Влияние 2-(пара-аминобензолсульфамидо)-тиазола на рост культуры Serratia Marcescens W1050 и биосинтез эндонуклеазы в присутствии и в отсутствие пуринов

Шах Махмуд Раихан

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние 2-(пара-аминобензолсульфамидо)-тиазола на рост культуры Serratia Marcescens W1050 и биосинтез эндонуклеазы в присутствии и в отсутствие пуринов
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние 2-(пара-аминобензолсульфамидо)-тиазола на рост культуры Serratia Marcescens W1050 и биосинтез эндонуклеазы в присутствии и в отсутствие пуринов"

На правах рукописи i •

ШАХ МАХМУД Р АИХАН

ВЛИЯНИЕ 2-(ПАРА-АМИНОБЕНЗОЛСУЛЬФАМИДО)-ТИАЗОЛА НА РОСТ КУЛЬТУРЫ SERRATIA MARCESCENS W1050 И БИОСИНТЕЗ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ В ПРИСУТСТВИИ И В ОТСУТСТВИЕ ПУРИНОВ

03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 з НОЯ 2010

Казань-2010

004613017

Работа выполнена на кафедре микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета

Научный руководитель: доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник Филимонова Мария Николаевна

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук,

профессор

Госманов Рауис Госманович

кандидат биологических наук, доцент

Гимадутдинов Олег Александрович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Казанский государственный

медицинский университет», г. Казань

Защита диссертации состоится «25» ноября 2010 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание, ауд. 211.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Н. И. Лобачевского при Казанском (Приволжском) федеральном университете.

Автореферат разослан «15» октября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Абрамова 3. И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эндонуклеаза грамотрицательных бактерий Serratia marcescens (Sma nuc, КФ 3.1.4.9) является одной из наиболее изученных бактериальных нуклеаз. Определены многие физико-химические и биохимические свойства этого фермента, выделены и охарактеризованы молекулярные формы, установлены структура и механизм действия [Филимонова с соавт., 1991; Miller et al., 1994; Педерсен с соавт, 1995; Филимонова с соавт., 1996; Friedhoff et al., 1996; Филимонова с соавт., 1997; Benedik and Strych, 1998; Филимонова, 2003; Романова с соавт., 2008].

Эндонуклеазу применяют на практике: в молекулярно-биологических исследованиях в качестве биохимического реактива, в пчеловодстве в качестве противовирусного средства и стимулятора развития пчелиных семей. Есть данные, свидетельствующие о целесообразности ее использования в животноводстве и растениеводстве в качестве противовирусного препарата [Аликин с соавт., 1998; Филимонова с соавт., 1999; Krause and Miller, 2001, Трифонова с соавт., 2002], а также антибактериального препарата широкого спектра действия [Патент РФ №2337139]. Известны ее противоопухолевые свойства [Габдуллина, 1980].

пуриновых нуклеотидов репликация ДНК также должна быть замедлена, появилось предположение о том, что присутствие в среде такого ингибитора должно привести к увеличению биосинтеза эндонуклеазы. Одновременно возникло предположение, что обогащение среды экзогенными пуринами должно положительно сказаться на росте культуры, и, как следствие этого, на биосинтезе эндонуклеазы. В пользу этого предположения свидетельствовало сформировавшееся мнение о том, что физиологическая роль эндонуклеазы состоит в обеспечении клеток питанием [Беляева с соавт., 1976], и сведения о предпочтении эндонуклеазы к гидролизу фосфодиэфирных связей, обогащенных гуанином [Филимонова с соавт., 1996; Ме1зз е? а!., 1995].

Целью настоящего исследования стал анализ биосинтеза эндонуклеазы и роста культуры 5. тагсезсет в присутствии экзогенных пуринов и ингибитора биосинтеза фолиевой кислоты 2-(иара-аминобензолсульфамидо)-тиазола, вызывающего ингибирование биосинтеза пуриновых нуклеотидов.

В работе решались следующие задачи:

1. Провести оптимизацию метода получения периплазматической фракции.

2. Провести сравнительный анализ роста культуры и биосинтеза эндонуклеазы в отсутствие и в присутствии пуринов: аденина, аденозина, гуанина, гуанозина, инозина.

3. Определить влияние 2-(пара-аминобензолсульфамидо)-тиазола на рост культуры и биосинтез эндонуклеазы.

4. Исследовать рост культуры и биосинтез эндонуклеазы при одновременном присутствии в среде пуринов и 2-(пара-аминобензолсульфамидо)-тиазола.

Положения, выносимые на защиту:

1. В присутствии 2-(иора-аминобензолсульфамидо)-,шазола происходит подавление роста культуры 5. тагсейсет и увеличение биосинтеза эндонуклеазы и продуктивности культуры по эндонуклеазе.

2. Обогащение полноценной синтетической среды одним из пуринов: аденином, аденозином, гуанином, гуанозином или инозином, - не влияет на рост культуры тагсеьсет, биосинтез эндонуклеазы и продуктивность культуры по эндонуклеазе.

3. Обогащение полноценной синтетической среды одним из пуринов: гуанином, гуанозином или инозином, - в присутствии 2-{пара-аминобензолсульфамидо)-тиазола не влияет на рост культуры S. marcescens и оказывает влияние на биосинтез эндонуклеазы и продуктивность культуры по эндонуклеазе.

Научная новизна работы. Впервые исследовано влияние пуринов: аденина, аденозина, гуанина, гуанозина или инозина, - на рост культуры и биосинтез эндонуклеазы S. marcescens в присутствии и в отсутствие ингибитора биосинтеза фолиевой кислоты - 2-(пяра-аминобензолсульфамидо)-тиазола, вызывающего ингибирование биосинтеза пуриновых нуклеотидов de novo, и показано, что присутствие в среде 2-(ияра-аминобензолсульфамидо)-тиазола ведет к увеличению биосинтеза эндонуклеазы и продуктивности культуры по эндонуклеазе, а также к качественному и количественному изменению динамики роста культуры и накопления эндонуклеазы в среде и периплазме.

Установлено, что обогащение полноценной синтетической среды одним из пуринов: аденином, аденозином, гуанином, гуанозином или инозином, - не влияет на рост культуры, биосинтез эндонуклеазы и продуктивность культуры по эндонуклеазе и ведет к увеличению доли внеклеточной фракции эндонуклеазы. Напротив, присутствие в среде вместе с 2-{пара-аминобензолсульфамидо)-тиазолом одного из экзогенных пуринов: гуанина, гуанозина или инозина, - приводит к репрессии клеточного ответа на ингибирование биосинтеза пуриновых нуклеотидов de novo, возникающего в их отсутствие.

Обоснована возможность участия эндонуклеазы в пуриновом обмене бактерий S. marcescens и наличия у них пути биосинтеза пуриновых нуклеотидов с реутилизацией пуринов, альтернативного общеизвестному пути биосинтеза нуклеотидов de novo.

Практическая ценность работы. Обоснованием практической значимости работы служит оптимизация метода получения периплазматической фракции бактерий S. marcescens, который может быть использован при изучении периплазматических белков S. marcescens, а также определение условий культивирования, приводящих к росту продуктивности

культуры по эндонукяеазе или увеличению доли внеклеточной фракции эндонуклеазы в синтезированном ферменте, что увеличивает выход эндонуклеазы при ее получении.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на Первой межуниверситетской конференции по современной биологии «Bionews» (Kazan, 2008); XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009); XIV Международной конференции, посвященной 20-летию партнерства между Казанским государственным университетом им. В.И. Ульянова-Ленина и Гиссенским университетом им. Ю. Либиха «Microbial enzymes in biotechnology and medicine» (Kazan, 2009); 13-ом ежегодном симпозиуме студентов биологов Европы «SymBioSE 2009» «Biology: Expansion of Borders» (Kazan, 2009); a также на итоговых конференциях Казанского государственного университета «Молекулярно-генетические, клеточные и популяционные основы функционирования живых систем» (Казань, 2009,2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 2 статьи в журнале, поименованном в списке ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 134 источника, из них 98 зарубежных. Работа изложена на 100 страницах машинописного текста, содержит 1 таблицу и 34 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили бактерии S. marcescens W1050, любезно предоставленные профессором университета г. Хьюстона (США) М. Бенедиком.

При исследовании роста культуры и биосинтеза эндонуклеазы использовали среду, включающую (г/л): NaCl - 4.7, NH4CI - 1.1, Na2S04 - 0.4, MgCl2 - 0.95, К2НРО4ХЗН2О - 2.8, глюкозу - 5, гидролизат казеина - 1 и дрожжевой экстракт - 3, которую засевали до оптической плотности 0.16-0.2 ед./мл. Культуру выращивали 36 ч при 37°С с принудительной аэрацией на

вибростенде (200 об./мин) в инкубационном шкафу BS4 («В.BRAUN«, Германия). На протяжении всего наблюдения через каждые 1-3 ч контролировали изменение оптической плотности культуры, выделяли биомассу и получали периплазматическую фракцию, определяли ферментативную активность в среде и в периплазме.

При исследовании влияния 2-(/за/ш-ампнобензолсульфамидо)-тиазола (2-ПАБСТ) и (или) пуринов: аденина, аденозина, гуанина, гуанозина или инозина, - их добавляли в питательную среду перед внесением посевного материала до конечной концентрации, соответственно, 0.01% и 0.0005%.

Периплазматическую фракцию получали, взяв за основу и оптимизировав ранее разработанный Герхардом [Gerhardt et al., 1994] метод получения сферопластов.

Нуклеазную активность определяли методом кислоторастворимых фракций в соответствии с рекомендациями [Nestle and Roberts, 1969; Лещинская с соавт., 1974]. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое вызывало увеличение А26о в 1 мл раствора на 1 оптическую единицу за 1 ч инкубации при 37°С (Ед./мл).

Биосинтез эндонуклеазы оценивали, суммируя величины нуклеазной активности, определенные в среде и периплазме.

Продуктивность культуры рассчитывали как отношение ферментативной активности к содержанию биомассы, выраженной в единицах оптической плотности культуры.

Активность ß-галактозидазы определяли стандартным методом [Миллер, 1976]. За единицу активности принимали количество фермента, которое вызывало увеличение оптической плотности на 1 оптическую единицу при 420 нм в пересчете на 1 мл ферментного раствора за 1 ч инкубации.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью подпрограммы статистического анализа графической программы «Sigma plot 8.0» и программы «Microsoft Excel».

Проводили выбраковку данных для доверительного интервала 95%, Достоверность разницы оценивали с помощью критерия Стьюдента, используя

значения среднего арифметического и стандартной ошибки, полученные после выбраковки.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Сложность и многоэтапность процессов биосинтеза и секреции эндонуклеазы послужили основной причиной отработки подходов, без которых корректный анализ биосинтеза в рамках поставленной цели не представлялся возможным. В результате был оптимизирован метод получения периплазматической фракции и исследован биосинтез р-галаетозидазы -маркера периплазмы бактерий 5. тагсеясет. Оптимизированный метод, отличающийся от исходного изменением времени и температуры инкубации клеточной суспензии с лизирующей смесью, состав которой также был модифицирован: в 3 раза увеличена концентрация сахарозы и в 2.5-5 раз -лизоцима, - улучшал эффективность разделения периплазматической фракции и сферопластов по сравнению с исходным методом. Об этом свидетельствовало ярко выраженное преобладание сферопластов над бактериальными клетками в полученных препаратах и многократное различие периплазматической фракции и среды по Р-галактозидазной активности на протяжении всего срока наблюдения.

б)

в)

4 и

. 3,5-

£ 3-1 = 2,5

1 2

1 1.55 1 '

< 0,5 О

0 6 12 18 24 30 36 Время, час

1 6 12 18 24 30 ЗВ Время, час

1 I I"

1 6 12 18 24 30 36

Время, час

Рисунок 1. Динамика роста культуры (а) и активности Р-галаюгозидазы в среде (б) или в периплазме (в).

Как видно из рисунка 1а, кривая роста культуры имела стандартный вид. Адаптационная фаза была непродолжительной, экспоненциальная, при которой оптическая плотность культуры приближалась к 5 оп.ед./мл, длилась 5 ч. Затем следовала фаза замедления роста (3 ч), плавно переходящая в стационарную фазу, и после этого в фазу отмирания. С замедлением роста культуры наблюдали многократное увеличение уровня нуклеазной активности (рис. 2а), как в среде, так и в периплазме, с пиком, приходящимся на начало стационарного роста (15 ч). После этого уровень нуклеазной активности вне- и внутри бактериальной клетки постепенно понижался почти до исходных величин. На протяжении всего срока наблюдения нуклеазная активность в периплазме была в 5-10 раз выше, чем в окружающей среде. Аналогичным было распределение между клеточными компартментами Р-галактозидазы (рис. 16). При этом Р-галактозидазная активность в периплазме была в 100-200 раз выше, чем в среде на протяжении всего срока наблюдения.

1. Рост культуры в биосинтез эндонуклеазы в присутствии пуринов.

Поскольку ранее было показано [Богомольная, 2000], что присутствие в среде нуклеотидов (ГМФ или УМФ) незначительно изменяло биосинтез эндонуклеазы, а ГМФ стимулировал рост культуры, для достижения поставленной цели в исследовании использовали пурины в виде нукпеозидов и азотистых оснований. Установлено, что добавление в среду одного из пуринов: аденина, аденозина, гуанина, гуанозина, инозина, - не влияло на рост культуры и оказывало влияние на динамику накопления эндонуклеазы в среде и в периплазме (рис. 2). Кривые роста в присутствии и в отсутствие пуринов были идентичны.

Уровень активности в среде в присутствии пуринов был в 1.5-2 раза выше, чем в отсутствие пуринов во время стационарного роста культуры. Кроме этого наивысшая активность в среде наблюдалась с 15 по 21 ч роста культуры в присутствии пуринов, и лишь на 15 ч роста в их отсутствие. В периплазме, напротив, в период ранней и средней стационарной фазы активность в присутствии пуринов была в 1.5-2 раза ниже, чем в их отсутствие, а в фазе

5 10 15 20 25 30 35 40 Время, час

Рисунок % Активность эндонуклеазы в среде (-•- (КЖ)) и в периплазме (-ш- (ПП)) в отсутствие (а) и присутствии аденина (б), аденозина (в), гуанина (г), гуанозина (д), инозина (е).

замедления роста (6 ч), наоборот, в 1.6 раза выше. Принципиальных различий между кривыми динамики накопления эндонуклеазы в среде, а также в периплазме, обусловленных типом

пурина, обнаружено не было. Также не было выявлено принципиальных различий между динамикой биосинтеза эндонуклеазы в целом в отсутствие или в присутствии пуринов, независимо от типа пурина (рис. 3). Аналогичной была картина динамики продуктивности культуры по эндонуклеазе (рис. 4). Для более точной количественной оценки полученные значения были, соответственно,

просуммированы и показано отсутствие достоверной разницы между

соответствующими суммами в отсутствие и в присутствии пуринов (рис. 5). Таким образом, добавление к среде пуринов не влияло на рост культуры, количество

Время, час Время, чао

Рисунок 3. Динамика биосинтеза Рисунок 4. Динамика

эндонуклеазы в отсутствие (а) и в продуктивности культуры по присутствии аденина (б), аденозина (в), эндонукдеазе в отсутствие (а) и в гуанина (г), гуанозина (д), инозина (е). присутствии аденина (б), аденозина (в),

гуанина (г), гуанозина (д), инозина (е).

4 ■

к Ы

| 2

К 1

а)

2 3 Вариант

1,4 -| 1,2

1 -

^ 0,8 х

В 0,6 и

о в

5 0,4 А

£ 0,2 А

8. 0 В

б)

2 3 Вариант

Рисунок 5. Сумма значений биосинтеза эндонуклеазы (а) и продуктивности культуры по эндонуклеазе (б) при росте в отсутствие (К - контроль) и в присутствии аденина (1), аденозина (2), гуанина (3), гуанозина (4), инозина (5).

синтезированной эндонуклеазы и продуктивность культуры и отражалось лишь на соотношении фракций эндонуклеазы, локализованных в среде и в периплазме.

Увеличение содержания в среде пурина в 20 раз не оказывало существенного влияния на полученные результаты, что было продемонстрировано на примере гуанина.

2. Влияние 2-(иара-амииобензолсульфамидо)-тиазола на рост культуры и биосинтез эндонуклеазы

Предварительная оценка содержания в среде 2-ПАБСТ показала, что в период со 2-го по 4-й ч роста культуры его содержание скачкообразно снижается примерно на 20% и затем сохраняется на одном уровне до конца наблюдения.

Добавление в среду 2-ПАБСТ приводило к подавлению роста культуры, что проявлялось снижением оптической плотности (рис. 6) и служило косвенным доказательством ингибирования биосинтеза пуринов de novo, которое, очевидно, приводило к недостатку пуринов внутри клетки. Под действием 2-ПАБСТ продолжительность адаптационной и экспоненциальной

фаз возрастала в 2-3 раза, а срока, достижения наибольшей оптической плотности культуры - почти в 2.5 раза. Кривая роста ступенчатым видом напоминала кривую роста синхронной культуры. Одновременно наблюдались изменения в динамике накопления эндонуклеазы в среде и в периплазме.

Рисунок 6. Динамика роста (-Д-, (ОП590)) и активности эндонуклеазы в среде (-0-, (ЮК)) или в периплазме (-□-, (ПП)).

На кривой накопления эндонуклеазы в среде появлялся дополнительный пик активности с максимумом на З-б ч роста культуры. Следующий пик активности, который наблюдали в среде на 18-24 ч, почти в 2.5 раза превосходил по величине первый и примерно во столько же раз был меньше аналогичного пика на кривой накопления эндонуклеазы в отсутствие 2-ПАБСТ, возникающего на 15 ч роста культуры (рис. 2а). Кроме этого в присутствии 2-ПАБСТ сохранялся высокий уровень нуклеазной активности в среде и на позднем этапе роста культуры. В периплазме уровень эндонуклеазы в присутствии в среде 2-ПАБСТ многократно увеличивался при переходе культуры к стационарному росту и достигал наибольшей величины - почти в 2 раза выше активности пиковой фракции (15 ч) в отсутствие 2-ПАБСТ (рис. 2а) -на 36 ч роста культуры.

Аналогичной была тенденция изменений в динамике накопления р-галактозидазы (в периплазме и в среде). При этом, на протяжении всего срока наблюдения уровень (3-галактозидазной активности в периплазме был много

ю С О

4.0 1 з,о

3,5 сп о 2,5

3,0 X

2,5 § 2,0

2,0 ц 1,5

1,5 2 =г 1,0

1,0 о

0,5 < 0,5

0 0

15 20 25 30 Время, час

12 г— x

10 с

8 с

6 е

4 ег ш

2 <

выше, чем в среде, что свидетельствовало о сохранении интактностной клеточной оболочки при выделении биомассы в ходе эксперимента.

Сравнительный анализ динамики биосинтеза (рис. 7а) показал, что в присутствии 2-ПАБСТ биосинтез эндонуклеазы многократно возрастал в период стационарного роста культуры (27-36 ч). По сумме значений биосинтез эндонуклеазы в присутствии 2-ПАБСТ был выше, чем в его отсутствие примерно в 1.5 раза (рис. 76). Продуктивность культуры по эндонуклеазе

ч *

в -л

5 -

4 -

3 -

2 -1 О

а)

»н

О 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36

Время, час

6,0 5,0 4,03,02,0 1,0 -0,0

б)

Без С

2-ПАБСТ 2-ПАБСТ

Рисунок 7. Динамика (а) и сумма значений биосинтеза (О) эндонуклеазы в отсутствие {Щ) и в присутствии 2-ПАБСТ <у.\).

О б"]

Й о ж а

4 Н 3 2 1 О

а)

.¿¡■Рьй. Щ

О 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36

Время,час

о й-

30 25 20 1510 -5 0

б)

Без С

2-ПАКСТ 2-ПАБСТ

Рисунок 8. Динамика (а) и сумма значений продуктивности культуры по эндонуклеазе (б) в отсутствие (щ) и в присутствии 2-ПАБСТ ([:■()•

(рис. 8а) многократно возрастали на 3 ч роста, что совпадало с первым пиком на кривой накопления эндонуклеазы в среде, и на 21-36 ч - период стационара. По сумме значений продуктивность культуры под действием 2-ПАБСТ возрастала примерно в 2.5 раза (рис. 86).

Таким образом, показано, что иншбирование биосинтеза пуринов de novo приводило к усилению биосинтеза эндонуклеазы и росту продуктивности культуры по эндонуклеазе, что, вероятно, служит механизмом компенсации недостатка внутриклеточных пуринов, возникающего под действием 2-ПАБСТ, экзогенными пуринами, образующимися при гидролизе нуклеиновых кислот.

В пользу этого предположения свидетельствовали результаты, полученные при анализе биосинтеза эндонуклеазы в присутствии 2-ПАБСТ и экзогенных пуринов.

3. Влияние пуринов на рост культуры и биосинтез эндонуклеазы в присутствии 2-(иара-аминобензолсульфамидо)-тиазола

Присутствие в среде пуринов: аденина, аденозина, гуанина, гуанозина, инозина, - не влияло на рост культуры, который был подавлен под действием 2-ПАБСТ, увеличивало уровень нуклеазной активности в среде (рис. 9, 6) и, наоборот, понижало его в периплазме. Одновременно наблюдались различия в кривых накопления эндонуклеазы в среде - наиболее выраженные в присутствии аденозина (рис. 96) и в периплазме - под действием 1уанина, гуанозина или инозина (рис. 9в-д). Количественные изменения в динамике биосинтеза и продуктивности культуры по эндонуклеазе были наиболее ярко выражены в присутствии гуанина или гуанозина (рис. 10, 11). Сумма значений биосинтеза фермента, а также продуктивности культуры по эндонуклеазе в присутствии в среде гуанина или гуанозина или инозина была почти в 2 раза меньше, чем в его отсутствие (рис. 12). Увеличение содержания пурина в 20 раз не влияло на полученные результаты, что продемонстрировано на примере гуанина. Таким образом, присутствие в среде вместе с 2-ПАБСТ одного из пуринов: гуанина, гуанозина или инозина, - подавляло предполагаемый ответ клетки на ингибирование биосинтеза пуршювых нуклеотидов de novo, который в их отсутствие проявлялся увеличенным биосинтезом эндонуклеазы и возросшей продуктивностью культуры по эндонуклеазе.

5 10 15 20 25 30 35 Время, час

Рисунок 9. Активность эндонуклеазы в среде (-(КЖ)) и в периплазме (-ш- (ПП)) после добавления аденина (а), аденозина (б), гуанина (в), гуанозина (г), инозина (д).

В отсутствие 2-ПАБСТ наличие в среде экзогенных пуринов независимо от их типа и количества не приводит ни к индукции, ни к репрессии биосинтеза эндонуклеазы. Установленный факт, очевидно, не

противоречит результатам, полученным в

присутствии в среде пуринов вместе с 2-ПАБСТ, а лишь свидетельствует о том, что при росте на полноценной синтетической среде бактерии S. marcescem, аналогично Я. pylori [Mendz et al., 1997], предпочитают использованию готовых пуринов, локализованных в питательной среде, биосинтез пуриновых нуклеотидов de novo.

Время,чае

Рисунок 10. Динамика биосинтеза эндонуклеазы в отсутствие (а) и в присутствии аденина (б), аденозина (в), гуанина (г), гуанозина (д), инозина (е).

О 3 6 9 12 15 1В 21 24 27 30 33 36 Время, чао

Рисунок 11. Динамика продуктивности культуры по эндонуклеазе в отсутствие (а) и в присутствии аденина (б), аденозина (в), гуанина (г), гуанозина (д), инозина (е).

Рисунок 12. Сумма значений биосинтеза эндонуклеазы (а) и продуктивности культуры по эндонуклеазе (б) при росте в отсутствие (К - контроль) и в присутствии аденина* (1), аденозина* (2), гуанина (3), гуанозина (4), инозина (5). * Разница с контролем недостоверна.

Хотя прямых доказательств проникновения пуринов из среды в клетки S. marcescens нет, в пользу этого свидетельствует изменение биосинтеза эндонуклеазы и продуктивности культуры по эндонуклеазе под действием гуанина, гуанозина или инозина в условиях ингибирования биосинтеза пуринов. Биосинтез нуклеотидов из готовых предшественников: азотистых оснований, нуклеозидов и прочие, - образующихся внутри клетки или вне ее при катаболических реакциях, - это известный путь для ряда организмов [Zalkin and Nygaard, 1996; Becerra and Lazcano, 1998; Xi et al., 2000; Cui et al., 2001; Tozzi et al., 2006]. Этот путь - альтернативный пути биосинтеза пуриновых нуклеотидов de novo - включает реакции реутилизации пуринов. Хотя настоящее время нет сведений, подтверждающих или опровергающих наличие такого пути в метаболизме S. marcescens, известно, что в клетках этих бактерий встречается ключевой фермент пути биосинтеза пуриновых нуклеотидов из готовых предшественников - пурин нуклеозид фосфорилаза [Choi, 1998]. В связи с этим и на основании полученных результатов в диссертационной работе делается заключение о том, что бактерии S. marcescens

способны синтезировать пуриновые нуклеотиды из готовых, предшественников, а эндонукяеаза - одна из самых мощных в настоящее время дезоксирибонуклеат (рибонуклеат) — 5'-пуклеотидогидролаз является активным участником этого процесса.

ВЫВОДЫ

1. Оптимизация метода получения периплазматической фракции, включающего 30 мин инкубацию клеточной суспензии при комнатной температуре в 30 мМ Трис-HCl буфере, pH 8.0, в присутствии 20% сахарозы, 0.7% фенилметилсульфонилфторида, 10 мМ К-ЭДТА и 0.05% лизоцима, которая заключалась в увеличении времени инкубации в 4 раза, температуры до 37°С, концентрации сахарозы в 3 раза и лизоцима в 2.5-5 раз, повышала эффективность и избирательность нарушения целостности наружной мембраны и клеточной стенки.

2. Обогащение полноценной синтетической среды одним из пуринов: аденином, аденозином, гуанином, гуанозином или инозином, - не влияет на рост культуры Serratia marcescens, биосинтез эндонуклеазы и продуктивность бактерий по эндонуклеазе и ведет к увеличению доли внеклеточной фракции эндонуклеазы.

3. Установлено, что добавление в питательную среду 0.1% 2-{пара-аминобензолсульфамидо)-тиазола, ведущее к ингибированию биосинтеза фолиевой кислоты, а следовательно, и к ингибированию синтеза пуриновых нуклеотидов, приводит к увеличению биосинтеза эндонуклеазы и продуктивности культуры по эндонуклеазе, сопряженных с качественным и количественным изменением динамики роста культуры и накопления эндонуклеазы в среде и периплазме, а также с увеличением доли периплазменной фракции фермента во время стационарного роста.

4. Присутствие в среде вместе с 2-(иа/ю-аминобензолсульфамидо)-тиазола одного из пуринов: гуанина, гуанозина или инозина, - приводит к репрессии

клеточного ответа на ингибирование биосинтеза пуриновых нуклеотидов de novo, возникающего в их отсутствие.

5. В условиях ингибирования биосинтеза фолиевой кислоты, а следовательно, и ингибирования биосинтеза пуриновых нуклеотидов de novo, бактерии 5. marcescens синтезируют пуриновые нуклеотиды с помощью биохимических реакций пути реутилизации экзогенных гуанина, гуанозина или инозина, в образовании которых принимает непосредственное участие бактериальная эндонуклеаза.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шах Махмуд, Р. О получении цитоплазматической фракции бактерий Serratia marcescens / Р. Шах Махмуд, М. Н. Филимонова // Ученые записки Казанского государственного университета. Серия Естественные науки. - 2010. -Т. 152, кн. 1.-С. 121-126.

2. Шах Махмуд, Р. Биосинтез эндонуклеазы Serratia marcescens в присутствии пуринов и ингибитора их биосинтеза / Р. Шах Махмуд, М. Н. Филимонова // Ученые записки Казанского государственного университета. Серия Естественные науки. - 2010. -Т. 152, кн. 2. - С. 166-171.

3. Шах Махмуд, Р. Влияние пуриновых нуклеозидов на рост и биосинтез эндонуклеазы Serratia marcescens в условиях ингибирования биосинтеза пуринов / Р. Шах Махмуд, М. Н. Филимонова // III Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010»: сб. тезисов. - Нижний Новогород, 2010. - С. 83.

4. Шах Махмуд, Р. Действие экзогенных пуринов на биосинтез и продукцию эндонуклеазы Serratia marcescens в присутствии 2 -{пара-аминобензолсульфамидо)-тиазола / Р. Шах Махмуд, М. Н. Филимонова // 14-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «биология -наука XXI века»: сб. тезисов. - Пущино, 2010. - Т. 2. - С. 274.

5. Шах Махмуд, Р. Изменение активности эндонуклеазы Serratia marcescens и ее биосинтез в субоптимальных условиях / Р. Шах Махмуд., Г. М. Галиева, JI.

Ш. Нигматуллина// Научно-практическая конференция «Становление и достижения биохимической школы казанского университета», посвященная памяти проф. В.Г. Винтера: сб. материалов. - Казань, 2009. - С. 140-141.

6. Shah Mahmud, R. Effect of adenine on growth of bacteria and biosynthesis and secretion of Serratia marcescens nuclease in the presence of purine inhibitor / R. Shah Mahmud, M. N. Filimonova I I Abstracts of the 13 th annual Symposium for Bioiogy Students of Europe «SymBioSE 2009» «Biology: Expansion of Borders».-Kazan, 2009.-P. 66.

7. Shah Mahmud, R. Probability of purine salvage pathway in bacteria Serratia marcescens / R. Shah Mahmud, M. N. Filimonova // Abstracts of the XIV International Conference Devoted to the 20th Anniversary of partnership between Kazan State University and Justus-Liebig Giessen university «Microbial en2ymes in biotechnology and medicine».- Kazan, 2009.- P. 60-61.

8. Шах Махмуд, P. Рост и биосинтез эндонуклеазы Serratia marcescens в условиях ингибирования биосинтеза пуринов / Р. Шах Махмуд // XVI Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов»: тезисы докладов - Москва, 2009. - С. 178.

9. Shah Mahmud, R. Effect of 2-para-aminobenzolsulfamidothyazole on biosynthesis and secretion of Serratia marcescens nuclease / R. Shah Mahmud, M. N. Filimonova // Building the Future in Biology "Bionews": Proceedings of the First Interuniversity Conference on Modem Biology. - Kazan, 2008. - P. 30.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207

Тел: 272-74-59, 541-76-41, 541-76-51. Лицензия ПДМ7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 08.10.2010 г. Печ.л.1 £ Заказ № К-6946. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шах Махмуд Раихан

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Бактерии Serratia marcescens.

1.1.1. Краткая характеристика бактерий.

1.1.2. Эндонуклеаза Serratia marcescens.

1.2. Сульфаниламидные препараты.

1.2.1. Краткая характеристика.

1.2.2. Действие на Serratia marcescens.

1.2.3. Транспорт в клетку.

1.2.4. Механизм действия.

1.3. Биосинтез пуриновых нуклеотидов в клетках про- и эукариот.

1.3.1. Биосинтез de novo.

1.3.2. Синтез с реутилизацией пуринов.

1.3.3. Ферменты пути реутилизации пуринов у Serratia marcescens.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние 2-(пара-аминобензолсульфамидо)-тиазола на рост культуры Serratia Marcescens W1050 и биосинтез эндонуклеазы в присутствии и в отсутствие пуринов"

Актуальность проблемы. Эндонуклеаза грамотрицательных бактерий Serratia marcescens (Sma nue, КФ 3.1.4.9) является одной из наиболее изученных бактериальных нуклеаз. Определены многие физико-химические и биохимические свойства этого фермента, выделены и охарактеризованы молекулярные формы, установлены структура и механизм действия [Филимонова с соавт., 1991; Miller et al., 1994; Педерсен с соавт, 1995а; Филимонова с соавт., 1996; Friedhoff et al., 1996; Филимонова с соавт., 1997; Benedik and Strych, 1998; Филимонова, 2003; Романова с соавт., 2008].

Несмотря на большие успехи, достигнутые в исследовании данного фермента, изучение закономерностей его биосинтеза не утратило своей актуальности, так как получение коммерческого продукта должно быть экономически оправданным, уровень его биосинтеза должен быть высоким. Существуют различные подходы к увеличению биосинтеза. Классические подходы включают оптимизацию состава питательной среды и условий выращивания культуры. Возможно использование агентов, на которые бактерии отвечают повышением биосинтеза. В частности известно, что биосинтез эндонуклеазы увеличивается при SOS-ответе клеток на повреждение ДНК или блокирование ее репликации [Юсупова с соавт., 1991, Ball et al., 1990]. Есть данные, что биосинтез эндонуклеазы изменяется под действием ингибитора биосинтеза фолиевой кислоты, вызывающего подавление роста культуры и биосинтеза пуриновых нуклеотидов [Старшинова и Филимонова, 2005]. Так как в условиях ингибирования биосинтеза пуриновых нуклеотидов репликация ДНК также должна быть замедлена, появилось предположение о том, что присутствие в среде такого ингибитора должно привести к увеличению биосинтеза эндонуклеазы. Одновременно возникло предположение, что обогащение среды экзогенными пуринами должно положительно сказаться на росте культуры, и, как следствие этого, на биосинтезе эндонуклеазы. В пользу этого предположения свидетельствовало сформировавшееся мнение о том, что физиологическая роль эндонуклеазы состоит в обеспечении клеток питанием [Беляева с соавт., 1976], и сведения о предпочтении эндонуклеазы к гидролизу фосфодиэфирных связей, обогащенных гуанином [Филимонова с соавт., 1996; Meiss étal., 1995].

Таким образом, целью настоящего исследования стал анализ биосинтеза эндонуклеазы и роста культуры S. marcescens в присутствии экзогенных пуринов и ингибитора биосинтеза фолиевой кислоты 2-(пара-аминобензолсульфамидо)-тиазола, вызывающего ингибирование биосинтеза пуриновых нуклеотидов.

В связи с поставленной целью решали следующие задачи:

1. Провести оптимизацию метода получения периплазматической фракции.

3. Определить влияние 2-(/?я/?а-аминобензолсульфамидо)-тиазола на рост культуры и биосинтез эндонуклеазы.

4. Исследовать рост культуры и биосинтез эндонуклеазы при одновременном присутствии в среде пуринов и 2-{пара-аминобензолсульфамидо)-тиазола.

Положения, выносимые на защиту:

1. В присутствии 2-(иа/?а-аминобензолсульфамидо)-тиазола происходит подавление роста культуры S. marcescens и увеличение биосинтеза эндонуклеазы и продуктивности культуры по эндонуклеазе.

2. Обогащение полноценной синтетической среды одним из пуринов: аденином, аденозином, гуанином, гуанозином или инозином, - не влияет на рост культуры S. marcescens, биосинтез эндонуклеазы и продуктивность культуры по эндонуклеазе.

Научная новизна. Впервые исследовано влияние пуринов: аденина, аденозина, гуанина, гуанозина или инозина, - на рост культуры и биосинтез эндонуклеазы S. marcescens в присутствии и в отсутствие ингибитора биосинтеза фолиевой кислоты - 2-(и<яря-аминобензолсульфамидо)-тиазола, вызывающего ингибирование биосинтеза пуриновых нуклеотидов de novo, и показано, что присутствие в среде 2-(ия/?я-аминобензолсульфамидо)-тиазола ведет к увеличению биосинтеза эндонуклеазы и продуктивности культуры по эндонуклеазе, а также к качественному и количественному изменению динамики роста культуры и накопления эндонуклеазы в среде и периплазме.

Установлено, что обогащение полноценной синтетической среды одним из пуринов: аденином, аденозином, гуанином, гуанозином или инозином, - не влияет на рост культуры S. marcescens, биосинтез эндонуклеазы и продуктивность культуры по эндонуклеазе и ведет к увеличению доли внеклеточной фракции эндонуклеазы. Напротив присутствие в среде вместе с 2-(ляря-аминобензолсульфамидо)-тиазолом одного из экзогенных пуринов: гуанина, гуанозина или инозина, - приводит к репрессии клеточного ответа на ингибирование биосинтеза пуриновых нуклеотидов de novo, возникающего в их отсутствие.

Практическая значимость. Обоснованием практической значимости работы служит оптимизация метода получения периплазматической фракции бактерий S. marcescens, который может быть использован при изучении периплазматических белков S. marcescens, а также определение условий культивирования, приводящих к росту продуктивности культуры по эндонуклеазе или увеличению доли внеклеточной фракции эндонуклеазы в синтезированном ферменте, что увеличивает выход эндонуклеазы при ее получении.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на Первой межуниверситетской конференции по современной биологии «Bionews» (Kazan, 2008); XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009); XIV Международной конференции, посвященной 20-летию партнерства между Казанским государственным университетом им. В.И. Ульянова-Ленина и Гиссенским университетом им. Ю. Либиха «Microbial enzymes in biotechnology and medicine» (Kazan, 2009); 13-ом ежегодном симпозиуме студентов биологов Европы «SymBioSE 2009» «Biology: Expansion of Borders» (Kazan, 2009); а также на итоговых конференциях Казанского государственного университета «Молекулярно-генетические, клеточные и популяционные основы функционирования живых систем» (Казань, 2009, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 2 статьи в журнале, поименованном в списке ВАК.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шах Махмуд Раихан

выводы

4. Присутствие в среде вместе с 2-(^<зра-аминобензолсульфамидо)-тиазолом одного из пуринов: гуанина, гуанозина или инозина, - приводит к репрессии клеточного ответа на ингибирование биосинтеза пуриновых нуклеотидов de novo, возникающего в их отсутствие.

5. В условиях ингибирования биосинтеза фолиевой кислоты, а следовательно, и ингибирования биосинтеза пуриновых нуклеотидов de novo, бактерии Serratia marcescens синтезируют пуриновые нуклеотиды с помощью биохимических реакций пути реутилизации экзогенных гуанина, гуанозина или инозина, в образовании которых принимает непосредственное участие бактериальная эндонуклеаза.

Заключение

Эндонуклеаза 5. тагсеясет — это хорошо изученный фермент, применяемый на практике. Результатом его глубокого и всестороннего исследования на протяжении нескольких десятилетий в разных лабораториях мира стала расшифровка механизма действия, определение ключевых физико-химических и биохимических свойств, структуры, закономерностей биосинтеза и его индукции. Наряду с этим многое еще остается неизвестным или изученным недостаточно глубоко. Например, остается актуальным исследование закономерностей биосинтеза данного фермента, так как получение коммерческих продуктов на его основе, а также глобальных исследовательских проектов непосредственно связано с высоким уровнем его биосинтеза. Незаурядность этого фермента, возглавляющего семейство гомологичных нуклеаз, широко распространенных в мире про- и эукариот, свидетельствует в пользу многообразия физиолого-биохимических свойств данного фермента и механизмов его регуляции, понимание которых, очевидно, позволит приблизиться к пониманию сути процессов, в которых принимает участие как сама эндонуклеаза, так и ферменты гомологичного ряда.

Таким образом, планируемое исследование влияния 2-{пара-аминобензолсульфамидо)-тиазола на рост культуры тагсезсет \Y1050 и биосинтез эндонуклеазы в присутствии и в отсутствие пуринов было нацелено на получение сведений, представляющих научный и практический интерес.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы исследования

В качестве реактивов использовали дрожжевую РНК и ДНК, 2-(пара-аминобензолсульфамидо)-тиазол («ICN», США), аденин, аденозин, гуанин, гуанозин, инозин («ICN», США), фенилметилсульфонилфторид («Serva», Германия), лизоцим («Реахим», Россия), о-нитрофенил-|3-0-галактопиранозид («Sigma», Германия), Судан черный В, метиловый зеленый («ICN», США), гидролизат казеина, дрожжевой экстракт («Sigma», Германия), МПА и пр. (отечественного производства).

2.2. Отбор высокопродуктивного клона бактерий

Бактерии выращивали отдельными колониями при 37°С 24 ч на селективной среде, содержащей дополнительно к МПА 0.2% ДНК или РНК и 8% метилового зеленого, служащего индикатором превращения высокомолекулярных полинуклеотидов в низкомолекулярные фрагменты. О продуктивности культуры в отношение эндонуклеазы судили по величине зон с измененной окраской вокруг образовавшихся колоний. Клоны, проявившие ДНКазную активность, переносили путем перекалывания на индикаторную среду с РНК и наоборот, для подтверждения способности фермента гидролизовать одновременно и-ДНК и РНК.

2.3. Подготовка посевного материала и условия культивирования

Посевным материалом служила культура, выращенная в условиях принудительной аэрации при 37° С в течение 12 ч на питательной среде, состав которой указан ниже.

При исследовании роста культуры и биосинтеза эндонуклеазы питательную среду, включающую (г/л): NaCl - 4.7, NH4C1 - 1.1, Na2SC>4 - 0.4, MgCl2 - 0.95, K2HP04-3H20 - 2.8, глюкозу - 5, гидролизат казеина - 1 и дрожжевой экстракт - 3,- засевали до оптической плотности 0.16-0.2 ед./мл.

Культуру выращивали 36 ч при 37°С с принудительной аэрацией на вибростенде (200 об./мин) в инкубационном шкафу BS4 («В .BRAUN», Германия). На протяжении всего периода наблюдения через каждые 1-3 часа (в зависимости от фазы роста культуры) отбирали аликвоты, в которых измеряли оптическую плотность бактериальной суспензии и ферментативную активность, из которых выделяли биомассу для получения периплазматической фракции.

При исследовании влияние 2-ПАБСТ 6.66% водный раствор 2-ПАБСТ, дополнительно включающий 0.25М Na2C03, pH 9.0, перед внесением посевного материала добавляли в питательную среду до конечной концентрации 0.1%.

Так же при исследовании влияния пуринов: аденина, аденозина, гуанина, гуанозина или инозина, - их добавляли в питательную среду непосредственно перед внесением посевного материала. Для этого сначала с соблюдением правил антисептики готовили их концентрированные водные растворы. В частности, аденин, аденозин и инозин растворяли нагреванием на кипящей водяной бане до концентрации 1%. Поскольку гуанин и гуанозин в воде растворяются плохо, их растворяли до 1% концентрации, соответственно, в 9.4% и 3.2% растворах HCl.

Конечная концентрация пуринов в питательной среде на момент засева составляла 0.0005%, а при исследовании влияния гуанина с повышенной концентрацией - 0.01%. С помощью рН-индикатора убеждались в том, что питательная среда после добавления пуринов оставалась нейтральной. При работе с высокой концентрацией гуанина (конечная концентрация 0.01%) среду нейтрализовали добавлением NaOH.

О приросте биомассы судили по изменению оптической плотности культуры, которую определяли нефелометрически с помощью фотоэлектрокалориметра КФК-2 в кювете толщиной 3.06 мм. За единицу оптической плотности принимали такое светорассеяние, которое при длине волны 590 нм и длине оптического пути 1 см составляло величину, равную 1.

2.4. Подготовка бактериальной суспензии

При оптимизации метода получения периплазматической фракции бактерии выращивали 14-16 часов на скошенном МПА при 37°С и затем смывали 0.5% NaCl (физраствор). Далее клетки собирали центрифугированием на СМ-50 («ELMI», Латвия) в течение 15 мин при 1000 g. Образовавшийся осадок отмывали 0.5% NaCl и вновь клетки собирали центрифугированием в тех же условиях. Процедуру повторяли 5-6 раз.

2.5. Получение сферопластов

По методу Телесниной Г.Н. с соавт. [1992] отмытые 0.5% NaCl клетки помещали в гипертонический раствор, содержащий (%): 0.15 - Na2HP04; 0.08 - КН2Р04; 0.02 - NaCl; 0.03 - NH4C1; 0.4 - глюкозу; 0.001- СаС12; 1.71-сахарозу; 0.1 - лизоцим; 0.15 - ЭДТА; 0.7 - фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), pH 7.9-8.0, и инкубировали 15 мин при комнатной температуре. Действие лизоцима останавливали охлаждением реакционной смеси до 0°С. Образование сферопластов контролировали под световым микроскопом («Carl Zeiss Jena», Германия) при увеличении 1600 раз.

По методу Герхарда [Gerhardt et я/., 1994] отмытые физраствором клетки дважды отмывали ЮмМ Трис-HCl буфером, pH 8.0, при 4°С. Клетки отделяли центрифугированием в течение 15 мин при 1000 g. Образовавшийся осадок суспендировали в 30 мМ Трис-HCl буфере, pH 8.0, содержащем 20% сахарозу и 0.7% ФМСФ. К 10 мг собранных центрифугированием клеток добавляли 0.8 мл буфера и все перемешивали при комнатной температуре. Затем добавляли 10 мМ К-ЭДТА, pH 7.0 и лизоцим из расчета 0.5 мг/мл и инкубировали при комнатной температуре 30 мин. Лизоцим добавляли на поверхность раствора порциями, чтобы не было агрегации сферопластов. Действие лизоцима останавливали 10 мин инкубацией на ледяной бане.

2.6. Окрашивание сферопластов

При окрашивании сферопластов и клеток из анализируемого препарата делали мазок, который затем фиксировали в пламени горелки.

При окрашивании метиленовым синим 10% водный раствор метиленового синего наносили на мазок, высушивали на воздухе, избыток красителя смывали дистиллированной водой и высушивали на воздухе.

Окрашивание 0.04%-ным спиртовым раствором Судана черного В вели в течение 1 ч. Затем на поверхность препарата наносили спирт, который удаляли через 30 секунд, после чего отмывали препарат от Судана черного В водой и высушивали на воздухе.

Окрашивание препарата по Граму проводили в соответствии с рекомендациями [Benson, 2001].

На окрашенные препараты наносили иммерсионное масло и смотрели под микроскопом при увеличении в 1600 раз.

2.7. Определение нуклеазной активности

Метод кислоторастворимых фракций. К реакционной смеси, которая состояла из 0.2 мл 0.2М Трис-HCl буфера, рН 8.5, содержащего 0.02М MgS04-7H20, и 0.25 мл 0.2% раствора ДНК, добавляли 0.05 мл исследуемого раствора. Инкубацию проводили в течение 15 мин при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 4% хлорной кислоты. Смесь выдерживали на ледяной бане в течение 10 мин, затем центрифугировали в течение 10 мин при 5600 g, после разведения надосадочной жидкости в 20 раз дистиллированной водой измеряли оптическую плотность раствора при 260 нм на спектрофотометре СФ-46 (Россия).

В качестве контроля на поглощение субстрата вместо ферментного раствора в реакционную смесь добавляли 0.05 мл дистиллированной воды.

Расчет активности фермента производили по следующей формуле: А№=(Е26о-Е26ок5) хЮ*2х60ЛхКх20, где - активность фермента, выраженная в оптических единицах на 1 мл за 1 час инкубации,

Е260 - среднее поглощение при 260нм в опытных образцах, Е2бокэ - среднее поглощение при 260нм в контроле на субстрат, 10 - разведение фермента при внесении в реакционную смесь, 2 - разведение фермента в результате добавления к реакционной смеси 4% хлорной кислоты,

X - время инкубации фермента в реакционной смеси (мин),

К - разведение фермента перед внесением в реакционную смесь,

20 - разведение супернатанта перед измерением поглощения при 260нм.

Для определения активности в среде или в периплазме сначала бактериальные клетки отделяли от среды центрифугированием в течение 10 мин при 5600 g.

Активность фермента в периплазме (Апп) определяли после получения периплазматической фракции бактериальных клеток и рассчитывали по следующей формуле:

А\У * 80 * Всыр

Апп =-------------------, где

0.01 -V

А№ — нуклеазная активность образца, ед./мл, 80 - разбавление биомассы лизирующей смесью, ВСыр - количество биомассы в мг, выделенной из среды, V - объем среды (1.5 мл),

0.01 - 10 мг клеток.

За единицу активности принимали количество фермента, которое вызывало увеличение оптической плотности на одну оптическую единицу при 260 нм в пересчете на 1 мл ферментного раствора за 1 час инкубации при 37°С (Ед./мл).

Биосинтез эндонуклеазы оценивали, суммируя величины нуклеазной активности, определенные в культуральной жидкости и периплазме.

2.8. Определение ß-галактозидазной активности

Активность ß-галактозидазы определяли в соответствии со стандартным методом [Миллер, 1976]. Для этого к 0.1 мл пробы добавляли 0.9 мл буфера, содержащего 1 мМ MgS04, 40 мМ NaH2P04, 60 мМ Na2HP04 и 10 мМ ß-меркаптоэтанол, 0.2 мл водного раствора 0.4% о-нитрофенил-ß-D-галактопиранозида и инкубировали при 37°С. При появлении желтой окраски, реакцию останавливали, добавляя 0.5 мл 1 М Na2C03. Оптическую плотность (ОП420) измеряли при 420 нм на двухлучевом спектрометре Lambda 35 UV/VIS («Perkin Elmer», США).

Активность ß-галактозидазы в культуральной жидкости определяли по следующей формуле:

ОПш* 1000

А42о=-, где

V*t

V — объем пробы (0.1 мл), t - время инкубации (22.5 час).

За единицу активности принимали количество фермента, которое вызывало увеличение оптической плотности на одну оптическую единицу при 420 нм в пересчете на 1 мл ферментного раствора за 1 час инкубации.

Активность (3-галактозидазы в периплазме (Ар.гал. (ПП)) рассчитывали по следующей формуле:

А420 * 80 * Всыр

Ар-гал. (пп) =-------------------5 где

0.01 *V

А42о - активность образца, ед./мл;

80 - разбавление биомассы лизирующей смесью;

ВСыр - количество биомассы в мг, выделенной из питательной среды;

V - объем питательной среды (1.5 мл);

0.01 - 10 мг клеток.

2.9. Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку результатов проводили с помощью подпрограммы статистического анализа графической программы «Sigma plot 8.0» (»Jandel Scientific Corporation», США) и программы «Microsoft Excel».

Проводили выбраковку данных, находили новые значения среднего арифметического и стандартного отклонения во вновь установленном доверительном интервале 95%.

Определение достоверности разницы проводили с применением критерия Стьюдента, используя значения среднего арифметического и стандартной ошибки, полученные после выбраковки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шах Махмуд Раихан, Казань

1. Аликин, Ю. С. Эндоглюкин препарат против вирусных заболевание текст. / Ю. С. Аликин, И. И. Масычева, В. П. Клименко [и др.] // Пчеловодство. - 1996. - № 4. - С. 17-19.

2. Балабан, Н. П. Действие ДНКаз на апуриновые ДНК текст. / Н. П. Балабан, В. И. Таняшин, И. Б. Лещинская // Биохимия. 1971. - Т. 36, вып. 3. - С. 513-518.

3. Беляева, М. И. Использование нуклеиновых кислот в качестве основного источника питания бактерий текст. / М. И. Беляева, М. Н. Капранова, М. Я. Витол [и др.] // Микробиология. 1976. - Т. 45. - С. 420-424.

4. Богомольная, JI. М. Влияние условий культивирования и некоторых экзогенных факторов на биосинтез и секрецию изоформ эндонуклеазы Serratia marcescens текст.: автореф. дис.канд. биол. наук : 03.00.07 / Богомольная Лидия Михайловна. Казань, 2000.- 20 с.

5. Богомольная, JI. М. Динамика активности ферментов потенциальных маркеров цитоплазмы и периплазмы бактерий Serratia marcescens текст. / Л. М. Богомольная, М. Н. Филимонова // Приклад, биохим. микробиол. 2010. - Т. 46, № 4. - С. 428-432.

6. Божокина Е. С. Термолизиноподобные металлопротеазы бактерий и их роль в инвазии эукариотических клеток текст.: автореф. дис.канд. биол. наук : 03.00.03 / Божокина Екатерина Сергеевна. Санкт-Петербург, 2008.- 24 с.

7. Габдуллина, Г. К. Действие нуклеазы Serratia marcescens на клетки ирост асцитной опухоли Эрлиха текст.: автореф. дис.канд. биол. наук : 14.00.14 / Габдуллина Гашира Карамовна. Киев, 1980. - 20 с.

8. Журавлева, Н. В. Хитинолитические ферменты: источники, характеристика и применение в биотехнологии / Н. В. Журавлева, П. А. Лукьянов // Вестник ДВО РАН. 2004. -№ 3. - С. 76-86.

9. Имшенецкий, А. А. Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз текст. /А. А. Имшенецкий. Москва: Наука, 1979. С.7-15.

10. И. Кольман, Я. Наглядная биохимия текст. / Я. Кольман, К.Г. Рем.- М.: Мир, 2000.- С.190-191.

11. Лещинская, И. Б. Нуклеазы Serratia marcescens текст. / И. Б. Лещинская, 3. Ф. Богаутдинов // Микробиология. 1963. - Т. 32, вып. 3-4.-С. 413-415.

12. Лещинская, И. Б. Сравнительное изучение бактериальных фосфомоно-и фосфодиэстераз, гидролизующих нуклеиновые кислоты и нуклеотиды текст. / И. Б. Лещинская, М. И. Беляева, К. 3. Гильфанова // Микробиология. 1968. - Т. 37. - С. 979-983.

13. Миллер, Дж. Эксперименты в молекулярной генетике текст. / Дж. Миллер. М.: Мир, 1976. - С. 438

14. Педерсен, Ю. Нуклеазы Serratia marcescens. I. Сравнение природной и рекомбинантной нуклеаз с использованием электроспрей-масс-спектрометрии текст. / Ю. Педерсен, Ж. Андерсен, П. Роепсторф [и др.] // Биоорг. химия 1995а. - Т. 21, № 5. - С. 330-335.

15. Педерсен, Ю. Нуклеазы Serratia marcescens. II. Анализ первичных структур путем пептидного картирования в комбинации с плазменно-десорбционной масс-спектрометрией текст. / Ю. Педерсен, М. Н.

16. Филимонова, П. Роепсторф и др. // Биоорг. химия 19956. - Т. 21, № 5.-С. 336-344.

17. Романова, Ю. Д. О механизме регуляции активности эндонуклеазы Serratia marcescens катионами магния текст. / Ю. Д. Романова, В. П. Губская, И. А. Нуретдинов [и др.] // Учен. зап. Казан, ун-та. Сер. Естеств. науки. 2008. - Т. 150, кн. 2. - С. 176-185.

18. Салганик, Р. И. Эндонуклеаза бактериальная средство пофилактики вирусного паралича пчел текст. / Р. И. Салганик, С. Н. Загребельный, С. Ф. Грачева // Ветеринария. - 1985, № 5. - С. 42 - 44.

19. Старшинова, Н. В. Особенности биосинтеза нуклеазы и роста Serratia marcescens в присутствии 2-(яя/?а-аминобензолсульфамидо) -тиазола текст. / Н. В. Старшинова, М. Н. Филимонова // Микробиология. -2005.-Т. 74,№2.-С. 1-5.

20. Телесниной Г. Н. Получение протопластов Xanthomonas rubrilineans и их использование для изучения локализации аминопептидаз текст. / Г. Н. Телесниной, Н. А. Васильева, И. Н. Крестьянова [и др.] //

21. Антибиотики и химиотерапия. 1992. - Т. 37, № 4. - С. 14-16.

22. Трифонова, Е. А. Трансгенные растения табака Nicotiana tabacum SRI, экспрессирующие ген, кодирующий нуклеазу Serratia marcescens текст. / Е. А. Трифонова, М. JI. Комарова, О. А. Сырник [и др.] // Генетика. 2002. - Т. 32, № 2. - Р. 274-277.

23. Филимонова, М. Н. Получение нуклеазы Serratia marcescens в гомогенном состоянии и изучение физико-химических свойств фермента текст. / М. Н. Филимонова, Н. П. Балабан, Ф. Р. Шарипова [и др.] //Биохимия. 1980. - Т. 45, вып. 11. - С. 2096 - 2102.

24. Филимонова, М. Н. Эндонуклеаза Serratia marcescens. Характеристика фермента / М. Н. Филимонова, Н. П. Баратова, Н. Д. Воспельникова и др. //Биохимия. 1981. - Т. 46, вып. 9. - С. 1660-1666.

25. Филимонова, М. Н. Выделение и характеристика изоформ внеклеточной нуклеазы Serratia marcescens текст. / М. Н. Филимонова, А. А. Дементьева, И. Б. Лещинская [и др.] // Биохимия. 1991. - Т. 56, вып. У. - С. 508-520.

26. Филимонова, М. Н. Изоформы нуклеазы Serratia marcescens. Сравнительный анализ субстратной специфичности текст. / М. Н. Филимонова, А. В. Гарусов, Т. А. Сметанина [и др.] // Биохимия 1996 -Т. 61, вып. 10. - С. 1800-1806.

27. Филимонова, М. Н. Изоформы нуклеазы Serratia marcescens. Роль ионов Mg в механизме гидролиза текст. / М. Н. Филимонова, В. П. Губская, Н: А. Нуретдинов [и,др.],// Биохимия. 1997. - Т. 62, вып.9. -С. 1148- 1154.

28. Филимонова, М. Н. Эндонуклеазы Serratia marcescens. Определение димеров текст. / М. Н. Филимонова, Н. Г. Уразов // XI Всероссийская Конференция «Ферменты микроорганизмов». Казань, 1998.- С. 89-93.

29. Филимонова, М. Н. Полидисперность нуклеазы Serratia marcescens при оптимальном значении pH текст. / М. Н. Филимонова, М. Дж. Бенедик, Н. Г. Уразов [и др.] // Приклад, биохим. микробиол. 1999.1. Т. 35, № l.-C. 20-24.

30. Филимонова, М. Н. Эндонуклеаза Serratia marcescens текст. / М. Н. Филимонова // Объединенная Международная конференция «Новая геометрия природы»: Сб. науч. тр. Казань, 2003. - Т. 11.- С. 67-70.

31. Юсупова, Д. В. Индукция синтеза внеклеточной эндонуклеазы Serratia marcescens агентами, подавляющими репликацию ДНКтекст. / Д. В. Юсупова, Р. Б. Соколова, О. В. Порфирьева [и др.] // Микробиология. -1991. Т.60, вып. 2. - С. 279-284.

32. Юсупова, Д. В. Влияние налидиксовой кислоты и митомицина С на рост и биосинтез внеклеточных белков Serratia marcescens текст. / Д. В. Юсупова, Р. Б. Соколова, Е. В. Петухова // Антибиотики и химиотер. — 1993. — Т.38, № 8-9. С. 16-21.

33. Abdollahi, A. Serratia marcescens, an opportunistic gram-negative infection in cardiac valve surgery text. / A. Abdollahi, S. Nasirpour, N. Shahmohammad [et al.] II Iran. J. Pathol. 2008. - Vol. 3,1. 1. - P. 40-42.

34. Abdou A. M. Purification and partial characterization of psychrotrophic Serratia marcescens lipase text. / A. M. Abdou // J. Dairy Sci. 2003. -Vol. 86.-P. 127-132.

35. Ajithkumar, B. Spore-forming Serratia marcescens subsp. sakuensis subsp. nov., isolated from a domestic wastewater treatment tank text. / B. Ajithkumar, V. P. Ajithkumar, R. Iriye [et al.] II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2003.-Vol. 53.-P. 253-258.

36. Aucken, H. M. Identification of capsular antigens in Serratia marcescens text. / H. M. Aucken, S. G. Wilkinson, T. L. Pitt // J. Clin. Microbiol. -1997. -Vol. 35, № 1. P. 59-63.

37. Ball, Т. K. The extracellular nuclease gene of Serratia marcescens and its secretion from Escherichia coli text. / Т. K. Ball, P. N. Saurugger, M. J. Benedik // Gene. 1987. - Vol. 57, № 2-3. - P. 183-192.

38. Ball, Т. K. Expression of Serratia marcescens extracellular proteins requires RecA text. / Т. K. Ball, C. R. Wasmuth, S. C. Braunagel [et al.] II J. Bacteriol. 1990. - Vol. 172, № 1. - P. 342-349.

39. Ball, Т. K. Disulfide bonds are required for Serratia marcescens nuclease activity text. / Т. K. Ball, Y. Suh, M. J. Benedik // Nucleic Acids Res. -1992. Vol. 20, № 19. - P. 4971-4974.

40. Beales, N. Adaptation of microorganisms to cold temperatures, weak acid preservatives, low pH, and osmotic stress: a review text. / N. Beales // CRFSFS 2004. - Vol. 3. - P. 1-20.

41. Becerra, A. The role of gene duplication in the evolution of purine nucleotide salvage pathways text. / A. Becerra, A. Lazcano // Orig. Life Evol. Biosph. 1998. - Vol. 28,1. 4-6. - P. 539-53.

42. Benedik, M. J. Serratia marcescens and its extracellular nuclease / M. J. Benedik, U. Strych // FEMS Microbiol. Let. 1998. - Vol. 165,1. 1 - P. 1-13.

43. Benson, H. J. Microbiological applications. Laboratory manual in general microbiology text. / H.J. Benson.- 8th ed.- The McGraw-Hill" Companies, 2001.-P. 64-66

44. Bhatti, A. R. pH-Dependent modulation of alkaline phosphatase activity in Serratia mareescens text. / A. R. Bhatti, A. Alvi, S. Walia [et al.] II Curr. Microbiol. 2002. - Vol. 45, № 4. - P. 245-249.

45. BRENDA : база данных ферментов: на английском языке Электронный ресурс. // Режим доступа : http://www.brenda-enzymes.org, свободный. Дата обращения: 10.03.2010.

46. Brown, G. M. The biosynthesis of folic acid II. Inhibition by sulfonamides text. / G. M. Brown // J. Biol. Chem. - 1962. - Vol. 237,1. 2. - P. 536-540.

47. Brurberg, M. B. Comparative studies of chitinases A and B from Serratia marcescens text. / M. B. Brurberg, I. F. Nesl, V. G. H. Eijsinkl // Microbiol. 1996. - Vol. 142. - P. 1581-1589.

48. Buchanan, R. E. General systematic bacteriology text. / R. E. Buchanan // Baltimore. 1925. - P. 463-465.

49. Büttner, D. pH Dependency in uptake of sulfonamides by bacteria text. / D. Btttner, H. Büttner // Chemother. 1980. - Vol. 26, № 3. - P. 153-163.

50. Burgert, S. R. Droplet Enrichment factors of pigmented and nonpigmented Serratia marcescens: possible selective function for prodigiosin text. / S. R. Burgert, J. W. Bennett // Appl. Environ. Microbiol. 1985. - Vol. 50,1. 2. -P. 487-490.

51. Bzowska, A. Purine nucleoside phosphorylases: properties, functions, and clinical aspects text. / A. Bzowska, E. Kulikowska, D. Shugar // Pharmacol. Ther. 2000. - Vol. 88, № 3. - P. 349-425.

52. Cappiello, M. Purine salvage as a metabolite and energy saving mechanism in the ocular lens text. / M. Cappiello, D. Barsacchi, A. Del Corso [et al.] // Curr. Eye Res. 1992. - Vol. 11,1. 5. - P. 435-444.

53. Chen, Y. Regulatory mutants and transcriptional control of the Serratia marcescens extracellular nuclease gene text. // Y. Chen, G. L. Shipley, K. T. Ball [etal.] //Mol. Microbiol. 1992. - Vol. 6, № 5.-P. 643-651.

54. Chichiro, V. E. Use of UV spectra for the* identification' of sulfanilamide preparations text. / V. E. Chichiro, A. P. Arzamastsev, N. V. Trius [et al.] // Pharmaceut. Chem. J. 1981. - Vol. 15, № 9. - P. 681-686.

55. Choi, H. S. Purification and partial characterization of purine nucleoside Phosphorylase from Serratia marcescens text. / H. S. Choi // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998. - Vol. 62, № 4. - P. 667-671.

56. Cui, L. A nonspecific nucleoside hydrolase from Leishmania donovani: implications for purine salvage by the parasite text. / L. Cui, G. R.

57. Rajasekariah, S. K.Martin // Gene. 2001. - Vol. 280, № 1-2. - P. 153-162.

58. Davis B. Chitosanases: occurrence, production and immobilization text. / B. Davis, D. E. Eveleigh. -Orlando: Academic press. Inc, 1984. P. 161-179.

59. Dawson, W. Histamine formation in guinea-pigs text. / W. Dawson, D. V. Maudsley, G. B. West II J. Phygiol.- 1965. Vol. 181. - P. 801-809.

60. Eaves, G. N. Isolation and properties of exocellular nuclease of Serratia marcescens text. / G .N. Eaves, C. D. Jeffries // J. Bacteriol. 1963. - V. 85, № 2. - P. 273-278.

61. Escher, B. I. Kinetic model to describe the intrinsic uncoupling activity of substituted phenols in energy transducing membranes text. / B. I. Escher, R. Hunziker, R. Schwarzenbach [etal.] // Environ. Sci. Technol. 1999. - Vol. 33, №4.-P. 560-570.

62. Francisco, R. Mechanisms of prodigiosin cytotoxicity in human neuroblastoma cell lines text. / R. Francisco, R. Perez-Tomas, P. Gimenez-Bonafe [et al.] // Eur. J. Pharmacol. 2007. - Vol. 572,1. 2-3. - P. 111-119.

63. Friedhoff, P. Analysis of the mechanism of the Serratia nuclease using site-directed mutagenesis text. / P. Friedhoff, B. Kolmes, O. Gimadutdinow [et al.] II Nuc. Acids Res. 1996. - Vol. 24, № 14. - P. 2632-2639.

64. Gao, J. Adsorption of sulfonamide antimicrobial agents to clay minerals text. / J. Gao, J. A. Pedersen // Environ. Sci. Technol. 2005. - Vol. 39, № 10.-P. 9509-9516.

65. Gerhardt, P. Methods for General and Molecular Bacteriology text. / P. Gerhardt, R. G. E. Murray, W. A. Wood, N. R. Krieg. Washington D.C.: AMS, 1994.-P. 78-79.

66. Giri, A. V. A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil text. / A. V. Giri, N. Anandkumar, G. Muthukumaran [et al.] // BMC. Microbiol. 2004. -Vol. 4, № 11.-P. 1-10.

67. Goudela, S. Characterization and kinetics of the major purine transporters in Aspergillus fumigatus text. / S. Goudela, U. Reichard, S. Amillis [et al.] II Fungal Genet. Biol. 2008. - Vol. 45, № 4. - P. 459-472.

68. Goullet, P. An epidemiological study of Serratia marcescens isolates from nosocomial infections by enzyme electrophoresis text. / P. Goullet, B. Picard // J. Med. Microbiol. 1997. - Vol. 46. - P. 1019-1028.

69. Grenha, R. Structure of purine nucleoside phosphorylase (DeoD) from Bacillus anthracis text. / R. Grenha, V. M. Levdikov, M. J. Fogg [et al.] II Ther. 2005. - Vol. 61, Pt. 5. - P. 459-462.

70. Hejazi, A. Serratia marcescens text. / A. Hejazi, F. R. Falkiner // J. Med. Microbiol. 1997. - Vol. 46. - P. 903-912.

71. Henriette, C. Protease and lipase production by a strain of Serratia marcescens (532 S) text. / C. Henriette, S. Zinebi, M. F. Aumaitre [et al.] II J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 1993. - Vol. 12, № 2. - P. 129-135.

72. Ingerslev, F. Biodegradability properties of sulfonamides in activated sludgetext. / F. Ingerslev, B. Halling-Sorensen // Environ. Toxicol. Chem. 2000. -Vol. 19, № 10. - P. 2467-2473.

73. Khanafari, A. Review of Prodigiosin, Pigmentation in Serratia marcescens text. / A. Khanafari, M. M. Assadi, F. A. Fakhr // Online J. Biol. Sei. 2006. -Vol. 6, № l.-P. 1-13.

74. Kilstrup, M. Nucleotide metabolism and its control in lactic acid bacteria text. / M. Kilstrup, K. Hammer, P. Ruhdal Jensen [et al.] // FEMS Microbiol. Rev. 2005. - Vol. 29,1. 3. - P. 555-590.

75. Kohler, T. Multidrug efflux in intrinsic resistance to trimethoprim and sulfamethoxazole in Pseudomonas aeruginosa text. / T, Kohler, M. Kok, M. Michea-Hamzehpour [et al.] II Antimicrob. Agents Chemother. 1996. -Vol. 40, № 10. - P. 2280-2290.

76. Kolmes, B. Analysis of the reaction mechanism of the non specific endonuclease of Serratia marcescens using an artificial minimal substrate text. / B. Kolmes, I Franke, P Friedhoff [et al.] II FEBS Letters. - 1996 -Vol.397,1. 2-3.-P. 343-346.

77. Kurz, C. L. Virulence factors of the human opportunistic pathogen Serratia marcescens identified by in vivo screening text. / C. L. Kurz, S. Chauvet, E. Andres [et al.] II EMBO J. 2003. - Vol. 22.-P. 1451 - 1460.

78. Lu, C. C. Resveratrol ameliorates Serratia marcescens-induced acute pneumonia in rats text. / C. C. Lu, H. C. Lai, S. C. Hsieh [et al.] II J. Leukoc. Biol. 2008. - Vol. 83,1. 4. - P. 1028-1037.

79. Lunin, V. Yu. Three-dimensional structure of Serratia marcescens nuclease at 1.7 A resolution and mechanism of its action text. / V. Yu. Lunin, V. M. Levdikov, S. V. Shlyapnikov [et aL] II FEBS Letters. 1997. - Vol. 412, № 1. -P. 217-222.

80. Meiss, G. Sequence preferences in cleavage of dsDNA and ssDNA by the extracellular Serratia marcescens endonuclease / G. Meiss, P. Friedhoff, M. Hahn et aL. II Biochem. 1995 - Vol. 34, № 37. - P. 6125-6130.

81. Meiss, G. Biochemical characterization of Anabaena sp. strain PCC 7120 non-specific nuclease Nuc A and its inhibitor Nui A / G. Meiss, I. Franke, O. Gimadutdinow et al. II Eur. J. Biochem. 1998. - Vol. 251. - P. 924-934.

82. Mendz, G. L. Purine metabolism and the microaerophily of Helicobacter pylori text. / G. L. Mendz, A. J. Shepley, S. L. Hazell [et al.] II Arch. Microbiol. 1997. - Vol. 168. - P. 448^56.

83. Metintas, S. Prevalence and characteristics of nosocomial infections in a Turkish university hospital text. / S. Metintas, Y. Akgun, G. Durmaz [et aL] II Am. J. Infect.Control. 2004. - Vol. 32,1. 7. - P. 409-413.

84. Miller, M. A. Structure of Serratia endonuclease suggest a mechanism for binding to double-stranded DNA text. // M. Miller, J. Tanner, M. Afpaugh [et al.] //Nature Struct. Biol. 1994. - Vol. 1, № 7. - P. 461 - 468.

85. Miller, M. Identification of the Serratia endonuclease dimmer: structural-basis and implication for catalysis text. / M. Miller, K. Krause // Protein Sei. 1996. - Vol. 5, № 1. -P. 24-33.

86. Miyamoto, Y. Characterization of N-deoxyribosyltransferase from Lactococcus lactis subsp. lactis text. / Y. Miyamoto, T. Masaki, S. Chohnan //Biochim. Biophys. Acta. 2007. - Vol. 1774,1. 10.-P. 1323-1330.

87. Miyazaki, H. Specific excretion into the medium of a serine protease from

88. Serratia marcescens text. / H. Miyazaki, N. Yanagida, S. Horinouchi [et a/.] // Agric. Biol. Chem. 1990. - Vol. 54, № ю. - P. 2763-2765.

89. Nelson, D. L. Biosynthesis of amino acids, nucleotides, and related molecules text. / Nelson D. L., Cox M.M. // Lehninger Principles of Biochemistry, 5th ed. New York: W. H. Freeman and Co., 2008. - Ch. 22. -P. 851-899.

90. Nestle, M. An extracellular nuclease from Serratia marcescens. I. Purification and some properties of the enzyme text. / M. Nestle, W. K. Roberts // Biol. Chem. 1969a. - Vol. 244. - P. 5213 - 5218.

91. Nestle, M. An extracellular nuclease from Serratia marcescens. II. Specificity of the enzyme text. / M. Nestles, W. K. Roberts // J. Biol. Chem. 1969b-Vol. 397, № 19. - P. 343-346.

92. Neuhard, J. Purines and pyrimidenes text. / J. Neuhard, P. Nygaard // Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology/ F. C. Neidhart. Washington D.C.: AMS, 1987.-Ch. 29. - P. 445^167.

93. Ophardt, С. E. Sulfa drugs: Электронный ресурс. / С. E. Ophardt // Virtual Chembook. 2003. - Режим доступа: http://www.elmhurst.edu/~chm/vchembook/653sulfa.html, свободный. Дата обращения: 23.03.2010.

94. Pedersen, J. Separation of isoforms of Serratia marcescens nuclease by capillary electrophoresis text. / J. Pedersen, M. Pedersen, H. Soeberg [et al.] И J. Chromatogr. 1993. - V. 645,1. 2. - P. 353-361.

95. Perez-Tomas, R. Effects of the proapoplotic drug prodigiosin on cell cycle-related proteins in Jurkat T cells text. / R. Perez-Tomas, B. Montaner // Histol. Histopathol. 2003. - Vol. 18, № 2. - P. 379-385.

96. Qiang, Z. Potentiometrie determination of acid dissociation constants (pKa) for human and veterinary antibiotics text. / Z. Qiang, C. Adams // Water Res. 2004. - Vol. 38,1. 12. - P. 2874-2890.

97. Rolfes, R. J. Regulation of purine nucleotide biosynthesis: in yeast and beyond text. / R. J. Rolfes // Biochem. Soc. Trans. 2006. - Vol, 34, Pt. 5.1. P. 786-790.

98. Salamone, P. R. Production, purification and characterization of a 50-kDa extracellular metalloprotease from Serratia marcescens text. / P. R. Salamone, R. J. Wodzinski // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. - V. 48, №3.-P. 317-324.

99. Sauermann, R. Penetration von Antibiotika in das schwer erreichbare Kompartiment text. / R. Sauermann, M. Muller, C. Joukhadar // Chemother. J. 2005. - Vol. 14. - P. 74-78.

100. Sleigh, J. D. Antibiotic resistance in Serratia marcescens text. / J. D. Sleigh // Br. Med. J. 1983. - Vol. 287, № 6406. - P. 1651-1653.

101. Stuer-Lauridsen, B. Purine salvage in two halophilic archaea: characterization of salvage pathways and isolation of mutants resistant to purine analogs text. / B. Stuer-Lauridsen, P. Nygaard // J. Bacteriol. 1998. - Vol. 180, № 3. - P. 457-463.

102. Suh, Y. Secretion of nuclease across the outer membrane of Serratia marcescens and its energy requirements text. / Y. Suh, M. Benedik // J. Bacteriol. 1997. - Vol. 179, № 3. - P. 677-683.

103. Taylor, C. M. Listeria monocytogenes relA and hpt mutants are impaired in surface-attached growth and virulence text. / C. M. Taylor, M. Beresford, H. A. S. Epton [et al.] // J. Bacteriol. 2002. - Vol. 184, № 3. - P. 621-628.

104. Thayer, H. H. Contraindication for use of Serratia marcescens as tracer organisms in research text. / H. H. Thayer // J. dent. Res. 1966. - Vol. 45, № 3.- P. 853-855

105. Thomson, N. R. Biosynthesis of carbapenem antibiotic and prodigiosin pigment in Serratia is under quorum sensing control text. / N. R. Thomson, M. A. Crow, S. J. McGowan [et al.] II Mol. Microbiol. 2000. - Vol. 36, № 3. -P. 539-556.

106. Tozzi, M. G. Pentose phosphates in nucleoside interconversion and catabolism text. / M. G. Tozzi, M. Camici, L. Mascia [et al.] II FEBS J. -2006. Vol. 273,1. 6. -P. 1089-1101.

107. Trapp, S. A predictive model for the selective accumulation of chemicals in tumor cells text. / S. Trapp, R.W. Horobin II Eur. Biophys. J. 2005. - Vol. 34.-P. 959-966.

108. Tras, B. Concentrations of sulfadoxine and trimethoprim in plasma, lymph fluids and some tissues 24 h after intramuscular administration to angora goats text. / B. Tras, M. Elmas, E. Yazar [et al.] II Vet. Quart. 1998. - Vol. 20, №2.-P. 62-64.

109. Vaaje-Kolstad, G. The Non-catalytic chitin-binding protein CBP21 from Serratia marcescens is essential for chitin degradation text. / G. Vaaje-Kolstad, S. J. Horn, D. M. F. van Aalten [et al] II J Biol Chem. 2005. -Vol. 280, № 31. - P. 28492-28497.

110. Vinnicombe, H. G. Dihydropteroate synthase: an old drug target revisited text. / H. G. Vinnicombe, J. P.Derrick // Biochem. Soc. Trans. 1999. -Vol. 27,1. 2.-P. 53-58.

111. Waisman, H. A. The presence of Serratia marcescens as the predominatingorganism in the intestinal tract of the newborn text. / H. A. Waisman, W. H. Stone //Pediatrics. 1958. - Vol. 21, № 1. - P. 8-12.

112. Williamson, N. R. The biosynthesis and regulation of bacterial prodiginines text. / N. R. Williamson, P. C. Fineran, F. J. Leeper [et al.] // Nat. Rev. Microbiol. 2006. - Vol. 4. - P. 887-899.

113. Xi, H. Purine catabolism in Escherichia coli and function of xanthine dehydrogenase in purine salvage text. / H. Xi, B. L. Schneider, L. Reitzer // J. Bacteriol. 2000. - Vol. 189,№ 19.-P. 5332-41.

114. Yonemura, K. Isolation and characterization of nucleases from clinical isolate of Serratia marcescens kums 3958 text. / K. Yonemura, K. Matsumoto, H. Maeda // J. Biochem. 1983. - Vol. 93, № 5. - P. 1287 - 1295.

115. Zalkin, H. Biosynthesis of purine nucleotides text. / H. Zalkin, P. Nygaard // Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, 2nd ed. / F. C. Neidhart. Washington D.C.: AMS, 1996. - Ch. 34. - P. 561-579.

116. Zarfl, C. A mechanistical model for the uptake of sulfonamides by bacteria text. / C. Zarfl, M. Matthies, J. Klasmeier // Chemosphere 2008. - Vol. 70, I. 5.-P. 753-760.

117. Zhao, L. L. Strain improvement of Serratia marcescens ECU1010 and medium cost reductio for economic production of lipase text. / L. L. Zhao, X. X. Chen, J. H. Xu // World J. Microbiol. Biotechnol. 2009. - Vol. 26,1. 3.-P. 537-543.

118. Zilberstein, D. Escherichia coli intracellular pH, membrane potential, and cell growth text. / D. Zilberstein, V. Agmon, S. Schuldiner [et al.] II J. Bacteriol. 1984. - Vol. 158,1. 1. -P. 246-252.

Информация о работе

Шах Махмуд Раихан
кандидата биологических наук
Казань, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Влияние 2-(пара-аминобензолсульфамидо)-тиазола на рост культуры Serratia Marcescens W1050 и биосинтез эндонуклеазы в присутствии и в отсутствие пуринов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы