Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние условий культивирования и некоторых экзогенных факторов на биосинтез и секрецию изоформ эндонуклеазы Serratia marcescens

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние условий культивирования и некоторых экзогенных факторов на биосинтез и секрецию изоформ эндонуклеазы Serratia marcescens"

На правах рукописи

РГБ Oft

БОГОМОЛЬНАЯ ЛИДИЯ МИХАЙЛОВНА

Влияние условий культивирования и некоторых экзогенных факторов на биосинтез и секрецию изоформ эндонуклеазы Serratia marcescens

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ-2000

Работа выполнена на кафедре микробиологии Казанского государственного университета им. В.И.Ульянова-Ленина

Научный руководитель: доктор биологических наук

М.Н. Филимонова

Официальные оппоненты: к.б.н. доц.каф.микробиологии КГМУ

Амерханова H.H.

д.б.н. с.н.с. Коксин В.П.

Ведущая организация: Казанский Институт биохимии и биофизики КНЦ РАН

Защита диссертации состоится Л _2000 г.

в Щ. 50 часов на заседании диссертационного совета К 053.29.19 при Казанском государственном университете им. В.И.Ульянова-Ленина, 420008, г.Казань, ул.Кремлевская, 18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного университета

Автореферат разослан _2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук ¿¡-а у/ п А.Н. Аскарова

E&ft.SM.Ho.l, О

ВВЕДЕНИЕ .

Актуальность проблемы. Внеклеточная эндонуклеаза бактерий Serratia marcescens (эндонуклеаза Sm) изучается на протяжении многих лег.-Интерес.к этому ферменту вызван уникальностью его свойств. В частности известно, что каталитическая активность эндонуклеазы Sm в 4 раза превышает таковую стафилококковой нуклеазы и в 34 раза - ДНКазы I. Ферментный, препарат находит применение в молекулярной биологии для удаления ДНК из белковых препаратов (Manual "Benzon Nuclease", 1989). На. примере эндонуклеазы Sm показана возможность использования в биотехнологии модифицированных "генов-убийц", кодирующих нуклеазы, разрушающие при . определенных условиях геном клетки-хозяина и предотвращающих возможность переноса генов от клетки к клетке (Ahrenholtz I. et al., 1994). Известно, что отдельные нуклеазы, в их числе эндонуклеаза Sm, являются эффективными, антивирусными агентами (Аликинидр., 1998). . .. ,-

В настоящее время известны основные биохимические свойства (Nestle M., Roberts W.K., 1969, Лещинская И.Б. и др., . 1974), пространственная структура (Miller M.D., Krause K.L., 1996, Shlyapnikov, S.V. et al., 2ООО), каталитически значимые аминокислоты (Friedhoff P. et al., 1994. Friedhoff P. et al., 1996), предложены механизмы действия (Kolmes В. et al., 1996, Шляпников C.B. и др., 1999) эндонуклеазы Sm, . разработана эффективная схема её. очистки (Филимонова М.Н. и, др.л ., 1980, FriedhpfF P.. et, al., 1994). Показано, что эндонуклеаза секретируется в окружающую среду в виде двух основных изоформ, Sm2 и Sml. Известно, что единственным различием структуры изоформ является строение ^концевой - аминокислотной последовательности. Изоформы различаются по молекулярной массе, оптимуму pH действия, оптимальной концентрации активатора, (Mg2„+), кинетическим параметрам гидролиза .ДНК, предпочтением к природе азотистых оснований (Банникова Г.Е. и др., 1990, Филимолова М-Н. и др., 1991, 1996, Д997, Filimonpva^M-N^ et Ю. И др., 1995 а-г). ....... .....

. Выдвигаются предположения, что синтез и секреция изоформ регулируется факторами внешней среды и физиологическим состоянием клеток (Suh Y. et al., 1995). В связи с вышеизложенным представляло значительный интерес изучить влияние разнообразных экзогенных, факторов на образование и экспорт из клетки изоформ эндонуклеазы Serratia marcescens.

Дели и задачи исследования. Данная работа проведена с целью установления влияния на биосинтез и секрецию изоформ эндонуклеазы .Serratia marcescens различных экзогенных эффекторов, включая компоненты питательной >' среды, условия культивирования, ингибиторы дыхания и репликации ДНК. ' ••

В соответствии с поставленной целью решались следующие экспериментальные задачи: '

1. Отбор штаммов бактерий и питательной среды, обеспечивающей секрецию эндонуклеазы в два этапа; * . s.

'' 2. Подбор маркеров целостности цитоплазматичесйой и наружной . '-мембраны йгеток; ■

3. Исследование влияния на синтез и сяфецию изоформ ' эндонуклеазы Serratia 'marcescens природы 'источников азотного" и углеродного питания, субстратов и продуктов их гидролиза (ДНК, РНК, мононуклеотидов), уровня аэрации в процессе культивирования бактерий ■ ■ • • 1 ' '4. : Изучение влияния на синтез й секрецию изоформ фермента - : веществ, вызывающих ингибирование дыхания хлеток (азйд натрия) и репликации ДНК (налидиксовая кислота);

Научная новизна работы. Показано, что биосинтез и секреция изоформ эндонуклеазы Serratia marcescens зависит от состава питательной средь! и , условий культивирования. Установлено, что: ответом клетки на изменение факторов внешней среды, а именно, добавление в среду нуклеиновых кислот, мононуклеотидов, использование альтернативных источников. азотного и углеродного питания, добавление веществ, вызывающих ингибирование дыхания клеток (азид натрия) и репликации ДНК (налидиксовая кислота), является . увеличение уровня синтеза молекулярной формы Sml. Только при снижении* аэрации было отмечено увеличение биосинтеза обеих изоформ.:

Практическая ценность работы. Показано, что изменение условий культивирования1 может" привести к направленному синтезу отдельных-молекулярных форм эндонуклеазы. Кроме того установлено, что при ' культивировании бактерий на'средах с нуклеиновыми кислотами, а также при добавлении веществ, вызывающих ингибирование дыхания клеток (азид натрия) и репликации ДНК (налидиксовая кислота) практически весь синтезированный фермент - эндонуклеаза выделяется в окружающую среду. Этот прием можно

использовать для повышения выхода фермента при его последующем выделении из культуральной жидкости.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на Форуме по прикладной биотехнологии (Брюгге, Бельгия, 1998), IX Европейском конгрессе по биотехнологии (Брюссель, Бельгия, 1999), VIII Конференции по промышленному использованию ферментов (Барселона, Испания,- 1999), V Международной конференции по рибонуклеазам (Варрентон, США, 1999), XXXVIII ( Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2000), Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов» (Москва, 2000), XVIII Международном Конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Бирмингем, Великобритания, 2000), I Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2000).

Публикации. Опубликовано 10 работ по материалам диссертации.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста; состоит из обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложения. Работа содержит 20 таблиц, 25 рисунков. Список литературы включает 177 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследования использовали штамм Serratia marcescens W1050. •

Для культивирования клеток Serratia marcescens использовали среды: минимальную, обогащенную гидролизатом казеина и дрожжевым автолизатом и LB. Минимальная среда содержала (%): 0,47 - NaCl, 0,11 - NH4CI, 0,04 - Na2S04, 0,0095 - MgCl2, 0,0011 - СаС12, 0,28 - K2HP04 ■ ЗН20, 0,5% глюкозы, pH 7,5. Обогащенная среда (среда А), содержала дополнительно к минимальному составу 0,1% гидролизата казеина и 0,3% дрожжевого автолизата. Среда LB .(%) . содержала 1 - триптона, 0,5 - дрожжевого экстракта, 1 - NaCl.

С целью изучения влияния азотного и углеродного питания на биосинтез и секрецию изоформ нуклеазы проводили культивирование на средах, содержащих

альтернативные источники углерода — пируват, цитрат, лактат натрия в количестве, эквимолярном по отношению к углероду в составе глюкозы; на средах, содержащих альтернативные источники азота - (ЫНОгЩРО^, KNO3, мочевину в эквимолярном по отношению к азоту в составе NH4CI количестве; на среде, содержащей в качестве единственного источника азота и углерода 0,1% гидролизат казеина. Для того, чтобы изучить влияние субстратов и конечных продуктов гидролиза на биосинтез и секрецию изоформ нуклеазы проводили культивирование на средах, содержащих 0,5% ДНК или РНК, 0,1% УМФ или ГМФ. Для изучения влияние веществ, ингибирующих репликацию ДНК и дыхание клеток, проводили культивирование на средах в присутствии налидиксовой кислоты и азида натрия соответсвенно.

Растворы налидиксовой кислоты и азида натрия готовили отдельно и вносили в среду до конечной концентрации 2 мкг/мл и 5 мМ соответственно вместе с посевным материалом.

Проводили культивирование при 30 °С в течение 36-92 часов. Для изучения влияния аэрации на биосинтез и секрецию изоформ нуклеазы проводили культивирование на среде А без принудительного перемешивания, рН среды поддерживали на уровне начального (рН=7,5) при помощи стерильного раствора NaOH. В качестве контрольной использовали культуру, выращенную на среде А, при перемешивании (200 об/мин.).

Прирост биомассы измеряли по оптической плотности на КФК-2 при длине волны 590 нм. Вес сухой биомассы определяли высушиванием клеточной суспензии до постоянного веса. Продуктивность (удельную активность) в отношении синтеза фермента рассчитывали как отношение активности фермента к величине сухой биомассы. Уровень биосинтеза нуклеазы рассчитывали как сумму продуктивности в культуральной жидкости и периплазме.

Фракции белков периплазмы и цитоплазмы получали, как описано (Шнайтман, 1983, Телеснина Г.Н. и др, 1992).

Нуклеазную активность определяли по количеству кислоторастворимых продуктов (Nestle М. and Roberts W.K., 1969, Лещинская И.Б. и др., 1974) и шишечным методом с использованием этидиум бромида (T.K.Ball et al., 1990). Наличие сукцинатдегидрогеназы в клеточных фракциях определяли, как описано (Филлипович Ю. и др., 1975). Активность Р-галактозидазы определяли в соответствии со стандартным методом (Миллер, 1976). Активность аспартатаминотрансферазы определяли, как описано (Нгуен и др., 1978). Активность глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (ГФДГ) определяли, как описано

(Кочетов Г.А., 1980). Активность Р-лактамазы определяли, как описано (Чайковская С.М., Венкина Т.Г., 1962). Активность щелочной фосфатазы (ФМЭ) определяли, как описано (Лещинская И.Б. и др., 1980).

Для выявления молекулярных форм нуклеазы Sml и Sm2 проводили электрофорез клеточных фракций S.marcescens в 15% полиакриламидном геле (ПААГ) в отсутствии денатурирующих агентов (Маурер, 1971). В качестве маркерных белков использовали гомогенные нативные препараты Sml и Sm2, которые были любезно предоставлены д.б.н. Филимоновой М.Н. Продолжительность электрофореза 8 часов при силе тока 50 мА. Впитывание образцов проводили в течение 20 минут - 1 часа при силе тока 24 мА. Определение локализации нуклеазы проводили с помощью метода энзимограмм, как описано (Гааль Э. и др., 1982, Филимонова и др., 1991). Полученные энзимограммы сканировали при помощи сканера "Scanexpress 6000 SP", изображения переводили в черно-белую гамму и представляли в виде негатива в программе "PhotoPIus 1.2". Для определения соотношения изоформ при электрофорезе пятна, соответствующие локализации нуклеазы вырезали и взвешивали на электронных весах "ER-180A" .

Статистический анализ проводили с использованием стандартных математических методов в программе Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Отбор штамма Serratia marcescens, условий синтеза эндонуклеазы в два этапа, биохимических маркеров цитоплазмы и

периплазмы

Из трех штаммов Serratia marcescens (В10М1, 24 и W1050) и трех питательных сред (минимальная, А и LB) для дальнейшей работы были выбраны S.marcescens штамм W1050 и среда А, представляющая собой минимальную среду, обогащенную гидролизатом казеина (0,1%) и дрожжевым автолизатом (0,3%), по признаку максимального синтеза эндонуклеазы и ее секреции в два этапа - на рисунке это выражается в виде двух последовательно расположенных пиков - первый пик - в конце логарифмической фазы роста, а второй - в фазе стационарного роста (рис.1).

Минимальная среда

Среда А

Среда LB

В10М1

24

10 30 30 40

В

W1050

10 „ 20 30 Время, ч

Рис.1. Динамика продуктивности культуры в отношении синтеза нуклеазы при культивировании на средах А (Г-Е), LB (Ж-И) и минимальной (А-В) Serratia marcescens штаммов В10М1 (А, Г, Ж), 24 (Б, Д, 3) и W1050 (В, Е, И)

В цитоплазме, периплазме и культуральной жидкости определяли содержание аспартатаминотрансферазы, ß-гапактозидазы и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (ГФДГ), ß-лактамазы и щелочной фосфатазы (ФМЭ) (табл.1). В результате этих исследований были выбраны биохимические маркеры целостности цитоплазматической мембраны (глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа) и наружной мембраны (щелочная фосфатаза). Считали, что появление нуклеазной активности в периплазме и среде является результатом секреции через цитоплазматическую и наружную мембраны, если содержание ГФДГ в периплазме и ФМЭ в культуральной жидкости не превышало значений, определенных для минимальной среды и среды А.

Таблица 1

Активность ферментов - потенциальных биохимических маркеров целостности цитоплазматической мембраны и наружной мембраны клеток

Serratia marcescens

Фермент Цитоплазма, ед. Периплазма, ед. Культуральная жидкость, ед.

Аспартатаминотрансфераза 0,5±0,06 0,75±0,05 - ;

ß-галактозидаза 210,3±4,4 147,5±5,8 -

Глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа Ю'^г-Ю"4 10"4±2-10"5 -

ß-лактамаза В отсутствии ампициллина - 6,0±0,5 -

В присутствии ампициллина . 49,4±8,5 190,1 ±4,3. 149,7±2,9

Щелочная фосфатаза 10,6±0,3 -

Согласно данным литературы, появление изоформ эндонуклеазы 8ш1 и 8т2 в периплазме и культуральной жидкости разделено во времени - сначала появляется изоформа вт2 и лишь на более поздних стадиях роста - изоформа Бт1, при этом лишь изоформа 8ш2 выделяется из клетки путем секреции, а изоформа 8т1 попадает в культуральную жидкость только в результате лизиса клеток (ЭиЬ У. еЬ а1., 1995). Исследование динамики накопления эндонуклеазы в

периплазме и культуральной жидкости показали (рис.2), что при культивировании бактерий на минимальной среде появление изоформы 8ш1 является результатом изменения проницаемости мембраны, а при культивировании на среде А - следствием секреции. Таким образом, наши данные отличаются от имеющихся в литературе.

Кроме того, добавление гидролизата казеина и дрожжевого автолизата в среду приводило к увеличению уровня синтеза изоформы 8т1 приблизительно в 10 раз, а изоформы 8ш2 - в 4 раза.

Таким образом, полученные результаты указывают на зависимость уровня биосинтеза и секреции изоформ эндонуклеазы от состава среды.

А

Бт1

В

8т1 8т2 <

Рис.2. Энзимограмма фракций нуклеазы в периплазме (А, В) и культуральной жидкости (Б, Г) при культивировании клеток на минимальной среде (А, Б) среде А (В, Г)

Время блотгинга: А — 60 минут, Б - 20 минут, В - 30 минут, Г - 6 минут.

2. Влияние субстратов и продуктов гидролиза на биосинтез и секрецию изоформ эндонуклеазы

Было изучено влияние ДНК и РНК на биосинтез и секрецию изоформ фермента. Результаты электрофореза фракций показали (рис.3), что добавление нуклеиновых кислот в среду приводило к появлению в периплазме во фракции

Пики активности вт2 1 2 2

** ■ ф

Пики активности 1 2

¡тгчЯ-

Пики активности 8ш1 Бт2 1 2

Пики активности вш! 8ш2 1 2

первого пика обеих изоформ, в отличие от контроля, где в первом пике обнаруживалась только изоформа 8т2. Стоит также отметить, что преобладание той или иной молекулярной формы во фракциях пиков в культуральной жидкости зависело от типа нуклеиновой кислоты. Так, на среде с ДНК в культуральной жидкости преобладала изоформа 8т2, а на среде с РНК - изоформа БтЬ Было установлено, что добавление нуклеиновых кислот в состав питательной среды приводило к увеличению уровня биосинтеза изоформы 8т1 в 2-3 раза. Однако, сделать заключение о субстратной индукции в данном случае не представляется возможным.

Поскольку преобладающим мононуклеотидом в продуктах гидролиза РНК для изоформы Бт2 является гуанозин-, а 8т1 - уридинмонофосфат, указанные нуклеотиды были выбраны для испытания в качестве потенциальных репрессоров биосинтеза и секреции изоформ эндонуклеазы З.тагсевсет.

Бш!

Пики активности 8т2 1 2 2

Пики активности Бш! 8ш2 1 2 3

В

8ш1 8ш2

Пики активности 1 2 2

«В*

Пики активности 8ш1 8ш2 1 2 2 3

Л'

М

Рис.3. Энзимограмма фракций нуклеазы в периплазме (А, В) и культуральной жидкости (Б, Г) при культивировании клеток на среде с ДНК (А, Б) и РНК (В, Г) Время блотгинга: А, В - 30 минут, Б, Г - 6 минут.

Появление нуклеазы в периплазме и культуральной жидкости при культивировании бактерий на среде с мононуклеотидами было обнаружено на фоне изменения проницаемости цитоплазматической и наружной мембран. Электрофоретический анализ (рис.4) показал, что картина распределения изоформ во фракциях пиков нуклеазной активности в периплазме и

культуралыюй жидкости зависела от природы мононуклеотидов. В культуральной жидкости во фракции первого пика на среде с ГМФ содержалась изоформа 8т2, а на среде с УМФ - только изоформа 8т1. Мононуклеотиды, добавленные в среду в качестве дополнительного источника питания, не вызывали репрессии синтеза эндонуклеазы, однако изменяли биосинтез отдельных молекулярных форм. Так, биосинтез изоформы 8т1 увеличивался в среднем на 80% при снижении биосинтеза изоформы 8ш2 на 20-30%.

Таким образом, проведенные исследования позволяют заключить, что биосинтез изоформ эндонуклеазы не подвергается значительной стимуляции субстратом и не ингибируется продуктами гидролиза субстратов. В обоих случаях ответом клетки было увеличение уровня биосинтеза изоформы Бш!.

А

Пики активности 8т1 8т2 1 2

Б

Пики активности вш! 8т2 12 2

^ -

В

Пики активности Бт! 8т2 1 2 3

Г

Пики активности Бт! 8т2 12 3

4 ...»

§т - ■

Рис.4. Энзимограмма фракций нуклеазы в периплазме (А, В) и культуральной жидкости (Б, Г) при культивировании клеток на среде с УМФ (А, Б) и ГМФ (В, Г) Время блоттинга: А, В - 30 минут, Б, Г - 10 минут.

3. Влияние источников азотного и углеродного питания на биосинтез и секрецию изоформ эндонуклеазы

Представляло интерес провести исследование влияния альтернативных источников азотного питания на биосинтез и секрецию изоформ эндонуклеазы. Показано (табл.2), что замена NH4C1 на мочевину и (NH^HPC^ увеличивала уровень биосинтеза изоформы Sml в 1,4-1,8 раза. Нитрат (KN03) стимулировал уровень синтеза обеих изоформ в 8-9 раз. Ответом клетки на добавление нитратов стало появление изоформы Sml в первом пике нуклеазной активности в культуральной жидкости (рис.5).

Таблица 2

Биосинтез изоформ эндонуклеазы Serratia marcescens при культивировании на средах с разными источниками азота и углерода

Источник Биосинтез, %

азота углерода Sml Sm2

NH4CI Глюкоза 100,00±15,54 100,00±3,64

Мочевина Глюкоза 143,99±4,73 64,32±1,11

(NH4)2HP04 Глюкоза 180,08±16,05 107,19±3,76

KNO3 Глюкоза 968,00±42,90 801,61±10,06

Гидролизат казеина 439,91±31,75 275,72±7,45

NH4CI Цитрат натрия 885,47±18,02 374,46±3,53

NH4CI Пируват натрия 1355,54 ±120,81 806,91±28,34

NH4CI Лактат натрия 3409,86±91,26 552,31±21,41

При подборе питательной среды было установлено, что обогащение среды минимального состава гидролизатом казеина и дрожжевым автолизатом приводило к двухэтапному накоплению эндонуклеазы в среде. Использование гидролизата казеина в качестве единственного источника азотного и углеродного питания приводило к увеличению уровня биосинтеза обеих молекулярных форм (табл.2). Электрофоретический анализ фракций показал, что единственным отличием от контроля было приблизительно равное соотношение изоформ во фракциях второго пика нуклеазной активности в периплазме и культуральной жидкости (рис.6).

Бт! 8ш2

Пики активности 1 2

Пики активности Бш! Бт2 1 2

в

Пики активности Бш! Бш2 1 2

Пики активности Бщ! Бт2 12 2

ГУ+ г

Д

Пики активности

Бт1 Бт2 12 3

* » • * «

Е

Пики активности Бш! 5ш2 1 2 3

Рис.5. Энзимограмма фракций нуклеазы в периплазме (А, В, Д) и культуралыюй жидкости (Б, Г, Е) при культивировании клеток на среде с мочевиной (А, Б), (Ш4)2НР04 (В, Г) и КЖ)3 (Д, Е)

Время блоттинга: А, В - 60 минут, Д - 40 минут, Б, Г - 20 минут, Е - 15 минут.

А Б

Пики активности Пики активности

Бш! Бт2 1 2 Бт1 Бт2 1 2

Рис.6. Энзимограмма фракций нуклеазы в периплазме (А) и культуральной жидкости (Б) при культивировании клеток на среде с гидролизатом казеина

Время блотгинга: А - 60 минут, Б - 20 минут.

Замена глюкозы в минимальной среде на цитрат, пируват и лактат натрия приводила к увеличению уровня биосинтеза эндонуклеазы, как отмечали и другие исследователи (Юсупова Д.В. и др., 1983), а также её молекулярных форм (табл.2). Максимальное увеличение уровня биосинтеза изоформы 8ш1 (в 34 раза) обнаружено на среде с лактатом натрия, а изоформы 8т2 (в 8 раз) на среде с пируватом натрия. Распределение изоформ в пиках активности эндонуклеазы в периплазме и культуральной жидкости зависело от источника углеродного питания (рис.7). На минимальной среде бактерии синтезировали изоформы 8ш1 и 8ш2 в соотношении 1 : 4. Замена глюкозы на пируват, цитрат и лактат натрия изменяла это соотношение в сторону увеличения изоформы 8т1 (максимальное соотношение 3 : 2), то есть, меняя источник углерода, можно моделировать условия для направленного получения той или иной молекулярной формы нуклеазы.

Таким образом, проведенные исследования позволяют отметить, что природа источника азотного и углеродного питания оказывает влияние на биосинтез и секрецию изоформ эндонуклеазы. Максимальное увеличение биосинтеза обеих изоформ обнаружено при замене №14С1 на КЖ)э, а также при замене глюкозы на лактат натрия.

А

Бт1

щ

в

8т1

Щ

д'

8т1 5

• ^

Рис.7. Эизимограмма фракций нуклеазы в периплазме (А, В, Д) и кулыуральной жидкости (Б, Г, Е) при культивировании клеток на среде с пируватом (А, Б), цитратом (В, Г) и лактатом натрия (Д, Е)

Время блоттинга: А, В, Г - 30 минут, Б, Г, Д - 15 минут.

4. Влияние веществ, вызывающих ингибирование дыхания (азид натрия) и репликации ДНК (налидиксовая кислота), а также уровня аэрации на биосинтез и секрецию . изоформ эндонуклеазы

Важным фактором, влияющим на биосинтез ферментов у бактерий, является аэрация. Показано, что в результате культивирования бактерий в условиях пониженной аэрации увеличивался биосинтез обеих изоформ в 2,6-3 раза. Электрофоретический анализ фракций показал, что распределение изоформ во фракциях первого и второго пиков нуклеазной активности в периплазме и

Пики активности 8т2 1 2

Пики активности 8ш18т2 • 1 2

8т2 *

Пики активности 1 2 2

Я

Пики активности п2 1 1

к' Л

■ *

Е

Пики активности вш! 8ш2 1 2

т.

.г

Пики активности Бт! 8т2 1 1 1

' Т1'

№ «К' Ч*" • !«»-

культуральной жидкости не отличалось от контроля (среда А), во фракции третьего пика, отсутствующего в контроле, преобладала изоформа 8ш1 (рис.8).

А

Пики активности 8ш1 8ш2 1 2

Б

Пики активности Бш! Бт! 1 2 3

*

*. -ф

Рис.8. Энзимограмма фракций нуклеазы в периплазме (А) и культуральной жидкости (Б) при культивировании бактерий в условиях пониженной аэрации

Время блоттинга: А - 30 минут, Б - 6 минут.

Азид натрия, являющийся одновременно ингибитором дыхания и окислительного фосфорилирования, при добавлении вместе с посевным материалом вызывал увеличение уровня биосинтеза нуклеазы примерно в 2,3 раза. Уровень синтеза отдельных молекулярных форм увеличивался в разной степени - изоформы 8ш1 приблизительно в 3,3 раза, а изоформы 8т2 - в 1,7 раза. Добавление №N3 приводило к изменению проницаемости цитоплазматической и наружной мембран, появление нуклеазной активности в периплазме и культуральной жидкости, таким образом, нельзя объяснить только процессом секреции. Известно, что азид натрия ингибирует синтез ДНК в клетках прокариот (Слез1а Ъ. е! а1. 1974), однако не вызывает ЗОБ-ответ клетки (Бглуаска М. е! а1., 1979). Тем не менее, азид натрия при добавлении в питательную среду вместе с посевным материалом, стимулировал биосинтез эндонуклеазы и её отдельных молекулярных форм.

При добавлении классического индуктора ЗОБ-ответа - налидиксовой кислоты вместе с посевным материалом, наблюдалось увеличение биосинтеза нуклеазы в 5 раз. Эти данные хорошо согласуются с результатами, полученными в группе Юсуповой Д.В. с соавторами (1991, 1993). При добавлении налидиксовой кислоты увеличивался уровень синтеза обеих молекулярных форм эндонуклеазы (в 4-6 раз), однако биосинтез изоформы 8ш1 изменялся в большей

степени. Показано что при добавлении налидиксовой кислоты происходило изменение проницаемости цитоплазматической и наружной мембран клетки. Поэтому нуклеазная активность, обнаруженная в периплазме и в культуральной жидкости, являлась не только результатом активной секреции.

Бт!

Пики активности 8т2 1 2

В

Пики активности Бш! 8т2 1 2 2 3

Г

Пики активности

Пики активности

8т1 8т2 ¥

1

8ш1 8ш2 1 2 3

4ЙШ ^

Шт. ^

Рис.9 Энзимограмма фракций нуклеазы в периплазме (А, В) и культуральной жидкости (Б, Г) при культивировании бактерий в присутствии азида натрия (А, Б) и налидиксовой кислоты (В, Г)

Время блоттинга: А, В - 30 минут, Б, Г - 6 минут.

Анализ электрофореза фракций (рис.9) показал, что ответом клетки на добавление ингибитора дыхания (азид натрия) или репликации ДНК (налидиксовая кислота) является появление изоформы 8ш1 во фракции первого пика нуклеазной активности в периплазме.

Таким образом, ингибитор дыхания клеток (азид натрия) и ингибитор репликации ДНК (налидиксовая кислота), а также пониженная аэрация вызывают увеличение уровня биосинтеза обеих молекулярных форм эндонуклеазы.

19

ВЫВОДЫ

1. Подобран штамм Serratia marcescens - W1050 и состав питательной среды, обогащенной гидролизатом казеина (0,1%) и дрожжевым автолизатом (0,3%), при культивировании на которой накопление фермента происходит в два этапа.

2. Подобраны биохимические агенты: глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа - как маркер целостности цитоплазматической мембраны, щелочная фосфатаза - как маркер целостности наружной мембраны.

3. Показано, что биосинтез изоформ эндонуклеазы не подвергается значительной стимуляции субстратом и не ингибируется продуктами гидролиза субстратов. В обоих случаях обнаружено увеличение биосинтеза изоформы Sml в 1,6-3,0 раза.

4. Установлено, что природа источников азотного и углеродного питания оказывает влияние на биосинтез и секрецию изоформ эндонуклеазы: максимальное увеличение биосинтеза обеих изоформ обнаружено при замене NH4CI на KN03, а также при замене глюкозы на лактат натрия.

5. Показано, что ингибитор дыхания клеток (азид натрия) и ингибитор репликации ДНК (налидиксовая кислота), а также пониженная аэрация вызывают увеличение уровня биосинтеза эндонуклеазы и её молекулярных форм.

6. Установлено, что ответом клетки на неблагоприятные условия внешней среды является увеличение уровня синтеза молекулярной формы Sml.

Публикации по теме диссертации

1. Филимонова М.Н., Гарусов А.В., Сметанина Т.А., Андреева М.А., Богомольная Л.М., Лещинская И.Б. Изоформы нуклеазы Serratia marcescens. Сравнительный анализ субстратной специфичности// Биохимия - 1996. - т.61. -вып. 10. - е.. 1800-1806.

2. Филимонова М.Н., Губская В.П., Нуретдинов И.А., Бенедик М.Дж., Богомольная Л.М., Андреева М.А., Лещинская И.Б. Изоформы нуклеазы Serratia marcescens. Роль ионов Mg+2. в механизме гидролиза// Биохимия -1997. - т.62. - вып.9 - с. 1148-1154.

3. Bogomolnaya L.M., Filimonova M.N. The path for directed preparation of two different isoform of Serratia marcescens nuclease/ FAB proceeding , FAB-98, September, 24-25, Belgium, 1998, Part I, pp.. 1333 - 1337.

4. Bogomolnaya L.M., Filimonova M.N. The path for preparation of isoforms Sm2 of Serratia marcescens nuclease/ ECB 9 Book of abstracts, 9th European Congress on Biotechnology, July 11-15,' Brussels, Belgium, 1999.

5. Bogomolnaya L., Filimonova M. The path for directed preparation of two different isoform of Serratia marcescens nuclease/ VIII Meeting on Industrial Applications of Enzymes, November 30 -December 1, Barcelone, Spain, 1999

6. Bogomolnaya L., Filimonova M. Endonuclease of Serratia marcescens. Biosynthesis and properties of the isoforms/ Book of abstract, _ 5th International Meeting on ribonucleases, May 12-16, Airlie Center Warrenton, Virginia, USA,

1999, p.92 ,

7. Богомольная Л.М. Изоформы эндонуклеазы Serratia marcescens.l Материалы XXXVIII международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс", Новосибирск, 11-13 апреля 2000 г.,

2000, ч.1 (Биология), С.69-70.

8. Богомольная Л.М., Филимонова М.Н. Эндонуклеаза бактерий Serratia marcescens. Влияние факторов среды на биосинтез и секрецию изоформ фермента/ Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов", 12-15 апреля 2000 г., г.Москва, вып.4., Изд-во МГУ, 2000, С. 14-15

9. Bogomolnaya L.M., Filimonova M.N. Bioenergetic processes as a factor regulating secretion of isoforms of Serratia marcescens nuclease/ Book of abstract,

18-th International Congress of biochemistry and molecular biology "Beyond the genome", 16-20 July, Birmingham, UK, 2000,p.624

10. Богомольная JI.M., Филимонова M.H. Влияние факторов окружающей среды на биосинтез изоформ нуклеазы бактерий Serratia marcescensl Тезисы докладов I Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века", 20-21 октября, г.Казань, 2000, С.25-26

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Богомольная, Лидия Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Секреция белков у грамотрицательных бактерий

1.1. Типы секреции

1.2. Секретируемые белки Serratia marcescens

2. Внеклеточная эндонуклеаза Serratia marcescens

2.1. Эндонуклеаза и её свойства

2.2. Особенности структуры макромолекулы и каталитический 21 механизм действия эндонуклеазы

2.3. Изоформы эндонуклеазы Serratia marcescens

3. Биосинтез и секреция эндонуклеазы Serratia marcescens

3.1. Экспрессия гена и регуляция биосинтеза эндонуклеазы

3.2. Секреция эндонуклеазы

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ V ' * *

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ : ** * "

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Отбор штамма бактерий Serratia marcescens и питательной 53 среды, обеспечивающей секрецию эндонуклеазы в два этапа

2. Подбор белков-маркеров цитоплазмы и периплазмы

3. Рост бактерий и изменение нуклеазной активности в 63 разных фракциях при культивировании на средах разного состава

4. Влияние субстратов и продуктов гидролиза на биосинтез и 70 секрецию изоформ эндонуклеазы

4.1. Влияние нуклеиновых кислот

4.2. Влияние мононуклеотидов

5. Влияние источников азотного и углеродного питания на 80 биосинтез и секрецию изоформ эндонуклеазы

5.1. Влияние источников азотного питания

5.2. Влияние гидролизата казеина

5.3. Влияние источников углеродного питания

6. Влияние аэрации на биосинтез и секрецию изоформ 97 эндонуклеазы

7. Действие веществ, вызывающих ингибирование дыхания 101 (азид натрия) и репликации ДНК (налидиксовая кислота) на биосинтез и секрецию изоформ эндонуклеазы

7.1. Влияние азида натрия

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние условий культивирования и некоторых экзогенных факторов на биосинтез и секрецию изоформ эндонуклеазы Serratia marcescens"

Актуальность проблемы. Внеклеточная эндонуклеаза бактерий Serratia marcescens (эндонуклеаза Sm) изучается на протяжении многих лет. Интерес к этому ферменту вызван уникальностью его свойств. В частности известно, что каталитическая активность эндонуклеазы Sm в 4 раза превышает таковую стафилококковой нуклеазы и в 34 раза - ДНКазы I. Ферментный препарат находит применение в молекулярной биологии для удаления ДНК из белковых препаратов (Manual "Benzon Nuclease", 1989). На примере эндонуклеазы Sm показана возможность использования в биотехнологии модифицированных "генов-убийц", кодирующих нуклеазы, разрушающие при определенных условиях геном клетки-хозяина и предотвращающих возможность переноса генов от клетки к клетке (Ahrenholtz I. et al., 1994). Известно, что отдельные нуклеазы, в их числе эндонуклеаза Sm, являются эффективными антивирусными агентами (Аликин и др., 1998).

В настоящее время известны основные биохимические свойства (Nestle M., Roberts W.K., 1969, Лещинская И.Б. и др., 1974), пространственная структура (Miller M.D., Krause K.L., 1996, Shlyapnikov S.V. et al., 2000), каталитически значимые аминокислоты (Friedhoff P. et al., 1994. Friedhoff P. et al., 1996), предложены механизмы действия (Kolmes В. et al., 1996, Шляпников C.B. и др., 1999) эндонуклеазы Sm, разработана эффективная схема её очистки (Филимонова М.Н. и др., 1980, Friedhoff P. et al., 1994). Показано, что эндонуклеаза секретируется в окружающую среду в виде двух основных изоформ, Sm2 и Sml. Известно, что единственным различием структуры изоформ является строение N-концевой аминокислотной последовательности. Изоформы различаются по молекулярной массе, I оптимуму pH действия, оптимальной концентрации активатора (Mg ), кинетическим параметрам гидролиза ДНК, предпочтением к природе азотистых оснований (Банникова Г.Е. и др., 1990, Филимонова М.Н. и др., 1991, 1996, 1997, Filimonova M.N. et al., 1994, Педерсен Ю. И др., 1995 а-г).

Выдвигаются предположения, что синтез и секреция изоформ регулируется факторами внешней среды и физиологическим состоянием клеток (Suh Y. et aL, 1995). В связи с вышеизложенным, представляло значительный интерес изучить влияние разнообразных экзогенных факторов на образование и экспорт из клетки изоформ эндонуклеазы Serratia marcescens.

Цели и задачи исследования. Данная работа проведена с целью установления влияния на биосинтез и секрецию изоформ эндонуклеазы Serratia marcescens различных экзогенных эффекторов, включая компоненты питательной среды, условия культивирования, ингибиторы дыхания и репликации ДНК.

В соответствии с поставленной целью решались следующие экспериментальные задачи:

1. Отбор штаммов бактерий и питательной среды, обеспечивающей секрецию эндонуклеазы в два этапа;

2. Подбор маркеров целостности цитоплазматической и наружной мембраны клеток;

3. Исследование влияния на синтез и секрецию изоформ эндонуклеазы Serratia marcescens природы источников азотного и углеродного питания, субстратов и продуктов их гидролиза (ДНК, РНК, мононуклеотидов), уровня аэрации в процессе культивирования бактерий

4. Изучение влияния на синтез и секрецию изоформ фермента веществ, вызывающих ингибирование дыхания клеток (азид натрия) и репликации ДНК (налидиксовая кислота);

Научная новизна работы. Показано, что биосинтез и секреция изоформ эндонуклеазы Serratia marcescens зависит от состава питательной среды и условий культивирования. Установлено, что ответом клетки на 7 изменение факторов внешней среды, а именно, добавление в среду нуклеиновых кислот, мононуклеотидов, использование альтернативных источников азотного и углеродного питания, добавление веществ, вызывающих ингибирование дыхания клеток (азид натрия) и репликации ДНК (налидиксовая кислота) является увеличение уровня синтеза молекулярной формы 8ш1. Только при снижении аэрации было отмечено увеличение биосинтеза обеих изоформ.

Практическая ценность работы. Показано, что изменения условий культивирования могут привести к направленному синтезу отдельных молекулярных форм эндонуклеазы. Кроме того установлено, что при культивировании бактерий на средах с нуклеиновыми кислотами, а также при добавлении веществ, вызывающих ингибирование дыхания клеток (азид натрия) и репликации ДНК (налидиксовая кислота) практически весь синтезированный фермент - эндонуклеаза выделяется в окружающую среду. Этот прием можно использовать для повышения выхода фермента при его последующем выделении из культуральной жидкости.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Род Serratia, принадлежащий к энтеробактериям, состоит их нескольких видов. Отличительной особенностью многих представителей этого рода является способность вырабатывать нерастворимый в воде пигмент продигиозин, придающий колониям характерный красный цвет. Несмотря на то, что изначально к представителям рода Serratia были отнесены все энтеробактерии, образующие колонии красного цвета, впоследствии было установлено, что отдельные штаммы Serratia могут и не обладать этой способностью. В настоящее время наиболее изученными представителями рода Serratia являются S.marcescens, S.liquefaciens и S.rubidaea (Grimont P.A. and Grimont F., 1978, Janda J.M., Abbott S.L., 1998).

Представители рода Serratia обитают в воде, почве и на растениях. Разнообразные штаммы также могут колонизировать рептилий, насекомых и млекопитающих, включая человека. Заражение происходит при контакте с окружающей средой. Среди домашних животных у бактерий рода Serratia были выделены у лошадей, кроликов, свиней и коров. У человека из бактерий рода Serratia наиболее часто выделяется S.marcescens (Yu V.L., 1979, Grimont F. and Grimont P.A., 1981, Janda J.M., Abbott S.L., 1998).

Изначально предполагалось, что Serratia marcescens является сугубо сапрофитным организмом. Однако с течением времени появлялось все больше доказательств его патогенности. В соответствии с данными National Nosocomial Infections Surveilance System (NNIS, USA), бактерии Serratia marcescens ответственны за 1-4% всех инфекций кровеносных и мочеиспускательных путей. Источниками заражения в госпиталях и больницах, как правило, являются больничное оборудование, а также руки персонала. Нередки и случаи устойчивости к антибиотикам, часто множественной (Schaberg D.R. et al., 1991).

Интересно отметить, что хотя смертельные случаи, обусловленные инфицированием Serratia marcescens, относительно редки, процент смертности от этой инфекции гораздо превосходит данный показатель для других представителей грамотрицательных и грамположительных бактерий. Обычно процент смертности в тяжелых случаях, вызванных инфекцией Serratia marcescens, составляет 33 - 52% (Watanakunakorn С. 1989, Saito Н. et al., 1989, Arribas J.R. et al., 1990).

Отдельные представители рода Serratia патогенны для насекомых. Например, бактерии вида S.entemophila патогенны для травяных личинок Costelytra zealandica. Эти бактерии широко используются для борьбы с вредителями сельскохозяйственных угодий в Новой Зеландии(Оптогй P.A.D. et al., 1988).

Представители рода Serratia хорошо растут в лабораторных условиях, образуя как окрашенные, так и бесцветные колонии. Оптимум температуры составляет 15 - 30 °С, однако большинство видов может расти при температурах до 4 °С. Содержание G/C пар в геноме Serratia составляет от 54 - 64%, что является наибольшим среди всех энтеробактерий (Grimont P.A. and Grimont F., 1978).

Наиболее хорошо изученным и часто встречаемым представителем рода Serratia является S.marcescens. Представители этого вида могут быть определены по четырем важным признакам: неспособности ферментировать арабинозу, рамнозу, и наличию лизин- и орнитин-декарбоксилаз (Farmer J.J. III, 1995).

S.marcescens обладает рядом преимуществ, которые позволяют использовать данный организм как уникальную систему для изучения секреции внеклеточных белков. С одной стороны, разнообразные способы и возможности генетических манипуляций, разработанные для изучения модельного организма E.coli, в полной мере могут быть использованы и в случае S.marcescens. Поскольку плазмиды на основе ColEl могут одинаково реплицироваться как в E.coli, так и в S.marcescens, все стандартные векторы семейства pBR322 могут также быть использованы в работе с S.marcescens. Методы трансформации, разработанные для E.coli, могут быть применены и для S.marcescens. Многие бактериофаги и даже плазмида F, необходимая для конъюгации в E.coli, также могут быть использованы для конструирования новых штаммов S.marcescens (Ball Т.К. et al., 1987).

С другой стороны, в отличие от большинства энтеробактерий и особенно E.coli, бактерии S.marcescens секретируют несколько внеклеточных белков. Среди достаточно хорошо изученных секретируемых белков есть эндонуклеаза, липаза, протеаза, и хитиназы (Eaves G.N and Jeffries C.D., 1963 Monreal J. and Reese E.T., 1969, Heller K.B., 1979 Braun V. and Schmitz G., 1980, Порфирьева O.B. и др., 1997). Таким образом, S.marcescens, обладающая как всеми преимуществами E.coli, так и развитой системой внеклеточной секреции, является исключительно заманчивой моделью для изучения секреции белков в грамотрицательных бактериях.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Богомольная, Лидия Михайловна

выводы

1. Подобран штамм Serratia marcescens - W1050 и состав питательной среды, обогащенной гидролизатом казеина (0,1%) и дрожжевым автолизатом (0,3%), при культивировании на которой накопление фермента происходит в два этапа.

2. Подобраны биохимические агенты: глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа - как маркер целостности цитоплазматической мембраны, щелочная фосфатаза - как маркер целостности наружной мембраны.

3. Показано, что биосинтез изоформ эндонуклеазы не подвергается значительной стимуляции субстратом и не ингибируется продуктами гидролиза субстратов. В обоих случаях обнаружено увеличение биосинтеза изоформы Sml в 1,6-3,0 раза.

4. Установлено, что природа источников азотного и углеродного питания оказывает влияние на биосинтез и секрецию изоформ эндонуклеазы: максимальное увеличение биосинтеза обеих изоформ обнаружено при замене NH4C1 на KN03, а также при замене глюкозы на лактат натрия.

5. Показано, что ингибитор дыхания клеток (азид натрия) и ингибитор репликации ДНК (налидиксовая кислота), а также пониженная аэрация вызывают увеличение уровня биосинтеза эндонуклеазы и её молекулярных форм.

6. Установлено, что ответом клетки на неблагоприятные условия внешней среды является увеличение уровня синтеза молекулярной формы Sml.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Богомольная, Лидия Михайловна, Казань

1. Аглиуллина Д.Г., Юсупова Д.В., Беляева М.И. Активность внутри- и внеклеточной нуклеазы по фазам роста пигментного и беспигментного штаммов Serratia marcescens 1. Прикл. биохимия и микробиология. -1976. - т. 12. - №4. - с.544-547

2. Аликин Ю.С., Сенженко Л.П., Клименко В.П. Развитие технологии получения и перпективы использования эндонуклеазы Serratia marcescens II В Сб. Ферменты микроорганизмов. Казань. - 1998. -с.152-161

3. Балабан Н.П., Лещинская И.Б., Таняшин В.И. Действие ДНКаз на апиримидиновые ДНК// Биохимия. 1971. - т.36. - вып.4. - с.727-731

4. Балабан Н.П., Таняшин В.И., Лещинская И.Б. Действие ДНКаз на апуриновые ДНК// Биохимия. 1971. - т.36. - вып.З. - с.513-517

5. Банникова Г.Е., Благова Е.В., Варламов В.П., Моргунова Е.Ю., Дементьев А.Н., Шляпников C.B. Разделение изоформ и кристаллизация эндонуклеазы Serratia marcescens II Биоорган, химия. -1990. т.16. - вып. 12. - с.1678-1682

6. Безбородов A.M., Астапович Н.И. Секреция ферментов у микроорганизмов. М.: Наука. - 1984.

7. Беляева М.И., Капранова М.Н., Витол М.Я., Голубенко И.А., Лещинская И.Б. Использование нуклеиновых кислот в качестве основного источника питания бактерий// Микробиология. 1976. -т.45. - вып.З. - с.420-424

8. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. -М.: Мир, 1982, 448 с.

9. Егоров Н.С., Лория Ж.К., Брюкнер Б. Регуляция синтеза внеклеточных протеолитических ферментов у микроорганизмов // Успехи микробиологии. 1977. - №12. - с.59-79

10. Ю.Егоров Н.С., Лория Ж.К., Юдина Т.Г. Влияние белков на синтез экзопротеазы Bacillus thuringiensis II Микробиология. 1983. - т.52. -вып.4. - с.569-572

11. П.Зеленский М.И. Полярографическое определение кислорода в исследованиях по фотосинтезу и дыханию. М.: Наука. - 1986.

12. Капранова М.Н., Балабан Н.П., Голубенко И.А., Лещинская И.Б. Внеклеточные нуклеазы Bacillus mesentericus II Биохимия. 1976. -т.41. - вып.4, - с.639-642

13. Коновалов С.А., Воротило С.П., Зюкова Л.А. Биосинтез глюканаз и манназ, входящих в комплекс литических ферментов, термотолерантным штаммом Actinomyces griseinus 11 II Микробиология. 1974. -т.43. - вып.2. - с.261-266

14. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высш. Школа, 1980, 272 с.

15. Ландау Н.С., Туликова О.М., Егоров Н.С. Особенности контроля синтеза протеиназ с плсзминоподобной и активаторной активностями у морских бактерий // Микробиология. 2000. - т.69. - вып.2. - с.185-190

16. Лещинская И.Б., Балабан Н.П., Егорова Г.С., Таняшин В.И., Третьяк Т.М. Получение и характеристика высокоочищенного препарата нуклеазы Serratia marcescens II Биохимия. 1974. - т.39. - вып.1. -с.116-122

17. Лещинская И.Б., Богаутдинов З.Ф. Нуклеазы Serratia marcescens И Микробиология. 1963. -т.32. - с.412-415

18. Лория Ж.К., Брюкнер Б., Егоров Н.С. Влияние аминокислот на синтез внеклеточной протеазы у Serratia marcescens!I Микробиология. 1977. - т.46. - вып. 1. - с.41-45

19. Лория Ж.К., Брюкнер Б., Егоров Н.С. Влияние глюкозы на индуцированный синтез внеклеточной протеазы Serratia marcescens!7 Микробиология. 1977. -т.46. - вып.5. - с.926-930

20. Лория Ж.К., Брюкнер Б., Егоров Н.С. Индукция синтеза протеазы Serratia marcescens!! Биол.науки. 1976. - №6 - с. 108-111

21. Лория Ж.К., Брюкнер Б., Егоров Н.С. Корреляция синтеза внеклеточной протеазы с синтезом красного пигмента продигиозина у Serratia marcescens!I Микробиология. 1977. - т.46. - вып.4. - с.647-650

22. Лория Ж.К., Брюкнер Б., Егоров Н.С. О природе истинного индуктора синтеза внеклеточной протеазы Serratia marcescens!I Микробиология. -1977. т.46. - вып.З. - с.440-445

23. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. -М.: Мир, 1984,480с.

24. Миллер Д.Ж. Эксперименты в молекулярной генетики. — М.: Мир, 1976

25. Нгуен Ф.В., И.В. Малофеева, В.И.Яковлева Аспартат-аминотрансферазная активность разных штамов Е. coli // Прикл. Биохимия и микробиология. 1978. - т.14. - вып.4 - с.504-509

26. Панфилова З.И., Салганик Р.И. Получение мутантов Serratia marcescens суперпродуцентов эндонуклеазы путем воздействия нитрозометилмочевиной на синхронизированную культуру //Микробиология. 1983. - т.52. - вып.6. - с.974-978.

27. Педерсен Ю., Андерсен Ж., Роепсторф П., Филимонова М.Н., Бидерман К. Характеристика изоформ нуклеазы Serratia marcescens электроспрей масс-спектрометрией// Биохимия. 1995. - т.60. - вып.З.- с.462-469

28. Педерсен Ю., Филимонова М.Н., Роепсторф П., Бидерман К. Изоформы нуклеазы Serratia marcescens природного и рекомбинантного шатаммов. Сравнительная характеристика плазменно-десорбционной масс-спектрометрией// Биохимия. 1995. -т.60.- вып.З. -с.450-461

29. Порфирьева О.В., Юсупова Д.В, Беляева М.И. Сравнительное изучение активности ферментов энергетического обмена пигментных и беспигментных штаммов Serratia marcescens II Микробиология. 1980.- т.49. вып.2. - с.319-322.

30. Порфирьева О.В., Юсупова Д.В., Беляева М.И. Некоторые особенности физиологии пигментных штаммов Serratia marcescens и их беспигментных вариантов с повышенной нуклеазной активностью // Микробиология. 1976. - т.45. - вып.6. - с. 1045-1048

31. Порфирьева О.В., Юсупова Д.В., Зоткина H.JL, Соколова Р.Б., Габдрахманова JI.A. Хитинолитический комплекс Serratia marcescens иособенности его биосинтеза // Микробиология. 1997. - т.66. - вып.З. -с.347-353

32. Сазыкин Ю.О.// Итоги науки и техники. Биологическая химия. М.: ВИНИТИ. 1984. - т.20. - с.96.

33. Северина JI.O., Башкатова H.A. Выделение внутриклеточной липазы у Serratia marcescensl7 Микробиология. 1979. - т.48. - вып.6. - с.994-998

34. Сибирный A.A., Шавловский Г.М. Репрессия и инактивация ионами аммония системы транспорта мочевой кислоты у дрожжей Pichia guilliermondii//Биохимия. — 1974. т.39. - вып.1. - с.164-172

35. Современные методы изучения нуклеиновых кислот и нуклеаз микроорганизмов. Казань, КГУ, 1980, с.53-58.

36. Телеснина Г.Н.,. Васильева Н.А, Крестьянова И.Н.,.Бартошевич Ю.Э, Сазыкин Ю.О. Получение протопластов Xantomonas rubrilineans и их использование для изучения локализации аминопептидаз// Антибиотики и химиотерапия. 1992. - т.37. - 34. - с.14-16.

37. Филимонова М.Н., Балабан Н.П., Шарипова Ф.Р., Лещинская И.Б. Получение нуклеазы Serratia marcescens в гомогенном состоянии и изучение физико-химических свойств фермента // Биохимияю 1980. -т.45. - вып.11. - с.2096-2104

38. Филимонова М.Н., Баратова Л.А., Воспельникова Н.Д., Желтова А.О., Лещинская И.Б. Эндонуклеаза Serratia marcescens. Характеристика фермента// Биохимия. -1981.- т46. вып. 9. С. 1660-1666

39. Филимонова М.Н., Бенедик М., Уразов Н.Г., Лещинская И.Б. Нуклеазы Serratia marcescens полидисперсны при оптимальном значении pH// Прикладная биохимия и микробиология. 1999. - т.35. - вып.1. - с.20-24

40. Филимонова М.Н., Гарусов A.B., Сметанина Т.А., Андреева М.А., Богомольная Л.М., Лещинская И.Б. Изоформы нуклеазы Serratiamarcescens. Сравнительный анализ субстратной специфичности// Биохимия. 1996. -Т.61. - вып. 10. - с. 1800-1806

41. Филимонова М.Н., Губская В.П., Нуретдинов И.А., Бенедик М.Дж., Богомольная JI.M., Андреева М.А., Лещинская И.Б. Изоформы1. О Ануклеазы Serratia marcescens. Роль ионов Mg в механизме гидролиза// Биохимия. 1997. - т. 62. - вып.9. - 1448-1154

42. Филимонова М.Н., Дементьев A.A., Лещинская И.Б., Бакулина Г.Ю., Шляпников C.B. Выделение и характеристика изоформ внеклеточной нуклеазы Serratia marcescens// Биохимия. 1991. - т.56. - вып.З. -с.508-520

43. Филимонова М.Н., Уразов Н.Г., Хаертынов К.С. Препаративное выделение нуклеаз Sml и Sm2 и изучение их антигенности// Биологические науки, 1992. - вып.2. - с.65-70

44. Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей биохимии. М.: Просвещение, 1975, с.139-140.

45. Чайковская С.М., Венкина Т.Г. Модифицированный йодометрический метод определения активности пенициллиназы. // Антибиотики. -1962.-№5.-с.453-456.49.1Ннайтман К. Получение клеточных фракций// Методы общей бактериологии, 1983, т.1, с.138-148.

46. Юсупова Д.В., Соколова Р.Б. Штамм бактерий Serratia marcescens 24 -продуцент эндонуклеазы. Авт.свидетельство №1025725 СССР МКИ3С12 №9/22ж С12 15/00 Бюл. Открытия и изобретения. 1983. -№24.

47. Юсупова Д.В., Соколова Р.Б., Петухова Е.В. Влияние налидиксовой кислоты и митомицина С на рост и биосинтез внеклеточных белков Serratia marcescenslI Антибиотики и химиотер. 1993. - т.38. - №8-9. -с. 16-21

48. Юсупова Д.В., Соколова Р.Б., Порфирьева О.В., Пономарева А.З. Индукция синтеза внеклеточной эндонуклеазы Serratia marcescens агентами, подавляющими репликацию ДНК // Микробиология. 1991.- т.60. вып.2. - с.279-284.

49. Яснова JI.H., Пучкова Л.И. Изучение динамика накопления экстрацеллюлярных белков Serratia marcescens и их нуклеазной активности в процессе роста клеток// Микробиология. 1976. - т.45. -вып.6. - с.979-989

50. Ahrenholtz I., Lorenz M.G., Wackernagel W. A conditional suicide system in E.coli based on the intracellular degradation of DNA // Appl.Environ.Microbiol. 1994. - v.60. - pp.3736-3751

51. Akatsuka H., Kawai E., Omori K., Komatsubara S., Shibatani Т., Tosa T. The lipA gene of Serratia marcescens which encodes an extracellular lipase having no N-terminal signal peptide// JBacteriol. 1994. - v. 176. - №7. -pp. 1949-1956

52. Akatsuka H., Kawai E., Omori K., Shibatani T. The three genes lipB, lipC, and lipD involved in the extracellular secretion of the Serratia marcescens lipase which lacks an N-terminal signal peptide//JBacteriol.-1995.-v.l77.-№22.-pp.6381-6389

53. Antosiewicz J., Miller M.D., Krause K.L., McCammon J.A. Simulation of electrostatic and hydrodynamic properties of Serratia endonuclease// Biopolymers. 1997. - v.41. - №4. -pp.443-450

54. Arribas J.R., Domuiguez A., Folgueira M.D., Pena P., Luengo S., Pena J.M., Vazquez J.J. Prognostic factors in Serratia bacteremia// Reviews of Infectious Diseases. 1990. - v. 12. - №3. -pp.563-564

55. Ball Т.К., Saurugger P.N., Benedik M.J. The extracellular nuclease gene of Serratia marcescens and its secretion from Escherichia coli!I Gene. 1987.- v.57. №2-3. - pp.183-92

56. O.Ball T.K., Suh Y., Benedik M.J. Disulfide bonds are required for Serratia marcescens nuclease activity// Nucleic Acids Research. 1992. - v.20. -№19.-pp.4971-4974

57. Ball T.K., Wasmuth C.R., Branagel S.C. and Benedik M.J. Expression of Serratia marcescens extracellular proteins requires recA // J.Bacteriol. -1990. vol.172. - №1. -pp.,342-349.

58. Barnsley E.A. Phtalate pathway of phenanthrene metabolism: formation of 2'-carboxybenzolpiruvate // J.Bacteriol. 1983. - v. 154. - №1. - pp. 113117.

59. Benedik M.J., Strych U. Serratia marcescens and its extracellular nuclease //FEMS Microbiol Lett. 1998. - v.165. - №1. - pp.l-13

60. Berkmen M., Benedik M.J., Blasi U. The Serratia marcescens NucE protein functions as a holin in Escherichia coli// J Bacteriol. 1997. - v. 179. - №20. -pp.6522-6524

61. Biedermann K., Jepsen P.K., Riise E., Svendsen I. Purification and characterization of a Serratia marcescens nuclease produced by Escherichia colill Carlsberg Research Communications. 1989. - v.54. - №1. - pp. 1727

62. Birkeland N.K., Lindquist B.H. Coliphage P2 late control gene ogr. DNA sequence and product identification// Journal of Molecular Biology. 1986. -v.188.-№3.-pp.487-490

63. Braun V., Schmitz G. Excretion of a protease by Serratia marcescens!I Archives of Microbiology. 1980. - v.124. - №1. -pp.55-61

64. Bromke B.J., Hammel J.M. Regulation of extracellular protease formation by Serratia marcescensH Can. J. of Microbiology. 1979. - v.25. - №1. -pp.47-52

65. Brurberg M.B., Eijsink V.G., Haandrikman A.J., Venema G., Nes I.F. Chitinase B from Serratia marcescens BJL200 is exported to the periplasm without processing// Microbiology. v. 141. - pp. 123-131

66. Brurberg M.B., Eijsink V.G., Nes I.F. Characterization of a chitinase gene (chiA) from Serratia marcescens BJL200 and one-step purification of the gene product// FEMS Microbiol.Lett. 1994. - v. 124. - №3. - pp.399-404

67. Brurberg M.B., Nes I.F., Eijsink V.G. Comparative studies of chitinases A and B from Serratia marcescens //Microbiology. 1996. - v. 142. — pp.1581-1589

68. Chen Y.C., Shipley G.L., Ball T.K., Benedik MJ. Regulatory mutants and transcriptional control of the Serratia marcescens extracellular nuclease gene// Molecular Microbiology. 1992. - v.6. - №5. - pp.643-651

69. Chen Y.C., Suh Y., Riise E., Kartman B., Jin S., Benedik M.J. Inhibition of Serratia marcescens nuclease secretion by a truncated nuclease peptide// Gene. 1996.-v.172. -№l.-pp.9-16

70. Christie G.E. Haggard-Ljungquist E., Feiwell R., Calendar R. Regulation of bacteriophage P2 late-gene expression: the ogr gene// PNAS. 1986. - v.83. - №10. - pp.3238-3242

71. Ciesla Z., Mardarowicz K., Klopotowski T. Inhibition of DNA synthesis and cell division in Salmonella typhimurium by azide / Mol.Gen.Genet. -1974.-v. 135. №4.-pp. 339-348.

72. Cornelis G.R., Wolf-Watz H. The Yersinia Yop virulon: a bacterial system for subverting eukaryotic cells//MolMicrobiol. 1997. - v.23. - №5. -pp.861-867

73. Decedue C.J., Broussard E.A. 2d., Larson A.D., Braymer HD. Purification and characterization of the extracellular proteinase of Serratia marcescens!i&Qh. 1979. - v.569. - №2. - pp.293-301

74. Dibbens J.A., Egan J.B. Control of gene expression in the temperate coliphage 186. IX. B is the sole phage function needed to activate transcription of the phage late genes// Molecular Microbiology. 1992. -v.6. - №18. - pp.2629-2642

75. Driessen A.J. Bacterial protein translocation: kinetic and thermodynamic role of ATP and the proton motive force//Trends in Biochemical Sciences. -1992. v.17. - №6. - pp.219-223

76. Eaves G.N., Jeffries C.D. Effect of the pH on the formation of exocellular nuclease in aging broth cultures of Serratia marcescens// Journal of bacteriology. 1963. -V.85. -pp. 1194-1196.

77. Filimonova M.N., Krause K.L., Benedik M.J. Kinetic studies of the Serratia marcescens extracellular nuclease isoforms// Biochemistry & Molecular Biology International. 1994. - v.33. - №6. - pp. 1229-1236

78. Filloux A., Michel G., Bally M. GSP-dependent protein secretion in gramnegative bacteria: the Xcp system of Pseudomonas aeroginosall FEMS Microbiology Reviews. 1998. -v.22. - №3. Pp. 177-198

79. Franke I., Meiss G., Blecher D., Gimadutdinow O., Urbanke C., Pingoud A. Genetic engineering, production and characterisation of monomeric variants of the dimeric Serratia marcescens endonuclease// FEBS Letters. 1998. -v.425.№3.-pp.517-522

80. Franke I., Meiss G., Pingoud A. On the advantage of being a dimer, a case study using the dimeric Serratia nuclease and the monomeric nuclease from Anabaena sp. strain PCC 7120// Journal of Biological Chemistry. 1999. -v.274. - №2. - pp.825-832

81. Frazer M.J. and Low R.L. 1993, in Linn S.M., Lloyd R.S. and Roberts R.J. (ed.), Nucleases. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp.171-210

82. Friedhoff P., Franke I., Meiss G., Wende W., Krause K.L., Pingoud A. A similar active site for non-specific and specific endonucleases// Nature struct.biol. 1999. -v.6. - №2. - pp.112-113

83. Friedhoff P., Gimadutdinow O., Pingoud A. Identification of catalytically relevant amino acids of the extracellular Serratia marcescens endonuclease by alignment-guided mutagenesis// Nucleic Acids Research. 1994. - v.22. - №16. - pp.3280-3287

84. Friedhoff P., Kolmes B., Gimadutdinow O., Wende W., Krause K.L. Pingoud A. Analysis of the mechanism of the Serratia nuclease using sitedirected mutagenesis// Nucleic Acids Research. 1996. - v.24. - №14. -pp.2632-2639

85. Friedhoff P., Meiss G, Kolmes B., Pieper U., Gimadutdinow O, Urbanke C., Pingoud A. Kinetic analysis of the cleavage of natural and synthetic substrates by the Serratia nuclease// European Journal of Biochemistry.1996.-v.241. -№2.- pp.572-580

86. Givskov M, Eberl L, Molin S. Control of exoenzyme production, motility and cell differentiation in Serratia liquefaciens!7 FEMS Microbiol Lett.1997. v.148. - №2. -pp.l 15-122

87. Glick B.S, Beasley E.M, Schatz G. Protein sorting in mitochondria// Trends in Biochemical Sciences. 1992. - v.17. - №11. - pp.453-459

88. Goebel W, Hedgpeth J. Cloning and functional characterization of the plasmid-encoded hemolysin determinant of Escherichia colill JBacteriol. -1982. v.151. - №3. - 1290-1298

89. Grimont F, Grimont P.A. The genus Serratia. In: Starr M.P, Stolp H, Truper H.G, Schlegel H.G, eds. /The prokaryotes: A handbook on habitats, isolation and identification of bacteria. Berlin: Springer-Verlag. 1981. pp. 2822-2848.

90. Grimont P.A, Grimont F, De Rosnay H.L. Characterization of Serratia marcescens, S.liquefaciens, S.plymuthica, and S.mannorubra by electrophoresis of their proteinases// J.Gen.Microbiol. 1977. - v.99. -pp.301-310

91. Grimont P.A.D., Jackson T.A, Ageron E, Noonan M.J. Serratia entomophila sp-nov associated with amber disease in the New Zealand grassgrub Costelytra zealandica// International journal of systematic bacteriology. 1988. -v.38. - №1. -pp.l-6

92. Grimont PA., Grimont F, The genus Serratia.ll Annual Review of Microbiology. 1978. -v.32 -pp.221-248

93. Guynn L.J., Dai W.P., Benedik M.J. Nuclease overexpression mutants of Serratia marcescensll J Bacteriol. 1998. - v. 180 - №8. - pp.2262-2264

94. Hailing C., Sunshine M.G., Lane K.B., Six E.W., Calendar R. A mutation of the transactivation gene of satellite bacteriophage P4 that suppresses the rpoA109 mutation of Escherichia coli/l Journal of Bacteriology. 1990. - v.172. - №7. -pp.3541-3548

95. Hartl F.U., Lecker S., Schiebel E., Hendrick J.P., Wickner W. The binding cascade of SecB to SecA is SecY/E mediates preprotein targeting to the E. coli plasma membrane//Celi. 1990. - v.63. - №2. - pp.269-279

96. Heller K.B. Lipolytic activity copurified with the outer membrane of Serratia marcescensll Jbacteriol. 1979. - v. 140. -№3. - pp. 1120-1122

97. Hines D.A., Saurugger P.N., Ihler G.M., Benedik M.J. Genetic analysis of extracellular proteins of Serratia marcescensll JBacteriol. 1988 - v. 170. - №9. - pp.4141-4146

98. Holland I.B., Keimy B., Blight M. Haemolysin secretion from E colill Biochimie.- 1990.-v.72. -№2-3.-pp.l31-141

99. Jacob-Dubuisson F., Striker R., Hultgren S.J. Chaperone-assisted self-assembly of pili independent of cellular energy// Journal of Biological Chemistry. 1994. - v.269. - №17. - pp. 12447-12455

100. Jakes K.S., Model P. Mechanism of export of colicin El and colicin E3// J Bacteriol. 1979. - v. 138. - №3.-pp.770-778

101. Janda J.M., Abbott S.L. The Enterobacteria. Philadelphia, LippincottRaven, 1998, p.387

102. Jin S., Chen Y.C., Christie G.E., Benedik M.J. Regulation of the Serratia marcescens extracellular nuclease: Positive control by a homolog of P2 Ogr encoded by a cryptic prophage// Journal of Molecular Biology. 1996. -v.256.-№2.-pp.264-278

103. Katz M.E., Rice R.N., Cheetham B.F. Isolation and chracterization of an Aspergillus nidulans gene encoding an alkaline protease // Gene. 1994. -v. 150. - pp.287-292

104. Kim N. Kim S.I. Characterization and primary specificity of an extracellular metalloproteinase from Serratia marcescens!I Can.J. of Microbiology. 1994. - v.40. - №2. - pp. 102-126

105. Kolmes B., Franke I., Friedhoff P., Pingoud A. Analysis of the reaction mechanism of the non-specific endonuclease of Serratia marcescens using an artificial minimal substrate// FEBS Letters. 1996. - v.397. - №2-3. -pp.343-346

106. Kumamoto C.A. Molecular chaperones and protein translocation across the Escherichia coli inner membrane // MolMicrobiol. 1991. - v.5. - №1. -pp. 19-22

107. Lee CA. Type III secretion systems: machines to deliver bacterial proteins into eukaryotic cells?//Trends in Microbiology. 1997. - v.5. - №4. -pp.148-156

108. Letoffe S., Delepelaire P., Wandersman C. Protease secretion by Erwinia chrysanthemi: the specific secretion functions are analogous to those of

109. Escherichia coli alpha-haemolysin// EMBO J. 1990. - v.9. - №5. -pp.1375-1382

110. Letoffe S., Ghigo JM., Wandersman C. Iron acquisition from heme and hemoglobin by a Serratia marcescens extracellular protein/ZProceedings of the National Academy of Sciences of th United States of America.-1994.-v.91.- №21.-pp.9876-9880

111. Li X., Tetling S., Winkler U.K., Jaeger K.E., Benedik M.J. Gene cloning, sequence analysis, purification and secretion by Escherichia coli of an extracellular lipase from Serratia marcesceraV/Enviromental Microbiol. -i995. v.61. - №7 - pp.2674-2680

112. Liao T. Deoxythymidine 3', 5'-di-p-nitrophenyl phosphate as a synthetic substrate for bovine pancreatic deoxyribonuclease// Journal of Biological Chemistry. 1975. - v.250. - №10. - pp.3721-3724

113. Lill R., Cunningham K., Brundage L.A., Ito K., Oliver D., Wickner W. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli!I EMBO J. 1989. - v.8. - №3. -pp.961-966

114. Lory S. Determinants of extracellular protein secretion in gram-negative bacteriaII Jbacteriol. 1992. - v. 174. - №11. - pp.3423-3428

115. Lu H.M., Mizushima S., Lory S. A periplasmic intermediate in the extracellular secretion pathway of Pseudomonas aeruginosa exotoxin AII Journal of Bacteriology. 1993. - v. 175. - №22. - pp.7463-7467

116. Mackmam N., Holland I.B. Secretion of a 107 K dalton polypeptide into the medium from a haemolytic E. coli K12 strain// Mol.Gen.Genet. 1984. - v.193. - № 2. -pp.312-315

117. Manual "Benzon nuclease", Darmstadt, Merck, 1989, p.l

118. Meiss G., Friedhoff P., Hahn M., Gimadutdinow O., Pingoud A. Sequence preferences in cleavage of dsDNA and ssDNA by the extracellular Serratia marcescens endonuclease// Biochemistry. 1995. -v.34. - №37. - pp. 11979-11988

119. Meiss G., Gast F.U., Pingoud A.M. The DNA/RNA non-specific Serratia nuclease prefers double-stranded A-form nucleic acids as substrates// Journal of Molecular Biology. 1999. - v.288. - №3. - pp.377-390

120. Miller M.D., Cai J., Krause K.L. The active site of Serratia endonuclease contains a conserved magnesium-water cluster // Journal of Molecular Biology. 1999. - v.288. - №5. -pp.975-987

121. Miller M.D., Krause K.L. Identification of the Serratia endonuclease dimer: structural basis and implications for catalysis// Protein Science. -1996. v.5. - №1. -pp.24-33

122. Miller M.D., Tanner J., Alpaugh M., Benedik M.J., Krause K.L. 2.1 A structure of Serratia endonuclease suggests a mechanism for binding to double-stranded DNA// Nature Structural Biology. 1994. - v.l. - № 7. -pp.461-468

123. Mock M., Schwartz M. Mechanism of colicin B3 production in strains harboring wild-type or mutant plasmids// Jbacteriol. 1978. - v. 136. - №2. -pp.700-707

124. Monreal J., Reese E.T. The chitinase of Serratia marcescens!I Can J Microbiol. 1969. - v. 15. - №7. -pp.689-696

125. Nakahama K., Yoshimura K., Marumoto R., Kikuchi M., Lee I.S., Hase T., Matsubara H. Cloning and sequencing of Serratia protease gene// Nucleic Acid Research. 1986.-v.14. -№14.-pp.5843-5855

126. Nestle M. Roberts WK. An extracellular nuclease from Serratia marcescens. II. Specificity of the enzyme// Journal of Biological Chemistry. 1969. - v.244. - №19. - pp.5219-5225

127. Nestle M., Roberts W.K. An extracellular nuclease from Serratia marcescens. I. Purification and some properties of the enzyme //J.Biol.Chem. 1969. - v.244. -pp.5213-5218.

128. Neu H.C., Chou J. Release of surface enzymes in Enterobacteriaceae by osmotic shock. //J.Bacteriol. 1967. - v.94. -pp. 1934-1945.

129. Ohnishi Y., Horinouchi S. Extracellular production of a Serratia marcescens serine protease in Escherichia colill Bioscience, Biotechnology & Biochemistry. 1996.-v.60. -№10.-pp.1551-1556

130. Oliver D.B., Cabelli R.J., Dolan K.M., Jarosik G.P. Azide-resistant mutants of Escherichia coli after the SecA protein, an azide-sensitive component of protein export machinery //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -1990. v.87. - pp.8227-8231.

131. Parle C.H., Lopez J.C., Cook C.B. Acidometric agar plate method for ampicillin susceptibility testing of Haemophilus influenzae II Antimicrob.Agents Chemother. 1978. - v.13. - pp. 318-320.

132. Pedersen J., Andersen J, Roepstorff P, Filimonova M., Biedermann K. Characterization of natural and recombinant nuclease isoforms by electrospray mass-spectrometry// Biotechnol Appl Biochem. 1993. - v.18. -pp.389-399

133. Pedersen J., Filimonova M., Roepstorff P., Biedermann K. Characterization of Serratia marcescens nuclease isoforms by plasma desorption mass-spectrometry// Biochim Biophys Acta. 1993. - v. 1202. -№1.-pp.13-21

134. Pedersen J., Pedersen M., Soeberg H., Biedermann K. Separation of isoforms of Serratia marcescens nuclease by capillary electrophoresis//! Chromatogr. 1993. - v.645. - №2. - pp.353-361

135. Pugsley A.P. The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria// Microbiological Reviews. 1993. - v.57. - №1. - pp.50-108

136. Pugsley A.P. The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria// Microbiological Reviews. 1993. - v.57. - № 1. - pp.50-108

137. Pugsley A.P, d'Enfert C, Reyss I, Kornacker M.G. Genetics of extracellular protein secretion by gram-negative bacteria// Annual Review of Genetics. 1990. - v.24. -pp.67-90

138. Saito H, Elting L, Bodey G.P, Berkey P. Serratia bacteremia: review of 118 cases// Review of Infectious Diseases. 1989. - v. 11. -№ 6. - pp.912-920

139. Salamone P.R, Wodzinski RJ. Production, purification and characterization of a 50-kDa extracellular metalloprotease from Serratia marcescensH Applied Microbiol and Biotechnol. 1997. - v.48. - №3. -pp.317-324

140. Salmond G.P, Reeves P.J. Membrane traffic wardens and protein secretion in gram-negative bacteria// Trends in Biochemical Sciences. -1993. -v.18. -№l.-pp.7-12

141. Schaberg D.R, Culver D.H., Gaynes R.P. Major trends in the microbial etiology of nosocomial infection// American Journal of Medicine. 1991. -v.91 - pp.72-75

142. Sharp P.A., Sugden B, Sambrook J. Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophilus parainfluenzae using analitical agarose / Biochemistry. 1973. - v.12. -p.3055.

143. Song J.K., Kim M.K., Rhee J.S. Cloning and expression of the gene encoding phospholipase A1 from Serratia sp. MK1 in Escherichia coli II J. of Biotechnology. 1999. - v.72. - №1-2.-pp. 103-114

144. Strych U., Dai W.P., Benedik M.J. The NucE and NucD lysis proteins are not essential for secretion of the Serratia marcescens extracellular nuclease//Microbiology. 1999.- v.145. -pp.l209-1216

145. Suck D. DNA recognition by structure-selective nucleases// Biopolymers. 1997. - v.44. - №4. - pp.405-421

146. Suh Y., Benedik M.J. Secretion of nuclease across the outer membrane of Serratia marcescens and its energy requirements// Journal of Bacteriology. 1997. - v. 179. - №3. - pp.677-683

147. Suh Y., Jin Sh., Ball T.K., Benedik M.J. Two-step secretion of the Serratia marcescens extracellular nuclease // J. Bacteriol. 1996. - v. 178. -№13. - pp.3771-3778.

148. Suh Y.S., Alpaugh M., Krause K.L., Benedik M.J. Differential secretion of isoforms of Serratia marcescens extracellular nuclease// Applied and Environmental Microbiology. 1995. - v.61. - №11. -pp.4083-4088

149. Sun J., Inouye M., Inouye S. Association of a retroelement with a P4-like cryptic prophage (retronphage phi R73) integrated into the selenocystyl tRNA gene of Escherichia colill Journal of Bacteriology. 1991. - v. 173. -№13. -pp.4171-4181

150. Sunshine M.G., Sauer B. A bacterial mutation blocking P2 phage late gene expression// PNAS. 1975. - v.72. - №7. - pp.2770-2774

151. Suzuki K., Taiyoji M., Sugawara N., Nikaidou N., Henrissat B., Watanabe T. The third chitinase gene (chiC) of Serratia marcescens 2170 and the relationship of its product to other bacterial chitinases// Biochemical J. 1999. - v.343. - pp.587-596

152. Szwacka M., Ciesla Z., Klopotowski T. Azide-induced mutagenesis in gram-negative bacteria is recA- and lexA-independent /Mutat.Res. 1979. -v.62. - №2. - pp. 221-5.

153. Wandersman C Secretion across the bacterial outer-membrane//Trends in genetics. 1992. - v.8. - №9. - pp.317-322

154. Watanabe T., Kimura K., Sumiya T., Nikaidou N., Suzuki K., Suzuki M., Taiyoji M., Ferrer S., Regue M. Genetic analysis of the chitinase system of Serratia marcescens 2170// J Bacteriol. 1997. - v.179. - №22. - pp.7111-7117

155. Watanakunakorn C. Serratia bacteremia: a review of 44 episodes// Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 1989. - v.21. - №5. -pp.477-483

156. Weiss A.A., Johnson F.D., Burns D.L. Molecular characterization of an operon required for pertussis toxin secretion// PNAS. 1993. - v.90. - №7. -pp.2970-2974

157. Wickner W., Driessen A.J., Hartl F.U. The enzymology of protein translocation across the Escherichia coli plasma membrane// Annual Review of Biochemistry.- 1991.-v.60. pp. 101-124

158. Winkler U., Timmis K. Pleiotropic mutations in Serratia marcescens which increase the synthesis of certain exocellular proteins and the rate of spontaneous prophage exicision // Mol.Gen.Genet. 1973. - v. 124. -pp. 197-206.

159. Winkler U.K., Stuckmann M. Glycogen, hyaluronate, and some other polysaccharides greatly enhance the formation of exolipase by Serratia marcescensll JBacteriol. 1979. -v.138. - №3. -pp.663-70

160. Winslow R.H., Julien B., Calendar R., Christie G.E. An upstream sequence element required for NucC-dependent expression of the Serratia marcescens extracellular nuclease// J Bacteriol. 1998. - v. 180. - №22. -pp.6064-6067152

161. Wotf U., Bauer D., Traub W.H. Metalloproteases of Serratia liqueifaciens: degradation of purified human serum proteins// Zentralblatt fur Bacteriologie. 1991. -v.276. - №1. -pp 16-26

162. Woytowich A.E., Selvaraj G., Khachatourians G.G. Analysis of the chiB gene of Serratia liquefaciensH J Bacteriol. 2000. - v80. - №3. - pp.277-283

163. Yonemura K., Matsumoto K., Maeda H. Isolation and characterization of nucleases from a clinical isolate of Serratia marcescens kums 3958// Journal of Biochemistry. 1983. - v.93. - №5. -pp.l287-1295

164. Yu V.L. Serratia marcescens: historical perspective and clinical review// New England Journal of Medicine. 1979. - v.300. - №16. - pp.887-893