Эндонуклеазы WEN1 и WEN2 и адениновая ДНК-метилтрансфераза WAD из проростков пшеницы

Федореева, Лариса Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Эндонуклеазы WEN1 и WEN2 и адениновая ДНК-метилтрансфераза WAD из проростков пшеницы
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Эндонуклеазы WEN1 и WEN2 и адениновая ДНК-метилтрансфераза WAD из проростков пшеницы"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА логический факультет

005049513

ФЕДОРЕЕВА ЛАРИСА ИВАНОВНА

На правах рукописи

ЭНДОНУКЛЕАЗЫ WEN1 И WEN2 И АДЕНИНОВАЯ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗА WAD ИЗ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ

Специальность: 03.01.05 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

| ФЕВ 2013

Москва-2013

005049513

Работа выполнена в НИИФХБ имени А.Н.Белозерского Московского Государственного Университета им. М.ВЛомоносова и ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор, член-корр. РАН Ванюшин Б.Ф.

доктор биологических наук, профессор Бурьянов ЯМ.

доктор биологических наук, профессор Кузнецов В.В.

доктор биологических наук, профессор Колесников А.А.

РГАУ МСХА им. К.А.Тимирязева

2013 года на заседании

Защита состоится

диссертационного совета Д 50Ї.001.46 при Московском государственном университете им. М.ВЛомоносова по адресу: 119899 Москва, Воробьевы Горы, МГУ, Биологический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.ВЛомоносова

Автореферат разослан «__»_2013 года

Ученый секретарь '

Диссертационного совета, к.б.н. М.А. Гусаковская

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы: Нуклеазы - один из самых многочисленных и разнообразных классов ферментов, расщепляющих фосфодиэфирную связь в нуклеиновых кислотах. Они участвуют во многих генетических процессах, включая репликацию, репарацию, рекомбинацию, а также осуществляют гидролиз чужеродного генетического материала, который может быть использован клеткой для синтеза новых нуклеиновых кислот. К сожалению, растительные эндонуклеазы все еще относительно мало изучены. Поэтому поиск, выделение, изучение структуры, каталитических свойств и функциональных особенностей этих растительных ферментов являются актуальными и имеют большое научное и практическое значение. Для решения многих проблем физиологии и молекулярной биологии растений и биотехнологии нужны нуклеазы с заданными и разнообразными специфическими свойствами. В последние годы нуклеазы нашли применение в медицине, как лекарственные препараты, и сельскохозяйственной биотехнологии.

Способность растительных эндонуклеаз распознавать разные по статусу метилирования ДНК оставалась неизвестной. Изучение этой возможной особенности нуклеаз растений представлялось очень важным и интересным, потому что растительные ДНК в клетке сильно метилированы. В ДНК растений наряду с 5-метилцитозином ранее был выявлен Ыб-метил аденин, однако его происхождение было неясным и вообще было неизвестно - существуют ли у растений ферменты адениновые ДНК-метилтрансферазы. Модификация ДНК по адениновым основаниям в бактериях является существенным элементом системы рестрикции-модификации и вовлечена в процессы регуляции репликации и транскрипции.

Цель работы: Целью работы является выделение и характеристика эндонуклеаз и адениновой ДНК-метилтрансферазы из везикулярной фракции проростков пшеницы, являющихся маркерами апоптоза в растениях, определение субстратной и сайтовой специфичности ферментов, каталитического механизма действия эндонуклеаз, возможной модуляции активности эндонуклеаз 8-аденозил-/,-метионином (SAM), гистонами из пшеницы, короткими пептидами и определение функциональной роли ферментов.

Научная новизна и практическая ценность работы: Выделенная из везикул проростков пшеницы адениновая ДНК-метилтрансфераза является первой эукариотической адениновой ДНК-метилтрансферазой. Ферменты WEN1 и WEN2, выделенные из того же объекта, являются новыми бифункциональными эндонуклеазами, которые чувствительны к статусу метилирования ДНК, и их активность модулируется SAM. Действие эндонуклеаз WEN1 и WEN2 модулируется гистоном HI и коровыми гистонами, а также короткими пептидами. WEN1 и WEN2 обладают сайтовой и структурной специфичностями и слабой экзонуклеазной

активностью. Благодаря сайтовой специфичности действия эндонуклеазы и адениновая ДНК-метилтрансфераза могут найти применение в генной инженерии и биотехнологии.

Структура диссертации: Диссертация состоит из пяти частей 1) введение, 2) обзор литературы, 3) материалы и методы исследования, 4) результаты и их обсуждение и 5) заключение. Работа дополнена выводами и списком литературы (1017 ссылок). Работа иллюстрирована 128 фотографиями, схемами, рисунками, спектрами и хроматограммами. Кроме того результаты работы представлены в 30 таблицах.

Объект исследования: Проростки злаков оказались уникальной и очень удобной моделью для изучения физиолого-биохимических механизмов роста и развития растений: рост и развитие проростков могут быть легко синхронизированы. Кроме того, колеоптиль злаков существует относительно короткое время и относительно быстро погибает по мере формирования и роста проростка. Поэтому колеоптиль служит хорошей естественной природной моделью органоптоза и апоптоза у растений. Апоптоз у пшеницы сопровождается возникновением в клетках особых структур цитоплазматичеких везикул, в которых происходит интенсивная репликация митохондриальной ДНК. Другим характерным маркером апоптоза является межнуклеосомная фрагментация ядерной ДНК. Именно из таких везикул проростков пшеницы сорта Мироновская 808 нами и были выделены эндонуклеазы WEN1, WEN2 и адениновая ДНК-метилтрансфераза.

Нуклеазная активность в колсоптнлях при развитии проростков пшеницы. Влияние этрела и ионола (ВНТ). Апоптоз представляет собой генетически детерминированную гибель клеток и является обязательной интегральной частью процесса развития растений. В самом процессе апоптоза можно выделить три стадии: индукционную, зависящую от природы смерть-индуцирующего сигнала, эффекторную, в течение которой активируется механизм самоуничтожения клетки, и деградационную, в процессе которой клетки претерпевают необратимые биохимические и морфологические изменения. Нуклеазы являются одними из главных участников процесса апоптоза. Из графиков изменения нуклеазной активности (НА) в процессе развития проростков видна четко выраженная цикличность изменения НА (рис.1). Можно выделить три пика изменений НА, которые коррелируют с известными стадиями роста и развития колеоптиля, включая апоптоз.

Можно полагать, что обнаруженное увеличение НА к 5-у дню развития проростка определяется синтезом или активацией эндонуклеаз, расщепляющих ДНК на крупные фрагменты. Резкое увеличение НА, наблюдаемое после 6-го дня развития проростка, связано, скорее всего, с действием набора нуклеаз, ответственных за межнуклеосомную и более глубокую деградацию яДНК. Продуцент фитогормона этилена - этрел

ICKXXl

•xxto

ÄOOö /ООО ЫХЮ

МЮО

ЗЖЮ 3ÖOO lOOO

Рис. 1. Нуклеазная активность в колеоптилях пшеницы. 1 - контроль; 2-колеоптили, выросшие в присутствии этрела; 3- колеоптили, выросшие в присутствии ВНТ.

приводит к резкому увеличению НА и более раннему апоптозу (примерно на 48 час) (рис.2).

КОНТ f >C )J l t:.

Этреп

Рис. 2. Электрофореграммы ДНК из колеоптилей этиолированных проростков пшеницы, выращенных без и в присутствии ВНТ (2,3 х НГ'М) и этрела (10~2М).

Антиоксидант ВНТ замедляет рост НА в колеоптилях, что приводит к появлению первых признаков фрагментации ядерной ДНК только после 8-го дня развития проростка. Таким образом, фитогормон этилен и антиоксидант ионол контролируют уровень суммарной нуклеазной активности и тем самым могут быть вовлечены в регуляцию апоптоза у проростков пшеницы.

Выделение и очистка эндонуклеаз WEN1 и WEN2. Везикулы из 8-ми дневных колеоптилей этиолированных проростков пшеницы отделяли от ядер и митохондрий дробным центрифугированием гомогенатов клеток. Нуклеазная активность была экстрагирована из полученных цитоплазматических везикул и очищена последовательно с помощью ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе, гельфильтрации на Superdex-200 и Superdex-75 и хроматографии на Toyopearl HW-50. В результате выделены две белковые фракции, обладающие нуклеазной активностью. Один из ферментов, названный WEN2, имел кажущуюся мол. массу около 43 кДа, другой, названный WEN1, имел кажущуюся мол.массу

около 27 кДа. В нативном ПААГ-электрофорезе (без ЗБв) была обнаружена полоса на уровне 54 кДа, что позволило предположить, что этот фермент имеет димерную структуру и состоит из двух гомогенных субъединиц (рис.

3).

маркеры WEN1 WEN2 WEN2 WEN1 WEN1 +

WEN2

kDa +СІ5ДНК +dsflHK +ssflHK

Рис. 3. Электрофореграммы в SDS-ПААГ WEN1 и WEN2 и нуклеазной активности WEN1 и WEN2 в геле с вплавленной в гель нативной и денатурированной тимусной ДНК.

Характеристика эндонуклеаз WEN1 и WEN2. 1. Субстратная специфичность эндонуклеаз WEN1 и WEN2.

Нуклеазы WEN1 и WEN2 расщепляют ДНК как из растительного материала, так и из животного. Образование высокомолекулярных фрагментов ДНК, свидетельствующее о расщеплении ДНК внутри цепи, позволяет отнести нуклеазы WEN1 и WEN2 к эндонуклеазам. Эндонуклеаза WEN2 расщепляет

кеметклированнаяДНК метилированная ДНК

фягалямода фйгалямбдэ

1234. 5 в 7 1234 S а 7

Рис. 4. Электрофореграмма ДНК и продуктов ее гидролиза в 1,2 % агарозе. 1 - контроль (ДНК), 2-1+ WEN2, 3 -2 в присутствии 3 мМ Mg2+, 4 -2 в присутствии 1 мМ SAM, 5-1+ WEN1, 6 - 5 в присутствии 3 мМ Mg2+, 7 -5 в присутствии 1 мМ SAM.

двутяжевую (ds) ДНК, а эндонуклеаза WEN1 дву- и однотяжевую (ss) ДНК. Кроме того, WEN1 обладает слабой рибонуклеазной активностью. В присутствии ионов магния эндонуклеазы расщепляют ДНК до

низкомолекулярных дезоксирибоолигонуклеотидов ;(ДРОН) и мононуклеотидов. С помощью высокоэффективной хроматографии на колонке С-18 в градиенте концентрации ацетонитрила (0-100%) продуктов гидролиза ДНК эндонуклеазами в присутствии 3 мМ MgCl2 были обнаружены мононуклеотиды. Значит, эндонуклеазы WEN1 и WEN2 могут также проявлять экзонуклеазную активность.

Таким образом, эндонуклеазы WEN1 и WEN2 являются бифункциональными ферментами, обладающими высокой эндонуклеазной и слабой экзонуклеазной активностью.

Эндонуклеаза WEN2 предпочитает в качестве субстрата неметилированную ДНК (dam", dem") X фага. Наоборот, эндонуклеаза WEN1 преимущественно гидролизовала метилированную по сайтам Gm6АТС и CWCWGG (dam+, dcm+) ДНК X фага (рис. 4).

Ферменты WEN1 и WEN2 - первые описанные эндонуклеазы эукариот, которые распознают субстратные ДНК по статусу метилирования. Этот феномен известен для высокоспецифичных бактериальных и протозойных (Chlamido monas) рестрикционных эндонуклеаз, принадлежащих к системе рестрикции-модификации (R-M).

2. Зависимость нуклеазных активностей от ионов металлов, pH, температуры и SAM.

Ионы Zn2+ полностью ингибировали активность эндонуклеаз WEN1 и WEN2 во всех случаях даже при низких концентрациях. Таким образом, эндонуклеазы WEN1 и WEN2 из проростков пшеницы явно не относятся к Zn2+- зависимым эндонуклеазам.

Ионы Mg2+ увеличивают активность эндонуклеаз WEN1 и WEN2. В присутствии ионов Mg2+ увеличивается выход низкомолекулярных продуктов гидролиза ДНК. Состав продуктов гидролиза ДНК эндонуклеазами зависит от концентрации ионов Mg2+. В присутствии ионов Mg2+ обе эндонуклеазы расщепляют как метилированную, так и неметилированную ДНК X фага практически в равной степени (рис. 4).

Ионы Са2+значительно активируют эндонуклеазу WEN1 практически в равной степени, как ионы Mg2+. Но в отличие от WEN1, ионы Са2+ заметно ингибировали активность эндонуклеазы WEN2, даже в концентрации 1 мМ. Ионы Мп2+, напротив, активируют эндонуклеазу WEN2 и ингибируют, хотя и незначительно, эндонуклеазу WEN1. Таким образом, катионы влияют на активность эндонуклеаз WEN1 и WEN2 и эти ферменты можно отнести к Са2+, Mg2+-3aBHCHMbiM эндонуклеазам.

ЭДТА в реакционной среде приводит к полному ингибированию активности как эндонуклеазы WEN1, так и эндонуклеазы WEN2. Увеличение ионной силы путем добавления NaCI или KCl в концентрации от 10 до 100 мМ также приводит к ингибированию ферментативной активности эндонуклеаз. Даже добавление ионов дивалентных металлов в среду с высокой ионной силой не приводит к увеличению активности эндонуклеаз.

Эндонуклеаза WEN1 имеет два pH-оптимума в узких диапазонах pH

приблизительно от 6,5 до 7.2 и около 9,7-10,2. Наличие двух рН-оптимумов может свидетельствовать о существовании двух форм фермента -(мономерной и димерной). Нельзя исключать и влияние ионизированных остатков тирозина на активность WEN1. Ионы магния в реакционной среде увеличивают 1 pH-устойчивость фермента. Переход от терминальных значений pH к нейтральным приводит к восстановлению активности WEN1, что указывает на высокую стабильность этого фермента. В отличие от WEN1, эндонуклеаза WEN2 имеет только один pH-оптимум (в нейтральной области 6,8-7,7), диапазон которого увеличивается при добавлении к реакционному раствору ионов Mg2+. В отличие от WEN1, переход от терминальных значений pH к нейтральным не восстанавливает активность фермента, что указывает на нестабильность WEN2 по отношению к pH.

Оптимальной температурой гидролиза ДНК обеими эндонуклеазами, при которой образуются более низкомолекулярные продукты, является 37 С. При комнатной температуре ни эндонуклеаза WEN1, ни эндонуклеаза WEN2 практически не гидролизуют ДНК независимо от статуса метилирования и даже присутствие ионов Mg2+ не приводит к существенному увеличению активности ферментов. Гидролиз ДНК эндонуклеазой WEN2 при 65°С приводит к заметному увеличению выхода более высокомолекулярных ДРОН по сравнению с набором ДРОН при 37°С. Даже увеличение времени гидролиза не приводит к уменьшению размеров ДРОН. В отличие от эндонуклеазы WEN2, продукты гидролиза ДНК, особенно метилированной, ферментом WEN1 при 65°С заметно не отличаются от продуктов гидролиза ДНК при 37°С. Таким образом, WEN1 более стабильна при повышении температуры, чем WEN2.

SAM, а также его производные - SAH (S-аденозил- L -гомоцистеин) и SiBA (S-изобутиладенозин), которые не содержат активной метильной группы, модулируют активность растительных эндонуклеаз WEN1 и WEN2. Так, SAM значительно активирует WEN2 при гидролизе ДНК фага X (dam", dem') и (dam+, dcm+) (рис. 4). В присутствии SAM гидролиз эндонуклеазой WEN2 ДНК независимо от статуса ее метилирования осуществляется практически целиком до олигомеров размером 120-140 пн. SAM также модулирует активность эндонуклеазы WEN1 независимо от статуса метилирования ДНК, но в отличие от WEN2, присутствие SAM в реакционной среде приводит к ингибированию активности WEN1. Таким образом, статус метилирования ДНК и аллостерическое влияние SAMa -донора метальных групп для метилирования, в том числе и ДНК - являются эффективными регуляторами активности WEN1 и WEN2 in vitro, а возможно, и in vivo.

SAH стимулирует WEN1, что проявляется в образовании ДРОН длиной в 120-140 пн. SAH в низких концентрациях также стимулирует гидролиз фаговой ДНК ферментом WEN2, но в меньшей степени, чем WEN1, особенно при гидролизе метилированной ДНК. Интересно отметить, что другой структурный аналог SAM - SiBA - также активирует обе эндонуклеазы, хотя и в разной степени. Тем не менее, стимуляция гидролиза вполне заметна, и

эти агенты при определенных условиях, как и SAM, могут выступать в качестве модуляторов активности эндонуклеаз WEN1 и WEN2. Можно предположить, что в эндонуклеазах WEN1 и WEN2 существуют специфические участки - регуляторные домены, отвечающие за связывание с SAM, подобно эндонуклеазам рестрикции (и метилтрансферазам).

Локализация и изменение активностей эндонуклеаз WEN1 и WEN2 в субклеточных структурах колеоптилей в процессе развития проростков пшеницы.

Нуклеазная активность WEN1 обнаружена во всех изученных нами субклеточных структурах (свободные митохондрии, митохондрии в везикулах, ядра) колеоптиля. Нуклеазная активность другой эндонуклеазы -WEN2 выявлена только в ядерной и везикулярных фракциях. Динамика изменения нуклеазной активности в разных структурах в процессе развития проростков позволяет судить о времени индукции и/или активации индивидуальных нуклеаз (рис. 5).

54 кда 4ЭкДа 2/ кда ,

100

1 бо

1 20

і 100

1 ВО

во

І ДО

І. 100

s 80

1 во

Л ДО

9КШІШ Шшж

¡1 3

2 шш а : 1 2 ...., L-JS шШ ¿Ь3

3-й 5-й 7-м to

43 кДа

54 кДа

27 кДа

tO-іЛ день.

Рис. 5. Динамика нуклеазной активности полипептидов с мол. массой 43 кДа, 54 кДа и 27 кДа в субклеточных структурах колеоптилей проростков. 1 - ядерная фракция, 2 - везикулярная фракция, 3 — фракция свободных митохондрий.

На основе данных по динамике нуклеазной активности ферментов в разных структурах предложена схема локализации эндонуклеаз WEN1 и WEN2 в процессе развития проростков (рис. 6). Эндонуклеаза WEN1 в молодых проростках локализуется в свободных митохондриях, но в процессе развития фермент высвобождается из митохондрий и накапливается в ядерной и везикулярной фракциях. Эндонуклеаза WEN1, вероятно, может появляться в везикулярной фракции также внутри целых митохондрий.

ВЕЗИКУЛЫ

ЯДРА

Рис. 6. Предполагаемая субклеточная локализация эндонуклеаз WENJ и

WEN2.

Эндонуклеаза WEN2 в молодых проростках локализуется только в ядерной фракции. В старых апоптозных колеоптилях активность WEN1 и WEN2 в ядерной фракции падает и увеличивается во фракции везикул.

Функциональная роль эндонуклеаз WEN1 и WEN2. Возможное участие в апоптозе.

Мы считаем, что эндонуклеазы WEN1 и WEN2 принимают участие в апоптозе, осуществляя межнуклеосомную фрагментацию и последующую деградацию ядерной ДНК. Об этом, в частности, свидетельствуют их локализация в ядре клеток стареющих апоптозных колеоптилей, резкое увеличение их активности при апоптозе и индукция их активности гормоном старения - этиленом. Мы установили, что в изолированных ядрах эндонуклеаза WEN2 расщепляла ДНК на крупные фрагменты. В этих

12 3 4 5

Рис. 7. Активность эндонуклеаз WEN1 и WEN2 на изолированных ядрах из 3-х дневных проростков пшеницы. 1 - изолированные ядра, 2 - 1 + ДНКаза1, 3 -1+WENI + WEN2, 4 -1+ WEN2, 5 - 1+WEN1. Маркеры в тыс.пн.

условиях эндонуклеаза WEN1 гидролизовала ДНК хроматина на более короткие фрагменты. При одновременном воздействии эндонуклеаз WEN1 и WEN2 на ядра проростков пшеницы выявляется четкая картина деградации

яДНК с образованием фрагментов, кратных по длине примерно 140 пн. (рис.7).

Таким образом, найденные нами эндонуклеазы из проростков пшеницы фрагментируют ДНК в хроматине по межнуклеосомным участкам, образуя так называемую «лестницу» из фрагментов ДНК, и, следовательно, они могут быть активными участниками процесса апоптоза.

Сайтовая специфичность действия эндонуклеаз WEN1 и WEN2.

Сайтовая специфичность действия растительных эндонуклеаз практически не изучена. Имеются лишь указания на то, что у растений эти ферменты, в отличие от известных бактериальных эндонуклеаз рестрикции, выраженной сайтовой специфичностью действия не обладают. При анализе продуктов гидролиза ДНК X фага эндонуклеазами WEN1 и WEN2 с помощью электрофореза в агарозном геле четких дискретных полос (фрагментов ДНК) не выявлено (рис. 4). Это может, в частности, объясняться наличием большого количества относительно коротких сайтов в ДНК, которые распознаются и расщепляются эндонуклеазами WEN1 и WEN2.

Для изучения сайтовой специфичности ферментов были синтезированы ДРОН с разной последовательностью, а также нуклеотиды с флуоресцентным зондом FAM- 5,6-карбоксифлуоресцеином. Анализ продуктов гидролиза синтетических ДРОН эндонуклеазой WEN1 выявил, что сайтом, по которому происходит расщепление фосфодиэфирной связи, является CNG (рис. 8). При гидролизе ферментом WEN1 разных ДРОН,

12345678

Рис. 8. Электрофореграммы в 20% -ном полиакриламидном геле олигонуклеотидов с одним CNG сайтом и продуктов их гидролиза эндонуклеазой WEN1: 1 - CGC GCG CGC GCG GCG CGC GCG CGC, 2 -продукты гидролиза 1, 3 - CGC GCG CGC GCA GCG CGC GCG CGC, 4 -продукты гидролиза 3, 5 - CGC GCG CGC GCT GCG CGC GCG CGC, 6 -продукты гидролиза 5,7- CGC GCG CGC GCC GCG CGC GCG CGC, 8 -продукты гидролиза 7. a - двутяжевые, б — однотяжевые олигонуклеотиды

содержащих только один CNG сайт (CGC GCG CGC GCG GCG CGC GCG CGC, CGC GCG CGC GCA GCG CGC GCG CGC, CGC GCG CGC GCT GCG CGC GCG CGC и CGC GCG CGC GCC GCG CGC GCG CGC), возникают два сходные по длине фрагмента, которые на геле представлены одной полосой

щрц

(второй не виден). В контроле эти исходные ДРОН представлены двумя компонентами, один из которых является двутяжевым (я), а другой однотяжевым (б). Под действием фермента двутяжевые структуры в ДРОН с CGG, CTG и CCG, но не с CAG сайтами исчезают полностью. Эндонуклеаза WEN1 гидролизует метилированные и полуметилированные двутяжевые структуры, содержащие 5-метилцитозин (m CAG и т CTG) в большей степени, чем неметилированные. Фермент способен гидролизовать и однотяжевые ДРОН, но в этом случае он предпочитает неметилированные субстраты.

Это первый случай обнаружения и выделения эндонуклеазы высших эукариот, обладающей выраженной сайтовой специфичностью действия. Фермент гидролизует ДРОН по CNG сайтам, расщепляя фосфодиэфирную связь между остатками С и N (N - G, А, Т, С) в любом близлежащем нуклеотидном окружении, за исключением сочетания CCCG. Не исключено, что действие этого фермента может быть связано или даже скоординировано с действием ДНК-метилтрансферазы СМТЗ, которая метилирует цитозиновый остаток в CNG последовательности ДНК. Метилирование именно этой последовательности играет важную роль в организации хроматина и специфической регуляции экспрессии ряда генов у растений и животных в норме и при различных стрессовых ситуациях. Поскольку действие эндонуклеазы WEN1 может подавляться SAM, логично предположить, что под влиянием SAM в условиях благоприятных собственно для метилирования ДНК активность WEN1 должна быть понижена, чтобы, по-крайней мере, обеспечивалась целостность ДНК структур, метилируемых или прометилированных ДНК-метилтрансферазой СМТЗ.

24 H 20 H 18 н

1 2 н S н

в M

3 н 1 н

Рис. 9. Электрофоретический анализ продуктов гидролиза эндонуклеазой WEN2: 1 -GCG GCG GAT CGC CGC CGC CGC CGC (FÂM), 2 -1+ WEN2, 3 -CGC CGC CGC C(m5)GA TGG CGC CGC(FAM), 4 - 3+WEN2, 5 - CCC CCC GATCCC CCC CCC (FAM), 6 - 5+WEN2, 7 - GCG GCG TGA TCA GCG GCG GCG(FAM), 8 - 7+WEN2

Набор разных по длине продуктов гидролиза ДНК эндонуклеазой WEN2 подобен набору продуктов гидролиза ДНК эндонуклеазой WEN1.

Гидролиз синтетических ДРОН эндонуклеазой WEN2 выявил различие в специфичности между двумя ферментами (рис. 9), Эндонуклеаза WEN2 предпочитает гидролизовать CG-обогащенные последовательности, которые расположены по соседству со связывающим сайтом. Этот сайт, скорее всего, имеет последовательность GAT. Если природа нуклеотида, ближайшего к 3'-концу сайта GAT, не влияет на состав продуктов гидролиза ДРОН ферментом, то с 5'- конца оказывала существенное влияние. Расположение остатков гуанина и, особенно, цитозина перед сайтом проводит к полному гидролизу ДРОН, вплоть до появления мононуклеотидов. Остатки аденина или тимина (рис. 9, дорожки 7 и 8) перед сайтом GAT приводят к образованию только двух продуктов (второй не виден). Расщепление ДРОН только в одном месте непосредственно перед сайтом связывания представляется перспективным для использования фермента в биотехнологии.

Способность ферментов дискриминировать метилированные и неметилированные ДНК, а также разные по статусу метилирования двутяжевые ДРОН, распознавать в субстрате определенные специфичные сайты (CG и CNG) и модулироваться SAM в какой-то мере роднит эукариотические эндонуклеазы WEN1 и WEN2 с прокариотическими эндонуклеазами рестрикции. Учитывая возможное бактериальное происхождение митохондрий у эукариот, резонно предположить, что в процессе эволюции эукариотической клетки именно бактерии как предшественники митохондрий, могли привнести в нее эндонуклеазы рестрикции, а кодирующие их гены попали в ядро. Как бы то ни было, обнаружение в проростках пшеницы описанной нами уникальной эндонуклеазы WEN1 (а также WEN2) указывает на то, что у высших растений могут существовать системы рестрикции-модификации генома (R-М) или, по крайней мере, некоторые их элементы. На наш взгляд, такие эпигенетические системы могут принимать участие в явлениях избирательной делеции генетического материала и так называемой нестабильности генома у растений, в том числе и при апомиксисе.

Взаимодействие эндонуклеаз WEN1 и WEN2 с ДНК.

Взаимодействие эндонуклеаз с ДНК изучено с помощью флуоресцентных методов. Спектры флуоресценции эндонуклеаз, полученные при возбуждении светом длиной волны Х=280 нм, имеют два максимума (при Л.=315 нм и около Х=340 нм), что является нехарактерным для глобулярных белков, причем интенсивность флуоресценции при Х=315 нм выше, чем интенсивность флуоресценции, обусловленной триптофановыми остатками. Наличие двух максимумов флуоресценции может быть связано с тем, что тирозиновые и триптофановые остатки в белках находятся на значительном удалении между собой и возможно связано с существованием доменной структуры в ферментах.

При титровании эндонуклеазами WEN1 и WEN2 ДНК разного статуса метилирования наблюдается тушение флуоресценции, обусловленной как

тирозиновыми, так и триптофановыми остатками (рис.10). Образование комплексов ДНК-белок сопровождается также смещением максимумов спектров флуоресценции, обусловленной триптофановыми остатками, в длинноволновую область более, чем на 10 нм. Батохромный сдвиг максимума указывает на увеличение полярности окружения триптофановых

Рис. 10. Титрование эндонукпеаз WEN1 (А) и WEN2 (Б) метилированной ДНК. Спектры флуоресценции получены при возбуждении светом с длиной волны А= 280 нм.

остатков эндонуклеаз WEN1 и WEN2. Такое изменение микроокружения ароматических аминокислотных остатков обусловлено образованием ионных связей между ДНК и ферментами, которые приводят к конформационным перестройкам в структуре белков.

При титровании раствором ДНК эндонуклеаз WEN1 и WEN2 наблюдается появление флуоресценции в дальней области (рис. 10). Изменение интенсивности эмиссии в длинноволновой области спектра флуоресценции не имело прямой зависимости от концентрации ДНК. Предполагается, что появление флуоресценции в этой области спектра связано с образованием промежуточных комплексов фермент-ДНК. По-видимому, пространственные структуры промежуточных комплексов WEN1-ДНК и WEN2-flHK различны. Об этом могут свидетельствовать положения максимумов спектров флуоресценции в дальней области спектра. Этот факт может быть обусловлен тем, что каталитические центры у WEN1 и WEN2 отличаются по набору аминокислотных остатков и, следовательно, каталитические механизмы действия этих ферментов могут быть различными.

Для каждого варианта фермент-ДНК были построены зависимости Q от R (рис. 11). Из этих зависимостей следует, что ферменты связываются с ДНК независимо от статуса метилирования в соотношении 1:1. Из графиков зависимости r/L от г, построенных согласно уравнению Скэтчарда, были

»120

320 340 Ш Ш Ш 420 440 460 А. ИМ

320 340 J» Ш 400 420 440 4S0A.M«

в. о с» ©.о

4.О О

0.2 О.в "«.О 1.4- R

Рис. П. Зависимость тушения флуоресценции (Q) от молярного соотношения (R) WEN1 и метилированной ДНК. Q= 100 х ( Fa— F/ Fa), Fa — начальная интенсивность флуоресценции, F- интенсивность при добавлении ДНК, R- отношение концентрации фермента к концентрации добавленной ДНК.

рассчитаны константы диссоциации комплексов ферментов с ДНК (табл.1), которые зависят от статуса метилирования ДНК и от природы

Таблица 1

Взаимодействие эндонуклеаз WEN1 и WEN2 с ДНК лямбда фага (dam~, dem') и (dam , dem ). Константы диссоциации, 10" М"1

WEN1 Л = 315 нм Л = 315 ни Л = 340 нм Л = 340 нм

-Mg" + Mg2t -Mg" + Mg1+

не,метилированная ДНК 4,4 2,8 2,3 3,2

метилированная ДНК 2,3 3,6 4,8 6,3

WEN2 Л = 31S нм Л — 315 нм Л =340 нм Л т 340 нм

-Mg2* + Mg2+ - Mg2+ + Mg2t

неметилированная ДНК 2,2 3,6 4,8 5,6

метилированная ДНК 4,6 2,2 2,8 4,2

флуоресцирующего основания. Также из полученных данных можно сказать, что остатки тирозина могут участвовать в связывании с ДНК и определять чувствительность эндонуклеаз к статусу метилирования ДНК.

При титровании эндонуклеаз ионами магния наблюдается увеличение интенсивности флуоресценции. У WEN1 выявлен один конформационный переход при концентрации 5 мМ MgCl2, а у WEN2 - два конформационных перехода, соответственно при 3 мМ и 7 мМ MgCl2 (рис. 12). По-видимому, эндонуклеаза WEN1 связывается с одним ионом металла и ее катализ зависит

от одного иона металла, а эндонуклеаза \VEN2 связывается с двумя ионами металла и ее катализ зависит от двух ионов металла.

А Б

t 3 9 У 9 «« 1Э5ГЙ 11

[Mg2* ], мМ

Рис. 12. Зависимость интенсивности флуоресценции при 1= 340 нм эндонуклеаз WEN1 (А) и WEN2 (Б) от концентрации ионов магния в среде.

Было выявлено, что константы диссоциации комплексов фермент-ДНК изменяются в присутствии ионов магния (табл.1). Следовательно, ионы магния могут влиять на связывание ферментов с ДНК. Изменения этого связывания сопровождаются модулированием действия ферментов, что приводит к потере распознавания ферментами статуса метилирования ДНК, как это было показано на основании электрофоретического анализа продуктов гидролиза ДНК (рис.4).

Процессивный характер реакции гидролиза ДНК эндонуклеазами WEN1 и WEN2.

При анализе продуктов гидролиза ДНК пшеничными эндонуклеазами в течение различных промежутков времени методом электрофореза в агарозе выявлены разные по молекулярной массе фрагменты ДНК (рис. 13). Такой

Динамика гидролиза метилированной ДНК неметилированной ДНК эндонуклеазой WEN1 жщонуклеазой WEN 2

Рис. 13 Электрофоретический анализ продуктов гидролиза ДНК эндонуклеазами ]¥ЕК1и ]¥ЕЮ в присутствии ионов в зависимости от

времени гидролиза: 1-5мин, 2-10мин, 3-15мин, 4— 20мин, 5 — 30мин, б -45мин, 7-бОмин

выявленный нами более или менее дискретный последовательно возникающий набор продуктов гидролиза ДНК может объясняться выраженным процессивным действием эндонуклеаз из пшеницы. Была выявлена корреляция между конформационными изменениями в ферментах и появлением новых продуктов гидролиза ДНК.

Была предложена следующая вероятная схема гидролиза ДНК эндонуклеазой

не зависит от М§2* зависит от зависит от М§24

Е + Р«-»ЕР -» Е + Р,<-»ЕР, Е + Р20 ЕР2 Е + Р3

сайт-специфичное образование образование

расщепление ДНК олигонуклеотидов очень коротких олиго-

(120-140 пн) и мононуклеотидов

и эндонуклеазой '^/ЕШ

не зависит от Ми" не зависит от М§!* зависит от М§2<

Е + Р ЕР Е + Р, ЕР2 Е + Рг ЕР3 Е + Р3

сайт-специфичное. расщепление ДНК

образование олигонуклеотидов (120-140 пн)

расплетание цепей ДНК

зависит от Mg2* ЕР, Е + Р,.

образование очень коротких олиго-и мононуклеотидов

где Е - эндонуклеаза, Р - исходный лиганд (ДНК), ЕР - промежуточный комплекс эндонуклеаза-ДНК, Ph Р2, Рз, Р^- продукты соответствующих этапов гидролиза ДНК.

На первом этапе гидролиза, характерном только для эндонуклеазы WEN1, происходит возможно расплетание цепей ДНК. Доказательством существования этого этапа может быть тушение флуоресценции комплекса бромистый этидий-ДНК только эндонуклеазой WEN1 и расщепление сплавленных двух олигонуклеотидов — AAA AAA AAA CGA AAA AAA AAA + TTT TTT TTT GCT TTT TTT TTT, у которых сайт- CNG образуется только при их сплавлении, причем однотяжевые исходные олигонуклеотиды

WEN1 не расщеплял. Второй этап - это сайт-специфичный этап гидролиза, осуществляющийся по металл-независимому механизму, третий этап, названный структурно-специфичным этапом гидролиза и зависящий от присутствия ионов магния, происходит с образованием олигонуклеотидов длиной в 120-140 пн. Последний этап связан с образованием низкомолекулярных олигонуклеотидов. Гидролиз ДНК эндонуклеазой WEN2 протекает в три этапа.

Итак, пшеничные эндонуклеазы WEN1 и WEN2 существенно различаются по сродству к субстратным ДНК с разным статусом метилирования, скоростям гидролиза и времени образования сходных по длине фрагментов ДНК. Выраженная сайтовая специфичность действия ферментов с узнаванием определенных нуклеотидных последовательностей (CNG и CG) проявляется на ранних этапах гидролиза ДНК. После добавления ионов металла в реакционную среду такая сайтовая избирательность действия ферментов утрачивается и ферменты меняют специфичность и проявляют структурную специфичность (расщепляют ДНК из разных источников до фрагментов 120-140 нп). В конечном итоге ферменты способны расщеплять возникшие фрагменты ДНК практически до мононуклеотидов, действуя как экзонуклеазы. Мы не знаем, как работают эти ферменты собственно в клетке и ядре, однако такая наблюдаемая любопытная последовательная деградация ДНК под их действием, по-видимому, имеет определенный биологический смысл. Может быть, после начального избирательного гидролиза ДНК по определенным доступным сайт-специфичным последовательностям ДНК в хроматине возникшие фрагменты ДНК служат некими сигналами для реорганизации структуры и изменения свойств самих ферментов, сообщая им способность уже полностью деградировать ДНК. Вероятно, такая перестройка в структуре и работе эндонуклеаз действительно происходит, поскольку мы на самом деле наблюдаем два типа эндонуклеазной активности у этих ферментов — не зависимую и зависимую от ионов металлов. Изученные растительные эндонуклеазы, по-видимому, и в клетке могут не только фрагментировать ядерную ДНК на крупные куски, но и последовательно гидролизовать возникшие фрагменты ДНК до очень коротких олиго- и мононуклеотидов, участвуя в утилизации ядерного материала клетки при апоптозе. Процессивный характер гидролиза может быть проявлен не только в участии эндонуклеаз в процессе апоптоза, но и в других процессах, например, в процессах репликации и репарации.

Химическая модификация эндонуклеаз WEN1 и WEN2. Каталитический механизм.

Для понимания каталитического механизма действия пшеничных эндонуклеаз WEN1 и WEN2 и определения аминокислотных остатков, входящих в каталитический домен, проводили химическую модификацию аминокислотных остатков наиболее часто образующих каталитические центры нуклеаз — гистидина, дикарбоновых кислот и лизинов/аргининов.

Модификацию аминокислотных остатков проводили как в отсутствие, так и в присутствии ДНК разного статуса метилирования, а также изучали влияние ионов магния на модифицированные в разных условиях ферменты. Благодаря такому комплексному подходу к модификации можно определить аминокислотные остатки, входящие не только в каталитический домен, но и в ДНК-связывающие домены.

Модификацию гистидиновых остатков эндонуклеаз WEN1 и WEN2 проводили диэтилпирокарбонатом (ДЭПК). В отсутствие ДНК наблюдается полная потеря энзиматической активности у эндонуклеаз. ДНК защищает эндонуклеазу WEN2 от ингибирующего действия ДЭПК (рис. 14). Защитное действие ДНК от потери активности эндонуклеазы WEN2 доказывает, что гистидин участвует в связывании с ДНК. В случае эндонуклеазы WEN! присутствие ДНК при модификации гистидинов ДЭПК не защищает фермент от потери активности. Из дифференциальных спектров поглощения было

Неметипированная ДНК

Метилированная ДНК WEN1 WEM 2

1 2 3 Л S е 7

8 9 10 11 12 13

12 3 Л 5 в 7

В 9 Ю 11 12 13

Рис. 14. Электрофоретический анализ продуктов гидролиза ДНК эндонуклеазами WEN1 и WEN2 в 1,2% агарозном геле при модификации гистидиновых остатков. 1- контроль (неметилированная ДНК), со 2 по 7 дорожки - эндонуклеаза WEN1, с 8 по 13 дорожки эндонуклеаза WEN2. 2-ДНК+фермент, З-ДНК+фермент+Mg2* ,4-ДЭПК-фермент+ДНК, 5-ДЭПК + ДНК+фермент+Mg21, 6- модифицированный ДЭПК фермент в присутствии ДНК, 7- модифицированный ДЭПК фермент в присутствии ДНК+Mg2*

определено число модифицированных остатков гистидина, оно для обеих эндонуклеаз равно 2. Однако при модификации ДЭПК гистидиновых остатков в присутствии ДНК независимо от статуса метилирования у WEN 1 модифицируются два остатка, а у WEN2 только один. Можно предположить, что только один остаток гистидина в эндонуклеазе WEN2 входит в активный центр. Присутствие ДНК при модификации фермента ДЭПК не защищает этот остаток гистидина от модификации, но при этом активность фермента падает. Второй остаток гистидина у эндонуклеазы WEN2 может входить в связывающий центр.

Модификация карбоксильных групп проводилась 1 — этил-3-(-

диметиламинопропил)карбодиимидом (КДИ). Из дифференциальных спектров поглощения при Х=305 нм модифицированных эндонуклеаз против

Немвтипировамная ДНК Метилированная ДНК

WEN1 WEN 2 WEN1 WEN2

1234567 8 Э Ю 1112 13 12 3 4 5 6 7 8 Э Ю 11 12 13

Рис. 15. Электрофоретический анализ продуктов гидролиза ДНК эндонуклеазами WEN1 и WEN2 в 1,2% агарозном геле после модификации остатков дикарбоновых аминокислот. 1- контроль (неметилированная ДНК), со 2 по 7 дорожки - эндонуклеаза WEN1, с 8 по 13 дорожки эндонуклеаза WEN2. 2 - ДНК+фермент, 3- ДНК+фермент+Mg2* ,4 - КДИ-фермент+ДНК, 5 - КДИ + ДНК +фepмeнm+Mg2+ , 6 - модифицированный КДИ фермент в присутствии ДНК, 7- модифицированный КДИ фермент в присутствии ДНК + Mg2*

исходных было рассчитано число остатков модифицированных дикарбоновых кислот. Модификация КДИ дикарбоновых аминокислот в присутствии ДНК зависит от статуса метилирования ДНК.

Модификация аспарагиновых и глутаминовых аминокислотных остатков приводит к полной потере активности эндонуклеазы WEN1 при гидролизе неметилированной ДНК, однако при добавлении к реакционной среде ионов Mg2+ ферментативная активность частично восстанавливается (рис. 15). Модификация дикарбоновых аминокислотных остатков

Неметилированная ДНК Метилированная ДНК

WEN1 WEN 2 WEN 1 WEN 2

123 45 67 8910111213 12 34 5 S 7 8 910111213

Рис. 16. Электрофоретический анализ продуктов гидролиза ДНК эндонуклеазами WEN1 и WEN2 в 1,2% агарозном геле после модификации лизиновых/аргининовых остатков. 1-контроль (неметилированная ДНК), со

2 по 7 дорожки - эндонуклеаза WEN1, с 8 по 13 дорожки эндонуклеаза WEN2. 2-ДНК+фермент,3-ДНК + фермент +Mg2\4-ТНБС.К-фермент+ДНК, 5- ТНБСК + ДНК + фермент +Mg2+ , б-модифицированный ТНБСК фермент в присутствии ДНК, 7- модифицированный ТНБСК фермент в присутствии ДНК+Mg2'

эндонуклеазы WEN2 также приводит к потере активности при гидролизе неметилированной ДНК и практически не влияет на активность при гидролизе метилированной ДНК.

Модификация лизиновых и/или аргининовых аминокислотных остатков тринитробензол сульфокислотой (ТНБСК) приводит к потере ферментативной активности эндонуклеазы WEN1 в реакции гидролиза ДНК, независимо от статуса метилирования ДНК (рис. 16). Проведение модификации WEN1 в присутствии ДНК защищает эндонуклеазу от ингибирующего действия ТНБСК. При модификации

лизиновых/аргининовых остатков эндонуклеазы WEN2 активность фермента не только не уменьшается, а сильно увеличивается. Нейтрализация положительного заряда приводит к изменению специфичности действия фермента и он действует как экзонуклеаза.

Итак, в каталитический центр эндонуклеазы WEN1 входят два остатка гистидина и, скорее всего, два остатка дикарбоновых аминокислот, а также остатки лизина. Кратко каталитический центр WEN1 можно представить в таком виде как HD/EK(D/EK)H. В каталитический центр эндонуклеазы WEN2 входят один остаток гистидина и, скорее всего, два остатка аспарагиновой или глутаминовой аминокислот. Мы можем кратко представить каталитический центр WEN2 как HD/ED/E. Остатки дикарбоновых кислот, входящие в связывающие домены, возможно, определяют чувствительность эндонуклеаз WEN1 и WEN2 к статусу метилирования ДНК. Нами показано, что остатки тирозинов также входят в состав ДНК-связывающих доменов, особенно они важны для WEN1. Для эндонуклеазы WEN2 особую роль в ДНК-связывающем домене играют остатки лизина.

Как уже упоминалось, изученные нами эндонуклеазы обладают сайт-специфичной и структурной эндонуклеазной и экзонуклеазной активностями. Мы предположили, что гидролиз ДНК эндонуклеазами из проростков пшеницы по металл-независимому и металл-зависимому путям осуществляется в одном каталитическом центре. Однако, для проявления раздельно разных активностей ферменты имеют, по крайней мере, два ДНК-связывающих домена и один регуляторный домен. На рис. 17 представлена схема возможного взаимодействия ДНК-связывающих, регуляторного и каталитического доменов эндонуклеаз WEN1 и WEN2. Расположение, последовательность доменов в ферментах на схеме представлена произвольно.

ДНК-связывающии домен А

регуляторный

домен каталитический домен

ДНК-связывающий домен Б

Рис. 17. Схема возможного взаимодействия каталитического, ДНК-связывающих и регуляторного доменов при гидролизе ДНК эндонуклеазами WEN1 и WEN2 по металл-независимому механизму.

Добавление ионов магния к ферментам сопровождается информационными перестройками, скорее всего, изменяется ионное окружение вблизи каталитического домена. Эти структурные изменения в белках, вероятно, сопровождаются участием в катализе второго ДНК-связывающего домена, в результате ферменты теряют чувствительность к статусу метилирования ДНК и проявляют иную эндонуклеазную активность (структурную). Именно благодаря наличию двух разных ДНК- связывающих доменов в ферментах возможно проявление двух разных по специфичности эндонуклеазных активностей у ферментов.

Модуляция активности эндонуклеаз WEN1 и WEN2 гистонами из проростков пшеницы.

Эндонуклеазы действуют в клетке на ядерную ДНК в составе хроматина. Гистоны - небольшие основные белки, которые вовлечены в организацию хроматиновой структуры и регуляцию активности генов. Гистон Н1 локализован в линкерной зоне между нуклеосомами. Гистон Н1 имеет множественные изоформы. Нами установлено, что гистон Н1 модулирует действие эндонуклеаз WEN1 и WEN2 из проростков пшеницы, причем разные подфракции гистона Н1 могут как активировать, так и ингибировать ферменты, и эта модуляция зависит от типа гистона и от статуса метилирования ДНК. Как видно на рис. 18 и 19, добавление гистонов в реакционную смесь приводит к разному соотношению продуктов гидролиза ДНК, это позволяет предполагать, что разные гистоны влияют на разные

Рис. 18 Влияние гистонов на нуклеазную активность WEN1 в реакции гидролиза неметилированной (А) и метилированной (Б) ДНК. Разделение продуктов гидролиза в 1.2% агарозе. Ниже приведены значения нуклеазной активности в виде гистограмм. 1 —высокомолекулярные фрагменты ДНК (более 1000 пн), 2 -фрагменты ДНК около 500 пн, 3 -фрагменты ДНК около 100 пн.

WEN2

неметилированная ДНК

+-ГИСТОНЫ

метилироЕ^анкая ДНК + гистоны

Рис. 19 Влияние гистонов на нуклеазную активность WEN2 в реакции гидролиза неметилированной (А) и метилированной (Б) ДНК Разделение продуктов гидролиза в 1.2% агарозе. Ниже приведены значения нуклеазной активности в виде гистограмм. 1 —высокомолекулярные фрагменты ДНК (более 1000 пн), 2 -фрагменты ДНК около 500 пн, 3 -фрагменты ДНК около 100 пн.

этапы гидролиза ДНК эндонуклеазами WEN1 и WEN2. Такое различие в модуляции действия ферментативной активности разными гистонами возможно обусловлено образованием разных специфических структур с ДНК, которые являются более или менее предпочтительными структурами для атаки эндонуклеаз. Как свидетельствуют данные спектров флуоресценции, взаимодействие между эндонуклеазами и FITC-меченными гистонами зависит как от эндонуклеаз, так и от природы коровых гистонов и подфракций гистона Н1, т.е. можно говорить о специфичности взаимодействия между этими белками. Так, эндонуклеаза WEN1 сильно тушит флуоресценцию FITC-гистона Н1/6, кор-гистонов и слабо тушит флуоресценцию гистона Н1/1. В отличие от эндонуклеазы WEN1, эндонуклеаза WEN2 слабо тушит флуоресценцию гистона Н1/6 и сильно тушит флуоресценцию гистона Н1/1.

ж 5 ш

1 4

ф*

Ш 3

£ г «

I. 1

ОД 0.4 0.6 0.8 1.0 1,2 0,5 1.0 1.5 2.0 2.S

молярное отношение гиі-гои Н.1Л : VVEN1 1 молярное отношение пістон Hl/1: WF.N2

Рис. 20. Зависимость тушение флуоресценции (А F'/ F0) FITC- гистона Н1/1 от молярного отношения гистон. эндонуклеаза WEN1(A) и WEN2(E).

В качестве примера на рис. 20 приведены кривые титрования FITC-гистона Н1/1 эндонуклеазами WEN1 и WEN2 в виде зависимости тушения флуоресценции (Q=AF/F0) от молярного соотношения гистон-фермент. Из подобных зависимостей была определена стехиометрия связывания белков. Н1/1 связывается с WEN1 в молярном соотношении 1:1, а с WEN2 он связывается в соотношении 1:2. Исходя из данных рис. 20,Б, можно предположить, что связывание двух молекул эндонуклеазы WEN2 с

гистоном Hl/1 происходит по разным участкам белка с разными константами связывания. Интересно отметить, что каждый коровый гистон связывается только с одной молекулой WEN 1 или WEN2.

WEN2 имеет более высокую константу диссоциации его комплекса с гистоном Н1/1 и практически одинаковые константы с коровыми гистонами (табл. 2). В случае эндонуклеазы WEN1 наблюдается обратная зависимость: этот фермент имеет более высокие константы диссоциации его комплексов с коровыми гистонами и гистоном Н1/6, тогда как с Н1/1 константа диссоциации почти на порядок ниже. Таким образом, были обнаружены существенные различия во взаимодействиях эндонуклеаз как с разными подфракциями гистона Н1/1, так и с разными коровыми гистонами.

Различия в связывании гистонов с ферментами обусловлены особенностями структуры гистонов. В аминокислотной последовательности Н1 из пшеницы обнаружен пептид каакакк в N-концевой области, который присущ всем подфракциям гистона Н1. Однако его расположение и его микроокружение различно во всех подфракциях, что, по-видимому, и обусловливает связывание подфракций гистона Н1 с эндонуклеазами WEN1 и WEN2 с разной аффинностью.

Таблица 2

Взаимодействие FITC-меченых гистонов пшеницы и их ДНК-комплексов с эндонуклеазами WEN1 и WEN2. Константы диссоциации, М"1

лиганд His Hl/1 His Hl/6 His Н2 His НЗ His Н4

VVEN1 1,0x10" 6,7x10' 1,6x10' 2,4x10' 1,5x10'

VVEN2 1,0x10" 5,7x101 2,3x10" 3,6x10" 1,3x10"

WENl+неметДНК 5,3x10" 1,5x10' 0,7x10' 8,9x10" 8,8x10"

ЛУЕГО+неметДНК 0,9x10" 1,3x10" 0,6x10' 5,3 хЮ" 1,7x10"

VVEN1+ метДНК 2,4x10" 8,9x10" 2,0x10' 4,3x10" 2,2x10'

VVEN2+ метДНК 1,1x10" 1,4x10' 4,3x10" 3,0x10" 1,2x10"

Зависимость тушения флуоресценции при титровании комплексов гистон-ДНК ферментами ((3=ДР/Р0) от молярного соотношения комплекс-фермент выявила, что во всех случаях это соотношение равно 1:1, т.е. оно не зависит ни от природы гистона, ни от фермента, ни от статуса метилирования ДНК (табл. 2).

Связывание ферментов с комплексом гистон-ДНК может протекать следующим образом: 1) ферменты связываются со свободными участками

ДНК. В этом варианте гиетон не влияет на состав продуктов гидролиза ДНК (рис.18,19). Такая ситуация возможно имеет место при взаимодействии WEN1 с комплексом ДНК-гистон Н1. 2) ферменты связываются с комплексом через N-концевой участок гистона. В этом случае, вероятнее всего, гистон будет существенно влиять на набор продуктов гидролиза ДНК ферментами, ингибируя или активируя действие эндонуклеаз. При этом модуляция действия ферментов будет зависеть от структуры комплекса гистон-ДНК и, следовательно, от природы гистона и от статуса метилирования ДНК.

Величины констант диссоциации комплексов фермент-гистон-ДНК существенно зависят от статуса метилирования ДНК (табл. 2). In vivo метилирование ДНК - один из механизмов регуляции экспрессии генов. Оно влияет на ДНК-белковые взаимодействия и индуцирует конформационные превращения в хроматине. Так как пшеничные эндонуклеазы чувствительны к статусу метилирования ДНК, они, скорее всего, чувствительны к этим конформационным изменениям субстратов. Поскольку метилированная ДНК предпочтительно связывается с гистоном Н1, образующиеся комплексы, по-видимому, обогащены метилированной ДНК, тогда как свободная от гистона Н1 ДНК, по-видимому, содержит незначительное количество метилированных участков. Не исключено, что под влиянием гистона Н1 в результате белок-белковых взаимодействий может изменяться сайтовая специфичность действия эндонуклеаз. Ингибирование фракциями Н1/1 и Н1/6 гидролиза метилированной ДНК эндонуклеазой WEN1 указывает на то, что возможными местами атаки ДНК для WEN1 могут быть сайты с метилированными адениновыми остатками, так как известно, что Н1 предпочитает связываться с АТ-богатыми последовательностями, которые после связывания Н1, по-видимому, становятся стерически недоступными для WEN 1.

Поскольку гистон Н1 расположен в межнуклеосомных линкерах, можно предположить, что первоначальной атаке эндонуклеазы WEN2 на ДНК хроматина подвергаются именно линкерные области хроматина. Действительно, WEN2 расщепляет ДНК в изолированных ядрах на крупные фрагменты по межнуклеосомным участкам, образуя выявляемую при электрофорезе так называемую «лестницу» фрагментов ДНК. В отличие от WEN2, действие эндонуклеазы WEN1 стимулируется коровыми гистонами, особенно Н2в.

Разные подфракции гистона Н1, по-видимому, участвуют в регуляции ступенчатой деградации ДНК эндонуклеазой WEN2 при апоптозе. Известно, что на первых стадиях апоптоза гидролиз ДНК может быть остановлен. Однако когда апоптоз основательно задействован и началась уже межнуклеосомная фрагментация ДНК, процесс уже нельзя остановить и деградация ДНК продолжается. При этом значительную роль могут играть, коровые гистоны, которые активируют действие эндонуклеазы WEN1.

Модуляция активности эндонуклеаз WEN1 и WEN2 короткими биологически активными пептидами

Пептиды образуют обширную и многообразную сигнальную регуляторную систему, контролирующую физиологию, рост и развитие растений и животных. Мы нашли, что пептиды, синтезированные в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии - эпиталон® (А1а-Glu-Asp-Gly), пинеалон® (Glu-Asp-Arg), бронхоген® (Ala-Asp-Glu-Leu), тестаген® (Lys-Glu-Asp-Gly), кардиоген® (Ala-Glu-Asp-Arg), панкраген® (Lys-Glu-Asp-Trp) модулируют действие эндонуклеаз WEN1 и WEN2 по-разному (рис. 21). Модуляция активности ферментов пептидами может быть

Метилированная ДНК WEN2 WEN1

Неметилированная ДНК WEN2 WEN1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1718 19

Рис. 21. Электрофоретический анализ продуктов гидролиза метилированной и неметилированной X фаговой ДНК эндонуклеазами ШЕЫ1 и \VEN2. I - метилированная ДНК, 2-1+ фермент №ЕШ, 3-2+ , 4 -2+гистон Н1, 5-2+ эпиталон, 6-4+ эпиталон, 7 - 2+гистон НІ, 8-4+ бронхоген, 9 — 2+ пинеалон, 10 - 4+ пинеалон, 11 - 1+фермент 12 —

11+ М^, 13 - 11+ гистон Н1, 14 - 11+ эпиталон, 15 - 13 + эпиталон, 16 -11+бронхоген, 17 - 13 + бронхоген, 18 — 11+ пинеалон, 19 -13+ пинеалон.

обусловлена тем, что пептиды связываются с определенными сайтами на ДНК, в результате чего ферменты либо конкурируют с пептидами за эти сайты и в результате наблюдается ингибирование действия ферментов, либо связанные пептиды облегчают гидролиз ДНК ферментами. Кроме того, действие пептидов может быть опосредовано гистонами. Это очень важный факт, поскольку в клетке пептиды изначально должны найти в хроматине те

места, которые доступны для связывания, а эта доступность может определяться гистонами.

Мы установили, что FITC-меченные пептиды способны проникать внутрь клетки. Они были обнаружены нами внутри ядер и ядрышек, и, тем самым, одним из местом связывания пептидов может быть ДНК.

Все исследованные пептиды модулируют гидролиз однотяжевых и двутяжевых олигонуклеотидов, содержащих CNG и CG-сайты, ферментами WEN1 и WEN2 (рис. 22). Эта модуляция зависит от структуры пептида и может свидетельствовать о специфическом связывании пептидов с олигонуклеотидами.

А Б

12345678 1 2 345678

Рис. 22 Электрофоретический анализ (в 20%-ном полиакриламидном геле) продуктов гидролиза флуоресцентно меченных однотяжевого 5'-FAM CGC CGC CAG GCG CCG CCG CG-3' (A) и двутяжевого 5'-FAM CGC CGC CAG GCG CCG CCG CG-3 '/3 '-GCG GCG GTC CGC GGC GGC GC-FAM (Б) дезоксирибоолигонуклеотидов эндонуклеазой WEN1. A: 1 - олигонуклеотид, 2 — 1 + фермент + Mg2+; 3 - 2 + эпиталон; 4 — 2 + бронхоген; 5-2 +кардиоген; б -2 + панкраген; 7 - 2 + пинеалон; 8 - 2 + тестаген. Б: а -двутяжевый, б - смесь однотяжевых.

Итак, нами впервые показано, что короткие пептиды модулируют действие эндонуклеаз. По-видимому, эта модуляция в основном происходит благодаря сайт-специфическому связыванию пептид-ДНК. Выявленное нами специфическое связывание пептидов с одноцепочечными ДРОН имеет особое значение. В ДНК всегда есть или появляются однотяжевые участки, особенно при репликации, рекомбинации и репарации. Взаимодействие коротких пептидов именно с такими участками может контролировать и эти генетические процессы.

Поскольку существует тканевая, субклеточная и возрастная разнокачественность метилирования ДНК, мы считаем, что один и тот же биологически активный пептид будет по-разному связываться с ДНК в

зависимости от ее метилирования и по-разному воздействовать на геном: в различных тканях (клетках), в ядре и митохондриях, в молодых и старых клетках, в нормальных и раковых клетках. Почти все это подтверждено экспериментально. Обнаруженный нами феномен модуляции действия эндонуклеаз короткими пептидами может быть лишь частью глобального биологического закона: сайт-специфично связывающиеся с ДНК (особенно с регуляторными элементами генома) пептиды должны модулировать функции многих взаимодействующих с ДНК белков (РНК- и ДНК-полимеразы, ДНК-метилтрансферазы и многие регуляторные факторы). Мы предлагаем один из наиболее вероятных механизмов активации генов короткими пептидами: пептиды селективно связываются с промоторными СИй или Сй сайтами, что делает эти сайты недоступными для ДНК метилтрансфераз и в результате промотор остается неметилированным, а это - решающий элемент активации генов. Таким образом, специфические (комплементарные) пептид-ДНК взаимодействия могут эпигенетически контролировать генетические функции клетки, и, вероятно, они играли очень важную роль уже на самых ранних этапах зарождения жизни и эволюции.

1Чб-адениновая ДНК метилтрансфераза из проростков пшеницы.

Ыб-метиладенин уже давно найден в ДНК высших растений, протозойных, грибов и водорослей, однако его происхождение оставалось неизвестным. До сих пор адениновые ДНК-метилтрансферазы у этих организмов были не выявлены.

Нами из везикулярной фракции колеоптилей 8-дневных проростков пшеницы выделена адениновая ДНК-метилтрансфераза ^АО-метилтрансфераза). Фермент гомогенен, его удельная активность 1,4 ксрт/мкг.

А Б

123 45678 9 10

Рис. 23. А - БЭЯ-ПААГ электрофорез белковых фракций с адениновой ДНК-метилтрансферазной активностью, выделенных из колеоптилей пшеницы. 1- белковый экстракт из везикул колеоптилей, 2- очищенная обогащенная

белковая фракция,' 3- фракция 2 после HPLC в градиенте ацетонитрила с 1% трифторуксусной кислотой Б -Электрофореграммы в 0.7%-ном агарозном геле неметипированной и метилированной WAD метилазой ДНК X фага и продуктов их гидролиза различными рестрикционными эндонуклеазами: 1 -неметилированная ДНК X фага, 2-1+ Bell, 3 - метилированная WAD метилазой ДНК X фага + нерадиоактивный SAM + Bell, 4 - метилированная WAD метилазой ДНК X фага, 5-4+ Mbol, 6-1 + Mbol, 7-1 + Rsal, 8 - 4+ Rsal, 9-1 + EcoRI, 10-4 + EcoRI.

Кажущаяся молекулярная масса фермента по данным SDS-электрофореза 39 кДа (рис. 23, А). Фермент метилирует ДНК в присутствии SAM с образованием остатков N6 -метилдезоксиаденозина, который был выделен тонкослойной хроматографией и имел характерные экстремумы в УФ-спектре.

Другим важным доказательством аденинового метилирования ДНК является защита метилирования от действия соответствующих рестрикционных эндонуклеаз. В качестве субстратной ДНК для метилирования WAD-метилазой была использована неметилированная ДНК X фага (dam", dem"). Метилирование ДНК WAD-метилазой защищает ДНК от гидролиза рестрикционной эндонуклеазой Bell (рис. 23, Б). Эта эндонуклеаза рестрикции расщепляет ДНК по сайту TGATCA.

Таблица 3

Радиоактивность в N'-метиладенозине в различных олигонуклеотидах после метилирования адениновой ДНК-метилтрансферазой в присутствии (3 Н-метил) -SAM.

Субстрат Радиоактивность, cpm

(1) GGG TGA TCAGGG 11640±300

(2) ССС TGA ТСА ССС 10070±240

(3) GGG TGA ТСА GGG +

ССС TGA ТСА ССС (сплав) 7590±280

(4) GCG TGA ТСА CGC 11140±320

(5) GCG TGA ТСА CGC (сплав) 6070±300

(6) GG TGTTCAGG 160±40

(7) X фага ДНК 9980±320

(8) poly d(AT) 160±40

(9) poly d(IC) 40±10

(10) poly d(A) 190±40

В качестве субстратов для метилирования Х^'АБ-метилазой были использованы также синтетические ДРОН (табл. 3). Фермент эффективно катализирует включение радиоактивности из [метил-3Н]-8АМ в однотяжевые ДРОН 1, 2 и 4 с сайтом-мишенью ТОАТСА. Эффективность включения метки падает в два раза при использовании в качестве мишени

комплементарных ДРОН 1+2 (3) или самокомплементарного ДРОН 4.

Фермент de novo метилирует одно- и двутяжевые структуры ДНК, но предпочитает однотяжевые. Замена первого остатка аденина на тимин в сайте - мишени TGATCA делает ДРОН (6) инертным для метилирования WAD-метилазой.

Таким образом, первый остаток аденина является мишенью для метилирования в сайте TGATCA и делает этот сайт после метилирования WAD-метилазой устойчивым к действию рестрикционной эндонуклеазы Bell (рис. 23,Б). Монотонные ДРОН, такие как poly-d(AT) или poly-d(IC) и полирибонуклеотид poly-A не служат субстратами для WAD-метилазы.

WAD-метилаза является Са2+, Mg2+ -зависимым ферментом. Около 2-3 мМ СаС12 и MgCl2 необходимо для проявления максимальной ДНК-метилазной активности. ЭДТА (до 3 мМ) почти не влияет на активность фермента. Увеличение концентрации ЭДТА до 10 мМ приводит к почти полному ингибированию фермента. Фермент активен в относительно широком интервале pH, а в диапазоне pH от 7,5 до 8,0 он проявляет максимальную активность. Оптимальная концентрация SAM для реакции метилирования ДНК WAD-метилазой - 10 мкМ, что является характерной для многих бактериальных адениновых ДНК-метилтрасфераз. Увеличение концентрации SAM в реакционной среде выше 20 мкМ приводит даже к ингибированию фермента.

По-видимому, выделенная из проростков пшеницы WAD-метилаза участвует в репликации митоходриальной ДНК, так как WAD-метилаза была обнаружена в везикулярной фракции, содержащей митохондрии, в которых происходит активная репликация ДНК в апоптозных растительных клетках. Известно, что энзиматическое dam метилирование контролирует репликацию плазмид в бактериях. Возможно WAD-метилтрансфераза может контролировать репликацию митохондриальной ДНК, которая представляет собой, главным образом, циклические молекулы. Известно, что митохондрии эволюционно происходят от бактерий, поэтому существование контроля плазмидной репликации адениновым ДНК метилированием, подобно бактериальному, кажется вполне реальным и в растительных клетках и, вероятно, оно используется для контроля за митохондриальной репликацией.

Одним из механизмов защиты от чужой ДНК, например, у бактерий, является система рестрикции-модификации. В проростках пшеницы в везикулярной фракции были обнаружены, помимо адениновой ДНК-метилтрансферазы, две эндонуклеазы WEN1 и WEN2, чувствительные к статусу метилирования ДНК, и их действие регулируется SAM - донором метильной группы. На основании этих данных можно предположить, что у высших растений существует система «рестрикции-модификации» или, по крайней мере, ее элементы. Эндонуклеазы WEN1 и WEN2 могут принимать участие в репликации, репарации и рекомбинации митохондриальной ДНК.

Выводы:

1. Из везикулярной фракции стареющих колеоптилей пшеницы выделены две новые Са2+, Mg2+ - зависимые нуклеазы, названные WEN1 и WEN2. Эти ферменты - первые эукариотические нуклеазы, которые чувствительны к статусу метилирования ДНК и активность которых модулируется S-аденозил-1-метионином (SAM). Это указывает на то, что у растений могут существовать элементы системы рестрикции-модификации (R-M) генома.

2. Нуклеазные активности, соответствующие активностям WEN1 и WEN2, найдены в ядре, их действие увеличивается со старением колеоптилей, а также под воздействием гормона старения — этилена, и оно максимально выражено при апоптозе. WEN1 и WEN2 расщепляют ДНК изолированных ядер проростков пшеницы по межнуклеосомным участкам. Все это означает, что ферменты WEN1 и WEN2 могут участвовать в апоптозе у растений.

3. Фермент WEN1 предпочитает гидролизовать метилированную ДНК фага лямбда, и его активность ингибируется SAM. Наоборот, фермент WEN2 предпочтительно гидролизует неметилированную ДНК фага лямбда, и SAM активирует гидролиз ДНК. Тем самым, открыт новый механизм разнонаправленной регуляции активности растительных нуклеаз SAMom. Са2+ активирует WEN1 и ингибирует WEN2. Таким образом, оптимальные условия для функционирования одного фермента являются ингибирующими для работы другого.

4. WEN1 эндонуклеолитически расщепляет как двутяжевую ДНК, так и однотяжевую ДНК. Кроме того, WEN1 обладает слабой рибонуклеазной активностью. WEN2 эндонуклеолитически предпочитает расщеплять двутяжевую ДНК. В присутствии ионов магния ферменты могут расщеплять ДНК экзонуклеолитически. Таким образом, нуклеазы WEN1 и WEN2 являются бифункциональными ферментами, обладающими высокой эндо- и слабой экзонуклеазной активностями.

5. Эндонуклеаза WEN1 обладает CNG-сайтовой специфичностью действия и расщепляет фосфодиэфирную связь между остатками С и N. Это - первый случай обнаружения и выделения эндонуклеазы из эукариот, обладающей выраженной сайтовой специфичностью действия. Эндонуклеаза WEN2 предпочитает расщеплять CG-обогащенные участки ДНК.

6. Эндонуклеазы WEN1 и WEN2 обладают выраженным процессивным действием. Сначала ДНК расщепляется ферментами сайт-специфически до крупных фрагментов независимо от присутствия ионов магния. Затем эти фрагменты в присутствии ионов магния гидролизуются до олигонуклеотидов длиной 120-140 пн. На этом этапе гидролиза ДНК изменяется специфичность действия ферментов и утрачивается их чувствительность к статусу метилирования ДНК. При дальнейшем гидролизе эндонуклеазы расщепляют образовавшиеся олигонуклеотиды до низкомолекулярных и

мононуклеотидов. Этапы гидролиза ДНК сопровождаются изменениями спектров собственной белковой флуоресценции эндонуклеаз WEN1 и WEN2. Наблюдаемые конформационные переходы этих белков коррелируют с изменением специфичности действия ферментов.

7. Открыта важная роль ионов магния в регуляции специфичности действия растительных эндонуклеаз. Ферменты гидролизуют ДНК по металл-независимому и металл-зависимому механизмам. Эндонуклеаза WEN1 расщепляет образовавшиеся крупные фрагменты ДНК по механизму, зависимому от одного иона магния, а эндонуклеаза WEN2 - от двух.

8. С помощью химической модификации аминокислотных остатков нуклеаз, установлено, что каталитический центр эндонуклеазы WEN1 имеет мотив -HD/E(D/EK)KH, а у эндонуклеазы WEN2 - H(E/D)(E/D). Остатки дикарбоновых аминокислот и тирозинов входят в ДНК-связывающие мотивы этих ферментов и, по-видимому, определяют чувствительность эндонуклеаз к статусу метилирования ДНК.

9. Гистон Н1 и коровые гистоны модулируют действие эндонуклеаз WEN1 и WEN2. Эта модуляция действия ферментов зависит от природы гистонов и статуса метилирования ДНК. Эндонуклеаза WEN1 связывается со свободным участком ДНК в комплексе ДНК-гистон Н1, а WEN2 связывается непосредственно с гистоном в составе этого комплекса. WEN1 и WEN2 связываются с комплексом кор-гистоны-ДНК непосредственно через кор-гистоны.

10. Короткие пептиды модулируют действие эндонуклеаз WEN1 и WEN2, и эта модуляция опосредована гистонами. Пептиды специфически связываются с олигонуклеотидами и ДНК, а также с определенными мотивами гистонов и их комплексов с ДНК. Таким образом, короткие пептиды могут регулировать связывание эндонуклеаз с хроматином.

11. Из везикулярной фракции клеток стареющих колеоптилей пшеницы выделена и охарактеризована первая эукариотическая адениновая ДНК-метилтрансфераза. Этот Са2+, Mg2+ - зависимый фермент метилирует остаток аденина внутри сайта TGATCA и, по-видимому, может участвовать в регуляции репликации митохондриальной ДНК.

Публикации по теме диссертации:

1. Fedoreyeva L. I., Vanyushin В. F. (2002). N6-Adenine DNA-methyltransferase in wheat seedlings. // FEBS Letters 514, 305-308.

2. Александрушкина Н. И., Середина А. В., Федореева JI. И., Замятнина В.А., Бакеева JI. Е., Смирнова Е. Г., Ягужинский Л. С., Ванюшин Б. Ф. (2001). Антиоксиданты — регуляторы роста, развития и клеточной дифференцировки растений. // 6-я Международная конференция «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях» (26-28 июня 2001 г.) ISBN 5-94327-038-8, М.: Изд-во МСХА, 78.

3. Федореева Л.И., Александрушкина Н.И., Дунаевский Я.Е., Белозерский М.А., Ванюшин Б.Ф. (2003). Влияние продуцента этилена этрела и антиоксиданта ионола (ВНТ) на протеолитический аппарат в колеоптилях проростков пшеницы при сопровождающем ранний онтогенез апоптозе. // Биохимия, 68, 570-576.

4. Дунаевский Я.Е., Федореева Л.И., Александрушкина Н.И., Смирнова Т.А., Коломийцева Г.Я., Ванюшин Б.Ф.,. Белозерский М.А. (2003). Влияние антиоксиданта ионола на протеолитический аппарат стареющих колеоптилей, выращиваемых на свету проростков пшеницы // Биоорганическая химия, 29, 505-509.

5. Fedoreyeva L.I., Sobolev D.E., Vanyushin B.F. (2007). Wheat endonuclease WEN1 depent on S-adenosyl-L-methionine and sensitive to DNA methylation status. П Epigenetics 2, 50-53.

6. Соболев Д.Е., Федореева Л.И., Ванюшин Б.Ф. (2007).Чувствительная к статусу метилирования ДНК S-аденозилметионин - зависимая растительная эндонуклеаза. // VI съезд общества физиологов растений России. Международная конференция «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (18-24 июня 2007 г. Сыктывкар, республика Коми, Россия), стр. 215-216 Изд-во Коми НЦ УрО РАН.

7. Федореева Л.И., Соболев Д.Е., Ванюшин Б.Ф. (2008). S-аденозил-Ь-метионинзависимая и чувствительная к статусу метилирования ДНК эндонуклеаза WEN2 из колеоптилей пшеницы. // Биохимия 73, 1243-1251.

8. Федореева Л.И., Смирнова Т.А., Коломийцева Г.Я., Ванюшин Б.Ф. (2008). Влияние подфракций гистона HI пшеницы на активность апоптотических эндонуклеаз стареющего колеоптиля пшеницы.// IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (11-15 мая 2008 г., Новосибирск), 105.

9. Vanyushin B.F., Fedoreyeva L.I., Sobolev D.E., Ashapkin V.V., Kharchenko P.N. (2008). DNA methylation and endonucleases dependent on S-adenosyl-L-methionine and sensitive to DNA methylation status in plants. // 7th Plant Genomics European Meeting. "Epigenetics, Small RNAs and Chromatin Structure", Albena, Bulgaria (24-27 September, 2008), number S 10.5.

10. Vanyushin B.F., Fedoreyeva L.I., Ashapkin V.V., Kharchenko P.N. (2009). Adenine DNA methylation and unique endonucleases in plants. // 8th Plant Genomics European Meeting (07-10 October, 2009; Lisbon, Portugal), S.4.1, p.

127. '

11. Федореева Л.И., Смирнова Т.А., Коломийцева Г.Я.. Ванюшин Б.Ф. (2009). Гистон HI модулирует гидролиз ДНК эндонуклеазами WEN1 и WEN2 из колеоптилей пшеницы.//Биохимия 74,181-189.

12. Хавинсон В.Х., Федореева Л.И., Ванюшин Б.Ф. (2011). Сайт-специфическое взаимодействие коротких пептидов . с. ДНК модулирует действие эукариотических эндонуклеаз. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 151, 76-81.

13. Хавинсон В.Х., Федореева Л.И., Ванюшин Б.Ф. (2011). Короткие пептиды модулируют действие эукариотических эндонуклеаз из проростков пшеницы. //Докл. РАН, 437,124-127.

14. Федореева Л.И., Ванюшин Б.Ф. (2011). CNG сайт-специфичная метил-чувствительная эндонуклеаза WEN1 из проростков пшеницы. // Биохимия 76, 799-806.

15. Федореева Л.И, Киресв И.И., Хавинсон В.Х., Ванюшин Б.Ф. (2011). Проникновение коротких флуоресцентно-меченых пептидов в ядро в клетках HeLa и специфическое взаимодействие пептидов с дезоксирибоолигонуклеотидами и ДНК in vitro. II Биохимия, 76. 1505-1516.

16. Федореева Л.И., Ванюшин Б.Ф. (2012). Процессивный характер действия пшеничных эндонуклеаз WEN1 и WEN2. Кинетические параметры. Биохимия, 77, 603-610 (2012).

17. Moiseyev G.P., Beintema J.J., Fedoreyeva L.I.,, Yakovlev G I. (1994). High sequence similarity between a ribonuclease from ginseng calluses and fungus-elicited proteins from parsley indicates that intracellular pathogenesis-related proteins are ribonucleases.//Planta 193,470-472. -

18. Moiseyev G.P., Fedoreyeva L.I., Zhuravlev Y.N., Yasnetskaya, Jekel P.A., Beintema J.J. (1997). Primary structures of two ribonucleases from ginseng calluses/ new members of PR-10 family of intracellular patgogenesis-related plant proteins.//FEBS Letters 407,207-210.

Список статей, которые будут опубликованы в 2013 г.

1. Федореева Л.И., Ванюшин Б.Ф. (2013). Механизмы каталитического действия и химические модификации эндонуклеаз WEN 1 и WEN2 из проростков пшеницы//Биохимия, 78, 52-65.

2. Федореева Л.И., Смирнова Т.А., Коломийцева Г.Я., Хавинсон В.Х., Ванюшин Б.Ф. (2013). Взаимодействие коротких биологически активных пептидов с FITC-меченными гистонами пшеницы и их комплексы с дезоксирибоолигонуклеотидами//Биохимия, 78, 230-242.

3. Федореева Л.И., Смирнова Т.А., Коломийцева Г.Я., ВанЮшин Б.Ф. (2013). Модуляция гистонами действия эндонуклеаз WEN1 и WEN2 Из проростков пшеницы//Биохимия, 78 ■

Подписано в печать:

14.01.2013

Заказ № 8058 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. autoreferat. ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Федореева, Лариса Ивановна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

ФЕДОРЕЕВА ЛАРИСА ИВАНОВНА

ЭНДОНУКЛЕАЗЫ WEN1 И WEN2 И АДЕНИНОВАЯ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗА WAD ИЗ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ

Специальность: 03.01.05 - физиология и биохимия растений

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант член-корр. РАН, профессор Ванюшин Борис Федорович

Москва-2013

Стр.

СОДЕРЖАНИЕ.......................................................................1 - 6

Введение................................................................................7 -15

Литературный обзор.............................................................16-164

I. ВВЕДЕНИЕ...............................................................................16

II. КЛАССИФИКАЦИЯ НУКЛЕАЗ.................................................17

III. КАТАЛИТИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ НУКЛЕАЗ..............................21

III. 1 - Реакция нуклеолитического расщепления...................................21

111.2 - Нуклеофилы......................................................................22

111.3 - Продукты реакции расщепления............................................24

111.4 - Основные свойства ионов Mg и других дивалентных катионов ...24

111.5 - Три главных класса нуклеаз в зависимости от использования ионов металла в катализе......................................................................25

5.1. - Катализ в зависимости от двух ионов металла...................26

5.1. 1. - Эндонуклеазы рестрикции (ВатШ, HincII,

MutH, EcoR124I, и т.д.).........................................................27

5.1.2. - FEN1 - 5'-экзо- и эндонуклеазы....................................28

5. 1.3. - ДНКаза I и подобные ей эндо- и З'-экзонуклеазы............28

5.1.4. - LAGLIDADG хоуминг эндонуклеазы...........................29

5.2. - Катализ, зависимый от одного иона металла.....................30

5.2.1. - Семейство ßßa-Me нуклеаз..........................................31

5.2.2. - Эндонуклеазы рестрикции типа-Ii.................................32

5.2.3. - Углевод-неспецифические нуклеазы..............................32

5.2.4. - Serratia, NucA и endo G..............................................32

5.2.5 - Каспазо- активируемая ДНКаза (CAD/DFF40).................33

5.2.6. - Семейство нуклеаз HUH............................................33

5.2.7. - Нуклеазы, зависимые от трех ионов Zn2+......................34

5.3. - Металл-независимый катализ.........................................35

5.3.1. -Nuc и ДНКаза II......................................................35

5.3.2. - Bfil эндонуклеаза рестрикции.....................................36

IV. - ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ НУКЛЕАЗ.................................36

IV. 1. НУКЛЕАЗЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В РЕПЛИКАЦИИ......................38

1.1. FEN1 нуклеаза, участвующая в ДНК репликации, расщепляющая короткие структуры........................................42

1.2. Dna2 нуклеаза, участвующая в процессе ДНК репликаци, расщепляющая длинные структуры........................................ 43

1.3. Эндонуклеаза G (endoG), обладающая экзонуклеазной активностью, участвующая в репликации митохондриальной ДНК..44

IV.2. НУКЛЕАЗЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В РЕПАРАЦИИ........................45

2.1. Апуриновые/апиримидиновые нуклеазы,

участвующие в репарации......................................................47

2.2. Участие ароматических аминокислот в связывании

ДНК с нуклеазами...............................................................48

2.3.Апуриновые/апиримидиновые нуклеазы, участвующие в репарациии.......................................................................50

2.4. Нуклеазы, участвующие в репарации неканонических пар нуклеотидов.......................................................................51

2.5. Нуклеазы, участвующие в репарации двойной цепи ДНК.........52

IV.3. ФЕРМЕНТЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В РЕКОМБИНАЦИИ................53

3.1. Нуклеазы, участвующие в общей рекомбинации..................54

3.2. Роль Exol в мейотическом процессинге ( в рекомбинации )....58

IV.4. СИСТЕМА РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ Рестрикционные эндонуклеазы. ДНК метилтрансферазы..................59

4.1.Классификация ферментов рестрикции.................................61

4.2. Рестрикционные эндонуклеазы..........................................67

4.3. ДНК метилтрансферазы...................................................69

4.4. Структурные и функциональные домены RM системы.............72

V. ЗАПРОГРАММИРОВАННАЯ КЛЕТОЧНАЯ ГИБЕЛЬ. АПОПТОЗ И НЕКРОЗ.................................................................................73

V.l. Регуляция апоптоза................................................................75

V.2. Молекулярные механизмы апоптоза...........................................77

V.3. Пути реализации программы ЗГК..............................................78

V.3.I.Реализация программы ЗГК через рецепторы плазматической

мембраны...................................................................................78

V.3.2. Митохондриальный путь реализации ЗГК...................................80

Y.3.3. Комбинированный путь реализации апоптоза..............................82

V.3.4. Путь ЗГК с участием эндоплазматического ретикула...................82

V.3.5. Путь ЗГК с участием белка перфорина......................................82

V.3.6. Путь ЗГК с участием интегринов.............................................83

У.3.7.3ГК в эритроцитах...............................................................83

V.4. Основные нуклеазы, участвующие в апоптозе..............................83

4.1. Эндонуклеаза DFF40 и каспазо-зависимый путь апоптоза.......84

4.2. endoG и каспазо-независимый путь развития апоптоза............89

4.3. exoG - паралог эндонуклеазы endoG..................................97

4.4. Кислые нуклеазы, участвующие в апоптозе.........................99

V.5. Принципы терапевтического использования апоптотических

нуклеаз...............................................................................................................101

V.5.I. Патологии, связанные с ослаблением апоптоза..........................103

V.5.2. Патологии, связанные с усилением апоптоза.............................105

VI. КАНЦЕРОГЕНЕЗ..................................................................107

VI. 1. Мутагенез..........................................................................107

VI.2. Старение...........................................................................109

VI.3. Эпигенетический контроль клеточных процессов........................111

VI.4. ДНК-метилирование............................................................115

VI.5. Эндонуклеаза FEN1 и ее роль в канцерогенезе............................116

VI.6. Хоуминг эндонуклеазы.........................................................125

VII. ФАГАЦИТОЗ. Роль нуклеазы ДНКаза II в фагоцитозе...................131

VIII. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НУКЛЕАЗ В ТЕРАПИИ. ИНЖЕНЕРИНГ НУКЛЕАЗ................................................................................135

IX. РОЛЬ НУКЛЕАЗ В ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ

РАСТЕНИЙ.............................................................................144

IX.1. Роль нуклеаз в системе самонесовместимости...........................144

IX.2. Патоген-обусловленные (PR) белки и их роль в защите растений

против патогенов. PR-10 белки как рибонуклеазы..............................146

IX.2.1. Белки PRlO-класса обладают рибонуклеазной активностью........148

IX. 3. Нуклеазы, участвующие в ЗКГ у растений...............................153

IX. 3.1. Нуклеазы, участвующие в ЗГК при увядании..........................154

IX.3.2. Нуклеазы, участвующие в формировании адаптивного ответа.....155

3.2.1. Биотический стресс. Гиперчувствительный ответ...............156

3.2.2. Абиотический стресс...................................................157

IX.4. Бифункциональные растительные нуклеазы...............................158

IX.5. Использование растительных нуклеаз в биотехнологии................159

IX.6. Использование растительных нуклеаз в терапии..........................163

Список сокращений..................................................................165

Материалы и методы...........................................................167-185

Результаты и обсуждение.....................................................186- 381

ГВведение.............................................................................. 186

II. ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ.................................................... 188

III. ДИНАМИКА НАКОПЛЕНИЯ НУКЛЕАЗНОЙ И ПРОТЕАЗНОЙ АКТИВНОСТЕЙ В ПРОРОСТКАХ ПШЕНИЦЫ. Влияние антиоксиданта (ВНТ) и регулятора роста растений (этрела) на уровень активностей............................................................................... 193

IV. ВЫДЕЛЕНИЕ и ОЧИСТКА ЭНДОНУКЛЕАЗ WEN1 и WEN2.........200

V. СУБСТРАТЫ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ ГИДРОЛИЗА ЭНДОНУКЛЕАЗАМИ WEN1 и WEN2. ЗАВИСИМОСТЬ АКТИВНОСТИ НУКЛЕАЗ от СТАТУСА МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК.... 204

VI. ЛОКАЛИЗАЦИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗ WEN1 и WEN2 в КЛЕТКЕ....... 207

VII. ДИНАМИКА НАКОПЛЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗ WEN1 и WEN2 в СУБКЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУРАХ КОЛЕОПТИЛЕЙ ПШЕНИЦЫ...... 208

VIII. ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНДОНУКЛЕАЗ WEN1 и WEN2

1) зависимость от ионов металлов...........................................213

2) pH-зависимость эндонуклеаз WEN1 и WEN2.........................216

3) температурная зависимость...............................................220

4) модуляция активности ферментов SAM, SAH и SIB А.............. 221

IX. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ ЭНДОНУКЛЕАЗ WEN1 и WEN2. УЧАСТИЕ в АПОПТОЗЕ............................................................ 224

X. САЙТОВАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ЭНДОНУКЛЕАЗ WEN1 и WEN2....227

1) сайтовая специфичность эндонуклеазы WEN1.........................228

2) сайтовая специфичность эндонуклеазы WEN2..........................237

XI. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ТРИПТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ ЭНДОНУКЛЕАЗ WEN1 и WEN2...................................................243

XII. ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНДОНУКЛЕАЗ WEN1 и WEN2 МЕТОДОМ

ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ......................................247

XII. 1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЭНДОНУКЛЕАЗ WEN1 и WEN2 с ДНК

РАЗНОГО СТАТУСА МЕТИЛИРОВАНИЯ.................................... 249

XII.2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЭНДОНУКЛЕАЗ WEN1 и WEN2 с ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ........................................................ 263

XIII. ПРОЦЕССИВНЫЙ ХАРАКТЕР РЕАКЦИИ ГИДРОЛИЗА ДНК ЭНДОНУКЛЕАЗАМИ ЧУЕШ и WEN2..........................................268

XIV. ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗ \VEN1 и \VEN2. КАТАЛИТИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ..........276

XV. МОДУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ЭНДОНКУЛЕАЗ \VEN1 И \VEN2 ГИСТОНАМИ ИЗ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ..............................293

XVI. КИНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГИДРОЛИЗА ДНК ЭНДОНУКЛЕАЗАМИ \УЕШ и \VEN2.........................................314

XVII. МОДУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ЭНДОНУКЛЕАЗ \VEN1 и \VEN2 КОРОТКИМИ БИОЛОГИЧЕСКИМИ АКТИВНЫМИ ПЕПТИДАМИ....323

XVIII. СПЕЦИФИЧЕСКОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОРОТКИХ

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ с

ДЕЗОКСИРИБООЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ и ДНК..........................331

XIX ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПЕПТИДОВ с ГИСТОНОМ Н1 и КОРОВЫМИ ГИСТОНАМИ и ИХ КОМПЛЕКСАМИ с ДНК и

ДЕЗОКСИРИБООЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ.....................................348

XX. 1М6 -АДЕНИНОВАЯ ДНК МЕТИЛТРАНСФЕРАЗА ИЗ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ..............................................................................365

Заключение........................................................................379-389

Список литературы.............................................................390-490

Выводы........................................................................... 491-493

Список публикаций по теме диссертации

494-496

ВВЕДЕНИЕ

Нуклеазы - один из самых многочисленных и разнообразных классов ферментов, расщепляющих фосфодиэфирную связь [1]. Это уникальный класс ферментов, обладающих обширной функциональной активностью. Они участвуют во всех генетических процессах, включая репликацию, репарацию, рекомбинацию, а также рестрикцию и полную переработку отработанного, мутированного и чужеродного генетического материала, который в дальнейшем может быть использован клеткой для синтеза нового генетического материала.

Не существует единой системы классификации для нуклеаз. В зависимости от субстрата нуклеазы делятся на РНКазы и ДНКазы, но имеются нуклеазы, которые могут расщеплять как ДНК, так и РНК и являются субстрат-независимыми нуклеазами [2-4]. Как РНКазы, так и ДНКазы осуществляют только один вид расщепления - это расщепление фосфодиэфирной связи, которое происходит по нуклеофильному бимолекулярному механизму или кратко по 8Ы2 пути [1].. Поэтому нет ничего удивительного, что в одном и том же активном центре нуклеаз может происходить гидролиз, как ДНК, так и РНК. Однако существует огромное разнообразие структур и каталитических механизмов РНКаз и ДНКаз, по которым происходит гидролиз РНК и ДНК.

Нуклеазы, уникальный класс ферментов, которые практически не имеют гомологичных аминокислотных участков. Несмотря на явное отсутствие гомологии аминокислотных последовательностей у ферментов, иногда используют классификацию нуклеаз по аминокислотным последовательностям [5,6]. Зато сравнительный анализ и выявление гомологии каталитических доменов нуклеаз является одним из обязательных элементом характеристики ферментов. Особенность каталитического мотива нуклеаз отражается в его ферментативной эффективности. Например, мотив ОЕБО ассоциирован с большим числом З'-экзонуклеаз, являющихся

углевод- неспецифическими и гидролизующими как ДНК, так и РНК [7]. Но этот же мотив найден и в FEN1-подобных нуклеазах, содержащих как 5'-экзо, так и эндонуклеазную активности, и которые участвуют во многих физиологических процессах (удаление РНК праймеров в репликации ДНК, расщеплении нуклеотидных участков в структурах Холлидея, ДНК репарации и РНК процессинге) [8].

На основании подробного анализа нуклеаз было показано, что нет соответствия между структурой нуклеаз, каталитическим механизмом и функциональной активностью ферментов. Нуклеазы, распознающие сайт на субстрате по подобному пути, могут различаться по каталитическому мотиву и пространственной организиции. Разные нуклеазы могут выполнять одну и ту же биологическую функцию. Например, даже в бактериях и одноклеточных организмах найдены более, чем четыре различных резолваз [9,10]. И с другой стороны, один и тот фермент может участвовать в разных генетических процессах [11]. Нуклеазы могут участвовать в нескольких процессах, например, в процессах репликации и репарации. Такие бифункциональные нуклеазы распространены в животном и растительном мирах [11].

Нуклеазы участвуют на всех стадиях клеточного развития, в том числе на стадии запрограммированной клеточной гибели и терминальной стадии развития - полной утилизации клеточного материала [12,13]. Программа гибели клеток генетически заложена у многоклеточных организмов. Онтогенез невозможен без ликвидации отдельных клеток, участков тканей и даже целых органов. Процесс старения можно также рассматривать как одну из форм программируемой гибели клеток. Известный американский ученый JI. Хейфлик [14] впервые доказал, что естественная продолжительность жизни человека обусловлена числом митозов, которые могут совершить клетки данного организма. Оказалось, что клетки эмбриона могут совершить около 50 делений, а затем в них наблюдаются все признаки апоптотической смерти. В настоящее время различают гибель клеток двух, внешне похожих,

но принципиально различных, типов: апоптоз и некроз [15]. Ежедневно у здорового человека возникает от 50 до 70 миллиардов новых клеток, и такое же количество их гибнет, в основном за счёт апоптоза. За год обновляется столько клеток, что их общий вес равен весу тела. В отличие от некроза, при котором клетка раздувается и лопается, выбрасывая своё содержимое в межклеточное пространство, при апоптозе клетка сжимается и часто делится. В результате остатки клетки могут быть переварены путём фагоцитоза соседними клетками или макрофагами. Переваривание остатков клеток макрофагами осуществляется специальным классом нуклеаз - кислыми неспецифическими ДНКазами II [16].

Апоптоз играет важную роль в развитии эмбрионов и морфогенезе животных и растений. Организмы с обширными дефектами, обусловленными нарушениями апоптоза, погибают ещё на ранних стадиях онтогенеза. Патологические процессы развиваются в случае подавления или усиления апоптоза. При недостаточности апоптоза прогрессируют аутоиммунные процессы и злокачественные новообразования. При усилении апоптоза возникают аплазии и дегенеративные процессы, а также некоторые уродства с дефектами тканей [17].

Одним из маркеров апоптоза является фрагментация ДНК - деградация ядерной ДНК по межнуклеосомным связям с образованием так называемой «лестницы ДНК» [18]. Самыми известными эндонуклеазами, принимающими участие во фрагментации ДНК, являются БРР40 и епёоО [19]. Эндонуклеаза ОРР40 локализуется в ядре и деградирует ДНК на крупные фрагменты после ее активации каспазой-3, тем самым является терминальной частью каспазо-зависимого пути апоптоза в клетке. Другая эндонуклеаза епс!оО локализуется в митохондриях и деградирует ядерную ДНК на мелкие фрагменты на терминальной стадии каспазо-независимого пути апоптоза (или митохондриального пути).

Онкогенез связан с генетическими изменениями, такими как точечные мутации, хромосомные дефекты и микросаттелитное расширение и сжатие.

Процесс превращения нормальных клеток в злокачественные сопровождается увеличением этих альтераций в клетках, которые продолжают генерировать опухолевую клеточную популяцию в процессе развития опухоли [20]. Механизмы, которые эти ошибки аккумулируют, вовлечены в геномную нестабильность. Эта нестабильность и приводит к мутациям. Мутации являются необходимыми в жизни, как и точность в ДНК репликации. Обнаружено, что причина многих заболеваний заключена в вариабельности ответов среди индивидуумов. Ежедневно в молекулах ДНК каждой клетки человеческого тела около 100000 звеньев повреждаются за счет разнообразных эндогенных процессов и экзогенных генотоксичных воздействий [21]. Действительно, новые мутации те, что не стали полиморфными, часто являются вредными и вызывают заболевания, вредные для индивидуумов. Нуклеаза СЕЬ I показывает высокую специфичность для удаления всех генетических ошибок [22]. Использование этой нуклеазы, а также других методов, детектирующих мутации, может привести к значительному прорыву в медицине в индивидуализации тестирования мутаций и их удалении.

Инициация и развитие рака обосновано эволюцией, в процессе которой происходят многочисленные генетические изменения в мультиплетных генах [23,24]. В большинстве видов раковых опухолях, генетические изменения увеличиваются соматическими мутациями [25]. Например, мутации специфических генов, таких как ВЯСА1 или В11СА2, и образование неканонических пар у генов, приводят к увеличению вероятности образования рака груди и рака прямой кишки, соответственно [25].

Недостаток той или иной нуклеазы и более того ее отсутствие может привести к очень серьезным последствиям. О серь�

Информация о работе

Федореева, Лариса Ивановна
доктора биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.05

Диссертация

Эндонуклеазы WEN1 и WEN2 и адениновая ДНК-метилтрансфераза WAD из проростков пшеницы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы