Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метилирование ДНК у растений

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Метилирование ДНК у растений"



и

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи ГО 547.963.32

КИРНОС Михаил Дмитриевич

МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК 7 РАСТЕНИЙ 03-00.03 - Молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного -доклада

Москва - 1987 г.

Работа выполнена в секторе молекулярных основ онтогенеза Межфакудьтетской проблемной НИЛ молекулярной биологии и биоорганической хшст имени А.Н.Белозерского Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

&

Официальные оппоненты:

академик1 АМН СССР, профессор, доктор биологических наук

И.П.Ашарин

чл. -кор^., ЗАЛНИл. профессор, дошгор биологических науг.

Т.И.Тихоненко

доктор биологических каук Я.И.Бурьянов

Ведутся организация - Институт молекулярной биологии АН СССР

Защита состоится _" 198 ■ г. в_час

на заседании специализированного совета Д 053.05.70 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Московском государственно?л университете имени М.В.'Ломоносова по адресу: Москва, 119899, Ленинские горы, МГ7, Биологический факультет.

С материалами диссертации можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета .МГУ.

Автореферат разослан "_"_198 года

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат химических наук

З.Н.Кагрзыанов

1 - ......■' S

\

' j ' ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

r "л!--1 Актуальность проблему. Эизиматическое метилирование ДНК рассматривается сегодня как один из механизмов регуляции экс-• прессии генов и клеточной дифференцировки у эукзриот (Ванюшин, I968;I972;I974;I983;Biggs , 1985; Cedar, 1985). В клетках животных модификация ДНК по цитозиновым остаткам играет ванную роль в регуляшш транскрипции (Cedar, 1985; Doerfler et al-, 1985) и репарации неспаренных оснований (Haxe,Taylor, 1985), а подавление метилирования ДНК индуцирует экспрессию "молчащих" генов и клеточную дифференцировку ( Jones, 1985). При этом, как и в случае индукции дифференцировки под действием 5-азашггидина в клетках животных, для проявления эффекта под действием фито-гормонов у растений необходимы несколько циклов репликации ядерной ДНК (яДКК)х и клеточных делений (Бутенко, 1976; Jones, 1985). Роль же этой модификации при репликации ДНК совсем не известна. Тем не менее, можно думать, что метилирование ДНК по цитозиновым остаткам у эукариот полифункционально. В особенности это касается высших растений, степень метилирования ДНК которых в 10-100 раз выше, чем ДНК животных и микроорганизмов (Ванюшин, 1958; 1972; Wyatt, 1951; Vanyushin et al., 1970).

rr&k в ДНК животных нет, но он найден в ДНК низших эукариот и растений в очень малых количествах ( Vanyusbin et al., 1968; I970;I97I; Бурьянов и др., I970;I972; Gorovsky et al., 1973; Пахомова и др., 1968). 0 функциональной значимости этой модифи- . кации ДНК ничего не известно.

К началу нашей работы не было известно как, когда и с какой специфичностью метилируется ДНК в клеточном цикле, как регулируется и какова возможная роль модификации ДНК по цитозиновым ос. таткам в реализации процессов репликации и транскрипции ДНК в клетках высших растений. Ничего не было известно о природе модифицированных оснований в митохондриальных ДНК (мтДНК) высших растений. В то же время знание природы и функций энзиматической модификации ДНК принципиально важно для расшифровки механизмов сохранения, передачи и реализации генетической информации в клетке. В частности, исследование в этом отношении субклеточных органелл важно не только с теоретической, но и практической точек зрения, поскольку эти органеллы вносят заметный вклад в устойчивость рас-

s

Список сокраиений см. стр.44

тений в токсинам, адаптационную изменчивость ж цитотигазиатичес-кую мужскую стерильность.

Таким образом, изучение природы, динамики, специфичности и регуляции метилирования различных ДНК в клетках высших растений необходимо и для разработки теоретических основ регуляции продуктивности с/х культур. Все эти моменты определили цель а зада-

0 Делью работы стало сравнительное изучение природы, динамики, специфичности и регуляции метилирования ДНК в связи с ее репликацией в клеточном цикле клеток выоиих растений. В ходе работы решались следующие экспериментальные задачи:

1) Разработка методов выд ленгл, ^акционирования и анализа природы, уровня и специфичности метилирования различных клеточных ДНК высших растений и зииотных.

2) Определение природы модифицированных (метилированных) оснований в ДЕ". растений и животных.

3) Исследование специфичности ?лвтилнрования ДНК растении и зи-вотных.

1) Выбор объектов и исследование сопряженности реплпкативного синтеза и метилирования ДНК в двух различных модельных системах: в культуре недифференцированных клеток л детерминированных делящихся клетках формирующегося органа в целом растении.

5) Выявление и анализ дискретности этапов метилирования ДНК в клеточном цикле клеток целого растения.

6) Исследование регуляции репликации и отдельных этапов метилирования ДНК в клеточном цикле высших растений, в том числе под действием фитогормонов.

Натчная новизна л тгеак^ичдскзд значимость работы. 3 ходе выполнения исследования разработаны 'оригинальные методы:

1) выделения из животных тканей и очистки мтДНК от примесей яДНК путем обработки митохондрий суспензией ДЭАЭ-целлюлозы;

2) разделения по длине и составу пиримидиновых и пуриновых де-зоксирибоолигонуклеотидов аз ДНК различного происхождения о помощью двумерной тонкослойной хроматографии на ДЗАЭ-аелдю-лозе;

3) выделения и количественного определения пг'с в пиримидиновых последовательностях и трехкомпонентных дезоксирибоолигонук-леотидов из ДНК разного происхождения;

4) выделения и очистки фрагментов Оказаки из тканей и органов целого растения.

Было впервые установлено, что метилирование дЦНК у растений осуществляется в двух типах последовательностей с осью симметрии, проходящей между ( парой оснований - - или через основание I (любое) в - СрХрв Открыт синхронный и периодический репликативный синтез яДНК в первом листе и - митохондриаль-ной ДНК в колеоптиле этиолированных проростков пшеницы. В мтДНЕС пшеницы найден н6-метиладенин. Установлено, что ытДНК позвоночных животных содержат 5-метилаитозин, а их митохондрии - соответствующие цитозиновые ДНК-метялазные активности, отличающиеся от ядерных по специфичности действия. Установлено, что характерным и. отличным от яЕКК свойством структуры всех изученных мтДНК (простейщие, позвоночные животные, высшие растения) является низкая сблоченность пиримидиновых нуклеотидов. Тем самым, установлено, что по структуре, природе модифицированных оснований и специфичности модификации ДНК ядер и митохондрий у животных и растений существенно различаются.

Открыты каскадная организация и скоординировакность этапов метилирования я5НХ с ее репликацией и фазами клеточного цикла. Впервые установлено, что репликация - основной путь уменьшения содержания в ДНК у растений: в клетках целого растения, в отличие от клеток в культуре, в результате репликации возникают резко асимметричные по содержанию т-'с в комплементарных цепях дуплексы яДНК. Впервые показано, что степень асимметрии новообразованных дуплексов уменьшается в результате дискретного, относительно разномерно протекающего в клеточном цикле, этапа пост-репликативного метилирования. Последовательности, реплицирован-ные в разные моменты б -фазы к началу следующего клеточного цикла метилированы в разной степени. Впервые изучена специфическая организация метилируемых последовательностей ДНК в реплицирующемся геноме делящихся клеток в целом растении. На базе полученных данных о динамике уровня и специфичности метилирования яДНК в последовательных клеточных циклах делящихся клеток первого листа проростков пшеницы сформулирована гипотеза о возможных функциях этапного метилирования ДНК в клетках формирующегося органа в целом растении: контроле за точностью удвоения и очередностью репликации (и экспрессии) генов в одной и той же и в последовательных Б -фазах клеточных циклов. Впервые изучено влияние на отдельные этапы метилирования яДНК в клеточном цикле клеток в

целой растении фитогормонов, ингибиторов транскрипции, трансляции, метилирования ДНК. Установлена относительная независимость регуляции отдельных этапов метилирования. Предложен новый механизм молекулярного действия фитогормонов на экспрессию, репликацию генов и клеточную дафференцировку - модуляция репликативного метилирования яДНК.

Полученные результаты и разработанные методы могут быть использованы и уже успешно используются для глубокого изучения механизмов экспрессии, репликации генома и клеточной дифференциров-ки у эукариот, а также при чтении курсов лзкций по молекулярной биологии, биохшлип и физиологии растений.

Адробапля 'эаб&ты. Основные результаты работы были представлены и обсуждены на Международных симпозиумах "Структура и функции нуклеиновых кислот и нуклеопротендов" (Москва, 1974), "Генетические функции органоидов цитоплазмы" (Ленинград, 1974), 4-м симпозиуме СССР-ФРГ "Структура и транскрипция генома" (Ереван, 1981), 16-ой конференции Федерации Европейских Биохимических обществ (Москва, 1984), "Физико-химия ДНК и молекулярные механизмы функционирования генома" (Тбилиси, 1987); 7, 8 и 9 Всесоюзных симпозиумах по структуре и функциям клеточного ядра (Харьков, 1980; Пушно, 1984; Черноголовка, 1987) и "Реализация наследственной информации" (Паланга, 1980); конференции "Геном растений" (Черновцы, 1983) и 5-Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986).

Глазные результаты работы и сделанные на их основе выводы изложены в обобщенном виде в настоящем докладе.

Работа обобщает результаты личных исследований автора, выполненных с 1970 по 1987 гг. в секторе молекулярных основ онтогенеза Лаборатории им. А.Н.Белозерского МГУ, возглавляемом профессором Б.Ф.Ванюшиным. В работе на отдельных этапах принимали участие некоторые сотрудники, аспиранты и студенты МГУ.

ПРИРОДА МЕТИЛИРОВАННЫХ ОСНОВАНИЙ В ДНК ОЕГАНЕЛЛ У ЖИВОТНЫХ И РАСТЕНИЙ

К началу нашей экспериментальной работы в МГУ (1970 г.) в ядерных ДНК животных и высших растений уже был найден 5-метил-цитозин и установлено, что он возникает на полинуклеотидном уровне в результате модификации цитозиновых остатков ферментами ДНК-метилтрансферазами (»уаЬЬ, 1951; Богек еЬ а1., 1964; УапуиаЫп еь а!., 1Э70;1Э71;1973; Ванагин и Белозерский, 1959). Однако о

метилированных основаниях в ДНК митохондрий животных к этому времена было лишь два противоречивых сообщения (Казакова, Мар-косян, 1966; Иааз, 1969), а о минорных основаниях в мтДНК высших растений ничего не было известно. Поэтому мы начали работу с изучения природы модифицированных оснований в ДНК митохондрий животных и растений.

Для изучения состава мтДНК животных мы разработали метод выделения из животных тканей препаративных количеств мтДНК и очистки ее от примесей яДНК с помощью обработки митохондрий суспензией ДЭАЭ-целдюлозы /2, 33/. Метод сснохап на связывании свободных нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов с частицами ДЭАЭ-цел-люлозы в среде выделения митохондрий. Обработка ДЭАЭ-пеллюяозой не приводит к деградации митохондрий и мтДГ-^% и обеспечивает удаление яЕНК /2, 33/.

Все изученные нами мтДНК позвоночных животных содержат 5-метилиитозин /2-5, 30, 33/. Мы показали, что у животных существует видовая специфичность мтДНК по содержанию 5-метилштозина /3, 5,33/. Его распределение по пиримидиновым изошштам в мтДНК сердца быка существенно отличается от такового в яДЕК, что может свидетельствовать о различной специфичности метилирования яДНК и мтДНК (табл. I) /30/.

Таблица I. Распределение 5-метилцитозина по пиримидиновым

изошштам, выделенным из мтДНК и яДНК сердца быка

т Изоплиты ! Содержание 5-метилцитозина {% от всего)

i т з мтДНК ! в яДНК

I 46,4 60,0

П 37,5 25,8

16,1 14,2

В митохондриях печени крысы я сердца быка нами выявлена ДНК-метилазная активность, осуществляющая in vibro метилирование шггозиновых остатков как в гомологичной мтДНК, так и в различных гетерологичных ДНК /4. J. Специфичность метилирования in vitro цитозиновых остатков в одной и той же гетерологичной ДНК s. coli в ядерным и митохондриальныь* ферментами различна: ■ митохокдриальный метилирует эти остатки преимущественно в moho-, а_ядерннй - в ди- и трипиримидиновых фрагментах (табл. 2).

Таблица 2. Распределение СН3 групп по пиримидиновым изоплитам ДНК 2.coli В црометилирозанноЗ vitro до насыщения митохондриальным и ядерным ферментами из печени крысы .(в присутствии 3H-sAM)

Изоплиты

Радиоактивность, %

МТ ¡ядерный фермент \фермент

¡Изоплиты

Радиоактивность, %

МТ ! ядэоный

фермент ! фермент

I Д Ж

36,846,3 19,1+2,4 22,3+5,4

19,5+2,5 30,9+1,2 32,7+3,2

Л X

9,6+1,0 6,2+3,1 6,0+2,2

11,6+3,4 1,3+0,2 4,0+1,5

После метилирования in vitro разных ДНК ядерным ферментом "до насыщения", митохондриальный фермент дополнительно включает в них СН -группы из /метил-3Н/ S -адекозилметионина (Ж.!) (рис. I).

'.НО

\т s w

S'f.'r

j 23Ü гт из из т^»

Р^с. I.:"Дометилиоование"-in vitro 1 ДНК Е.coli В ферментами из ядер и митохондрий печенй крысы в условиях полного'насыщения метильными группами /4/-

Это еще раз свидетельствует о том, что ДНК-метилазы ядра и митохондрий у животных обладают разной специфичностью действия /4/.

Выделение достаточных для спектрофотометрического определения азотистых оснований количеств ДНК из митохондрий растений намного сложнее, чем из клеток животных, поэтому для изучения природы минорных оснований в мтДНК растений мы использовали другие подходы. Мы установили, что в сформированном и стареющем органе проростков пшеницы - колеоптиле - синтезируется необычная, отличающаяся от яДНК по составу (6С=56 тол.%) и плавучей плотности (/> =1,716 г/см3, рис. 2) метаболически стабильная фракция ДНК /13, 14/. С помощью ингибиторов направленного действия на синтез

1,7Ш !,ТОО

\ ♦ 1 ♦

3000 • 1

X

I

г ооо

ч

5 юао ч. 'Ч\

20 30

Франции

Ряс. 2, Профили радиоактивности в градиенте плотности СзС1 новообразованной в старевших колеопти-лях ДНК (I) и ДНК из фракции митохондрий (2). Величина над стрелками -плавучая плотность (г/см3).

ядерной ДНК (циклогекскмид) и неядерной (бромистый этидий, гьвг ) ДНК мм показали, что эта ДНК неядерного происхождения /14/- Синтез ее локализован во фракции органелл (рис. 3), а не в цитоплазме Д4/. Эта фракция однородна по составу и представлена только митохондриями Д4_/. Поскольку мтДНК пшеница отличается от яЯНК и хлоропластной ДНК (хцЕНК) пшеницы по плавучей плотности Д4, 15/ (Одинцова, 1976) то по этому признаку ее легко отделить от основной массы клеточной ДНК и выделить в чистом виде в градиенте плотности СэСа Д4, 15/. Инкубируя проростки пшеницы с мечеными предшественниками пуряновых (/В-^С/аденин) или пиримидиновых (/2-^С/оротовая кислота) оснований ДНК, можно из небольшого их количества выделить достаточные для анализа уровня метилирования адениновых и цитозиновых остатков количества меченных ДНК клеточных органелл. Такой подход позволяет избежать трудоемких общепринятых методов выделения препаративных количеств цитоплазматичес-

Ряс. 3. Распределение в сахарозном градиенте радиоактивности клеточного гомогената меченных /В-3к/тютщшом этиолированных срезанных проростков пшеницы.

ких органам для получения соответствующих ДНК и выделить свободные от примесей меченые новообразованные мтДНК (колеоптиль) и яПНК (лист) из развивающихся этиолированных проростков /14,15/.

Анализ очищенной в градиентах СзС1 мтДНК из разных органов проростков пшеницы, инкубированных в присутствии /2-^4С/оротовой кислоты в различных условиях (истощение, циклогексимид), показал, что все они неметшшрованы^по цитозиговш остаткам и идентичны по плавучей плотности (составу) Д4, 15/. Другие исследователи также не нашли ш^с в суммарной мтДНК пшеницы в последовательности СС6& ( Воаеп еЪ в1., 1980).

Адениновых ДНК-метилаз, а также модифицированных по аденп-новым остаткам оснований ДНК ни в ядрах, ни в митохондриях позвоночных животных путем спектрофотометрического анализа ками не обнаружено 33/. В то же щюыя в ДНК простейшего ТеагаЬуиепа ругиогсаа по матке из /В-1ЧС/аденина мы обнаружили -кетил-аденин ( шбА'Ю0/(ш6А +А) - 0,7) /10/. В качестве минорного основания ш6А найден в ДНК бактерий ( Уас&зЫп е*; а1., 1968), грибов (Бурьянов и др., 1970), водорослей (Пахомова и др., 1968) и высших растений (Ванюпзин и др., 1971; Бурьянов и др., 197<:). Однако клеточная природа метилированной по адениновым остаткам ДНК высших растений неизвестна. Поэтому мы предприняли специальное исследование по определению уровня метилирования адениновых остатков в ДНК ядра, хлоропластов и митоховдрий. Для этого мы воспользовались уже известной нам моделью стареющего колеоптиля ДЗ-15/, а также разработанным нами с Н.И.Александрушкиной способом индукции синтеза хцДНК и мтДНК в сформированном листе этиолированных проростков при их освещении. Из инкубированных на свету, в -присутствии /8-14С/аденина проростков (колеоптиля, никней, средней и верхней частей листа) выделяли ДНК, фракционировали ее в градиенте плотности на ядерную (синтез в ~ I см нижней

части листа), митохондриальную (преимущественный синтез в колеоп-тиле, средней и верхней частях листа) и хлоропластную (синтез в средней и верхней частях листа) и определяли уровень метилирования этих ДНК по адениновым остаткам. В специальных опытах мы убедились в том, что эти фракции действительно соответствуют (по 6С, т5с и величине ) новообразованным яДНК, мтДНК и хпДНК. Оказалось, что у проростков пшеницы тба содержится только в митохондриях (100- ш6а /(А +т6А ) — 0,5). Таким образом, митохонд-таалькая ДНК высшего растения (пшеница) неметилтоован^ по нито-зпнознм. ко ^етилгдуется по адениновым остаткам. Возможный бис-

логический смысл этой модификации ДНК у растений обсуждается (Ванюшин, 1985). '- ..

Таким образом, мы впервые установили различную природу минорных оснований в ДНК ядра и митохондрий g клетках -высших растений. Природа метилированных оснований в ДНК митохондрий высших растений и позвоночных животных также различна. Это указывает на наличие в ядрах и митохондриях растительных и животных клеток различных по специфичности действия систем энзиматической модификации ДНК.

Характерным и отличным от яДНК свойством структуры мтДНК . всех изученных нами мтДНК позвоночных животных,, растений, кине-топластной ДНК простейшего и мтДНК дрожжей (Ehrlich et al.,I972) является низкая сблоченност$ пиримидиновых нуклеотидов (рис. 4) /1-3, 5, 30, 337. Это может указывать на некое единство структурной организации этих ДНК.

IIJII Изоплшпы

Рис. 4. Распределение пиримидиновых изоплит в митохондриаль-ных (мт), ядерных (я) и кинетопластных (к) ДНК. N _ количество олигонуклеотидов, иол.%

СОПРЯЖЕННОСТЬ МЕТИЛИРОВАНИЯ С РЕПЛИКАЦИЕЙ ДНК И ФАЗАМИ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА В КЛЕТКАХ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

Обнаружение репликативного метилирования ДНК в культуре■клеток. Известно, что репликация ДНК в растительных клетках проис- . ходит дискретно через образование коротких (4-6 s ) фрагментбв с последующим их Лигированием (Sakamaü et al., 1975; Creas et al., 1978). До наших работ не было известно, происходит ли у pác-тений метилирование ДНК при репликации, метилированы ли вообще

новообразованные ДНК (ноДНК), и, в частности, фрагменты Оказаки (4-6 s ). Поэтому.мы попытались изучить характер и динамику репликации ДНК в суспензионной асинхронной культуре клеток табака и определить, на каких этапах репликации происходит метилирование ДНК /8,9,12,347.

После 2 мин инкубирования культуры клеток табака ( ~ Ю^кле-ток в I мл) с 3Н-тимидином основная радиоактивность ноДНК обнаруживается в коротких ( < 5 S ) фрагментах, а при длительной инкубации клеток (5-60 мин.) и в длинных ( >15 s ) фрагментах репликации /9/. Таким образом, репликация ДНК в клетках табака происходит дискретно, через образование и сшивание фрагментов Оказаки /5/..С увеличением :онцентрации.клеток в среде динамика репликации ДНК" резко изменяется. При концентрации 4-10°клеток в I мл даже через 4 ч инкубации с /5-3Н/уридином или -^С-тимидином преобладающая часть меченной ДНК остается в зоне 4-8 s фрагментов /Э/. Можно думать, что при повышенной концентрации клеток в среде резко подавляется лигирование фрагментов Оказаки. Такое же явление мы наблюдали в культуре с повышенной плотностью ь-клеток мыши Д2,- 347.

Таким обоазом. у растений и животных стпествудт некий обиий. зависимый от концентрация клеток в среде тизиологический механизм регуляции (блок) репликации ДНК на уровне липгоования фрагментов Оказаки. Это позволило исследовать характер метилирования ДНК на отдельных стадиях ее репликации. Мы использовали это явление для получения достаточных для исследования метилирования количеств меченых фрагментов Оказаки. До сих пор это еще не удавалось (Grafstrom et al., 1985), и сама идея попытки оценить уровень метилирования фрагментов Оказаки у эукариот казалась "esofce -rie exercise ", хотя необходимость этого не вызывает сомнений ( Grafatroo et al., 1985).

Для количественного определения уровня метилирования (УМ = = IOQ'Bi^C/(m^c+C) ) репликативных фрагментов суспензию клеток большой плотности (4-Ю5 клеток в I мл) инкубировали с. /5-3Н/ури-дином в течение 4 ч; ноДНК фракционировали центрифугированием лизатов клеток в щелочном градиенте концентрации сахарозы. У инкубированных в этих условиях клеток преобладает радиоактивность в зоне коротких ( ~ 5-8 S ) фрагментов ноДНК /9Д После гидролиза 5 s - и >8S -ДНК до оснований и их двумерной тонкослойной хроматографии был определен УМ репликативных фрагментов. Обнаружено, что метилированы все фрагменты ноДНК, в том числе фрагменты

Оказаки и .тегированные репликативные Фрагменты /Э/. Однако по УМ они различаются: фрагменты Оказаки (УМ = 16-20) почти вдвое нв-дометллировавы по сравнению-с легированными фрагментами, которые пфтому признаку узе не отличаются от суммарной ДНК (УМ - 40) /5/. Таким образом, в культтое клеток табака связанное с репликацией метилирование ДНК происходит. по крайней мере, в две стадии: сначала метплиэтются фрагменты Оказаки. а затем датированная ДНК /9/. Причины и механизмы даухстадийного метилирования ноДНК неизвестны, неясно также, осуществляется ли метилирование ДНК на этих стадиях репликации одной и той же или разными ДНК-метилазами.

Аналогично, при инкубациях ь -клеток с различной" концентрацией в слое (10 -5-Ю5) с /В-3Н/уридином, УМ фрагментов Оказаки, независимо от плотности клеток в слое (УТЛ = 2,7-2,9) в ~ 1,5 раза ниже УМ лигированной ноДНК (УТЛ = 4,1-4,3), который совпадает с УТЛ суммарной ДНК, определенным спектрофотометрически /12,34/.

Таким образом, метилирование ноДНК в культтое клеток растений и животных практически завершается яри репликации.

Несмотря на исключительную значимость сведений о метилировании ДНК в культуре клеток, все же следует учитывать, что этот процесс в них лишен регуляторных воздействий целостного организма. Так, например, в листьях табака уровень метилирования яДНК (Занюгин и др., 1971) почти в 1,5 раза ниже, чем в культуре клеток /Э/, а а ДНК отдельных органов мыши содержится, наоборот, больше ш 5С,( ^апуцэЫп еь а1., 1970), чем в ДНК из культуры клеток /12,34/. Между тем, до наших работ не было известно, как метилируются ДНК в цикле развития животной и растительной клеток в целостном организме. В частности, не известно, в какой степени выражена этапность реплихативкого метилирования ДНК и каковы степень и специфичность метилирования релликативных фрагментов ДНК в клетках в целом организме. Поэтому следующей нашей задачей был поиск и изучение подходящей для этой цели растительной модели.

Обнаружение синхронного и периодичного синтеза ядерной ДНК в первом листе и мктохондриальной ДНК в колеоптиле этиолированных проростков пшеницы. Мы обнаружили, что-в колеоптиле и первом листе развивающихся этиолированных проростков пшеницы синтез ДНК периодичен и синхронен (рис. 5,6^,6).

В колеоптиле содержание ДНК возрастает лишь в первые два наблюдаемые цикла синтеза, в последующие циклы оно не увеличи-

"Рис.5 Динамика синтеза ДНК в клетках первого листа (а) и колеоптиля (б)

Н полированных проростков пшеницы. - ЗП - циклы синтеза ДНК

Рис, 6 Распределение в градиенте плотности СзС1 радиоактивности (I) и УФ-поглощения(2) ДНК первого листа (а) и нолеоптиля (б) из отполированных проростков пшеницы. I -V-циклы синтеза ДНК

вается (рис. 5, б). Профиль радиоактивности ноДНК первого листа (рис. 6, а), синтезируемой в течение первых двух наблюдаемых циклов в градиенте СаС1 унимодален и совпадает с профилем суммарной я2НК по УФ-поглощению. Профили радиоактивности ноДНК в коле-оптиле в градиенте саС1 во все тту.™ синтеза, в отличие от профиля УФ-поглоиения бимодальны (рис. 6, б): они представлены пиком, совпадающим по плотности с яйЙК (у= 1,700 г/см3) и более тяжелым пиком мтДНК ( у = 1,716 г/см3). Таким образом, синхронный периодичный синтез ДНК в стареющем колеоатиле происходит преимущественно в митохондриях /14,15/.

В листе каждый цикл синтеза приводит к ступенчатому увеличению содержания ДНК, а в первые два наблюдаемые цикла оно, каж- • дай раз удваивается Д5/. В интервалах меэду циклами включение метки в ДНК листа невелико (рис. 5,6; а,б). Таким образом, син- • тез ДНК в клетках первого листа дискретен, носит решшкативный характер и, в первые два наблюдаемые цикла, скорее всего, отражает одновременную репликацию геномов всех клеток органа.. Поэтому выявленные циклы синтеза ДНК можно рассматривать как циклы репликации, а наблюдаемые фазы синтеза ДНК представляют собой 3 -фазы синхронизированных клеточных циклов в клетках первого листа /15/. Тем самым, первый лист этиолированных проростков пшеницы можно использовать в качестве модели для исследования соп-. ряаенноотя метилирования яПНК с ее репликацией в клеточном цикле на уровне формирующегося органа целого высшего растения (иными • словами, при морфогенезе). Мы установили, что репликация яДНК в 3 -фазе осуществляется в 2 этапа: на ранней, и поздней,' Зт -фазах, разделенных периодом менее интенсивного синтеза ДНК {средняя, э у-фаза). В и 3 ,^-фазах преимущественно реплицируются малоповторенные, а в -фазе - среднеповторенные в геноме последовательности /24/. Предполагается, что рано- и позднорешш-цирующиеся области генома в клетках высших растений функционально неравнозначны /24/.

Мы установили, что прирост ДНК в органе происходит практически только за счет синхронного синтеза яДНК в делящихся' клетках /15/. В сформировавшейся листовой пластине и колеоптиде этиолированных проростков пшеницы ДНК синтезируется практически только в митохондриях /13,15/.

Ресдикативное и пострепликативное метилирование ядерной ДНК в клеточном цикле клеток первого листа проростков пшеницы закономерно модулируют асимметрию ее комплементарных цепей по содержанию остатков 5-ыетилцитозина

Дискретность и особенности репликативного метилирования ДНК. Уровень метилирования новообразованной в разные S -фазы яДЕК в клетках первого листа в ~ 1,5 раза ниже УТЛ суммарной яЕНК (табл.3). Следовательно, .метилирование яИНК в клетках пелого растения не чавесшаетсч при репликации ",/157. Поэтому нашей задачей было определить, как происходит дометилгрование ноДНК до У?' срелой ДНК и каков собственно Т1 репликативных фрагментов, в том числе собст-, венно фрагментов Эказакь.

:.5ы определили ЛЯ новообразованной в разине моменты двух , . последовательных s-фаз яДНК из клеток первого листа импульсно (I ч) меченых /2-*4С/оротовой кислотой этиолированных проростков (табл. 4). По 37.1 эти яДНК не различаются .{табл. 4). Они примерно в 3 раза менее метилированы, чем зрелая яДЯК (табл. 8). Более 90% всей ноДНК за время инкубации с меткой представлено длинны:.® легированными фрагментами (рис. 7) [ 18/. Чтобы четко оценить собственно уровень репликативного метилирования'ДНК, следовало оп-. ределить Ж первичных дисзфетных фрагментов репликации - фрагментов Оказаки. - .'

. Выделение достаточных для такого анализа количеств фрагментов Оказаки. из любого источника, даже такого, как культура клеток, весьма затруднительно. Еще сложнее выделить и очистить от-примесей фрагменты Оказаки из тканей (органов) целого высшего рас-

Рис. 7. Распределение радиоактивности меченной /5-метил--эН/тимщцшом ноДНК первого листа этиолированных проростков пшеницы в щелочном сахарозном градиенте. Срезанные при прохождении s -фазы клеточного цикла клетками меристемы первого листа проростки инкубировали с меткой в течение 10(1), 30(2) и 60 мин (3).

Фракции■

Таблица 3. Состав, плавучая плотность и уровень метилирования новообразованных мтДНК и яЦНК в колеоптиле и первом листе ь ^ время разных циклов репликации в этиолированных

прсьостках пшеницы X £(5" ( п = 3-5 ) т--

Никл синтеза

ДНК

Источник ДНК

( Суммарная ноДНК

!_

| 4ес:

! мол.$

!

I

УТЛ

Новообразованная

ДНК

дЦНК

мтДНК

Я

г/см3

СО" мол. 5

УМ

! г/см"* ! мол.% !

! т*С

И Лист 45,1+0,7 17,4+0,5 1,700 44,4+0,6 17,2+0,5

Колеоптиль 49,2+1,4 9,4+0,7 1,700 43,6±1,4 11,2+2,0

ж Лист 44,5±0,7 16,8 1,700 44,7+0,4 16,8±0,7

Колеоптиль 52,8+1,2 4,3+0,5 1,700 45,9^0,3 12,7+1,6

и Лист 45,0+0,5 15,6±0,6 1,700 43,9+1,3 15,8+1,2

Колеоптиль 55,9+2,4 3,2+0,5 1,700 Не определяли

X Лист 46,7+0,7 16,0+0,3 1,700 45,1+1,2 16,3+0,5

Колеоптиль 55,8+1,3 1,5+0,3 1,700 (минорный компонент) Не определяли

и Лист 47,2+1,5 8,0+0,7 1,700 44,8+2,1 10,0+0,9

Колеоптиль 56,4+2,1 0,4±0,2 ,1.700 (минорный компонент) Не определяли

1,716 55,6+1,8 1,716

Нет

1,716 (минорный компонент)

1,716

1,716 (минорный компонент)

1,716

54,7+1,7 Нет Не определяли

56,8+0,9 Нет Не определяли

56,1+0,5 Нет Не определяли 1,716 57,211,1 Нет

, 1,716 (минорный КОМ-ПС :ент)

СП I

Таблипа 4. Уровень метилирования импульсно (I ч) меченной

.новообразованной яДНК первого листа развивающихся зтиолированныг проростков пшеницы, 3+ б*(а = 3-5)

Возраст про-| ^ | Возраст про- | ^

рсстка, ч ! \ ростка, ч I

56 7,2 ± 0,6 74 7,3 + 0,3

4 59 7,6 .¿ 0,3 77 7,0 + 0,7

61 , 7,5 + 0,2 80 7,7 + 0,5

63 7,9 + 0,6" 64 7,5 + 0,3

Таблипа 5. Уровень метилирования РЕЮ яДНК этиолированных проростков пшеницы (¿=0,3-0,5)

Размер фрагмента! УМ ! Размер фрагмента! уу

45 7.4 12 7,2

8 6,4 >12 : 7,4

тения. Мы разработали систему методов, обеспечиваюздх выделение и очистку фрагментов Оказаки яДНК из проростков пшеницы Д8,27/-Она базируется на использовании органа растения с естественной синхронизацией клеточных циклов (первый лист, без заметного синтеза в нем хдорошгастной ДНК (молодые этиолированные проростки), на выборе подходящего времени синхронной репликации яДНК (ранняя Б-фаза: репаративный синтез Д9_/ минимален)' и последующей очистки яДНК от примесей мтДНК с помощью центрифугирования в градиенте ПЛОТНОСТИ Се С1 Д8,19,27/.

В отличие от клеток в культуре, в делящихся клетках в органе целого растения "контактного торможения" лигирования коротких репликативных фрагментов мы не наблюдали (рис. 7). Выделенные фрагменты Оказаки из синхронно делящихся клеток первого листа этиолированных проростков пшеницы (их доля составляет ~ 2% от суммарной вновь синтезированной яДНК) метилированы (Г.! = 7,4+0,5) (табл. 5). Таким образом, в проростках пшеницы, как и з суспензионной культуре клеток табака нЬ-клетках первая стадия реплпкатизного метилирования яДНК. ■тсег:,днт":з ( ¿5 в проростках в 3-4 раза ниже Т.' :тс"Зрной клэт.т-чно.: I?"

(табл. 3,5,9,10). При датировании Фрагментов Оказаки с образованием длинных реплнкатлвннх фрагментов ( »8S ) степень их метилирования почти не изменяется (табл. 5), по крайней мере, она не возрастает как в 1»-клетках [12,"¡А] и клетках культуры табака /9/. Следовательно, в клетках меристемы проростков пшениш в-отличие от культуры клеток табака и L-клеток мыши повышенного метилирования участков лигирования во эновь синтезирующейся дочерней зепи не происходит. Итак, а проростках гшенипы новообразованная при репликапии ДНК оказывается существенно недометилированной по сравнению с суммарной клеточной ДНК. Это означает, что новообразованные при репликации дтплексы ДНК характеризуются резко выраженной асимметрией распределения остатков ш°С по комплементарны?.! - родительской л дочерней - пеням ДНК. Иными словами -репликадия - генератизозанный путь образования недометилдрован-ных ДНК з ядре растительной клетки. Следовательно, в реплицирующейся ДНК проростков пшеницы в s-фазе клеточного цикла в отличие от симметрично метилированных ДНК животных (Bird, 1978) и ДНК из культур растительных и животных клеток содержится много полуметилированных сайтов. Низкий уровень репликатиЕного метилирования ДНК в целом растении по сравнению с УМ суммарной яДНК указывает на существование в клеточном цикле особого механизма пострепликативного дометилировачия новообразованных дуплексов ДЕК. Таким образом, репликативное метилирование яДНК в клетках целого растения протекает иначе, чем з суспензионной культуре • клеток.

Мы установили, что, в отличие от ДНК-метилаз животных (см. стр.б , а так же Adaca et al., 1979; Bazin, 1985) ДНК-ме-тилаза из экстрактов первого листа почти в 10 раз эффективнее включает СН3-группы из /метил-3Н/.5'АМ в гомологичную сильноме-тиллрованную ДНК (УМ = 24-27), чем неметилированную бактериальную ДНК Pb.belozerskii . Скорее всего, это является отражением поддерживающего характера пострепликативного метилирования асимметричных по метилированию, возникающих при репликации сайтов ДНК у растений. Эти данные восполнили пробел в литературе по субстратной специфичности ДНК-метилаз из делящихся клеток высших растений ( Eazin, 1985)Дб, 17/.

Дискретность и особенности пострепликативного метилирования ДНК. Практически вся радиоактивность в ДНК из проростков, инкубированных с /2-1^С7оротовой кислотой, сосредоточена в ее пири-мидиновых основаниях (С, m5C, Т). Оксимочевина на 90-95$ ингиби-

рует синтез (включение метки из меченых уридина или оротовой кислоты) ДНК клеток первого листа проростков пшеницы /19/. Поэтому после импульсной (I ч) инкубации срезанных в начале Б-фазы ( ~ 74 ч развития) проростков с /2-С/оротовой кислотой и последующем переносе их на нерадиоактивную среду с оксимочевиной (25-50 мМ) и избытком (I иг/мл) немеченых оротовой кислоты или ¿С и аТ (при этом ~ в 10 раз разбавляющих эндогенный фоад пи-рймидиновых предшественников синтеза ДНК)ДЭ,21/ заметного включения метки в ДНК не происходило (рис. 8, б). В такой постановке опыта удалось проследить за метилированием уже предобразован-ной зрелой мечено* яДНК (га в "0"-точке составляет 7,0 - 7,5) по изменению-соотношения радиоактивности выделенных из ДНК оснований С и в5С (рис. 3, кривая 2)/19/.

Рис. 8. Пострешшкативное

метилирование образованной в начале Б-фазы яЕНК первого листа этиолированных проростков пшеницы. Проростки срезали во время первой трети Б-фазы клеточного цикла клеток первого листа и'инкубировали I ч в растворе /2- С/оротовой кислоты (0,4 мКи/ыл). После инкубации часть проростков фиксировав, выделяли из первого листа ДНК, гидролизовали ее до оснований и определяли радиоактивность в С, т°С и Т, а также уровень метилирования (Ю0-ш5С/(С+и5С) меченой ноДНК ("0" - точка). Остальные проростки отмывали от метки водой и часть из них продолжали инкубировать в нерадиоактивной среде, содержащей избыток ь-метионина (300 мкг/мл), оротовую кислоту (1,8 мг/мл) и 25-ную сахарозу (контроль), а другую часть - в той же среде в присутствии 25 мМ оксимочевины (опыт). Через определенные интервалы контрольные и опытные проростки фиксировати этанолом,выделяли из первого листа ДНК и определяли ее удельную радиоактивность (левая ось

Возраст праростна, у

ординат) и уровень метилировании меченой ДНК (правая ось ординат), а - контроль, й - опыт, I - удельная радиоактивность, 2 - уровень метилирования меченной ДНК.

Так было изучено пострепликативное метилирование ДНК в делящихся клетках первого листа проростков пшеницы и влияние на этот этап метилирования яДНК ингибиторов трансляции, транскрипции и метилирования ДНК, фитогормонов и температуры /19,23,25/. Видно (рис. 3, б), что на фоне блока репликации (.включение метки в ДРК, кривая I) четко заметно протяженное во времени интенсивное дополнительное метилирование ксДЕл (кривая 2). Оно завершается быстрее, чем з контрольных (рис. 8, а)(инкубированных без оксимочезины) проростках:в присутствии оксимочевины и избытка немеченых предшественников синтеза новые меченые фрагменты с низким уровнем метилирования не возникают, а репаратизный синтез незаметен, поскольку при этом преимущественно используются немеченные предшественники /19,21/. Скорость пострепликативного метилирования импулъсно меченой ДНК более-менее постоянна з течение ~ 15 ч инкубации, а весь процесс пострепликативного метилирования длится около 20 ч. В результате, в клеточном цикле долина постепенно сгакаться степень асимметрии метилирования новообразованных дуплексов ДНК. Таким образом, синтезированные пои репликации зэ-та-~ ^епп ДНК становятся "убсггатсм дополнительного пост—

р епликат ив н с г о м ет илисозанпя.

Поскольку интервал времени между концом и начатом б-фаз последовательных клеточных циклов в делящихся клетках первого листа, выращиваемых-при 30° проростков пшеницы менее 10 ч (рис. 5, а), то метилирование этой яДНК в них, по-видимому, не завершается в пределах одного клеточного цикла, и, вероятно, продолжается затем еще и в дочерних клетках. Поэтому важно было исследовать динамику метилирования ноДНК, по крайней мере, в -двух последовательных клеточных циклах. Это можно было исследовать только на целых, нормально развивающихся проростках.

Кезазерсенность метилирования яДНК в одном клеточном цикле. Содержание ДНК в первом листе практически удваивается в течение каждого из первых двух наблюдаемых циклов репликации. Измеряя прирост ДНК в первом листе во времени и учитывая, что синтез ДНК ( 3-фазы клеточных циклов) в значительной мере синхронен, можно довольно точно определить начата и конец каздой наблюдаемой Б-фа-зы (рис. 9, кривая I). Значит, можно проследить за изменениями в

метилировании как родительских, так и ноДНК- дочерних цепей как при репликации (Б-фаза), так и вне ее (интервал между Б-фазами) в связи с прохождением клетками первого листа фаз клеточного цикла /29/.

Как видно на рис. 9 (кривая 2) УМ меченой, синтезируемой на протяжении Б-фазы яДНК постепенно возрастает. Почти линейно протекающий процесс метилирования ноДНК не оканчивается с завершением б-фазы, а продолжается в интервале между б-фазами и в з-фазе следующего клеточного цикла (рис. 9, кривая 2). Сходным ■образом изменяется уровень метилирования лДКК, репликация которой начинается в следующей Б-фазе (рис. 9, кривая 4). Поскольку уровень репликативного метилирования (УМ = 7,0 - 7,5) в разные моменты и ^-фаз относительно постоянен (табл. 4), то возрастание результирующего ТА меченой в течение двух клеточных циклов яДНК можно объяснить постоянно осуществляемым в клеточном цикле пострепликативным метилированием не только новообразованной в 32~Фазе, но и уже вышедшей из репликации в Б^-фазе яДКК.

Таким образом, в листе как срезанных (рис.. 8). так и делах проростков новообразованная, кедометилированная яДНК практически сразу вовлекается в процесс пострепликатявного метилирования, которое может продолжаться, по крайней мере, в течение двух клеточных циклов.

Если ввести /2-^С/оратовую кислоту',в клетки проростка в конце Б|-фазы (рис. 9, кривая 3), то ноДНК к концу этого цикла метилирована в меньшей степени, чем яДНК, меченная в течение всей б-фазы (рис. 9, кривая 2). В результате, последовательности (гены), реплипированные в разные моменты я-^базы к начат/ следующего клеточного цикла метилированы в разной степени. В отличие от позднореплицирующихся, ранореплицированные последовательности к началу новой Б-фазы окажутся почти полностью метилированы. Тем самым, в делящихся клетках по уровню (асимметрии) метилирования могут дискриминироваться рано- и позднореплицирующиеся гены. Таким образом, у растений существует .скоординированностъ этапов ?ле-тшпгоования ДНК с ее синтезом и прохождение клетками таз клеточного цикла.

Чтобы выяснить, когда завершается метилирование асимметрично метилированных, новообразованных в предыдущей Зт-фазе цепей ДНК: - до или после их' вступления в новый цикл репликации, мы блокировали наступление новой Б2-ф>азы (рис. 10,(1)) или ее прохождение (рис. 10,(2)) срезанием проростков в конце Бт-фазы или

¡%-фаза Зя-сразс

&<раза

90 Ч

Рис.9 Незавершенность метилирования новообразованной яДНК в одном клеточном цикле.

1-синтез яДНК; '¿-к- - УМ ноДНК,меченной \Z-\C1оротовой кислотой: 5 - УЯ суммарной ДНК клеток первого листа.

M >•*---------- ^Т"Г^,---О- i

я80

блохреп.- НА и t

Лихации L-X——*. {

Щ !

/ >lfz) W)

f

■ \ ft ■

J i , . •

18

I

Й X

I

А

«о

! %

2.

Л К

бО 70 80 90 V

Рис.10 Постреиликативпая природа "завершающего" в-Зь-фазе метилирования новообразованной в#4азе яДНКЛ-удельная радиоактивность'(УРУ НоДНК в несрезанных, а 1(1) и 1(2) - УР ноДНК в срезанных в возрасте 65 и 70 ч (стрелки) и помещенных " в среду с оксимочевиной проростках.П - Ж ноДНК в несрезанных, а П(1) и 11(2) - в срезанных в возрасте 65 и 70 ч и помещенных в среду с окси-иочевиной проростках.Здесь и на рис.9 приведены средние величины*х).о не прев'.'шает Ь-1% от х

«

IM

начале s ¿-фазы и инкубацией с оксимочевиной и избытком немеченых ат и dC. На фоне этого блока (рис. 10, I и 2) отчетливо заметно дополнительное метилирование образованной в sj-фазе яЕНК (рис. 10, ДШ иП(2)). Таким образом, "завершающее" метилирование образованных в предыдущей ,Я74!азе асимметрично метилированных дуплексов яДНК происходит еше до вступления в репликацию и имеет пострепликативнта природу /29/. По-видимому, прежде, чем войти в новай цикл репликации, обе цепи в дуплексах ДНК должны быть симметрично прометилированы.

МЕТИЛИРУЕМЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ И ИХ СПЩЙИЧЕСКАЛ ОРГАНИЗАЦИЯ В ШиШ7ЛРУЩЕГ.^Я ЯДЕРНА ГЕКО:.З У

ВЫСШИХ РАСПЕЙ —

Дна изучения специфичности метилирования ДНК высших растений и животных" мы разработали методы: I) разделения пиримидино-вых дезоксирибоолигонуклеотидов, выщешшемых из ДНК в результате специфического гидролиза (burton, Petersen'. I960), по длине и составу путем одномерной или двумерной тонкослойной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе /11,31/ и 2) количественного определения циримидиновых последовательностей в ДНК и содержания в них остатков 5-метилцитозина ( п?С) /11,18/. При ТСХ в первом направлении при рН 5,0-5,1 в 0,2 М N аС1 четко разделяются по длине, а во втором направлении при рН 3,0 в 0,3 М NaCI -.но составу 6-8 пирими-диновых изоплит структурыPyQpn+1 (рис. II). В этих условиях . п?С не влияет на хроматографическую подвижность содержащих его циримидиновых последовательностей Д1,31/. Количественное спектро-фотометрическое определение таких дезоксирибоолигонуклеотидов проводили по изобестической точке дезокситимидиловой и дезокси-цитидиловой кислот с учетом рассчитанного наш поправочного коэффициента

» ' С+гпК С

Определение изобестической точки, а также спектральные отношения компонентов в изобестической точке ( л = 0,54; = 265 нм)

проводили, как описано нами ранее /7,11/. Содержание п£с в олиго-нуклеотиде определяли после его гидролиза до оснований 57^-ной Н0104 и разделения оснований путем двумерной тонкослойной хроматографии на целлюлозе /II/..

Метод был использован для изучения содержания циримидиновых

^ О) ; О)

ооз

Рис. II. Двумерная ТС1 пари- .

мидиновых дезоксири-боолигонуклеотидов на ДЭАЭ-целлюлозе. I - Ср2; 2 - Тр2? 3 - С2р3; 4 - (С,Т)рз; 5 -Т2р3; 6 - Сзр4; 7 - С2Тр4; 8 - СТ2Р4; 9 - ТдР4; 10 - С^р5; II - С3Тр5; 12 - С2Т2Р5; 13 - СТзР5; 14 - Т4р5 И т.д.

/ направление

Рис, 12. Уровень метилирования некоторых пири-мидиновых дезоксирибоолиго-нуклеотидов с различным содержанием цитозина из ДНК растений и животных

изоплит в ДНК различных организмов /1-7,32,33/. В табл. 6 и 7 приведены результаты количественного определения описанным способом разных по длине и составу пиримидиновых дезоксирибоолигонук-леотидов из различных по происхождению ДНК, в частности, ■ содержащих неидентифицированные основания /6,7/. Результаты определения ■ пиримидиновых изоплит в ДНК печени крысы, селезенки быка и зародышей пшеницы совпадают с данными других авторов, полученными •

Таблипа 6. Содержание пиримидиновых изоплит- в ДНК, мол.?

й изо-плита

Т

Источник ДНК

Цианофаг{Лягушка | Кшса, ; Бык, ¡Ландыш, Пшеница^Фаг ¡озерная,( печень ¡селезен-¡листья ¡затзоды I ' » ! ка

Б-2Ь

! печень

ТТТИ

БЫзеПа аоппех ж

"Уфа"

' 1 г 1 10,0-0,3 '1 12 2~*"0 2 12,3±0,5 11,0±0,2 ! I2.l-t0.ll |2.4±0.2 14.0±0.2

и ! 15,5+0,4 11'2+о',3 ! 11,2*0,3 10.6+0,1 ll.SiO.ti 12,2"^ 0,3 11.8Г0.2

ш 11,0 ":0.4 7.К0.1 8,9+0,1 7.9+0.3 3.4±0.2, 8.4±0.3 Ю.З^О.З

IV ; 6,2±0,3 . 5."±0,1 6,4+0,2 5,8+0,2 8.1±".1! ' 5.7+0.2 6.3+0.3

V 3.2^-0,3 3.5Г0.1 4.0 -.0.1 4 '.±0.2 3.8±0,Г, З.Э±0,1 4.1Г0.3

VI Ь"-о.г 2.1*0.1 2, Г, К), 2 3.4^0.1 1 2,»Г0,1 2 ,'!' | ' .1

VII 0.0-0.1 1.3Х.0.1 1.7 <-0.2 2.0±".1 1.8Г0 2 ' 1.8+.П.2 1.2±п.1

VIII п.з+о.о 0.6- ).1 1.0~0,1 1.8Г0.2 1.о-*о,1 ; 1.1±».2

IX 1.5+0.3** 5,2±0,3" 2.<)±0,2** 1,1±0.1 О,3±0.2 1 0.8±0,2

X» 2,0±0,1 1,7±0,3 1 1.4i0,3

* ДНК цигнофага э-21< любезно предоставлена й. Я. Худяковым, а ДНК фага "Уфа" - Л.А.Замчук и Д.М.Гольдфарбом.

ш

Суммарный нуклзотидный матерзал более длинных изоплит

Таблица 7. Содержание пиримвдиновых дезоксирибоолигонуклеотидов в ДНК растений и животных,

коя.%

й изо-¡Состав ;__

плита доплата; К:зыса1 , ! '.печень

Источник

! Бык, ¡Лягушка,¡Пшеница, !.селезенка!печень !затюдшпи

¡Ландыш, ¡листья

' 1 Ср, Тр, . 24±0.25 7,эв±0,35 4,47±0.12 9,79±0,11 4,76+0,12 7,44^:0,13 5,75+0,11 ! 1 6,65+0,11 5.50Г0,17 6,60±0,17

II I 1 С,р ■ ! <СТ)р, | т<р. 2,20±0,14 5,63±О.ОЭ 3,27±0,12 1,86+0.10 5,72—0,14 3,06-0,13 1.86+0.11 5.82±0,12 3,52—0,10 3.09±0,20 5,60±0,15 3,51+0.17 2,43±0,13 6,07+0,11 3,40±0,10

ш ! с,Р. ! (С,Т)Р, , (СТ,)р, т,р, 0,М±0,08 2,90±0,31 3,74±0.26 1,82±0,12 0,53+0.10 2,13±0.20 2,97+0.12 1.6610,12 0.43+0.0Я 2,47 *:0,02 3,18±0.05 1,82±0,12 0,68±0,17 2,8510.30 3,21±0,15 1,66±0,14 0,65+0,07 2,71+0,13 3,42-0,14 1.62±0,05

IV 1 С«р, (С,Т)р5 ; ;. (С,Т,)р« <СТ,)1* 1 • т.р» 0.33+0.07 |,09г'1.05 2,21+0.22 1,77±0.05 0,8.4+0.14 0.19±0,05 1,'И+0.02 2,02±0.10 1.79±0,10 0,79+0,03 ; 0,17+0.03 0.87+0,06 1. «8+0,10 1.85±0,10 0,93±0.Н 0.32±0.03 1,14±О,07 1,94+0.17 1,61±0,14 0,69±0.09 0,39+0,03 1,08+0,08 2,00±0,07. 1,85±0,07 0,78±0,10

V 1 1 1 1 С,р, (СД)р. (С,Т,)р. ' . (С,т,)р. (ст,)р. • ; 0,15+0,03 0,33+0.05 0,95±и,05 1.33±0.08 1.02+0.05 0,35±0,04 • 0,05+0,02 | 0,32±0.06 . 1,00±0,13 1,50+0,13 1,04±0,1О 0.49±0,10 .<0,02 0,11±0.01 0.74+0,10 1,15+0,16 1 1,05+0,06 ' 0,45±0,06 0,15+0.05 0.39±0.08 0,93±0,10 1.25-0.09 0.85±0.11 0.23+0,04 0,05+0,02 0,39±0.06 0.85—0,03 1.12+0,11 1.02—0.10 0,37±0,03

другими методами, а также комплементарны данным, полученным при определении пуриновых изоплит в соответствующих ДНК аналогичным методом, разработанным соаместно с Н.Г.Лопатиной и др./20/.

В основном, ш^С в ДНК животных и растений содержится в моно-и дипиримидиновых последовательностях. В ДНК животных цитозиновые остатки максимально метилированы в выделенной монопиримидиновой Фракции, а в ДНК растений - в последовательностях Ри-С-Ри и-Рц-(С,Т)-Ри (рис. 12). В ЛЕК ландыша цитозиновые остатки в последовательности (С,Т)р3 метилируются как на 3 -, так и на 5 -конце олигонуклеотида. Кроме того, часть последовательностей С^рд в ДНК пшеницы и С3р4 и. С4р5 в ДНК ландыша содержат, по крайней мере, по два метилированных цитозиновых остатка (табл. 8 /II/). Значит, Таблица 8. Содержание•5-метилцитозина в пиримидиновых дезокси-рибоолигонуклеотидах из ДНК растений и животных

'.1 изо- С-содеожа-щие олиго-нуклеотиды изоплита 1 Бык, селе- ; зенка \ Лягушка, | печень ) Пшеница, зародыши Ландыш, листья

плит а мол.от , % ¡всего; ! т5С 1 т I мол.\% ОТ| % ¡все-; !г§ ! 'с мол.от % ¡всего !'ш5С > ' 'йг " кол.\% от "¿о ¡всего ! и5С !

1 Срг

И СгРъ (С т)рз СъРи

ш

(СзОРг Ыр;г

(СГз)Д^

Содержание ш С в ДНК, иол.%

III

Ш

0,76

0,12 0,17

0,03 0,13 0,03

58,0

9,0 13,0

2,3 10,0 2,3

1,02 54,0

0,25 13,2

0,23 12,1

0,04 2,1

0,16 8^4

0,07 3,7

2,3

0,90 1,09

0,17 0,42 0,27

0,10 0,17

0,06

40,4

15,8 19,1

3,0 7,4

4.7

1.8

3.0

з:?

1.1

3,03

1,12 1,89

0,28 0,70 0,43

0,16 В',29

0,17

36,0

13,3 22,5

3,3 8 3 5,1

1,9 3,0 3,5 2,0

1,31+0,05 1,9+0,4 5,7+0,2

8,4+0,3

в ДНК растений с 3 -конца от ш °С может быть любой из четырех-пяти нуклеотидов. Иными словами в отличие от ДНК животных, у которых метилируется почти только симметричная последовательность с осью вращательной симметрии, проходящей между остатками С и 8 (5*-

—Со»—3 ), в ДНК оастен;;У; г.-тетилируется как Со^-последовательность. так г вырожденная последовательность СзХп£ с осью вращательной симметрии, проходящей через X (X - любое основание): 5*-Стфэ6-3*.

Независимо и одновременно с нами к аналогичному выводу пришла другая группа исследователей ( СгиепЪаиш еь а1., 1981).

Уровень метилирования ДНК модет определяться как частотой встречаемости метилируемых сайтов в ДНК, так и регуляцией доступности сайта и активности ДНК-метплаз при репликации и вне репликации ДКК в ¿летке. Поэтому на следующем этапе работы мы попытались выяснить, насколько скоординировано метилирование с синтезом ДНК. К сожалению не известно, одна и та же или разные метилазы ■участвуют в репликативной и пострепликативной модификации яДНК у растений. Тем ке менее, функционирующие на разных этапах клеточного цикла ДНК-мегилазы (метилаза) могут отличаться по свойствам, например, по субстратной и сайтовой специфичности. Относительное содержание т "С в моноииримидиновых фрагментах, на наш взгляд, :.:ож-( , но использовать в качестве характеристики сайтовой специфичности метилирования (ССУ) ДНК на разных его этапах в клеточном цикле и при различных воздействиях на клетку. Мы оценили этот показатель (СИ = доля 1^0 в последовательности Ри-ш^С -На) у фрагментов Оказаки ( ^5в), лигированных репликативных интермедиатов ( в) и суммарной ДНК клеток первого листа этиолированных проростков пшеницы (табл. 9). Можно видеть, что ССМ фрагментов Оказаки ( 453) ■ (ССМ = 18-20) резко отличается от ССМ (40-42) лигированных фрагментов и "зрелой" ДНК (табл. 9). Следовательно, в лигированных фрагментах репликации должны преимущественно метилироваться иные, чем до лигирования фрагментов Оказаки участки. Любопытно отменить, что ССМ фрагментов Оказаки из проростков пшеницы оказалась практически идентичной ССМ фрагментов Оказаки из ь-клеток мыши (Демидкина и др., 1979). Таким образом, как з животных клетках фрагменты Оказаки проростков пшеницы по опецлтлчноот:: -.:бтлл;гроБа-ния резко отличается от лигированных тсагментоз. До нашел данным, дополнительное метилирование, условно относимое к ДНК участков лигирования происходит преимущественно в чередующиеся ?и - Ру --Ри последовательностях ДНК /18.27,28/. Пострешшхативное метилирование яДНК не изменяет характера ее метилирования в клеточном цикле (табл. 9). Таким образом, каждый этап :.пд::т:;:-:апп:г ДНК у. растений характеризуется особой сайтово:: опеплхлчноотьа. Это может объясняться или различной специфичностью соответствующих ДНК-мети-лаз, либо особенностями функционирования одной и той же метилазы в составе репликативного комплекса и в "свободном" виде.

■ В реплицирующемся ядерном геноме последовательно делящихся клеток формирующегося первого листа проростков пшеницы по степени

Таблица 9. Сайтовая специфичность метилирования яДНК первого листа этиолированных проростков пшеницы

ДНК ; ССМ

я Я Репликативные ^5s 18 - 20

к ® ф фрагменты ¿8s 40 - 42

а а к с-" о Долгомеченная /2-^С/ ооотовой кислотой яДНК ( ~ 24 ч) 40-42

о, о о, с ДНК зародышей' пшеницы 40,4

2 ж Е-" 3 ф а § § 1 ~ Фрагменты Оказаки Зрелая ДНК 18,8+5,4 43,6+3,2

s (Демидкина и др., 1979)

с.

асимметрии распределения остатков m С по комплементарным - роди-, тельской и дочерней цепям ДНК и сайтовой специфичности их метилирования можно выделить по крайней мере три типа дуплексов ДНК. I тип - дуплексы, в которых комплементарные цепи по уровню ( =*25) :■: специфичности метилирования (ССМ = 40) не различаются. У прокариот именно симметрично метилированные дуплексы по постулату Тэй-лора (Taylor, 1978) могут вступать в репликацию. Я тип - новообразованные при репликации дуплексы ДНК: они отличаются от дуплексов I типа резкой асимметрией содержания остатков и качественно иной специфичностью метилирования комплементарных цепей ДНК. Так, в дуплексах, где дочерней цепью являются фрагменты Оказаки (тип Я А) или участки их лигирования (тип Я Е) разница в ТО цепей составляет величину 18,5. По специфичности же метилирования фрагменты Оказаки (CCJ.I = 18-20) резко отличаются как от участков их лигирования (ССМ = 8С ), так и от родительских цепей ДНК (ССМ=4С ). Ш тип дуплексов, представленный, по-видимому, основной массой ДНК делящихся клеток, является переходной формой между Я и I типами и характеризуется постоянно уменьшавшейся по мере "созревания" ДНК степенью асимметрии комплементарных цепей по распределению в них остатков ш°С. Это уменьшение асимметрии скорее всего обусловлено функционированием пострепликативной ДНК-метилазы "поддерживающего" типа, субстратом которой являются полуметилированные•

сайты в новообразованных дуплексах ДНК П типа (рис. 13).

Родительская цепь ДНК УН=25-26 CCli =40-42

I

Фрагменты Оказаки

«►Участок ;игиоования

УМ <25 ССМ=40-42

Л!=25-26 CCU=40-42

Л!=7-7,5 СС-=18-20

Т.'.=1-1,5 CC!i=80-82

УМ<25 ' ССМ=40-42

!-»-Дочерняя цепь ДНК

Тип III дуплексов (слабо ■ асимметричны)

Тип I дуплексов (симметричны)

Тип II А дуплексов (резко асимметричны)

Тип II Б дуплексов (резко асимметричны)

Тип III дуплексов (асимметричны)

• метилированный сайт о неиетилированный сайт

■ t '

Рис. 13. Схема организации метилируемых .сайтов в яДНК псеницы при ее репликации.

Изменение уровня, субстратной и сайтовой специфичности метилирования ДНК в клеточном цикле долены, вероятно, привести к заметным дая ДНК - белкового узнавания кокформационным перестройкам дуплексов ДНК, вступающих.в репликацию (I тип), реплицирующихся (Я тип) и вышедпих из репликации (Ш тип). Взаимодействие с такими участками специфических белков может повлиять на специфическую организацию хроматика таких участков и взаимодействие с ними ферментативных комплексов репликации, рекомбинации и транскриптпти.

Таким образом, выявленная нами закономерная модуляция сте-

клеточных цп :клах посседотзг/. л оеиллк.'.тлвн зп л пооттепллкатлвнтго

метплпоованя [q ;- пастени: t ■.'о.'кэт ".'icатьол как мэханкзм.

опоеделятю!-":^ : очередность ;i i гочнсоть гепллкаглл и экспрессии генов

в клеточном цикле.

Гипотеза о возможных функциях этапности метилирования ДНК в клеточном цикле делящихся клеток формирующегося органа растения: контроль за точностью удвоения и очередностью репликация генов в одной и той же и в последовательных Б-фазах клеточных циклов

Выявленная нами каскадная организация метилирования ДНК при репликации ядерного генома в последовательно и многократно делящихся клетках первого листа проростков пшеницы пока что является уникальной естественной моделью для исследования вопросов о связи метилирования ДНК с регуляцией репликации генома и клеточной диф-ферекцироЕкп у высших зукариот.' ДНК, находящаяся на разных этапах репликации и созревания в клеточном цикле существенно различается по уровню и специфичности метилирования комплементарных цепей (рис. 8-10, 13, табл. 3-5, 9). Хаг>актео:~;е :: последовательные изменения з уровне и специфичности метилирования ДНК, относительно жестко дйтео'.ргя;грозакные временем ее репликации з клеточном цикле. могут определять зремя. очередность и точность процессов репликации генов, их транскрипцию и рекомбинацию гомологичных участков ДНК. ¿ели постулировать, что з репликацию вступают симметрично метилированные дуплексы ДНК, а степень экспрессии обратно коррелирует с уровнем метилирования гена (или регуляторных участков генома) ,(1:знюшин, 1983), то в ранней э-разе будут реплицироваться полностью прометилированные участки генома, на которых уже за-зершена транскрипция ( Б-р-ДИК, рис. 14). 3 это время последовательности ДНК, которые вступают в репликация в Б-^фазе ( БЬ-ДНК) метилированы асимметрично, они еще экспрессируются и их репликация, по-видимому, запрещена. По окончании репликации б-7-ДНК но-зообразованные з--дуплексы резко асимметричны по содержанию ЕЭС з комплементарных цепях ДНК, новообразованные значащие цепи з^-генов метилированы мало и их экспрессия не запрещена. При этом повторная их репликация з этом же клеточном цикле (по постулату) запрещена. В результате пострепликативкого метилирования Б^-по-следовательности из предыдущего клеточного цикла постепенно становятся симметрично метилированными, транскрипция "поздних" генов прекращается и они вступают в репликацию. В результате к концу з, -фазы содержание ДНК на клетку удваивается. К началу новой Б-фазы Бтг- и Бь-последовательности будут метилированы в той же степени , как и перед предыдущим циклом синтеза ДНК (рис. 14). Достижение Бг>- и б -дуплексами такого состояния будет зависеть

Рис.14 Гипотетическая схема участия метилирования ,'лНК в контроле за точностью удвоения и

очередностью репликации участков генома в ¿У-дазах последовательных клеточных циклов.

от скорости пострешшсативного дометилироваяия, которое скоординировано с продолжительностью клеточного цикла. С помощью такого механизма в ряду последовательных клеточных делений будет сохранена точность удвоения и очередность (последовательность) репликации (и экспрессии) генов в клеточном цикле'. Изменение уровня и специфичности метилирования того или иного гена в зависимости от времени его репликации и компетентность к транскрипция в клеточном цикле должны модулировать и собственно генную активность в клетке. Благодаря этому механизму будет довольно строго поддерживаться очередность экспрессии регуляторных белков, участвующих в инициации и терминааии тех или иных фаз клеточного цикла.

■ ОТДЕЛЬНЫЕ ЭТАПЫ МЕТИЛИРОВАНИЯ яДНК 7 РАСТЕНИЙ В КЛЕТОЧНОМ ЦИКЛЕ: ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРОВ

Разные этапы метилирования ДНК, скорее всего, должны существенно различаться как по пространственной организации в клеточном ядре, так и по регуляции в клеточном цикле. Поэтому на следующем этапе работы мы изучили влияние на тот или иной этап метилирования ингибиторов транскрипции, трансляции, метилирования ДНК и фитогормонов,

Постоепликатизное метилирование. Так как этот этап вносит более 70^-ный вклад в суммарное метилирование генома и реализуется на всех этапах клеточного цикла, можно было думать, что для него необходим постоянный синтез SÍU и соответствующей ДНК-мети-лазы. Однако оказалось, что при действии ингибитора трансляции-циклогексимида - пострепликативное метилирование не нарушается /25/. s -изобутиладенозин (1,5 мМ) подавляет метилирование импуль-сно меченой ноДНК вне репликации (рис. 15). По-видимому, 52ВА-сильнкй конкурентный ингибитор пострепликативной ДНК-метилазы. Следует отметить, что степень его воздействия на пострепликативное метилирование заметно уменьшается во времени (рис. 15). Это, скорее всего, следствие распада ДГВА в клетках первого листа. Таким образом, пострепликативное метилирование может регулироваться в клеточном цикле "активной" концентрацией 5АМ: его недостаток может сказаться на степени завершенности метилирования ядерного генома и компетентности соответствующих его компартментов к инициации репликации. На пострепликативное метилирование не влиявт высрк^е концентрации (100 мкг/мл) актиномипина Д и ЕьВг /2?7-Еострешшкативное метилирование зависит от температуры инкубации

Рис.15. Влияние ДЕВА и 5-азацити-дина на пострепликативное метилирование импульсно меченной в начале З-фазы яДНК в клетках первого листа этиолированных проростков пшеницы.

Рис. 16. Влияние температуры на пострепликативное метилигювакие

новообразованной в а;-фазе ДНК (а) и включение ^4СН3-груш1 из ь-/метил-х4С/метионина в ^С ДНК (б) клеток первого листа этиолированных проростков пшеницы вне репликации .(в присутствии 50 1,1.1 оксимочевины).

проростков. Так, при 30° этот процесс идет с максимальной скоростью, а при 40° и 50° он полностью блокирован (рис. -16). Скорее всего, это связано с подавлением активности пострепликативной ДНК-метилазы. Однако, не исключено, что под влиянием высоких температур в ядре может измениться доступность определенных сайтов в ДНК хроматина для метилирования.

Относительное постоянство скорости пострешшкативного метилирования ДНК в клеточном цикле, по-видимому, может определять стабильность и точность механизма регуляции удвоения ДНК при репликации п очередности синтеза и экспрессии тех или иных генов в последовательных циклах репликации.

Репликативное метилирование. В отличие от протяженного во времени (клеточном цикле) пострешшкативного метилирования, репли-кативное метилирование жестко скоординировано с репликативнкм синтезом (металаза - компонент репликатпвного комплекса*). Можно было предположить, что "репликатдзная" ДНК-метилаза "приспособлена" функционировать на фоне "избыточных" концентраций э -аденозилго-мопистеина. 3 таких условиях "реплзкативная" ДНК-метилаза, а отличие от "пострепликативной", должна четко различать 5АМ и его аналоги. Мы изучили влияние 51ВА на синтез и редликативное метилирование яЕКК в проростках пшеницы (табл. 10). Таблица ГО. Уровень и специфичность метилирования репликативных фрагментов ДНК, синтезированных в присутствии 51ВА и 5-ага-С в Б-фазе клеток первого листа этиолированных проростков пшеницы, { п- 3-5)

Вариант опыта 1 ; } Размер реп- ; ланативного ( ; фрагмента ; ; ко ДНК, з га 1 { \ ! ! ССМ

Контроль 4. 5 7,8 + 0,4 18,5 + 1,5

¿15 10,4 + 0,2 46,0 + 2,0

51ВА, < 5 5,3 + 0,3 21,7 + 2,0

1,7 мг/мл Ж 6,9 ± 0,4 45,0 + 2,0

5-ега С, 4 5 1,0 + 0,2 33,1 + 1,4

£00 ют/мл >15 1.0 ± 0,2 52,0 + 3,0

Срезанные проростки инкубировали с /2-^4С/оротовой кислотой или Ь-Д-.етил-^С/метионином в течение 3 ч, так что датированные фрагменты ( »I® ) в контроле уже подвергались пострешшкативному метилированию (УМ = 10,4 + 0,3). В то же время з присутствии 1,5 м?Л <!>13А лигироваяная ДНК отличалась по уровню метилирования от фрагментов Оказаки, которые, по сравнению с контролем, были

заметно (на ~35#) недометшшрованы (табл. 10). Следовательно, 5IBA ингибиртет и репликатизное метилирование, но. в отличие от пострепликативного (блок), в меньшей степени. Таким образом, "реп-ликативная" и "пострепликативная" ДНК-метилазы должны четко различаться по сродству к аналогу <?АМ- s-изобутиладенозину.

Одним из наиболее интересных ингибиторов метилирования ДНК у эукариот оказался 5-азацитидин (5-aza-C)( Piskala, Sorn, 1964; Jones, 1985). Попадая в клетку, он фосфорилируется и включается в ДНК и РНК по матричному механизму вместо ¿СМР. ДНК-метилаза прочно связывается с 5-aza-C-содержащей ДНК и "выходит из игры" СJones, 1985). О влиянии 5-aza-C на метилирование ДНК у растений ничего не известно. Мы исследовали влияние 5-азаиитидина на реп-ликативное и пострепликатиБное метилирование яЕНК в клетках первого листа этиолированных проростков пшеницы (табл. 10, рис. i5). Видно, что этот ингибитор резко и почти полностью (на 80-90$) подавляет метилирование фрагментов Оказаки (табл. 10). При этом изменяется также специфичность "остаточного"(в присутствии 5-aza-C) метилирования. Более того, лигированная ноДНК метилирована в той же степени, что и фрагменты Оказаки (УМ = 1,0). Следовательно, 5-aza-C подавляет обе стадии решшкативного и пострепликативное метилирование ДНК. Однако при добавлении 5-aza-C в инкубационную среду для изучения пострепликативной модификации ДНК скорость пострепликативного метилирования не изменялась ,'(рис. 15). Следовательно, в свободном виде 5-aza-C не влияет на: пострепликативное метилирование ДНК, а лишь включившись в ДНК,он почти полностью подавляет как решшкативное, так и пострепликативное ее метилирование /"25, 28/.

ВЛИЯНИЕ ФИТОГОРМОНОВ И ИХ СИНТЕТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ НА РЕЕШКАТИВНЫЙ СИНТЕЗ И МЕТИЛИРОВАНИЕ яДНК

0 влиянии фитогормонов на репликацию и репликативное метилирование в s-фазе клеточного ц^-^а в делящихся клетках формирующегося органа в целом растении ничего не было известно.

Мы изучили влияние различных экзогенных фитогормонов и их синтетических аналогов (индолилмасляная кислота, 2,4-Д, кинетин, Ыб-бвнзиламинопурин, гиббереллсвая кислота SA3) на репликативный синтез яДНК на разных этапах s-фазы клеточного цикла (табл. И). Все эти соединения в разной степени, в зависимости от концентрации и момента s-фазы, ингибиоуют реплякативный синтез ДНК. В наибольшей степени (в 2-2,5 раза) репликативный синтез ДНК подавля-

Таблица И. Влияние фитогормонов на включение радиоактивности из /2-^4С/оротовоЙ кислоты в ДНК клеток первого листа в разные моменты Б-фазы. Приведена средняя величина х; <54 5% от*. ( п= 3-5)

Гормон Кони, гормона, Й Удельная радиоактивность ДНК, % от контроля

3Е ■ Ч

Контроль - 100$ (60 ООО расп/мин на 1 мкмолъ А) | 100/1 ,443 000 | 1 расп/мин на } 1 'I мкмоль А) ( , 100$ (33 200 расп/мин на I мкмолъ А)

2,4-Д Ю-4 43 39 67

10~5 40 57 78

Кинетин ю-4 41 44 61

иг5 40 51 50

БАЛ Ю-4 ■ 41 ' 65 86

10"° 43 54 66

гк ю-5 Ю-6 - 66 50 41 60

есая шли в первой половине з-фазы и в наигленьшей - во второй половине (табл. II).

Ингибируюцее действие фитогормонов и их аналогов на репли-кативный синтез ДНК не является избирательны:.! в отношении каких-либо репликативных интермедиатов или скоростей формирования фондов пиримидиновых предшественников синтеза ДНК [22].

Все изученные Фитогормокы л их аналог:: з •разно:? степени (в зависимости от концентрации и момента Э -фазы) ;:нг;ю:готат репли-катпвное метилирование яДНК (табл. 12 ). Наибольшее (до 30£)- подавление репликативного метилирования при инкубировании проростков с разными фитогормонами происходит, в основном, в бщ- и. Э^-фазах клеточного цикла (табл. 12).

Мы установили, что в среде без ауксина (2,4—Д) или в присутствии его физиологической концентрации (I мг/л) клетки табака не различаются по степени метилирования как коротких, так и длинных фрагментов ноДНК /9]. Однако при повышенной концентрации 2,4-Д (5 мг/л) фрагменты Оказаки метилируются в такой же степени, как и при физиологической концентрации фитогормона, зато последушцёго дополнительного метилирования лигированных фрагментов не происхо-

Таблица 12. Влияние фитогормонов на решшкативное метилирование ДНК в .¿тетках'' первого листа проростков пшеницы в . , разные моменты б -фазы5

X

Условия }Конц. Уровень метилирования, + 6

инкубации |гср|тона'

Контроль 7,9 + 0,6 8,0 + 0,8 8,2 + 0,7

2Д-Д иг4 7,0 + 0,4 6,6 0,6 6,6 0,4

Ю-5 8,0 6,2 + 0,7 7,8 + 0,2

Кинетин "ю-4 7,9 4,2 + 0,2 6,5 + 0,5

ГО-5 8,5 + 0,3 . 6,7 0,1 6,5 + 0,7

БАЛ , ют4 4,5 ± 0,4 7,4 5,5 + 0,3

ю-5 7,9 5,5 0,7 6,3 + 0,2

ГК ю-5 — 7,6 + 0,7 5,3 + 0,5

ю-6 - 6,0 + 0,2

и 83 ч (бт)

срезали.

Проростки в, возрасте. 74 ч (эц). 78 ч (з у) инкубировали 30 мин в растворе фитогормона и затем еще 1 ч в присутствии-фитогормона и метки (0,25 мКи/мл/2-*4С/оротовой кислоты). • '

дат /9/. Это согласуется с нашит.ш данными. о 'том, что в клетках табака и в.проростках пшенипы в таких>условиях заметно подавляется включение радиоактивности из Ь-/метил-3Н/метионина в ДНК /Ь, 23/. . • '

Таким образом, сбитоготаоны влияют на определенную стадию репликативного метилирования ДНК как в культуре клеток, так'и в клетках целого растения.

В то же время изученные фитогормоны и их синтетические аналоги практически не влияют' на процесс пострешикативного метили' рования ДНК в клетках первого листа, проростков пшеницы /23,25/. Таким образом, действие фитогормонов в делящихся клетках формирующегося органа.целого растения почти исключительно направлено на решшкативное метилирование яДНК и почти не затрагивает ее пост-решшкативного, метилирования.

Итак, все изученные здесь фитогормоны регулируют решшкативное метилирование ДНК по принципу негативного контроля, и в результате их действия во вновь сформированных дуплексах ДНК возникают дополнительные полуметилированные сайты. Иными словами,

индукция дифференцировки как з клетках животных, так и , по-видимому, у растений, в качестве необходимого этапа включает формирование недометилированных участков ДНК, возникающих при решлкацк: ядерного генома.

Здесь мы доказали, что у растений эффективным механизмом образования недометилированных сайтов в ДНК служит ее репликация; можно думать, что и в норме образование неметклированных участков в ДНК при репликации не обходится без участия эндогенных фитогор-монов. Можно предположить, что ь делящихся клетках под действием фитогормонов на синтез и метилирование ДНК в з-фазе клеточного цикла гложет изменяться временная оргагззация репликации и экспрессии генома, что может сказаться на последующих этапах клеточной диффэрекпироБки. Иными словами, одним из неизвестных ранее механизмов молекулярного Действия фитогормонов на регуляцию экспрессии гзков, репликацию ДНК и клеточную дифференцировку гложет служить открытая нами модуляция (репликативного) метилирования яДНК в растительной клетке под действием этих регуляторов роста и развития растений.

заводы

1. Разработана система методов выделения ДНК из субклеточных ор-ганелл растений и животных и количественного определения содержания модифицированных оснований и сайтовой специфичности метилирования суммарных и новообразованных при репликации ДНК. Зта система включает:

а) метод выделения из животных тканей митохондриальной ДНК и ее очистки от примесей яДНК с помощью обработки митохондрий суспензией ДЭАЭ-целлюлозы;

б) метод разделения по длине и составу ппримидиновых и пуриновых дезоксирибоолигонуклеотидов с помощью двумерной тонкослойной хроматографии на ДЗАЗ-целлюлозе;

в) методы количественного определения ш°С в пиримидиновых последовательностях и ш"С-содержащих пиримидиновых дезоксирибоолигонуклеотидов из ДНК разного происхождения;

г) метод выделения и очистки фрагментов Оказаки из тканей и органов целого растения.

2. Впервые установлена различная природа метилированных оснований в ДНК ядра и митохондрий у высших растений, а также в ДНК митохондрий высших растений и позвоночных животных.

а) в мтДНК пшеницы найден Ыб-метиладенин; в отличие от яДНК мтДНК пшеницы неметилирована по остаткам цитозина;

б) все изученные мтДНК позвоночных животных содержат 5-метил-цитозин, а митохондрии животных - цитозиновые ДНХ-метилаз-ные активности, которые отличаются по специфичности действия от ядерных.

3. Характерном и отличны:,! с.' яДНК свойство:.: структуры всех изученных нами мтДНК (высшие рйЬтения, позвоночные животные) является низкая сблоченность пиримидзновых нуклеотидов.

4. Открыт синхронный и периодичный репликативный синтез яЕНК в клетках формирующегося первого листа и мтДНК в стареющем колеоп-тиле этиолированных проростков пшеницы. Наблюдаемые циклы синтеза яДНК представляют собой Б -фазы клеточных цтклов. С помощью этой модели изучено метилирование ядерного генома в клеточном цикле на уровне формирующегося органа целого растения.

5. Открыто решшкативное метилирование ядНХ э клетках целого растения (проростки пше-1ицы):

оно проходит в две стадии: сначала метилируются фрагменты .Оказаки, а затем продукты их лнгпрования; новообразование при репликации дочерние цепи ДЕ\ в 3-4 раза недомет;:д:роза-ны по сравнению с суммарной (родительскйй) ДЕ'.; в результате новообразованные дуплексы яДЕС метилированы резко асимметрично. Таким образом, доказано, что('реплккация - путь уменьшения содержания т^С в ДНК у растений.

6. Открыто пострепликативное метилирование яЕНК в ¡слетках целого растения:

во время этого протяженного в клеточном цикле процесса метилируются дочерние недометилированные цепи в асимметрично метилированных дуплексах яДНК, в результате новообразованные в разные моменты б-фазы яДНК к началу следующего клеточного цикла метилированы в разной степени; пострепликативное метилирование завершается до вступления яЕНК в репликацию. Тем самым, в делящихся клетках по уровню (степени асимметрии) метилирования могут дискриминироваться рано- и поздяореплл-цирующиеся компартменты генома.

Таким образом,у растений существует скоординированнооть этапов метилирования ДНК с ее синтезом и фазами клеточного цикла.

7. Впервые изучены сайтовая специфичность метилирования яЕНК и организация метилированных сайтов в реплицирующемся ядерном геноме клеток бысешх растений.

а)Установлено, что метилирование яДНК у растений осуществляется в последовательностях с осью симметрии, проходящей меж^у парой оснований -Ср5- или через основание I (любое) в -СрХр5-.

б)Показано, что в реплицирующемся геноме существуют разные по специфичности метилирования цепей дуплексы яДНК. В частности, фрагменты Оказаки в новообразованных дуплексах метилируются преимущественно в полипирпмдциповчх, а у-гастки датирования -з чередующихся пурпн-шп озлн-пурин последовательностях.

о. Полученные дачные о динамике уровня и специфичности метилирования рзилтщирующейся ДНК клеток пшеницы доложены в основу гипотезы о возможных функциях зтапности метилирования генома у 2ысщих растений: контроле за точностью удвоения и очередностью репликации генов в клеточном цикле.

9. Изучено влияние на отдельные этапы метилирования яДНК в клеточном цикле клеток первого листа этиолированных проростков пшеницы ингибиторов метилирования ДНК и температуры.

а) Показано, что пострепликативное метилирование яДНК не чувствительно к свободному 5-азадитидину, но угнетается э-пзо-бутиладенозиком и блокируется при повышенной температуре и включенным в ДНК 5-азацитидпном.

б) Установлено, что репликативное метилирование ЖК в меньшей степени, чем пострепликатизное чувствительно к 3-изобутил-аденозину и практически полностью подавляется 5-азацитидином.

10. Изучено влияние экзогенных фитогормонов и их синтетических, аналогов (индолилмасляная кислота, 2,4-Д, кинетин, №-бензил-аденин, гибберелловач кислота 5А3) на репликативный синтез и метилирование яДНК в проростках шпеницы.

а) Установлено, что все эти соединения ингибируют репликативный синтез яДНК в наибольшей степени (в 2,5 раза) в ранней Б -фазе а в меньшей степени - в поздней Б -фазе клеточного цикла.

б) Показано, что изученные фитогормоны и их аналоги практически не влияют на пострепликативкое метилирование яДНК, но, в зависимости от концентрации и момента Б -фазы ингибируют репликативное метилирование яДНК. В результате в новообразованной яДНК возникают дополнительные недометилированные участки.

Таким образом, решшкативное и пострепликативное метилирование дЦНК в клеточном цикле могут регулироваться относительно независимо.

в) Открытая нами модуляция репликативного метилирования ДНК'у пшеницы под влиянием фитогормонов - ночый возможный механизм молекулярного действия этих регуляторов роста на экспрессию, репликацию г.енов и меточную дифференцировку у растений.

Список статей, опубликованных по теме диссертации

1. Зайцева Г.Н., Колесников д.Яценко И.Л., Кирнос М.Д. Ванюшин Б.Ф. О первичной структуре кинетопласта Critbidia oncopelti // Докл. АН СССР.- 1974.-Т. 219. - & I.- С. 243-245.

2. Кирнос М.Д., Ванюшин Б.Ф. Получение очищенной от ядерной ДНК митохондриальнсй ДНК из животных тканей (уровень метилирования и степень сблоченности пиримидиновых нуклеотидов - критерии очистки // Биохимия.- 1976.- Т. 41.- Ь I.- С. 68-74.

3. Ванюшин Б.Ф., Кирнос М.Д. Структура митохондриатьных ДНК животных: нукдеотидный состав, пиримидиновые блоки и характер метилирования // Молекулярная биология.- 1976.- Т. 10.- С. 868-879.

4.. Кудряшова И.Б., Кирнос М.Д., Ванюшин Б.Ф. ДНК-метилазные активности из митохондрий и ядер животных. Различная специфичность метилирования ДНК // Биохимия.- 1976.- Т./(41.- J§ II. - С.1968-1977.

5. Ванюшин Б.Ф., Кирнос М.Д. Структура митохондриальных ДНК животных.- Молекулярная генетика митохондрий.- Л.: изд. Наука,1977.

' С. 84-89.

6. Александрушкина Н.И., Кирнос М.Д., Маградзе Н.М., Зам-чук Л.А., Гольдфарб Д.М., Ванюшин Б.Ф. Об аналоге цитозина в ДНК бактериофага Shigella soanei "Уфа"// Биоорганич.химия.- 1978.Т. 4.- С. II9I-II96.

7. Кирнос М.Д., Александрушкина Н.И., Ванюшин Б.Ф. Количественное спектрофотометрическое определение неизвестных нуклеотидов в ДНК // Биохимия.- 1979.- Т. 44.- Д 6.- С. 1026-1029.

8. Бапките Е.А., Александрушкина Н.И., Кирнос М.Д., Кирьянов Г.И., Ванюшин Я.Ф. Метилирование ДНК в суспензионной культуре клеток табака при обработке фитогормонами // Биол.науки,- 1980.-А 4.- С. I03-II0.

9. Башките Е.А., Кирнос М.Д., Александрушкина Н.И., Кирьянов Г.И., Ванюшин Б.Ф. Репликация и метилирование ДНК в клетках суспензионной культуры табака й влияние ауксина// Биохимия.-'1980.-

Т. 45.- Ä 8.- С. I448-1456.

10. Кирнос М.Д., Меркулова H.A., Борхсениус С.Н., Ванюшин Б.Ф. Характер метилирования ДНК макронуклеуса у простейшего Tetrabymeoa pyrifornia // Докл. АН СССР.- 1980.- Т. 225.- Je I.-С. 225-227.

И. Кирнос-М.Д., Александрушкина Н.И., Ванюшин Б.Ф. 5-метил-цитозин з пиримитшознх последовательностях ДНК растений и животных: специфичность метилирования// Биохимия.- 1981.- Т. 46.- й 8.-С. 1453-Г474.

12. Кирьянов Г.И..Исаева Л.В., Клрнос М.Д., Ганичева Н.И., Занюпан 5.'5. Рэпликативное метилирование ДНК в i-клетках в норме л при действии 5-изобутиладенозина и циклогексимида //Биохимия.-1Э82,- Т. 47.- Уг Г.- С. I53-I6I.

13. Кудряшова Л.Е., Волкова С.А., Кирнос М.Д., Занюппн Б.Ф. Метилирование новообразованной ДНК в развивающихся проростках пшеницы // Биохимия.- 1933.- Т. 48.- Ii б.- С. I03I-IC34.

14. Кирнос ".Д., Бакеева Л.2., Ганичева Н.'Л., Волкова С.А., Заншин Б. 5. Митохондрнальная природа новообразованной ДНК в ста-реюцих колеоптилях этиолированных проростков пшеницы //Биохимия.-1983.- Т. 48.- S 9.- С. I5G5-I5I2.

15. ¡{ирное М.Д., Волкоза С.А., Ганичева Н.'.'., Кудряшова И.Б., Вз1пшин Б.-5. Синхронный синтез ДНК в колеоптиле и первом листе р"ЗБава?:сихся проростков пшеницы: природа и соотношение синтеза ядерной и митохондриальной ДНК // Биохимия.- 1933.- Т. 48.- И 10.-С. I587-I596.

16. Кудряшова И.Б., Ковальская Б.С., Кирнос 'Л.Д., Ванюшин Б.Ф. Цитозпнозач ДНК-метилазкая активность в листьях развивающихся этиолированных проростков пшеницы // Биол.науки.- 1934.- .'3 4.- С.27-30.

11. Ковальская B.C., Кудряпова И.Б., Кирнос М.Д., Ванюшин Б.Ф. О некоторых свойствах цзтозиновой ДНК-метилазы из листьев этиолированных проростков пшеницы// Биол.науки.- 1984,- .'г 6.- С. 13-17.

18. Кирнос М.Д., Кутуева Л.И., Гачичева Н.И., Ванюшин Б1Ф. Неполухонсервативный характер репликативного метилирования ДНК в меристема листа проростков пшеницы: образование недометилированных участков и разная специфичность метилирования промежуточных реши-кативных фрагментов // Биохимия.- 1984.- Т. 49.- 'Л 8.- С. 1357-1566. ,

19. Кирнос М.Д., Ганичева Н.И., Кутуева Л.И., Ванюшин Б.Ф. Нерепликативные синтез и метилирование ДНК в клеточном цикле клеток первого листа этиолированных проростков пшеницы// Биохимия.- 1984.-Т.~49.- Ü 10.- С. 1690-1702.

20. Лопатина Н.Г., Кирнос М.Д., Сучков C.B., Ванюшин Б.Ф., Никольская И.И., Дебов С.С. Определение сайта узнавания аденин-специфической метилазы Shigella sonnei 47 с помощью гидразино-лиза ДНК и последующего разделения пуриновых олигонуклеотидов тонкослойной хроматографией на ДЭАЭ-целлплозе // Биохимия.- 1985.Т. 50.- Л 3.- С. 495-501.

21. Ашапкин В.В., Александрущкина H.H., Кирнос М.Д., Ванз-ши:-: Б.Ф. Подавление репликативного синтеза ДНК нуклеозидами, их синтетически!® аналогами и ингибиторами метилирования ДНК в первом листе этиолированных проростков пшеницы// Биохимия.- 1986.- Т. 51.-,'ё 10.- С. 1587-1594.

22. Артюховская H.A., АлексАндрузкика Н.й., Ашалклн 3.3., Кирнос М.Д., Ванюшин Б.Ф. Влияние различных фитогормонов на реп-ликативнш синтез ядерной ДНК в эмфазе клеток первого листа этиолированных проростков пшеницы // Биохимия.- 1986.- Т. 51.- л II.-С. I868-1874.

23. Кирнос М.Д., Артюховская H.A., Александрущкина ¡¡.И., Ашапкин В.В., -Ванюшин Б.Ф. Злияние фитогормонов на реплихативное

и пострепликативное метилирование ядерной ДНК в s-фазе клеточного цикла клеток первого листа этиолированных проростков пшеницы // Биохимия.- 1986.- Т. 51.- Ü II.- С. I875-I88S.

24. Азапкнн В.В., Савельев C.B., Кирнос М.Д., Ванюшин Б.Ф. Временная организация репликации различных последовательностей ядерной ДНК в s-фазе клеток первого листа этиолированных проростков пшеницы // Молекулярная биология.- 1566.- Г. 2С.- 5.-

'С. 1570-1573.

25. Кирнос М.Д., Алексачдрушкина Н.Й., Кутуева Л.И., Артюховская H.A., Ванюшин Б.Ф. Пострепликативное метилирование - дискретный этап метилирования ядерной ДНК в клеточном цикле клеток первого листа проростков пшеницы. Влияние температуры, фитогормонов, ингибиторов трансляции, транскрипции и метилирования яДНК// Биохимия.- 1987.- Т. 52.- :i 4.- С. 525-637.

26. Ванюшин Б.Ф.. Кирнос М.Д. Метилирование ДНК у растений и клеточная дифференцировка.- Геном растений.- Киев; изд. Наукова Думка, 1987.- С.

27. Кирнос М.Д., Александрушкина Н.И., Кутуева Л.И., Ванюшин Б.Ф. Реплпкатизнсе метилирование - дискретный этап метилирования ДНК у растений: критерии дискретности - уровень и специфичность метилирования фрагментов Оказаки в проростках пшеницы// Биохимия.- 1988.- Т. 53.-й .-С.

28. Александрушкина Н.И., Кирнос М.Д., Ванюшин Е.Ф. Пнгисированке я изменение специфичности метилирования фрагментов Оказгки в проростках пшеницы под влиянием 5-азацитидика или 5-изо-буткладенозина// Биохимия.-1988.-1.53.-¡.з .-С;

29. Курнос У.Д., Александрупклна H.H., Кутуева Л.'Л., Ванюшин 5.'5. Репликативное и пострепликативное метилирование ядерной ДНК закономерно модулируют асимметрия ее комплементарных цепей

по содержания остатков 5-метилдитозина з течение двух последовательных клеточных циклов клеток первого листа проростков пшеницы // Биохимия.-1986.-Т.53.-С. •

jО. Vanyushin В.?., üirnos The nucleotide composition and

pyriaidine clusters fron beef heart ait cnondria // FbBS Letters.-1974.- V.-J9.- ¿2.- 195-199.

31. Kirnos ¡i.D., Vasilyev V.K., Vanyushin 3.J?. Separation of pyritaidine deoxyribooligoaucleocides according со length and composition using tnin layer coromatoyraphy on LSAE-cellulose // J.Chro-macog.- 1975-- V\1CW.- .¿1.- P.369-370.

33. Vanyushin B.H1., Jürnos ».D, Sti-ucture of animal mitochondrial DMA ( base composition, pynaiaine clusters, character of netaylation) // 3iochin.3iophys.Acta.- 1977.- 7.2't5.- P.323-336.

34. Kiryanov G.I., Deaidkina N.P., Kirnos bi.D., Alexandrusn-Izt^b N.I., Vnnyushin 3./'. mecnylation of DNA in и cells on replication // ?:--3S meters.- 1980.- '/.112.- P.225-228.

Сокращения

яЦНК, мгДНК, тпДНК - ядерная, митохондриальная, хлоропластная ДНК соответственно ноДНК - новообразованная ДНК

ш5С,С,Т,А, иРА, £ - б-метицгтозик, цятоззш, тиман, аденгн,

с

Н -метиладенин и гуанин соответственно СТР - дезоксицатидинтрифосфорная кислота йл, Ру - пурин и пиримидин соответственно р - остаток фосфорной кислотн ТСХ - тонкослойная хроматография

, Бу » - соответственно ранняя, средняя и поздняя Б-фазк < клеточного цикла 5-ага-С - 5-азацитддин ЕЬВс - бромистый этпдий 51ВА - ¿'-йзобутидаденозин 5АМ - Б -аденозилметионин

УМ - уровень метилирования, 100-ш5С/( тС+С) или 100-п6Л/(тбА+А) ССМ. - сайтовая специфичность метилирования = относительное

содержание Ш°С в последовательности Нх-тС-Вг , в % от всего ¿С в исследуемой ДНК ГРК - гормон-рецепторный комплекс 2,4-Д - 2,4-Дихдорфеноксиуксусная кислота' БАЛ - Я^-бензиламинопурин ' ' '

ГК - гибберелловая кислота 'РПФ - репликатизный фрагмент

Автор глубоко благодарен профессору Б.Ф.Ванзшину и коллективу сектора молекулярных основ онтогенеза за доброжелательное внимание и поддержку на всех этапах работы, коллективам секторов изотопных методов анатпза, информации, электронной микроскопии и седиментационных методов анализа за помощь в работе, Н.И.Алексазд-рущкиной, Г.И.Кирьянову, В.З.Ашапкияу, И.Б.Кудрящовой, С.А.Волко-войгц.А,Артюховской и Л.И.Кутуевой на разных этапах принимавших участие в работе

Л-53?^,подл.к печ.27/1Ш-87г.