Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика биологических свойств бактерий рода Serratia, выделенных при инфекционных процессах различной локализации

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика биологических свойств бактерий рода Serratia, выделенных при инфекционных процессах различной локализации"

На правахрукописи

Саляхов Раис Зайнетдинович

ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ РОДА SERRATIA, ВЫДЕЛЕННЫХ ПРИ ИНФЕКЦИОННЫХ ПРОЦЕССАХ РАЗЛИЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ

03.00.07. - «Микробиология»

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Оренбург 2005

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального

развития РФ».

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор Габидуллин Зайнулла Гайнуллинович

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор кандидат медицинских наук, доцент

Усвяцов Борис Яковлевич Валышев Александр Владимирович

Ведущая организация

Челябинская государственная медицинская академия

Зашита диссертации состоится «_»_2005 г. в ....часов на

заседании диссертационного совета Д.2008.066.03 в Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Оренбургской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан «_»_2005 год

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Немцева Н.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В связи с неблагополучной экологической ситуацией и нерациональным применением антибактериальных препаратов в практике, в последние годы наблюдается тенденция увеличения частоты выделения условно-патогенных грамотрицательных бактерий, в частности бактерий рода Serratia, при инфекциях различной локализации (Колганов А.Н. и соавт., 1992).

Бактерии рода Serratia достаточно широко распространены в природе: их обнаруживают в воде, почве, пищевых продуктах, а в последние годы они стали выделятся от здоровых и больных людей, животных (Покровский В.И., 1985).

Бактерии рода Serratia часто являются причиной гнойно- воспалительных, кишечных заболеваний (Абрикосова Н.Ю., 1990) и инфекций мочевыводящих путей (Obana Y., 1991; Parment PA., 1992). Инфекционные процессы, вызванные этими бактериями, нередко развиваются у детей раннего возраста, онкологических больных, и являются причиной внутрибольничных инфекций (KrishnanPU., 1991; Warren NP., 1991).

Способность бактерий рода Serratia размножаться в макроорганизме и вызывать инфекционный процесс зависит от наличия у бактерий ряда факторов, определяющих их адгезивную, колонизирующую, цитотоксическую и энтеротоксическую активности возбудителя. В связи с этим изучение этих факторов, может позволить разработать критерии этиологической значимости, основанные на изучении указанных биологических характеристик возбудителей и улучшить диагностику инфекций, вызванных бактериями рода Serratia. К сожалению, недостаточно изучены роль отдельных поверхностных структурных элементов бактериальной клетки Serratia и факторов обуславливающих патогенность клинических изолятов, в частности их адгезивная, энтеротоксигенная, гемолитическая, ДНК- азная, лецитиназная активности и персистентный потенциал микроорганизмов.

Исходя из вышеизложенного, проведение комплексных исследований, направленных на изучение факторов патогенности, тесным образом связанных с этиологической значимостью выделяемых штаммов бактерий рода Serratia является весьма актуальным.

Цель исследования.

Изучить биологические свойства клинических штаммов бактерий рода Serratia, выделенных от больных с инфекционными процессами различной локализации.

Задачи исследования:

1. Изучить частоту встречаемости бактерий рода Serratia при кишечных, урологических инфекциях и гнойно-воспалительных заболеваниях хирургического профиля, и их устойчивость к наиболее широко применяемым в практике антибиотикам.

2. Изучить культуральные, морфологические свойства и ультраструктуру клеток бактерий рода Serratia.

3. Выяснить частоту проявления адгезивной, гемолитической (а-, энтеро-, тиолзависимый гемолизин), лецитиназной, ДНК-азной, антилизоцимной, антиинтерфероновой, антикомплементарной, LT-энтеротоксигенной активностей у штаммов бактерий рода Serratia, выделенных от больных с кишечными, урологическими и гнойно- воспалительными заболеваниями.

4. Дать биологическую характеристику бактерий рода Serratia на различных моделях экспериментальной инфекций.

5. Изучить природу генетических детерминант некоторых факторов патогенности бактерий рода Serratia.

Научная новизна.

С помощью электронного микроскопа описаны морфологические особенности бактерий рода Serratia и изучены взаимоотношения между бактериальными клетками Serratia в колониях. Выявлено два типа контактов: плотное слипание и образование перемычек на уровне наружных мембран. У клинических штаммов, обладающих высокой адгезивной активностью по

периметру клеток обнаружены реснички. У двух клинических штаммов Serratia выявлена способность синтеза высокоактивного холероподобного термолабильного энтеротоксина.

Определен широкий спектр антибиотикоустойчивости у клинических штаммов бактерий рода Serratia.

Получены новые данные о распространении а- гемолитической, тиолзависимой, энтерогемолитической, антиинтерфероновой,

антикомплементарной, антилизоцимной, ДНК-азной, лецитиназной активностей клинических штаммов Serratia.

У штаммов, выделенных при кишечных инфекциях, обнаружена способность к синтезу гемолизина нового типа - энтерогемолизина, формирующего на кровяном агаре с 5% кровью барана зоны двойного лизиса и вызывающего накопление геморрагической жидкости в петле тонкого кишечника кролика.

Среди клинических штаммов бактерий рода Serratia выделены два штамма: S. odorifera и S. marcescens, обладающие комплексом факторов патогенности. Штаммы депонированы в ГНИСК им. Л.А. Тарасевича под №№275, 268 соответственно и запатентованы № 2003138265/13 (041348), № 2003133683/13 (036133) и могут быть использованы в качестве эталонных культур при изучении биологических свойств бактерий рода Serratia.

Практическая значимость.

Среди клинических штаммов Serratia выделены культуры, обладающие факторами патогенности, что свидетельствует о их роли в инфекционной патологии человека.

Из числа клинических штаммов Serratia отобраны культуры, обладающие комплексом факторов патогенности, депонированы в коллекции живых культур Государственного Научно - исследовательского института стандартизации и контроля им. Л.А. Тарасевича для использования в качестве эталонных культур.

Полученные в процессе диссертационной работы результаты используются в учебном процессе кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Башкирского государственного медицинского университета и в бактериологических лабораториях г. Уфы, Стерлитамака и Ишимбая.

Положения, выносимые на защиту:

1. Клинические изоляты микроорганизмов бактерий рода Serratia, характеризуются комплексом факторов вирулентности и персистенции.

2. Определены генетические детерминанты факторов патогенности бактерий рода Serratia.

3. При изучении биологических свойств бактерий рода Serratia, в качестве эталонных культур предложены штаммы S. odorifera №275 и S. marcescens №268, депонированные в ГИСК имени Л.А. Тарасевича, обладающие комплексом факторов патогенности.

Апробация работы.

Материалы работы представлялись на научных конференциях Башкирского Государственного Медицинского Университета (2002, 2004); на Ш конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2003); Республиканской Конференции молодых ученых Республики Башкортостан «Медицинская наука-2003»; Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии», ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ, (Уфа, 2004); на 69-й межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых (Курск, 2004); На конференции, посвященной 10-летию НПЦ лечения дисбактериозов НИИ иммунологии ЧелГМА и 60-летию ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия МЗ РФ». (Челябинск, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ и получено 2 положительных решения на изобретения.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы и приложения. Работа изложена на 112 страницах компьютерного текста, содержит 4 таблицы, 21 рисунок.

Список литературы включает 198 источников (88 отечественных и 110 зарубежных авторов).

При проведении исследований были использованы 148 штаммов бактерий рода Serratia, среди которых 48,6% составляли штаммы, выделенные от больных с урологическими, 21,6% - гнойно-воспалительными хирургического профиля, 9,5% - гинекологическими заболеваниями, 6,7% с кишечными инфекциями и 13,6% (20 штаммов) от практически здоровых людей. По биохимическим свойствам 43,9% штаммов принадлежали к виду S. odorífera, 29,1% - S. marcescens, 21,6% - S. liguefaciens, 4,1% - S. rubidaea и 1,3% - S. plymuthica (Рис. 1).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Рис. 1.

Частота встречаемости видов бактерий рода Serratia

4.1% 1.3%

Serratia odorífera

¡ j Serratia marcescens Ц Serratia liquefaciens Щ Serratia rubidaea

Serratia plymuthica

Поскольку бактерии рода Serratia относятся к семейству Enterobacteriaceae, и способны синтезировать пигмент - продигиозин, оказалось, что из всего количества штаммов бактерий S. marcescens 15,5% синтезировали продигиозин.

Бактерии рода Serratia на поверхности универсальных плотных питательных сред растут с образованием характерных изолированных колоний, а в МПБ - вызывают равномерное помутнение с выпадением осадка к концу суточного культивирования. Штаммы S. marcescens образуют пигмент красно-малинового цвета.

При посеве на полужидкий агар бактерии диффундировали в среду в течение суток. Исследования на подвижность методом «раздавленной» и «висячей» капли показали, что бактериальные клетки обладали поступательными и маятникообразными движениями.

На окрашенных препаратах по Граму бактериальные клетки представляли собой мелкие грамотрицательные палочки.

При электронно - микроскопическом изучении бактериальные клетки представляли собой палочки размерами длиной 1,1-1,3 мкм и шириной 0,5-0,6 мкм, окруженные перетрихиально расположенными жгутиками, которые имели различную толщину и длину (2x4 - 20 нм). Их количество и место расположения различны и неодинаковы у разных штаммов, среднее число жгутиков колебалось в пределах от 6 до 50-60. Следует отметить, что на количество жгутиков определенное влияние оказывали используемые в приготовлении препарата химические вещества: так при обработке препаратов раствором уранилацетата наблюдали большую ломкость жгутиков, что соответственно резко уменьшало их количество.

Исследование структуры колоний бактерий рода Serratia показало, что между клетками внутри колоний существуют контакты двух типов: плотное слипание клеток между собой и образование внутрицитоплазматических перемычек на уровне наружных мембран клеточных стенок.

Кроме того, при электронной микроскопии у высокоадгезивных штаммов удалось выявить короткие нитевидные выросты - фимбрии, исходящие из клеточной стенки и располагающиеся на поверхности у бактерий.

При определении групповой, родовой и видовой принадлежности бактерий опирались на их ферментативные свойства. По биохимическим признакам все выделенные штаммы были типичными для рода Serratia.

При изучении антибиотикоустойчивости клинических штаммов Serratia, изолированных при урологических, хирургических, гинекологических, кишечных инфекциях и от здоровых людей, было установлено, что из 148 штаммов 92,4% оказались устойчивыми к ампициллину, 88,8% -стрептомицину, 90,4% - рифампицину, 46,3% - тетрациклину, 50,3% -карбенициллину, 36,4% - гентамицину, 37,6% - левамицетину, 50,3% -канамицину, а наибольшей активностью к данным бактериям обладали ципробай (80%), клафоран (95%), лизолин (78%). Анализ антибиотикоустойчивости бактерий показал, что из всех выделенных штаммов 53% обладали устойчивостью к 5 и более применяемым в практике антибиотикам.

Учитывая, что у патогенных бактерий первым этапом развития инфекционного процесса является лиганд - рецепторное взаимодействие, обусловленное адгезией микроорганизмов на специфических рецепторах чувствительных клеток макроорганизма, для выявления адгезинов у бактериальных клеток использовали реакцию гемагглютинации с эритроцитами различных видов животных и птиц. В качестве клеток-мишеней для выявления адгезинов, и выяснения природы структур бактериальной клетки, определяющих у Serratia адгезивную активность, использовали эритроциты цыпленка (Габидуллин З.Г. и соавт., 1987).

При постановке реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка из 148 штаммов бактерий рода Serratia 39,2% давали маннозочувствительную (MS) и 30,4% маннозорезистентную (MR) реакцию. Среди штаммов способных давать MR реакции гемагтлютинации 45,5% проявляли высокую, 35,3% -среднюю и 19,2% слабую адгезивную активности.

В дальнейшем была изучена частота встречаемости MS, так и MR реакции у культур Serratia, выделенных от больных с хирургическими, урологическими, кишечными, гинекологическими заболеваниями, а так же от практически здоровых людей. Так из 58 штаммов, способных давать положительную MS РГА с эритроцитами цыпленка 44,8% оказались выделенными при урологических, 25,9% - хирургических, 10,3% -гинекологических, 15,5% - кишечных заболеваниях и 3,5% - от здоровых людей (Р< 0,05). Из 45 штаммов, способных давать положительную MR РГА, 53,4% - были выделены при урологических, 33,3% - хирургических, 11,1% -гинекологических, и 2,2% - кишечных заболеваниях.

Одновременно было проведено изучение среднего показателя адгезивности (СПА) в опытах на формализированных эритроцитах I группы крови человека при микроскопическом учете результатов в соответствии с методом Брилис В.И. с соавт. (1986). Результаты исследований показали, что из 148 культур 6,8% штаммов имели высокий показатель СПА, 28,4% -средний, 17,6% - низкий, а у 47,2% культур, в том числе и у штаммов выделенных от здоровых людей СПА вообще не выявлялся (Р< 0,05).

Полученные результаты исследований подтверждают, что адгезия бактерий рода Serratia - это сложный процесс, при котором специфическое взаимодействие микроба с определенными рецепторами клеток хозяина зависит от наличия определенных фимбриальных структур, однако, адгезивная активность, возможно, зависит и от других структур бактериальной клетки, выяснение которых требует дальнейших исследований.

Учитывая, что гемолизины относят к факторам патогенности, и они могут быть использованы в качестве маркеров при оценке этиологической значимости выделенных культур Welch R.A. et. al., (1987), была изучена а-гемолитическая, тиолзависимая гемолитическая и энтерогемолитическая активности у бактерий рода Serratia.

Наличие а-гемолизина исследовали на эритроцитах I группы крови человека. Результаты проведенных исследований показали, что из 148 изученных штаммов Serratia а- гемолитической активностью обладали 36

культур, среди которых высокую активность проявляли 58,3% штаммов, среднюю - 25,0% и слабую - 16,7%, а остальные 112 не проявляли а-гемолитической активности.

Из 36 культур, продуцирующих а- гемолизин, 38,9% были выделены при урологических заболеваниях, 33,3% - при гнойно-воспалительных, 8,3% - при гинекологических, 16,7% - при кишечных инфекциях и 2,8% - от здоровых людей (Рис. 2).

Рис. 2.

Частота обнаружения (%) а-гемолитическом активности бактерий рода Serratia

Достоверность различий в а- гемолитической активности между штаммами, выделенными от больных и здоровых людей, составляет (Р<0,05). По биохимическим свойствам 52,8% штаммов принадлежали к S. marcescens, 27,7% - S. odorífera, 13,9% - S. liquefaciens и 5,6% - S. rubidarae.

Способностью синтезировать тиолзависимый гемолизин обладали 56 штаммов. Из них 33,9% проявляли высокую активность, 44,7% - среднюю и

21,4% - обладали слабой тиолзависимой гемолитической активностью. Из общего, числа штаммов, продуцирующих тиолзависимую гемолитическую активность, 35,7% были выделены при урологических, 32,1% - гнойно-воспалительных, 14,3% - кишечных, 10,7% - гинекологических инфекциях и 7,2% - от здоровых людей. Из штаммов, выделенных от здоровых людей, лишь 1 штамм обладал средней и 3 - слабой тиолзависимой гемолитической активностью. Достоверность различий по тиолзависимой гемолитической активности между штаммами, выделенными от больных и здоровых людей, составляет (Р<0,05). По биохимическим свойствам 42,9% штамма принадлежали к S. marcescens, 39,3% - S. odorífera, 16,1% - S. liquefaciens, 1,7% - S. plymuthica.

Принимая во внимание, что энтерогемолизин является ведущим фактором в развитии диарейного синдрома мы изучили энтерогемолитическую активность бактерий рода Serratia. Оказалось, что зону двойного лизиса на среде Blood agar (Difco и Oxoid) содержащей 5% дефибринированную кровь барана, и ЮМ хлористый кальций давали 8 штаммов изолированных при кишечных инфекциях. Количественное определение энтерогемолитической активности позволило выявить высокую активность у 4 штаммов (в разведении 1:80), у 2- среднюю (1:40) и 2 слабую (1:10). По биохимическим свойствам 6 культур принадлежали к S. odorifera, по одному к S. marcescens и S. liguefaciens. Штаммы, выделенные от здоровых людей оказались не способными продуцировать энтерогемолизин.

Анализ корреляции гемолитической активности и вирулентности показал, что наиболее вирулентными при интраназальном заражении белых мышей и в протистоцидном тесте оказались штаммы, обладающие одновременно гемолитической и энтерогемолитической активностями. Таким образом, результаты данного раздела исследований показали, что клинические штаммы Serratia способны продуцировать а- гемолизин, синтезировать тиолзависимый и энтерогемолизин.

Были изучены и факторы персистенции, позволяющие возбудителю в целях самосохранения от бактерицидных факторов макроорганизма

располагать средствами, направленными на инактивацию механизмов защиты: антилизоцимная (АЛА), антиинтерфероновая (АИА) и антикомплементарная (АКА) активности бактерий (Бухарин О.В., 1999).

Результаты исследований показали, что из 128 клинических штаммов АЛА обладали 69 культур, из них 40 были выделены от больных с урологическими, 17- хирургическими, 7- гинекологическими , 5- кишечными заболеваниями и 5 - от здоровых людей (таблица 1). Достоверность различий между штаммами, выделенными от больных и здоровых людей, составляет (Р<0,05).По биохимическим свойствам - 41,9% культур относились к S. maгcescens, 45,9% - S. odorifera, 12,2% - S. liquefaciens.

Таблица 1.

Частота обнаружения персистентных свойств бактерий рода Serratia

Выделение бактерий при заболеваниях количес тво АЛА АИА АКА

урологические хирургические гинекологические кишечные п п(%) п(%) п (%)

72 32 14 10 40 (55,6%) 17(53,1%) 7 (50,0%) 5 (50,0%) 22 (30,6%) 22 (68,8%) 6 (42,9%) 3 (30,0%) 20 (27,8%) 17 (53,1%) 8 (57,1%) 8 (80,0%)

ИТОГО 128 69 (53,9%) 53(41,4%) . 53 (41,4%)

от здоровых людей 20 5 (25,0%) 4 (20,0%) 5 (25,0%)

АИА обладали 53 культур, из них 22 штамма были выделены при урологических, 22 - хирургических, 6 - гинекологических, 3 - кишечных инфекциях и 4 - от здоровых людей (Р<0,05). По биохимическим свойствам 56,1% культур относились к виду S. odorífera, 35,1%- к S. marcescens и 8,8% - к S. liquefaciens.

АКА признак обеспечивает персистирование микробной, клетки и характеризует способность инактивировать комплемент. Изучение частоты

встречаемости АКА среди клинических штаммов бактерий рода Serratia, выделенных при различных инфекционных процессах, показало, что из 148 штаммов АКА обладали 53 клинических штаммов, среди которых 20 были выделены при урологических, 17 - хирургических, по 8 - гинекологических и кишечных инфекциях, 5 - от здоровых людей (Р<0,05).

Таким образом результаты данного раздела исследований, дают основание заключить, что клинические штаммы бактерии рода Serratia, выделенные от больных с различными инфекционными заболеваниями, чаще обладают персистирующими свойствами (АЛА, АИА, АКА), чем штаммы изолированные от здоровых людей (Р<0,05), что необходимо учитывать при оценке этиологической значимости бактерий рода Serratia.

Лецитиназа - фермент агрессии, биологическая роль которой заключается в растворении лецитина оболочек и мембран клеток, что позволяет считать, лецитиназную активность одним из показателей вирулентности бактерий (Ильинская Б.В., Керашова СИ., 1979).

Исходя из этого, была изучена лецитиназная активность клинических штаммов бактерий рода Serratia.

Как показали результаты наших исследований, из 148 культур Serratia лецитиназной активностью обладали 35 культур, среди которых высокую лецитиназную активность проявляли 34,3%, среднюю - 48,6% и слабую -17,1%.

Структура распределения штаммов с лецитиназной активностью, выделенных при различных заболеваниях представлена на рис. 3, из которого видно, что при урологических инфекциях выявляется более половины штаммов с определяемым признаком (51,4%) и 22,9% бактерий при хирургической патологии и только 5,7% бактерий было выделено от здоровых лиц. Достоверность различий между штаммами, выделенными от больных и здоровых людей, составляет (Р<0,05).

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что клинические штаммы Serratia, выделенные от больных с инфекционными

процессами различной локализации, чаще обладают лецитиназной активностью, что позволяет рекомендовать этот метод при отнесении выделенных штаммов к этиологическим.

Рис.3.

Частота обнаружения (%) лецитиназной активности бактерий рода Serratia

Учитывая, что нуклеиновые кислоты являются основным субстратом действия ДНК-аз и РНК- аз, понятен интерес исследователей к изучению этих ферментов, связанных с патогенностью бактерий (Jacob S.L. et al., 1964, ledakis N. et al., 1974). Подтвреждением тому является, что некоторые представители семейства Enterobacteriaceae, выделенные от больных гнойно-воспалительными и острыми кишечными инфекциями, по сравнению с культурами изолированными из окружающей среды и от здоровых людей чаще обладают ДНК- азной активностью (NassifX., 1987).

В этой связи мы изучили частоту встречаемости среди клинических штаммов бактерий рода Serratia, ДНК- азную активность.

В ходе проведенных нами исследований по изучению ДНК- азной активности было установлено, что из 148 штаммов 48 обладали ДНК-азной активностью, среди которых 37,6% штаммов проявляли высокую, 31,2% -среднюю, 31,2% - слабую активности. Подавляющее количество бактерий с ДНК - азной активностью выделялось при хирургической патологии (41,7%) и от урологических больных (39,6%), доля выделенных микроорганизмов от здоровых составила 4,2%. По видовой принадлежности штаммы распределились следующим образом: 39,6% - S. marcescens, 43,8% - S. odorifera, 16,6% - S. liquefaciens.

В дальнейшим была изучена корреляция ДНК - азной активности с их вирулентностью в опытах интраназального заражения белых мышей и на модели инфузорий туфелек. Анализ полученных результатов показал, что из 48 ДНК - аза активных штаммов 15 обладали вирулентностью, среди которых 46,7% проявляли высокую, 40,0% - среднюю и 13,3% - низкую ДНК - азную активность. Таким образом проведенные исследования показали, что ДНК-азная активность в комплексе с другими факторами патогенности может быть использована в качестве маркера оценки этиологической значимости клинических штаммов бактерий рода Serratia.

Для сравнительной оценки частоты встречаемости патогенных вариантов бактерий рода Serratia использовали следующие тесты:

• отек лапки на беспородных белых мышах;

• изолированная петля тонкого кишечника кролика;

• интраназальное заражение беспородных белых мышей;

• тест на простейших (протистоцидная активность).

Принимая во внимание работу Вартаняна Ю.П. и соавт., 1984 о возможности использования метода «отек лап» для выявления у бактерий термолабильных токсических веществ типа энтеротоксинов, мы на беспородных белых мышах (весом 18-20г) провели исследования по обнаружению термолабильных токсических компонентов в центрифугате 20 часовой бульонной культуры клинических штаммов бактерий рода Serratia. Предварительные исследования показали, что из 148 исследованных культур

Serratia при введении центрифугата 20- часовой бульонной культуры 21 штамма давали разницу между опытом и контролем (65 мг и более). Среди них 23,8% штаммов оказались способными продуцировать LT-энтеротоксин высокой активности (разница составила 105 мг и более), из них 3 культуры - S. marcescens, 2 культуры - S. odorifera, 23,8% штаммов с разницей от 75 до 95 мг. условно считали способными продуцировать активный LT- энтеротоксин, центрифугаты 52,4% штаммов (от 65 до 75 мг) считали способными продуцировать LT- энтеротоксин слабой активности, тогда как штаммы, дающие разницу между опытными и контрольными лапками менее 65мг, считали не способными продуцировать LT- энтеротоксин. Ни один штамм, выделенный от здоровых людей, не давал отек лап белых мышей более 65 мг (Р<0,05).

В дальнейшим определение способности культур продуцировать LT-энтеротоксин проводили в опытах изолированный петли тонкого кишечника кролика.

Полученные результаты показали, что при введении супернатантов бульонных культур Serratia, продуцирующих LT- энтеротоксин, а также энтерогемолизин наблюдали образование экссудата в просвете тонкой кишки, и характеризовалось значениями отношения объема жидкости к длине легированного сегмента (V/L) от 1,0 и более. При этом, штаммы продуцирующие LT-энтеротоксин вызывали накопление серозного экссудата, а штаммы продуцирующие энтерогемолизин геморрагического экссудата, центрифугаты остальных штаммов давали показатели менее 0,5. Необходимо отметить, что отношение объема к длине петли при введении гретого при 56° С центрифугата составило не более 0,3, что дополнительно подтверждало термолабильность токсического вещества, вызывающего накопление жидкости в петле тонкого кишечника кролика.

Необходимо отметить, что штаммы продуцирующие энтеротоксины и энтеротгемолизин, вызывали патоморфологические и гистологические изменения кишечника. Патоморфологическая картина поражения кишечника в известной степени дифференцировалась в зависимости от наиболее

выраженных фенотипических свойств, наличие которых коррелирует с патогенностью бактерий.

Наиболее чувствительным методом при изучении вирулентности бактерий оказался метод интраназального заражения белых мышей (весом 1820), который позволял определять динамику развития острой токсической пневмонии от момента введения возбудителя, а по времени гибели и количеству погибших животных установить степень вирулентности бактерий.

Вирулентность была изучена у 148 клинических штаммов Serratia. При этом только 3,4% штаммов оказались способньми вызывать острую токсическую пневмонию с гибелью более 50% животных в течение 5 часов от начала заражения, 5,4% в течение 12-18 часов вызывали гибель до 50% (средняя степень вирулентности) и 8,1% (слабая степень вирулентности), вызывали гибель 50% животных в течение 36 - 48 часов, 83,1% штаммов были авирулентными, (не вызывали гибель или болезненное состояние животных). Штаммы выделенные от здоровых людей оказались авирулентными (Р<0,05).

С целью выявления цитотоксических токсинов бактерий был использован протистопидный тест, который, по мнению Х.Л. Галикеева и соавт., (1987) позволяет оценивать не только наличие токсинов, но и определять степень вирулентности микроорганизмов в зависимости от времени гибели инфузорий туфелек.

За поведением инфузорий наблюдали до и после внесения суспензии культур Serratia. Оказалось, что при добавлении суспензии вирулентных штаммов движения инфузорий замедлялись и полностью прекращались.

Анализ полученных результатов показал, что 5 штаммов, вызывающих гибель инфузорий в течение 30- 90 секунд, оказались способными вызывать «отек лап» с разницей 105 мг. и более, вызывал гибель более 50% взятых в опыт белых мышей в течение 5 часов с момента интраназального заражения. Из 14 штаммов, вызывающих гибель инфузорий в течение 1,5 - 5,5 минут, 71,4% оказались способными вызывать «отек лап» до 65мг. и гибель до 50% животных в течение 18 часов, а 4 штамма вызывали лишь некоторое болезненное состояние в поведении животных.

Изучение взаимодействия штаммов Serratia с простейшими позволило выявить у штаммов сочетание свойств, вызывающих токсическую пневмонию, «отек лап» и гибель инфузорий - туфелек.

Таким образом, результаты проведенных исследований дали основание заключить, что время, в течение которого происходит гибель инфузорий, зависит от биологической активности клинических штаммов Serratia, в частности от их продукции токсических веществ, наличие которых у бактерий сочетается с их способностью вызывать гибель белых мышей при их интраназальном заражении.

Используя отработанный нами способ определения адгезивной активности бактерий мы попытались выяснить природу генетического детерминанта факторов патогенности клинических штаммов Serratia.

Вначале была выяснена роль плазмид в способности бактерии рода Serratia давать D - маннозочувствительную и D - маннозорезистентную реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка (Габидуллин З.Г. и соавт., 1987). Для этого было отобрано 27 культур с высокой адгезивной активностью и изучен профиль их плазмидной ДНК (Kado C.T., Liu S.T. 1981). При этом 13 штаммов оказались несущими плазмиды. Все плазмидонесущие штаммы были представлены клиническими изолятами. Молекулярные массы плазмид значительно различались. Так электрофоретически было установлено, что бактерии рода Serratia могут нести плазмиды массой от 19 до 120 МД. В качестве контроля использовали штамм S. marcescens ГИСК №268, несущей плазмиду массой 120 МД, обладающий свойством давать D-маннозочувсвительную и D - маннозорезистентную реакции геммаглютинации с эритроцитами цыпленка и его изогенный, бесплазмидный вариант. При этом у изогенных культур не выявлено наличие разницы в их способности давать реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка.

Наши попытки в опытах прямой передачи плазмид осуществить между штаммами Serratia spp, передачи детерминанта, контролирующего реакцию гемагглютинации с эритроцитами цыпленка не увенчались успехом. Полученные результаты дали нам основание заключить, что генетическим

детерминантом, контролирующей MR и MS реакции у Serratia, возможно являются структурные элементы хромосомной природы.

Для выявления природы генетического детерминанта, контролирующего синтез LT- энтеротоксина использовали две группы штаммов и изучали профиль их плазмидной ДНК. Первую группу составляли 3 штамма, продуцирующие высокоактивный LT - энтеротоксин, который вызывали отек лап более 100мг, вторую- 4 штамма, не продуцирующие LT - энтеротоксина и вызывающие «отек лап» не более 35мг. Из 3 штаммов суперпродуцентов LT-энтеротоксина 2 - оказались несущими плазмиду массой 60 МД и 1 штамм 40 МД, а у 4 штаммов второй группы не было выявлено плазмиды массой 60 МД.

В следующей серии опытов изучали возможность конъюгативной передачи Ent плазмиды между бактериями рода Serratia и от Serratia к E.coli К12 G62 Rif®. В качестве донора брали S. marcescens (Ent+, Str®, Amps) и реципиента S. marcescens (Enf, Str* , Amp®). В качестве селективной среды использовали, 2% мясопептонный агар, содержащий 500мкг/мл. стрептомицина и 300 мкг/мл. ампицилина. Полученные трансконъюгаты были способны давать «отек лап» 95 мг и более и на фореграмме просматривалась плазмиды массой

60 МД.

Наши попытки в опытах прямой передачи плазмид осуществить передачу Ent плазмиды от Serratia к E.coli K12 G62 Rif® не имели успеха.

Полученные данные дали нам основание считать, что генетическим детерминантом, контролирующий у бактерий рода Serratia продукцию LT -энтеротоксина, возможно, является конъюгативная плазмида массой 60 МД, выявляемая у ряда бактерий, вызывающих «отек лап» 95мг. и более.

По мнению Ильинской В.В., Керашевой СИ. (1979), Петровской В.Г. с соавт. (1983) гемолизины могут быть отнесены к фактору, потенциальной патогенности энтеробактерий, в том числе и для бактерий рода Serratia.

В связи с этим мы попытались выяснить природу генетического детерминанта, контролирующего свойство продуцировать а- гемолизин.

Исследование проводили на 8 штаммах бактерий рода Serratia, обладающих а- гемолитической активностью, и 6 штаммах, не способных

продуцировать а- гемолизин. В качестве эталонной культуры использовали штамм P. vulgaris Rts-1, обладающий а- гемолитической активностью и несущий плазмиду массой 120 МД. Результаты исследований показали, что среди клонов 8 штаммов, обладающих а- гемолитической активностью, у большинства была обнаружена плазмида массой 120 МД, что указывало на возможную роль данной плазмиды в продукции а- гемолизина.

В дальнейшим эти плазмиды элиминировали по общепринятой методике и у клонов изучали профиль плазмидной ДНК. При этом клоны 6 штаммов потеряли способность продуцировать а- гемолизин, а на фореграмме не просматривалась плазмида массой 120 МД, что указывало на возможную роль данной плазмиды в продукции а- гемолизина.Тем не менее, некоторые клоны, утратившие плазмиды массой 120МД продолжали продуцировать а- гемолизин, что свидетельствовало о вероятности существования у Serratia генетического детерминанта иной природы, контролирующею продукцию а- гемолизина. Все наши попытки осуществить конъюгативную передачу плазмиды массой 120 МД между бактериями рода Serratia и от Serratia к универсальному реципиенту E.coli K12 G62 Rif® не увенчались успехом.

Таким образом, результаты наших исследований позволяют полагать, что генетическим детерминантом адгезивной активности бактерий являются структурные элементы хромосомной природы; продукции LT - энтеротоксина -плазмида массой 60 МД, а- гемолизина - плазмида массой 120 МД и хромосома.

Проведенные опыты по изучению профиля плазмидной ДНК, элиминации и коньюгативной передачи плазмид не позволили выявить плазмиды контролирующие синтез тиолзависимого гемолизина, энтерогемолизина, лецитиназной и ДНК-азной активности.

Методом ПЦР были протестированы клинические штаммы бактерий рода Serratia в количестве 16 штаммов, выделенных при различных инфекционных процессах и несущих плазмидный профиль с различной молекулярной массой. Из них 8 штаммов относятся к виду S. odorifera, 5 штаммов - к S. marcescens, 2 штамма - S. ligufaciens и один - S. rubidara.

Амплификацию участков ДНК «островков патогенности» осуществляли методом ПЦР. ПЦР проводилась в амплификаторе МС-16 («ДНК- технология», Россия). По завершении амплификации из реакционной смеси отбирали аликвоту объемом 10 мкм и анализировали в 1%- 2%-ом агарозном геле, в зависимости от предполагаемого размера фрагмента ДНК.

Проведенные исследования позволили установить факт наличия у протестированных микроорганизмов фрагментов ДНК, специфичных известным генам кластеров патогенности Е. coli. Среди исследованных штаммов образование искомых ампликонов при использовании праймеров к Ыу А и Ыу В имело место в 4 случаях, cnf 1 - в 2, sfa А и sfa G - в 2 случаях (Рис. 3). При этом у 2-х штаммов одновременно были обнаружены фрагменты генов «островков патогенности» к образованию sfa А и sfa G, продукции Ыу А и Ыу В, cnf 1, выделенные при урологической и гинекологической инфекциях, (S. marcescens).

п I; и и

Рис.3. Электрофореграмма тестирования культур на наличие

генов Ыу А, Ыу В.

Таким образом, наши данные по изучению адгезивной, гемолитической (а-, энтеро-, тиолзависимой гемолизин), LT-энтеротоксигенной, лецитиназной, ДНК-азной, антилизоцимной, антикомплементарной, антиинтерфероновой активностей, тестов на и вирулентность, проводимых в опытах на лабораторных животных, в совокупности служат основанием для отнесения ряда выделенных штаммов Serratia к потенциально патогенным, т.е. этиологически значимым, что следует учитывать при проведении профилактики и лечения заболеваний, вызванных бактериями рода Serratia.

ВЫВОДЫ

1. Из клинического материала было выделено 148 изолятов бактерий рода Serratia, среди которых 74 составляли штаммы, изолированные от больных с урологическими, 32 - хирургическими, 14 - гинекологическими заболеваниями, 10 с кишечными инфекциями и 20 от практически здоровых людей. Среди них 43,9% штаммов принадлежали к виду S. odorifera, 29,1% штамма к виду S. marcescens, 21,6% к S. liguefaciens, 4,1% к S. rubidaea и 1,3% к S. plymuthica.

2. Штаммы бактерий рода Serratia, выделенные от больных с кишечными и урологическими инфекциями, обладали высокой адгезивной активностью и по периметру клетки имели реснички, обусловливающие D маннозорезистентнуюгемагглютинацию.

3. Бактерии рода Serratia, выделенные от больных с кишечными, урологическими, гинекологическими и хирургическими заболеваниями, по сравнению со штаммами изолированными от здоровых людей, чаще обладали адгезивной, гемолитической ( энтеро-, тиолзависимой гемолизин), лецитиназной, ДНК-азной активностями и LT-энтеротоксигенностью.

4. Пенетратность и экспрессивность персистентных характеристик (антилизоцимной, «антиинтерфероновой», антикомплементарной активностей)

бактерий рода Serratia, выделенных от больных были значительно выше бактерийных изолятов от здоровых людей.

5. Генетическим детерминантом адгезивной активности являются структурные элементы хромосомной природы, LT- энтеротоксигенности -плазмида массой 60 МД, а а-гемолитической активности как плазмидная (массой 120 МД), так и хромосомная ДНК.

6. Среди клинических изолятов рода Serratia отобраны два штамма S. odorifera и S. marcescens, обладающие комплексом факторов патогенности и депонированные в ГНИСК им. Л.А Тарасевича (№№275, 268 соответственно). Штаммы запатентованы (№ 2003138265/13 (041348), № 2003133683/13 (036133)), для использования в качестве эталонных культур при изучении биологических свойств бактерий рода Serratia.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные результаты являются обоснованием для объяснения этиопатогенеза инфекций, вызванных бактериями рода Serratia.

2. Для оценки этиологической значимости выделенных бактерий рода Serratia рекомендуется использовать в условиях баклаборатории протистоцидный тест и феномен гемагглютинации с эритроцитами цыпленка.

3. Метод ПЦР может быть использован для обнаружения факторов патогенности бактерий рода Serratia.

4. Штаммы S. odorifera ГНИСК №275, S. marcescens ГНИОК № 268 рекомендуется использовать в качестве эталонных культур при идентификации бактерий рода Serratia.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Саляхов Р.З. Характеристика некоторых свойств бактерий рода Serratia /Д.Т. Гашимова, А.А. Ахтариева // Материалы межвузовской студенческой конференции. -Уфа, 2002.-С.100-101.

2. Антибиотикочувствительность условно- патогенных энтеробактерий, выделенных при инфекциях мочевыводящих путей /Р.З. Саляхов, З.Г. Габидуллин, В.З. Галимзянов, А.К. Булгаков, А.А. Ахтариева, М.М. Туйгунов // Материалы III конференции иммунологов Урала. -Челябинск, 2003. -С.49

3. Антибиотикочувствительность бактерий рода Serratia, выделенных при различных инфекциях / Р.З. Саляхов, А.Х. Галиева, А.И. Мусалямова, А.Р. Булатов // Медицинская наука-2003: материалы республиканской конференции молодых ученых Республики Башкортостан. -Уфа, 2003. -С.80.

4. Амплификация участков ДНК «островов патогенности» бактерий рода Serratia методом полимеразной цепной реакции / Р.З. Саляхов, Ю.З. Габидуллин, З.Г. Габидуллин. А.Х. Баймиев, А.А. Ахтариева // Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии: материалы Всероссийской научной конференции молодых ученых, ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ. - Уфа: Иммунопрепарат 2004. -С.21-22.

5. Изучение морфологии и ультраструктуры бактерий рода Serratia / Р.З. Саляхов, И.Б. Ишкильдин, Е.И. Ишкильдина, В.А. Трофимов, Ю.З. Габидуллин // Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии: материалы Всероссийской научной конференции молодых ученых, ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ. -Уфа: Иммунопрепарат 2004.-С.34-35.

6. Гемолитическая активность клинических штаммов бактерий родов Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Proteus, E. coli, Shigella dysenteriae,

Serratia, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia, выделенных в виде смешанных и монокультур / Ю.З. Габидуллин, А.К. Булгаков, Р.З. Саляхов, З.Г. Габидуллин, М.М. Туйгунов // Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии: материалы Всероссийской научной конференции молодых ученых, ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ. -Уфа: Иммунопрепарат 2004 -С.43-44.

7. Гемолитическая активность клинических штаммов бактерий рода Serratia / Р.З. Саляхов, Ю.З. Габидуллин, З.Г. Габидуллин, А.А. Ахтариева //Материалы 69-й межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых. -Курск, 2004. -С.23-24.

8. Критерии этиологической значимости бактерий рода Serratia / Р.З. Саляхов, З.Г. Габидуллин, Ю.З. Габидуллин, А.А. Ахтариева, А.К. Булгаков, Г.Н. Нигматуллина, А.Х. Баймиев // Материалы конференции, посвященной 10-летию НПЦ лечения дисбактериозов НИИ иммунологии ЧелГМА и 60-летию ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия МЗ РФ». -Челябинск, 2004. -С.44-45.

Саляхов Раис Зайнетдинович

ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ РОДА SERRATIA, ВЫДЕЛЕННЫХ ПРИ ИНФЕКЦИОННЫХ ПРОЦЕССАХ РАЗЛИЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ

АВТОРЕФЕРАТ Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Издательская лицензия № 06788 от 01.11.2001. ООО «Издательство «Здравоохранение Башкортостана». 450000, РБ, г.Уфа, ул. Ленина, 3. Тел. (3472) 22-73-50.

Подписано в печать 12.04.2005 г. Формат 60x84 1/16

Гарнитура Times New Roman. Бумага офсетная. Отпечатано на ризографе. Заказ № 19 Усл. печ. л. 2.6 Тираж 100 экз.

07 m 2005 -

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Саляхов, Раис Зайнетдинович

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Роль бактерий рода Serratia в инфекционной патологии человека.

2.2. Факторы патогенности бактерий рода Serratia.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Морфологические и культуральные свойства, ультраструктурные строения и контакты между клетками клинических штаммов бактерий рода Serratia, выделенных от больных гнойно-воспалительными и кишечными инфекциями.

4.2. Антибиотикорезистентность бактерий рода Serratia.

4.3. Характеристика некоторых факторов вирулентности бактерий рода Serratia in vitro.

4.3.1. Адгезивные свойства бактерий рода Serratia.

4.3.2. (а-, энтеро-, тиолзависимые) гемолитические активности бактерий рода Serratia.

4.3.3. Лецитиназная активность клинических штаммов Serratia.

4.3.4. ДНК-азная активность бактерий рода Serratia.

4.4. Персистентные свойства бактерий рода Serratia.

4.5. Комплексная оценка патогенности клинических штаммов бактерий рода Serratia in vivo.

4.5.1. Плантарный тест на беспородных белых мышах.

4.5.2. Петля тонкого кишечника кролика.

4.5.3. Интраназальное заражение беспородных белых мышей.

4.5.4. Протистоцидная активность.

4.6. Генетическая природа некоторых факторов патогенности клинических штаммов бактерий рода Serratia.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика биологических свойств бактерий рода Serratia, выделенных при инфекционных процессах различной локализации"

ГЛАВА 1 АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

В связи с неблагополучной экологической ситуацией и нерациональным применением антибактериальных препаратов в практике, в последние годы наблюдается тенденция увеличения частоты выделения условно-патогенных грамотрицательных бактерий, в частности бактерий рода Ser-ratia, при инфекциях различной локализации (1, 8, 79, 80,192).

Бактерии рода Serratia достаточно широко распространены в природе: их обнаруживают в воде, почве, пищевых продуктах, а в последние десятилетия они часто стали выделяться от здоровых и больных людей, животных (87).

Представители вышеуказанных микроорганизмов в ходе эволюции приобрели способность при попадании в организм человека не только выживать, но и наносить ему вред (5, 84).

Бактерии рода Serratia часто являются причиной гнойно- воспалительных, урологических, гинекологических и кишечных заболеваний (94, 95). Также инфекционные процессы, вызванные этими бактериями, нередко развиваются у детей раннего возраста, онкологических больных, и являются причиной внутрибольничных инфекций (89, 91, 96).

Способность бактерий рода Serratia размножаться в макроорганизме и вызывать инфекционный процесс зависит от наличия у бактерий ряда факторов, определяющих их адгезивную, колонизирующую, цитотоксиче-скую и энтеротоксическую активности возбудителя. В связи с этим изучение этих факторов может позволить разработать критерии этиологической значимости, основанные на изучении указанных биологических характеристик возбудителей и улучшить диагностику инфекций, вызванных бактериями рода Serratia (84). К сожалению, недостаточно изучена роль отдельных поверхностных структурных элементов бактериальной клетки Serratia и факторов, обуславливающих патогенность клинических изолятов, в частности их адгезивная, энтеротоксигенная, гемолитическая, ДНК-азная, лецитиназная активности и персистентный потенциал микроорганизмов.

Исходя из вышеизложенного, проведение комплексных исследований, направленных на изучение факторов патогенности, тесным образом связаных с этиологической значимостью выделяемых штаммов бактерий рода Serratia, является весьма актуальным.

Цель исследования. Изучить биологические свойства клинических штаммов бактерий рода Serratia, выделенных от больных с инфекционными процессами различной локализации.

Задачи исследования:

1. Изучить частоту встречаемости бактерий рода Serratia при кишечных, урологических инфекциях и гнойно-воспалительных заболеваниях хирургического профиля, и их устойчивость к наиболее широко применяемым в практике антибиотикам.

2. Изучить культуральные, морфологические свойства и ультраструктуру клеток бактерий рода Serratia.

3. Выяснить частоту проявления адгезивной, гемолитической (а-, энтеро-, тиолзависимый гемолизин), лецитиназной, ДНК-азной, антилизоцимной, антиинтерфероновой, антикомплементарной, LT-энтеротоксигенной активностей у штаммов бактерий рода Serratia, выделенных от больных с кишечными, урологическими и гнойно- воспалительными заболеваниями.

4. Дать биологическую характеристику бактерий рода Serratia на различных моделях экспериментальной инфекций.

5. Изучить природу генетических детерминант некоторых факторов патогенности бактерий рода Serratia.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. .

С помощью электронного микроскопа описаны морфологические особенности бактерий рода Serratia и изучены взаимоотношения между бактериальными клетками Serratia в колониях. Выявлено два типа контактов: плотное слипание и образование перемычек на уровне наружных мембран. У клинических штаммов, обладающих высокой адгезивной активностью, по периметру клеток обнаружены реснички. У двух клинических штаммов Serratia выявлена способность к синтезу холероподобного термолабильного энтеротоксина.

Определен широкий спектр антибиотикоустойчивости у клинических штаммов бактерий рода Serratia.

Получены новые данные о распространении а- гемолитической, ти-олзависимой, энтерогемолитической, антиинтерфероновой, антикомплементарной, антилизоцимной, ДНК-азной, лецитиназной активностей клинических штаммов Serratia.

У штаммов, выделенных при кишечных инфекциях, обнаружена способность к синтезу гемолизина нового типа - энтерогемолизина, формирующего на кровяном агаре с 5% кровью барана зоны двойного лизиса и вызывающего накопление геморрагической жидкости в петле тонкого кишечника кролика.

Среди клинических штаммов бактерий рода Serratia выделены два штамма: S. odorifera и S. marcescens, обладающие комплексом факторов патогенности. Штаммы депонированы в ГНИСК им. JI.A. Тарасевича под №№275, 268 соответственно и запатентованы № 2003138265/13 (041348), № 2003133683/13 (036133) для использования в качестве эталонных культур при изучении биологических свойств бактерий рода Serratia.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Среди клинических штаммов Serratia выделены культуры, обладающие факторами патогенности, что свидетельствует о их роли в инфекционной патологии человека.

Из числа клинических штаммов Serratia отобраны культуры, обладающие комплексом факторов патогенности, депонированные в коллекции живых культур Государственного Научно - исследовательского института стандартизации и контроля им. Л.А. Тарасевича для использования в качестве эталонных культур.

Полученные в процессе диссертационной работы результаты используются в учебном процессе кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Башкирского государственного медицинского университета и в бактериологических лабораториях г. Уфы, Стерлитамака и Ишимбая.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы работы представлялись на научных конференциях Башкирского Государственного Медицинского Университета (2002, 2004); на III конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2003); Республиканской Конференции молодых ученых Республики Башкортостан «Медицинская наука-2003»; Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии», ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ, (Уфа, 2004); на 69-й межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых (Курск, 2004); На конференции, посвященной 10-летию НПЦ лечения дисбактериозов НИИ иммунологии ЧелГМА и 60-летию ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия МЗ РФ». (Челябинск, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ и получено 2 положительных решения на изобретения.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы и приложения. Работа изложена на 112 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы, 21 рисунок.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Саляхов, Раис Зайнетдинович

ВЫВОДЫ

1. Из клинического материала было выделено 148 изолятов бактерий рода Serratia, среди которых 74 составляли штаммы, изолированные от больных с урологическими, 32 - хирургическими, 14 - гинекологическими заболеваниями, 10 с кишечными инфекциями и 20 от практически здоровых людей. Среди них 43,9% штаммов принадлежали к виду S. odorifera, 29,1% штамма к виду S. marcescens, 21,6% к S. liguefaciens, 4,1% к S. rubidaea и 1,3% к S. plymuthica.

2. Штаммы бактерий рода Serratia, выделенные от больных с кишечными и урологическими инфекциями, обладали высокой адгезивной активностью и по периметру клетки имели реснички, обусловливающие D - маннозорезистентную гемагглютинацию.

3. Бактерии рода Serratia, выделенные от больных с кишечными, урологическими, гинекологическими и хирургическими заболеваниями, по сравнению со штаммами изолированными от здоровых людей, чаще обладали адгезивной, гемолитической (а-, энтеро-, тиолзависимой гемолизин), лецитиназной, ДНК-азной активностями и LT-энтеротоксигенностью.

4. Пенетратность и экспрессивность персистентных характеристик (антилизоцимной, «антиинтерфероновой», антикомплементарной активностей) бактерий рода Serratia, выделенных от больных были значительно выше бактерийных изолятов от здоровых людей.

5. Генетическим детерминантом адгезивной активности являются структурные элементы хромосомной природы, LT- энтеротоксигенности -плазмида массой 60 МД, а а-гемолитической активности как плазмидная (массой 120 МД), так и хромосомная ДНК.

6. Среди клинических изолятов рода Serratia отобраны два штамма S. odorifera и S. marcescens, обладающие комплексом факторов патогенности и депонированные в ГНИСК им. JI.A. Тарасевича (№№275, 268 соответственно). Штаммы запатентованы (№ 2003138265/13 (041348), № 2003133683/13 (036133)), для использования в качестве эталонных культур при изучении биологических свойств бактерий рода Serratia.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В связи с неблагополучной экологической ситуацией и нерациональным применением антибактериальных препаратов в практике, в последние годы наблюдается тенденция увеличения частоты выделения условно-патогенных грамотрицательных бактерий, в частности бактерий рода Serratia, при инфекциях различной локализации.

Способность бактерий рода Serratia размножаться в макроорганизме и вызывать инфекционный процесс зависит от наличия у бактерий ряда факторов, определяющих их адгезивную, колонизирующую, цитотоксическую и энтеротоксическую активности возбудителя. В связи с этим изучение этих факторов, может позволить разработать критерии этиологической значимости, основанные на изучении указанных биологических характеристик возбудителей и улучшить диагностику инфекций, вызванных бактериями рода Serratia.

Исходя из вышеизложенного, проведение комплексных исследований, направленных на изучение факторов патогенности, тесным образом связанных с этиологической значимостью выделяемых штаммов бактерий рода Serratia является весьма актуальным.

При проведении исследований были использованы 148 штаммов бактерий рода Serratia, среди которых 48,6% составляли штаммы, выделенные от больных с урологическими, 21,6% - гнойно-воспалительными хирургического профиля, 9,5% — гинекологическими заболеваниями, 6,7% с кишечными инфекциями и 13,6% от практически здоровых людей. По биохимическим свойствам 43,9% штаммов принадлежали к виду S. odorifera, 29,1%) - S. marcescens, 21,6% - S. liguefaciens, 4,1% - S. rubidaea и 1,3% - S. plymuthica.

Поскольку бактерии рода Serratia относятся к семейству Enterobacteriaceae, и способны синтезировать пигмент - продигиозин, оказалось, что из всего количества штаммов бактерий S. marcescens 15,5% синтезировали продигиозин.

Бактерии рода Serratia на поверхности универсальных плотных питательных сред растут с образованием характерных изолированных колоний, а в МПБ - вызывают равномерное помутнение с выпадением осадка к концу суточного культивирования. Штаммы S. marcescens образуют пигмент красно-малинового цвета.

При посеве на полужидкий агар бактерии диффундировали в среду в течение суток. Исследования на подвижность методом «раздавленной» и «висячей» капли показали, что бактериальные клетки обладали поступательными и маятникообразными движениями.

На окрашенных препаратах по Граму бактериальные клетки представляли собой мелкие грамотрицательные палочки.

При электронно - микроскопическом изучении бактериальные клетки представляли собой палочки размерами длиной 1,1-1,3 мкм и шириной 0,5-0,6 мкм, окруженные перитрихиально расположенными жгутиками, которые имели различную толщину и длину (2x4 - 20 нм). Их количество и место расположения различны и неодинаковы у разных штаммов, среднее число жгутиков колебалось в пределах от 6 до 50-60. Следует отметить, что на количество жгутиков определенное влияние оказывали используемые в приготовлении препарата химические вещества: так при обработке препаратов раствором уранилацетата наблюдали большую ломкость жгутиков, что соответственно резко уменьшало их количество.

Исследование структуры колоний бактерий рода Serratia показало, что между клетками внутри колоний существуют контакты двух типов: плотное слипание клеток между собой и образование внутрицитоплазматических перемычек на уровне наружных мембран клеточных стенок.

Кроме того, при электронной микроскопии у высокоадгезивных штаммов удалось выявить короткие нитевидные выросты - фимбрии, исходящие из клеточной стенки и располагающиеся на поверхности у бактерий.

При определении групповой, родовой и видовой принадлежности бактерий опирались на их ферментативные свойства. По биохимическим признакам все выделенные штаммы были типичными для рода Serratia.

При изучении антибиотикоустойчивости клинических штаммов Serratia, изолированных при урологических, хирургических, гинекологических, кишечных инфекциях и от здоровых людей, было установлено, что из 148 штаммов 92,4% оказались устойчивыми к ампициллину, 88,8% - стрептомицину, 90,4% - рифампицину, 46,3% -тетрациклину, 50,3% - карбенициллину, 36,4% - гентамицину, 37,6%) -левамицетину, 50,3% - канамицину, а наибольшей активностью к данным бактериям обладали ципробай (80%), клафоран (95%), лизолин (78%). Анализ антибиотикоустойчивости бактерий показал, что из всех выделенных штаммов 53% обладали устойчивостью к 5 и более применяемым в практике антибиотикам.

Учитывая, что у патогенных бактерий первым этапом развития инфекционного процесса является лиганд - рецепторное взаимодействие, обусловленное адгезией микроорганизмов на специфических рецепторах чувствительных клеток макроорганизма, для выявления адгезинов у бактериальных клеток использовали реакцию гемагглютинации с эритроцитами различных видов животных и птиц. В качестве клеток-мишеней для выявления адгезинов, и выяснения природы структур бактериальной клетки, определяющих у Serratia адгезивную активность, использовали эритроциты цыпленка.

При постановке реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка из 148 штаммов бактерий рода Serratia 39,2% давали маннозочувствительную (MS) и 30,4% маннозорезистентную (MR) реакцию. Среди штаммов способных давать MR реакции гемагглютинации 45,5% проявляли высокую, 35,3% - среднюю и 19,2% слабую адгезивную активности.

В дальнейшем была изучена частота встречаемости MS, так и MR реакции у культур Serratia, выделенных от больных с хирургическими, урологическими, кишечными, гинекологическими заболеваниями, а так же от практически здоровых людей. Так из 58 штаммов, способных давать положительную MS РГА с эритроцитами цыпленка 44,8% оказались выделенными при урологических, 25,9% - хирургических, 10,3% -гинекологических, 15,5% - кишечных заболеваниях и 3,5% - от здоровых людей (Р< 0,05). Из 45 штаммов, способных давать положительную MR РГА, 53,4% - были выделены при урологических, 33,3% - хирургических, 11,1% - гинекологических, и 2,2% - кишечных заболеваниях.

Одновременно было проведено изучение среднего показателя адгезивности (СПА) в опытах на формализированных эритроцитах I группы крови человека при микроскопическом учете результатов в соответствии с методом Брилис В.И. с соавт. (1986). Результаты исследований показали, что из148 культур 6,8% штаммов имели высокий показатель СПА, 28,4% - средний, 17,6% - низкий, а у 47,2% культур, в том числе и у штаммов выделенных от здоровых людей СПА вообще не выявлялся (Р< 0,05).

Полученные результаты исследований подтверждают, что адгезия бактерий рода Serratia - это сложный процесс, при котором специфическое взаимодействие микроба с определенными рецепторами клеток хозяина зависит от наличия определенных фимбриальных структур, однако, адгезивная активность, возможно, зависит и от других структур бактериальной клетки, выяснение которых требует дальнейших исследований.

Учитывая, что гемолизины относят к факторам патогенности, и они могут быть использованы в качестве маркеров при оценке этиологической значимости выделенных культур Welch R.A. et. al., (1987), была изучена а-гемолитическая, тиолзависимая гемолитическая и энтерогемолитическая активности у бактерий рода Serratia.

Наличие а-гемолизина исследовали на эритроцитах I группы крови человека. Результаты проведенных исследований показали, что из 148 изученных штаммов Serratia а- гемолитической активностью обладали 36 культур, среди которых высокую активность проявляли 58,3% штаммов, среднюю - 25,0% и слабую - 16,7%, а остальные 112 не проявляли а-гемолитической активности.

Из 36 культур, продуцирующих а- гемолизин, 38,9% были выделены при урологических заболеваниях, 33,3% - при гнойно-воспалительных, 8,3% - при гинекологических, 16,7% - при кишечных инфекциях и 2,8% -от здоровых людей.

Достоверность различий в а- гемолитической активности между штаммами, выделенными от больных и здоровых людей, составляет (Р<0,05). По биохимическим свойствам 52,8% штаммов принадлежали к S. marcescens, 27,7% - S. odorifera, 13,9% - S. liquefaciens и 5,6% - S. rubidarae.

Способностью синтезировать тиолзависимый гемолизин обладали 56 штаммов. Из них 33,9% проявляли высокую активность, 44,7% - среднюю и 21,4% - обладали слабой тиолзависимой гемолитической активностью. Из общего числа штаммов, продуцирующих тиолзависимую гемолитическую активность, 35,7% были выделены при урологических, 32,1%) - гнойно-воспалительных, 14,3% - кишечных, 10,7% -гинекологических инфекциях и 7,2% - от здоровых людей. Из штаммов, выделенных от здоровых людей, лишь 1 штамм обладал средней и 3 -слабой тиолзависимой гемолитической активностью. Достоверность различий по тиолзависимой гемолитической активности между штаммами, выделенными от больных и здоровых людей, составляет (Р<0,05). По биохимическим свойствам 42,9% штамма принадлежали к S. marcescens, 39,3% - S. odorifera, 16,1% - S. liquefaciens, 1,7% - S. plymuthica.

Принимая во внимание, что энтерогемолизин является ведущим фактором в развитии диарейного синдрома мы изучили энтерогемолитическую активность бактерий рода Serratia. Оказалось, что зону двойного лизиса на среде Blood agar (Difco и Oxoid) содержащей 5% дефибринированную кровь барана, и ЮМ хлористый кальций давали 8 штаммов изолированных при кишечных инфекциях. Количественное определение энтерогемолитической активности позволило выявить высокую активность у 4 штаммов (в разведении 1:80), у 2- среднюю (1:40) и 2 слабую (1:10). По биохимическим свойствам 6 культур принадлежали к S. odorifera, по одному к S. marcescens и S. liguefaciens. Штаммы, выделенные от здоровых людей оказались не способными продуцировать энтерогемолизин.

Анализ корреляции гемолитической активности и вирулентности показал, что наиболее вирулентными при интраназальном заражении белых мышей и в протистоцидном тесте оказались штаммы, обладающие одновременно а- гемолитической и энтерогемолитической активностями.

Таким образом, результаты данного раздела исследований показали, что клинические штаммы Serratia способны продуцировать ос- гемолизин, синтезировать тиолзависимый и энтерогемолизин.

Были изучены и факторы персистенции, позволяющие возбудителю в целях самосохранения от бактерицидных факторов макроорганизма располагать средствами, направленными на инактивацию механизмов защиты: антилизоцимная (АЛА), антиинтерфероновая (АИА) и антикомплементарная (АКА) активности бактерий (Бухарин О.В., 1999).

Результаты исследований показали, что из 128 клинических штаммов АЛА обладали 69 культур, из них 40 были выделены от больных с урологическими, 17- хирургическими, 7- гинекологическими , 5-кишечными заболеваниями и 5 - от здоровых людей. Достоверность различий между штаммами, выделенными от больных и здоровых людей, составляет (Р<0,05).По биохимическим свойствам - 41,9% культур относились к S. marcescens, 45,9% - S. odorifera, 12,2% - S. liquefaciens.

АИА обладали 53 культур, из них 22 штамма были выделены при урологических, 22 - хирургических, 6 - гинекологических, 3 - кишечных инфекциях и 4 - от здоровых людей (Р<0,05). По биохимическим свойствам 56,1% культур относились к виду S. odorifera, 35,1% - к S. marcescens и 8,8% - к S. liquefaciens.

АКА признак обеспечивает персистирование микробной клетки и характеризует способность инактивировать комплемент. Изучение частоты встречаемости АКА среди клинических штаммов бактерий рода Serratia, выделенных при различных инфекционных процессах, показало, что из 148 штаммов АКА обладали 53 клинических штаммов, среди которых 20 были выделены при урологических, 17 - хирургических, по 8 -гинекологических и кишечных инфекциях, 5 - от здоровых людей (Р<0,05).

Таким образом результаты данного раздела исследований, дают основание заключить, что клинические штаммы бактерии рода Serratia, выделенные от больных с различными1 инфекционными заболеваниями, чаще обладают персистирующими свойствами (AJIA, АИА, АКА), чем штаммы изолированные от здоровых людей (Р<0,05), что необходимо учитывать при оценке этиологической значимости бактерий рода Serratia.

Лецитиназа - фермент агрессии, биологическая роль которой, заключается в растворении лецитина оболочек и мембран клеток, что позволяет считать, лецитиназную активность одним из показателей вирулентности бактерий.

Исходя из этого, была изучена лецитиназная активность клинических штаммов бактерий рода Serratia.

Как показали результаты наших исследований, из 148 культур Serratia лецитиназной активностью обладали 35 культур, среди которых высокую лецитиназную активность проявляли 34,3%, среднюю - 48,6% и слабую - 17,1%.

Структура распределения штаммов с лецитиназной- активностью, выделенных при урологических инфекциях выявляется более половины штаммов с определяемым признаком (51,4%) и 22,9%) бактерий при хирургической патологии и только- 5,7%) бактерий было выделено от здоровых лиц. Достоверность различий между штаммами, выделенными от больных и здоровых людей, составляет (Р<0,05).

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что клинические штаммы Serratia, выделенные от больных с инфекционными процессами различной локализации, чаще обладают лецитиназной активностью, что позволяет рекомендовать этот метод при отнесении выделенных штаммов к этиологическим.

Учитывая, что нуклеиновые кислоты являются основным субстратом действия ДНК-аз и РНК- аз, понятен интерес исследователей к изучению этих ферментов, связанных с патогенностью бактерий (Jacob S.L. et al., 1964, ledakis N. et al., 1974). Подтвреждением тому является, что некоторые представители семейства Enterobacteriaceae, выделенные от больных гнойно- воспалительными и острыми кишечными инфекциями, по сравнению с культурами изолированными из окружающей среды и от здоровых людей чаще обладают ДНК- азной активностью (Nassif X., 1987).

В этой связи мы изучили частоту встречаемости среди клинических штаммов бактерий рода Serratia, ДНК- азную активность.

В ходе проведенных нами исследований по изучению ДНК- азной, активности было установлено, что из 148 штаммов 48 обладали ДНК-азной активностью, среди которых 37,6% штаммов проявляли высокую, 31,2% -среднюю, 31,2% - слабую активности. Подавляющее количество бактерий с ДНК - азной активностью выделялось при хирургической патологии (41,7%) и от урологических больных (39,6%), доля выделенных:-микроорганизмов от здоровых составила 4,2%. По видовой принадлежности штаммы распределились следующим образом: 39,6% - S. marcescens, 43,8% - S. odorifera, 16,6% - S. liquefaciens.

В дальнейшим была изучена корреляция ДНК - азной активности с их вирулентностью в опытах интраназального заражения белых мышей и на модели инфузорий туфелек. Анализ полученных результатов показал, что из 48 ДНК — аза активных штаммов 15 обладали вирулентностью, среди которых 46,7% проявляли высокую, 40,0% - среднюю и 13,3% -низкую ДНК - азную активность. Таким образом проведенные исследования показали, что ДНК- азная активность в комплексе с другими факторами патогенности может быть использована в качестве маркера оценки этиологической значимости клинических штаммов бактерий рода Serratia.

Для сравнительной оценки частоты встречаемости патогенных вариантов бактерий рода Serratia использовали следующие тесты:

• отек лапки на беспородных белых мышах;

• изолированная петля тонкого кишечника кролика;

• интраназальное заражение беспородных белых мышей;

• тест на простейших (протистоцидная активность).

Принимая во внимание работу Вартаняна Ю.П. и соавт., 1984 о возможности использования метода «отек лап» для выявления у бактерий термолабильных токсических веществ типа энтеротоксинов, мы на беспородных белых мышах (весом 18-20г) провели исследования по обнаружению термолабильных токсических компонентов в центрифугате 20 часовой бульонной культуры клинических штаммов бактерий рода Serratia. Предварительные исследования показали, что из 148 исследованных культур Serratia при введении центрифугата 20- часовой бульонной культуры 21 штамма давали разницу между опытом и контролем (65 мг и более). Среди них 23,8% штаммов оказались способными продуцировать LT-энтеротоксин высокой активности (разница составила 105 мг и более), из них 3 культуры - S. marcescens, 2 культуры - S. odorifera, 23,8% штаммов с разницей от 75 до 95 мг. условно считали способными продуцировать активный LT- энтеротоксин, центрифугаты 52,4% штаммов (от 65 до 75 мг) считали способными продуцировать LT- энтеротоксин слабой активности, тогда как штаммы, дающие разницу между опытными и контрольными лапками менее 65мг, считали не способными продуцировать LT- энтеротоксин. Ни один штамм, выделенный от здоровых людей, не давал отек лап белых мышей более 65 мг (Р<0,05).

В дальнейшим определение способности культур продуцировать LT-энтеротоксин проводили в опытах изолированный петли тонкого кишечника кролика.

Полученные результаты показали, что при введении супернатантов бульонных культур Serratia, продуцирующих LT- энтеротоксин, а также энтерогемолизин наблюдали образование экссудата в просвете тонкой кишки, и характеризовалось значениями отношения объема жидкости к длине легированного сегмента (V/L) от 1,0 и более. При этом, штаммы продуцирующие LT-энтеротоксин вызывали накопление серозного экссудата, а штаммы продуцирующие энтерогемолизин геморрагического экссудата, центрифугаты остальных штаммов давали показатели менее 0,5. Необходимо отметить, что отношение объема к длине петли при введении гретого при 56° С центрифугата составило не более 0,3, что дополнительно подтверждало термолабильность токсического вещества, вызывающего накопление жидкости в петле тонкого кишечника кролика.

Необходимо отметить, что штаммы продуцирующие энтеротоксины и энтеротгемолизин, вызывали патоморфологические и гистологические изменения кишечника. Патоморфологическая картина поражения кишечника в известной степени дифференцировалась в зависимости от наиболее выраженных фенотипических свойств, наличие которых коррелирует с патогенностью бактерий.

Наиболее чувствительным методом при изучении вирулентности бактерий оказался метод интраназального заражения белых мышей (весом 18-20), который позволял определять динамику развития острой токсической пневмонии от момента введения возбудителя, а по времени гибели и количеству погибших животных установить степень вирулентности бактерий.

Вирулентность была изучена у 148 клинических штаммов Serratia. При этом только 3,4% штаммов оказались способными вызывать острую токсическую пневмонию с гибелью более 50% животных в течение 5 часов от начала заражения, 5,4% в течение 12-18 часов вызывали гибель до 50% (средняя степень вирулентности) и 8,1% (слабая степень вирулентности), вызывали гибель 50% животных в течение 36 - 48 часов, 83,1% штаммов были авирулентными, (не вызывали гибель или болезненное состояние животных). Штаммы выделенные от здоровых людей оказались авирулентными (Р<0,05).

С целью выявления цитотоксических токсинов бактерий был использован протистоцидный тест, который, по мнению X.JI. Галикеева и соавт., (1987) позволяет оценивать не только наличие токсинов, но и определять степень вирулентности микроорганизмов в зависимости от времени гибели инфузорий туфелек.

За поведением инфузорий наблюдали до и после внесения суспензии культур Serratia. Оказалось, что при добавлении суспензии вирулентных штаммов движения инфузорий замедлялись и полностью прекращались.

Анализ полученных результатов показал, что 5 штаммов, вызывающих гибель инфузорий в течение 30- 90 секунд, оказались способными вызывать «отек лап» с разницей 105 мг. и более, вызывал гибель более 50% взятых в опыт белых мышей в течение 5 часов с момента интраназального заражения. Из 14 штаммов, вызывающих гибель инфузорий в течение 1,5 - 5,5 минут, 71,4% оказались способными вызывать «отек лап» до 65мг. и гибель до 50% животных в течение 18 часов, а 4 штамма вызывали лишь некоторое болезненное состояние в поведении животных.

Изучение взаимодействия штаммов Serratia с простейшими позволило выявить у штаммов сочетание свойств, вызывающих токсическую пневмонию, «отек лап» и гибель инфузорий - туфелек.

Таким образом, результаты проведенных исследований дали основание заключить, что время, в течение которого происходит гибель инфузорий, зависит от биологической активности клинических штаммов Serratia, в частности от их продукции токсических веществ, наличие которых у бактерий сочетается с их способностью вызывать гибель белых мышей при их интраназальном заражении.

Используя отработанный нами способ определения адгезивной активности бактерий мы попытались выяснить природу генетического детерминанта факторов патогенности клинических штаммов Serratia.

Вначале была выяснена роль плазмид в способности бактерии рода Serratia давать D - маннозочувствительную и D - маннозорезистентную реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка (Габидуллин З.Г. и соавт., 1987). Для этого было отобрано 27 культур с высокой адгезивной активностью и изучен профиль их плазмидной ДНК (Kado С.Т., Liu S.T. 1981). При этом 13 штаммов оказались несущими плазмиды. Все плазмидонесущие штаммы были представлены клиническими изолятами. Молекулярные массы плазмид значительно различались. Так электрофоретически было установлено, что бактерии рода Serratia могут нести плазмиды массой от 19 до 120 МД. В качестве контроля использовали штамм S. marcescens ГИСК №268, несущей плазмиду массой 120 МД, обладающий свойством давать D-маннозочувсвительную и D -маннозорезистентную реакции геммаглютинации с эритроцитами цыпленка и его изогенный, бесплазмидный вариант. При этом у изогенных культур не выявлено наличие разницы в их способности давать реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка.

Наши попытки в опытах прямой передачи плазмид осуществить между штаммами Serratia spp, передачи детерминанта, контролирующего реакцию гемагглютинации с эритроцитами цыпленка не увенчались успехом. Полученные результаты дали нам основание заключить, что генетическим детерминантом, контролирующей MR и MS реакции у Serratia, возможно являются структурные элементы хромосомной природы.

Для выявления природы генетического детерминанта, контролирующего синтез LT- энтеротоксина использовали две группы штаммов и изучали профиль их плазмидной ДНК. Первую группу составляли 3 штамма, продуцирующие высокоактивный LT -энтеротоксин, который вызывали отек лап более 100мг, вторую- 4 штамма, не продуцирующие LT - энтеротоксина и вызывающие «отек лап» не более 35мг. Из 3 штаммов суперпродуцентов LT- энтеротоксина 2 -оказались несущими плазмиду массой 60 МД и 1 штамм 40 МД, а у 4 штаммов второй группы не было выявлено плазмиды массой 60 МД.

В следующей серии опытов изучали возможность конъюгативной передачи Ent плазмиды между бактериями рода Serratia и от Serratia к

E.coli K12 G62 Rif®. В качестве донора брали S. marcescens (Ent+, Str®, Amps) и реципиента S. marcescens (Ent", Strs , Amp®). В качестве селективной среды использовали, 2% мясопептонный агар, содержащий 500мкг/мл. стрептомицина и 300 мкг/мл. ампицилина. Полученные трансконъюгаты были способны давать «отек лап» 95 мг и более и на фореграмме просматривалась плазмиды массой 60 МД.

Наши попытки в опытах прямой передачи плазмид осуществить передачу Ent плазмиды от Serratia к E.coli К12 G62 Rif® не имели успеха.

Полученные данные дали нам основание считать, что генетическим детерминантом, контролирующий у бактерий рода Serratia продукцию LT - энтеротоксина, возможно, является конъюгативная плазмида массой 60 МД, выявляемая у ряда бактерий, вызывающих «отек лап» 95мг. и более.

По мнению Ильинской В.В1, Керашевой С.И. (1979), Петровской В.Г. с соавт. (1983) гемолизины могут быть отнесены к фактору, потенциальной патогенности энтеробактерий, в том числе и для бактерий рода Serratia.

В связи с этим мы попытались выяснить природу генетического детерминанта, контролирующего свойство продуцировать а- гемолизин.

Исследование проводили на 8 штаммах бактерий рода Serratia, обладающих а- гемолитической активностью, и 6 штаммах, не способных продуцировать а- гемолизин. В качестве эталонной культуры использовали штамм P.vulgaris Rts-1, обладающий а- гемолитической активностью и несущий плазмиду массой 120 МД. Результаты исследований показали, что среди клонов 8 штаммов, обладающих а- гемолитической активностью, у большинства была обнаружена плазмида массой 120 МД, что указывало на возможную роль данной плазмиды в продукции а-гемолизина.

В дальнейшим эти плазмиды элиминировали по общепринятой методике и у клонов изучали профиль плазмидной ДНК. При этом клоны 6 штаммов потеряли способность продуцировать а- гемолизин, а на фореграмме не просматривалась плазмида массой 120 МД, что указывало на возможную роль данной плазмиды в продукции а- гемолизина.Тем не менее, некоторые клоны, утратившие плазмиды массой 120МД продолжали продуцировать а- гемолизин, что свидетельствовало о вероятности существования у Serratia генетического детерминанта иной природы, контролирующею продукцию а- гемолизина. Все наши попытки осуществить конъюгативную передачу плазмиды массой 120 МД между бактериями рода Serratia и от Serratia к универсальному реципиенту E.coli К12 G62 Rif® не увенчались успехом.

Таким образом, результаты наших исследований позволяют полагать, что генетическим детерминантом адгезивной активности бактерий являются структурные элементы хромосомной природы; продукции LT - энтеротоксина - плазмида массой 60 МД, а- гемолизина -плазмида массой 120 МД и хромосома.

Проведенные опыты по изучению профиля плазмидной ДНК, элиминации и коныогативной передачи плазмид не позволили выявить плазмиды контролирующие синтез тиолзависимого гемолизина, энтерогемолизина, лецитиназной и ДНК-азной активности.

Методом ПЦР были протестированы клинические штаммы бактерий рода Serratia в количестве 16 штаммов, выделенных при различных инфекционных процессах и несущих плазмидный профиль с различной молекулярной массой. Из них 8 штаммов относятся к виду S. odorifera, 5 штаммов - к S. marcescens, 2 штамма - S. ligufaciens и один - S. rubidara.

Амплификацию участков ДНК «островков патогенности» осуществляли методом ПЦР. ПЦР проводилась в амплификаторе МС- 16 («ДНК- технология», Россия). По завершении амплификации из реакционной смеси отбирали аликвоту объемом 10 мкм и анализировали в 1%- 2%-ом агарозном геле, в зависимости от предполагаемого размера фрагмента ДНК.

Проведенные исследования позволили установить факт наличия у протестированных микроорганизмов фрагментов ДНК, специфичных известным генам кластеров патогенности Е. coli. Среди исследованных штаммов образование искомых ампликонов при использовании праймеров к hly А и hly В имело место в 4 случаях, cnf 1 - в 2, sfa А и sfa G — в 2 случаях. При этом у 2-х штаммов одновременно были обнаружены фрагменты генов «островков патогенности» к образованию sfa А и sfa G, продукции hly А и hly В, cnf 1, выделенные при урологической и гинекологической инфекциях, (S. marcescens).

Таким образом, наши данные по изучению адгезивной, гемолитической (а-, энтеро-, тиолзависимой гемолизин), LT-энтеротоксигенной, лецитиназной, ДНК-азной, антилизоцимной, антикомплементарной, антиинтерфероновой активностей, тестов на вирулентность, проводимых в опытах на лабораторных животных, в совокупности служат основанием для отнесения ряда выделенных штаммов Serratia к потенциально патогенным, т.е. этиологически значимым, что следует учитывать при проведении профилактики и лечения заболеваний, вызванных бактериями рода Serratia.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Саляхов, Раис Зайнетдинович, Оренбург

1. Абрикосова Н.Ю. Сравнительное изучение биологических свойств Serratia marcescens и Klebsiella pneumoniae, выделенных при менингите и сепсисе новорожденных / Н.Ю. Абрикосова // Новосибирск. М.1990. Т.2.С.104-106.

2. Аверина И.В. Биологическая характеристика отдельных серологических групп бактерий рода Proteus, изолированных от детей с острыми кишечными заболеваниями / И.В. Аверина // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -1974. -№4. -С.66-71.

3. Андреева И.Н. Влияние условий культивирования на рост и пигментацию Serratia marcescens / И.Н. Андреева, Т.И. Огородникова // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1999. - №3. - С. 16-20.

4. Анцилевич JI.M. Биосинтез внеклеточной эндонуклеазы Serratia marcescens рекомбинантными штаммами Escherichia coli и Serratia marcescens: автореф. дис. . канд. мед. наук / Л.М. Анцилевич. Казань, 1994.

5. Аталикова Ж.Б. Бактериоцины в типировании серраций: автореф. дис. . канд. мед. наук / Ж.Б. Аталикова. Кабардина- Балкарская республика г. Нальчик, 2000.

6. Ахтариева А.А. Некоторые биологические свойства бактерий рода Enterobacter, выделенных при различных инфекционных процессах: автореф. дис. . канд. мед. наук /А.А. Ахтариева. Уфа, 2000.

7. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.Х. Воробьев. // Л. 1962. - С. 180

8. Белокрысенко С.С. Микробная экология и ретроспективная оценка возможности прогноза вспышки гнойных менингитов, вызванной штаммом Serratia marcescens, в стационаре для выхаживания недоношенных детей / С.С. Белокрысенко, Н.В. Шестопалов, В.П. Гераськина,

9. Р.Ф. Парфенюк // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1992. - №2.- С. 28-31.

10. Бондаренко В. М. Общий анализ представлений о патогенных и условно патогенных бактерих / В.М. Бондаренко // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1997. - с. 20- 25.

11. Бондаренко В. М. Гемолизины энтеробактерий и их связь с вирулентностью возбудителя / В.М. Бондаренко, А.В. Голубева // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1988. - №11. -С. 102109

12. Бондаренко В.М. Общий анализ представлений о патогенных и условно-патогенных- бактериях / В.М. Бондаренко //Материалы VII Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. -Мю, 1997. - с. 180- 183.

13. Бондаренко В:М. Факторы патогенности бактерий и их роль в раз ционного процесса / В.М. Бондаренко // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1999.- №5.- С.34-39.

14. Бондаренко В.М. Энтеротоксигенная способность штаммов родов Klebsiella и Enterobacter, выделенных при острых кишечных заболеваниях у детей / В.М. Бондаренко, М.М. Баркус // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -1990.-№10.- С.28-32.

15. Бондаренко В.М. Влияние гемолитических плазмид на развитие «бьющего эффекта» у энтеробактерий разных видов / В.М. Бондаренко, А.В. Голубева, И.П. Корягина // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.- 1983.-№9.-С.50-53.

16. Бондаренко В.М.' Термостабильные энтеротоксины условно-патогенных представителей Enterobacteriaceae / В.М. Бондаренко, А.Р. Мавзютов, З.Г. Габидуллин // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1998.-№3.- С. 104-107.

17. Бондаренко В.М. Клеточный и молекулярный уровни взаимодействия паразита и хозяина / В.М. Бондаренко, Ю.Е. Полоцкий // Эпидемический процесс как социально экологическая система/М., 1986.- С. 138-150.

18. Бочков И.А. Бактериальная колонизация и сукцессия у новорожденных в аспекте проблемы госпитальной инфекции / И.А. Бочков, Н.М. Овчарова // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -1991. №8.-С.71-75.

19. Брилис В.И. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов / В.И. Брилис, Т.А. Брилене, Х.П. Ленцнер, А.А. Ленцнер // Лаб.дело.-1986, 4.-С.210-212.

20. Булгаков А. К. Факторы вирулентности к лекарственной устойчивости некоторых представителей семейства Enterobacteriactae их чувствительность к новому ряду азот содержащих гетероциклов: автореф. дис. . д-ра мед. наук / А.К. Булгаков. Челябинск, 2000.

21. Бухарин О. В. Изучение антикомплементарной активности стафилококков / О.В. Бухарин, Ю.А. Брудастов, Д.Т. Дерябин //Журн. Клин. Лаб. Диагн. -1992. -№11.- С.68 70.

22. Бухарин О. В., Усвяцов Б. Я. Бактерионосительство / О.В'. Бухарин, Б.Я. Усвяцов // Екатеринбург. 1996. - с.78 - 89

23. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий: теория и практика / О.В. Бухарин // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2000, - №4.- С.4-7.

24. Бухарин О.В. Лизоцим микроорганизмов / О.В. Бухарин, Н.В. Васильева, Б.Я. Усвяцов // Томск, 1984.-С. -214.

25. Бухарин О.В. Антилизоцимный тест как маркер персистенции микроорганизмов / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцов // Теоретическая и прикладная иммунология: Тез. Докл.1 всесоюзн. конф. /М., 1982.- С.58-34.

26. Бухарин О.В. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцов, А.П. Малышкин, Н.В. На-муева // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -1984.-№2,- С. 27-28.

27. Валышев А.В. Факторы персистенции энтеробактерий фекальной флоры при дисбиозе кишечника / А.В. Валышев, Ф.Г. Гильмутдинова, С.В. Фомичева // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.-1996. -№3. -С. 96-98.

28. Вартанян Ю.П. Отек лап белых мышей- тест для оценки активности энтеротоксинов Escherihia coli / Ю.П. Вартанян, М.К. Северцева, О.И. Введенская и др. // Бюлл. Эксп. биол. и медицины.- 1978.-№2.-С. 150152.

29. Вертиев Ю.В. Бактериальные токсины: биологическая сущность и происхождение / Ю.В. Вертиев // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1996. - №3. - С. 43-46.

30. Вертиев.Ю.В. Токсин опосредованная обусловленность инфекционных заболеваний / Ю.В. Вертиев // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -1987.-№3.-С.86-93.

31. Вилыпанская Н.И. Микробиологические подходы к установлению этиологического значения выделенных при острых кишечных заболеваниях условно-патогенных энтеробактерий / Н.И. Вилыпанская, Р.В. Энпггейн

32. Литвак IIIV Всероссийский съезд эпидемиологов и микробиологов // М., 1978.-С. 113-116.

33. Войно Ясенецкая М.К. Опыт изучения дизентерийной инфекции вость лабораторных животных / М.К. Войно-Ясенецкая // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 1957. - №4.-С.65-69.

34. Воробьев А.А. Особенности микрофлоры толстого кишечника при инфекционном эндокардите / А.А. Воробьев, Л.О. Иноземцев, Ю.В. Не-свижеский и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -1996.-№1,-С. 70-74.

35. Воробьев А.А. Популяционно-генетические аспекты микробиологического фенотипа кишечника здорового человека / А.А. Воробьев, Ю.В. Несвижский, Е.В. Буданова, Л.О. Иноземцев // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1995. -№4.- С.30-35.

36. Габидуллин З.Г. Биологическая характеристика' штаммов бактерий рода Proteus, выделенных при инфекционных процессах различной локализации: автореф. дис. . д-ра мед. наук / З.Г. Габидуллин. Саратов 1989.

37. Габрилович И.М. Гетерогенность антилизоцимной активности в популяции условно-патогенных энтеробактерий / И.М. Габрилович, В.Б. Бозиев, М.И. Габрилович, Б.С. Нагоев, Я.С. Усаева // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1997.-№4.-С.32-33.

38. Габрилович И.М. Тиолзависимые гемолизины как фактор патогенности бактерий рода Цитробактер и Серрация / И.М. Габрилович, Р.Х. Гайрабеков, М.А. Шеожев, О.С. Якушенко // Сб. науч. трудов. Куйбышев. 1990.-С. 69-71.

39. Галикеев X.JI. Изучение вирулентности дизентерийных бактерий с использованием инфузорий-туфелек / Х.Л. Галикеев, Н.И. Потатуркина-Нестерова//Здравоохр. Казахстана.- 1987. -№1.-С.34-36.

40. Гизатуллина С.С. Изучение адгезивной способности грамотрицатель-ных бактерий, выделенных от больных с диареями /С.С. Гизатуллина // V Всерос. Съезд Микробиол. Эпидемиологов / М., 1985.- С. 188.

41. Гинцбург АЛ. Современное состояние и перспективы молекулярно-генетических методов в решении задач медицинской микробиологии / А.Л. Гинцбург, Н.А. Зигангирова, Ю.М. Романова // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1999. - №5. - С. 22-26.

42. Далин М.В. Белковые токсины микробов / М.В. Далин, Н.Г. Фиш //М., 1980.-С. 179-180.

43. Дикий В.Н. К вопросу о болезнетворных свойств протея / В.Н. Дикий//Кишечные инфекции / -Киев. 1974. -№ 7. -С. 163-165.

44. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомалекул / Ю.В. Езепчук // М.: Медицина. - 1985. -С. 270-273.

45. Каральник Б.В. Стандартизация определения фимбрий/адгезины Citrobacter / Б.В. Каральник, Ш.И. Сарбасова, Т.Д. Акбаев // Лаб. дело -1990. №2. -С. 46-49.

46. Кацинян М.Е. Выделение условно-патогенных энтеробактерий от больных менингитом / М.Е. Кацинян, А.В. Чилингарян // Пробл. клин, микро-биол. в неинфек. клин. /М., 1983. С. 76.

47. Колганов А.Н. Гены резистентности к аминогликозидным антибиотикам клинических штаммов Serratia marcescens и кодируемые ими ферменты) / А.Н. Колганов, С.Б. Вакуленко // Журн. Антибиотики и химиотерапия. 1992. №11. - С. 10-14.

48. Колкер И.И. Микробиология,ран / И.И. Колкер, С.М. Буль // Раны и раневая инфекция /под ред. М.И: Кузина, Б.М. Костиченск -М., 1981. -С. 187-214.

49. Мавзютов А.Р. Молекулярно-генетические основы токсигенности < условно-патогенных представителей Enterobacteriaceae: Автореф дис. .д-ра мед. наук / А.Р. Мавзютов. Челябинск. 2000.

50. Мавзютов А.Р. Исследование гомологии генетических детерминант эн-теротоксинов условно-патогенных энтеробактерий / А.Р. Мавзютов, Э.Д. Ахунов, З.Г. Габидуллин // Тез.докл.2-ой межд.конф. «Современная вакцинология» 16-18 июня 1998. / Пермь, 1998. С. 125.

51. Мавзютов А.Р. «Острова» патогенности условно- патогенных энтеробактерий / А.Р. Мавзютов, С.В. Фиалкина, В.М. Бондаренко //

52. Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -2002. -№1. -С. 84-90.

53. Маньковский А.В. К вопросу о токсичности культурных фильтратов протея разного происхождения / А.В. Маньковский // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1965. -Т. XXVII Вып. 4. — С. 10-13.

54. Мельников Н.И. «Ферменты патогенности» и токсины бактерий / Н.И. Мельников, В.Н. Мельников, М.Г. Гимранов II -М; Медицина. 1969.

55. Мамонтова Т.Н. Методические рекомендации по обнаружению и классификации R плазмид у шигелл / Т.Н. Мамонтова, С.С. Белокры-сенко, Е.Д.Тихомиров, Ю.П. Солодовников, М.В.Турчинская // М.1983.-МЗ СССР.

56. Маниатис Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ./ Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж.// М.: Мир,1984.- 480

57. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике / Дж. Миллер // под ред. проф. Алиханяна С.И. / М.; Мир, 1986. -С. 436.

58. Митрохин С.Д. Факторы персистенции условно-патогенных микроорганизмов при дисбактериозе желудочно-кишечного тракта / С.Д. Митрохин, В.И. Минаев, О.Н. Зайцева // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -1997. -№4. -С. 84-87.

59. Мнацаканов С.Т. Энтеротоксигенность условно-патогенных энте-робактерий при острых кишечных заболеваниях у детей / С.Т. Мнацаканов // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -1983.-№6. -С. 53-55.

60. Мнацаканов С.Т. О выделении условно-патогенных энтеробакте-рий у детей раннего возраста / С.Т. Мнацаканов, М.Е. Коцинян, Р.Г.

61. Акопян; // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.- -1983. -№8.-С. 106-107.

62. НестероваF.H. Биология протея /Г.Н. Нестерова //-Горький; -1972. 143.

63. Нестерова Г.Н: Патогенетическое значение эколо- физиологических особенностей бактерий рода Proteus / Г.М.Нестерова //- Горкий. -1975.

64. Определитель бактерий Берджи.Т. 1: Пер. с англ ./Под ред. Дж. Хоул-та, Н. Грига, П. Сита, С. Уилльямся // -М.: Мир, 1997.-432 с.

65. Пархоменко JI.B. К характеристике гемолизинов / JI.B. Пархоменко, И.Б. Лукач, Д.Е. Дыховичная //Журн. микробиологии, эпидемиологии и,иммунологии: -1986. -Т.48. -№6. -С. 24-29.

66. Петровская: В :Г.Энтеротоксины энтеротоксигенных Es-cherihia coli: характеристика, механизм действия и генетический; контроль / В.Г. Петровская, В.М. Бондаренко // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -1990; -№7. С. 92-98.

67. Поликарпов Н.А. Биологические свойства условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от больных острыми кишечными заболеваниями / Н.А. Поликарпов,// Воен.-мед. журн. -1991. -№7. -С. 19-23.

68. Поликарпова Н.А. Биологические свойства условно-патогенных эн-теробактерий, выделенных из< крови больных / Н.А. Поликарпова, В.М. Шилов, В.Н. Красноголовец, Ю:А. Ильинский//Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -1985: -№10: С. 15-19.

69. Полоцкий Ю.Е. Адгезивность, инвазивность и энтеротоксигенность возбудителей кишечных инфекций / Ю.Е. Полоцкий, Т.А. Авдеева // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -1981. -№5.-С. 23-32.

70. Полоцкий Ю.Е. Экспериментально-морфологические обоснования подразделения энтеропатогенных кишечных палочек / Ю.Е. Полоцкий, ТА. Авдеева // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1980. -№10. -С. 3-10.

71. Применение легочной модели- метода интраназального заражения белых мышей возбудителями кишечных инфекций. /Методические рекомендации.// JL, 1977.

72. Прозоровский С.В. Принципы работы с внутрибольничными инфекциями / С.В. Прозоровский, JI.A. Генчиков // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -1984. -с. 21-25.

73. Прозоровский С.В. Эпидемиологический анализ и опыт профилактики внутрибольничных заболеваний новорожденных и родильниц / С.В. Прозоровский, JI.A. Генчиков // -М., -1991.

74. Смирнов И.В. Возбудители бактериальных инфекций человека / И.В. Смирнов // Клин.микробиол. и антимикроб.химиотерапия.- 2000.-Т.2., -№2.- С.4-11.

75. Смолянская А.З. Дисбактериозы кишечные инфекции смешанной этиологии / А.З. Смолянская, О.М. Дронова, Ф.И. Солодовник // Лаб. дело. - 1985.-№3.-С. 159-163.

76. Соколов В.Ю. Антиинтерфероновая активность микроорганизмов /

77. B.Ю. Соколов // Персистенция микроорганизмов / -Куйбышев. 1990.1. C.83 93.

78. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. М.О. Берге., М." Медицина", 1982, 462 л.

79. Туйгунов М.М. Иммунобиологические основы энтеротоксигенности бактерий рода Citrobacter в системе взаимодействия «патоген — хозяин». Автореф дис. . д-ра мед. наук / М.М. Туйгунов. Челябинск. 2002.

80. Усманова С.С. Биологические свойства бактериофагов Serratia marcescens и разработка научных основ технологии получения препарата бактериофагов: автореф. дис. . канд. мед. наук / С.С. Усманова. -Уфа. -1999.

81. Филимонова М. Н. Изоформы нуклеазы Serratia marcescens. Роль ионов Mg2+ в механизме гидролиза / М.Н. Филимонова, В.П. Губская, И. А. Нуретдинов и др. // Журн. Биохим. 1997. -№9. - С. 1148- 1154.

82. Филимонова М.Н. Выделение нуклеаз Sml и Sm2 в препаративных количествах и изучение их антигенности / М.Н. Филимонова, Н.Г. Ура-зов, К.С. Хаертынов // Журн. Биол. науки. 1992. -№2. -С. 65-70.

83. Энтеробактерии (руководство для врачей). /Под ред. В.И.Покровского.// М.: Медицина, 1985.- 320 с.

84. Albers MJ. Colonization and infection by Serratia species in a paediatric surgical intensive care unit / MJAlbers; JW Mouton; D Tibboel // J Hosp Infect, 2001 May; Vol. 48 (1), pp. 7-12.

85. Appelbaum P.C. Transductional analysis of nonmotile mutants in Proteus mirabilis / P.C. Appelbaum, O. W. Prozecky // T. of Gen. Microbiology. -1973.-77. -№1.- P. 89-97.

86. Ayg&uuml;n C. Serratia marcescens: an emerging microorganism in the neonatal intensive care unit / C. Ayg&uuml;n, S. Yigit; D. G&uuml;r; G. Er-dem; O. Oran; G. Tekinalp; M. Yurdak&ouml // Turk J Pediatr, 2000 Jul-Sep; Vol. 42(3), pp. 219-22.

87. Barbers L.J. Molecular weight determination and partial characterization of Klebsiella pneumonia haemolysins / L.J. Barbers, A.J. Eraso, M.C. Pajaro and J. Albesa // Can. J. Microbiol.- 1986.-v.32.-p.884-885.

88. Beutin L. Enterohemolysin, a new type by some strains of enteropatho-genic E.coli (EPEC) / L. Beutin, J. Prado, S. Zamerman et al. // Zbl. Bakte-riol. Hyd.A.- 1988, A 267.-S. 576-588.

89. Biering-S&oslash F. Urinary tract infections in patients with spinal cord lesions: treatment and prevention / F. Biering-S&oslash;rensen; P. Bagi; N H&oslash;iby // Drugs, 2001; Vol. 61 (9), pp. 1275-87.

90. Biering-S&oslash;rensen F. Urinary Tract Infections in Patients with Spinal Cord Lesions: Treatment and Prevention / F. Biering-S&oslash; P. Bagi; Hoiby, Niels. // Drugs, Sep. 2001, Vol. 61. Issue 9, pl275.

91. BmnderW. Genome plasticity in Enterobacteriaceae / W. Bmnder, H.

92. Karch // Int. J. Med. Microbiol.- 2000, 290.- P. 153-165

93. Bogaert MA. Serratia cellulitis and secondary infection of leg ulcers by Serratia / MA Bogaert; DJ Hogan; AE Jr Miller // J Am Acad Dermatol, 1991 Sep; Vol. 25 (3), pp. 565

94. Bollet C. Serratia fonticola isolated from a leg abscess / M Gainnier; JM Sainty; P Orhesser; P De Micco // J Clin Microbiol, 1991 Apr; Vol. 29 (4), pp. 834-5

95. Bornstein PF. Serratia marcescens cellulitis in a patient on hemodialysis / PF Bornstein; AM Ditto; GA Noskin // Am J Nephrol, 1992; Vol. 12 (5), pp. 374-6

96. Braun V. Activation and secretion of Serratia hemolysin / V Braun; R Ond-raczek; S Hobbie // Zentralbl Bakteriol, 1993 Apr; Vol. 278 (2-3), pp. 306-15

97. Brubaker R.R. Mechanism of bacterial virulence / RR Brubaker //Ann. Rev. Microbiol. -2000, 290. -P. 153-165

98. Buhimschi C. Endotoxemia causing fetal bradycardia during urosepsis / С Buhimschi; CP Weiner // Obstet Gynecol, 2001 May; Vol. 97 (5 Pt 2), pp. 81820

99. Carbonell GV. Virulence factors in Serratia marcescens: cell-bound hemolysin and aerobactin / GV Carbonell; MC Vidotto // Braz J Med Biol Res, 1992; Vol. 25 (l),pp. 1-8

100. Carek PJ. Diagnosis and management of osteomyelitis / PJ Carek; LM Dickerson; JL Sack //Am Fam Physician, 2001 Jun 15; Vol. 63 (12), pp. 241320

101. Chen КН. Serratia Marcescens corneal ulcer as a complication of orthokera-tology / KH Chen; TM Kuang; WM Hsu // Am J Ophthalmol, 2001 Aug; Vol. 132 (2), pp. 257-8

102. Clouthier S.C. Unique fimbriae- like structures encoded by SEF D of the SEF 14 fimbrial gene cluster of Salmonella enteritidis / SC Clouthier, S.K. Col-linson, WW Kay // Moll. Microbiol. -1994. -v. 12. -№6. -P. 893-901

103. Coria-Jim&eacute;nez VR. Partial characterization of Serratia marcescens nosocomial strains / VR Coria-Jim&eacute;nez; L Villa-Tanaka; С Ort&iacute;z-Torres // Arch Invest Med (Мех), 1991 Jul-Dec; Vol. 22 (3-4), pp. 273-8

104. Dauga C. Nucleotide sequences of 16S rRNA from ten Serratia species / С Dauga; F Grimont; PA Grimont // Res Microbiol, 1990 Nov-Dec; Vol. 141 (9), pp. 1139-49

105. De la Cruz F. Hemolysis determinant common to Escherichia coli hemolytic plasmids of different incompatibility groups / F De la Cruz, D Muller D, JM Ortiz // J. of Bacteriology. -1980. -v. 143. -№2. -P. 825-833.

106. De Rycke J. Evidence for two types of cytotoxic necrotizing factor in human and clinical isolates of Escherichi coli / J De Rycke, EA Gonzalez, J Blanco et al. // J. Clm. Microbiol.- 1 990, 28.- P.694-699

107. DeOreo PB. Serratia liquefaciens infections at a hemodialysis center / PB DeOreo; AS Kliger //N Engl J Med, 2001 Sep 20; Vol. 345 (12), pp. 921

108. Dom&iacute;nguez A. Nosocomial bacteremia caused by Serratia marcescens: analysis of 44 cases / A Dom&iacute;nguez; Ж Arribas; MD Folgueira // Enferm Infecc Microbiol Clin, 1990 Nov; Vol. 8 (9), pp. 553-9

109. Duqued J.P. Adhesive properties in Enterobacteriaceae / JP Duqued, DC Old // In Bacteriae Adherence, series 13. vol. 6. 1980, reseptors and recognisation ED.-Beachey E.H. 1980.-P. 185-217

110. Ena J. Ciprofloxacin as an effective antibacterial agent in serratia endocarditis / J Ena; С Amador; F Parras; E Bouza // J Infect, 1991 Jan; Vol. 22 (1), pp. 103-5

111. Equi RA. Endogenous Serratia marcescens endophthalmitis with dark hypopyon: case report and review / RA Equi; WR Green // J. Article. 2001 Nov-Dec; Vol. 46 (3), pp. 259-68.

112. Esselman M.T. Lecitinase production by gram- negative bacteria / MT Es-selman, PV Liu // J. of Bacteriology. -1961.-81. -№6. -P. 939-945.

113. Falbo V. Isolation and nucleotide sequence of the gene encoding cytotoxic necrotizing facter 1 of Escherichia coli / V Falbo, T Pace, L Picci et al. // In- fect.Immun.- 1993, 61.- P.4909-4914

114. Falsano L. Interaction of Escherichia coli cytotoxic necrotizing factor type 1 (CNF1) with cultured cells / L Falsano, С Fiorentini, P Boguet, G Donelli //Cytotechnology.- 1993, 1 L-P.S56-S58.

115. Gandhi PA. Adaptation and growth of Serratia marcescens in contact lens disinfectant solutions containing chlorhexidine gluconate / PA Gandhi; AD Sa-want; LA Wilson; DG Ahearn // Appl Environ Microbiol, 1993 Jan; Vol. 59(1), pp. 183-8

116. Giraldi R. Production of Shiga-like toxin among Escherichia coli strains and other bacteria isolated from diarrhea in S&atilde;o Paulo, Brazil / R Giraldi; BE Guth; LR Trabulsi // J Clin Microbiol, 1990 Jun; Vol. 28 (6), pp. 1460-2

117. Hacker J. Deletions of chromosomal regions coding for fimbriae and hemolysins occur in vitro and in vivo in various extraintestinal Escherichia coli isolates / J Hacker, L Bender, M Ott et al. // Microb.Pathog.- 1990, 8.-P.213-225

118. Hacker J. Genetic analysis of bacterial haemolysin production / J Hacker, С Hughes //Bull. Inst. Proteus. -1985. -v. 83. -№2. -P. 148-165

119. Hacker J. Pathogenicity islands of virulent bacteria: structure, function, and impact on microbial evolution / J Hacker, G Oehler-Blum, I Muhlodor-fer, H Tschape // Mol. Microbiol.- 1997, 23.- P. 1089- 1097.

120. Hartmann F. Serratia infections in patients with neutropenia / F Hartmann; T Gheorghiu; H Leupold; F Baer; V Diehl // Klin Wochenschr, 1991 Aug 1; Vol. 69 (11), pp. 491-4

121. Harville B.A. Involvement of 5-hydroxytryptamine and prostaglandin E2 in the intestinal secretory action of Escherichia coli heat- stable enterotoxin В (STb) / BA Harville, LA Dreyfus // Infect.Immun.- 1995, 63.- P.745-750

122. Hazzaa SA. Pink hypopyon: a sign of Serratia marcescens endophthalmitis / SA Hazzaa; KF Tabbara; JA Gammon // Br J Ophthalmol, 1992 Dec; Vol.76 (12), pp.764-5.

123. Henry B. An outbreak of Serratia marcescens associated with the anesthetic agent propofol / В Henry; С Plante-Jenkins; К Ostrowska //Am J Infect Control, 2001 Oct; Vol. 29 (5), pp. 312-5

124. Horiguchi Y. Bordetella bronchiseptica dermonecrotizing toxin induces reorganization of actin stress fibers through deamidation of Gin-63 of the GTP-binding protein Rho / Y Horiguchi; N Inouc; M Masuda et al. // PNAS USA.- 1997, 94.-P.I 1623-11626

125. Hornick DB. Fimbrial types among respiratory isolates belonging to the family Enterobacteriaceae / DB Hornick; BL Allen; MA Horn; S Clegg // J Clin Microbiol, 1991 Sep; Vol. 29 (9), pp. 1795-800

126. Houwink A.L. Electron microscopal observations on Bacterial cytology П. A study of flagellation / AL Houwink; W van Iterson // Biochemica et biophysica et biophysica acta.- 1950.-5 .-p. 10-44.

127. Hu P. Structural organization of virulence-associated plasmids of Yersinia pestis/V Hu; J Elliott; P McCready et al. //J. Bacterid.- 1998, 180.- P.5192-5202

128. Issack MI. Serratia liquefaciens infections at a hemodialysis center / MI Is-sack //N Engl J Med, 2001 Sep 20; Vol. 345 (12), pp. 921-2

129. Iushchuk N.D. Clinicoimmunological features and treatment of acute intestinal infection of Proteus etiology / ND Iushchuk; VM Frolov; NA Peresadin // Klin. Med. Mosk. -1996. -v. 4, №4. -P. 6-7

130. Jacobson MS. Microbial challenge of a blood cell separator outside-seal bowl system / MS Jacobson; SV Kevy; GM Thorne; DA Goldmann; L Blasetti; JW Smith; H Schaefer // Transfusion, 1990 Feb; Vol. 30 (2), pp. 146-9

131. Jagielski M. Occurrence of P. fimbrii in strains from selected genera of Enterobacteriaceae / M Jagielski; H Sztabinska Koncka; W Rastawiski; J Szyech; S Kaluzewski; A Mrozowska // Med. Dosw. Microbiol.-1992. -v.44.-N.3-4.-p.97-107.

132. Jang TN. Use of pulsed-field gel electrophoresis to investigate an outbreak of Serratia marcescens infection in a neonatal intensive care unit / TN Jang; CP Fung; TL Yang; SH Shen; CS Huang; SH Lee //J Hosp Infect, 2001 May; Vol. 48 (1), pp. 13-9

133. Jeffries C.D. Rapid method for determining the activity of microorganisms on nuclear acids / CD Jeffries; DF Holtman; DG Guse // J. of Bacterijljgy. -1957.-73.-4.-p. 590-591

134. Knapp S. Unstableinserts in the chromosome affect virulence properties of uropathogenic Escherichia coli Об strain 536 / S Knapp; J Hacker; T Jar-chauet al. //J. Bacterid.- 1986, 168.-P.22-30

135. Krishnan PU. Epidemiological study of an outbreak of Serratia marcescens in a haemodialysis unit / PU Krishnan; В Pereira; R Macaden // J Hosp Infect, 1991 May; Vol. 18 (1), pp. 57-61

136. Leranoz AM. Cloning and expression in Escherichia coli of a gene encoding proline oxidase of Serratia marcescens / AM Leranoz; MC Fust&eacute; M Vi&ntilde;as; RA Hull; RP Williams // Microbios, 1991; Vol. 67 (271), pp. 8794

137. Leranoz S., Orquacute;s P., Berlanga M. et al. // J. Urol. 1997 Feb. Vol. 157(2).-PP. 694-698

138. Llanes C. Stability of conjugative and non-conjugative R-plasmids from Serratia marcescens to gyrase inhibitors / С Llanes; Y Michel-Briand; M Thou-verez; С Bailly; F Grimont // Microbiologica, 1990 Apr; Vol. 13 (2), pp. 157-9

139. Maclagan R.M. Haemagglutinins and fimbiae in different serotypes and bio-types of Yersinia enterocolitica / RM Maclagan; DC Old // J. of Appl. Bacteriol. -1980.-v.49.-p.353-360.

140. Magnuson JA. Microflora of partially processed lettuce / JA Magnuson; AD King Jr; T T&ouml;r&ouml;k // Appl Environ Microbiol, 1990 Dec; Vol. 56 (12), pp. 3851-4

141. Makino K. Complete nucleotide se-quences of 93-kb and 3.3-kb plas-mids of an enterohemorrhagic Escherichia coll 0157:H7 derived from Sakai outbreak / К Makino; К Ishii; T Yasunaga et al. // DNA Res.- 1998, 5.- P.I-9

142. Mancon W.L. Selective intestinal decontamination for prevention of wound colonization in severely burned patients: a retrospective analysis / WL Mancon; HJ Klasen; EW Sauer; A Olieman //Burns. -1992. -v. 18. -№2 -P. 98-102.

143. Marumo K. Epidemiological evaluation of Serratia marcescens isolates in one Japanese hospital during the two years from April 1997 to March 1999. / К

144. Marumo; YNakamura; M Togashi //Rinsho Byori, 2000 Oct; Vol. 48 (10), pp. 960-5

145. Marzano AV. Cutaneous infection caused by Serratia marcescens / AV Mar-zano; G Gasparini; R Caputo //Cutis, 2000 Dec; Vol. 66 (6), pp. 461-3

146. Massad G. Genetic organization and complete sequence of the Proteus mir-abilis pmf fimbrial operon / G Massad; HL Mobley // Gene. -1994. -v. 150. -№12.-P. 101-104

147. Matsumoto T. Role of superoxide in renal scarring following infection by mannose-sensitive piliated bacteria / T Matsumoto; Y Mizunoe; N Ogata; M Tanaka; J Kumazawa // Urol Res, 1991; Vol. 19 (4), pp. 229-33

148. Miller MJ. Disinfection efficacy of contact lens care solutions against ocular pathogens / MJ Miller; DE Callahan; D McGrath; R Manchester; SE Norton // CLAO J, 2001 Jan; Vol. 27 (1), pp. 16-22

149. Mizunoe Y. Identification and nucleotide sequence of the gene determining the adhesion capacity of Serratia marcescens / Y Mizunoe; T Matsumoto; К Amako; M Sekiguchi; J Kumazawa // J Bacteriol, 1991 May; Vol. 173 (10), pp. 3257-60

150. Morris R. Postoperative endophtalmitis resulting from prosthesis contamination in a monocular patient / R Morris; FI Camesasca; J Byrne; G John // Am. J. Ophtalmol. -1993. -v. 15. -№9. -P. 346-349

151. Muhldorfer I. Regulation of Shiga-like toxin 2 operon in Escherichia coli / I Muhldorfer; J Hacker; GT Keusch et al. // Infect. Immun.- 1 996, 64.- P. 495-502

152. Nichols W. A. Characterization of the type I fimbrial subunt gene (fim A) of Serratia marcescens / AW Nichols; S Clegg; MR Brown // Mol. Microbiol.-1990 Dec. Vol. 4(12).- PP. 2119-2126

153. Nishino Т. Combination antibacterial effects between aztreonam and eight other antibiotics / T Nishino; Y Obana; H Kuzui; T Murakami // Jpn J Antibiot, 1991 Jan; Vol. 44(1), pp. 1-8

154. Obana Y. Adherence of Serratia marcescens in the pathogenesis of urinary tract infections in diabetic mice / Y Obana; К Shibata; T Nishino // J Med Microbiol, 1991 Aug; Vol. 35 (2), pp. 93-7

155. Old D.C. A new mannose- resistant haemagglutinin in Klebsiella / DC Old; RA Adegbola //J. of Appl. Bacter. -1983. -v.55. -P. 165-172

156. Omori K. Analysis of the Serratia marcescens proBA operon and feedback control of proline biosynthesis / К Omori; S Suzuki; Y Imai; S Komatsubara // J Gen Microbiol, 1991 Mar; Vol. 137 (Pt 3), pp. 509-17

157. Ondraczek R. In vitro activation of the Serratia marcescens hemolysin through modification and complementation / R Ondraczek; S Hobbie; V Braun // J Bacterid, 1992 Aug; Vol. 174 (15), pp. 5086-94

158. Oswald E. Cytotoxic necrotizing factor type 2 produced by virulent Escherichia coli modifies the small GTF-binding proteins Rho involved in assembly of actin stress fibers / E Oswald; M Sugai; A Labigne et al. // PNAS USA.- 1994, 91.-P.3814-3818

159. Palobart G. Excretion of the Escherichia coli alpha-haemolysin by Serratia marcescens / G Palobart; A Ju&aacute;rez; J Tomas; Regu&eacute // Microbios, 1991; Vol. 67 (272-273), pp. 171-6

160. Path MJ. ABC transporters: bacterial exporters / MJ Path; R Kolter // Microbiol. Rev.- 1993, 57.- P.995-1017

161. Patton TG. Genotyping of clinical Serratia marcescens isolates: a comparison of PCR-based methods / TG Patton; S Katz; RJ Sobieski; SS Crupper //FEMS Microbiol Lett, 2001 Jan 1; Vol. 194 (1), pp. 19-25

162. Perry R. D. DNA sequencing and analysis of the low-Ca 2J3 response plasmid pCDl of Yersinia pestis KIM5 / RD Perry; SC Straley; JD Feth-erston et al. // Infect. Imraun.- 1998, 66,- P.4611- 4623

163. Picket C.L. The cytoletal distending toxin family / CL Picket; CA White-house // Trends Microbiol.- 1999, 7.- P.292-297

164. Prasad GA. Outbreak of Serratia marcescens infection in a neonatal intensive care unit / GA Prasad; PG Jones; J Michaels; JS Garland; CR Shivpuri //-Infect Control Hosp Epidemiol, 2001 May; Vol. 22 (5), pp. 303-5

165. Ramos SR. Neonatal bacterial meningitis: etiological agents in 109 cases during a 10 year period / SR Ramos; R Feferbaum; A Manissadjian; FA Vaz // Arq Neuropsiquiatr, 1992 Sep; Vol. 50 (3), pp. 289-94

166. Roth VR. Transfusion-related sepsis due to Serratia liquefaciens in the United States / VR Roth; MJ Arduino; J Nobiletti; SC Holt; LA Carson; CF Wolf; BA Lenes; PM Allison; WR Jarvis // Transfusion, 2000 Aug; Vol. 40 (8), pp. 931-5

167. Ruan Y. Hemolysin asa marker for Serratia / Y Ruan; V Braun //Arch. Microbiol. -1990. -v. 154 (3), -pp. 221-225

168. Ruegg PL. Microbiologic investigation of an epizootic of mastitis caused by Serratia marcescens in a dairy herd / PL Ruegg; WM Guterbock; CA Holmberg; JM Gay; LD Weaver; RW Walton // J Am Vet Med Assoc, 1992 Jan 15; Vol. 200 (2), pp. 184-9

169. Schaefer F. Bacterial keratitis: a prospective clinical and microbiological study / F Schaefer; О Bruttin; L Zografos; Y Guex-Crosier // Br J Ophthalmol, 2001 Jul; Vol. 85 (7), pp. 842-7

170. Scharf JW. Infection with Serratia marcescens in newborn infants. Clinical aspects, therapy and disease course / JW Scharf; F Wild; JP Guggenbichler // Monatsschr Kinderheilkd, 1991 Oct; Vol. 139 (10), pp. 695-8

171. Schmidt G. Gm-63 of Rho is deamidated by Escherichia coli cytotoxic necrotizing factor-. / G Schmidt; P Sehr; M Wilm et al. //' Nature.-1997, 387.-P.725—729

172. Sears C.L. Enteric bacterial toxins: mechanisms of action and linkage to in-terstinal secretion / CL Sears; JB Kaper //Microbiol. Reviews. -1996. -v. 60. -P. 167-215

173. Sixina Т. K. Refined structure of Escherichia coll heat-labile enterotoxin, a close relative of cholera toxin / TK Sixina; KH Kalk; BA van Zanten et al. // J. Mol. Biol.- 1993, 230.- P.890-918

174. Sixma Т.К. Comparison of the B-pentamers of heat-labile enterotoxin and verotoxin-1: two structures with remarkable similarity and dissimilarity / TK Sixma; PE Stein; WG Hoi; RJ Read // Biochemistry.- 1993, 32.- P. 191-198

175. Smith H.R. Mapping of aplasmid, coding for colonization factor antige I and heat-stabl enterotoxin production isolated from on enterotoxigenic strain of E. coli / HR Smith; GA Willchow; В Rowl //J. of Bacteriology. -1982. -v. 149. -№ 1. -P. 264-275

176. So M. Characterisation of E. coli plasmid encoded for synthesis of heat-labile toxin Molecular cloning of the toxin determinants / M So; WS Dallas; S Falkow //Infection and Immunity. -1978. -v.21 -№2. -P. 405-411

177. Stock I. Proteus infection / I Stock; В Wiedemann //Med. Monatsschr. Pharm. -1997. -№10. -P.271-276

178. Sullivan JD. Serratia liquefaciens infections at a hemodialysis center / JD Sullivan //N Engl J Med, 2001 Sep 20; Vol. 345 (12), pp. 922

179. Szewzyk U. Growth and survival of Serratia marcescens under aerobic and anaerobic conditions in the presence of materials from blood bags / U Szewzyk; R Szewzyk; Stenstr&ouml // J Clin Microbiol, 1993 Jul; Vol. 31 (7), pp. 182630

180. Todhunter D. Growth of gram-negative bacteria in dry cow secretion / D Todhunter; KL Smith; JS Hogan // J Dairy Sci, 1990 Feb; Vol. 73 (2), pp. 36372

181. Todhunter DA. Serratia species isolated from bovine intramammary infections / D Todhunter; KL Smith; JS Hogan // J Dairy Sci, 1991 Jun; Vol. 74 (6), pp. 1860-5

182. Todhunter DA. Gram-negative bacterial infections of the mammary gland in cows / D Todhunter; KL Smith; JS Hogan; PS Schoenberger // Am J Vet Res, 1991 Feb; Vol. 52 (2), pp. 184-8

183. Torres R. Endovas-cular infections due to salmonella non-typhi the of surgery to active cure / R Torres; J Azofra; С Verdejo; ML Fernandes-Juerrero //5th Eur.Congr.Clin.Microbiol.and Infect.Dis., Oslo. 9-1 1, 1991:Abstr.-Oslo.[1991]- P.168

184. Traub WH. Antibiotic susceptibility of Serratia marcescens and Serratii liquefaciens / WH Traub //Chemotherapy, 2000 Sep-Oct; Vol. 46 (5), pp. 31521

185. Warren NP. Delayed Serratia marcescens osteomyelitis following a gunshot injury / NP Warren; RR Coombs // Injury, 1991 Nov; Vol. 22 (6), pp. 493-4

186. Watanebe K. Pathogenic bacteria isolated from the sputum of the patients with pulmonary emphysema / К Watanebe; T Aritomi; H Toyoshima; S Sonja; M Yeshiva //Kansenshogaki Zasshi. -1995. -v. 69. -№11. -P. 1251-1259

187. Wilson DJ. Serratia marcescens mastitis in a dairy herd / DJ Wilson; JH Kirk; RD Walker; QW Bosworth // J Am Vet Med Assoc, 1990 Apr 1; Vol. 196 (7), pp. 1102-5

188. Wong WW. Serratia marcescens bacteremia / WW Wong; LS Wang; DL Cheng; SJ Lin; Chin // J Formos Med Assoc, 1991 Jan; Vol. 90 (1), pp. 88-93

189. ШТАММ БАКТЕРИЙ SERRATIA MARCESCENS ГИСК № 268 ПРОДУЦЕНТ ТЕРМОЛАБИЛЬНОГО ЭНТЕРОТОКСИНА

190. Заявка №2003133683 Приоритет изобретения 18 ноября 2003 г. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 марта 2005 г.

191. Срок действия патента истекает 18 ноября 2023 г.

192. Руководитель Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам, и товарным знакам1. Б. П. Симонов1. Ш Шт ш тт »т ш тш ш ш т ш ш т т ш ш ш т ш ш га ш1. Ш^тШШАт ФВДШРАЩШШ