Анализ действия эндонуклеазы в комбинации с "бетадином" на клетки организмов различных таксономических групп

Зайнутдинова, Эльмира Фаритовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ действия эндонуклеазы в комбинации с "бетадином" на клетки организмов различных таксономических групп
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Анализ действия эндонуклеазы в комбинации с "бетадином" на клетки организмов различных таксономических групп"

На правах рукописи

ЗАЙНУТДИНОВА ЭЛЬМИРА ФАРИТОВНА

АНАЛИЗ ДЕЙСТВИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ В КОМБИНАЦИИ С «БЕТАДИНОМ» НА КЛЕТКИ ОРГАНИЗМОВ РАЗЛИЧНЫХ ТАКСОНОМИЧЕСКИХ ГРУПП

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

7 НОЯ 2013

Казань-2013 005537326

005537326

Работа выполнена на кафедре микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник Филимонова Мария Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Чернова Ольга Александровна

(ведущий научный сотрудник ФГБУН «Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН»)

доктор ветеринарных наук, профессор, Галиуллин Альберт Камилович (ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н. Э. Баумана», заведующий кафедрой микробиологии и вирусологии факультета ветеринарной медицины»)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (г. Казань)

Защита состоится «28 » ноября 2013 г. в _13_ч. на заседании диссертационного совета Д.212.08! .08 при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, главное здание, аудитория №211.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Н. И. Лобачевского при Казанском (Приволжском) федеральном университете.

Автореферат разослан « 25 » октября

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Абрамова З.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Неуклонный рост устойчивости микроорганизмов к антибактериальным средствам, трудности лечения и профилактики инфекционных заболеваний, обусловленные появлением мультирезистентных форм патогенов, их биологическим разнообразием, а также возникновением новых видов инфекций, определяют актуальность поиска и создания новых противомикробных средств и находятся в фокусе пристального внимания мирового сообщества. Возможность летального исхода от любой банальной инфекции в силу неэффективности традиционной терапии все чаще обращает внимание исследователей к соединениям нового типа и их комбинированию с известными средствами с целью получения высокого фармакотерапевтического эффекта (Аляутдин Р. Н. и др. Молекулярная медицина. 2003. С. 41-44). Примером тому может служить внеклеточная эндонуклеаза грамотрицательных бактерий Serratia marcescens, проявляющая целый ряд биологических эффектов, механизмы которых до конца не познаны (Беляева М. Н. Микробиология. 1977. Т. 46. С. 300-304; ГабдуллинаГ. К. Автореф. дис. ...канд. биол. наук. 1980.25 е.; СалганикР. И. и др. Ветеринария. 1985. № 5. С. 42 - 44; Куриненко Б. М. и др. Нуклеазы бактерий. 1991. С.153-230).

Представляя собой дезоксирибонуклеат (рибонуклеат) - 5'-нуклеотидогидролазу и выделяясь в ряду аналогичных ферментов чрезвычайно высокой гидролитической активностью по отношению к высокомолекулярным ДНК и РНК, эндонуклеаза служит реактивом для молекулярно-биологических исследований, а также применяется в пчеловодстве в качестве противовирусного препарата (Панфилова 3. И. и др., 1982. С. 100; Детиненко Л. Д. и др. Патент на изобретение № 2038776.1995; Kalyuzhny A. Handbook of EL1SPOT. Methods and Protocols. 2005. 336 p.). Изучение ее противовирусного эффекта показало перспективность использования не только при болезнях вирусной этиологии пчел, но и животных (Аликин Ю. С. и др. Сб. Докл. 1998. С. 152 -163).

Комбинирование эндонуклеазы с «Йодохлорином» - эффективным дезинфектантом, представляющим йодсодержащий электроактивированный солевой раствор приводило не только к возрастанию противовирусной активности (Филимонова М. Н. и др. Патент на изобретение №2337139. 2006), но и к расширению спектра действия фермента, вероятно за счет взаимодополнения механизмов и мишеней действия. Созданная принципиально новая композиция представляла практический интерес, так как отличалась высокой вирулицидной и микробоцидной активностью без выраженной видоспецифичности и была активна при мягких физиологических условиях (Филимонова VI. Н. и др. Сб. Докл. 2009. С. 287-289).

Несмотря на массу положительный качеств «Йодохлорина»: безвредность для эукариот, отсутствие отрицательного влияния на пассивный и поствакцинальный иммунитет (Фаткуллова А. А. и др. Мат. Всеросс. н. п. конфер. 2005. С. 393-395), способность к самоинактивации (Угрюмова В. С. и др. Ветеринарный врач. 2001. - №. 3. - С. 59), образование пор в результате контакта с клеточными мембранами и т.д., - значительное снижение каталитической активности эндонуклеазы даже при ее кратковременном прямом контакте с «Йодохлорином» стало основной причиной создания новой аналогичной композиции, где роль йодосодержащего реагента отводилась повидон-йоду в составе средства «Бетадин». Известно, что «Бетадин» находит широкое применение в медицине, производится фармацевтичекой промышленностью и обладает идентичным «Иодохлорину» механизмом и широким спектром действия (William A. et al. Guideline for Disinfection and Sterilization in Healthcare Facilities. 2008. C. 51-52; Alps R. Povidone Iodine Antiseptic Agent. 2004. P. 7-26). Есть сведения об эффективности его применения для профилактики вторичного опухолевого роста при проведении абдоминальных операций на животных (Tsunoda A. et al. Europ. surg. research. J. 1997. P. 473-480, Anticancer research J. 1999. P.l 149-1152; Sindelar W.F. et al. Hosp Infect. J. - 1985. P.103-104).

Таким образом, изложенное обосновывает актуальность исследования, цель которого состояла в оценке антибактериального, антивирусного, антимикотического и противоопухолевого эффекта эндонуклеазы Serratia marcescens в комбинации с «Бетадином».

В связи с поставленной целью решали следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ эффективности действия эндонуклеазы на бактерии, вирусы, дрожжи и культуру клеток гепатомы.

2. Оценить эффективность действия растворов «Бетадина», различающихся содержанием повидон-йода, на бактерии, вирусы, дрожжи и культуру клеток гепатомы в зависимости от условий среды и физиологического состояния организмов.

3. Подобрать условия эффективного действия эндонуклеазы в комбинации

с «Бетадином» на организмы разных таксономических групп.

Научная новизна. Впервые исследовано влияние мономеров гомогенной эндонуклеазы на жизнеспособность организмов различных таксономических групп: вирусы (фаг X Ы1), бактерии грамотрицательные (Serratia marcescens) и грамположительные (Bacillis subtilis), низшие эукариоты (дрожжи Saccharomyces cerevisiae), а также высшие эукариоты (культура клеток гепатомы Н4-Н-Е-СЗ) и установлено снижение жизнеспособности всех исследованных объектов кроме культуры клеток гепатомы. Показано, что подавляющее жизнеспособность действие эндонуклеазы не зависит от типа молекулярной формы фермента. Впервые

установлена возможность комбинирования эндонуклеазы и «Бетадина» и показано, что после их прямого б мин контакта сохраняется не менее 30% ферментативной активности независимо от типа изоформы. Исследовано изменение морфологии и ультраструктуры бактериальных клеток под действием «Бетадина» и выявлено нарушение мембранных структур, цитоплазмы и ядерного материала Впервые продемонстрирована эффективность действия «Бетадина» в щелочной среде и показано, что 1% «Бетадин» вызывает полное подавление роста и жизнеспособности всех исследованных организмов, кроме культуры клеток гепатомы. Показано, что в результате комбинированного действия эндонуклеазы и «Бетадина» подавление жизнеспособности всех исследованных организмов усиливается. Подобраны условия 100% подавления жизнеспособности культуры клеток гепатомы H4-II-E-C3.

Практическая значимость. Настоящим исследованием показана перспективность использования эндонуклеазы Serratia marcescens в комбинации с йодофором «Бетадин» - препаратов, относящихся к разным классам соединений - для повышения эффективности подавляющего действия эндонуклеазы широкого спектра, что является основой для создания универсального средства защиты от инфекций различной этиологии в разных отраслях народного хозяйства. Полное подавление жизнеспособности клеток культуры гепатомы H4-II-E-C3 под действием эндонуклеазы в комбинации с «Бетадином» открывает перспективу применения данной композиции в онкологии для предотвращения вторичного роста раковых опухолей при проведении абдоминальных операций.

Основные научные положения, выносимые на защиту:

1. Прямой контакт клеток про- и низших эукариот с мономерами гомогенной эндонуклеазы приводит к снижению жизнеспособности культуры.

2. Растворы «Бетадина» с содержанием повидон-йода 0.002% вызывают подавление жизнеспособности организмов за счет нарушений в мембранных структурах, цитоплазме и ядерном материале.

3. В результате прямого б мин контакта эндонуклеазы с «Бетадином» происходит не полное, а лишь частичное снижение ферментативной активности; остаточная активность составляет не менее 30% независимо от типа изоформы.

4. Комбинирование эндонуклеазы с разбавленным «Бетадином» увеличивает ее эффективность действия на организмы, относящиеся к разным таксономическим группам.

молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского университета «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2011).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в числе которых 1 патент, 3 статьи (ВАК), 2 тезисов.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю д.б.н., ведущему научному сотруднику кафедры микробиологии М. Н. Филимоновой за постановку проблемы, и неоценимую помощь на всех этапах работы; профессору ИБФМ РАН В. В. Дмитриеву, профессору А. И. Голубеву, доценту Р. М. Сабирову, к.б.н. В.Г. Евтюгину (Казанский (Приволжский) Федеральный университет) за помощь при проведении электронно-микроскопического анализа, к.б.н. Е. Науменко и заведующей кафедрой микробиологии Казанского (Приволжского) Федерального университета д.б.н., профессору, академику АН РТ О. Н. Ильинской за предоставленную возможность и помощь, оказанную при проведении исследований на культуре клеток гепатомы, другу и соратнику И. А. Рассохиной за совместное исследование противовирусной активности, а также к.б.н., старшему научному сотруднику А. И. Колпакову и всем сотрудникам кафедры за всестороннюю поддержку.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 136 страницах и включает в себя: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы (275 источник, в том числе 125 иностранных). Диссертация содержит 4 таблицы и 35 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследовании использовали грамположительные бактерии В. subtilis JH 642, грамотрицательные бактерии S. marcescens W 1050, любезно предоставленные профессором М. Бенедиком (США), дрожжи S. cerevisiae, полученные из коллекции чистых культур кафедры микробиологии КПФУ, систему фаг/хозяин, включающую бактерии Е. colt BL21(DE3)pLysS и бактериофаг X Ы1, полученные от профессора Королевского университета сельского хозяйства Дании Ю. Джозефсен, а также клеточные линии гепатомы крысы (H4-II-E-C3) из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС, США), «Бетадин» - коммерческий препарат для наружного применения, содержащий 10% повидон-йод (Egis Pharmaceutical, Венгрия). В работе использовали ранее выделенные и охарактеризованные лиофильно высушенные препараты эндонуклеазы бактерий S. marcescens, которые растворяли в 0.1 М Трис-HCl буфере, рН8.5, и разделяли гельхроматографией на колонке с сефадексом G-100 на мономеры и олигомеры. Препарат

изоформы Stnl с активностью 25536 Ед./мл применяли при определении влияния эндонуклеазы в отдельности и в комбинации с «Бетадином» на жизнеспособность вирусов л Ы1 и бактерий S. marcescens. В остальных случаях использовали гомогенные препараты эндонуклеазы с активностью 257600 Ед./мл и 228800 Ед./мл, содержащие практически в равных количествах изоформы Sml и Sm2. Определение нуклеазной активности проводили методом кислоторастворимых фракций согласно рекомендациям (Лещинская И. Б. и др. Биохимия. 1974. - Т. 39. - №1 - С. 116-122).

S. marcescens и В. subtilis выращивали на среде, включающей (г/л): панкреатический гидролизат кильки-10.05, NaCl - 4.95, и при необходимости 2.5 % агара. S. cerevisiae выращивали на среде Сабуро, Е. coli - на среде LB (Sigma, США) с 0.005% ампициллином при необходимости дополненной 2% или 0.8% агаром. Культуру клеток гепатомы выращивали в С02- инкубаторе (с 5 %-ным С02) 3 суток при 37°С в модифицированной по способу Дульбекко ростовой питательной среде ИглафМЕМ; Sigma-Aldrich, США) содержавшей дополнительно 10% FBS - эмбриональной телячьей сыворотки и раствора антибиотиков, включающего 10 000 Ед./мл пенициллина G и 10 мг/мл стрептомицина сульфата (Bottenstein etal. Methods in Enzymology. 1979).

Жизнеспособность 5. marcescens, В. subtilis, S. cerevisiae оценивали прямым подсчетом числа КОЕ, полученных посевом микробных суспензий на твердые питательные среды. Жизнеспособность фагов оценивали прямым подсчетом числа негативных колоний, полученных по методу Грациа (Габрилович И. Г. Методы получения и определения бактериофагов. 1968. с.79). Для оценки жизнеспособности культуры клеток гепатомы применяли метод двойного окрашивания в системе «живой/мертвый», используя набор Live/Dead Cell Viability Kit (Fluka, Швейцария), в ходе которого 10 мкл 5 мкМ ацетоаоксиметилового эфира кальцеина (Calcein-AM) и 5 мкл 5 мкМ пропидий-йодида смешивали с 5 мл натрий-фосфатного буфера, pH 7.0, (PBS) и добавляли по 0.2 мл к исследуемой культуре клеток, предварительно проинкубированной с тестируемыми соединениями и затем промытой 1 раз PBS. После 15 мин инкубации при 37 ° С окрашенные клетки фиксировали 20 мин с помощью 4% параформальдегида и промывали 1 раз PBS. Количественную оценку живых, мертвых и поврежденных клеток проводили прямым подсчетом каждой из флюоресцентных меток не менее чем в 300 клетках опухоли и не менее чем в 10 полях зрения с помощью флюоресцентного микроскопа AxioVision (Carl Zeiss, Германия) при длине волны возбуждения 490 nm.

Изменение морфологии и ультраструктуры клеток S. marcescens под действием «Бетадина» или эндонуклеазы в сочетании с «Бетадином» определяли с помощью электронного микроскопа JEM-!OOCX(JEOL, Япония) при увеличении 28000 и 40000 раз. Для этого бактериальную суспензию (ОП

= 0.46 ед./мл) смешивали с равным объёмом водного раствора «Бетадина», содержавшего 0.002 % повидон-йода, или его смеси с буферным раствором эндонуклеазы. После 15 сек инкубации добавляли 3-х кратным объемом 10% глутарового альдегида в 0.2 М какодилатном буфере, рН 7.2, и инкубировали 30 мин при 8 °С. Затем биомассу отделяли центрифугированием и продолжали подготовку по общепринятой классической схеме (Уикли, Электронная микроскопия для начинающих. 1975. с. 324.), фиксируя в 2.5 % глутаровом альдегиде, затем в 2%-ном растворе 0з04 Далее проводили дегидратацию этанолом и пропитывали смолами: Ероп 812, Э005А, №ЧА, ОМР 30. Полимеризовали образцы в течение 2 суток сначала при 37°., а затем при 60"С. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме «ШгаЮт 3» (ЛКБ, Швеция). Срезы контрастировали 4% уранилацетатом в 70% С2Н5ОН и цитратом свинца.

При определении влияния эндонуклеазы на жизнеспособность вирусов вирусную суспензию смешивали с равным объёмом раствора эндонуклеазы с активностью 10000 Ед./мл в 0.1 М Трис-НС1 буфере, рН8.5, содержащем 0.01 М М§2+, и инкубировали, за исключением опытов по влиянию времени инкубации, 6 мин при комнатной температуре. Затем определяли жизнеспособность. Бактериальную суспензию (ОП = 0.056 ед./мл) или суспензию дрожжей (ОП= 0.07 ед./мл) смешивали с равным объёмом буферного раствора эндонуклеазы и инкубировали 20 мин при исследовании Б.тагсезсепх, 30 мин - В.^мШи, а также 15 и 30 мин - 5. сегел^а. Здесь и далее инкубация с эндонуклеазой проходила при 4-8 ° С. При оценке влияния на жизнеспособность культуры клеток гепатомы 0.2 М Трис-НС1 буфера, рН 8.5, содержащего 0.02 М М§2+ или эндонуклеазы к культуре клеток добавляли по 0.2 мл/лунку буфера или буферного раствора эндонуклеазы с активностью 6440 ЕдУмл, 1288 Ед./мл или 12.88 Ед./мл, инкубировали 15 мин и оценивали жизнеспособность.

При определении влияния «Бетадина» на жизнеспособность вирусов вирусную суспензию смешивали с равным объёмом водного раствора «Бетадина» и инкубировали 6 мин в темноте при комнатной температуре. Затем определяли жизнеспособность. При определении зависимости антивирусного эффекта от времени инкубации, инкубацию проводили при 812° С. При определении действия «Бетадина» на жизнеспособность Б.тагсевсет, а также влияния на эффективность действия присутствия в инкубационной среде, количества повидон-йода, времени инкубации, плотности бактериальной суспензии или фазы роста культуры, «Бетадин» или его раствор смешивали с равным объёмом бактериальной суспензии или культуры, инкубировали 10-15 сек или 30 мин в темноте при комнатной температуре, после чего определяли жизнеспособность. Бактериальную суспензию (ОП = 0.056 ед./мл) смешивали с равным объёмом

раствора «Бетадина» до содержания повидон-йода, соответственно, 0.010.04%. После 35 мин инкубации оценивали жизнеспособность культуры. Суспензию дрожжей (ОП= 0.07 ед./мл) смешивали с равным объёмом неразбавленного (10%) или водного раствора «Бетадина», включавшего 1.0 -0.01% повидон-йода, инкубировали 15 сек или 3 мин при 25-28°С, а затем оценивали жизнеспособность. К культуре клеток гепатомы добавляли по 0.2 мл/лунку раствора «Бетадина», полученного разбавлением 0.5 % NaCl или стерильной дистиллированной водой и включавшего, соответственно, 1 или 0.005 % повидон-йода. После б мин инкубации проводили окрашивание по стандартной методике.

При определении влияния эндонуклеазы в комбинации с «Бетадином» на жизнеспособность вирусов к вирусной суспензии добавляли в равном объеме смесь водного раствора «Бетадина», содержавшего 0.0001% повидон-йода, и буферного раствора эндонуклеазы с активностью 10 000 Ед./мл, которые предварительно смешали в равных частях. После 6 мин инкубации определяли жизнеспособность. Суспензию бактерий S.marcescens (ОП = 0.056 ед./мл) смешивали с равным объёмом композиции, составленной из равных частей буферного раствора эндонуклеазы с активностью 6384 Ед./мл и водного раствора «Бетадина», содержавшего 0.002; 0.01; 0.02 или 0.025 % повидон-йода, инкубировали 20 мин. Суспензию бактерий B.subtilis (ОП = 0.056 ед./мл) смешивали с равным объёмом композиции, составленной из равных частей буферного раствора эндонуклеазы с активностью 11 440 Ед./мл или 1 144 Ед./мл и водного раствора «Бетадина», содержавшего 0.02 % повидон-йода, инкубировали 20 мин. Суспензию дрожжей (ОП = 0.07 ед./мл) смешивали с равным объёмом водного раствора «Бетадина», содержавшего 0.02 % повидон-йода, инкубировали 6 мин, затем смешивали с равным объемом буферного раствора эндонуклеазы с активностью 5720 Ед./мл или 1 144 Ед./мл, и инкубировали 15- или 30 мин. Анализируя комбинированное действие эндонуклеазы и «Бетадина», культуру клеток гепатомы подвергали прямому контакту, как с предварительно подготовленной смесью разбавленного «Бетадина» и раствора эндонуклеазы в 0.2 М Трис-НС1-буфере, pH 8.5, содержавшего 0.02 М Mg2+, так и их последовательно сочетанному действию. Активность эндонуклеазы до смешивания с культурой клеток составляла 6440 ед./мл, 1288 ед./мл или 12.88 ед./мл. Для оценки влияния комбинированного препарата к культуре клеток добавляли по 0.2 мл/лунку смеси, составленной из равных частей буферного раствора эндонуклеазы и раствора «Бетадина», полученного разбавлением 0.5 % NaCl или стерильной дистиллированной водой и включавшего, соответственно, 1 или 0.005 % повидон-йода. После 15 мин инкубации определяли жизнеспособность по стандартной методике. Для оценки последовательно сочетанного действия «Бетадина» и эндонуклеазы и зависимости эффекта от содержания повидон-

йода и ферментативной активности к культуре клеток добавляли по 0.2 мл/лунку раствора «Бетадина», полученного, как описано. Затем после 6 мин инкубации добавляли по 0.2 мл/лунку буферного раствора эндонуклеазы и инкубировали 15 мин.

При определении действия «Бетадина» на активность эндонуклеазы водные или буферные растворы изоформ Sml или Sm2 эндонуклеазы смешивали в равных частях с 10% или разбавленным «Бетадином», инкубировали 3 мин, 6 мин и определяли ферментативную активность. За 100% принимали активность до инкубации.

Статистическая обработка результатов проводили с помощью подпрограммы статистического анализа графической программы Sigma plot 8.0 и программы Microsoft Excel для доверительного интервала 95%. Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием параметрических (оценка достоверности разности td, критерий Стьюдента с поправкой Бонферонни для множественного сравнения). Уровень значимости р=0.05 принимали достаточным для достоверной разницы групп данных. Использовали принципы обработки результатов изучения инактивирующего действия на фаги физических и химических агентов согласно руководствам Бейли (1963) и П. Ф. Рокицкого (1967).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование эффективности действия гомогенной эндонуклеазы

Для исследования эффективности действия эндонуклеазы колоночной хроматографией в разработанных ранее условиях (Галиева Г. М. и др. Учен.зап. Казан. Ун-та. 2011. Т. 153, кн. 2. С.41-50) была выделена фракция мономеров из гомогенных препаратов изоформы Sm 1 и смеси изоформ Sm 1 и Sm2.

Исследование антивирусной активности эндонуклеазы выявило прямую зависимость от величины ферментативной активности в интервале 100 -100 ООО Ед./мл (рис. 1). Наилучший антивирусный эффект - уменьшение жизнеспособности почти в 2 раза - наблюдали при использовании препарата с активностью 100 000 Ед./мл.

Изменение продолжительности инкубации с фаговой суспензией выявило прямую зависимость антивирусного эффекта эндонуклеазы от времени инкубации (рис. 2). Так, через 6 мин инкубации жизнеспособность суспензии сокращалась почти на 40%, через 1 ч - больше, чем в 2 раза, через 6ч- почти в 7 раз, а через сутки наблюдали полную утрату жизнеспособности. Изменение плотности фаговой суспензии в 10 раз не влияло на результат действия эндонуклеазы. Напротив, возрастание ионной силы за счет 5-кратного увеличения содержания Триса увеличивало эффективность действия

эндонуклеазы, вызывая достоверное снижение жизнеспособности суспензии почти на 10%.

120 100 30 60 40 20 0

_ 69.57

59.73

¡¡«я

100 5000

Активность, Ед./мл.

Рис. 1. Изменение жизнеспособности фаговой суспензии под действием эндонуклеазы

Таким образом, гомогенная эндонуклеаза, проявляла выраженную антивирусную активность, величина которой зависела от величины ферментативной активности, продолжительности контакта вирусов с ферментом, и не зависела от плотности вирусной суспензии.

«8

5 -зо

£ 20 £

Время

Рис. 2. Зависимость

эффективности

действия

эндонуклеазы от

продолжительности

инкубации

Анализ действия эндонуклеазы на 5. тагсезсепз показал, что независимо от типа молекулярной формы фермента происходило подавление жизнеспособности культуры, слабо зависящее от ферментативной активности (рис. 3)

зк 70

ш о

а: 60

«;

и 50

3Г

76.85

6384 12768

Активность , Ед./мл

100

ш 60

<5 и 40

X 30

76.79

ЯР

& ■ ¡¡¡Р в

286

2860

57200

Активность, Ед./мл

Рис. 3. Изменение жизнеспособности бактериальной суспензии 5. тагсезсет под действием изоформы 8ш1 (А) и смеси изоформ 8т1 и 8т2 (Б) в зависимости от ферментативной активности

Поскольку на примере энтеробактерий установлено, что подавление жизнеспособности не зависит от типа молекулярной формы эндонуклеазы, в дальнейших исследованиях использовали смесь изоформ 8ш1 и 8т2.

Анализ действия эндонуклеазы на ВяиЬИНэ выявил достоверную зависимость эффекта подавления жизнеспособности от ферментативной активности, что служило сходством с антивирусной активностью и отличием от эффекта подавления жизнеспособности грамотрицательных бактерий. В частности, в результате 30-минутной инкубации бацилл с эндонуклеазой, активность которой составляла 572 или 5720 Ед./ мл, соответственно, жизнеспособность культуры сокращалось более чем на 30 или 50 % (рис. 4 А).

Аналогично, под действием эндонуклеазы происходило подавление жизнеспособности дрожжей Хсегершае (рис. 4 Б), которое зависело как от ферментативной активности, так и времени инкубации. Так после 30 мин инкубации в присутствие эндонуклеазы с активностью 1 144 Ед./мл, жизнеспособность культуры снижалась почти в 2 раза. При увеличении активности в пять раз жизнеспособность культуры уменьшалась почти на 10%. Сокращение времени инкубации в 2 раза повышало жизнеспособность культуры почти на 10 % тогда, когда активность составляла 5720 Ед./мл.

о 40

а:

о 30

ж 20

67.42

43.es

572

Активность, Ед./мл

5720

О ас

о 30

I Акхивность 5720 Ед.. мл

□ Активность 1144 Ед. мл

Время инкубации, мин

Рис. 4. Изменение жизнеспособности клеточной суспензии АлиШи (А) и 5,сеге\'шае (Б) под действием эндонуклеазы

В отличие от микроорганизмов эндонуклеаза не оказывала влияния на жизнеспособность культуры клеток гепатомы, в которой почти 9% клеток были нежизнеспособны: мертвые или поврежденные, - и отличались от преобладающего большинства клеток, окрашенных в зеленый цвет, красной флюоресценцией в области ядра или цитозоля (рис. 5). Картина оставалась прежней, после 15 мин инкубации культуры клеток с 0.2 М Трис-НС! буфером, рН 8.5, содержащим 0.02 М К^или с буферными растворами эндонуклеазы, различающимися ферментативной активностью.

ß >, - и- ^ «. v ' ' j / 1 1 ' Ч.' - .: ' \ - ''

Рис. 5. Культура клеток гепатомы H4-1I-E-C3 до (А) и после (Б) инкубации с буферным растворов эндонуклеазы с активностью 6440 Ед./мл.

1 - затемненная область ядерного материала

2. Оценка эффективности действия растворов «Бетадина» При оценке эффективности действия растворов «Бетадина» на вирусы, была установлена прямая зависимость эффективности антивирусного действия «Бетадина» от концентрации активного вещества (рис. 6). Так, 100%-ный антивирусный эффект, проявлявшийся полной утратой жизнеспособности фагов, получали в контакте с растворами «Бетадина», содержащими, соответственно, 10 или 1% повидон-йода. Снижение содержания повидон-йода до 0.1 - 0.00001% приводило к частичному сохранению жизнеспособности фаговой суспензии, которая, соответственно, составляла 50-85 % от исходной.

100 90 80 70

°„- 60

\о 40 о

О 30 с

Ф 20

S ю

36 О

'Ш

0.00001 0.0001

0.01

т т 0.1

Рис. «Бетадина»

Содержание поеидон йода,%

6. Изменение жизнеспособности фагов под действием растворов

Увеличение плотности вирусной суспензии в 10 раз не оказывало существенного влияния на эффективность действия 0.1% раствора «Бетадина».

Напротив, увеличение времени инкубации фаговой суспензии с «Бетадином», приводило к усилению антивирусного эффекта. Так, в результате 6 мин инкубации, (рис. 7), число жизнеспособных фагов суспензии уменьшалось почти на 25%, через I ч - дополнительно на 20%, через 6 ч -более чем на 80%, а через сутки наблюдали полную утрату жизнеспособности.

контроль

73.6

54.24

14.61

, •• ' 0 - . -,-

Рис. 8.

Зависимость антивирусного действия 0.0001% «Бетадина» от продолжительност и инкубации

Время

При исследовании действия «Бетадина» на Б.тагсе.чсет наблюдали полную утрату жизнеспособности бактериальной суспензии при контакте с 10% «Бетадином» и его водным раствором, содержащим 1% повидон-иода. Снижение содержания повидон-йода до 0.1 - 0.0001% за счет разбавления «Бетадина» водой приводило к сохранению жизнеспособности бактериальной суспензии, которая, соответственно, находилась в пределах 1-50% от исходной величины (рис. 9 А). Добавление в среду Трис-НС1 буфера и, вследствие этого, изменение рН и ионной силы среды сопровождалось увеличением жизнеспособности бактерий в 3.5-12 раз (рис. 9 Б).

Увеличение времени инкубации с 15 сек до 30 мин дополнительно сокращало жизнеспособность суспензии в 1.6 раза, если содержание в среде повидон-йода составляло 0.0002-0.005%. Увеличение оптической плотности бактериальной суспензии сопровождалось пропорциональным снижением ее жизнеспособности при 15-секундном контакте с 0.02% «Бетадином». Установлена зависимость эффективности действия «Бетадина» от фазы роста культуры. Наибольшее подавление жизнеспособности - сокращение почти в 11 раз - наблюдалось под действием 0.02% «Бетадина» в стационарной фазе, наименьшее - почти в 4 раза - в лаг фазе. Жизнеспособность культура в экспоненциальной фазе или фазе отмирания сокращалась под действием 0.02% «Бетадин» в 6 или в 7 раз, соответственно.

Содержание повмдон-йода,%

90 -,-----

0.0002 0.0005 0.001 0.002 0.005 0.01 0.02 0.02! Содержание повидон-йода. %

Рис. 9. Изменение жизнеспособности бактериальной суспензии 5.тагсезсет под действием «Бетадина» в отсутствие ( А) и в присутствие 0.2 М Трис-НС! буфера, рН 8.5, содержащего 0.02 М М§2+ (Б)

Электронно-микроскопическое исследование выявило существенное изменение, как морфологии, так и ультраструктуры бактериальных клеток, возникающее под действием 15-секундной инкубации культуры 0.002% «Бетадином». Так, в микробном материале появлялись клетки округлой формы с размытыми пограничными слоями. Местами наблюдалось отхождение цитоплазматической мембраны внутрьцитозоля (рис. 10). Область нуклеоида выглядела гетерогенной и внешним видом напоминала конденсированный хроматин, встречающийся при апоптозе клеток (рис. 11).

Рис. 10. Электронные фотографии ультраструктуры клеток 5.тагсейсет после инкубации с «Бетадином». Отхождение цитоплазматической мембраны внутрь цитозоля (А); Гетерогенность нуклеоида (Б). Увеличение 40 (А) и 28 тыс. раз (Б).

Результаты анализа действия «Бетадина» иа бактерии В.янЫШз были аналогичны результатам для З.тагсе.чсепв. Хотя снижение жизнеспособности бацилл под действием «Бетадина» было выражено слабее, установлена прямая зависимость эффективности действия «Бетадина» от концентрации повидон-йода (рис. 11). Одновременно показано, что присутствие в инкубационной среде 0.1 М Трис-НС1 буфера, рН 8.5, содержащего 0.01 М М, не оказывало существенного влияния на эффективность действия разбавленного «Бетадина» на суспензию В. .шйп'/г.?.

Содержание гювлдон-йода, %

Рис. 11. Изменение жизнеспособности бактериальной суспензии В. зиЬИНь под действием «Бетадина» в отсутствие Ц и в присутствие 0.1 М Трис~НС1 буфера, рН 8.5, содержащего 0.01 М Mg2*

Исследование действия «Бетадина» на показало, что в

отличие от грамотрицательных бактерий и вирусов 15-секундный прямой контакт не только с 10-1%, но и 0.1% раствором «Бетадина» приводил к полной утрате жизнеспособности клеточной суспензии (рис. 12). Уменьшение

в 500 - 1000 раз содержания повидон-йода в водном растворе «Бетадина» по сравнению с исходным препаратом приводило к частичному сохранению жизнеспособности суспензии. При этом увеличение времени инкубации в 1020 раз не оказывало влияния на эффективность действия растворов.

..........«......юо .......гтг™::::

о 80

^ Рис. 12. Изменение

о 60 I 3119 жизнеспособности

с;

суспензии 8- сегеугь/ае

5 20 ооо под действием

' ( " «Бетадина»

о . Ша 111 ....

К 0.01 0.1 1 10

Содержание повидон-йода, %

Анализ действия разбавленного «Бетадина» на культуру клеток гепатомы показал, что в целом демонстрируя чувствительность к действию «Бетадина», клетки проявляли и большую устойчивость по сравнению с про-и низшими эукариотами. Так, при контакте с 1% «Бетадином» жизнеспособность культуры частично сохранялась. Около 3% клеток имели слабую или остаточную флюоресценцию зеленого цвета (рис. 13 Б), представляя, таким образом, поврежденные и живые клетки: соответственно 2.4±0.4 % и 0.5±0 % от общего числа. А под действием «Бетадина», содержащего 0.005% повидон-йода, количество живых клеток по сравнению с исходной культурой сокращалось в 1.3 раза, процент мертвых и поврежденных клеток увеличивался в 3 и 10 раз, соответственно. И в препарате среди клеток флюоресцирующих зеленым (рис. 13 А) с затемненной областью ядерного материала (1) встречались клетки, у которых область ядра ярко флюоресцировала красным (2), а также структуры без протопласта (3), очевидно, представляющие собой клеточные ядра, окрашенные пропидий-йодидом.

Рис. 13. Культура клеток гепатомы после контакта с 0.005% (А) или 1% повидон-йодом (Б), окрашенная в системе «живой/мертвый»

3. Определение эффективности действия эндонуклеазы в

комбинации с «Бетадином»

Поскольку известно, что йод и йодсодержащие соединения негативно влияют на конформацию и каталитическую активность белков (Alps R. Povidone Iodine Antiseptic Agent. USA, 2004. P. 7-26.), исследовали изменение активности эндонуклеазы под действием «Бетадина». Установлено, что 3- или 6- минутная инкубация водного раствора эндонуклеазы с 10% «Бетадином» уменьшала ДНКазную активность, соответственно, на 30- или 70 %, независимо от типа исследуемой изоформы или присутствия в среде 0.1 M Трис-HCl буфера, pH 8.5, содержавшего 0.0IM MgS04.

При определении эффективности действия эндонуклеазы в комбинации с «Бетадином» условия комбинированного воздействия выбирались на основании результатов, представленных выше. При определении комбинированного действия на вирусы сначала смешивали в равных частях водный раствор «Бетадина» и буферный раствор эндонуклеазы, затем добавляли равный объем вирусной суспензии, и через 6 мин инкубации определяли снижение жизнеспособности. Установлено, что под действием комбинированного препарата жизнеспособность фаговой суспензии уменьшалась на 10%, по сравнению с раствором эндонуклеазы, и на 23% по сравнению с раствором «Бетадина» (рис.14).

73.6

50.12

Рис. 14. Изменение жизнеспособности вирусной суспензии под действием водного

раствора 0.0001%

«Бетадина» (1), буферного раствора эндонуклеазы с активностью 10000 Ед./мл (2), и комбинированного препарата, полученного их смешиванием в равных частях(3)

Результатом сочетанного действия растворов «Бетадина» и эндонуклеазы на бактерии В. яиЬШЫ было увеличение эффективности действия эндонуклеазы почти в 2 раза, а «Бетадина» в 1.2-1.3 раза. Дальнейшее увеличение активности эндонуклеазы практически не влияло на полученный результат (рис. 15).

Рис. 15. Изменение жизнеспособности бактериальной суспензии В. внЫШэ под действием буферного раствора

«Бетадина», содержавшего 0.01% повидон-йода (1), буферных растворов

эндонуклеазы (2) с активностью 11 440 Ед./мл И или 1144 Ед./мл □ и комбинированных

препаратов, полученных их смешиванием в равных частях (3)

Хотя усиление подавления жизнеспособности бактерии Б.тагсезсепэ под действием комбинированного препарата наблюдалось лишь тогда, когда исходная концентрации повидон-йода в разбавленном «Бетадине» была не ниже 0.025% (рис. 16), исследование изменения морфологии и ультраструктуры клеток & тагсеьсет под действием эндонуклеазы в комбинации с 0.002% «Бетадином», показало, что (рис. 17). микробный материал в преобладающем большинстве содержал клетки с искаженной формой: изогнутые, округлые, - а также структуры, напоминающие фрагменты клеток. Довольно часто встречались структуры, напоминающие клетки со «шлейфом», позволяющие предположить вытекание протопласта. В большинстве случаев наблюдалась практически полная утрата границ между периплазмой, цитоплазмой, клеточной стенкой, цитоплазматической мембраной (1) и областью нуклеоида (2), в результате чего клетки представляли собой смесь бессистемно расположенных фрагментов различной электронной плотности. Такой результат позволил констатировать сочетанное действие «Бетадина» и эндонуклеазы, что послужило косвенным свидетельством попадания эндонуклеазы внутрь поврежденных клеток.

79.9

77.3

79.1

30.9

36.4

0.002

0.01 0.02 0.025

Содержание повидон-йода, %

Рис. 16. Изменение жизнеспособности бактериальной суспензии £ тагсе&сет под действием буферных растворов «Бетадина», содержание повидон-йода в которых составляло 0.002% - 0.025 % ■, буферного раствора эндонуклеазы с активностью 6384 Ед./мл и комбинированных препаратов, полученных их смешиванием в равных частях □

Рис. 17. Электронная фотография ультраструктуры клеток 5. тагсеясет после инкубации с «Бетадином», содержавшим 0.002% повидон-йода и последующей инкубацией с эндонуклеазой. Увеличение 40 тыс. раз. Полная утрата границ между периплазмой, цитоплазмой, клеточной стенкой, цитоплазматической мембраной (1) и областью нуклеоида (2)

.¡А»

Показано, что под действием предварительной инкубации суспензии 5. сегел'Шае в присутствии «Бетадина» эффективность действия эндонуклеа:;ы возрастала. Об этом свидетельствовало уменьшение жизнеспособности, соответственно, в 2 и 3 раза, по сравнению с изменениями - под действием буферных растворов эндонукпеазы или Бетадина», взятых по отдельности. Изменение содержания фермента в среде, что подтверждалось повышением ферментативной активности, или времени инкубации с эндонуклеазой не оказывало существенного влияния на результат (рис. 18).

□

Рис. 19. Изменение жизнеспособности клеточной суспензии 5. сеге»тае под действием водного раствора «Бетадина» (1), буферных растворов эндонуклеазы (2) с активностью 1144 Ед./мл П и 5720 Ед./мл Щ и их последовательно сочетанного действия (3). Время инкубации с эндонуклеазой 15 мин (А) и 30 мин (Б)

Анализ действия эндонуклеазы в комбинации с «Бетадином» показал, что в результате контакта культуры клеток со смесью буферного раствора эндонуклеазы и разбавленного «Бетадина» происходило ослабление цитоцидного действия «Бетадина». Напротив, при последовательно сочетанном действии растворов «Бетадина» и эндонуклеазы, эффективность повреждающего действия возрастала. Так, в результате прямого 6-минутного контакта культуры клеток с «Бетадином», содержавшим 0.005% повидон -йода, и последующего контакта с буферным раствором эндонуклеазы количество мертвых клеток достоверно увеличивалось, что свидетельствовало о снижении жизнеспособности культуры клеток (рис. 20). А в результате сочетанного действия раствора «Бетадина», содержавшего 1% повидон-йода, и буферного раствора эндонуклеазы с активностью 1288 Ед./мл, удавалось достичь полной утраты жизнеспособности культуры клеток (4).

□живые оповрежденные имёртвые

Рис. 20. Изменение жизнеспособности культуры клеток гепатомы Н4-П-Е-СЗ под действием водных растворов «Бетадина», содержание повидон-йода в которых составляло 1 % (1) или 0.005 % (2), и последовательно сочетанного действия этих растворов (3-5 и 6-8, соответственно) с буферными растворами эндонуклеазы, активность которых составляла 6440 Ед./мл (3, 6), 1288 Ед./мл (4, 7) или 12.88 Ед./мл (5, 8)

Таким образом, исследование комбинирования эндонуклеазы грамотрицательных бактерий 5 .тагсевсет с «Бетадином» - веществ относящихся к разным классам соединений - позволило создать 1 принципиально новую композицию, под действием которой с высокой эффективностью и широким спектром действия происходило снижение жизнеспособности организмов относящихся к разным таксономическим группам и серьезно отличающихся друг от друга уровнем организации.

I ВЫВОДЫ

1. Установлено, что эндонуклеаза грамотрицательных бактерий 5. тагсе.->сет, представленная смесью мономеров изоформ Бт 1 и 8т2, в концентрации не ниже 5 нМ способна в прямом 20-минутном контакте оказывать подавляющее действие на жизнеспособность микроорганизмов, принадлежащих к группе энтеробактерий, грамположительных эубактерий, дрожжей и вирусов.

2. Эффективность действия растворов «Бетадина» с содержанием повидон-йода 0.1- 0.0001% зависит не только от таксономической принадлежности объектов исследования, но и от длительности контакта с вирусной суспензией, а также фазы роста бактерий и плотности бактериальной суспензии.

3. Изменение жизнеспособности бактериальной суспензии S. marcescens под действием раствора «Бетадина», содержащего 0.002% повидон-йода, связано с изменением морфологии и ультраструктуры клеток, проявляющимся нарушениями мембранных структур, цитоплазмы и ядерного материала.

4. «Бетадин» подавляет активность эндонуклеазы S. marcescens, величина подавляющего эффекта зависит от концентрации раствора «Бетадина», времени контакта с эндонуклеазой и присутствия в инкубационной среде 0.1 M Трис-HCl буфера, pH 8.5, который препятствует уменьшению ферментативной активности.

5. Комбинирование с йодофором «Бетадин» увеличивает эффективность действия эндонуклеазы на организмы, принадлежащие к различным таксономическим группам, и позволяет достичь полного подавления жизнеспособности вирусов и культуры клеток гепатомы H4-II-E-C3.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Зайнутдинова Э. Ф. Анализ действия «Повидон- йода» на бактерии Serratia marcescens / Э. Ф. Зайнутдинова, M. Н. Филимонова. // Ученые зап. Казан. Ун-та. Сер. Естеств. науки. - 2012. - Т. 154, кн.4,- С. 151 -157. - ( перечень ВАК), автора - 0.62 пл.

2. Зайнутдинова Э. Ф. Средство защиты против бактерий Serratia marcescens / Г. M. Гапиева, Э. Ф. Зайнудинова, M. Н. Филимонова // Российский журнал «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии». Санитарная микробиология. - 2012. - №2 (8). - С. 50-53. - (перечень ВАК).

3. Зайнутдинова Э. Ф. Противовирусный эффект эндонуклезы в комбинации с «Бетадином» / Э. Ф. Зайнутдинова, И. О. Рассохина, M. Н. Филимонова// Ученые зап. Казан. Ун-та. Сер. Естеств.науки. - 2013. - Т. 155, кн.З. (перечень ВАК), автора - 0.62 пл.

4. Патент № 243136 РФ. Антивирусный препарат контактного действия на основе «Бетадина» и эндонуклезы : пат. № 243136 РФ С 2 МПК А 61 К С 12 N9 2 2423136 RU / Филимонова M. Н., Зайнутдинова Э. Ф., Рассохина И. А.; заявитель и патентообладатель Филимонова M. Н., ГОУВПО «КГУ им. В. И. Ленина»; заявлено 10.10. 2010, Бюл № 28.; опубликовано 10.07.2011, Бюл № 19. - 7 с.

5. Zainutdinova Е. F. Influence of povidon-iodine on microorganisms of different groups / E F. Zainutdinova, I. O. Rassohina, M. N. Filimonova // Abstracts of First Interuniversity Conference on Modern Biology «BioNews 2008» Kazan: 2008. - P. 37.

6. Зайнутдинова Э. Ф. Структурная организация молекул эндонуклеазы Serratia marcescens в растворах / Материалы X Научной конференции

молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского университета «Материалы и технологии XXI века». - Казань: 2011. -С.150.

Просьба высылать отзывы на автореферат по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание КФУ, отдел аттестации научно-педагогических кадров. Ученому секретарю Диссертационного совета Д 212.081.08 д.б.н., проф. Абрамовой Зинаиде Ивановне, факс: (843) 238-76-01. E-mail автора: ziabramova@mail.ru

Отпечатано в ООО «Печатный двор». г. Казань, ул. Журналистов, 2А, оф.022

Тел: 295-30-36, 564-77-41, 564-77-51. Лицензия ПД №7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 22.10.2013 г. Печ.л. 1,5 Заказ № К-7318. Тираж 100 экз. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зайнутдинова, Эльмира Фаритовна, Казань

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение

высшего профессионального образования КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

УДК 579.842.21:57.042.2:57.021:615.281.8

На правах рукописи

04201450611 ЗАЙНУТДИНОВА ЭЛЬМИРА ФАРИТОВНА

03.02.03 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Филимонова М.Н.

КАЗАНЬ-2013

СОДЕРЖАНИЕ

. ВВЕДЕНИЕ 4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

1.1. Биологические эффекты нуклеаз....................................................................9

1.1.1. К вопросу о биологических эффектах нуклеаз ......................................9

1.1.2. Стимулирующее действие нуклеаз на про- и эукариоты ... 11

1.1.3. Противоопухолевое действие нуклеаз........................................................15

1.1.4. Противовирусное действие нуклеаз............................................................17

1.1.5. Антимикробный эффект эндонуклеазы Serratia marcescens в сочетании с йодохлорином............................................................................................................21

1.2. Характеристика йодофора «Бетадин»..............................................................23

1.3. Основные характеристики эндонуклеазы Serratia marcescens 30

1.4. Заключение....................................................................................................................................35

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 38

2.1. Исследуемое соединение и объекты исследования................................38

2.2. Питательные среды и условия культивирования......................................39

2.3. Подготовка посевного материала и суспензии......................................................39

2.4. Подготовка и выращивание культуры клеток гепатомы H4-II-E-C3 40 2.5. Оценка жизнеспособности............................................................................................40

2.6. Определение эндонуклеазы на жизнеспособность вирусов, бактерий S.marcescens, B.subtilis, дрожжей S.cerevisiae....................................41

2.7. Определение влияния эндонуклеазы на жизнеспособность культуры клеток гепатомы (H4-II-E-C3)........................................................................43

2.8. Определение влияния «Бетадина» на жизнеспособность вирусов, бактерий S.marcescens, B.subtilis, дрожжей S.cerevisiae и культуры клеток гепатомы....................................................................................................................................44

2.9. Определение влияния эндонуклеазы в комбинации с «Бетадином»

на жизнеспособность вирусов, бактерий S.marcescens, B.subtilis, 46

дрожжей S. cerevisiae и культуры клеток гепатомы.......................

2.10. Определение влияния эндонуклеазы в комбинации с «Бетадином» на жизнеспособность культуры клеток гепатомы............47

2.11. Электронная микроскопия и подготовка препаратов для электронной микроскопии..........................................................................................................48

2.12. Определение оптической плотности................................................................49

2.13. Определение действия «Бетадина» на активность эндонуклеазы 49

2.14. Определение ферментативной активности................................................50

2.15. Определение концентрации белка в растворе....................................51

2.16. Статистическая обработка результатов..............................................................51

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 66

3.1. Исследование эффективности действия гомогенной эндонуклеазы 5. тагсеясет на бактерии, вирусы, дрожжи и культуру клеток гепатомы..................................52

3.1.1. Получение препарата эндонуклеазы............................................................................................52

3.1.2. Определение антивирусной активности..............................................................55

3.1.3. Анализ действия эндонуклеазы на бактерии..................................................58

3.1.4. Исследование действия эндонуклеазы на дрожжи £.сегеушае.... 61

3.1.5. Анализ действия эндонуклеазы на культуру клеток гепатомы 62

3.2. Оценка эффективности действия растворов «Бетадина» на бактерии, вирусы, дрожжи и культуру клеток гепатомы..................68

3.2.1. Антивирусный эффект «Бетадина»........................................................................69

3.2.2. Анализ действия «Бетадина» на бактерии........................................................72

3.2.3. Анализ действия «Бетадина» на дрожжи Б. сегеу1Б1ае..............................77

3.2.4. Анализ действия «Бетадина» на культуру клеток гепатомы 78

3.3. Определение эффективности действия эндонуклеазы в комбинации с «Бетадином» на бактерии, вирусы, дрожжи и культуру клеток гепатомы 80

3.3.1. Определение влияния «Бетадина» на активность эндонуклеазы 80

3.3.2. Действие эндонуклеазы в комбинации с «Бетадином» на

жизнеспособность вирусов......................................................................................................83

3.3.3. Действие эндонуклеазы в комбинации с «Бетадином» на жизнеспособность бактерий............................................................................................84

3.3.4. Действие эндонуклеазы в комбинации с «Бетадином» на жизнеспособность дрожжей ^.сегеушае............................................................87

3.3.5. Действие эндонуклеазы в комбинации с «Бетадином» на жизнеспособность культуры клеток гепатомы................................................89

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 95

ВЫВОДЫ 105

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 106

ВВЕДЕНИЕ

- В., 2009) в силу неэффективности традиционной терапии все чаще обращает внимание исследователей к соединениям нового типа и их комбинированию с известными средствами с целью получения высокого фармакотерапевтического эффекта (Аляутдин Р. Н. и др., 2003; Копылов Н. А. и др., 2011). В этом смысле примером может служить внеклеточная эндонуклеаза - биологический катализатор белковой природы грамотрицательных бактерий Serratia marcescens (Franke I. et al., 1999; Филимонова M. Н.,1999; Ghosh М. et al., 2007; Chen С. et al., 2009), проявляющая целый ряд биологических эффектов, механизмы которых до

- конца не познаны (Беляева М. Н. и др., 1977; Габдуллина Г. К., 1980; Панфилова 3. И. и др., 1982; Салганик Р. И. и др., 1985; Дьяченко С. Н. и др., 1988; Щелкунов И. С. и др., 1990; Куприянова-Ашина Ф. Г., 1992; Колпаков А. И., 1992; Куриненко Б. М. и др., 1991).

Представляя собой дезоксирибонуклеат (рибонуклеат) - 5'-нуклеотидогидролазу и выделяясь в ряду аналогичных ферментов чрезвычайно высокой гидролитической активностью по отношению к высокомолекулярным ДНК и РНК, эндонуклеаза служит реактивом для молекулярно-биологических исследований, а также применяется в т пчеловодстве в качестве противовирусного препарата (Панфилова 3. И. и др., 1983; Детиненко JI. Д. и др, 1995; Kalyuzhny А., 2005). Изучение ее противовирусного эффекта показало перспективность использования не

только при болезнях вирусной этиологии пчел, но и животных (Аликин Ю. С. и др., 1998).

Комбинирование эндонуклеазы с «Йодохлорином» - эффективным дезинфектантом, представляющим йодсодержащий электроактивированный солевой раствор - приводило не только к возрастанию противовирусной активности (Филимонова M. Н. и др., 2006), но и к расширению спектра действия фермента, вероятно за счет взаимодополнения механизмов и мишеней действия. Созданная принципиально новая композиция представляла практический интерес, так как отличалась высокой вирулицидной и микробоцидной активностью без выраженной видоспецифичности и была активна при мягких физиологических условиях (Филимонова M. Н. и др., 2009).

Несмотря на массу положительный качеств «Йодохлорина»: безвредность для эукариот, отсутствие отрицательного влияния на пассивный и поствакцинальный иммунитет (Фаткуллова А. А. и др., 2005), способность к самоинактивации (Шишко А. А., 2004; Угрюмова В. С. и др., 1995), образование пор в результате контакта с клеточными мембранами и т.д., - значительное снижение каталитической активности эндонуклеазы даже при ее кратковременном прямом контакте с «Йодохлорином» стало основной причиной создания новой аналогичной композиции, где роль йодосодержащего реагента отводилась повидон-йоду в составе средства «Бетадин». Известно, что «Бетадин» находит широкое применение в медицине, производится фармацевтичекой промышленностью и обладает идентичным «Йодохлорину» механизмом и широким спектром действия (Alps R., 2004; William A. et al., 2008). Есть сведения о эффективности его применения для профилактики вторичного опухолевого роста при проведении абдоминальных операций на животных (Sindelar W. F. et al., 1985; Tsunoda A. et al., 1997, 1999). Таким образом, изложенное обосновывает актуальность исследования цель которого состояла в оценке антибактериального, антивирусного, антимикотического и

противоопухолевого эффекта эндонуклеазы Serratia marcescens в комбинации с «Бетадином».

В связи с поставленной целью решали следующие задачи:

3. Подобрать условия эффективного действия эндонуклеазы в комбинации

с «Бетадином» на организмы разных таксономических групп.

Научная новизна. Впервые исследовано влияние мономеров гомогенной эндонуклеазы на жизнеспособность организмов различных таксономических групп: вирусы (фаг X ЬП), бактерии грамотрицательные {Serratia marcescens) и грамположительные (Bacillis subtilis), низшие эукариоты (дрожжи Saccharomyces cerevisiae), а также высшие эукариоты (культура клеток гепатомы H4-II-E-C3) и установлено снижение жизнеспособности всех исследованных организмов кроме культуры клеток гепатомы. Показано, что подавляющее жизнеспособность действие эндонуклеазы не зависит от типа молекулярной формы фермента. Впервые установлена возможность комбинирования эндонуклеазы и «Бетадина» и показано, что после их прямого 6 мин контакта сохраняется не менее 30% ферментативной активности независимо от типа изоформы. Исследовано изменение морфологии и ультраструктуры бактериальных клеток под действием «Бетадина» и выявлено нарушение мембранных структур, цитоплазмы и ядерного материала Впервые продемонстрирована эффективность действия «Бетадина» в щелочной среде и показано, что 1% «Бетадин» вызывает полное подавление роста и жизнеспособности всех исследованных организмов, кроме культуры клеток гепатомы. Показано, что

в результате комбинированного действия эндонуклеазы и «Бетадина» подавление жизнеспособности всех исследованных организмов усиливается. Подобраны условия 100% подавления жизнеспособности культуры клеток гепатомы H4-II-E-C3.

Решение поставленных задач позволило сформулировать следующие основные научные положения, выносимые на защиту:

1. Прямой контакт клеток про- и низших эукариот с мономерами гомогенной эндонуклеазы приводит к подавлению жизнеспособности культуры.

3. В результате прямого 6 мин контакта эндонуклеазы с «Бетадином» происходит не полное, а лишь частичное снижение ферментативной активности; остаточная активность составляет не менее 30% независимо от типа изоформы.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на Первой межуниверситетской конференции по современной биологии «Bionews» (Kazan, 2008); X Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского университета «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2011).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в числе которых 1 патент, 3 статьи (ВАК), 2 тезиса.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 136 страницах и включает в себя: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, выводы, список использованной литературы (275 источников, в том числе 125 иностранных). Диссертация содержит 4 таблицы и 35 рисунков.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Биологические эффекты нуклеаз 1.1.1. К вопросу о биологических эффектах нуклеаз

Известно, что степень выраженности биологических эффектов какого-либо фермента на клеточном уровне зависит от его способности к контакту с клеткой, который определяется совокупностью, как свойств цитоплазматической мембраны клетки, так и физико-химических свойств самого фермента. Это предполагает, что изменение любого элемента указанной совокупности свойств, например, физико-химических свойств фермента или оказывающих на них влияние условий среды, может существенным образом отразиться на эффективности взаимодействия фермента с клеткой, и, следовательно, на его биологическом действии.

Примером ферментов, у которых, вероятно благодаря перечисленным выше качествам, известен целый ряд биологических эффектов, являются нуклеазы - многочисленная группа, привлекающая внимание исследователей в качестве биологически активных веществ и потенциальных лекарственных препаратов (Лещинская И. Б. и др., 1991).

Широко известно, что основная функция нуклеаз заключается в гидролизе фосфодиэфирной связи в определенном участке полинуклеотида, служащего основным элементом ДНК или РНК. Известно, что присутствие в среде бактериальной эндонуклеазы ускоряет нарушение фосфодиэфирных связей ДНК и РНК по сравнению с их спонтанным разрушением в 1016 раз. Благодаря своей основной функции нуклеазы принимают участие в ряде молекулярно-биологических процессов, включая катаболизм нуклеиновых кислот, апоптоз, репликационно-репарационные процессы (и пр.), внешним проявлением которых является как рост и развитие, так и гибель организмов (Коваленко Г. А., 1986; Луцкая А. Ю. 1997; Ильинская О. Н., 1998; Urbano А. et al., 1998; Wolf В. В. et al., 1999; Kohler A. et al., 2002; Evans С. J. et al., 2003; Terman A. et al., 2006).

Показано, что нуклеазы вызывают стимуляцию гемопоэза и пролиферации некоторых клеток высших эукариот (Куриненко Б. М. и др., 1991). Стимулирование роста и деления клеток некоторые авторы связывали с небольшим повышением ДНКазной активности в организме за счет добавления в среду ферментов нуклеаз в низких концентрациях (Brody S., 1958; Zahn R. К. et al., 1960; Трухачев А. А., 1968; Беляева М. И. и др., 1976). В пользу этого заключения свидетельствует факт, установленный Бенбоу и Форд, которые еще в 1975 г. показали, что во время активной пролиферации эукариотических клеток в их цитоплазме накапливается белковый фактор, инициирующий синтез ДНК, - эндонуклеаза (Benbow R et al., 1975). Регуляция синтеза ДНК, по их мнению, зависит от концентрации инициирующего фактора и от числа доступных мест инициации репликации ДНК. Интенсивному обновлению и росту клеток, по мнению ряда других авторов, должны были способствовать однонитевые разрывы на молекуле нуклеиновой кислоты, которые могли быть дополнительными точками репликации ДНК (Парибок В. Т. 1970; Сойфер В. Н., 1974; Фрадкин Г. Е. и др., 1982). Показано, что в зависимости от концентрации нуклеазы стимулировали или ингибировали размножение клеток микроорганизмов-(Солдатова Н. Г. и др., 1972; Добротина Н. А. и др., 1992; Колпаков А. И. и др. 1992). Поскольку в регуляции роста и деления бактерий существенную роль играет репликация ДНК (Yoshikawa Н. et al., 1968; Gillian F. D., 1975; Benjamin L., 2004), стимулирующее действие нуклеолитических ферментов, как было установлено, обусловлено их влиянием на синтез ДНК (Куприянова Ф. Г. и др., 1979). В частности, показано, что способность эндонуклеаз вызывать эффект стимуляции размножения микробных клеток, который является следствием возникновения в хромосоме однонитевых разрывов, ведущих к усилению синтеза ДНК, объясняется не специфичностью нуклеаз, а чувствительностью области origin хромосомы к действию этих ферментов. Было продемонстрировано, что скорость синтеза ДНК при изменениях скорости роста зависит от частоты инициации цикла репликации хр

Информация о работе

Зайнутдинова, Эльмира Фаритовна
кандидата биологических наук
Казань, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Анализ действия эндонуклеазы в комбинации с "бетадином" на клетки организмов различных таксономических групп - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы