отделах желудочно-кишечного тракта, в крови, в мочеполовой и дыхательной системах, расценивается как признак дисбактериоза или симптом внекишечных эшерихиозов [19,28,43,149].

Риск развития внекишечного эшерихиоза у онкологических больных на порядок выше в связи с наличием взаимно сопряженных факторов: опухолевая интоксикация, истощение, анемия, длительностью оперативных вмешательств, обширной кровопотерей в ходе операций, а также предшествующей химио- и лучевой терапии [6,48,49,50,51].

По данным Дмитриевой Н.В. и соавт. [50] спектр инфекционных осложнений у онкологических больных включает: пневмонии (39%), глубокие и поверхностные раневые инфекции (31%), мочевые инфекции (8%), лихорадку неясного генеза (6%), сепсис (4%) и другие. Зачастую определить причину инфекционного осложнения невозможно, однако некоторые авторы считают, что наиболее частыми возбудителями являются: E.coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Pseudomonas spp., Staphylococcus epidermidis, Enterococcus spp., Candida albicans, Aspergillus spp. [52].

Изучив микробный пейзаж штаммов выделенных от онкологических и неонкологических больных, мы выявили, что E.coli является частой причиной инфекционных осложнений у онкологических больных, чем у неонкологических больных. Так если удельный вес E.coli в инфекционных осложнениях у онкологических-больных составил 33,1 ±4,7% (56), то у неонкологических больных - 23,8±4,6% (67) (р<0,05).

По мнению некоторых исследователей из множества факторов патогенности ни один из них не может быть достаточным в проявлении патогенности микроорганизмов, поскольку они часто могут изменяться независимо друг от друга [36,92]. Нами была изучена частота проявления некоторых биологических свойств УПЭ, на примере клинических штаммов E.coli, выделенных от онкологических и неонкологических больных с инфекционными осложнениями.

Все выделенные штаммы E.coli на поверхности МПА в течение суток вырастали в виде полупрозрачных колоний с гладкой поверхностью и ровными краями размером около 3-4 мм. На среде Эндо давали рост в виде красно-малиновых колоний с металлическим блеском, при этом лишь два штамма были лактозонегативными и вырастали в виде бледновато-матовых выпуклых колоний с ровными краями. При культивировании штаммов бактерий E.coli в жидкой питательной среде, образовывалось равномерное помутнение, с выпадением слабого осадка в течение 20-24 часов. Бактериоскопия в раздавленной и висячей капле показала, что клетки обладают поступательными и маятникообразными движениями.

При посеве на полужидкий агар, бактерии диффундировали в среду через 12-24 часов при температуре 37° С. На окрашенных по Граму препаратах, бактериальные клетки представляли собой мелкие грамотрицательные палочки.

Штаммы бактерий E.coli обладают весьма пестрой антигенной структурой. Для внутривидовой дифференциации штаммов разработаны ряд схем, основанных на изучении О -, К - и Н - антигенов.

Мы провели исследования по изучению поверхностных антигенов путем применения коммерческих поливалентных ОК-сывороток и типовых О-сывороток (НПО «Биомед») в реакции агглютинации на стекле.

При изучении реакции агглютинации с типовыми эшерихиозными О-сыворотками было выявлено, что среди штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями, 12 штаммов относились к серогруппе Об, 8 - к 08, 4 - к 080, 3 - к 025, по 1 - к 0128ас, 085, 0111, 0119 соответственно, тогда как среди культур E.coli, изолированных от неонкологических больных, 10 штаммов относились к серогруппе 055, 8 -085, 5 - к 025, 4 - 0128ав, 2 - к 08, 2 - 06 и 1 к 027.

Данные этих исследований показывают, что наибольшую эпидемиологическую значимость в развитии инфекционных осложнений у онкологических и неонкологических больных представляют ОКА, ОКВ и ОКЕ серо-группы. При этом штаммы выделенные от онкологических больных преимущественно принадлежали к Об, 08, 080, 025 серогруппам, тогда как штаммы изолированные от неонкологических больных - к 055, 085, 025, 0128ав. Вероятно, штаммы этих серогрупп чаще обладают необходимым комплексом факторов патогенности для развития инфекционного процесса.

Все микроорганизмы обладают способностью прикрепляться к органическим и неорганическим поверхностям [85,131,138]. Учитывая, что у патогенных бактерий первым этапом развития инфекционного процесса является лиганд - рецепторное взаимодействие, обусловленное адгезией микроорганизмов на специфических рецепторах чувствительных клеток макроорганизма, для выявления адгезинов у бактериальных клеток используют реакцию гемагглютинации с эритроцитами различных видов животных и птиц. Исходя из этого, мы сочли необходимым провести сравнительное изучение адгезив-ности E.coli, выделенных от онкологических больных и неонкологических больных. В качестве клеток-мишеней для выявления адгезинов, и выяснения природы структур бактериальной клетки, определяющих у E.coli адгезивную активность, использовали эритроциты цыпленка [36].

Было выявлено, что из 56 культур E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями, 41 (73,2±5,9%) обладали способностью давать Д-маннозочувствительную реакцию гемагглютинации (MS), тогда как среди 67 культур E.coli, изолированных от неонкологических больных, 31 (46,2±6,1%) давали положительную реакцию (р<0,05).

Изучение Д-маннозорезистентной гемагглютинирующей активности (MR) показало, что среди 56 штаммов E.coli, выделенных при инфекционных осложнениях от онкологических больных 32 (57,1±6,6%) обладали этим свойством, в то время как из 67 культур, изолированных от неонкологических больных лишь 24 (35,8±5,8%) штамма вызывали MR - гемагглютина-цию.

Одновременно было проведено изучение среднего показателя адгезив-ности (СПА) в опытах на формалинизированных эритроцитах I группы крови человека при микроскопическом учете результатов в соответствии с методом Брилиса В.И. с соавт. [20]. Результаты исследований показали, что среди 56 штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями 23 (41,1 ±6,5%) культуры проявляли высокий уровень адгезивной активности, 12 (21,4±5,4%) - средний, 6 (10,7±4,1) % - низкий и 15 (26,8±5,9%) - не проявляли адгезивную активность, тогда как среди 67 культур, выделенных от неонкологических больных 10 (14,9±4,2%) случаев проявлялся высокий уровень адгезивной активности, 11 (16,5±4,5%) - средний, 10 (14,9±4,2%) - низкий и 36 (53,8±6,1%) - не проявляли адгезивную активность (р< 0,05).

Для преодоления иммунобиологических барьеров многие бактерии продуцируют ряд продуктов жизнедеятельности, которые способствуют их проникновению, существованию и колонизации в тканях макроорганизма [43,56,92]. Исследования последних лет показывают, что к числу важнейших таких продуктов относятся бактериальные гемолизины [82,118,144]. Гемолизины относят к факторам патогенности, наличие которых может быть использовано в качестве показателя потенциальной цитотоксичности, выделенных условно-патогенных энтеробактерий. Функционально определяют несколько групп гемолизинов, среди которых у энтеробактерий превалирует а-гемолизин, тиолзависимый гемолизин и энтерогемолизин [118,171]. Исходя из этого, мы провели сравнительное изучение а-гемолитической активности бактерий E.coli, выделенных от онкологических и неонкологических больных с инфекционными осложнениями.

Результаты исследований показали, что среди 56 штаммов E.coli, изолированных от онкологических больных с инфекционными осложнениями 18 (32,1±6,3%) штаммов обладали высокой а - гемолитической активностью, 10 (17,9±5,1%) штаммов - средней, 16 (28,6±4,6%) - слабой и не обладали гемолитической активностью 12 (21,4±6,5%) культур, тогда как, из 67 штаммов E.coli, выделенных от неонкологических больных 13 (19,4±2,2%) культур обладали высокой а - гемолитической активностью, 6 (8,9±3,1%) - средней, 9 (13,4±4,2%) - слабой и не обладали гемолитической активностью 39 (58,2±5,2%). Проведенные исследования показали, что штаммы E.coli, обладающие а-гемолитической активностью чаще выделялись от онкологических больных с инфекционными осложнениями, чем от неонкологических больных страдающих, гнойно-воспалительными заболеваниями (р<0,05).

Корреляцию между способностью культур продуцировать а-гемолизин и вирулентностью in vivo в опытах интраназального заражения белых мышей и на модели инфузорий туфелек выявила, что из 20 штаммов 6 (30±6,5%) культур проявляли высокую вирулентность, 3 (15±4,7%) - среднюю, 4 (20±5,3%) - низкую, 7 (25±5,7%) штаммов были авирулентными. а-гемолитически - активные штаммы в опытах на лигированной петле тонкого кишечника кролика не вызывали дилатацию кишечника.

Наряду с а - гемолизином некоторые бактерии кишечной группы синтезируют тиолзависимый гемолизин, который лизирует эритроциты в присутствии цистеина и может быть использован при изучении патогенного потенциала возбудителя [36,221].

Среди 56 штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных, 29 культур обладали способностью синтезировать тиолзависимый гемолизин, из которых 7 (12,5±4,4%) проявляли высокую активность, 12 (21 ±5,4%)- среднюю и 10 (33,4±6,0%)- обладали слабой тиол-зависимой гемолитической активностью, в то время как из 67 культур E.coli, выделенных от неонкологических больных 26 штаммов обладали способность продуцировать тиолзависимый гемолизин, из которых 5 (7,4±3,2%) обладали высокой активностью, 13 (19,4±4,8%)- средней и 8 (11,9±3,9%)-слабой активностью и не обладали активностью - 41 (61,2±5,9%) (р<0,05).

Лецитиназная активность-способность бактерий растворять липидные мембраны, наряду с гемолитическими и протеолитическими активностями микроорганизмов, относится к факторам патогенности, в связи, с чем является важным показателем вирулентности высеваемых клинических штаммов условно-патогенных энтеробактерий, в том числе и E.coli [36,38а,52].

Сравнительный анализ между двумя группами E.coli показал, что 56 штаммов, выделенных от онкологических больных 24 (42,9±6,6%) обладали лецитиназной активностью, тогда как у 67 культур, изолированных от неонкологических больных этот признак встречался 19 (28,4±5,5%) культур, что характеризует их менее низкую способность к растворению липидных мембран (р<0,05).

В целях сохранения возбудителя, находящегося в организме, от бактерицидных факторов сыворотки или фагоцитов микробная клетка располагает также средствами дистанционного действия, которые представляют многочисленную группу секретируемых бактериальных субстанций, направленных на инактивацию механизмов иммунитета [25,27].

По данным некоторых авторов антилизоцимная активность встречается у большинства видов микроорганизмов [22,24].

Результаты исследований показали, что штаммы среди 56 штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями 17 (30,4±6,1%) - обладали высокой АЛА, 7 (12,5±4,4%) - средней АЛА, 6 (10,7±4,1%) - низкой АЛА, в то время как из 67 культур E.coli, выделенные от неонкологических больных 10 (14,9±4,4%) - обладали высокой АЛА, 8 (11,9±4,0%) - средней АЛА, 9 (13,4±4,2%) - низкой АЛА (р<0,05). Таким образом, штаммы, выделенные от онкологических больных с инфекционными осложнениями, достоверно (р<0,05) чаще всего проявляли антилизо-цимную активность, чем штаммы, выделенные от неонкологических больных.

Антиинтерфероновая активность (АИА) - это автономное свойство микроорганизмов, предназначенное для целенаправленного, специфического инактивирования бактерицидной фракции человеческого лейкоцитарного интерферона [25,87]. Среди 56 штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных АИА проявлялась у 30 (53,5±5,1%), в то время как у 67 культур, изолированных от неонкологических больных этот признак выявлялся у 27 (40,3±3,1%) культур (р<0,05), что говорит о частой встречаемости АИА у штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями.

Антикомплементарная активность (АКА) - это признак, обеспечивающий персистирование микробной клетки и характеризует способность инак-тивировать комплемент [23,26]. По анализу результатов можно сказать, что из 56 штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями 17 (30,4±6,1%) - обладали высокой АКА, 7 (12,5±4,4%) -средней АКА, 9 (16,1±4,9%) - низкой АКА, в то время как среди 67 культур E.coli, изолированных от неонкологических больных 10 (14,9±4,4%) штаммов проявляли высокую АКА, 6 (8,9±3,5%) - среднюю АКА, 11 (16,4±4,5%) - низкую АКА.

Данные исследований показывают, что AJIA, АИА, АКА могут быть использованы при оценке этиологической значимости E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями.

Вирулентность E.coli, тесным образом связана со способностью продуцировать токсины. Выделяют две группы энтеротоксинов по чувствительности к температурному фактору - термолабильные и термостабильные, а также выделяют шига-подобный токсин, продукция которых УПЭ определенным образом обусловливает развитие диарейного симптомокомплекса. Литературные данные о способности продуцировать энтеротоксины у E.coli многочисленны [120,134,143,198], однако вопрос об их роли в развитии инфекционных осложнений у онкологических больных крайне малочисленны. Поскольку бактерии E.coli относятся к условно-патогенным, то в каждом конкретном случае для выяснения их этиологической значимости необходимо исследовать свойства, характеризующие степень патогенности.

Использование легочной модели является наиболее подходящим методом определения вирулентности свежевыделенных штаммов, т.к. этот метод позволяет определять динамику размножения бактерий через различные интервалы времени с момента введения возбудителя, а по времени гибели и количеству погибших животных довольно быстро установить степень вирулентности бактерий [31].

Изучение вирулентности 56 штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных показало, что 12 (21,4±5,5%) штаммов вызывали гибель животных, причём из них 3 (25±3,8%) штамма оказались высоковирулентными, 4 (33,3±4,4%) штамма - средневирулентными и 5 (41,7±6,6%) штаммов были слабовирулентными. В то время среди 67 культур, выделенных от неонкологических больных, вирулентность проявлялась в слабой степени. Так из 67 штаммов - 10 (15,0±3,7%) проявляли слабую вирулентность, 57 (85,1±3,9 %) штаммов были авирулентными.

По данным некоторых исследователей [93,115,117,123,164] у УПЭ существует прямая корреляция между вирулентностью и способностью продуцировать LT- энтеротоксин. В связи, с этим, мы провели изучение способности продуцировать LT- энтеротоксин у штаммов E.coli, выделенных от онкологических и неонкологических больных с инфекционными осложнениями. При этом мы использовали тест отека лап белых мышей [216].

Результаты исследований показали, что из 56 штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями, 15 (26,8±4,7%) культур давали положительную реакцию, в то время как из 67 культур E.coli, изолированных от неонкологических больных, 11 (16,4±4,5%) штаммов вызывали отек лап у мышей (р<0,05).

С целью выяснения природы веществ, обуславливающих «отек лап» мышей, центрифугаты 20 - часовых бульонных культур нагревали при 56 °С и 85°С в течение 45 минут и вводили субплантарно. При этом гретые при 56°С центрифугаты давали разницу между опытным и контрольными лапками в пределах от 25-40 мг, при 85 °С - от 15-25 мг, что указывает на термолабильность токсических веществ.

Было выявлено, что среди 56 штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями 13 (23,2±3,6%) обладали способностью продуцировать JlT-энтеротоксин, тогда как у 67 культур, выделенных от неонкологических больных, 7 (10,4±2,5%) обладали этим свойством (р<0,05).

Результаты изучения ЛТ-энтеротоксигенности в тесте отека лап показали, что культуры E.coli, выделенные от онкологических больных с инфекционными осложнениями чаще проявляли ЛТ-энтеротоксигенную активность чем штаммы, изолированные от неонкологических больных (р<0,05), что необходимо учитывать при оценке их этиологической значимости.

Ещё одним способом тестирования энтеротоксигенной активности использованный нами был метод «лигированная петля тонкого кишечника кролика», который позволяет обнаружить степень активности энтеротоксинов. Результаты показали, что центрифугаты 20 - часовых бульонных культур 56 штаммов E.coli, при введении в просвет тонкого кишечника, вызывали накопление экссудата, и отношение V/L (объёма экссудата к длине лигированного участка) варьировала в пределах от 1,0 до 1,2, что являлось подтверждением наличия энтеротоксин продуцирующей способности.

Было выявлено, что из 56 культур E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями 16 (28,6±6,1 %) штаммов вызывали накопление экссудата в просвете тонкого кишечника кролика (V/L 1,0-1,2), из которых у 5 (31,3±4,1%) штаммов V/L = 1,2, у 7 (43,8±7,8%) - 1,1, и у 4 (25,0±3,5%) - 1,0 .

В то время как среди 67 культур E.coli, изолированных от неонкологических больных, 11 (16,4±4,5%) штаммов обладали способностью вызывать накопление экссудата и V/L при этом составило 1,0-1,2, из которых у 2 (18,1±4,7%) штаммов V/L = 1,2, у 8 (72,7±5,4%) - 1,1, у 1 (9,1±3,5%) - 1,0. Необходимо также отметить, что из всех культур 4 штамма изолированные при кишечных инфекциях вызывали накопление серозно-геморрагического экссудата, что указывает на наличие у штаммов E.coli способности синтезировать новый энтеротоксин типа энтерогемолизина.

При введении центрифугата прогретой при 56°С 20 - часовой бульонной культуры среди 16 (28,6±6,0) штаммов E.coli, изолированных от онкологических больных у 13 (81,3±6,0%) соотношение V/L составило не более 0,5, что свидетельствовало о термолабильности энтеротоксина, в то время как среди 11 (16,4±4,5%) культур, выделенных от неонкологических больных этот признак сохранялся у 7 (63,6±5,9%) штаммов.

По результатам опытов «лигированная петля тонкого кишечника кролика» можно заключить, что JIT - энтеротоксигенную активность чаще проявляли штаммы E.coli, выделенные от онкологических больных с инфекционными осложнениями, чем культуры, изолированные от неонкологических больных (р<0,05).

Кожно-некротическая проба отражает потенциал бактериальной клетки вызывающий некроз кожи благодаря наличию ряда факторов патогенности необходимых для развития инфекционного процесса. Нами была предпринята попытка изучения кожно-некротической пробы на кроликах несколькими штаммами. Критериями оценки дермо-некротического действия штаммов явились два фактора:

3) Разница в размерах воспалительного фокуса (гнойника, некроза) индуцированного штаммами E.coli, выделенных от онкологических и неонкологических больных.

4) Разница в характере течения воспалительного процесса и степень тяжести состояния опытных животных.

При изучении кожно-некротической способности у 4 штаммов бактерий E.coli, выделенных от онкологических больных, максимальный размер воспалительного фокуса варьировал от 3x3,3 см до 3,6x3,8 см, который нарастал в течении 48 часов с характерной картиной интоксикации в виде повышения температуры тела до 43 °С и угнетения двигательной активности кроликов, в то время как среди 4 культур E.coli, изолированных от неонкологических больных максимальный размер воспалительного фокуса варьировал от 2,2x2,5 см до 2,8x3,2 см, который достигал своего пика в течении 72 часов, с менее выраженной интоксикацией и угнетением двигательной активности кроликов.

Таким образом результаты исследований кожно-некротической пробы показали, что штаммы E.coli, выделенные от онкологических больных оказались способными вызывать некроз кожи и формирование гнойника у кроликов в более короткие сроки с характерной тяжелой клинической картиной, в отличии от культур, изолированных от неонкологических больных.

Проведенные нами исследования на биологических моделях экспериментальной инфекции показали, что интраназальное заражение, плантарный тест, «лигированная петля тонкого кишечника» требуют значительного количества экспериментальных животных и времени, в связи, с чем они не всегда выполнимы в бактериологических лабораториях стационаров.

В связи с этим мы решили для сравнительного изучения цитотоксично-сти клинических штаммов E.coli, выделенных от онкологических и неонкологических больных использовать инфузории туфельки. Результаты исследований показали, что из 56 штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями, 16 (28,5±6,0%) обладали протис-тоцидной активностью, тогда как среди 67 культур, выделенных от неонкологических больных этот признак встречался у 13 (19Д±4,8%) (р<0,05).

Результаты сравнительного изучения некоторых биологических свойств штаммов E.coli, показали, что E.coli чаще выделяются от онкологических больных с инфекционными осложнениями, чем от неонкологических больных и обладали более выраженной адгезивной, а-гемолитической активностью, LT-энтеротоксин продуцирующей, антилизоцимной, антиинтерфе-роновой, антикомплементарной активностями и более высокой вирулентностью соответственно.

Широкое и не всегда рациональное использование антибактериальных препаратов в медицинской практике способствовало уменьшению чувствительных и увеличению резистентных штаммов микроорганизмов. Успехи антибактериальной терапии и профилактики у онкологических больных зависят от чувствительности микроорганизмов к назначаемым антибактериальным препаратам. Известно, что в настоящее время наблюдается тенденция снижения инфекционных осложнений, вызванных грамположительными микроорганизмами [6,48,50,170]. Имеющиеся литературные данные о множественной лекарственной устойчивости бактерий E.coli не подвергаются сомнению [21,79,107,130]. Тем не менее знание спектра лекарственной устойчивости является важным в плане выбора этиотропного лечения.

Анализ изучения антибиотикограммы показал, что культуры E.coli, выделенные от онкологических больных с инфекционными осложнениями, были чувствительными к ципрофлоксацину (76,5%), имипенему (99,5%), меро-нему (99,1%), ванкомицину (99,3%), фузидину (97,2%), налидиксовой кислоте (71,4%), цефамизину (78,5%), амикацину (76,8%), цефоперазону (74,2%), и устойчивыми к действию бензилпенициллина (98%), ампициллина (86,5%), оксациллина (90,3%), карбенициллина (78,5%), азитрамицину (77,8%), азлоциллину (74,5%), клиндамицину (92%), линкомицину (84,3%), оксациллину (90,3%), олеандомицину (98%), полимиксину (90%), ристомицину (90,3%), рокситромицину (98%), сизомицину (87%), стрептомицину (82%), тетрациклину (72%), тобрамицину (68%), фурагину (75%), цефаклору (89%), цефалек-сину (90%), цефамандолу (74%), цефуроксиму (74%), эритромицину (98%).

Штаммы E.coli, изолированные от неонкологических больных, были чувствительными к ципрофлоксацину (87,5%), имипенему (99,8%), меронему (98,6%), ванкомицину (98,8%), фузидину (94,5%), налидиксовой кислоте (87,2%), цефамизину (85,3%), амикацину (82,5%), цефоперазону (98,6%), ген-тамицину (70%), канамицину (62%), неомицину (67%), и устойчивыми к бен-зилпенициллину (95,8%), ампициллину (91,6%), оксациллину (85,4%), карбе-нициллину (62,5%), азитрамицину (60%), азлоциллину (68%), клиндамицину (85%), линкомицину (74%), оксациллину (85,4%), олеандомицину (85%), полимиксину (80%), ристомицину (80%), рокситромицину (74%), сизомицину (74%), стрептомицину (71%), цефамандолу (82%), цефуроксиму (80%), эритромицину (95%).

Среди штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных и неонкологических больных, максимальная резистентность была отмечена к эритромицину, олеандомицину, ристомицину, бензилпенициллину, ампициллину и оксациллину, что вероятно обусловлено циркуляцией и селекцией штаммов, продуцирующих различного рода ферменты биодеградации антибиотиков.

Поскольку большинство штаммов обладали антибиотикорезистентно-стью ко многим антибактериальным препаратам, применяемым в практической медицине, мы сочли целесообразным с практической точки зрения изучить фагочувствительность к поливалентному пиобактериофагу производства ФГУП «НПО «Микроген» филиала «Иммунопрепарат», г. Уфа.

Пиобактериофаг поливалентный очищенный жидкий (pyobacteriophagum polyvalentum purum liquidum) представляет собой стерильную смесь очищенных фильтратов фаголизатов бактерий стафилококков, стрептококков, клебсиелл пневмонии, эшерихий коли, синегнойной палочки, протея в виде прозрачной жидкости желтого цвета различной степени интенсивности с зеленоватым оттенком. В целях использования пиобакте-риофага поливалентного очищенного жидкого в лечении инфекционных осложнений у онкологических больных, мы провели изучение фагочувстви-тельности 56 штаммов E.coli, выделенных от онкологических и 67 культур изолированных от неонкологических больных. «Пиобактериофаг поливалентный очищенный жидкий» производства ФГУП «НПО «Микроген» «Им-мунопрепарат» г. Уфа был любезно предоставлен профессором, д.м.н. Ворошиловой Н.Н.

Результаты показали, что из 56 штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями, 33 (58,9±6,6%) были чувствительными к поливалентному пиобактериофагу, 7 (12,5±4,4%) - уме-ренночувствительными, 16 (28,6±6,0%) - нечувствительными, в то время как среди 67 штаммов, изолированных от неонкологических больных 38 (56,7±2,0%) культур оказались чувствительны к этому препарату, 8 (11,9±4,0%) - умеренночувствительными и 21 (31,3±3,1%) - нечувствительными (р<0,05).

При проведении сравнительного анализа фагочувствительности штаммов с антибиотикочувствительностью было выявлено, что из 23 (41,1 ±6,6%) культуры E.coli, выделенных от онкологических (обладающих множественной лекарственной устойчивостью к 14 антибиотикам), 19 (82,6±4,2%) оказались чувствительными к поливалентному пиобактериофагу, 3 (13,0±2,1%) — умеренночувствительными и 1 (4,3±0,2%) - нечувствительным.

В группе штаммов E.coli, изолированных от неонкологических больных из 20 (29,8±5,6%) полирезистентных культур, которые были устойчивы к 9 и более антибактериальным препаратам, 12 (60±6,0%) были чувствительными к поливалентному пиобактериофагу, 5 (25±5,3%) - умеренночувствительными, 3 (15±4,4%)-нечувствительными.

Данные этих исследований дают основание полагать, что поливалентный пиобактериофаг может быть использован в комплексной антибактериальной терапии инфекционных осложнений у онкологических и неонкологических больных, вызванных полирезистентными штаммами E.coli. Необходимо также отметить, что этот препарат сочетает в себе широкий спектр микроорганизмов, что является важным аргументом для его использования при моно - и ассоциированных бактериальных инфекциях, обусловленных устойчивыми к антибактериальным препаратам штаммами.

Благодаря успехам в области изучения генетических и иммунологических маркеров вирулентности условно-патогенных микроорганизмов в настоящее время значительно улучшились диагностические подходы, позволяющие определить этиологическую значимость возбудителя [59,218,219,221].

Поскольку бактерии E.coli относятся к группе условно-патогенных грамотрицательных микроорганизмов, в каждом конкретном случае трудно объяснить этиологическую значимость возбудителя и провести при этом целенаправленную профилактику и лечение заболеваний, не зная природы генетического детерминанта «факторов патогенности», обуславливающие развитие инфекционного процесса.

Для этого мы в начале провели изучение профиля плазмидной ДНК у штаммов E.coli, выделенных от онкологических и неонкологических больных.

Адгезивность штаммов E.coli, выделенных как у онкологических, так и неонкологических больных была изучена в реакции гемагглютинации с использованием эритроцитов птиц. Мы отобрали по 15 штаммов из каждой группы, обладающие MS и MR гемагглютинирующей активностью, и изучили профиль их плазмидной ДНК.

При этом анализ профиля плазмидной ДНК обеих групп этих штаммов особых различий не выявил и оказалось, что 23 штамма оказались бесплаз-мидными, 3 штамма имели 4 плазмиды (120 МД, 60 МД, 3,2 МД, 1,4 МД), 3 штамма - по 3 плазмиды (60МД, 38МД, 1,4МД), 10 штаммов - по 2 плазмиды (120МД, 60МД), 8 штаммов - по 1 плазмиде: 3 штамма (60МД) и (1,4МД), 2 штамма - 40МД. Тестирование изогенных пар на их способность давать MS-и MR-реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка показало, что штаммы в одинаковой степени агглютинируют эритроциты птиц. Полученные результаты наших исследований дают нам основание полагать, что генетической детерминантой, контролирующей MS и MR реакцию гемагглютинации с эритроцитами цыпленка у E.coli, видимо являются структурные элементы хромосомной природы.

Некоторые исследователи показали, что синтез LT-энтеротоксина у E.coli детерминируется Ent плазмидами, молекулярная масса которых колеблется в пределах от 55 до 61 МД [36,52,61,98]. В то же время энтеротоксин холерного вибриона, иммунологически родственный LT-энтеротоксину E.coli, контролируется структурными генами хромосомной природы [159а].

Исходя из этого мы попытались выяснить природу генетической детерминанты, контролирующей у E.coli продукцию LT-энтеротоксина. Для изучения данного признака были отобраны 2 группы штаммов: первую группу составили штаммы суперпродуценты LT-энтеротоксина, способные вызывать "отек лап" мышей 95 мг и более, вторую - культуры, не продуцирующие LT-энтеротоксин и в опытах "отек лапки" белых мышей разницу давали не более 35 мг. Изучали профиль их плазмидной ДНК. Из 6 изученных штаммов первой группы, 4 (173, 587, 581, 165) оказались несущими плазмиды массой 60 МД, 1 штамм (26) - 60 и 3,2 МД и 1 штамм (123) - 60, 40 и 1,4 МД. Среди 4 штаммов второй группы (611, 769, 795, 843) 2 культуры были, несущими плазмиды массой 38 МД и 2 - бесплазмидными.

Опыты по элиминированию плазмид у штаммов, продуцирующих высокоактивный LT-энтеротоксин показали, что бесплазмидные изогенные пары токсигенных штаммов не вызывали отек лапки у мышей.

Из 40 отобранных клонов каждого штамма, утративших свойство продуцировать LT- энтеротоксин у двух на фореграмме просматривалась плазмида массой 60 МД, остальные клоны оказались не несущими данной плазмиды и в биологических пробах также были отрицательны.

В дальнейшем изучали возможность конъюгативной передачи Ent плазмиды между бактериями E.coli и от E.coli к E.coli К)2 Ge2 Rif®. Для чего в качестве донора брали №587 E.coli (Ent+,Str®, Mons) и реципиента №256 E.coli (Ent", Strs, Monr). У штаммов изучали резистограмму и на основе этого готовили селективную среду, содержащую 300 мкг/мл мономицина и 500 мкг/мл стрептомицина. Полученные трансконъюгаты давали рост в селективной среде и были способны вызывать "отек, лапки" у опытных мышей с разницей 95 мг и более. Результаты проведенных исследований дают нам основание полагать, что генетической детерминантой, контролирующей у E.coli продукцию LT-энтеротоксина, является, по-видимому, конъюгативная плазмида массой 60 МД.

Опыты по фенотипическому определению гемолитической активности E.coli указывают на то, что гемолизины являются одним из ведущих факторов патогенности клинических штаммов. Для. выяснения роли плазмиды, контролирующей гемолитическую активность E.coli, нами изучен плазмидный профиль а - гемолитически активных культур. Исследование проводили на 22 штаммах E.coli, обладающих а - гемолитической'активностью, и 6 штаммах, не способных продуцировать а - гемолизин. В качестве эталона использовали штамм Proteus vulgaris Rts-1, обладающий гемолитической активностью и несущий плазмиду с массой 120 МД.

Результаты исследований показали, что среди 22 штаммов E.coli, у 17 (11 - штаммов от онкологических больных, 6 - от неонкологических больных) обнаружили плазмиду массой 120 МД, в то время как в группе штаммов, не обладающих гемолитической активностью, этой плазмиды не оказалось, что указывало на возможную роль данной плазмиды в продукции а -гемолизина.

Для уточнения роли 120 МД плазмиды в следующей серии опытов элиминировали у бактерий плазмиду, культивируя а-гемолитически активные штаммы E.coli в бульоне Хоттингера (рН 7,4-7,6), содержащем 75 мкг/мл акридин оранжевого и у полученных клонов изучали профиль плазмидной ДНК. При этом клоны 8 штаммов потеряли способность продуцировать а-гемолизин, а клоны штаммов E.coli №661 и E.coli №171 сохраняли свойство продуцировать а-гемолизин.

Данные этих исследований, на наш взгляд, свидетельствуют о вероятности существования у E.coli генетической детерминанты иной природы, контролирующий продукцию а - гемолизин. Не исключено, что часть штаммов способны продуцировать биологически активные вещества, вызывающие гемолиз эритроцитов, но по своей природе не относящиеся к а-гемолизину. По нашему мнению, выяснение этого вопроса является весьма актуальным и перспективным и вполне может быть предметом отдельных исследований. Все наши попытки осуществить конъгативную передачу плазмиды массой 120 МД между бактериями E.coli к универсальному реципиенту E.coli К12 G62 Riffe) не увенчались успехом. Это, возможно, связано с большой массой плазмиды, контролирующей гемолитическую активность.

В дальнейшем с целью конкретизации роли 120 МД плазмиды в а-гемолитической активности брали изогенные пары штаммов. При этом у большинства гемолитически активных штаммов 22, 131, 586 (соответственно 30, 29, 32 из 50) на фореграмме наблюдали наличие плазмиды массой 120 МД, а у мутантов 22-э, 131-э, 586-э не проявляющих гемолитической активности, не были обнаружены плазмиды массой 120 МД. Все эти данные являются дополнительным подтверждением роли 120 МД в а-гемолитической активности бактерий E.coli.

Проведенные нами опыты, по изучению профиля плазмидной ДНК, элиминации и конъюгативной передачи плазмид, позволили обнаружить новые плазмиды различной массы (1,4МД, 2,8МД, 3,2МД, 12МД, 26МД, 38МД, 40МД), возможно, контролирующие различные факторы вирулентности (синтез энтеро-гемолизина, ДНК-азную, лецитиназную, антилизоцимную и антиинтерфероно-вую активности, резистентность к некоторым антибиотикам) клинических штаммов E.coli, выделенных как от онкологических, так и неонкологических больных. Выяснение роли этих плазмид может быть новым перспективным в плане дальнейших исследований в области молекулярной биологии.

У 56 штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных при инфекционных осложнениях, плазмиды массой 120 МДа встречались у 15 (26,8%), 60 МДа - у 25 (44,6%) и 40 МДа - у 5 (8,9%), в то время как у 67 культур, изолированных от неонкологических больных, плазмиды массой 120 МДа встречались у 10 (15,0%) культур, 60 МДа - 17 (25,4%) и 40 МДа - 4 (6,0%) (р<0,05), что свидетельствует о высокой частоте и значимости выявления этих маркеров у онкологических больных с инфекционными осложнениями во время проведения диагностических процедур и определения этиологической роли возбудителя.

Таким образом, результаты изучения профиля плазмидной ДНК дают основание полагать, что генетической детерминантой адгезивности бактерий E.coli, возможно, являются структурные элементы хромосомной природы, продукции LT-энтеротоксина - плазмида массой 60 МД, а-гемолизина — плазмида массой 120 МД.

Наличие у ряда клинических штаммов E.coli мобильных генетических элементов в виде плазмид может способствовать вертикальному и горизонтальному переносу в общей экологической нише, а наличие определенных хромосомных детерминант к выживанию клонов с необходимым набором генетических кластеров патогенности. Обнаружение генетических детерминант, контролирующих факторы патогенности свидетельствует о том, что среди культур E.coli встречаются штаммы, которые следует рассматривать не как условно-патогенные, а как конкретные патовары бактерий E.coli.

Локализация генетических элементов, ответственных за патогенность, часто остается не выясненной, однако, обнаружение ответственных участков генов тех или иных факторов патогенности во многом может помочь в проведении комплексной профилактики и терапии. В связи с этим мы провели исследования по обнаружению некоторых генов вирулентности методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) у штаммов E.coli, выделенных от онкологических и неонкологических больных с инфекционными осложнениями.

В серии амплификации были использованы 56 клинических штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями и 67 культур, изолированных от неонкологических больных, феноти-пически у которых заранее были определены некоторые факторы патогенности. Результаты исследований позволили установить факт превалирования частоты встречаемости генов рарС (пили адгезии Pap), hlyA (а-гемолизин) и Lth (LT-энтеротоксин) у штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями. Так у штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных ген РарС обнаруживался у 21 (37,5±6,5%) штамма, ген hlyA - у 17 (30,4±6,1%), ген Lth - у 13 (23,2±3, 7%), в то время как у культур E.coli, изолированных от неонкологических больных ген РарС обнаруживался 12 (17,9±4,7%), ген hlyA - у 11 (16,4±4,5%), ген Lth - у 7 (10,4± 2,3%) (р<0,05). Частота встречаемости комбинации нескольких генов у штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных была выше, чем у культур, изолированных от неонкологических больных (р<0,05). Вероятно, это обусловлено экологической экспансией наиболее патогенных сероваров E.coli у онкологических больных, что необходимо учитывать при оценке этиологической значимости штаммов E.coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями.

Обобщая результаты наших исследований, можно заключить, что данные по изучению адгезивной, лецитиназной, гемолитической, антилизоцим-ной, антиинтерфероновой, антикомплементарной, антибиотикоустойчивости, фагочувствительности, протистоцидной, JIT-энтеротоксигенной активностей и вирулентности, установленные в опытах на лабораторных животных и в совокупности могут служить теоретическим обоснованием для отнесения штаммов бактерий E.coli, выделенных от онкологических больных при инфекционных осложнениях, к обладающим выраженной патогенностью пато-генностью, чем изолированные от неонкологических больных, т.е. к патогенным и этиологически значимым, что должно учитываться при проведении мероприятий, направленных на профилактику и лечение инфекционных осложнений.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Билалов, Фаниль Салимович, Челябинск

1. Азнабаев Г.К. Биологические свойства бактерий рода Citrobacter, выделенных при моно и ассоциированных бактериальных инфекциях./ Азнабаев Г.К.// Дисс: канд. мед. наук. - 0ренбург-2003г. - 121 с.

2. Акар Ж.Ф. //Антибиотики и химиотерапия.-1991.-т. 36 (6).-С. 5-8.

3. Алмагамбетов К.Х., Горская Е.М., Бондаренко В.М. // Ж. микробиол. -1991.-№7.-С. 74-79.

4. Арион В.Я. Иммунология пептидов тимуса: Т-активин// Ж. микробиол. эпид. иммунол. 1987.-№4.-С. 98-104.

5. Арцимович Н.Г. Иммуномодуляторы, их природа и иммунотерапевтиче-ский эффект // Гематол. и трансфузиология.- 1988.-№10.-С. 37-41.

6. Ахатова Р.К. характеристика некоторых биологических свойств бактерий родов Enterobacter, Citrobacter, Proteus, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями. // Автореф. Дисс. Канд. мед. наук. Уфа - 2003. - 20 с.

7. Ахтариева А.А. Биологические свойства бактерий рода Enterobacter: Автореф. канд. мед. наук. Уфа. - 2000-39 с.

8. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологии / И.П. Ашма-рин, А.А. Воробьев. // Л.: Медицина, - 1962. - 179 с.

9. Багирова Н.С. Дрожжевые грибы: идентификация и резистентность к противогрибковым препаратам в онкогематологическом стационаре. / Н.С. Багирова, Н.В.Дмитриева // Инфекции и антимикробная терапия. 2001.- Т. 6 № 3 С. 178-182.

10. Бакиров А.Б. Некоторые биологические свойства микрофлоры гнойно-воспалительных осложнений у гематологических больных. / А.Б. Бакиров, З.Г. Габидуллин //Гематология и трансфузиология 1995.-№3.-С. 32-34.

11. П.Баклаев И.Е. Иммунокоррекция онкологических больных препаратами тимусного происхождения. / И.Е. Баклаев, Е.К. Олейник // Тез. I всесоюз. Съезда иммунологов.- М.-1989.-Т.1. С. 272.

12. Белобородов В.Б. Роль современных рекомендаций по профилактике инфекций, связанных с катетеризацией сосудов.//Инфекции и антимикробная терапия. 2002.-Т.4 №6.-С. 48-54.

13. Белобородов В.Б. Антибактериальная терапия больных острыми кишечными инфекциями. / В.Б. Белобородов, Ю.С. Алятин // Consilium medi-cum -2002.- Т.4 №6, -С. 43-47.

14. Белобородова Н.В. Алгоритмы антибиотикотерапии/ Н.В. Белобородова, М.Б. Богданов, Т.В. Черненькая // Руководство для врачей.- М., 1999. -144с.

15. Беляков В.Д., Яфаев Р.Х. Эпидемиология. М.,-1989.- 423с.

16. Берг Р.Д. Медицинские аспекты микробной экологии. М., 1993-1994.-Т.7/8.-С. 53-69.

17. Бондаренко В.М. О значимости высеваемости клебсиелл, энтеробактерий, цитробактерий, и кишечных иерсиний при бактериологических исследованиях.// В.М. Бондаренко, И.Г. Тимофеева, С.А. Колесников и др. //Ж. Микробиол.-1987.-№6-С. 74-78.

18. Бондаренко В.М. Дисбиоз: современные возможности профилактики и лечения.- М.-1995. 43 с.

19. Бондаренко В.М., Петровская В.Г. // Вестник РАМН.-1997.-ЖЗ.-С. 34-40.

20. Брилис В.И. Методика определения адгезивного процесса микроорганизмов / В.И. Брилис, Т.А. Брилене, Х.П. Ленцер, А.А. Ленцер //Лаб. дело.- 1986.-№4.-С. 210-212.

21. Булгаков А.К. Факторы вирулентности и лекарственной устойчивости-некоторых представителей семейства Enterobacteriaceae, и их чувствительность к новому ряду азотсодержащих гетероциклов. Автореф. д-ра. мед. наук. Челябинск-2000.-47 с.

22. Бухарин О.В. Антилизоцимный тест как маркер персистенции микроорганизмов / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцов // Теоретическая и прикладная иммунология: Тез. докл. 1 всесоюзн. конф. -М., 1982. С.58-34.

23. Бухарин О.В. Биология патогенных кокков / О.В.Бухарин, Б.Я. Усвяцов, О.Л. Чернова. // М.: Медицина, Екатеринбург: УрО РАН. 2002. С. 281-282.

24. Бухарин О. В. Бактерионосительство. / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцов // Екатеринбург. 1996. - С. 78 - 89.

25. Бухарин О.В. Механизмы выживания бактерий./ О.В. Бухарин, А.Л. Гинцбург, Ю.М. Романова, Г.И. Эль-Регистан // М.Медицина. 2005.-367с.

26. Бухарин О. В. Изучение антикомплементарной активности стафилококков / О.В. Бухарин, Ю.А. Брудастов, Д.Т. Дерябин //Журн. Клин. Лаб. Диагн. -1992. № 11. - С. 68 - 70.

27. Валышев А.В. Факторы персистенции энтеробактерий фекальной флоры при дисбиозе кишечника. / А.В. Валышев, Ф.Г. Гильмутдинова, С.В. Фомичева // Ж. микробиол.-1996.-№3.-С. 96-98.

28. Ван- дер -Ваай Д. // Антибиотики и химиотерапия,-1992.- т.37, №6.-С. 36-41.

29. Вартанян Ю.П. Отек лап белых мышей-тест для оценки активности энтеро-токсинов / Ю.П. Вартанян, М.К. Северцева, О.И. Введенская, Е.С. Станиславский. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1978. -№2.-С. 150-152.

30. Вертиев Ю.В. Бактериальные токсины: биологическая сущность и происхождение./Ю.В. Вертиев//Ж. микробиол.-1996.-№3.-С. 43-46.

31. Войно-Ясенецкая М.К. Опыт изучения дизентерейной инфекции у лабораторных животных / М.К. Войно-Ясенецкая // Журн. Микробиол. -1957. №4. - С. 65-69.

32. Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. // Вестник РАМН.-1997-№3 .-с. 4-7.

33. Воробьев А.А. Изменения микробиоценоза толстой кишки у больных различными заболеваниями. / А.А. Воробьев, Л.О. Иноземцева, Е.В. Буданова, Е.П. Пашков, Ю.В. Несвижский и др. // Вестн. РАМН. 1995.-№5.-С. 59-64.

34. Волкова З.В. Причины развития инфекций в онкологических боль-ных.//Материалы X Всероссийского конгресса онкологов. Москва-2005г.

35. Габидуллин З.Г. Биология О-форм протея: Дисс. канд. мед. наук.-Уфа.-1977.-25 с.

36. Габидуллин З.Г. Биологическая характеристика штаммов бактерий рода Proteus, выделенных при инфекционных процессах различной локализации: автореф. дисс. . д-ра мед. наук / З.Г. Габидуллин.// Саратов 198946 с.

37. Габидуллин З.Г., Хананова Р.К. Некоторые факторы патогенности и пер-систирующие свойства бактреиальной флоры, выделенных при инфекционных осложнениях от больных с острыми и хроническими лейкозами// Здравоохранение Башкортостана 2002. - №4 - С. 232-233.

38. Горелов В.Г. Острая дыхательная недостаточность при гемобластозах: типы диффузных поражений легких. / В.Г. Горелов, В.М. Городецкий, Э.Э. Мирзоян и др.// Тер. Архив. 1995. - т.67. - №7. - с. 52-57.

39. Горская Е.М. Механизмы развития микробиологических нарушений в кишечнике и новые подходы к их коррекции. Автореферат дис. Док-ра. мед. наук. М.-1994. - 42 с.

40. Гриценко В.А., Дерябин Д.Г., Брудастов Ю.А., Бухарин О.В. // Ж. мик-робиол. -1998.-№6.-С. 93-98.

41. Гриценко В.А., Вялкова А.А., Бухарин О.В. // Росс. Вест. Перинат. и педиатр.-1997.-№5.-С. 43-48.

42. Гриценко А.В. Экологические и медицинские аспекты симбиоза Escherichia coli и человека. / А.В. Гриценко, О.В. Бухарин // Журнал мик-робиол,- 2000.- №3.-С. 92-99.

43. Грузина В.Д. Коммуникативные сигналы бактерий. / В.Д. Грузина // Антибиотики и химиотерапия, -2003.- Т. 10 № 48 С. 32-39.

44. Дж. Миллер. Эксперименты в молекулярной генетике / Дж. Миллер. М.: Мир, 1976.-325 с.

45. Дмитриева Н.В. Антибиотикопрофилактика послеоперационных инфекционных осложнений у онкологических больных. / Н.В. Дмитриева, И.Н. Петухова //Клин, антимикроб, химиотерапия.-1999.-Т. ! №1.-С. 12-17.

46. Дмитриева Н.В. Этиологическая структура и чувствительность к антибиотикам основных возбудителей инфекционных осложнений в онкологической клинике. / Н.В. Дмитриева, И.Н. Петухова, А.З. Смолянская // М.,1999: 67 с.

47. Дмитриева Н.В. Применение клиндамицина и нетилмицина для профилактики послеоперационной раневой инфекции у больных раком верхних дыхательных и пищеварительных путей. / Н.В. Дмитриева, И.Н. Петухова, O.K. Борисова // Тер. Арх.-1993.-№10.-С. 55-58.

48. Дмитриева Н.В. Антимикробная химиотерапия и профилактика инфекционных осложнений у онкологических больных: Автореф. дис. Д-ра. мед. наук. М., 1995.-39 с.

49. Дмитриева Н.В. Инфекционные осложнения у онкологической клинике. / Н.В. Дмитриева, И.Н. Петухова, А.З. Смолянская // Практическая онко-логия-2001 .-N1 .-С. 18-20.

50. Дмитриева Н.В. Антибиотикопрофилактика послеоперационных инфекционных осложнений у онкологических больных. / Н.В. Дмитриева, И.Н. Петухова // Клиническая антимикробная химиотерапия. -1999. Т. 1 №1-С. 12-17.

51. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул.//Ю.В. Езепчук.-М. :Медицина, 1985.-145 с.

52. Карпов О.И. Антибиотикопрофилактика имипинемом при абдоминальной гистерэктомии у онкологических больных. / О.И. Карпов, И.Ю. Ко-лесниченко, А.Х. Халиков и др. // Инфекции и антимикробная терапия.-1999.-№3.-С. 45-48.

53. Клясова Г.А. Диагностика и лечение грибковых инфекций у больных ге-мобластозами. Автореф. дисс. канд. мед. наук. Москва-1995.- 24 с.

54. Комаров Ф.Н. О неспецифической противовоспалительной фармакотерапии больных инфекционно-воспалительными заболеваниями органов дыхания / Ф.Н. Комаров, И.Г. Данилян, Ф.Е. Гуляев и др. // Тер. Архив.-1979.-№10.-С. 104-108.

55. Куваева И.Б. Микроэкология и иммунные нарушения у детей. Диетическая коррекция./ И.Б. Куваева, К.С. Ладодо // М.-1991. 123 С.

56. Кулсков В.И. Антибактериальная терапия инфекций мочевыводящих путей у беременных. // Клин, микроб, антимикроб. химиотерапия.-2004.-Т. 6. №3.-С. 218-223

57. Лопухов Л.В. Полимеразная цепная реакция в клинической микробиологической диагностике. / Л.В. Лопухов, М.В. Эйделыптейн // Клин, мик-робиол. и антмикроб. химиотер. 2000. Т. 2. №3 -С. 96-106.

58. Мамонтова Т.Н. Методические рекомендации по обнаружению и классификации R плазмид у шигелл / Т.Н. Мамонтова, С.С. Белокрысенко, Е.Д. Тихомиров, Ю.П. Солодовников, М.В. Турчинская // М. - 1983. -МЗ СССР.

59. Мавзютов А.Р. Молекулярно-генетические основы токсигенности условно-патогенных представителей Enterobacteriaceae: Автореф дис. . д-ра мед. наук / А.Р. Мавзютов. Челябинск. 2000. - 43 с.

60. Медицинская микробиология. Под ред. В.И. Покровского, O.K. Поздее-ва. М.: ГЭОТАР-Медицина, 1998. 183-92.

61. Митрохин С.Д. Инфекции половых органов: Современный алгоритм микробиологического исследования.// Инфекция и антимикробная терапия. Т. 4 №5.- 2002.-С. 24-26.

62. Митрохин С.Д. Цефепим в лечении тяжелых инфекций у онкологических больных.// Инфекции и антимикробная терапия. 2001; 3(3):82 89.

63. Митрохин С.Д. Значимость микробиологической лаборатории в современной системе инфекционного контроля многопрофильного стационара (в плане профилактики и лечения госпитальных инфекций).// Consilium medicum. 2002. T.l №4 - С. 42 - 45.

64. Михна М.Г. Оценка действия Т-активина на различные стадии созревания Т-лимфоцитов. / М.Г. Михна, И.В. Мирошниченко, М.Ф. Никифорова//Бюлл. экспер. биол. и мед.-1988.-№2.-С. 189-191.

65. Навашин С.М. Макро- и микроорганизм взаимодействие в инфекционном процессе при антибактериальной терапии.//Антибиотики и химиотерапия.- 1998.-№11,- С. 3-5.

66. Наврузов С.Н., Корнеева Т.К., Воробьев Г.И. и др.// Клин. мед. 1988.-№2.-С. 106-109.

67. Наумова О.В. Аутофлора человека в норме и патологии и ее коррекция./ О.В. Наумова, И.Н. Блохина, К.Я. Соколова. Е.Е. Белова, Т.И. Хабазова //- Горький, 1988.- С. 36-40.

68. Нехаев И.В. Сепсис у онкологических больных в раннем послеоперационном периоде: взгляд клинициста. / И.В. Нехаев, С.П. Свиридова, О.Г. Мазурина, А.В. Сытов, А.В. Ломидзе // Инфекция и атимикробная терапия. -1999. Т. 5.-№1.-С. 7-12.

69. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. пер с англ. //Под ред. Дж. Хоул-таидр. -М.-1997. -432 с.

70. Папко А.Г. К оценке иммунодепрессивного действия пенициллина у больных пневмонией / А.Г. Папко, Е.Н. Шмелев // Лаб. дело.-1983.-№11.-С. 33-35.

71. Перепанова Т.С. Неосложненная инфекция мочевых путей. / Т.С. Перепанова, Ю.В. Кудрявцев, П.Л. Хазан // Cons med. прил.-2003.-Т. 5 №1.-С. 14-17

72. Петровская В.Г. Микрофлора человека в норме и патологии. / В.Г. Петровская, О.П.Марко // -М.,-1976.- 98 с.

73. Петухова И.Н. Опыт применения имипенема/циластатина при инфекционных осложнениях онкологических больных. / И.Н. Петухова, Н.В. Дмитриева, О.М. Дронова// Ibid.-1993.-№1.- С. 27-30.

74. Пинегин Б.В. / Б.В.Пинегин, В.М. Коршунов, А.В. Бодрягина //Ж. мик-робиол.-1982.-№11.-С. 34-39.

75. Польнер А.А. Исследование влияния пенициллина на хемотаксис лейкоцитов периферической крови / А.А. Польнер, С.М. Орлов // М.,1987.-с.10- Рук. деп. ВНИИМ и МЗ СССР.-№12 С. 640-78.

76. Применение иммунокоррегирующей терапии при гемобластозах. //Тез. докл. III Всесоюзного съезда гематол. и трансфузиол.-Киров.-1991.-Т. 1.-С. 192

77. Руднов В.А. Современное клиническое значение синегнойной инфекции и возможностей её терапии у пациентов отделений реанимации / В.А. Руднов // Инф. и антимикроб, терапия.- Т. 4 №6.-2002. С. 45-49.

78. Сазыкин Ю.О. П.Эрлих и начало современной антимикробной химиотерапии. / Ю.О. Сазыкин //Антибиотики и химиотер.- 1999.- Т. 12 №44.- С. 5-14.

79. Саркисян Б.Г. Агамалян С.С., Элоян Д.И.и др. // Клин. мед. -1989.- №2.-С. 123-125.

80. Сергеев А.Ю. Кандидоз. Природа инфекции, механизмы агрессии и защиты, лабораторная диагностика, клиника и лечение. / А.Ю. Сергеев, Ю.В. Сергеев // М: Триада-Х,-2000.-472 с.

81. Сибиряк С.В. Иммуностимуляторы и аутоиммунитет.// Фармакол. и ток-сикол.-1990.-№3.-С. 67-72.

82. Сидоренко С.В. Бета-лактамные антибиотики /Сидоренко С.В., Яковлев С.В. //РМЖ.- 1997.-Т. 5 № 21 С. 1367-1381.

83. Сидоренко С.В. Инфекционный процесс как «диалог» между хозяином и паразитом / С.В. Сидоренко // Клин, микробиол. и антимикробная хи-миотерапия.-2001.-Т. 3 №4. С. 301-315.

84. Смолянская А.З. Природа устойчивости к антибактериальным препаратам / А.З. Смолянская, Т.Е. Егорова // Сб. Госпитальная инфекция и лекарственная устойчивость микроорганизмов. -М. 1992.-С. 65-67.

85. Соколов В.Ю. Антиинтерфероновая активность микроорганизмов / В.Ю.Соколов // Персистенция микроорганизмов. Куйбышев, 1990. - С. 83-93.

86. Соловых Г.Н., Бухарин О.В., Немцева Н.В.// Экология.-1994.-№6.-С.82-85.

87. Сомов Г.М. Сапрофитизм и паразитизм патогенных бактерий. Экологические аспекты./ Г.М. Сомов, В.Ю. Литвин //- Новосибирск, 1988.

88. Страчунский Л.С. Consilium medicum Экстра выпуск 2002. - С. 6-9.

89. Тимаков В.Д. Биологические и генетические характеристики бактерий рода Shigella / В.Д.Тимаков, В.Г.Петровская, В.М.Бондаренко. М., 1980.-210 с.

90. Туйгунов М.М. Роль Энтеротоксина бактерий рода Citrobacter в исходе взаимодействия «патоген-хозяин»: Автреферат д-ра. мед. наук. -Челябинск-2003. 41 с.

91. Тупицын Н.Н. Клиническое значение иммунофенотипа острых миелоб-ластных лейкозов. / Н.Н. Тупицын, А.В. Попа, И.Г. Маркина // Гематология и трансфузиология.-1999.-№3.-С. 3-8.

92. Хмелевская Г.В. Факторы патогенности некоторых условно-патогенных бактерий вызывающие диареи. / Г.В. Хмелевская, Л.В. Девтерева, Э.А. Яговкин // Ж. микробиол. 1990. - №4. - С. 97-101.

93. Чахава О.В. Паразитоценология на начальном этапе /Чахава О.В., Горская Е.М. //Тр. II Всес. Съезда паразитоценологов-Киев.- 1985. С. 229236.

94. Шабалин В.Н., Серова Л.Д. Клиническая иммуногематология //М: медицина, 1988-310 с.

95. Шубатидзе А.Э. Антибиотикочувствительность госпитальных штаммов стафилококков. / А.Э. Шубатидзе, И.А. Мараушвили, Т.Г. Габисония // Антибиотики и химиотерапия. 1995. - №8. - С. 23-26.

96. Яковлев С.В. Госпитальные инфекции, вызванные резистентными гра-мотрицательными микроорганизмами: клиническое значение и современные возможности терапии. / С.В. Яковлев //Инфекция и антимикробная терапия.-2004.- Т. 6 №4. С. 133-136.

97. Яковлев В.П. Клинико-лабораторное обоснование назначения цефо-перазон/сульбактама больным с тяжелыми госпитальными инфекциями /Яковлев В.П., Щавелев Д.Л., Яковлев С.В.//Инфекц. и антимикробная химиотерапия.-2002.-Т.4 №5. С. 56-62.

98. Ярбо Дж. У. Срочная медицинская помощь в онкологии. / Под ред. Дж. У. Ярбо, Р. С. Борнстейна. Пер. с англ. М., Медицина, 1985. С. 264 -91.1. Иностранная литература:

99. Aktories К. Rho proteins: targets for bacterial toxins. Trends Microbiol 1997;5:282-8.

100. Allesio M.et al. Interspecific plasmid transferand modification of heat stable enterotoxin expression by Klebsiella pneumoniae from infants with diarrhea/ M. Allesio, F. Albano, L. Tarralo, A. Guarino// Pediatr. Res.- 1993.-Vol. 33.-P. 205-208.

101. Alexander J.W., Boyce S.T., Badcock G.F., et al. //Ann. Surg.-1990.-V.212.-P.496-512.

102. Appelbaum P.C. Transductional analysis of nonmotile mutants in Proteus mirabilis / P.C. Appelbaum, O.W. Prozecky // T. of Gen. Microbiology. -1973.-77. -№1. P. 89-97.

103. Bagirova N. Pattern of fungal infectionsin patientswith hematologicals malignancies./ Bagirova N., Dronova O., Volkova M. //HIS-EHA Combined Haematology Congress., Amsterdam, The Netherlands, 4-8 July,-1998.-p.90.

104. Bauer M.E. Characterization of an RTX toxin Enterohaemorragic Escherichia coli 0157:H7// Bauer M.E., Welch R.A.//Methods enzymol.-1994.-V.325.-P.667-678

105. Beutin L. Enterohemolysin, a new type hemolysin produced by some strains of enteropathogenic E.coli (EPEC) / L. Beutin, J. Prada, S. Zamermann et al. // Zbl. Bakt. Hyg. A. -1988. -Bd.267. -S.576-88.

106. Bhakdi, S. Effects of Escherichia coli hemolysin on human monocytes. /Bhakdi, S., M. Muhly, S. Korom, and G. Schmidt.//J. Clin. Investig. 1990.85:1746-1753.

107. Blanco M. Serotypes, Virulence Genes, and Intimin Types of Shiga Toxin (Verotoxin)-Producing Escherichia coli Isolates from Healthy Sheep in Spain. /Blanco M.,. Blanco J. E, Mora A.//J.of Clin. Microbiol.- 2003.- Vol. 41, No. 4.-p. 1351-1356.

108. Boogaerts M.A. J Antimicrob Chemother 1995, 36, Suppl A, 167-78

109. Brion J.P. Etude progrective et comparative de deux protocoles antibio-therapie chez 66 malades neutropeniques febriles. Ceftazidim- vancomycine ticarcelline /Brion J.P., Bru J.P., Michaelet M. // Pressemed. 1988.-vol.4-№7.-p. 1964-1967.

110. Boyce TG. Escherichia coli 0157:H7 and the hemolytic-uremic syndrome. / Boyce TG, Swerdlow DL, Griffin PM. //N Engl J Med 1995;333:364-8.

111. Cavalieri, S. J. Escherichia coli alpha-hemolysin: characteristics and probable role in pathogenicity. /Cavalieri, S. J., G. A. Bohach, and I. S. Snyder.// Microbiol. Rev. -1984.-48:326-343.

112. Cavalieri, S. J. Effect of Escherichia coli alphahemolysin on human peripheral leukocyte viability in vitro./Cavalieri, S. J., and I. S. Snyder, infect. Immun.-1982.- 36:455-461.

113. Centers for Disease Control. Isolation of E.coli 0157:H7 from sporadic cases of hemorrhagic colitis United States. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1982;31:580-5.

114. Chambers S.T. Cystitis and urethral syndromes 11 In Armstrong D. Cohen J., editors.//Infect. Dis.-1999.-V.l.-P.1571-1578

115. Chong, C. Y. Infections in acute lymphoblastic leukaemia./ Chong, C. Y., A. M. Tan, and J. Lou. //Ann. Acad. Med. Singapore.-1998.-V.27-P.491-495.

116. ClarceA.I. The prevalence of gentamicin 2, -IV- acetyltransferase in the Peroteae and its rale in the O-acetylation of peptidoglycan./ A.I Clarce, D. Framci, W.I. Keenleuside // FEMS. Microbiol. Lett.-1996.-vol. 145-№12.-P.201-207.

117. Coetzee J.N. Fimbriae and Haemaglutining properties in strains of Proteus/ Coetzee J.N. Perhet G., Nheron J.J. //Nature(London)-1962.-V.196.-P.-497-498.

118. Collier RJ. ADP-ribosylating toxins and g proteins./ Collier RJ, In: Moss J, Vaughan M, editors.// Am Soc Microbiol; 1990.- p.3-19.

119. Cooke E.M. Ewins S., Shooter R.A.// Brit. Med. J.-1969.-№l-P.593-595.

120. Cooke, E. M. Properties of strains of Escherichia coli isolated from faeces of patients with ulcerative colitis, patients with acute diarrhea and normal persons.//J. Pathol. Bacteriol. -1968-.95:101-113.

121. Cooke, E. M. Properties of strains of Escherichia coli isolated from a variety of sources./Cooke, E. M., and S. P. Ewins.// J. Med. Microbiol. -1975.8:107-111.

122. Cordonnier, C. Cefepine/amikacin versus ceftazidime/amikacin as empirical therapy for febrile episodes in neutropenic patients: a comparative stu-dy./Cordonnier, C., R. Herbrecht, J. L. Pico, M. //Clin. Infect. Dis. -1997.-V.24-P.41-51.

123. Cullman W., Comparative evalution of orally active antibiotics against community-acquired pathogens a multi center study in five Mediterranean countries// J. Chemother.-1995.- V. 7.- P. 21-25

124. David G. The PapC usher forms an oligomeric channel: Implications for pilus biogenesis across the outer membrane/ David G. Thannasi, Evan T.

125. Saulino, Mary-Jane Lombardo, Robyn- Roth, John Heuser, Scott J.Hultgren. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998 -V 95 - p. 3146-3151

126. Duquid J.P., Ocol D.C. Adhesive properties in Enterobacteriaceae.//In bac-teriae Adherence series 13.-V.6.-1980.-P. 185-217.

127. Eisner H.A. Fatal pulmonary hemorrhage in patients with acute leukemia and fulminant pneumonia caused by Stenotrophomonas maltophilia. /Eisner

128. H.A., Duhrsen U., Hollwitz В., Kaulfers P.M.,Hossfeed D.K.// Ann-hematal.-1997. Apr., 74(4): 155-161.

129. Endo Y. Site of action of a Vero toxin (VT2) from Escherichia coli. 0157:147 and Shiga toxin in eucaryotic ribosomes./Endo Y, Tsurngi K, Yutsucio T, Takeda Y, Ogasawara Y, Igarashi K.// Eur J Biochem 198;171:45-50.

130. Falbo V. Isolation and nucleotide sequence of the gene encoding cytotoxic necrotizing factor 1 of Escherichia coli. / Falbo V, Pace T, Picci L, Pizzi E, Caprioli A. //Infect Immun 1993 61: 4909-14.

131. Frasier ME. Crystal structure of the holotoxin from Shigella dysenteriae at 2.5 A resolution. / Frasier ME, Chernaia MM, Kozlov YV, James MNG.//Nature Structural Biol.- 1994.-1:59-64.

132. Gabriel E. Bacterial Adhesins: Common Themes and Variations in Architecture and Assembly/ Gabriel E. Soto, Scott J.Hultgren.// J. of Bacteriol. -1999 -V.181 N4-P. 1056-1071

133. Gadeberg, O.V. Cytotoxic effect of an alpha-hemolytic Escherichia coli strain on human blood monocytes and granulocytes in vitro./ Gadeberg, О. V.,

134. Orskov, and К. M. Rhodes. // Infect. Immun.- 1983.-41:358-364.

135. Gianella R.A. E.coli heat- stabile enterotoxins, gunilins and their receptors: whatare they and what do theydo?/J. Lab. Clin. Med.- 1995.- Vol. 125.- P. 173-81.

136. Gilbert DN.et al. The Sanford Guide to antimicrobial therapy. USA 1998; 136.

137. Giron R. Characterization of fimbriae produced by enteropathogenic E.coli /Giron R. A.S.Y. Ho Schoonik G.K.// J.Bacteriology.-1993.-v.l75.-P.7391-7403.

138. Given R. Peritonsillar abscess, retripharyngeal abscess, mediastinitis, and nonclostridial anaerobie myonecrosis a case report // R. Given, M.L. Vai-sanen, S.M. Finegold//Clin. Infect. Dis.-1993.-V.16.-P.299-303.

139. Goyal J. Studies on the mechanism of Escherichia coli heat-stable entero-toxin-induced diarrhoea in mice./ Goyal J, Ganguly NK, Mahajan RC, Garg UC, Walia BN.//Biochim Biophys Acta.- 1987.-№11;925(3):341-6.

140. Gregor R. Bacterial adherence in the pathogenesis of urinary tract infection a review/ Gregor R., Jack S.D.//Rev. Infect. Dis.-1987.-V.9.-№3-P.470-487.

141. Grouford J. Reduction by granulocyte colony- stimulating factor of fever and neutropenia / Grouford J., Ozer H., Stoller R., Johnsin D., Lyman G., Tabbara I., Kris M., //New end J. Med. 1991.-Vol.325.-№3-p.l64-170.

142. Hackford A. Polymicrobial intraabdominalinfection: medical /surgical therapy. Infections in surgery 1990; a(suppl 1): 40-6

143. Hilali F. Prevalence of Virulence Genes and Clonality in Escherichia coli Strains That Cause Bacteremia in Cancer Patients./ Hilali F.,Ryimy R.// Infect and Immun.-2000.- Vol. 68, No. 7-p. 3983-3989

144. Hoepelman A.I.M. Bacteriuria in men infected with HIV-l is related to their immune status (CD4+ cell count). / Hoepelman A.I.M, van Buren M., van den Broek J., Borleffs J.C.C //Aids 1992; 6:179-84.

145. Holmgren J. Action of cholera toxin and the prevention and treatment of cholera//J. Holmgren//Nature.-1981.- Vol.292.- P. 413-417.

146. Johnson J.R. P fimbriae and other virulence factors in E.coli urosepsis: association with patients' characteristics. / Johnson J.R., Roberts P.L., Stamm W.E.//J Infect Dis 1987; 156:225-9.

147. Jones R.N. Important and emerging betalactamose- mediatod resistantes in hospitallosed pathogens: the AmpC enzymes/ Jones R.N.// Diagn. Microbiol. Infect. Diseas-1998.-vol.31.-№3.-P.461-466.

148. Jorgenson, S. E. Studies on the origin of the alpha haemolysin produced by Escherichia coli. / Jorgenson, S. E., E. C. Short, H. J. Kurtz, H. K. Mussen, and G. K. Wu.//J. Med. Microbiol. -1975.-9:173-189.

149. Knutton, S. Actin accumulation at sites of bacterial adhesion to tissue culture cells: basis of a new diagnostic test for enteropathogenic Escherichia coli./Knutton, S., P. H. Williams, and A. S. McNeish.// Infect. Immun.- 1989.57:1290-1298.

150. Lally E.T. The interaction between RTX toxins and target cells/ Lally E.T., Hill R.B., Kieba J.R., Korostoff J.//Trends Microbiol.-1999.- V.7.-P.356-361

151. Lockman H. Nucleotide sequence analysis of the A2 and b subunits of the Vibrio cholerae enterotoxin / H. Lockman, J.B. Kaper// J. Biol.Chem.-1983.-Vol.258.-P. 13722-6.

152. Li JT, Lu Y, Hou J. et al.// Clin Inf Dis.- 1997.- 24.-p. 498-505

153. Lin CS. The detection and study on enterotoxigenic Escherichia coli in China// Lin CS, Zeng ZH, Zeng NM. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 1996 Oct;17(5):264-7.

154. Nealson, К. H., Piatt, T. & Hastings, J. W.// J. Bacteriol. -1970. 104, 313322.

155. Mackman, N. Functional characterization of acloned haemolysin determinant from E. coli of human origin, encoding information for the secretion of a 107L polypeptide./ Mackman, N., and I. B. Holland.// Mol. Gen. Genet. 1984.320:123-134

156. Mahlknecht U. Successful treatment of disseminated central nervous aspergillosis in a patient with acute myeloblastic leukemia. /Mahlknecht U., Lintig F., Mertelsmann R.//Leukemia and lymphoma. 1997; 27:191-4.

157. Mellata M. Role of Avian Pathogenic Escherichia coli Virulence Factors in Bacterial Interaction with Chicken Heterophils and Macrophages. /Mellata M., Maryvonne D., Lehoux В., Fairbrotherl J.//Infect. and Immun.- 2003.-Vol. 71, No. l.-p. 494-503.

158. Mellies, J. L., Elliott, S. J., Sperandio, V., Donnenberg, M. S. & Kaper, J. B. // Mol. Microbiol.-1999.- 33, 296-306

159. Mikhail M.S. Lower urinary tract dysfunction in pregnancy: a review /Mikhail M.S., Anyaegbunam A.// Obstet. Gynecol. Surv.-l995.-50: 675-683.

160. O-Brien AD. Escherichia coli 0157:H7 strains associated with hemorrhagic colitis in the United States produce a Shigella dysenteriae 1 (Shiga)like cytotoxin. /О-Brien AD, Lively ТА, Chen M, Rothman SW, Formal SB.//Lancet 1983; 1:702.

161. Oethinger M. Association of organic solvent tolerance and fluoroquinolone resistance in clinical isolates of Escherichia coli. /Oethinger M., Kern W.V., Goldman J.D., Levy SB.// J. of Antimicrob. Chem.-1998.-№ 41.-P. 111-114.

162. Orskov I., Orskov F. //Can J. Microbiol.-1992.-V. 38.-P.699-704.

163. Paton, J. C. Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producing Escherichia coli infections. /Paton, J. C., and A. W. Paton.// Clin. Microbiol. Rev.- 1998. 11:450-479.

164. Pauw B. Epidemiology and frequency of systemic fungal infections In book: Serious Candida infections: diagnosis, treatment, and prevention Ed /B.Pauw, G.Bodey 1998, p. 1-3.

165. Pfaller MA., Jones RN, Doern GV et al.//J. Clin Microbiol.-1998.-36(7).-p. 1886-96.

166. Pizzo P.A. Current issues in antibiotic primary management of the National cancer institute /Pizzo P.A.// J. Hosp. Infect.-I990.-Vol 15.-p.41-48/

167. Poolzobel B.L., Neudecker C.,Domizlaff J. et al. // Nutr. Cancer.-1996.-V.26.№3.-P.365-380.

168. Ragaieg R. Results and comlications of induction treatment of acute leucemia in chidren. A personal series of 79 cases (1988-1989). /Ragaieg R.,

169. Bertran Y., Mardini R., Manel A.M., Berthier J.C.//Pediatrie.-1992.-vol.47.-№l.-p.47-53.

170. Rahman M.M. The structure of the capsular polysaccharide from a swarming strain of pathogene Proteus vulgaris. Rahman M.M.,Guardpetter J.,Asokan K.,Carlson R.W.// Carbohydrat. Res.-1997.-№34.-P. 213-220

171. Ribaud P.// Eur. J. Cancer.-1997.-V.33.- P.50-54.

172. Richer H.M., Andremont A, Tanerede C., Pico J.L., Jarwis WR. Rev Infect. Dis.-1991.-13.-211-215

173. Rothbaum, R. A Clinicopathological study of enterocyte-adherent Escherichia coli: a cause of protracted diarrhea in infants. /Rothbaum, R., A. J. McAdams, R. Giannella, and J. C. Partin.//Gastroenterology -1982.-83:441-454.

174. Saha V. The treatment of Pseudomonas aeruginosa meningitis old regime or newer drugs? / Saha V., Stasfield R., Masterton R., Eden T.//Scand. J. Infect. Dis.- 1993.-vol.25-№l.-P.81-83.

175. Salonen J. Fungal colonisation and invasive fungal infections in patients with a hematological malignancy.// Medica-odontologica.- 2000.-T.47.-p. 3013-3014

176. Saurina G. Antimicrobial resistance in Enterobacteriaceae in Brooklyn, NY: epidemiology and relation to antibiotic usage patterns. /Saurina G., Quale J.M., Manikal V.M.//J Antimicrob Chemother 2000 Jun; 45(6): 895-8.

177. Saxena SK. Shiga toxin, Shiga-like toxin II variant, and ricin are all single-site RNA N-glycosidases of 28 S RNA when microinjected Xenopus oocytes. /Saxena SK, O-Brien AD, Ackerman KJ.// J Biol Chem 1989;264:596-601.

178. Schimpf S.C. Infections in the cancer patient-diagnosis, prevention and treatment. /Schimpf S.C.//Ibid.-1990.-2666-2675.

179. Scevola D, Marone P. Flora intestinale e salute dalla microbiologia alia clinica. /Scevola D, Marone P.//Milano, 2000; 120 p.

180. Sears C.L. Enteric bacterial toxins: mechanisms of action and lineage to intestinal secretion//C.L. Sears, J.B. Kaper// Microbiol. Reviews.-1996.-Vol.-60-P. 167-215.

181. Sears C.L. Enteric bacterial toxins: mechanisms of action and lineage to intestinal secretion//C.L. Sears, J.B. Kaper.//Microbiol. Rewiew.-1996.-V. 60.-P. 167-215.

182. Senior B.W., Loomes L.M., Kern M.A. The production and activity in vivo of Proteus mirabilis IgA protease in infections of the urinary tract. /Senior B.W., Loomes L.M., Kern M.A.// J. med. Microbiol. -1991.- №4.-P. 203-207.

183. So M. Molecular cloning of an E.coli plasmid determinant that encodes to the production of heat-stable enterotoxin / M. So, H.W. Royer, M. Bellach, S. Falkow // J. Bacterid. -1976. -Vol.128. -P.463-72.

184. Sixma TK. Redefined structure of Escherichia coli heat-labile enterotoxin, a close relative of cholera toxin. /Sixma TK, Kalk KH, van Zanten BA, Dauter Z, Kingma J, Witholt В //J Mol Biol.- 1993;230:890-918.

185. Song L. Structure of staphylococcal alpha-hemolysin, a heptameric transmembrane pore. /Song L, Hobaugh MR, Shustak C, Cheley S, Bayley H, Gouaux JE. //Science 1996;274:1859-66.

186. Spitzer E.D. Persistence of initial infection in recurrent Cryptococcus neo-formans meningitis / Spitzer E.D., Spitzer S.G., Freundlich L.F., Casadevall A.//Lancet.-1993 .-Vol.341 .-№45.-P.595-596

187. Stein PE. Crystal structure of the cell-binding В oligomer of verotoxin-1 from E coli. /Stein PE, Boodhoo A, Tyrell GT, Brunton J, Read RJ.//Nature -1992.-355:748-50.

188. Stein РЕ. The crystal structure of pertussis toxin. /Stein PE, Boodhoo A, Armstrong GD, Cockle SA, Klein MH, Read RJ. // Structure.- 1994.-2:45-57.

189. Suh J-K. Shiga toxin attacks bacterial ribosomes as effectively as eu-karyotic ribosomes. /Suh J-K, Hovde CJ, Robertus JD. //Biochemistry 1998;-37:9394-8.

190. Svanborg Eden, C., and P. de Man. Bacterial virulence in urinary tract./Svanborg Eden, C., and P. de Man.// Infect, immun. -1987.- 1:731-750.

191. Sznol M. Use of prefentiallyreplicating bacteria for the treatment of cancer. /Sznol M., Lin S., Bermudes D. // J. Clin invest.-2000.-105(8)-P.1027-1030.

192. Sulakvelidze A., Alavidze Z., Glenn Morris D.J. Bacteriophage Therapy. / Antimicrob. agents and chemoth. 2001. - Vol. 45. - N. 3. - P. 649-659.

193. TancreMe, C. Bacterial translocation and gramnegative bacteremia in patients with hematological malignancies. /TancreMe, C., and A. Andremont.// J. Infect. -1985.- Dis. 152:99-103.

194. Thomas Venetta S. Identification of Ure R binding sites in the Enterobac-teriaceae plasmid-encoded and P.mirabilisurease gene operons // Thomas Venetta S., M. Collins Carleen. // Mol. Microbiol.-1999.-Vol. 31.-№5.-p.1417-1428.

195. Todeschini G. Gram-negative septucemia in patients with hematologic ma-lignacies /Todeschini G., Vinante F., Benini F. // Eur. J. Cancer-1984. -Vol. 20 -№3.- 327-331.

196. Tomita T. Molecular biology of the pore-forming cytolysins from Staphylococcus aureus, alpha- and gamma-hemolysins and leukocidin. /Tomita T, Kamio Y.//Biosci. Biotechnol. Biocheml997;61:565-72.

197. Ulshen M. H. Pathogenesis of Escherichia coli gastroenteritis in man-another mechanism. /Ulshen, M. H., and J. L. Rallo.// N. Engl. J. Med.- 1980.302:99-101. VOL. 40, -2002 notes 297

198. Ungheri D. In-Vitro Susceptibility of Quinolon£-Resistant Clinical Isolates of Escherichia coli to Fosfomycin Trometamol /Ungheri D., Albini E., Bel-luco G.// J Chemother 2002; 14:237-40.

199. Welch R.A. Identification of two different hemolysin determinants in uro-pathogenic Proteus isolates /Welch R.A.// Infect. Immunol. 1987.-V. 55-P.2183-2190.

200. Wick M.J. Site of action of a Vero toxin VT(2) from E.coli 0157:H7 and Schiga-toxin in eucariotic ribosomes. /Wick M.J., Tsurugi K.,Jutsucio Т., Ta-ceda J., Ogasawara J., Jagarashi K.//Eur J. Biochem.-1998.-171:45-50.

201. Wick MJ. ADP-ribosylating toxins and g proteins./Wick MJ, Iglewski ВН. In: Moss J, Vaughan M, editors.// Am Soc Microbiol; 1990.p.l 1-43.

202. Yvonne M. Lee. P Pilus Assembly Motif Necessary for Activation of the CpxRA Pathway by PapE in Escherichia coli /Yvonne M. Lee, Patricia A. DiGiuseppe, Thomas J. Silhavy, Scott J. Hultgrenl. //J. of Bacteriol.-2004.-V. 186(13)-p. 4326-4337.