Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Двухэтапное метилирование реплицирующего генома растений

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Двухэтапное метилирование реплицирующего генома растений"

-}, л * о Р

ИОСКСШОШ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЩИИ И ОРДЕНА ТРУДС®ОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВШШ УНИВЕРСИТЕТ имени Ы. В.ЛОМОНОСОВА

ДВУХЭТАПНОЗ МЕТИЛИРОВАНИЕ РЕПЛИЦИРУЮЩЕГОСЯ ГШ {С*РАСТИШШ 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание учокой стопэпл кеялддата биологических поук

Биологический факультет

На правах рукошся УДК 547.953.32

Ротаепко Елена Петровна

Москва - 1991

Работа выполнена в секторе молекулярных основ онтогенеза 1гз!фа-культетской проблемной лаборатория молекулярной бжологш в Оео-органическо£ химии им.А.Н.Белозерского Московского государственного университета ш.Ы.В.Лошшсова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Б.в.Ваншин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Я.И.Бурьянов

кандидат биологических наук А.А.Колесников

Ведущее учреждение - институт молекулярной биологии АН СССР

Защита диссертации состоится ОМпаЗнА 1991 г. д ¿5"час на заседании Специализированного совета Д 055.05.10 но зедите диссертаций на соискание ученой степенг кандидата наук цра Московском государственном университете ем.Ы.В.Ломоносова по адресу: 119899, Ыосква, Ленинские Горы, ИГУ, Биологический факультет, Ученый совет

С диссертацией южно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ. ^

Автореферат разослан ■ /5 ■ ССЛЛаЗрЖ 1991 г. УчепкЯ секретарь .

Специализированного совета ^ , / г кандидат биологаческих наук г / .¡С^/ В.Н.Каграманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ _iL.iL 'Актуальность проблеет. Метилирование ДНК у эукарнот рассиатга-впется как один из способов модуляции активности генома, а именно ого осношшх генетических процессов - репликации, транскрипции, репарации и рекомбинации ( транспозиции ) [Вянтаип, 1983, Айата, 19851.

Ло спх пор 1,11 мало знаем о том, как организовано кэтялированиэ ДНК в клетках растений, характеризующихся сакнм высоким уровнем метилирования ДНК среди эукариот [Ваншин, 1ЭС0, 1972, 1974, 1983; АЛаяв, 1985 ]. Лсть сравнительно недавно была выявлена и изучена каскадная, двухэтапиая организация процесса метилирования ДНК в гарясте»яэ проростков ппеняцы, указыввкаая на возмозное участие этого процесса в определении очередности и точности репликации отдельных компартментов генома в клеточном цикле делящихся клеток растепгй! [Кприос и др.,1388; 7апуивЬ1п,К1гпов, 1988]. Однако не было известпо, пах гатплируется ДНК п рзяляцяруядемся геноме недп^ферендаровакных плеток п культуре. Поэтому оставалось неясным, является ли такая двухэтппзая организация процесса кеталзровання ДНК спощттпчннм для шгэточноЗ ДЕффэронцнропяп П 1ЮрфОГ9НОЗП пли обспм для делящихся клеток однодольных способом модаХккацни реплицирующегося генока. Крс-'-о того, не было известно, сп91пфлчеи ля этот механизм для клеток однодольпнх, или оп является обпзк как для однодольных, т": и для двудольных растений. Наконец, вазшо било знать, какое место соседе занимает двухэташюе метилирование ДНК в иерархии механизмов гпзт.птпчосксЛ кодв^гсацян генома растения па разных этапах его ¡¿ортаропьтая.

Цель п за дата исследования. Основной цельо диссертационной рйОотц япкдось изучение нехантагов метилирования ДНК метоп га спх рг.стг-якЯ яри репликации геномэ. Соответственно, эядачвия последога-

нил оылн:

1) Подбор и исследование растительных моделей (недифференцированные суспензионные и каллусные культуры клеток, меристемы форшру ющшсся листа и корня однодольных и двудольных растений), в клетках которых реализуется процесс репликации генома без заметной амплиф!-кации отдельных последовательностей и/или эндоредупликация.

2) Изучение организации этапности метилирования реплицирующегося генома в клетках растений:

а) выявление этапа репликативного метилирования ДНК;

0) определение соотношения репликативного и пострепликативноп атапов метилирования ДНК;

в) определение уровня метилирования комплементарных цепей в новообразованных дуплексах ДНК.

3) Исследование влияния недометалирования ядерной ДНК в Б-фазе клеточного цикла на компетентность генома к новым циклам репликацг

4) Анализ синтеза и метилирования ДНК в прекративших репликацию генома и дифференцирующихся клетках растений.

Научная новизна работы. Впервые показано, что двухэтапнн! процесс метилирования ядерной ДНК является общим для клеток высшк растений механизмом модификация реплицирупцагося генома. При избирательном синтезе отдельных последовательностей вне репликации ге нома реализуется иной, вероятно, одноэтапный механизм метилирован яДНК. Путем разделения, выделения и анализа уровня метилирования комплементарных родительской и дочерней цепей непосредственно выя леи асишетричкый характер метилирования новообразованных дуплекс яДНК. Впервые доказано, что в двухэтапноы механизме метилирования решшцирувивгося генома соотношение репликативного и постреплика-тивеого атапов метилирования в недаЕФэренцированных клетках в ку; ?уре н в ыэрисгвиэ целого растения коаэт заметно разлетаться; щи

8том определяющим в соотношении является репликативный этап. Установлено, что 5-азацитидин ингибирует метилирование ядерной ДНК в S-фазв клеточного цикла и "консервирует" в ней асимметрично метилированные сайты, что препятствует нормальной репликации генома в последующих клеточных циклах. Это подтверждает предположение об участии двухэтапного метилирования генома растений в регуляции очередности и точности репликации его последовательностей в клеточном цикле [Кирнос и др.,1988; Vanyushin, Kirnoe, 19ез]. Показано, что при дафференцировке растительных клеток на фоне блока репликации ядерного генома реализуется синтез "тяжелой"(р = 1,716 г/см3) популяции миниколъцевых молекул мтДНК. В листе и колеоптиле целых развивающихся проростков шеницы этот синтез цикличен и скоординирован с циклами репликации яДНК в клетках меристемы первого листа. В колеоптиле срезанных проростков наблюдается супергтродукция этой фракции мтДНК, приводящая к ее резкому накоплении в клетках этого органа.

Практическая значимость работа. Работа имеет теоретический характер. Ее результаты вааны для понимания ролл метилирования в генетических процессах у эукариот, в том числе в репликации ДНК у растений. Оли могут использоваться в курсах лекций по молекулярной биологии, биохимии и физиологии растений.

Апробация работы. Материалы работы были представлены па Всесо-юнем симпозиуме "Физиология семян", Душанбе, 1983 г., на Всесоюзной конференции "Частная генетика растений", Киев, 1989 г., на Международной школе по молекулярной генетике, ЧССР, Лнблице, 1989 г., на симпозиуме Индийского общества генетиков я селекционеров рзстепкЗ, Индия, Дели, 1991 г., на совместном заседании сектора молекулярных основ онтогенеза Нэгфнкулътетской проблемной научно-исследовательской лабераторхта молекулярной биологии и бкооргашпеской iffiffl та.

А.H.Белозерского ИГУ и кафедри молекулярной биологии Биологического факультета МГУ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит ез введения, об-оора литературы, описания материалов и методов исслэдования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка датированной литературы ( 152 наименований). Работа изложена на 1Z5 стр. машинописи, содержат 24 рисунка, б таблиц.

МАТЕРИАЛЫ и методы

Суспензионную культуру клеток пшеница сорта Щшшнал юбилейная выращивали по мотоду [Бутенко и др., 1968]. Использовали клетки в первой трети логарифмической фазы роста культуры. Каллусы паонпцы выращивали, как описано [Бутенко и др., 1388]. Кончики коркой стерильно прораидвееких семян пшеницы и гороха сорта Богатырь попользовали в момент прохождения клетками апикальной кернстеьш первого синхронного цикла репликации яДНК [Троян и др., 1975]. Проращивание и синхронизацию роста проростков пшеницы сорта Царопоз-скал 808 вели по [Кирнос и др., 1963].

Введопие вэченнх предшественников ( [2-14С]оротовая каслота, [б-'Ниурвдин, [Б-ьютпл-3н]шидш, [б-^урадин ) в клетки растений, Ездэлвнне м фракционирование ДНК в градиентах плотности ceci в коз-цонтрацин щелочной сахарозы (5-20W, а так со опродэленкэ уровня п споцнргшоста ыэтйЕарования ДНК описало в работах [Кнрнос и др., 1S81, 1984, 1988, 1991). Опредвлэшю количества ДНК опредэдяла катоду Опарина {Спирин,1368] шш »»дгЗзднрованпшу катоду Бартоаа [Еартоя, 1970].

Наделан®} ксатлеаэнтаршх цепоЗ яДНК ез новообразованных п

присутствии [б-Апуридиня, 5-PdUrd и 5-BrdUrd* дуплексов из клеток суспензионной культуры пшеницы осуществляли с помощью центрифугирования В щелочном градиенте CsCl/CegSO^ [Kowalski, Cheevers, 1976] о небольшими модификациями.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Двухэтапное метилирование генома пшеницы в культуре клеток и проростке.

1.1. Репликация и метилирование ДНК в культуре клеток или проростке.

В настоящей работе га изучили организацию процесса метилирования яДНК при репликации генома в каллусной и пролкферирутаюй суспензионной культурах недифференцированных клеток пшеницы в сравнения с меристематическимп клетками в формирующемся листе н корне проростков. •

Кро!.?э отого, мы разработали условия кечения, выделения и очистки ядерной ДНК и изучили ее метилирование при репликации генома в меристеме корней гороха.

Предварительно для кавдой модели мы экспериментально подобрали такое время развития (роста), в течете которого синтез ядерной ДНК происходят лгспь при репликации генома. Другие генетические процессы, рэолизуемые посредством репликации ДНК - эндоредупликацпд и/илп избирательная Е>шлфжя!ия отдельных последовательностей, а таксе сип-тез ДНК в юттохондриях и хлороплэстах в Бнбрагомх условиях не выявлялись. Поэтсну полученные результата по изучения метилирования сяя-

^ Ссгрчдмжя: ?(Ги'пЗ - {>тордезоксиур«.ган, Вг(511г(1 - Л(^«л»зохси- _ урчдин. ЯД]К - ядерная ДНК. НОДНК - чпвообриз оп«нн&я ДНК , ГУЧ - уровень «»гили ров»:>ия. 5-агаС - б-аэ&цитиднн. С - цятоэин. т'С - 5-кетклгусто-эггм, Т - тктлтн.

тезирующейся ДНК характеризуют метилирование собственно реплицирующегося генома растений.

Для выявления и изучения характера (асишетрии) метилирования новообразованных дуплексов яДНК в делящихся клетках, ми импульсно (1-3 ч) метили кончики корней и отрезки листа проростков, а также каллуса и суспензионную культуру клеток пшеницы [2-14С]оротовой кислотой или [6-3Н]уридиноы (предшественники С, ю5С, и Т в ДНК) и определяли уровень метилирования яДНК как по количеству (УФ-погло-цешсо) остатков 0 и ш5С, так и по их радиоактивности. Количественное спектрофотометрическое определение в ДНК остатков цитозина п б-метилцитозина позволяет оценить уровень метилирования (УН) суммарной ДНК, а уровень метилирования ДНК, измеренный по радиоактивности этих оснований позволяет судить о метилировании новообразованных (дочерних) цепей.

Как следует из табл.1, ноДНК пш&ницн как в клетках каллуса, так и в клетках суспензионной культуры заметно (в 1,5-3 раза) не-додаталкрована по сравнению с соответствующая! суммарными (ядерными) ДНК и ДНК зародышей. Это ве свойственно и для делящихся (мерас-тематических) клеток в основании листа и кончиков корней проростки иаешпда н гороха (табл.1). Такая ситуация резко отлична от метилирования ДНК в суспензионной культуре клеток табаха (Башките и др., 1980] и Ь-клеток шши [Кирьянов и др.,1962], где метилирование практически завершается репликацией в дискретный этап пострешшна-тнваого метилирования не вырахен.

Следовательно, в двляхщхся клетках однодольных Е двудольных растений, безотносительно к их посла душей дифференцировав в корфс генеэу соответствуйте го органа (корень, ласт) реализуются оба этот анзимапгческого метилирования ДНИ: решшкатгваый в пострешшкатии

Источник ДНК

Таблица 1

Уровень метилирования суммарной и новообразованной яДНК

Уровень метилирования [УМ=100 т Сб/(т5С+С)] X ± о; п = 3-Б

Суммарная яДНК Новообразованная яДНК

Пзеница Зародыши

Каллусная культура

Суспензионная культура,

начало лог.фазы

Основание первого листа проростков

Кончики корня проростков пшеницы

Горох

Кончики корня проростков гороха

25,0 ± 1,5

23.7 ± 1,7

19,6 ± 1,4 22,6 ± 1,3 22,6 ± 0,8

22.8 ± 1,2

10,6 ± 1,9

13,3 ± 0,5 7,9 ± 0,4

АА

7,6 ± 0,7

10,3 i 0,5

АА

* - инкубация с ¡.таткой в течение 3 ч. ** - инкубация с меткой в течение 1 ч.

1.2. Метилирование комплементарных цепей в новообразовании дуплоксах яДНК.

~ Для доказательства асимметричности метилирования комплементарное: цепей в новообразованных дуплексах ДНК в клетках асинхронно 3 суспензионпой культуры пшеницы >ш использовали традиционный преем - "утягэленпе" ноДНК с помощьв бромдозоксиуридина с последу-xsssa разделением кошлемвнтарных цепей в щелочном градиенте плотности Сз+. Iii напля условия, в котора включение этого замещащего тгмядин нуклвозидного остатка в новообразованные цепи яДНК в культу-рэ клеток ипэннвд было достаточны?! для количественного отделения новообразованных пъ-душюксов ДНК (Н-"тяколйян, дочерняя цепь ноДНК, 1г-"лэгкаяи, родительская цепь ноДНК) от не вступивших з решишипяэ

и поэтому не включивших остатки бромдезоксиуридина LL-дуплексов яДНК. Как видно на рис.1, hl-дуплексы хорошо отделяются от LL-дуплексов после инкубация клеток в присутствии 1ОмкЫ FdUrd и 100мкУ BrdUrd.

Одновременно с включением бромдезоксиуридина клетки суспензионной культуры метили [б-^Шуридином, По включению радиоактивности иа [в-3Н]уридина в HL- и ll-дуплексы яДНК могно было судить как о природе синтеза (репликативный или репаративный) ДНК в клетках шеницы, так и определить уровень метилирования ноДНК.

lía рис.1 видно, что синтез яДНК в клетках асинхронной суспензионной культуры в описанных условиях имеет репликативный характер: метка из [б-^Пуридина включается в HL-дуплексы яДНК и практически отсутствует в ll-ДНК. Это означает, что в первой половине логарифмической фазы роста культуры доля репаративного синтеза мала. Величина уровня метилирования ноДНК (по радиоактивности) составила около 12,0 (табл.2).

Чтобы установить, асзмлзтркчйо ли натилироьаяы комплементарные цепи ноДНК, мы выделили и фракционировали их-ДНК в щолочном градиенте плотности Св+. На рис.2 видно, что дочерние и родительские цепи яДНК хорош разделились, причем практически вся радиоактивность локализована в пике "тятлоЯ", дочерней цепи ДНК. Следовательно, как и в ll-ДНК, в родительской цепи новосинтезированных дуплексов яДНК заметного репаративного синтеза ДНК не наблюдается.

кн выделили дочерние (Н) и родительские (l) цепи hl-дик из градиента и после гидролиза до оснований спектрс«1ото?4втрячески определяли уровень их метилирования с покосу.» hplc (жидкостная хроматография васокого давления).Из табл.2 видно, что родительская цепь почти вдвое сальнее метилирована (3^=26,3), чои дочораяя цеп hl-дик (уму=14,7). таккм образам, величины уровня иетшгаровання ii-цапи ноДНК, определенные по радиоактивности и по УФ-поглоценшэ ос-

татков С и шбС, практически совпали (табл.2)

Таблица 2

Уровень метилирования комплементарны! цепей в новообразованных при репликации дуплексах ДНК в суспензионной культуре клеток

Образец ДНК -........ ..... " - - 1 "С 1 ■ с Уровень метилирования, УЫ=100 в С/(С+в С) х ± о; п г 3

Н-цепь (дочерняя) 14,7 ± 1,2 (по УФ-поглощению) 12,6 ± 1,4 (по радиоактивности)

L-цепь (родительская) 26,3 t 0,2 (по УФ-поглощению)

LL-ДНК (не вступившая в репликацию) 21,6 1 0,6 (по УФ-поглощению)

Из рис.1 и табл.1 и 2 следует, что в суспензионной культуре клеток пшеницы в кахдай момент в репликацию вступает небольшое (донов IS) количество яДНК. При атом новообразованные дуплексы (HL-ДНК) отличатся от не вступивших в репликацию LL-дуплексов максимальным уровнем метилирования родительских цепей ДНК (УЫ^б.З). LL-ДНК ш-тилирована в меньшей степени (30^=21,6). Следовательно, часть це-цйё ЯДНК у не вступивших в репликации дуплексов недоаетилирована. 8то подтверждает выдвинутую ранее гипотезу (Кирнос в др., 1988а) о тоа, что у растений, как, по-видимому, в у животных [лоодш ot.al., 1905s Woodoook et.al., 1982, 19аз, 1986] в репликацию вступают лшаь полностью (симметрично) метилированные дуплексы ДНК [Taylor, 1978].

Иными словами, как и в целом растении, в суспензионной куль-

пост

type клеток пшеницы дочерние цепи ноДНК подвергаются ^шшкатаваому вэтилярованию, в лишь по его завершении дуплекс ДНК становятся компетентным к новому раунду репликации. Таким образом, двухвтапноа иэтшшроваше яДШ является характерным обааы механизмом анзшата-. чвскоЯ шдзЭекации генома растений возашсимо от диф£еренцировпи вх клеток и морфогенээа.

1.3. Соотношение решгакативного и пострешшкативного метилирования ДНК й делящихся клетках в суспензионной культуре и в целом растении.

Кояно видеть (табл.1), что в клетках основания листа, кончиков корня проростков и в суспензионной культуре пшеницы импульсно (1 ч) меченные новообразованные яДНК метилированы в разной степени. Так, в клетках в начале логарифмической фазы роста суспензионной культуры УН ноДНК (13,3 ± 0,5) в Ь5 раза быео, чен в клетках листа н корня проростков (7,9 и 7,5 соответственно), в то время, как уровень метилирования суммарной ДНК в этих клетках заметно не различается (19,6 в 22,6 соответственно).

Чтобы количественно оценить вклад репликативного этапа метилирования ДНК в суммарное метилирование генома и сравнить эта показатели в клетках суспензионной культуры я в целом растении, кн определяла уровни метилирования собственно фрагментов- Оказахи а лнгированной ДНК (табл.3). Фрагменты Оказакн выделяли с помощью центрифугирования п сделочном градиенте концентрации сахарозы из импульсно (1 ч) меченной яДНК, очищенной в градиенте плотности СвС1. Можно видеть, что степень метилирования разных по длине фрагментов рештксцпз ДНК практически одинакова (Табл.3). Это зыявлено как в клетках суспензионной культура, так и в первом листе проростко» пе6е2цы. Следовательно, за 1 ч инкубации с меткой в метках суспензионной культуры лигированнне фрагменты репликации ДНК, как и в илэтках проростков, еще не подвергаются значительному пострешгака-тивяому метилированию.

Кек в клотках суспензионной культуры, так и в проростках гпэ-вгсци реализуется принципиально единый, не опосредованный детерминацией, шханизм днухэтапного кетилирования генома.

Таблаца 3

Уровень метилирования фрагментов Оказакн н датированной новообразованной яДНК в клетках первого диета пророотков и в клетках суспензионной культуры паеницы

Источник ДНК* Размер решшкативаого фрагмента ДНК, 8 100 вРс/ы6с + С) х 1 0| п «= 3-Б

Суспензионная культура з б 12,3 ± 0,9

Первый лист 4 Б 7,5 ± 0,6

Суспензионная культура 8 11,8 * 0,8

Первый лист В 7,0 ± 0,4

Суспензионная культура *1Б 13,4 * 0,4

Первый лист *1Б 8,0 1 0,8

Таким оОразоа, в клетках пвешщц с суспензионной культуре, каллусе, кончике корня и основании первого листа проростка ыопца-роваиае яДНК по цитозиновыы остаткам организовано в два этапа: рэп-ликативный и пострепликативный. Новообразованная при репликации дочерняя цень яДНК (Н-цепь) недометилнрована (У1М00 и5С/(С+аБС)=12,б; по сравнению с родительской цепью (¿-цепь, Л1-26.3) шш су*а*арцоЭ «ДНК (Л1=19,6-25,0). Еэ домэтнлировашш реализуется вне синтеза ДНИ на втором, постреддикативвоы »тале. В репликацию вступаю? максимально (симметрично) метилированные дуплексы яДНК (УЫ=26,3). Такая дву1этапная организация процесса штиларования ДНК характерна для всех долядахся в рвшнцирущнх яДНК шаток шетшн. незавнсаш от их детерминации. Уровень решшкатнвного датирования ядерной новообразованной ДНК (фрагменты Овазака в участки лагнрованая) в клетках целого растения (шристваз корня в ласта проростков, ЛЬ7,5 в 7,0) в в клетках суспензионной культура (У1Ы2.3 и 11,8) различен. Относятелыый вклад решшаатшздаго в пострешвкатввко-

го этапов в суггдарное иетнлирование генома в культуре клеток н в клетках проростка определяется, презде всего, модуляциями интенсив-поста собственно решшкативного этапа метилирования яДКК.

2. йпгибпрование 5-азацитидином синтеза и метилирования ядерной ДНК в последовательных клеточных циклах делящися клеток первого листа проростков ппешщы.

Чтобы проследить влияние полуметилированных сайтов на репликацию пи использовали модель первого листа проростков паеницы, 9 клетках которого отмечена синхронность синтеза ДНК в нескольких последовательных циклах репликации генома [Кирнос и др.,1983]. В среду с растущая проростками периодически добавляли б-azaC н следила за уровнем синтеза п метилирования яДНК клеток первого листа па протяжении трех клеточных циклов. Видно, что, начиная с з2-фазы, 5-azaC задергивает рост первого листа ( рис.3), через ICO ч развитая ого дзи в спите составляет примерно 70* от контроля.

Содерзашю ДНК в первом листе контрольных проростков по пера щ роста ступенчато возрастает (рлс.4). Периода увеличения содэр-Г2НИЯ ДНК соответствую* синхронно протекащна 3-Сазам клеточных цяк-дов клеток первого листа, а плато - интервалам кезду s-фазаиа. Со-дэрзавяэ ДНК в ¿астэ за пзрзуэ н вторув з-фззы калдый pas удааивэ-отся. Это jssssa раз подтверждает участие подавляющего болызинства пгэтса первого ласта в синхронной реплнкацан ДНК а этих двух 3-фазах.

ICejj н огадаюсь, содергаше ДНК за з1-фазу в листьях пророст-коз в опыте текгэ удваивается. Црз этсц кряныв динеияни содеряааая да а тэченгэ з^взн (с 50 до 66 ч ) в контроле s опыте практичос-кз совпадает. Это указывает на то, что 5-асаС в шрзоа цшоа рапдз-кзцга пргкстэчэска нэ влияет аз завэрззшюсть спзтаза яЛНЯ.

Одпаао в 32-фазе рэшгхацая яДЕЯ з опыте в отлячгэ от контроля

Ряс из.

60 ьо

возраст, ч

Рис .Л.

60 ■ ВО Возраст, ч

100

Рвс.3. Домапок рост» первого лгата вроростяоа дшци, растдах

а щжсутстшх 5-«мц>т11Дкт. Рмс.4. Дпмшх» содожвши ДЖ ■ мраон даст« проросло» актов», растудах в прасутствш 6-мецжтждав». 1 - соатрол», 2 - оонт.

ХО

100

Р>с.5.

60

во

Вшраст, *

17

Рве .6.

/

60 ВО 700 возраст, ч •

Рис Л. Скорость рпчпчцщ «ДБ в< рвши* ж»«!«» 0гЧв«а.

Рко .6. Кктшшроашп« яДИС.аагу—«ц>уца а вродоэтах в врхсугства 5-сяафгтвдаяа •

1.3 - хостроль, г.4 - ОВДГ.

оказывается сильно растянутой во времени н не заканчивается не только к моменту завершения з2-фвзы в контрольных проростках, но в к иоаенту наступления в них новой, третьей Б-фазы ( рис.3). В сле-дущнй цикл репликации эта синтезированная в присутствии 5-аваО ДНК во-вреыя не вступает. Такнм образом, в присутствии Б-агаО первый цакл репликация ДНК проростков нэ нарушается, а во втором скорость репликации сильно снкяена.

Изначально т предполагала, что яДНК не смсгэт вступать во второй цикл репликации из-за ингибировання метилирования ДНК б-агаС, однако, яДНК вступает во второй цикл репликации, но он идет с гораздо иеньшей скоростью, чей в контроле. Отсутствие блока репликации во втором цикле скорее всего объясняется тем, что 5-агас недостаточно гМектнвно проникает через корни и слабо ингибирует метилирование ноДНК.

Для изучения скорости репликация яДНК' в клетках в разные ио-ганта второго наблвдаемого цикла синтеза ДНК (с 65 до 80 ч.) контрольные и опытные проростки ( по 40-60 штук) через определенные про-кеяутки времени срезала и инкубировала в растворе [Б-штая-3Н)ТЕма-дяна в течение одного часа. Затем их фиксировала этанолом, выделяли из первого листа днк а определяла ее удельную радиоактивность.

В пределах з2-фзгы в контроле и опыте, как и ранее [Аиашаш п др., 1986], пйблвдватся ( рис.5 ), по крайней даре, два пика реп-лзхацни ДНК, связанные, по-видимому, с инициацией синтеза на той шп гной груша рашяконов. В присутствия 5-агаС удельная радяоак-тиепость яДНК но всех этапах з2-фззн зкгэтно ниве, чей в контроле. Пра этоу в значительной степени в 1,5 раза) подавляется знлэчэ-нгэ гачогого прэдзэственшиа из рзннэЗ з2-фззе (первый пик, ргс.5).

Уст ело зле по, что 5-агас гюдазляэт кэтилнровашш поДНК а гтэрвом

ласте проростков пшеницы (ряс.6). Ыотилирование ноДНй в присутствии Б-ае&о ингибируется не более, чем на 7-10Я. В клетки первого листа в резные моменты клеточного цикла, скорее всего, поступает так мало 6-адаО, что этого количества оказывается недостаточно для сильного ингибировакия метилирования ДНК.

Сформированная в присутствии 5-агаС и [2-'4С]оротовой кислоты яДНК к концу 82-фезы также не доме тилирована примерно на 7-1055 (рзс.6). В то же время, несмотря на такое относительно слабое ннгибированиэ кэтялированая яДНК, ее репликация существенно (в 1,5 раза) подавляется (рис.5).

Иожно предположить, что посла второго цикла решшхацвд в присутствии Б-агаС содержание асшлаетрично метилированных участков ДНК становится настолько существенным, что это препятствует своевременное репликации яДНК в третьем наблюдаемом клеточном цикла.

Таким образом, 5-агаС ингибирует метилирование в репликацию ДНК в проростках пшеницы. Можно думать, что наблюдаемое внгнбнрова-нио метилирования ДНК Б-агаС в известной мере ответственно за остановку репликации. Во всяком случае, его соответствует предположению (Кврнос в др.,1968а] о том, что метилирование цитозиновых остатков ДНК у высших растений контролирует репликацию ДНК.

3. Иные "сценарии" метилирования ДНК при ее решдаацин в клетках растений.

В конце логарнцшческой фазы роста к культуре клеток люцерш добавляли [&-3Шуридин (10мкКа/мл) и инкубировали в течение 1 ч. В результате в ДНК оказалось всего Б■10~4 б метки от радиоактивности кислотонерастворимой фракции.

При такой низкой эффективности включения кетка в ДШ{ на &тос стадии развития культура клеток нам удалось лига определить состав (00 радиоактивности) к уровень метилирования ноЛНК и сушарног ДНК

клеток. ноДНК в культуре клеток люцерны очень сильно метилирована: ее уровень метилирования (УМ=36,0%) почти вдвое выше, чем у суммарной ДНК (№19,3$). Это практически идентично тому, что было обнаружено в суспензионной культуре клеток табака [ Башките п др., 1960]. Таким образом, в клетках двух разных видов двудольных растений новообразованная пря репликации ДНК метилируется, по-видамому, сходным образом.

По составу, как и по уровню метилирования, ноДНК люцерны (ос=30,4 ьюл.%) резко отличалась от суммарной клеточной ДНК (00=41,7 мол.®) (табл.4). Это означает, что на выбранной для экспе-ршента стадии развития культуры, скорее всего, мы наблюдаем не репликацию генома, а амплификацию лишь какой-то его небольшой, АТ-обо-гагзеннной, сильного- Таблица 4

тилированной фракции, Состав ДНК суспензионной

¡.эхсгспм гэталнрова- культура клеток люцерны

ння которой отличен -

от двухэтапной мода- _

УЫ ОС, НОЛ.З

фзкацин яДНК пря реп- Сварная 19,3 41,7

лякащш генома. Так пли иначе, полутсп-

НОДНЯ 36,0 ± 4,1 30,4 ± 5,0

па» результата сжсте с данныкл Вклеите п др. указывают на существование разных способов гдатшгарования ДНК при ее репликации на разных этапах формирования генома растительной клетки.

4. О природе синтеза и характере иетплярованая ноДНК в недэляцихся клетках апякальвоЗ зоны листа пророспсоо

ГПГ.9ЕИЦ4.

Недавно в апикальной зспэ форярусзгЭся .¡зстовоЗ пластан, состояв из угз неделягихся клеток енлз шявлйни модуляцзя У?1

яДНК, сформированной в последний цикл репликации генома [Кирнос и др.,1969]. Механизм этой модуляции не известен. В этом процессе предполагалось участие репаративного синтеза яДНК. Не исключено, что и у растений реализуются механизмы, схожие с процессами терминальной дифференцировки в клетках животных, в нх числе особые сценарии синтеза и метилирования генома в дифференцирующем митозе. Поэтому представлялось интересным исследовать природу синтеза и метилирование ноДНК в завершивших циклы репликации клетках апикальной зоны формирующегося листа проростков пшеницы.

Мы подобрали условия эффективного меченая ДНК в таких клетках и изучили в них локализацию синтеза ДНК и его природу. х

С помощью лизиса клеточного гомогената 1Я-ным неионным детергентом Тритон Х-100 в условиях минимальной растворимости хроматина (0,15 М NaCl) мы установили, что вся кислотонерастворшш метка локализована в цитоплазме. В яДНК апикальной зоны метка не включается. Таким образом, новообразованная в неделящихся клетках ДНК имеет неядерное происхождение. После фракционирования трито-нового экстракта в градиенте плотности СоС1 и анализа состава новообразованной в разные моменты онтогенеза листа ДНК, мы установила, что в дифференцированных неделявдхся клетках листовой пласта ны синтезируются две фракции ДНК, различающиеся по плавучей плотности: "тяаэлая" (н-, р * 1.716Г/СМ3) и "легкая" (L-, р = 1,694 г/см3). Однако, в эти фракции ноДНК включается менее 5* радиоактивности кислотонбраетворЕйого материала. 95* метки имеют ненукле! новую, (предположительно, полисахаридную) природу. Это "балластное' мечение "ненуклеинового" материала не ингибируется оксимочевиной создает превратное впечатление о репаративнои характере синтеза Ш в апикальной воно листа. На самом деле, оксимочовянэ (в кон центрации 50dl ), как и BtBr (10-50 мкг/мл) примерно но 90S пода

ляют синтез "тяжелой" и "легкой" фракций. По плавучей плотности, • чувствительности синтеза к EtBr и неядерной локализации "тяжелая" фракция идентична "тяшлой" фракции мтДНК пшеницы 1Кирнос и др., 1963; Александруакина и др.,1969, 1990; Vanyuahin et.al.,1989). Характерным отличием "тяжелой" фракции мтДНК пшеницы от яДНК является отсутствие в ней остатков 5-метилцитозина и наличие н®-кэ-тнладапипа. Ны наяли, что в клетка! апикальной зоны листа ноДНК не «этилирована по цитозиновым остаткам. Это означает, что в данных препаратах практически отсутствует новообразованная яДНК, а "легкая" фракция, как и "тяжелая", не метилирована по остаткам цитозина. GC-coдерзание в ноДНК по метке в разных по возрасту проростках варьирует от "475 до "53$ ос-пар. Значит, соотношение скоростей синтеза я- и L- фракций ДНК изменяется в онтогенезе проростка.

На выделили L-фракцию ДНК из градиента ceci "тритонового" ли-зата клеток колеоптиля, полученного в условиях минимальной растворимости хроматина, и оценили скорость ее седиментации в градиенте концентрации (5-203) сахарозы, а такте подвизность при электрофорезе в агарозноы (13) геле (рис.9). Из рив.9 следует, что Xi-фракция представлена гетерогенной по размерам смесью молекул. Однако по количеству в ней превалирует лп^ь одна высокомолекулярная ("20000 п.н. )фракцпя. Практически вся радиоактивность, включенная в L-фракцию ДНК, локализована в этой зоне электрофоре-rpaœsi. Эта ДНК характеризуется очень больной величиной константы седиментации (>2003). Скорее всего, в клетка она находится в супер-скрученЕой форкэ. По своки раздрая эта Фракция веннзэ ЩДНК геони-цц (контурная длина хпДНК превышает 120-150 т.п.н. [Ояпщовз, 1SS3]. Кроиэ того, пзгестно. что репликация хпДНК у однодольных идет прэи-нупэстввнво в клэтках нианей трети листа проростков [ВоГГву et.al.,

*М 1т (ш 1II 4

1

и

N

N

■Л V

Рис Л.

Ркс.8

*<? «П7РТ»«И1

Рас .Т. Фршщионхровшша яовообр&зохаЕхой ДШС в проростках шюекци раавого возраст« а гралмс«тв плотности СаС1.

• - 5 сутан, 6-7 суток, в - б суток.

Ряс .8. фракционировали» сувварноА в иовообрааовлнвоЛ £ЕН кодеооткая ва "кстсадоних* проростсоа в гтядаонта плотности СвС1.

• - ва "истсщмиою" проростка. 6 — 1 сутки "астоЕгоявя'б в - 2 суток "«стоггм«*" •

1 - вро&ив, рмвоадггдвдоств. 2 - профсд» Ув-согдачаЕЯВ.

б

^ 43

I

05

шею г«-9-

Элвжтрофорвгамаи» | § [] иой [ квтул-"II) уиюдапоп

| ) срляцк» в» пророст-

1979], в то время, как выявляемая нами Ь-фракция синтезируется как в колэоптале, так и в клетках апикальной зоны листа. Поэтому мы предполагаем, что ь-фракция представляет собой так ее, как и Н-итДНК одну из автономно рэплицируешх популяций итДНК пшеницы.

Изучая синтез "тяжелой" и "легкой" фракций неядерной ДНК в .таете п колеоптнле проростков пиеницы разного возраста, мы устано-кила, что в тот пли иной мокент развития и в том, и в другом оргапэ синтезируется либо "тягелая", либо -летая", либо обе вшете фракции мтДНК (ряс. 7). Следовательно, на уровне целого проростка в определенные »¿оменты развития возникают сигналы, поступащие одновременно в разше его органы (части органов) п индуциругщае синтез той или иной фракции мтДНК.

В срезанных в момент синтеза "ткгелой" фракции мтДНК и ннку-С:фуе«51х длительнее время (2-3 суток) в воде проростках, в отличш от цела проростков, "выключения" синтеза этой фракции не происходит. Набладается "суперпродукция" Н-*ггДНК в клетках колеоптпля (рте.8). Видно (рнс.8), что Н-нтДНК в колэопталэ пэрэстеет быть "кп-порпо2": на профчлэ УФ-поглосения сухарной ДНК в градиенте плот-поста СоС1 появляется ¡аогщая шфлексня в области р = 1,716 г/ил3, соБпадг-гсгл с г"»ом радиоактивности новообразованной Н-мтДНК. Эта ДНК представлена няни-кольцоегся галекуленя с контурной длиной 0,1-0,5 кки.

££1 установила. что, крега гпешца, Н-втДНН синтезируется тазео на с£^их раннзх этапах прорэстааая с&яян гороха в корте1,6*"21* клетках поячпка корпя до наступления в них первого цпхла сгшхрошюЗ рэдгжист яДНИ.

Татгп обрззем, езтопокпзл рзппхгцзя "тя-элоГГ пепудлщгз тгокул итДНК характерна кгл для дгЗЗорзпцзроэапэа, так а кэрйстегптачвсти клэтез рзстэптЯ щп Спзгсиюгачоскса» шл

мериствматических клеток растений при физиологическом или экспериментально индуцированном блоке репликации генома.

Заключение.

Итак, в формирующемся первом листе проростков пшеницы отчетливо выявляются синтез ядерной и митохондриальной ДНК. На ранних этапах формирования этого органа его клетки синхронно реплицируют яДНК. Эта ДНК сильно метилирована по остаткам цитозина. Процесс метилирования ядерного генома двухэтапен. Репликативный этап вносит асимметрию в метилирование комплементарных цепей новообразованных-дуплексов, а пострепликативный ее "снимает". По уровню метилирования и степени асимметрии новообразованные дуплексы отличаются от.ре вступивших в репликацию и могут быть дискриминированы различными генетическими системами клетки (репликации, репарации, рекомбинации и транскрипции). В репликацию вступают максимально (для данного вида) и сикметрично метилированные дуплексы яДНК. Поэтому в ряду последовательных клеточных делений с помощью метилирования ДНК мокет поддерживаться очередность и точность репликации отдельных компарт-ментов генома в клеточном цикле. Тем самым, метилирование ядерной ДНК по цитозиновым остаткам мохет рассматриваться как один из механизмов, контролирующих репликацию генома у эукариот.

При избирательной репликации отдельных фракций генома реализуется не двухэтапный, а одноэтйпный (репликативный) механизм метилирования ноДНК. Это указывает на существование разных путей метнлир вания яДНК при ее репликации на разных этапах формирования геном растительной клетки.

В дафференцирующихся и прекративши деление клетках решшкэци генома блокирована и реализуется интенсивный синтез автономно рош цируемнх популяций молекул мтДНК. Выявлены две популяции ("тяжела? и "легкая") этих молекул, отличающихся от митохондриальной "макдо

мосомы"размерами и плавучей плотностью. Эти фракции ДНК не метилированы по остаткам цнтозина. Их синтез цикличен в онтогенезе, скоординирован с репликацией генома в меристематических клетках основания листа и реализуется одновременно в неделящихся клетках различных органов проростка. При подавлении синхронных циклов репликации яДНК в меристематических клетках цикличность синтеза "тяжелой" мтДНК таюке нарушается. Репликация "тяжелой" мтДНК (р = 1,716 г/са3) в срезанных и истощенных инкуовццзй в воде стареющих колвоптшшх на прекращается, не требует экзогенных предшественников синтеза, мояэт идти в течение нескольких суток и приводит к суперпродукции этих молекул в клетке. Функции этих ДНК в клетке не известны.

ВЫВОДЫ

1.Иетнлирование реолицирупцегося генома растений реализуется в два этапа: репликативный н пострепликативный.

2. Репликативный этап ( метилирование фрагментов Оказакз з участков дотирования в новообразованной ДНК ) форяирует резко асимметричные по степени метилирования комплементарных цепей дуплексы яДНК. Доказано, что выделенные дочерние цепи вновь синтезированных ДНК резко недометилированы по сравнению с материнский!.

3. Степень асимметрии метилирования комплементарных цепей яДНК в клетках суспензионной культуры н первого листа проростков пзеницы различна: соотношение реплихативного и постропликативного этапов кетнишрованая определяется кодуляцаямн интенсавноста решшгсативного кетаяарозанпя ДНК.

4. В решакецза вступеют какстаалъко к, по-Ездкиоку, пслпостьп (ошматрично ) кетилнровашшэ дуплекса яДНК.

5. Подавление кэталярования ДНК э Б-фазе шуточного цакла

Б-азецитндином сопровоадается выраженным ингибированием нового раунда репликации.

6. Избирательная репликация АТ-обогащенной, срльнометилиро-ванной фракции генома клеток люцерны, в отличие от репликации целого генома, сопровоадается не двухэтапным, а одноэтапным (реп-ликативным) метилированием. Это указывает на существование разных путей метилирования яДНК при ее репликации на разных этапах формирования генома растительной клетки.

7. В неделящихся клетках сформированной листовой пластины и стареющем колеоптиле проростков пшеницы, а такте в клетках первичного корня прорастающих семян гороха выявлен интенсивный синтез популяции "тяжелых" плазкидоподобных митохондрналышх ДНК (р = 1,716 г/см3 ).

8. В неделящихся клетках в стационарной фазе суспензионной культуры и в стареющих листе и колеоптиле проростков пшеницы ваявлен синтез "легкой" фракции мтДНК, предположительно кнтохондриальной природы (р = 1,694 г/см3)

9. Синтез "тяжелой" и "легкой" ытДНК в разпивавдемся йроростке пшеницы цикличен. Соотношение синтезов этих фракций меняется в онтогенезе проростков. В колеоптилях срезанных проростков цикличность синтеза Н-итДНК нарушается и наблюдается "суперпродукция" этих иолзкул в клетке.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕЫЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Ваншин Б.Ф., Александрувкинв Н.И., Кутуева Л.И., Кудрялюва И.Б Ротаенко Е.П., Ашапкнн В.В., Савельев C.B., Власова Т.И., Кир-нос Ы.Д.. Закономерности синтеза и энзиыатической модвфшсацип Д! в делящихся и поделякихся клетках первого листа проростков пкз-цицн. В сб. "Физиология семян: формирование, прорастание, при-

хладные аспекты" по ыатер. Всесоюз. симп. "Физиология семян", 10-14 октября 1968, Дупанбе, изд-во "Донш", Дупанбе, 1990.

2. кирнос М.Д., Ллексацдрушкина Н.И., Ваншнн Б.Ф., Ротаенко Е.П. Знзиматическая модификация ядерного генома растений пра клеточной даМеревдировке. Тезисы докл. Всесоюзной ховференции "Частная генетика растений", Киев, 23-25 мая, 1989, т.1, о.90.

3. Алексаддрушкнна Н.И., Кирнос И.Д., Ротаенко Е.П., Ваншнн Б.в. Ингибирование Б-азацатидинсм синтеза и метилирования ядерной ДНК в последовательных клеточных циклах деляпцпся клеток первого ласта проростков паешщы. Биохиняя, 1969, т.64, енп.З, с.356-360.

4. Xirnoa 'I.D., Alexandruelütina H.I., Rotaenko В.P. Huitiatop nuolear ВДА aathylation - a poeoible meohaniea detemlntnß tine, order and fidelity of genome replioating in plante. 7KBS AdTanoed Courue "Trends in oomparative noleoular Genetioe", Liblioo, 18-24 Juno, 1989, p.24.

5. ¿лександрупюша Н.И., Ротвенко Е.П., Никифорова И.Д., Чар-лоз В.А., БубеЕпнкова С.Н., Бо2ко JI.U., Кзрнос М.Д., Вашвин Б.Ф. Двухэтопноо кетнлзроваяиэ генома паеннцы в культуре клеток в в проростке. Бэохнкая, 1991, т.56, вып.2, с.361-368.

РОТАЕНКО МЕНА ПЗГР0Ы1А

ДВУХ ЭТАПНОЕ МЕТИЛИРОВАНИЕ РЕПЛИЦИРУЩЕГОСЯ ГСШДА РАСТЕНИЯ

(Автореферат)

Подписано к печати 15.06.91 Форлат 60x90 I/I6 1,6 п.л. Уч.изд.л. 1,4 Тираж 100 Заказ 333

Ротапринт ЖГЛ (ВТУЗ-31'Л), 109280,Москва, Автозаводская, 16