Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура хроматина и энзиматичекое метилирование ДНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Кирьянов, Глеб Иванович

ВВЕДЕНИЕ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структура хроматина и энзиматичекое метилирование ДНК"

5.2. Динамика репликации ДНК в l-клетках и клетках суспензионной культуры табака . 158

5.3. Метилирование ДНК при репликации. 172

5.4. Уровень метилирования ДНК при репликации. 177

5.5. Метилирование фрагментов Оказаки и линкер-ных участков ДНК. Локализация дополнительного метилирования. 179

5.6. Метилирование ДНК l -клеток в присутствии s -изобутиладенозина. 183

5.7. Метилирование ДНК в клетках суспензионной культуры табака в присутствии растительного гормона ауксина. 185

5.8. Метилирование ДНК в l-клетках в присутствии циклогексимида . 188

ГЛАВА У1. ОБЩАЯ СХЕМА РЕПЛИКАТИВНОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК . 192

ГЛАВА УЛ. МОДЕЛЬ СОПРЯЖЕННОСТИ РЕПЛИКАТИВНОГО НЕДОМЕТИ-1ИР0ВАНИЯ ДНК, ИЗМЕНЕНИЯ СТРУКТУРЫ ХРОМАТИНА. И АКТИВАЦИИ ГЕНОВ . 202

ВЫВОДЫ. 211

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 214

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Исследование принципов структурной и функциональной организации хроматина необходимо для понимания механизмов реализации генетической информации в эукариотической клетке. За последние годы сформулирована концепция нуклеосомной организации структуры хроматина, получены многочисленные данные о тонкой структурной организации нуклеосом. Однако, нуклеосомный уровень компактизации не адекватен представленным в клеточном ядре хроматиновым структурам, недостаточно изучены уровни организации фибрилл хроматина в интактном ядре, не решены проблемы соответствия между определенным уровнем организации хроматина и операционными возможностями ДНК в хроматине в процессах транскрипции и репликации. Многое остается неясным и в отношении ДНК-белковых узнаваний и взаимодействий. В последнее время широкое внимание привлекает проблема метилирования ДНК эукариот, как возможного механизма регуляции транскрипции. Метилирование ДНК, как модель специфического ДНК-белкового узнавания, реализующегося при репликации ДНК, привлекательно так же возможностью исследования скоординированности процессов репликации, метилирования ДНК и формирования ультраструктуры хроматина.

Задачи исследования. В настоящей работе исследована ультраструктура хроматина в условиях, обеспечивающих максимальную сохранность его параметров, соответствующих состоянию хроматина в интактном ядре. Детально изучены ненуклеосомные уровни организации хроматина и их соотношение с нуклеосомной структурой. Проведен анализ функциональной значимости различных уровней организации хроматина в терминах ограничений на возможность ДНК-б ежовых узнаваний и взаимодействий в хроматине. В культуре фибробластов изучен характер репликации и репликативного метилирования ДНК, вскрыта скоординированность этих двух процессов с процессом формирования хроматина.

Основными направлениями исследования явились:

1. Изучение наднуклеосомного уровня организации хроматина.

2. Изучение ограничений, накладываемых упаковкой ДНК в хроматине разных уровней организации и его субчастицах, на возможность специфических ДНК-белковых взаимодействий.

3. Изучение сопряжения ДНК-белковых взаимодействий и формирования ультра структуры хроматина на модели репликации и метилирования ДНК в культуре фибробластов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе выполнения настоящей работы открыт нуклеомерный уровень организации хроматина. Показано, что нуклеомерный уровень является над-нуклеосомным. Впервые выделены отдельные субъединицы нуклеомерной фибриллы-мононуклеомеры и их олигомеры. Получены новые данные о природе факторов, определяющих ультраструктурнуга организацию нук-леомера, выявлены его конформационные переходы, детально охарактеризованы условия переходов. Предложен и разработан количественный метод зондирования ограничений на доступность ДНК для сайт-специфических узнаваний, накладываемых ультраструктурой хроматина. С помощью этого метода впервые показано, что доступность ДНК для сайт-специфических взаимодействий резко ограничивается нуклеомерной и нуклеосомной организацией. Показано, что ДНК нуклеосом-ного кора полностью недоступна для узнаваний такого рода, а доступность ДНК линкеров варьирует в соответствии с уровнем организации фибриллы и минимальна в компактном конформере нуклеомера. Показано также, что нуклеомерная и нуклеосомная организация ограничивает возможность взаимодействия ДНК с рецепторами стероидных гормонов. Сформулировано положение о том, что нуклеосомная и в, еще большей степени, нуклеомерная организация блокирует начальные (специфические) этапы транскрипции, так что процесс активации генов должен сопровождаться значительной перестройкой структуры хроматина, вплоть до модификации структуры нуклеосом. Это подтверждено при анализе ультраструктуры фракции активного хроматина, полученной предложенным в работе методом. функциональная значимость определенных уровней организации хроматина исследована на клеточной модели - репликации ДНК в культуре фибробластов. Открыт и детально исследован двухэтапный характер метилирования ДНК при репликации, обнаружен феномен физиологического блока лигирования ДНК в зависимости от концентрации клеток в среде, показано, что характер метилирования ДНК и взаимодействие ДНК-метилаз с ДНК в ходе репликации определяются не только сайт-специфичностью ферментов, но и различной степенью экспон1фОванности вновь образующейся ДНК в формщ>ующейся структуре хроматина. Впервые сформулирована общая схема репликативно-го метилирования ДНК, объединяющая процессы поэтапной репликации ДНК, метилирования ДНК и синтеза хроматина. Выдвинуто предположение о существовании в клетке ДНК-метилаз двух типов, осуществляющих метилирование ДНК на разных этапах репликации. Сформулирована гипотеза о механизме сопряжения изменения характера метилирования ДНК и возможности экспрессии определенных ее последовательностей. Развито представление о трех функциональных состояниях гена (неактивном, активированном и активном), различающихся характером метилирования ДНК, что по предлагаемому механизму автоматически определяет конформационное состояние хроматина. Переход гена из неактивного в активированное состояние при этом определяется избирательным недометшшрованием части сайтов при репликации, что, по-видимому, детектируется Ср(3—узнающим белком, взаимодействие которого с линкерным участком хроматина запрещает формирование нуклеомерной структуры и дестабилизирует коровуго частицу нуклео-сомы. Таким образом, предполагается, что активированное состояние гена, характеризующееся резким повышением экспонированности его ДНК, делает его потенциально компетентным для взаимодействия и узнавания ре гулят орными белками аппарата транскрипции.

Результаты работы могут служить основой для дальнейших углубленных исследовании проблемы регуляции экспрессии эукариоти-ческих генов. Разработанный в диссертации метод количественного зондирования экспонированности ДНК в хроматине перспективен для изучения тонких структурных различий и изменений в хроматине, а метод выделения фракции активного хроматина - для детального анализа его ультраструктуры. Широкое применение может найти обнаруженный в работе феномен физиологического разобщения двух этапов репликативного синтеза ДНК.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Структура хроматина и реализация генетической информации ДНК

Нуклеосомная и все наднуклеосомные организации хроматина в ядре имеют следствием компактизацию гигантских молекул ДНК в малом объеме ядра. В принципе, исходя из общих соображений, можно допустить, что такая компактизация, являясь чисто упаковочным явлением, может резко ограничивать оперативные возможности ДНК и взаимодействующих с ДНК ферментов транскрипции, репликации, модификации, репарации и т.п., а также других факторов этих процессов. Являясь, таким образом, платой за возможность упорядоченной компактизации ДНК в ядре, это общее "неспецифическое" подавление активности процессов реализации генетической информации, может быть лишено функциональной нагрузки, т.е. регуляторной направленности. В то же время это заключение может быть справедливо только при наличии строгой регулярности структуры хроматина, никак не соотносящейся с организацией структуры генов. В ином случае, упаковка ДНК в составе хроматина может быть не только регуляторно значимой, но и, в экстремальном случае, единственной возможностью обеспечить специфическое взаимодействие ДНК-узнающих белков с определенной последовательностью ДНК (см., например, модель Вайн-трауба, ууеЗлЪгаиЪ ,1980). Другими словами, специфическая (а не просто регулярная) упакбвка ДНК в состав хроматина может приводить к избирательному экспонированию определенных последовательностей ДНК для ферментов системы транскрипции, что, как минимум, облегчает их работу (по сравнению с операциями на ДНК, свободной от белков хроматина и не компактизованной). Таким образом, из логических построений можно допустить все возможные варианты послед9 ствий взаимодействия ДНК со структурными белками хроматина: общее, "неспецифическое", ограничение взаимодействия ДНК с ферментами и другими факторами процессов реализации ее информации, например, ограничение транскрипции; специфическое, на уровне отдельных генов, или их групп, ограничение транскрипции; или, наконец, отсутствие ограничений и, наоборот, специфическую индукцию транскрипции.

Многочисленные экспериментальные данные работ, посвященные решению данной проблемы позволяют сделать выбор между этими вариантами, хотя и не дают однозначного ответа на многие вопросы. В первом приближении можно выделить три основных направления исследований в этой области: I) структура хроматина активных (в транскрипции и репликации) генов в сравнении со структурой хроматина неактивных (или репрессированных) генов, 2) характер взаимодействия РНК-полимеразы с ДНК в составе хроматина разных уровней организации, и 3) доступность ДНК в составе хроматина для узнавания или взаимодействия с широкой группой биологически активных соединений, в том числе и белков.

I.I. Структура хроматина тршскрипционно-активных генов

Первые работы по анализу транскрипционно-активного хроматина были выполнены еще в "донуклеосомнуго" эру. Они заключались в попытках физически отделить фракцию хроматина, обогащенную транскрибирующимися последовательностями ДНК ( Frenster et al», 1963; Maru

1972. shige and Bonner,1971; Billing and Bonner, ). Главным следствием этих работ можно считать вывод о том, что, макроструктура хроматина активных генов (степень компактизации) отлична от основной части хроматина. В этих же работах впервые было показано отсутствие гистона HI, или его обеднение^в хроматине транскрибирующихся ге- • НОВ (Simpson, Reeci 1973» Pederson, Bhorjee 1975; Berkowitz, Doty, 1975, ) что сейчас может рассматриваться как указание на отсутствие наднуклеосомной организации активных генов и возможную модификацию самой нуклеосомной структуры. К недостаткам работ этого типа надо отнести применение условий, при которых возможна артефактная модификация структуры хроматина, или разрушение структуры отделяемой фракции активного хроматина, что делало невозможным структурный анализ самого хроматина этой фракции.

С открытием нуклеосом, как единицы структурной организации хроматина, вопросы об отличии активно-транскрибирующегося хроматина конкретизировались. Вопрос о том, имеет ли хроматин активных генов нуклеосомную структуру, или некую иную, подробно исследовался многими авторами на разнообразных моделях с использованием электронной микроскопии.

Электронномикроскопически отсутствие нуклеосом в активно транскрибирующихся генах рДНК показано рядом исследователей

Woodcock et al., 1976; Laird et al.,1976 а,Ъ; Poe et al.,1976; Chambon, 1978; Pranke et al., 1976, 1978; Sheer 1978, 1981. )•

При этом, в нетранскрибиругощихся спейсерных участках активных генов нуклеосомы выявлялись (Попенко и др.,1981).

Отсутствие нуклеосом в активно транскрибирующихся нерибо-сомных генах так же выявлялось в ряде случаев электронномикроскопически ( Pranke et al., 1978; Pauvion et al., 1978; Lamb and Daneholt, 1979; Trendelenburg et al.,1980i В то же время этим g же методом, и даже в одном и том же биологическом материале, обнаружены два типа структур хроматина транскрибирующихся нерибо- j —— ^ сомных генов- нуклеосомная ( Рое et al., 1976, Kirszenbaum et al.,

1975, 1978; Laird et al.,1976; McKnight et al.,1978; Ata et al.,1977 c"

Petrov 1980; Franke, 1976, 1978; Puvion, 1978)

Следует отметить два основных вывода этих работ. Во-первых, во всех случаях, как для генов рДНК, так и генов, кодирующих мРНК, электронномикроскопически выявляемая структура хроматина отличалась от структуры основной массы хроматина тем, что не содержала наднуклеосомных комплексов, т.е. была менее компактизо-вана. Во-вторых, нуклеосомная организация, как правило, наблюдалась в редко-транскрибирующихся генах, и отсутствовала в участках с повышенной частотой транскрипции. Так, в хроматине микроплазмодия слизневого гриба физарума на стадии активной транскрипции большой части генома электронномикроскопически выявляются фибриллы без нуклеосом, или с резко увеличенными расстояниями между нуклеосомами (Долидзе и др.,1981; Scheer et al.t 1981) Нельзя исключить возможности, что степень "загруженности" ДНК нуклеосомами коррелирует с уровнем транскрипции этих районов,т.е. нуклеосомы будут выявляться на протяжении гена при его редкой транскрипции и не ¿удут выявляться при следующей одна за одной волне транскрипции, как это имеет место при транскрипции некоторых рибосомальных генов. Одной из возможных причин отсутствия нуклеосом в таких участках может быть изменение их структуры, соответствующее какой-то степени разворачивания ДНК и белкового кора, что делает такую структуру электронномикроскопически не-выявляемой.

Нельзя полностью исключить возможности артефактного "исчезновения" нуклеооом в транскрипционноактивных участках. Большая часть данных о ненуклеосомной организации хроматина активных генов получена методом Миллера (Miller, 1969) » где хроматин распластывается после его перевода в среду с низкой ионной силой, т.е. в условиях частичной дестабилизации нуклеосом ( wu, 1978). Однако ( Spring,1981) используя технику срезов без перевода хроматина в низкие ионные силы, обнаружил, что активно транскрибирующиеся районы хромосом типа ламповых щеток не содержат нуклеосом, в то время как неактивные участки в этих условиях были представлены наднуклеосомной структурой.

Значительно более информативными для понимания структуры хроматина активных генов оказались биохимические подходы, особенно с появлением теста на нуклеазочувствительность ДНК в хроматине. Еще в ранних работах Боннер и соавт. показали, что ДНК активных генов обладает в составе хроматина повышенной доступностью для нуклеаз (Maruschige and Bonner, 1971). В последнее время ДНКаза I и микрококковая нуклеаза стали важными инструментами не только для выделения фракции активных генов, но и для тонкого анализа их ультраструктуры. Действительно, обе нуклеазы способны расщеплять ДНК в хроматине в строгом соответствии со степенью защищенности ее белками хроматина и уровнем упаковки, так что чувствительность разных участков ДНК в составе хроматина различается в десятки раз. Применяя мягкие условия нуклеазного гидролиза, удаеться выявить тонкие различия не только в характере упаковки ДНК в том или ином типе фибрилл хроматина, но и различия в характере укладки ДНК в нуклесомном коре. Анализ нуклеазочувствительно-сти ДНК в сочетании с хорошо разработанными методами тестирования отдельных нуклеотидных последовательностей - фрагментов генов, позволяет, в принципе,картировать распределение нуклеосом по длине определенного гена в его различных состояниях.

Используя нуклеазы как средство для выделения мононуклеосом, авторы многих работ, во всех исследованных случаях показали, что активные гены находятся в нуклеосомной организации, точнее, хроматин активных генов при обработке нуклеазами расщепляется, подобно хроматину остального генома на фрагменты, содержащие отрезок ДНК, равный или кратный мономерному-нуклеосомному ( Lacy, Axel, 1975; Kuo et al., 1976; Reeves, 1977). Это относится так же и к тем генам, для которых электронномикроскопически нуклео-сомы как структура хроматина не выявляются, например, в генах рРНК ( Mathis, Gorovsky, 1976; Reeves 1976; Reeves, Johna, 1976). 1976). Известно, однако, что комплекс ДНК аденовируса с гистона-ми, в котором не выявляется глобулярной, нуклеосомной организации, при мягком нуклеазном гидролизе также обнаруживает типичную для нуклеосомной организации картину расщепления ДНК ( Miller Moghe, 1975). Аналогичный характер расщепления показан так же и для отдельных генов в транскрипционноактивном состоянии: интегрированного в геном клеток мыши тимидинкиназного гена вируса Герпеса (Camerine-Otero, Zaslov, 1980) генов овальбумина и fi -глобина цыпленка ( Bellard et al., 1978, 1980) и ¿-глоби-новых генов эритролейкемических клеток ( Slieffery et al., 1982) редко транскрибирующегося, интеркалированного в геном вируса миелобластоза птиц ( Weintraub and Groudine, 1976).

Таким образом, можно заключить, что нуклеосомы сохраняются на ДНК генов, участвующих в транскрипции, или, что, по крайней мере, гистоны в активных генах определяют нуклеосомно-подобную укладку ДНК, даже в тех случаях, когда, как морфологическое образование, нуклеосома не выявляется. С другой стороны, этот вывод как было показано в дальнейшем, является сильно упрощенным. С одной стороны, известно, что даже такая "дефектная" нуклеосома, как частица, состоящая из ДНК в комплексе только с гистоннами НЗ и Н4 выявляется как нуклеосома по тесту на нуклеазочувствительность и электронномикроскопически (Camerine-Otero and Felsenfeld, 1977)

С другой стороны, уже в тех же работах (см.выше), где был выявлен нуклеосомноподобный характер расщепления хроматина активных генов, было установлено, что этот хроматин значительно более чувствителен к нуклеазе, чем остальная часть хроматина, или хроматин неактивных генов. Так можно говорить об избирательности вышепле-ния активных генов из тотального хроматина при очень мягких условиях гидролиза хроматина ДНКазой I или микрококковой нуклеазой. Это было показано впервые для глобиновых генов ( Weintraub, Groudine, 1976) и овальбуминовых ( Garel, Axel, 1976) а позднее для всех исследованных типов активных генов. Различия в чувствительности к нуклеазам,четче выявляемые при малых концентрациях нуклеаз, достаточно велики, так что относительные скорости выщепления нуклеосом различаются, например, для активного t-глобинового гена (при индукции синтеза глобина в эритролейке-мических клетках) и неактивного иммуноглобулинового гена на порядок (Sheffery et al.,1982). Более детальное исследование нукле-азочувствительности активных генов еще осложнило картину, так как в ряде случаев выявило дифференциальную чувствительность хроматина генов в зависимости от уровня активности транскрипции. Так, наивысшей нуклеазочувствительностью обладает хроматин овальбуми-нового гена в клетках яйцевода, где его транскрипция максимальна, с другой стороны, нуклеазная чувствительность глобинового гена в ядерных эритроцитах, где синтеза глобиновой мРНК уже нет, хотя и сохраняется на повышенном по сравнению с неактивными генами уровне, но минимальна в эритроидном ряду (Chambón et al.,1980). Динамическая зависимость чувствительности хроматина гена к нуклеазе от уровня его экспрессии подтверящена на этих же моделях другими авторами (Schvanec et al.,1979» Ringerts et al.,1974). Блум и Андерсен (1979) показали, что нуклеазочувствительность овальбуминового гена коррелировала с уровнем индукции гена гормоном. Интересно, что как и в случае с глобиновым геном, повышенная нук-леазочувствительность гена овальбумина сохранялась при постепенной инактивации гена ( Blum, Anderson, 1979)- Корреляция нук-леазочувствительности с уровнем экспрессии установлена для генов рРНК в течение оогенеза ( Reeves ,1978) для генов теплового шока дрозофилы ( Gazit, Cedar, 1980).

Сталдер и др. ( Stalder et а1,1980) показали, что смена синтеза эмбрионального типа глобина на "взрослый" сопряжена с изменениями в нуклеазочувствительности хроматина соответствующих генов.

Очевидно, что нуклеазочувствительность хроматина коррелирует с изменением ультраструктуры хроматина, и, таким образом, ясно, что нуклеосомная фибрилла в активных генах модифицирована по сравнению с неактивными. Не предваряя вопрос о причинах модификации структуры, следует проанализировать сам характер изменений структуры. Ранние работы приводили к выводу, что в активном гене хроматин различается по характеру укладки нуклеосом в фибрилле, т.е. взаимодействием нуклеосом друг с другом, и как следствие, иной степенью структуризации линкерных, межнуклеосомных участков, без изменений в организации самих нуклеосом, точнее, коровых частиц нуклеосом. Так, показано, что выделенные моно-нуклеосомы активных генов не отличаются по нуклеазной чувствительности от мононуклеосом остального хроматина ( Garel, Axel, 1976). Анализ динамики расщепления хроматина активных генов показал, что при этом быстрее, чем из неактивных генов, происходит выщепление мононуклеосом, т.е. достпуность линкеров к нук-леазе в активных генах, действительно, повышена. Это было выявлено в хроматине овальбуминового гена ( Chambon, 1977; Blum and

Anderson, 1978) активно-транскрибируемых генов теплового шока (Wu et al. ,1979) группы активных генов, выявляемых с помощью оригинального метода маркирования их с помощью реакции ник-трансляции ( Gazit, Cedar, 1980). Во всех этих случаях наблюдалось преимущественное выщепление мононуклеосом из хроматина активных генов, в то время как неактивный хроматин расщеплялся еще только до мультимеров.

Более поздние работы, показывают, однако, что наряду с лин-керными участками, модификация затрагивает и структуру самих нук-леосом активных генов. Сениор и Пальмитер нашли (senior, Pal-miter, 1981) , что нуклеазочувствительность активных генов определяется так же и повышенной чувствительностью самих коровых частиц. Для стафилококковой нуклеазы различие в чувствительности между активными и неактивными генами сохраняется на всех стадиях гидролиза: межнуклеосомной, при выщеплении кора и при расщеплении ДНК внутри кора. Мононуклеосомы, выделенные при более мягких, чем в работе ( Garel, Axel, 1976) условиях при 0° сохраняют повышенную чувствительность к нуклеазе, в отличие от того, что выявлялось в этой работе. К такому же выводу приходят авторы работы ( Gazit, Cedar, 1980) при использовании ДНКазы I.

Таким образом, можно считать, что хроматин активных генов структурно отличен от хроматина остальных, неактивных генов. Отличия эти заключаются как в ослаблении взаимодействия между отдельными нуклеосомами, т.е. в нарушении наднуклеосомной структуры, так и в модификации структуры самой мононуклеосомы и коровой частицы, предположительно, некоей ее декомпактизации. Конформационные изменения хроматина затрагивают, по-видимому, не отдельные, ограниченные участки активного гена, но ген целиком. Так, при изучении нуклеазочувствительности хроматина гена 70 теплового шока при индукции показано, что скорость нуклеазной деградации транскрибирующейся части гена в 30 раз выше, чем для хроматина 3'-фланкирующей области или тотального хроматина ( Levy, Holl, 1981). Именно эти особенности хроматина всего гена коррелируют с транскрипционной активностью и обратимы при инактивации гена. Для глобинового гена показано, что область повышенной нуклеазной чувствительности может распространяться довольно далеко за пределы собственно транскрибируемой последовательности: 7 тыс.пар оснований от 5 конца первого jg-глобинового гена в глобиновом кластере ( Steider et al., 1979Ъ).

Доказанным, очевидно, можно считать и факт динамичности структуры активных генов. К сожалению, речь идет об установлении динамичности структуры нуклеосомной фибриллы и самих нуклеосом в гене in toto , а не в определенных функционально и структурно различных участках, и на разных стадиях его активности, а не в моменты интимных взаимодействий между определенным участком и РНК-полимеразой или другими факторами РНК-полимеразной системы. Иными словами, мы не знаем конкретной структуры хроматина при инициации, элонгации и терминации транскрипции, а также в местах, взаимодействующих с ДНК-узнающими белками. Частично ответы на эти вопросы представлены в недавних работах, в которых анализировались так называемые "суперчувствительные" к ДНКазе I места в хроматине отдельных генов (см.далее). В целом же ДНК в хроматине активных генов, по-видимому, более свободна для операций с РНК-поли-меразной машиной и более доступна для взаимодействий с ДНК-узнаю-щими белками.

1.2. Факторы,модифицирующие структуру хроматина

Модификация структуры хроматина при активации транскрипции может осуществляться на нескольких уровнях;разрушение наднуклео-сомной организации, т.е. ослабление взаимодействия нуклеосом между собой представляется обязательным компонентом этой активации. Хотя в настоящее время известны факторы, поддерживающие над-нуклеосомный уровень организации (по крайней мере, некоторые из них), механизм разрушения наднуклеосомной структуры неясен. Одним из звеньев этого процесса может быть выведение из активируемых районов гистона КС, отсутствие которого, или, по крайней мере, обеднение которым в активном хроматине показано в ряде ранних работ (см.выше). Возможно, что при этом гистон Н1 замещается на другие белки, которые, в отличие от гистона ЕС, не способны ком-пактизовать нуклеосомную фибриллу.

С другой стороны, изменения в коровой частице, в частности, модификация коровых гистонов, или их взаимодействие с другими белками, так же могут приводить к нарушению взаимодействий гистона Н1 с коровой частицей и, как следствие, снятию наднуклеосомной организации.

Еще меньше можно сказать о природе супернуклеазной чувствительности отдельных мест в активированных генах. Отсутствие нук-леосомных коровых частиц в этих участках или прямо показано ( УагзЬалгаку et а1. ,1979) или, в других случаях, предполагается. Однако, очевидно, что эти участки отличаются большей чувствительностью к нуклеазе, чем "обычные" линкерные межнуклеосомные участки в гене. Причиной избирательного эксповдцэования этих участков может быть более развернутая, чем в остальных линкерах структура, или большая длина линкерного участка, либо взаимодействие его с каким-либо специальным белком. Наконец, модификация структуры хроматина активных районов может включать в себя изменения структуры самих нуклеосомных коровых частиц. В принципе, возможность дестабилизации нуклеосомного кора разворачиванием без потери .гистонов показана в модельных опытах ( Dieterich et al., 1979)

Компактная форма нуклеосомы, наблюдающаяся в интервале ионных сил от 10 до 100 мМ, изменяется в очень низкой ионной силе (0,3-3 мМ) ( Wu et al., 1979), а также в умеренной ионной силе (300 мМ) без диссоциации гистонов ( Williamson, Felsenfeld, 1978; Wasylyk et al., 1979) Переход нуклеосомы в такую менее компактную форму коррелирует с резким (в 4-5 раз) повышением ее транскрипционной способности.

К факторам, определяющим модификацию структуры нуклеосомного кора in vivo , с большой долей уверенности можно отнести модификацию гистонов кора и взаимодействие с кором некоторых белков. Энзиматической модификации гистонов посвящен ряд обзоров ( Peder-son, 1978; Cartwnight et al., 1982,). Здесь следует отметить только некоторые данные, позволяющие соотносить изменение структуры нуклеосом с модификацией гистонов. Корреляция между уровнем экспрессии и ацетилированйем и фосфорилированием гистонов обнаружена уже довольно давно (см.например, Levy-Wilson et al., 1977. Повышенное ацетшшрование гистонов, особенно НЗ и Н4 можно вызвать обработкой клеток маслянокислым натрием ( Candido et al., 1978; Sealy et al., 1978.) • Эффект обратим при удалении агента и довольно специфичен, поскольку определяется ингибированием гистон-деаце-тилазы (Sealy et al., 1978)Лакое индуцированное суперацетилирова-ние гистонов не только коррелирует с мощной индукцией экспрессии (за 24 часа в эритролейкемических клетках активируется почти 4000 генов), но и действительно модифицирует структуру хроматина. Активируемые при этом гены обнаруживают повышенную нуклеазную чувствительность. В работах ( Egan, Levy-Wilson, 1981; Bode et al 1980 ) показано, что ацетшшрование гистонов реально -21

I. , дестабилизирует нуклеосому за счет ослабления взаимодействий ДНК-гистон. Георгиева и др. ( Georgieva et al.,1982)показали, что нуклеосомы, содержащие суперацетилированные гистоны, избирательно локализуются в магний-растворимой (в "активной конформа-ции") фракции хроматина после нуклеазной обработки. Ацетилирован-ными формами гистонов обогащена фракция активного хроматина и в клетках, не обработанных маслянокислым натрием ( Walles et al,, 1977; Nelson et al., 1978; Shumeker et al., 1978).

Ацетшщрование гистонов НЗ и Н4 по 4 остаткам лизина в Л^-концевых фрагментах может приводить к уменьшению суммарно заряда на 30%, что и может определять ослабление взаимодействия гистонов с фосфатными группами ДНК ( Perry, Chalkley, 1981).

В то же время, ацетилирование гистонов имеет следствием повышенную нуклеазную чувствительность линкерных участков ( Ueison et al.,1978)По-видимому, ацетилирование гистонов кора приводит так же к нарушению межнуклеосомных взаимодействий, возможно^ снятию в какой-то степени наднуклеосомной структуры.

Другие модификации гистонов, в том числе фосфорилирование, также, по-видимому, могут иметь отношение к характеру экспрессии генов, но прямых данных о вкладе этих модификаций гистонов в струю турные перестройки хроматина практически нет. Можно обратить внимание на фосфорилирование гистона HI, сопряженного с изменением уровня экспрессии (см. pedersen, 1978). Показано, что фосфорилирование гистона HI уменьшает способность связываться с ДНК, и, следовательно, может модулировать структуру хроматина. Вероятно, что функция гистона HI не сводится к поддержанию наднуклеосомной структуры. Действительно, гистон HI взаимодействует кроме лин-керной части ДНК так же с коровой частицей ( Boulikas et al,, 1980). По крайней мере, в одном из типов укладки нуклеосомной фибриллы гистон HI взаимодействует с обеими ветвями дуплекса ДНК: входящей в нуклеосомный кор и выходящей из него ( Smerdon, Lie-berman, 1981, ). По-видимому, присутствие гистона HI в хроматине реально стабилизирует нуклеосому. Как уже ошечалось выше гистон HI нейвляется во фракциях активного хроматина, или его содержание в ней оказывается пониженным. В некоторых случаях показано, что гистон HI замещается в хроматине его гомологом гистоном HI0, причем последний выявлялся в активном хроматине ( Smith, Johns, 1980.)-Авторы предполагают, что этот белок, в отличие от гистона HI, не является супрессором транскрипции, допуская, что он менее эффективно стабилизирует нуклеосому. Так или иначе, модификация гистона HI, или удаление его из хроматина, или замена на другой белок определенно может сказаться на стабильности коровых частиц. К сожалению, отсутствуют данные о гистоне HI в составе хроматина отдельных экспрессвфуемых генов.

Эффективными модуляторами экспрессии и структуры хроматина могут быть негистоновые белки, особенно белки HMG-. Негистоновые белки с "аномально высокой подвижностью" - HMG-, впервые обнаруженные и выделенные Джонсом и сотр. ( Goodwin et al., 1973;

Goodwin et al., 1975)> представлены в клетке в довольно больших

5 б количествах -10-10 молекул на ядро. Исходя из этого, Джонс и соавт. предполагают, что они являются структурными белками хроматина, а не вовлечены в спецйфический контроль активности генов ( Goodwin et al., 1975). В то же время в многочисленных работах так или иначе выявлена связь,по крайней мере, некоторых из этих белков с транскрипцией или репликацией ДНК. Прямая количественная корреляция между содержанием одного из HMG- - HMG-2 и проли-феративной активностью ткани наблюдается в яичниках, скелетных мышцах и других тканях и органах ( Segedin, Kistler, 1979).

HMG- -бежи типа I и 2 выявляются в больших количествах (абсолютных и по отношению к двум другим главным НМО-белкам типа 14 и 17) в клетках с блокированные синтезом ДНК, например, в ядерных эритроцитах ( Goodwin et al., 1978). При фракционировании хроматина любыми методами НМО-14 и 17 обнаруживаются в связи с фракцией активного хроматина ( Vidali et al., 1977; Davie et al.,

1981; Levy-W. et al.,1979;Georgieva et al.,1981;Weisbroad et al., 1980; Gabrielli et al., 1981).

Примечательно, что авторы последней работы не обнаруживают во фракции активного хроматина HMG-1 и 2. Активный хроматин при этом выделялся оригинальным методом - фракционированием в двухфазной системе полинуклеосомных фрагментов, что по-видимому, уменьшает вероятность потери или перераспределения белков, возможных при фракционировании отдельных нуклеосом.

Вопрос о выявлении НМО- в связи со структурными единицами хроматина осложняется легкостью удаления их при уже умеренных ионных силах-полная экстракция при 0,35 М хлористого натрия ( Goodwin et а1.1978)Кроме того, в отличие от гистонов кора, перманентно соединенных с нуклеосомной ДНК (Manser et al., 1980; Riley et al., 1979), HMG-, по-видимому, находятся в динамическом равновесии между хроматином и нуклеоплазмой ( wu et al. , 1981).

Тем не менее, в условиях, затрудняющих перераспределение белков, HMG- выявляются в нуклеосомах ( Goodwin et al., 1977). Локализация двух групп НМО- 1,2 и 14,17 в нуклеосомной фибрилле различна. Так, цри расщеплении хроматина до мононуклеосом HMG-I и 2 солюбилизируются, что, очевидно, соответствует их внекоровой, линкерной локализации (в динуклеосомах HMG-I и 2 представлены) ( Levy-W'.et al., 1977; Mathew et al.,1979; Tahourdin et al.,1981). В этих же работах показано, что HMG-I4 и 17, а также Нб (аналог HMG-I4 и 17 в семенниках форели), остаются связанными с мононуклеосомами (см.так же Christensen, Dixon, 1981). Вывод о / линкерном расположении HMG-I и 2, по-видимому, подкрепляется солюбилизацией их одновременно с гистоном HI ( Levy, Dixon, 1978) и обнаружением их связи с гистоном HI ( Сагу, 1979; Smerdon, 1976) Линкерная локализация HMG-I и 2, с другой стороны затрудняет однозначность вывода об отсутствии их в транскрипционноактивном хроматине. Так, Леви и Диксон (.Levy, Dixon, 1978) делают вывод о том, что они представлены в этой фракции. Не исключено,что существующие противоречия во многом определяются отсутствием стандартизации глубины нуклвазного гидролиза.

Преимущественная локализация HMC-I4 и 17 в активно-транскрибирующемся хроматине также подвергается сомнению.

Так, это белки были обнаружены в хроматине сателлитной ДНК, вероятнее всего, нетранскрибируемой ( Mathew et al., 1981). Они же сообщают, что в нуклеосомах, сильно обогащенных HMG- 14 и 17 (в 10-15 раз), из хроматина ретикулоцитов птиц нет соответствующего обогащения ДНК глобиновых генов. В противовес ранним данным об отсутствии НМО 14 и 17 в ядерных эритроцитах - клетках с практически полностью репрессированным геномом ( Johns, 1975), Раббани и др., прибегнув к дополнительным предосторожностям против потери и деградации НМО--белков, обнаружили их в эритроцитах в количестве, сопоставимом с тем, что было найдено в ти-моцитах ( Rabbani et al., 1978).

Очевидно, что связь между НМС- и транскрипцией непрямая, и, по-видимому, сами эти бейки не могут рассматриваться как факторы, непосредственно определяющие транскрипцию. Однако, эти белки могут определять и поддерживать конформационное состояние, предусматривающее возможность самой транскрипции, т.е. определять некое "компетентное" состояние хроматина. В этой связи целесообразно рассмотреть данные о характере взаимодействия HMG- -белков с нук-леосомами, а также некоторые особенности их структуры.

Все или большая часть нуклеосом в ядре имеют места связывания с BMG- ( Albright et а1,3980)в активном хроматине 2 молекулы HMG-14 или 17 связаны с одним нуклеосомным кором (Albright et al., 1980; Mardian et al.v 1980; Sandeen et al. ,1980). Само связывание HMG-I4 и 17 с нуклеосомой, по-видимому, определяет приобретение ею повышенной нуклеазной чувствительности. Так, добавление этих белков при реконструкции нуклеосом приводит к повышению нук-леазочувствительности ДНК в них ( Vfeintraub et al., 1980). Корреляция между повышенной нуклеазной чувствительностью и содержанием HMG-14 и 17 в нуклеосомах прослежена в ряде других работ (Levy et al., 1977, 1978, 1979; Vidali et al., 1977). Экстракция HMG-I4 и 17 из ядер приводит к потере специфической чувствительности хроматина активных генов к нуклеазе ( Gazit et al., 1980; weisbroad,Weintraub,1979). Надо отметить, однако, что в ряде работ, в том числе и в последней,экстракция НМС- не избирательна, а ионные силы, которые при этом применяются (0,4 М хлористого натрия) сами по себе способны вызывать дестабилизацию нуклеосом, что может нивелировать нуклеазную чувствительность всех нуклеосом. Возможность дестабилизации нуклеосомных коровых частиц при взаимодействии с ними HMG-I4 и 17 может определяться их характерной структурой. HMG-I4 и 17 имеют как и гистоны, сильно обогащенную основными аминокислотами n -концевой фрагмент, так в HMG-14 85% всех основных аминокислот (5 аргининов и 17 лизинов) сосредоточены в N-концевом фрагменте (в 61 остатке из 100). В отличие от гистонов, С-концевой фрагмент сильно обогащен кислыми аминокислотами (14 глутаминов и аспарагинов на 4 остатка лизина во фрагменте от 61 до 100) ( Walker et al., 1979).То же, в общем, характерно для HMO-17.

Предположительно, n-концевым фрагментом HMG-14 и 17 могут взаимодействовать с ДНК линкерной части, точнее с фрашентом линкера, дополняющим кор до хроматосомы, а С-концевой фрагмент взаимодействует с коровыми гистонами, что, собственно, и может служить дестабилизирующим факторов, ослабляя взаимодействие коровых гистонов с ДНК.

Интересным, но пока не подтвержденным, является свойство HMG-14 и 17 дестабилизировать двойную спираль ДНК в нуклеосоме ( Javaherian et al., 1978).

В свою очередь, предполагаемая роль HMG--белков в трансформации структуры хроматина может быть более тонкой,по-скольку известно, что эти белки в разной степени подвергаются фосфоршшро-ванию. Уровень модификации варьирует в разной степени для всех типов HMG- и по разному на отдельных стадиях клеточного цикла (Arfmann et al.3981). Таким образом, можно допустить, что один и тот же HMG- -белок может определять и поддерживать даже при постоянном присутствии в нуклеосоме динамическую серию ее состояний, так что HMG--содержащие нуклеосомы сателитного хроматина, транскрибирующихся или нетранскрибирующихся глобиновых генов могут, возможно, структурно отличаться друг от друга. Общим для них всех может быть, все-таки, поддержание некоей "открытой" конфор-мации нуклеосомы и нуклеосомной фибриллы, запрещающей, в частности, образование наднуклеосомных структур. В этой связи, любопытным может быть факт отсутствия наднуклеосиной структуры в содержащем сателлитную ДНК центромерном районе хромосом (Бураков и др.,1979). Такое состояние хроматина может быть недостаточным для активации транскрипции, но и не запрещающем ее.

Немногочисленные и противоречивые данные о функциональной роли HMG-I и 2, все таки скорее указывают на них, как на Факторы, могущие обеспечить дополнительную компактизациго нуклеосомной структуры, по крайней мере, способствовать межнуклеосомным взаимодействиям. Так, аналогично тому, что было показано для гистона HI, Иткес и др., выявили кластерность и теснуга сближенность в хроматине HMG-I ( Itkes et al., 1980 ).

Л' О

Ряд других характеристик HMG- -белков также интерес в связи , с рассматриваемой проблемой. Остановимся на них коротко. Показано, что HMG-I и 2 преимущественно связываются с однонитчатой ДНК. Так при физиологических ионных силах, связывание с однонитчатой ДНК исключительно (Vidny, Reeck, 1978; Isackson et al., 1979, 1981 ).

В то же время само связывание их с ДНК стабилизирует двойную спи-^ раль: повышается на 25° ( yu et al., 1978 ).

Относительное содержание HMG-разных типов различно в разных тканях, т.е. тканеспецифично, что может отражать различия в функциональной активности ( Gordon et al., 1980). В ОТЛИЧИв ОТ ГИСТОНОВ, в клетке,по-видимому, имеется большой пул HMG--белков,что, собственно и реализуется при динамическом равновесии между хроматином и нуклеоплазмой. Связывание HMG--белков с ДНК в хроматине, таким образом, определяется какими-то иными причинами, синтез же их не скоррелирован с синтезом ДНК (Kuehi, 1979). HMG- -белки являются, по-видимому, универсальными белками, так как выявлены в разных таксонах эукариот, в том числе в растениях,дрожжах (spiker et al., 1978),насекомые(Alfagene,et al.,1976). К TOMy Же, ОНИ ДОВОЛЬНО консервативны эволюционно (5 замен аминокислот между HMG-I7 эритроцитов цыпленка и тимуса теленка, не изменяют общую архитектуру молекулы (walker et ai.,i98o а,ь). Это значительно меньше, чем, например у глобина двух этих видов и лишь незначительно выше, чем у гистона НЗ ( Brand, Van Holt, 1974 ).

Набор негистоновых белков, способных обратимо трансформировать конформацию хроматина и модулировать транскрипционную активность, по-видимому, в ближайшее время может быть расширен. Чрезвычайно интересный белок выделен из тимуса теленка и описан в работе ( Saffer,Coleman, 1980), Этот кислый белок с молекулярным весом 55 ООО (Д-55, по номенклатуре авторов), представленный к в количестве примерно 10 молекул на ядро, способен связываться с ДНК, гистонами и нуклеосомами. Фосфорилирование этого бежа эндогенной ядерной протеинкиназой не изменяет связывания с ДНК, но резко стабилизирует связывание с гистонами и нуклеосомой. Связывание нефосфорилированной формы бежа с нуклеосомами увеличивает транскрипцию ДНК в них полимеразой е. coli в 100 раз, что в 4 раза выше, чем транскрипция на голой ДНК. Введение всего одной модификации на молекулу белка полностью снимает эффект активации транскрипции. При этом не происходит драматических изменений в структуре нуклеосом, по крайней мере, спектр продуктов нуклеаз-ного гидролиза зфоматина существенно не меняется.

Имеется пример и обратного влияния фосфорилирования негис-тонового белка на транскрипционную активность. Так, кислый не-^истоновый белок с молекулярным весом 70 ООО, выделенный из миксомицета Ph.polycephalum ,в нефосфорилированной форме ассоциирован с рибосомальным рибонуклеопротеидом. Фосфорилирование этого бежа резко увеличивает его взаимодействие с ДНК хроматина, что приводит к 100-кратной стимуляции транскрипции рибосом-ных генов. Эффект этот так же обратим при дефосфорилировании белка ( Kuehn et al., 1979).

Таким образом, в ядре действительно есть факторы, могущие модулировать структуру хроматина. Конформационные изменения хроматина, которые, в целом, можно описать, как приобретение более открытой" структуры фибриллы хроматина и нуклеосомного кора, в ряде случаев скоординированы с повышением экспрессии генов. Открытым, однако, остается вопрос о том, с каким этапом активации экспрессии можно соотнести эти конформационные изменения. В какой степени эти изменения необходимы и достаточны для разрешения собственно транскрипции? Частично ответ на эти вопросы предлагают исследования взаимодействия РНК-полимеразы с хроматином в модельных экспериментах.

1.3. Взаимодействие РНК-полимеразы с хроматином

В развитие ранних представлений об ограничении транскрипции на хроматине как матрице (Bonner et al.,1968) исследования на нуклеосомном хроматине, как матрице, подтвердили и детализовали отдельные стороны ограничений ( Cedar, Felsenfeld, 1973).

При использовании мононуклеосом как матрицы для РНК-полимеразы Е.coli показано, что Ограничена 3?ранскрипция как на ста- V дии инициации, так и элонгации. Количество мест связывания РНК-полимеразы с нуклеосомами уменьшено по сравнению с депротеинизи-рованной ДНК из них в 5-20 раз (Bustin,1978), скорость синтеза РНК на мононуклеосомах снижена до 8-15% от контроля свободной ДНК как матрицы (они же). Максимальная длина транскрипта, однако, соответствует полной длине ДНК в нуклеосоме, что позволяет допустить, что в принципе, нуклеосомный кор "проходим" для РНК-полимеразы ( Bustin et al., 1978).

Авторы этой работы не приводят убедительных свидетельств, что наблюдаемый синтез РНК не отражает гетерогенность нуклеосом в препарате, так что синтез может идти на малой фракции "дефектных" нуклеосом.

- 30

В одной из ранних работ, Виллиамсон и Фельзенфельд используя в качестве матрицы для РНК-полимеразы E.coli хроматин, реконструированный из коровых гистонов и ДНК фага 17, также показали сильное снижение скорости транскрипции по сравнению со свободной ДНК, а также малую длину транскрипта. Фиксация нуко леосом формальдегидом приводила к резкому падению скорости синтеза и еще большему ограничению длины транскрипта, а повышение ионной силы до 0,45 М хлористого натрия увеличивало скорость транскрипции до контрольного уровня. Возможными причинами ограничения скорости транскрипции и длины транскрипта авторы считают гетерогенность нуклеосом, одни из которых могут блокировать прохождение РНК-полимеразы, или смещение нуклеосом (слайдинг) перед РНК-полимеразой, что при скоплении их перед фронтом в конечном счете снижает и скорость транскрипции и длину транскрипта ( Williamson, Felsenfeld, 1978).

Обе модельные системы обладают тем главным недостатком, что нуклеосомы в них, по-видимому, в сильной мере дестабилизированы отсутствием гистона HI, а во втором случае также применением высокой ионной силы. Однако может быть сделан принципиальный вывод, что само присутствие гистонов в связи с ДНК не запрещает прохождения РНК-полимеразы по хроматину.

На более "нативных" нуклеосомах (хроматин плаценты человека, Show et al.,1978) ограничение матричной активности еще выше: она не превышает 2-Ъ% от таковой для полимерной депротеини-зированной ДНК. Переход к мононуклеосоме, как и матрице, действительно, увеличивает матричную активность в 2-5 раз. Интересно, что при этом выявлены три дискретных класса (по длине) транс-криптов РНК с мононуклеосомной матрицы-95,120 и 150 оснований.

Транскрипты, получаемые на олигонуклеосомах, больше по длине, что может трактоваться, как свидетельство в пользу наличия ограничений инициации внутри нуклеосомы при использовании ее как матрицы ( Show et al,, 1978).

При использовании хроматина минихромосомы SV-40 как матрицы для эукариотической полимеразы и полимеразы E.coli выявлено нарушение избирательности транскрипции нитей, что может трактоваться, как маскировка промоторного участка нуклеосомной организацией. И в этом случае, ограничена как скорость транскрипции, так и длина транскрипта ( Meneguzzi et al., 1979).

На хроматине, реконструированном из ДНК плазмиды, содержащей регуляторную область lai -оперона, и гистонов в присутствии экстракта яиц ксенопуса, показано, что наблюдаемую транс1фипцию нельзя отнести за счет наличия свободной от белка ДНК. Действительно, фиксация хроматина формальдегидом или глутаровым альдегидом полностью блокировала транскрипцию. Размер транскрипта превышал длину мононуклеосомы, однако, и в этом случае нельзя исключить смещения нуклеосом-слайдинга в нефиксированном хроматине. Интересным, но трудно объяснимым фактом является то, что транскрипция стимулировалась регуляторным белком1а( -оперона-САР (см.гл.1-3).

Косвенные свидетельства в пользу отсутствия перемещения нуклеосом при транскрипции получены в работе ( Wasylyk et al., 1979). Авторы показали, что в реконструированном хроматине мини-хромосомы SV-40 при транскрипции, так же как и без РНК-полиме-разы, единственный сайт для Eco RI-рестриктазы прикрыт нукле-осомой. Интересно, что уровень ограничения транскрипции на таком реконстру1фованном хроматине (без гистона HI) такой же как на нативной минихромосюме (с гистоном HI). Таким образом, цред-полагается, что главный вклад в ограничения вносит сама нуклеосомная организация коровой частицы (они же).

Критическому анализу работы, в которых в качестве матрицы для транскрипции использованы нуклеосомы, подвергли Лилли и др. ( Ы11еу е* а1.1979) Авторы обращают внимание на то, что в то время как исследования стабильности нуклеосом проводят при их относительно высоких концентрациях в растворе (от 0,1 до 10 мг/мл), в транскрипционных системах концентрация нуклеосом существенно ниже. Последнее определяется необходимостью создать условия насыщения РНК-полимеразой. Такое снижение концентрации нуклеосом, как показывают авторы, приводит к дестабилизации их. При использовании агентов, стабилизирующих нуклеосому, например, сывороточного альбумина, транскрипция снижается. В работе выявлена количественная корреляция между уровнем транскрипции и наличием свободной ДНК в препарате. Те же молекулы РНК-полимеразы, которые находятся в связи с мононуклеосомой, нарушают ее структуру, как выявляется из спектра нуклеазного гидролиза.

Не вставая на крайнюю точку зрения, высказанную Лилли и соавт., все таки следует отметить, что нуклеосомная организация представляет значительные ограничения для транскрипции, причем, как для инициации, так и для элонгации. Гипотетически можно представить несколько вероятных изменений конформации хроматина в участке взаимодействия с РНК-полимеразой. I) Разворачивание нуклеосом при прохождении РНК-полимеразы ( 1/Ге11гЬгаиЪ et а1., 1976). 2) Локальное ослабление взаимодействия ДНК-гистон без диссоциации Ж разворачивания нуклеосомы. 3) Быстрая и обратимая локальная диссоциация ДНК-гистон, по крайней мере, с одной из нитей дуплекса ДНК. 4) Смещение нуклеосом вдоль ДНК без диссоциации.

Сшивание гистонов кора между собой (без пришивки к ДНК) приводит к ингибированию транскрипции. Стимуляция транскрипции в таком хроматине наблюдается только при повышении ионных сил до того уровня, который обеспечивает высвобождение ДНК из взаимодействия с такими гистоновыми корами (Wasylyk et al., 1979). Эти данные допускают все возможные варианты изменения информации, кроме, пожалуй,слайдинга нуклеосомных коровых частиц. Однако, диссоциация гистонов от ДНК в тех условиях (ионных силах), которые были использованы в реакциях, мало вероятна, если только она не индуцируется самой РНК-полимеразой. В новой работе этих же авторов не исключается и возможность слайдинга нуклеосом (по тому же тесту на появление экспонированных сайтов для Eco Ri рестриказы ( Wasylyk et al,, 1979а) .Однако, экспонирование сайта может быть следствием не только смещения нуклеосомы, но и ее разворачивания.

Данные одной из недавних работ ( Gould et al.,1980) свидетельствуют в пользу возможности варианта смещения гистонового кора на одну из нитй ДНК, или вообще смещения, так как показано, что сшивка гистонов НЗ между собой не полностью ограничивает транскрипцию, в то время как пришивка гистонового октамера к ДНК, как показано и ранее, блокирует ее.

В целом, ясно, что нуклеосомная организация хроматина накладывает ограничения на транскрипцию на ее основных этапах. Кроме того, конформационные изменения структуры хроматина, моделируемые в условиях эксперимента, по-видимому, не полностью соответствуют тем конформационным состояниям, которые реально существуют при транскрипции гена. Так, на изолированном хроматине эритролейке-мических клеток, индуцированных к синтезу глобина, с помощью РНК-полимеразы П показано, что хотя синтез глобиновой мРНК и идет, но имеются серьезные нарушения транскрипции. Скорость синтеза глобиновой РНК намного ниже, чем в интактном ядре, к тому же считывание глобинового гена извращено так, что транскрипция идет с обеих нитей ДНК (Nose et al.,1981). Таким образом, выделение > хроматина может приводить к нарушению уникальной структуры транс-крипционноактивного гена, возможно за счет потери факторов, определяющих и поддерживающих эту конформацию. 1

Использование РНК-полимеразы в качестве теста на конформа-ционные изменения структуры хроматина при транскрипции, натолкнувшись на ряд серьезных методических затруднений, хотя и подтвердило представления об ограничении гистонами генной активности ДНК, но пока оказалось не способным ответить на ряд принципиальных вопросов.

1.4.Доступность ДНК в хроматине для взаимодействий

Использование РНК-полимеразы как зонда структуры хроматина, в частности, доступности ДЕК в хроматине, как было показано выше, наталкивается на ряд трудностей. Действительно, РНК-полимераза -мультиферментный комплекс, сопоставимый по размеру с нуклеосомой. С другой стороны, взаимодействие РНК-полимеразы с хроматином полифункционально, оно включает в себя как специфическое взаимодействия (узнавание определенных последовательностей ДНК), так и неспецифическое - собственно транскрипцию. Естественным, в таком случае является обращение к более простым зондам, позволяющим вычленить тот или иной тип взаимодействия с ДНК в хроматине.

Однишиз первых работ, исследующих ограничения возможностей узнавания ДНК в составе хроматина явились работы Мирзабекова и соав. (Melnikova et al.,1975)» Используя диметилсульфат, как агент, модифицирующий основания в ДНК, авторы оценили степень защищенности бороздок ДНК в хроматине гистонами. При этом показано, что гистоны лишь в минимальной степени блокируют метилирование оснований как в большой, так и в малой бороздках. Тем же методом МакГи и Фельзенфельд оценили доступность бороздок ДНК в

- 35 нуклеосомной коровой частице ( Мс Ghee, Felsenfeld, 1979). Метилирование гуанина в 7-положении (большая бороздка) и аденина в 3-положении (малая бороздка) диметилсульфатом происходит в нук-леосоме так же, как в свободной ДНК в растворе. Авторы приходят к выводу, что и в самом нуклеосомном коре обе бороздки практически не защищены гистонами от узнавания, и что, таким образом, гис-f тоны максимально компактизуя ДНК, в минимальной степени препят- / . ствуют ее химической и биологической активности.

Несколько ранее авторы работы ( Ramanathan et al., 1976), используя другой подход - анализ количества выщепляемых нуклеазой продуктов реакции метилирования ДНК в тотальном хроматине диметил-нитрозоамином, выявили неслучайный характер распределения метилированных оснований по ДНК. ДНК, защищенная гистонами от действия нуклеазы, модифицировалась в меньшей степени.

Малая бороздка ДНК в хроматине доступна также для бромистого этидия (Doenecke,1977) хотя при определенных условиях - низком отношении этидия к ДНК, места связывания агента с высоким сродством локализованы на участке линкерной ДНК. Таким образом, и в данном случае выявляется относительная большая защищенность ДНК в составе нуклеосомного кора (Genest et al., 1981, 1981а). Удаление гистона HI при этом увеличивает участок взаимодействия агента с линкерной ДНК от 20-30 пар до 55-60 (они же). К сожалению, , \ I бромистый этидий не может быть, по-видимому,идеальным зондом на j доступность ДНК в хроматине,по-скольку само его свявывание приводит к конформационным превращениям в хроматине. Так, интеркалиро-вание бромистого этидия в коровую ДНК приводит к сильному повышению ее доступности для стафилококковой нуклеазы (Doenecke, 1977; Ershimanovsky et al,,1978). При этом, изменение доступности ДНК для агента определяется не прямо изменением структуры ДНК, а, по-видимому, нарушением ДНК-белковых взаимодействий в коровой частице ( Ershimanovsky et al., 1978).

Тест на определение нуклеазочувствительности мест связывания каких-либо агентов с хроматином использован и в работе ( jack, Brookes, 1981). Авторы исследовали локализацию в структуре хроматина канцерогена бензпирена. И в этом случае распределение бензпирена и его метаболитов было неслучайным: связывание с ДНК линкерного участка в 3 раза выше, чем с ДНК кора.

Таким образом, хотя обе бороздки ДНК лишь в незначительной степени блокированы в хроматине для взаимодействия с низкомолекулярными соединениями, различия в конформации или защищенности белками все-таки определяют разный характер взаимодействия этих соединений с линкерной и коровой частью ДНК в нуклеосоме.

Значительно сильнее укладка ДНК в состав коровой частицы сказывается на взаимодействии с ДНК в ней белков. Собственно,сам динамичный характер расщепления нуклеосомной фибриллы нуклеазами уже выявляет различия в доступности ДНК в коре и линкере. Известно, что степень защиты ДНК кора для стафилококковой нуклеазы и ДНКазы I различна. Б жестких условиях гидролиза первая довольно слабо атакует ДНК кора, в то время как вторая расщепляет ДНК коровой частицы с периодичностью 10 пар, в соответствии с характером укладки ДНК по октомеру. Уайтлок, исследовавший характер расщепления ДНК нуклеосом обеими нуклеазами, приходит к выводу о том, что пространственная геометрия частицы, а не прямая физическая защита гистонами, может определять доступность ДНК в нуклеосоме для нуклеаз (Whitlock, 1977). Автор предполагает, что даже незначительные различия в пространственной организации нук-леосомы могут иметь, таким образом, важные последствия для взаимодействия с ДНК-узнающими белками и, в конечном счете, опреде

- 37 лять возможность или невозможность экспрессии гена.

Интересно, что нуклеаза не безразлична к состоянию малой бороздки ДНК. Так, полилизин, равномерно заполняя малую бороздку ДНК при титровании олигонуклеосом или мононуклеосом, уменьшает доступность ДНК в них для нуклеаз (Doeneoke,1977). в общем смысле, аналогично этому, заполнение малой бороздки ДНК в нуклеосоме каким-либо ядерным белком может дополнительно ограничивать доступность ДНК в ней.

Аналогично нуклеазам (стафилококковой) ограничение доступности ДНК в нуклеосомной фибрилле для антибиотика блеомицина г (смесь антибиотиков из . N -,

Антибиотик, вызывает разрывы в ДНК, свободной от бежа, выщепляя тимин (при малой концентрации в специфической последовательности). При обработке хроматина блеомицин вызывает образование нуклеосом, содержащих все гистоны, в том числе и HI и фрагмент ДНК длиной около 175 пар оснований. Хотя места расщепления ДНК при избранной концентрации неспецифичны, все они локализованы только в лин-керной ДНК, так что ДНК в составе кора полностью блокирована от взаимодействия с антибиотиком (Tien Kuo M., Hsu, 1978).

Сильно редуцирована возможность репарации однонитчатых разрывов в ДНК хроматина полинуклеотидлигазой. Репарация в этом случае, по-видимому, ограничивается линкером и модулируется конфор-мационными перестройками хроматина ( Montagna et al., 1981).

При действии на суммарный хроматин специфичной к однонитча-той ДНК нуклеазы продуктом расщепления являются нуклеосомы и, преимущественно, олигонуклеосомы ( Leibovitch et al., 1981). Можно допустить, хотя соответствующих контролей нет, что и в этом случае, реализуются только те однонитчатые разрывы, которые предсуществовали в линкерной части ДНК.

Более четкие данные имеются о сильном ограничении взаимодействия с ДНК в составе хроматина для бактериальных ДНК-рес-триктаз-сайт-специфических белков. Б ряде работ показано, что при их действии на хроматин ДНК расщепляется только в линкерной части ( Cremisi et al., 1976; Persico-Dilany et al., 1977; Amin Mirza et al., 1981).

Только олигонуклеосомы выявляются при обработке хроматина сателлитной ДНК зеленой мартышки рестриктазой Eco RI

Musich et al., 1977).

Таким образом, сайт-специфическое узнавание ДНК, упакованной в нуклеосомный кор, по-видимому, может быть сильно, если не полностью блокировано. Один из важнейших этапов в регуляции генной активности - специфическое узнавание, регуляторными белками определенных последовательностей ДНК, вероятно, требует кон-формационных перестроек хроматина. Хотя необходимость сайт-специфического узнавания как одного из механизмов тонкой регуляции генетической активности для эукариот пока остается гипотетической -по аналогии с бактериальными системами, однако сама возможность присутствия в клетках эукариот сайт-специфических белков уже не является только предположением. С большим основанием к ним можно отнести эукариотические ДНК-метилазы (см.далее). Несколько белков, обнаруживающих сайт-специфическое взаимодействие с ДНК выделено из разных объектов. Один из таких ДНК-связывающих белков

1980)

ДБ-2 из яиц дрозофилы (Weiâeli et al. связывается только с определенным рестриктом ДНК дрозофилы, выявленным при селекции плаз-мид. Этот белок, представленный ограниченным числом копий на ядро (от 150 до 1500), при связывании с ДНК перекрывает фрагмент от 13 до 30 пар оснований.

Хотя функция этого белка неизвестна, сам факт присутствия его в клеточном ядре делает правомочным постановку вопроса об ограничениях сайт-специфического узнавания ДНК в составе хроматина.

В этой связи чрезвычайно интересно исследование модельных, нуклеосом, содержащих фрагмент ДНК 1ас -оперона ( chao et al., 1980а,19806). Авторы реконструировали коровуго частицу и нуклео-сому из коровых гистонов и рестриктов, содержащих участок взаимодействия с 1ас-репрессором общей длиной 144 и 203 пары оснований. Взаимодействие lac -репрессора с частицами тестировалось по их утяжелению при центрифугировании в градиенте, содержащем белок-репрессор. Главным выводом работы является заключение о возможности образования специфического комплекса репрессора с ДНК в составе и нуклеосомы, и коровой частицы. Интересны некоторые особенности этого взаимодействия. Для взаимодействия репрессора с коровой частицей концентрация репрессора в градиенте должна быть в 100-200 раз выше, чем для нуклеосомы. В то время как связывание с нуклеосомой было высокоаффинным, коровые частицы представлены двумя дискретными классами, класс с высокоаффинным связыванием составлял 20% от всех коровых частиц. Сшивание гистонов кора диметилсуберимидатом или обработка нуклеосом формальдегидом полностью запрещала связывание с высоким сродством, низкоаффинное связывание цри этом не блокировалось. Высокоаффинное связывание, по-видимому, приводит к конформациоиному превращению нуклеосомы (по тесту на изменение спектра нуклеазного гидролизата). Авторы предполагают наличие двух этапов и типов связывания репрессора с сайтом узнавания. Первый этап состоит во взаимодействии с ограниченным участком ДНК-низкоаффинное связывание нестабильное, с высокой константой диссоциации. Второй этап предполагает кон-формационный переход в нуклеосоме с последующей реализацией более прочного связывания с ДНК. Ограничения на втором этапе могут определяться линейным и пространственным расположением узнаваемого сайта в нуклеосоме. Авторы предполагают существование двух типов доменов в нуклеосоме. Локализация узнаваемого участка только в одном из них обеспечивает возможность разворачивания и, следовательно, прочного связывания. Сопоставление места связывания с картой расположения гистонов по ДНК (Мирзабеков и др.,1978) показывает, что домен с прочным связыванием соответствует локализации гистонов Н2А и Н2Б, прочное связывание запрещается в домене, содержащем НЗ-Н4.

Таким образом, сайт-специфическое узнавание, в принципе, возможно для ДНК в составе хроматина. Следует отметить однако, что оно ограничено доступностью только определенных мест в нуклеосоме, так что полное взаимодействие репрессора с ДНК реализуется только при определенной локализации сайта узнавания. Взаимодействие это требует разворачивания нуклеосомы, или смещения гистонового кора на одну нить ДНК. Это конформационное изменение структуры нуклеосомы может частично определяться способностью репрессора при взаимодействии с ДНК нарушать ее конформацию ( Ки1аг<1 et а1., 1981) Облегчать такое взаимодействие с ДНК в составе нуклеосомы может также то, что репрессорв заимодействует с одной стороны дуплекса , ДНК^ ( Оое<1<1е1 et а1., 1978).

Надо отметить, что сама модель довольно упрощена - нуклео-сома без Н1, что уже само по себе делает ее более доступной, "открытой", а также без других факторов, возможно,обеспечивающих большую блокировку узнавания ДНК в нуклеосоме.

Таким образом, в целом, воцрос об ограничении узнавания ДНК при ее упаковке в нуклеосомную структуру не может считаться решенным, в том числе и проблема ограничения сайт-специфического узнавания и степень ограничений.

1.5. Другие подходы к исследованию доступности

В более широком смысле узнавание, которое может реализоваться в ядре при экспрессии генов, несводимо только к узнаванию и взаимодействию с ДНК. Факторы регуляции генной активности, например, стероидные гормоны могут иметь акцептор в хроматине, определяющий специфичность взаимодействия с определенным геном или блоком генов, отличный от ДНК. Такими акцепторами могут быть определенные негистоновые белки, локализация которых в хроматине в свою очередь специфична. В этом случае узнавание может быть усложнено добавлением еще одного звена: ДНК-белок-белок. С другой стороны, можно допустить, что один из этапов регуляции определяется взаимодействием со структурными белками нуклеосом "регу-ляторного белка", что приводит к изменению конформации нуклео-сомной фибриллы (или наднуклеосомной) с увеличением доступности ДНК для сайт-специфического узнавания.

Естественно в этой связи рассмотреть оборотную сторону медали, т.е. не только доступность ДНК в том или ином типе укладки, ^ноидоступность' 'белков хроматина для взаимодействий, и возможные изменения доступности при конформационных перестройках. Показательна в этом плане ситуация, выявляемая при использовании одной из фотоаффинных меток хроматина зА -бис- (9-акридинил) -4-аза(4-азидобензоил)-1,7-диаминогептана (ННаеп, 1981). В участках хроматина, отличающихся повышенной нуклеазной чувствительностью, избирательно метится гистон Н1, то же характерно для оли-гонуклеосом в форме "бусы-на-нитке". При компактизации хроматина, или в нуклеазорезистентных участках избирательность связывания метки с гистоном Н1 отсутствует.

Ограничение доступности негистоновых белков в хроматине для

-V-'' V •• •:•' -I

Г .;"г антител показано в работе Уманского (Ермекова и др.,1981).Неспецифическая декомпактизация хроматина экспонирует детерминанты негис-тоновых белков. Ограничения доступности могут быть связаны как с белок-белковыми взаимодействиями, так и ДНК-белковыми взаимодействиями в компактной форме хроматина,так и со стерическими факторами.

Разная доступность коровых гистонов для взаимодействий показана при анализе связывания бензо( )пирена с хроматином в ядрах. При очень низком уровне связывания -I молекула на 100 нуклеосом, выявлена избирательность связывания с гистонами НЗ и Н2А, но не с Н5 и Н2Б ( мае Leod et ai., 1981). К сожалению, в работе отсутствуют данные о характере связывания агента с изолированным хроматином или олигонуклеосомами. Избирательность связывания в данном случае может отражать не только (и, может быть, не столько) особенности укладки белков в нуклеосому, но соответствовать некоему классу нуклеосом. Действительно, гидрофобный характер бенз(а)пирена и его производных, предполагает локализацию последних в ядерной оболочке,и, таким образом, связывание может касаться класса нуклеосом ассоциированных с ядерной мембраной. Косвенно в пользу этого свидетельствует отсутствие связывания с гистоном HI, которого, как показано (Fais et al. Д982), лишен примембранный хроматин. Так или иначе,доступность бежов хроматина для взаимодействий, действительно, может быть различной и меняться при конформационных превращениях или в различных упаковочных состояниях.

Интересно было бы проанализировать характер связывания с хроматином агентов, имеющих в нем специфическую детерминанту. С этой точки зрения можно рассмотреть данные, правда немногочисленные, о взаимодействии с хроматином гормон-рецепторных комплексов. Для некоторых стероидных гормонов показано, что индукция транскрипции, опосредованная ими, сочетается с их непосредственным взаимодействием с хроматином, причем этот эффект реализуется не только в интактных клетках, но и на препаратах хроматина. Так, комплекс эстрогена с очищенным рецепторным белком (ГРК) в малой концентрации (0,1 нМ) стимулирует транскрипцию при связывании с выделенным хроматином клеток яйцевода (smith, Schwartz, 1979). Чистый гормон не обладает таким действием. При индукции такого типа количество мест связывания для эндогенной РНК-полимеразы увеличивается до уровня, соответствующего наблюдаемому в клетках при гормональной индукции (около 14000 мест инициации). Правомочным кажется допущение, что при взаимодействии ГРК с хроматином совершается конформационный переход в более "открытую" форму.

Действительно, при обработке клеток HeLa гидрокортизоном, при которой наблюдается резкое (в 10-12 раз) повышение уровня транскрипции, наблюдается повышение связывания с хроматином нит-розометилмочевины (НММ). При этом НММ обнаруживается в нуклеазо-доступной фракции хроматина, соответствующей по методу выделения (ДНКазо-11-растворимая фракция) транскрипционно-активному хроматину ( Tew et al., 1980). Связывание ГРК с транскрипционно-актив-ным хроматином, точнее, с нуклеазо-чувствительной фракцией хроматина, выявлено во всех исследованных в этом отношении случаях. Так, при инкубации хроматина с эстрадиолом насыщение магний-растворимой (после обработки ДНКазой II) фракции хроматина значительно выше ( Alberga et al.,1980).То же показано при введении гормона in vivo, ( Hemminki, Vanhkonen, 1977). По нуклеазо-доступной

ДНК связывается ГРК андрогена при инкубации с хроматином простаты ( Rennie, 1979).Такова же локализация трийодтиронина после его введения in vivo (Jump, Oppenheimer, 1980).

Итак, в этих исследованиях выявлено два принципиальных факта: ГРК предпочтительно локализуется в более "открытой" конформа-ции хроматина и, во-вторых, само связывание ГРК с хроматином может приводить к переходу хроматина в эту "открытую" конформацию. Сопоставление двух этих фактов заставляет предположить, что первичной для узнавания и взаимодействия с ГРК является не "открытая", а некая другая конформация. В принципе, возможны два типа взаимодействий ГРК с хроматином: один из них - взаимодействие с некомпактным хроматином может определяться повышенной доступностью для взаимодействия ДНК, что и соответствует локализации ГРК в транскрипционно-активной фракции. Второй тип взаимодействия должен основываться на узнавании гормонрецепторным комплексом специфической детерминанты в компактной форме хроматина. Можно допустить, далее, что только этот второй тип взаимодействий имеет отношение к собственно специфическому действию гормона, в то время как первый тип связывания отражает неспецифическую аффинность белка-рецептора к доступным участкам ДНК,экспонирующимся при конформационном переходе. В этой связи интересны данные работы Климента и др. (Kliment et al.,1978) исследовавших мишенную специфичность связывания ГРК триамцинолона и дексаметазона с хроматином и его частицами. Связывание комплекса гормона с очищенным рецептором - ГРК с тотальным хроматином in vitro сохраняет тканевую (мишенную) специфичность: 2,94 пикомоля ГРК на I мг ДНК в печени крыс и 1,45 - в эритроцитах цыпленка. Однако^ специфичность связывания исчезает при переходе к нуклеосомам и олигонук-леосомам, причем количественно связывание резко уменьшается: до 10% от исходного. Коровая частица совершенно не связывает ГРК. В то же время после обработки олигонуклеосом 0,6 М хлористым натрием связывание резко увеличивается, в том числе и связывание с кор-частицей нуклеосомы. Специфическое связывание в тотальном хроматине, таким образом, определяется каким-то фактором, элиминирующимся при переходе к олигонуклеосомам и мононуклесосомам.

В принципе, это может быть как сама наднуклеосомная организация хроматина, или какой-либо фактор (негистоновый белок), теряющийся при выделении моно- и олигонуклеосом. Сильная дестабилизация нуклеосом (при солевых обработках), действительно, приводит к увеличению неспецифического взаимодействия с ними за счет аффинности ГРК к ДНК. С другой стороны, нельзя исключить и возможности уменьшения доступности для взаимодействия с ГРК специфической детерминанты при декомпактизации хроматина, а не просто ее исчезновения.

Так или иначе, на примере ГРК и его взаимодействия с хроматином видно, что в ядре может реализоваться и узнавание, прямо не определяемое ДНК, и что этот тип узнавания и взаимодействия также может быть опосредован различными конформационными состояниями хроматина.

С другой стороны,ГРК может быть тем фактором, который, аналогично lac -репрессору на искусственной 1ас-нуклеосоме, может определять конформационный переход хроматина в "открытую" для других узнаваний и взаимодействий форму, в том числе и для специфических ДНК-белковых узнаваний. В пользу этого говорят прямые данные об увеличении доступности для РНК-полимеразы хроматина, обработанного ГРК эстрадиола (см.выше), а также данные о локализации ГРК в нуклеазодоступной фракции хроматина. Один из возможных механизмов дестабилизации нуклеосомы IPK может заключаться в непосредственном связывании его с гистонами кора, как показано для гормонрецепторного комплекса эстрадиола. Каллос и др. ( Kallos et al 1981) показали, что ГРК неслучайным образом связываются с гистонами; преимущественно с Н2А и Н2Б, умеренно с НЗ и Н4 и очень слабо с гистоном HI. Связывание ГРК с Н2Б, как показано в этой работе, стабилизирует связывание ГРК с ДНК. Такой тип связывания реально может приводить к конформационному переходу нуклеосомы в более "открытую" конформацию.

1.6. Неслучайный характер расположения нуклеосом по ДНК

Ограничения на узнавание ДНК в нуклеосоме и, в частности, ограничения на сайт-специфическое узнавание, в принципе, могут быть сняты не только конформационными преобразованиями в "открытую" структуру. Гипотетически возможен вариант неслучайного расположения нуклеосом вдоль дуплекса ДНК. Этот вариант может включать в себя не только аффинность коровых гистонов или всего ок-тамера к определенной нуклеотидной последовательности,но и предпочтительного связывания гистона Н1 и негистоновых белков с определенной нуклеотидной последовательностью, или в соответствии с какими-либо структурными особенностями ДНК-палиндромами и т.д.

В крайнем случае этого варианта можно допустить, что расположение нуклеосом вдоль ДНК находится в соответствии со структурой гена, вне зависимости от причин, которые могут этот феномен обеспечить. Это могло бы означать, что доступность тех или иных сайтов в ДНК для узнавания ре гулят орными белками или РНК-полиме-разной системой не ограничивается, так как они могут быть избирательно экспонированы. Исследованию этой привлекательной возможности посвящено большое количество работ последних лет. Главным подходом в исследованиях в этой области стало выявление и картирование мест (в суммарном хроматине, или в отдельном гене, или блоке генов), избирательно чувствительных к действию ДНКазы I или стафилококковой нуклеазы.

В ранних работах было обнаружено, что в хроматине минихро-мосомы5У40 один из районов избирательно доступен действию рес-триктаз, а в определенных условиях и стафилококковой нуклеазы Varshavsky et al. ,1978,1979). Эта избирательно экспонированная для нуклеаз область включает в себя "origin" репликации, место связывания Т-антигена и, по-видимому, промотор для "поздних" ге-' нов. Разрыв в локализации нуклеосом выявлен электронномикроско-пически ( Jakobovits et al. 1980), Величина этого разрыва, тестируемая с помощью рестрикционного анализа, составляет 249+13 пар оснований с максимальной величиной 385 пар оснований ( Saragosti et al., 1980).

В дальнейшем эти данные были как подтверждены, в том числе и на реконструированном хроматине, так и оспаривались и прямо опровергались (Nedospasov, Georgiev, 1980). Подробно исследования на этом объекте описаны в недавнем обстоятельном об- ' / зоре((см7обзор).; Здесь следует отметить, что несмотря на кажущуго

- ^ ся простоту - небольшой размер генома, точно известное количество нуклеосом - 22-24, объект достаточно сложен для однозначных интерпретаций. Одним из затруднений при анализе является гетерогенность популяции минихромосом, так что описанные выше феномены наблюдаются только в 15-20% минихромосом, и сложность сопоставления наблюдаемой картины с транскрипционной активностью.

Информация о возможно неслучайном расположении нуклеосом получена в последние несколько лет и на эукариотических хромосомах. Было обнаружено, что, помимо общей повышенной к нуклеазе чувствительности хроматина активных генов, существуют места гиперчувствительности к ДНКазе I. Расположение этих мест различно в разных генах, но в ряде случаев выявляется общая закономерность -наличие гиперчувствительных мест вблизи 5'-конца генов. Так,несколько генов теплового шока дрозофилы в большинстве или во всех тканях имеют область вблизи 5'-конца, избирательно чувствительную к ДНКазе I ( Wu et al.,1979).C другой стороны, при анализе специализированных клеток выявляется, что этот тип нуклеазочув-ствительности может быть связан с экспрессией генов. Так, гиперчувствительность хроматина в участке, соответствующем 5*-концу пре-мРНК инсулина, обнаруживается только в р -клетках опухоли поджелудочной железы (где синтез инсулина идет) и не выявляется в хроматине печени, селезенки, мозга ( Wu, GiTbert, 1981). Сталдер и др. установили ДНКазо 1-чувствительные места вблизи oL-и ^-глобиновых генов. Чувствительность этих сайтов также . различалась в хроматине эмбриональных и взрослых клеток, т.е. находилась в соответствии с характером экспрессии ( Steider et al.,1980). Детальный анализ ДНКазо-I чувствительности .р-глобинового гена цыпленка в эмбриональном развитии не только показал, что гиперчувствительные места локализованы вблизи 5'-конца гена, но при выключении транскрипции гиперчувствительность этого участка исчезает (Weintraub et al.,1981). Изменяется картина распределения гиперчувствительных мест при выключении транскрипции и в кодирующих участках гена ( Steider et al., 1980).

Хотя природа гиперчувствительности ДНК в хроматине к ДНКазе I не известна, вероятно, что участки обладающие его, лишены нуклеосом. Собственно активный хроматин, т.е. в целом, хроматин кодирующей области активных генов, характеризуется, хотя и повышенной чувствительностью к ДНКазе I, но значительно уступающей гиперчувствительным местам. Таким образом, правдоподобным кажется вывод о неслучайном расположении нуклеосом по ДНК, по крайней мере, в хроматине активных генов.

Неслучайность расположения нуклеосом вдоль нити ДНК может определяться, в принципе, инвариантностью взаимодействия гистоново-го октамера с определенной нуклеотидной последовательностью. В идеальном случае, ДНК, состоящая из блока повторяющихся по длине последовательностей, каждая из которых допускает только один из вариантов взаимодействия гистонового октамера, будет упакована в нуклеосомную фибриллу таким образом, что каждая нуклеосома будет "находиться в фазе" относительно другой. В иных случаях, позиция одной из нуклеосом на ДНК может быть задана инвариантно, что автоматически задаст положение других нуклеосом, которые уже не будут располагаться в соответствии с нуклеотидной последовательностью, Такое фазовое распределение нуклеосом по определенной последовательности ДНК должно быть одинаково для всех этих последовательностей в наборе клеток, если оно определяется сигналом, существующем в самой последовательности, или различным, если этот сигнал,т.е. место посадки "лидерной" нуклеосомы,оцределяется,например, неким негистоновым бежом, регулирующим экспрессию. Наконец, фазовость может быть поливариантной, если допускается несколько вариантов взаимодействия гистонового кора с одной и той же последовательностью ДНК.

Проблема фазовости распределения нуклеосом специально и довольно широко исследуется в последние годы. Ранние работы основывались на определении аффинности гистонов или гистоновых октаме-ров к ДНК определенного нуклеотидного состава. В этих работах, как и в более поздних (см., например Nelson et al.,1979)не было выявлено никакой предпочтительности взаимодействия гистонов или нуклеосом с определенной последовательностью ДНК. Более плодотворным оказался подход с использованием анализа характера расщепления ДНК в хроматине стафилококковой нуклеазой, ДНКазой I или рес-трикционными нуклеазами. Стратегия этих исследований базируется на следующей логике. Если расположение нуклеосом на определенной последовательности инвариантно (или допускает ограниченное число вариантов), то после нуклеазной фрагментации хроматина ткани (набора клеток) в гель-форезе можно будет наблюдать ограниченный набор фраплентов. Если же нуклеотидная последовательность допускает множество вариантов расположения нуклеосом (и эти варианты реализуются в разных клетках), то дискретные фрагменты в гель-форезе выявляться не будут.

Ранние работы, выполненные на вирусном хроматине (полиома и sv 40), показали рандомичный, случайный характер распределения нуклеосом ( Cremisi et al.1976),однако при этом не была исключена возможность наличия нескольких вариантов, в том числе и функционально различных. На сумме уникальных последовательностей ДНК печени крысы фазированность нуклеосом также не выявлялась (Prunell, Kornterg, 1978). Ситуация однако изменилась при переходе к анализу отдельных генов. При анализе продуктов расщепления хроматина ксенопуса при мягком гидролизе стафилококковой нуклеазой выявилось фазовое распределение нуклеосом по гену 5 S РНК ( cottesfeld, Bloomer, 1980). При этом определены 4 типа расположения нуклеосом. Во всех этих 4-х вариантах фазового распределения участки, соответствующие началу транскрипции, области контроля и терминации,найдены вблизи линкерных участков (или в них). Интересно, что при мягком гидролизе нуклеазой из хроматина выщепляется тетрануклеосомный фрагмент, соответствующий повтору (единице) ДНК генов 5 s РНК.

Два варианта расположения нуклеосом по ДНК5 s генов дрозофилы выявлены в работе ( Ъош±з et al., 1980).

В то же время Корнберг и др. ( Baer, Kornberg, 1979), анализируя расположение нуклеосом по ДНК генов 5 sPHK печени крысы тем же методом, но при глубоком гидролизе хроматина микрококковой нуклеазой (до коровых частиц), не выявили фазового распределения.

Возможных причин расхождения данных (и выводов) несколько. Во-первых, при использовании глубокого гидролиза до коровых частиц возможно смещение нуклеосом с первоначально занятых ими мест. Смещение (слайдинг) нуклеосом, в принципе, возможен, и показан при удалении гистона НЕ, что, в частности,и происходит при глубоком гидролизе. С другой стороны, при мягком гидролизе стафилококковая нуклеаза может действовать как сайт-специфический фермент, предпочитающий последовательность 5*-CATA или 5'-СТА ( Horz, Altenburger, 1981). Неслучайность расщепления и голой ДНК генов 5sPHK и ряда других последовательностей, действительно^ показана в эксперименте ( Keene et al., 1981)« Последнее, однако, не может доказательно отрицать фазовость распределения нуклеосом. К тому же надо иметь в виду, что при мягком гидролизе микрококковой нуклеазой расщепление преимущественно межкоровое, так что вряд ли можно ожидать сайт-специфического гидролиза ДНК, прикрытой кором. Наконец, возможная причина невыявления фазового распределения нуклеосом по ДНК генов 5S РНК в печени крысы может заключаться в малом количестве активно-транскрибирующихся генов в этих клетках, если неслучайное расположение нуклеосом характерно именно для гена в активном состоянии.

Некоторые варианты объяснений можно исключить, поскольку они были подвергнуты экспериментальной проверке. Так, дискретные фрагменты (что свидетельствует о фазированном распределении нуклеосом) были получены при гидролизе хроматина ДНКазой I, не обладающей выраженной сайт-специфичностью. Эти данные относятся к глобиновым генам цыпленка ( Stalder et al., 1980).

Возможность слайдинга нуклеосом, извращающего первоначальную их локализацию, также, по-видимому, не следует преувеличивать. Действительно, Леви и Нолл ( Levy, Noll, 1980), исследуя фазированноеть нуклеосом с помощью выявления расположения сайтов для рестриктаз в предварительно выделенных с помощью глубокого гидролиза коровых частицах, определили неслучайный характер распределения нуклеосом по гену теплового шока 70. Методология этого подхода состояла в следующем. После исчерпывающего гидролиза микрококковой нуклеазой ДНК из коровых частиц гидролизова-ли различными рестрикционными нуклеазами. Если положение нуклеосом по отношению к сайтам рестрикции первоначально фазировано (в сумме клеток дрозофилы), то при действии рестриктазы на ДНК коровой частицы ожидается получение дискретных полос длиной меньше, чем 145 оснований в гель-форезе. Рандомическому распределению нуклеосом по ДНК тестируемого гена соответствует в таком случае отсутствие дискретных полос. Таким методом было выявлено 3 типа расположения нуклеосом по гену. Неслучайный характер распределения нуклеосом выявлен также при использовании фрагментации тотального хроматина рестрикционных нуклеаз.

Один тип распределения нуклеосом по ¿-сателлитной ДНК африканской зеленой мартышки показан В работе ( Musich et al.,1977). Возможно, что на самом деле в данном случае имеется несколько типов фазирования ( Zachau, Igo-Kemenes, 1981 ) 2 ТИПЭ раСПОЛОЖв-ния нуклеосом на сателлите I из хроматина печени крысы выявили в работе ( igo-Kemenes,et ai.,1980). Фазовость нуклеосом выявлена также в С-части (константной) каппа-легкой цепи иммуноглобулина мыши ( Pfeiffer, zachau, 19 80) причем у гена в неактивном состоянии (печень мыши).

В целом, можно заключить, что, несмотря на ряд противоречивых и взаимоопровергающих данных, что в свою очередь,хотя бы отчасти, определяется методическими ограничениями, фазированность нуклеосом реально существует. Выявляется она для определенных последовательностей ДНК и для отдельных генов. Инвариантность распределения нуклеосом, однако, скорее является исключением и может быть особенностью нетранскрибируемых последовательностей. Наличие нескольких возможных вариантов расположения нуклеосом может отражать функциональную гетерогенность хроматина определенного гена. По крайней мере, изменение картины расположения гиперчувствительных мест при активации и инактивации гена с этим согласуются. К сожалению, возможность исследования собственно транскрибирующейся части гена этими методическими подходами, по-видимому, ограничена. Модификация самой нуклеосомной структуры, которая наблюдается при транскрипции (см.ранее), сильно изменяет доступность хроматина для нуклеаз. Это же относится и к возможностям использования рестриктаз. Неактивный ген фрагментируется рестриктазами только по линкерным участкам (что соответствует полному ограничению на узнавание сайта в коровой частице) (HÖrz et al., 197б).в активном гене (С-часть легкой цепи иммуноглобулина) все сайты рестрикции доступны для рестриктазы и расщепляются с большой скоростью, так что можно говорить о исчезновении типичной нуклеосомной структуры ( Pfeiffer, Zacbau, 1980). Этим может быть, возможно, объяснен тот факт, что в гистоновых генах дрозофилы фазирование в транскрибируемой части генов не выражено, хотя в нетранскрибируемом спейсере нуклеосомы расположены не-рандомически ( Samal et al., 1981).

Некоторые косвенные данные позволяют думать, что и в транскрибируемой части гена нуклеосомы могут быть расположены неслучайно. В пользу этого говорят данные об изменении длины повтора нуклеосомы в активном гене (см.»например, Berkowitz, Riggs, 1981 ) wWeintraub et al.,19E0) ПОКаЗЭЛИ, ЧТО ПО НвЭКТИВНОМу ß -ГЛОбиновому гену в эритроцитах нуклеосомы расположены фазировано, в то время как по этому же гену в мозгу нуклеосомы расположены случайным образом ( №е±п^аиЪ et а1.,1981). Сопоставив эти данные с тем, что при терминальной дифференцировке хроматин глобиновых генов сохраняет определенные черты организации, свойственные активному гену, можно предположить,что и в активном гене нуклеосомы фазированы. Нельзя конечно, исключить, что в мозгу фазированность не выявляется, так как высока клеточная гетерогенность (не функциональная по данному гену, а линейная - по происхождению).

Резюмируя, можно заключить, что расположение нуклеосом, цри-уроченное к определенным участкам гена в определенном его функциональном состоянии, действительно может снять ряд проблем с ограничением узнавания ДНК регуляторными белками или РНК-полимераз-ной машиной. В то же время, возможность существования нескольких типов фазирования требует участия дополнительных факторов, помимо собственно узнавания последовательности ДНК нуклеосомными корами. Таким образом, требуется допустить наличие какого-либо иного сигнала на расположение нуклеосом и его изменения. Такими факторами могут быть специфические негистоновые белки или особенности (трансформгфуемые) структуры ДНК: модификация оснований (метилирование) или конформационные состояния структуры ДНК.

П. ЭНЗИМАТЖЕСКОЕ МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК ЭУКАРИОТ

Метилирование ДНК эукариотических клеток исследуется уже более 30 лет - впервые наличие 5-метилцитозина в ДНК многоклеточных было обнаружено в 1950 г. ( Тсуа-Ь-Ь, 1950). За эти десятилетия сформировались представления о высшей степени специфичности явления метилирования ДНК; видовой, онтогенетической, тканевой, клеточной и т.д. (см.обзоры Ванюшин, 1974; Ванюшин и Романов,1981). Уникальность этого явления заключается в том, что метилирование ДНК-единственный тип модификации ее первичной структуры, контролируемый геномом клетки. К настоящему времени накоплена огромная информация о механизмах модификации ДНК, неслучайном характере расположения метилированного цитозина по ДНК и геному, корреляциях уровня модификации с самыми разнообразными клеточными отправлениями: транскрипцией, репликацией, трансформацией клеток, клеточной патологией и т.д. Сформулировано немало гипотез о возможной роли метилирования ДНК в процессах активации генов, клеточной дифференцировки (Ванюшин,Романов, 1981; Тоз1 et а1., 1972$ НоШйау, 1980; НоШйау, Ри^Ь, 1975; 1975;

ЕагЛп, 1980 и т.д.). Однако, только с введением в эксперимент современных молекулярно-биологических методов исследования в последние 2-3 года впервые на уровне отдельного гена выявлена тесная соотнесенность характера метилирования последовательности ДНК и транскрипционной активности. Исследования в этой области переживают бурный подъем, в то время как многие другие аспекты метилирования ДНК остаются в тени, так что состояние проблемы в целом представляет пеструю картину, отдельные части которой несопоставимы. Многие ранее полученные экспериментальные данные требуют переисследования с привлечением современной методологии, многие проблемы - более глубокого анализа.

В связи с резко усилившимся в последнее время интересом к проблемам метилирования ДНК в литературе появилось много обзорных работ. В настоящем обзоре, не претендующем сколько-нибудь на полноту охвата материала, мы считали целесообразным остановиться, в основном,на проблемах, имеющих отношение к характеру метилирования ДНК эукариотических клеток, функциональным аспектам метилирования, описав некоторые общие принципы реакции метилирования ДНК только вкратце.

ПЛ. Общая схема метилирования ДНК эукариот

Известно, что метилирование цитозина в ДНК происходит на по-линуклеотидном уровне с помощью фермента ДНК-метилтрансферазы .(ДНК-метилазы). Фермент переносит метильную группу в 5-положение цитозина в ДНК, используя в качестве донора S -аденозилметионин (Gold, Hurwitz, 1963). Продуктами реакции является m 5С в ДНК и S -аденозилгомоцистеин, потенциальный ингибитор реакции метилирования. m С является, по-видимому единственным минорным основанием в ДНК животных. Ранние работы, определявшие в ДНК животных г*------ -----метилированные производные аденина (6-метиламинопурин - m °А) и другие производные цитозина, гуанина и аденина, в последующем не г нашли подтверждения. Однако присутствие иных модифицированных оснований в ДНК представителей других таксонов не исключено. Так, у насекомых (клетки культуры москитов) ДНК содержит m °С и m -------------' с в равных пропорциях (по 0,03 моль/О (Adams et al.,1979 m А обнаружен в специализированных клетках (пыльце) растений (Ванюшин и др.,1971; Бурьянов и др.,1972). Присутствие и6А в ДНК специализированных клеток предоставляет возможность для построения привлекательных гипотез, однако этот факт должен стать предметом тщательного анализа с привлечением современных методических подходов (в частности, рестрикционного анализа), так как незначительл ное обнаруживаемое количество т °А может быть следствием бактериального или грибкового загрязнения исследуемого материала. Особенно это может касаться культур клеток (см.выше), нередко зараженных микоплазмой. Разин и Разин ( Re.z±D.t Иаизл, 1980), проанализировав 5 видов микоплазм на содержание минорных оснований

ГУ в их ДНК, обнаружили, что все они содержат т А в количестве от 0,075 до 0,75 моль$. По расчету, даже при уровне заражения клеток микоплазмой ниже стандартной концентрации микоплазм в клетке (I ООО микоплазм на одну клетку) т ^А будет тестироваться достоверно - около 0,1 моль$. Г

Содержание т С в ДНК животных колеблется (у разных видов) в довольно небольшом интервале - 0,5-1,5 тль% в среднем, хотя у растений уровень метилирования цитозина в ДНК может быть существенно выше (Ванюшин,Белозерский,1959; Пахомова и др.,1968; Ванюшин и др.,1971; Дохием и др.,1978; ЕЬг1д.с11, 1981). Размах колебаний в содержании метилированного цитозина в ДНК разных видов растений также значительно больше (там же).

Мало вероятно, что большие различия в уровне метилирования ДНК у разных видов (в том числе у близкородственных видов) функциональны, вне зависимости от того, каков реальный смысл метилирования ДНК. По-видимому, эти различия отражают особенности организации генома, например, долю сателлитных ДНК, повторяющихся последовательностей и т.д., то есть в общем плане коррелируют с количеством потенциально метилируемых сайтов. с

П.2. Распределение ш С по геному

В ранних работах была выявлена неравномерность распределес ния ю С по отдельным фракциям генома. Так,Саломон и др. (Salomon et al.t 1969) обнаружили повышенное почти в три раза по сравнек ниго с тотальной ДНК содержание m С в AT-богатом сателлите ДНК 5 клеток мыши. Неслучайный характер распределения m ^С по геному выявляется при анализе фракций ДНК различной степени повторенно-сти. Для нескольких видов животных (рыбы,грызуны) показано сильное обогащение метилированным цитозином ДНК высокоповторягощихся последовательностей, в то время как уникальные последовательности ДНК содержат незначительное количество т5С (Кирьянов и др.,1974). Интересным, по крайней мере, в то время, было наблюдение об отсут- ? ствии корреляции между уровнем метилирования ДНК определенной фракч ции и ее нуклеотидным составом, так что представлялось возможным, ✓ что характер метилирования ДНК разной степени повторенности отражает какие-то тонкие особенности структурной организации ДНК, а не детерминирован нуклеотидным составом. Надо отметить, что представление о сайт-специфичности ДНК-метилаз в то время не было сформулщювано, как, впрочем, не является очевидным для эукарио-тических ДНК-метилаз и сегодня (см.ниже).

Повышенный уровень метилирования ДНК повторяющихся последовательностей был выявлен и на ряде других объектов: клетках китайского хомячка (Schneiderman, Billen, 1973), BHK-2I клетках С Browne et al.,1978), подтвержден для клеток мыши (Solage, Cedar ,1978), в клетках человека (Boebm, Drabovsky, 1979). Драховски и соавт. (Drahovsky et al., 1979; Boehm,Drahovsky, 1979a) обнаружили, что во фракции повторяющихся последовательностей еще в большей степени метилированы палиндромы. Сулимова и др. (1970) обнаружили резкие вариации в уровне метилирования ДНК отдельных фракций, выделенных из генома методом термического фракционирования, т.е. различающихся по ГЦ-содержанию. Интересно, что уровень метилирования ДНК этих фракций коррелировал с ГЦ-содержанием в них. Сопоставление этих данных с данными о значительных колебаниях уровня метилирования ДНК у разных видов растений делало сомнительной ранее предполагавшуюся возможность прямой корреляции между функциональным состоянием определенной последовательности ДНК и характером ее метилирования. Предполагаемая в то время сиг5 нальная информативность ш С в процессах транскрипции так^же, в свете данных этой работы,казалась маловероятной. Действительно, в отдельных фракциях ДНК был метилирован каждый второй-третий цитозин. К сожалению, в работе не представлены данные о длине с таких т С-обогащенных последовательностей ДНК и соотнесенности их с транскрипционноактивными или неактивными последовательностями. к

Анализ распределения т С по фракциям разной степени повто-ренности у ДНК растений противоречив: выявлены как значительные различия в уровнях метилирования цитозина по фракциям (например, в 10 раз в геноме хлопчатника (Оизезлоу et а1.,1975), так и более-менее равномерное распределение т ^С по геному (пшеница, Дрожденюк и др.,1977).

Информативность такого рода исследований снижается тем обстоятельством, что при этом не учитывается возможный неслучайный характер распределения сайтов для фермента - ДНК-метилазы. Конечно, сам факт неравномерного метилирования последовательностей ДНК разного типа внутри генома очень интересен и может интерпретироваться в рамках представлений о структурной роли или функциональной значимости т^С. Однако неизвестная степень скор-релированности содержания сайтов модификации и уровня их метилирования вряд ли позволяют придти к однозначным выводам. В последние годы появились методические возможности решения этой проблемы.

П.З. Метилируемые в ДНК животных последовательности

Уже довольно давно было установлено предпочтительное метилирование цитозина в ДНК животных в последовательности 5'-CG--3' ( Doskocil, Sonn, 1962; Grippo et al.,1968; Sneider, Potter, 1969).

При анализе ДНК тимуса теленка, клеток HeLa, морского ежа найдено, что более 90% всего т5С локализовано в этой последовательности ( Roy, Weistoach, 1975). Такая же последовательность, но, по-видимому, не исключительно, метилируется в ДНК растений (Кир-нос и др.,1981; Bönen et al.,1980; Sinsheimer, 1955). Сам сайт CG-чрезвычайно интересен тем, что у всех исследованных эукариот частота его встречаемости в ДНК значительно ниже, чем ожидается при случайном его распределении (Josse et al., 1961; Swartz et al.,

1962). Так, в ДНК человека ожидаемое содержание (доля) CG-сайта -0,04, а реальное - 0,008 (Bird, 1980). Причины такого дефицита CG-сайта неизвестны, хотя обращают на себя внимание данные о корреляции между высоким уровнем метилирования ДНК (в целом в геноме) и дефицитностью CG-динуклеотида (Rüssel et al., 1976) ДНК с "умеренным" уровнем метилирования характеризуются "умерен

Sharpg, 197 3)у ной" дефицитностью динуклеотида CG-¿Это дало основание авторам этих работ высказать предположение, что именно метилирование цитозина в данной последовательности является причиной дефицитности динуклеотида, возможно, за счет мутационной нестабильности такой метилированной последовательности. Экспериментально показано,что в ДНК Е. coli в "горячей" точке в lac-опероне наблюдается ано5 мально повышенная скорость мутационного превращения m С в Т (Coulondre, 1978). Берд (Bird, 1980) проанализировал возможность таких превращений в ДНК эукариот. Для этого он определил частоту встречаемости динуклеотида TpG- и комплементарного ему СрА (эти последовательности будут возникать при мутации С в Т в динуклеотиде CpG-) в ДНК разных видов животных. Частота встречаемости этих динуклеотидов, действительно, оказалась больше ожидаемого при случайном характере встречаемости в ДНК тех видов, где найдено повышенное содержание т°С и дефицит CG--динуклеотида. По-видимому, m ^С может быть нестабильным в эволюционном смысле. Кажется, однако, маловероятным, чтобы в этом, то есть в увеличении скорости мутирования, состояла сама функция метилирования. Берд полагает, что функция метилирования состоит в чем-то другом, важность которого для клетки превышает неудобства, причиняемые му-табильностью ( Bird, Taggart, 1980),

Таким образом, большая часть (если не весь) т^С локализована в ДНК клеток животных в динуклеотиде CG-. Неясно, однако, существенно ли для осуществления метилирования соседство с этим динуклеотидом оцределейного нуклеотида с 5'- и 3*-конца. Как известно, минимальным сайтом узнавания для бактериальных ДНК-мети-лаз является тетрануклеотид. Эукариотические ДНК-метилазы в этом плане изучены крайне недостаточно, к тому же большая часть работ выполнена довольно давно, когда методы определения сайтов узнавания были несовершенны. Для ДНК-метилазы из клеток гепатомы Новикова показано, что в условиях in vitro она метилирует все возможные сайты, содержащие CG-динуклеотид ( Sneider, 1972). Однако разнообразными, в том числе и прямыми методами,показано, что далеко не все CG-динуклеотиды в ДНК клеток эукариот метилированы. Доля метилированных CG-динуклеотидов в последние годы оценивается как в тотальной ДНК, так и в ДНК определенных генов (см. ниже), как правило, с помощью пары бактериальных ДНК-рестриктаз, одна из которых безразлична к метилированию цитозина в сайте, а другая не рестрицирует сайт, если цитозин в нем метилирован. Набор рестриктаз с разной сайтовой специфичностью, включающих CG-динуклеотид в сайт узнавания, позволяет количественно оценить долю метилированных CG-динуклеотидов. По данным, полученным таким образом, 50-80% динуклеотида CG- содержит m^C (Bird, 1980). Близкие данные получены и при использовании одной пары рестриктаз: НраП и Map I (сайты узнавания: Cm^CGG и CCGG, соответственно, sharp et а1.,1973ЬВ этой последовательности метилирован цитозин (внутренний) на 77% в ДНК печени мыши ( Waalwijk, pia-vell,i978; Singer et al., 1979).Принцип определения доли метилированного цитозина в этом методе состоит в сопоставлении средних размеров фрагментов ДНК после рестрикции той или иной рестрикта-зой из пары.

Более строгим методом Сидар и соавт. ( Cedar et al., 1979) определили долю метилированного цитозина в этой же последовательности в ДНК тимуса теленка. Для этого ДНК после рестрикции ферментом Mspi, который вносит разрыв между двумя цитозинами в сайте, радиоактивно метили ^?-АТР с помощью Т4-полинуклеотидкиназы, гидролизовали до дезоксинуклеозидмонофосфатов и разделясь ли СМР и т^СМР тонкослойной хроматографией с последующим определением радиоактивности. Этим методом установлено, что почти 90% внутреннего цитозина в последовательности CCSG метилировано.

В общем близкие средним для Нра II сайта данным по степени метилирования получены для сайта GC6C (рестриктаза Hhal?Roberts et al., 1980).Однако данных для обобщения, что пурин- и пирими-дин-фланкируемый CG-динуклеотид метилируется в ДНК всех животных равновероятно, пока мало. Ограничена пока информация о метилировании цитозина в других последовательностях, содержащих CpG-ди-нуклеотид. Интересно, что в ДНК эукариот не метилируется цитозин в последовательности GGCC, которая, в принципе может перекрываться с последовательностью GCGC, во всяком случае, может фланкироваться с 3-конца гуанином (по Steele, Rae,1980). При очень высоком уровне метилирования цитозина в последовательности CCGG в рДНК динофлагеллят,последовательность CTCG- не метилирована вовсе ( Steele, Rae, 1980).

Оставляя пока в стороне вопрос о причинах неполного метилирования цитозина в метилируемом в принципе сайте, можно сделать общее заключение, что вопрос о сайт-специфичности метилирования ДНК у эукариот нельзя считать решенным. В принципе, можно допустить как вырожденную сайтовую специфичность ДНК-метилаз эукариот, так и наличие множества ДНК-метилаз с определенной сайтовой специфичностью. В этой связи следует рассмотреть данные, полученные в последние годы, о некоторых принципах метилирования ДНК у эукариот.

П.4. Принципы метилирования ДНК у эукариот

Количественный расчет данных, приведенных в вышецитированной работе (Cedar et al.,1979), приводит к заключению, что метилирование ДНК симметрично, по крайней мере, по сайту CCSG, так что метилированный цитозин расположен в обеих нитях дуплекса ДНК с симметрией второго порядка. Еще более убедительные данные в пользу этого получены в работе Берда (Bird, 1978). Основываясь на том, что бактериальные рестриктазы не вносят разрыв в сайт узнавания, если одна из нитей в дуплексе метилирована, Бред исследовал с помощью этих рестриктаз гибридные молекулы, состоящие из нормально (in viv0) метилированной рДНК и (вторая нить) клонированного ее фрагмента (т.е.неметилированного). Ни одна из к m С"-зависимых рестриктаз не фрагментировала такой гибридной молекулы. С учетом ошибки метода измерения можно говорить о том, что не менее 98% всех m 5С-содержащих сайтов метилированы в рДНК в обеих нитях. В этой же работе показано, что при репликации ДНК (в культуре клеток ксенопуса) метилируется только дочерняя нить ДНК.

В сумме эти данные однозначно подтверждают полуконсервативный, "поддерживающий" характер метилирования ДНК, что, в принципе, подразумевалось и ранее, по аналогии с метилированием ДНК у бактерий, но прямо не было показано. Данные о симметричности расположения сайтов метилирования и "поддерживающий" характер метилирования ДНК аналогичны тому, что наблюдается у бактерий, и, в общем, подтверждают представления о сайт-специфичном характере узнавания ДНК метилазами. Однако из этих данных может быть сделан и обратный вывод. Так, Дедар и др. ( Cedar et al., 1979) допускают, что для эукариотической ДНК-метилазы сигналом для метилирования может быть не собственно узнаваемая последовательность, но наличие метилированного цитозина в родительской нити. Не исключая целиком такую возможность, следует отметить, что ситуация, по-видимому, значительно сложнее. В этой связи интересно 5 рассмотреть данные о распределении т^с по длине последовательности ДНК в геноме морского ежа ( Bird et al.,1979) и данные о метилировании гомологичных и гетерологичных ДНК ДНК-метилазами эукариотических клеток в опытах in vitro. 5

Берд и соавт. показали, что в геноме морского ежа ш С расположен кластировано. При рестрикции ДНК двумя CpG- -рестриктазами выявляются два класса фрагментов: короткие (100-4000 пар оснований) и длинные (более 15000 пар оснований). 90% всего га5С локализовано во фракции длинных фрагментов. Эти две фракции ДНК не отличались по кинетической сложности, т.е. содержали одинаковые наборы последовательностей разной степени повторенности, но плохо гибридизовались между собой (в особенности, уникальные последовательности двух фракций). Другими словами, две эти фракции предоставляют собой два разных набора последовательностей ДНК, одни из которых (в одном наборе) метилированы, а другие - практически нет. Таким образом, в геноме морского ежа существуют длинные последовательности ДНК, практически (или совершенно) не содержащие с и длинные сильно метилированные последовательности. Такой с характер распределения m "С по ДНК плохо согласуется с идеей сайт-специфичности действия ДНК-метилаз. Авторы предлагают вместо нее "трековую" специфичность метилирования. По предлагаемой схеме, в ДНК есть последовательность, связывающая ДНК-метилазу, от которой она начинает сканировать ДНК и метилировать все CpG- -сайты. Таким образом, сайт специфического узнавания и сайт метилирования, по этой концепции - разные последовательности. Нельзя исключить, конечно, возможности блокировки ряда сайтов метилирования для ДНК-метилазы, например, физически - конденсацией хроматина, при одновременном допущении временного разрыва между репликацией и метилированием.

Трековая" модель специфичности ДНК-метилазы не согласуется, однако, с наличием хотя и небольшого количества и С в компарт-менте неметилированных последовательностей. К тому же, характер распределения m ^с по геному морского ежа, по-видимому, является все-таки исключением, так как в большинстве других исследованных эукариот m ^с рассеян по геному.

Эден и др. так^же выявили кластерность расположения ^ С в средне-повторяющихся последовательностях ДНК цыпленка ( Eden et al., 1981).Метилированные CCGG -сайты в некоторых участках последовательностей этого класса сильно сблочены, так что может быть

100 метилированных сайтов подряд, не прерываемых неметилирован-ным сайтом. Б то же время локализация неметилированных сайтов в сходных последовательностях (повторах), по-видимому, одинакова, что не определяется соседней, фланкирующей, последовательностью, так как сами эти повторяющиеся последовательности расположены (интерспейсированы) в совершенно различном окружении. Авторы приходят к выводу, что единицей для узнавания и мишенью для метилирования является не целый повторяющийся элемент, как это предполагается в схеме Бёрда, но малая область в нем. Б конечном счете, такой единицей узнавания может быть и сайт типа бактериального.

Противоречат схеме Берда также и данные о метилировании ДНК в изолированных ядрах. Как уже говорилось выше, не весьСрСг-ди-нуклеид метилирован в ДНК эукариот. В ДНК морского ежа, например, неметилирован каждый второй цитозин в CpGr (Bird, 1979). В то же время, если принять предположение Берда о существовании определенной значащей последовательности, определяющей последующее сканирование ДНК-метилазой с метилированием всех сайтов, следует считать, что все возможные (узнаваемые данной метилазой) сайты уже метилированы in vivo. С другой стороны, во всех опытах с использованием ДНК-метилаз или неочищенных препаратов фермента в реакции метилирования выявляется способность их метилировать дополнительно гомолочную ДНК ( Drahovsky, Morris, 1971; Sneider et al., 1975;

Adams et al., 1979; Simon et al.,1978). Танака и соавт. исследовали характер метилирования ДНК в изолированных ядрах клеток морского ежа (где репликативный синтез ДНК не идет) ( Tanaka et al., 1980). Авторы показали, что при этом наблюдается дополнительное метилирование ДНК. При этом уровень метилирования ДНК in vitro коррелирует с изменением количества фермента в ядрах, но не с уровнем метилирования ДНК in vivo который не меняется на разных стадиях эмбриогенеза. Таким образом, характер метилирования ДНК определяется, по-видимому, не только специфичностью самого фермента (сайтовой или "трековой"), но и какими-то ограничениями на возможность метилирования, существующими при нормальном процессе метилирования ixi vivoJaKne ограничения могут определяться условиями функционирования фермента в ДНК-репликативном комплексе, а также особенностями структуры хроматина в репликативной вилке и при выходе из нее.

Нельзя, однако, исключить и то, что специфичность действия фермента в опытах in vitro извращается. Кроме того, не исключено, что в таких опытах выявляется какая-то иная ДНК-метилазная активность. В этой связи надо обратить внимание на то, что при Яг., ' реакциях метилирования in vitro метилируется митозин в полностью неметилированном сайте (так как полуметилированные сайты отсутствуют). Это в принципе отличается от полуконсервативного, "поддерживающего" типа метилирования, наблюдающегося in vivo . Действительно, показано, что лучшим для ДНК-метилаз эукариотичес-кого происхождения являются бактериальные ДНК (с большим количеством CpG- -сайтов, так--же полностью неметилированных)(Кирьянов и др•, 1971; Burden, Douglas, 1974; Adama, Hogarth, 1973; Tosi,Searano, 1973;Adama, 1973; Gerari et al., 1974; Сох et al., 1977).

Во всех случаях эукариотические ДНК-метилазы в изолированных ядрах метилируют гомологичную ДНК. Для бактериальных ДНК-метилаз показано, что они метилируют полуметилированную ДНК преимущественно, по крайней мере, для одной из ДНК-метилаз показано, что она метилирует такую ДНК в 100 раз быстрее, чем неметилировэнную, в полном согласии с принципом"поддерживающего"метшшровшия( Vovis et al., 1974).Некоторые из исследованных эукариотических ДНК-метилаз, так'же, по крайней мере, частично, обладают свойством поддерживающей" ДНК-метилазы. Так, метилаза из ядер эритролейке-мических клеток метилирует полуметилированную ДНК в несколько раз более эффективно, чем метилированную ( Creusot, Christman, 1981).

Наличие отличного от "поддерживающего" метилирования - "инициирующего" - может быть связано с присутствием в клетке двух типов фермента - "поддерживающего" и "инициирующего". Однако показано, что один и тот же фермент - ДНК-метилаза из клеток асцита Кребса мыши может модифицировать как "полностью" метилированную in vivo днк, так и полуметилированную (полученную при репаратив-ном синтезе после ник-трансляции (Adams et al., 1979).

Инициирующее метилирование можно было бы отнести к артефакт-ному изменению специфичности ДНК-метилазы, работающей в условиях опыта in vitro. Однако недавно Драховски и др. (Drahovsky et al., л .

1980, 1981) показали, что в клеточных гибридах наблюдается повышенный уровень метилирования ДНК. По расчету, уровень метилирования, достигаемый при этом, соответствует полному метилированию всех CpG--сайтов, в то время как исходно в этих клетках было метилировано не более 65% CpG--динуклеотидов.Таким образом, инициирующее метилирование может реально происходить и в клетках in vivo (см.также главу 5 диссертации).

Причина наблюдающегося суперметилирования ДНК неясна, хотя -можно допустить, что при этом наблюдается аддитивное действие двух (или более) ДНК-метилаз с разной сайт-специфичностью.

Суммируя обсуждаемые данные, можно заключить, что процесс метилирования ДНК в эукариотической клетке высокоспецифичен. Он может включать в себя как сайт-специфичность ДНК-метилаз, так и участие ряда факторов, одни из которых могут блокировать метилирование некоторых сайтов или последовательностей ДНК, другие, наоборот, экспонировать их для метилирования. Эта сложная система регуляции может, с одной стороны, обеспечивать константность характера метилирования ДНК (в целом, у данного вида), а с дру- < гой лабильность и изменчивость картины метилирования ДНК опреде- ^ ленных клеток и генов в соответствии с их функциональным состоя- ) нием. Последнее ярко проявляется при изучении клеточной и ткане- \ вой специфичности метилирования ДНК.

П.5. Клеточная и тканевая разнокачественность метилирования ДНК

Ранние работы выявили немало примеров тканевой (органной) изменчивости характера метилирования ДНК (точнее, уровня метилирования). Показано, что уровень метилирования ДНК изменяется в отдельных тканях и органах в онтогенезе, при клеточных патологиях, в связи с онкогенезом и вирусными инфекциями. Эти результаты изложены в ряде обзоров (Ванюшин,1974; Романов и Ванюшин,1981). В настоящем обзоре мы остановимся, в основном, на данных последних работ, выполненных с привлечением новой методологии, а также работ, исследующих характер метилирования определенных последовательностей ДНК: вирусов эукариот и отдельных генов.

Одним из первых указаний на возможную важную функциональную роль метилирования ДНК эукариот были данные, полученные в лаборатории Б.Ф.Ванюшина о выраженной тканевой специфичности метилирования ДНК, точнее, о различии в уровне метилирования ДНК в разных тканях одного организма. Колебания в уровне метилирования были сопоставлены с функциональными характеристиками тканей, из чего следовало, что уровень метилирования ДНК коррелирует, в частности, с транскрипционной активностью ткани в целом (см.обзоры Занюшин,1974; Ванюшин и Романов,1981). Отдельные факты не подтвердились при использовании более тонких методов анализа уровня метилирования, хотя в целом концепция, развитая Б. Ф.Ванюшиным, нашла подтверждение в работах нового этапа.

Так, одно раннее наблюдение о недометилированности ДНК половых клеток по сравнению с соматическими клетками (Ванюшин и др., 1970), которое позволяло сопоставлять специфичность метилирования и процессы дифференцировки, недавно было переисследовано с использованием Нра И-рестриктазы и ее изошизомера - Msp I ( Kaput, Sneider, 1979). Сканограммы фрагментов ДНК, полученные после рестрикции, не отличались для тотальной ДНК разных соматических клеток, но картина распределения рестриктов ДНК спермы (быка) была качественно отличной, что свидетельствовало о недометилированности ДНК этих клеток. Анализ картин рестрикции ре-натурированных повторяющихся последовательностей ДНК спермы, кроме того, позволил авторам предположить существование в ней полуметилированных сайтов. Теоретически, если эти полуметилированные сайты, возникают в премейотической S-фазе, они могут превратиться в полностью неметилированные в ходе последующего кроссин-говера и репаративного синтеза. В конечном счете, следствием этого может быть возникновение асимметричности (по характеру метилирования) гамет, что уже, по мнению авторов, не может не сказаться при последующей дифференцировке. В качестве одной из возможностей реализации асимметрии гамет авторы предусматривают рестрикцию ДНК по полностью неметилировэнному сайту собственной клеточной рестриктазой. Вряд ли можно согласиться с такой драматизацией событий. Действительно, в литературе появилось несколько работ о выявлении нуклеаз с некоторыми свойствами рестрици-рующих ферментов у эукариот. Однако один из фактов касается одноклеточного хламидоманады ( Burton et al., 1979; Royer,

Sager, 1979) в другом случае не была показана сайт-специфичность фермента, и работа в последствии не подтверждена ( Cato, Burdon, 1979 ). Кроме того, из обсуждаемых ранее нами работ следует, что в геноме эукариот огромное количество сайтов, в принципе метилируемых в данной клетке, представлено неметилиро-ванными - до 50 % всех сайтов метилирования не содержит т^С и, таким образом, подлежит рестрикции.

Существенно однако, что данные этой работы, использующей принципиально иные методические подходы, нежели предсшествующие, подтверждают представления о различии в характере метилирования тотальной ДНК в разных клетках. Б целом же, тотальная ДНК как объект исследования клеточной или тканевой разнокачественности метилирования вряд ли информативна. Используя СрС--рестриктазы для количественной оценки различий в уровне метилирования тех или иных сайтов, Квинт и Цедар ( Quint, Cedar, 1980) не обнаружили значительных колебаний в уровне метилирования тотальной ДНК разных тканей рыбы (форель). Различия при этом не превышали 10$. Однако ДНК мозга и при данном методе анализа отличалась по уровню метилирования достаточно сильно (30% отклонения от среднего для разных тканей). Тканевые и возрастные различия в уровне^7 метилирования ДНК двух видов животных проанализировал Сингер с соавт. ( Singer et al,,1979).На фоне больших различий в метили-< ровании двух сайтов (GCGC и CC6G) между видами существенных тк^ невых различий уровня метилирования этих сайтов в тотальной ДНК^ не выявлено. В разных тканях мыши и кролика метилировано 70-80% ^ всех CGCG-сайтов. В тканях мыши метилировано так же 75-85% CCGG-сайтов, в то время как в ДНК кролика 45-55%. Различия в уровне метилирования ДНК в разных тканях не превышали 5-10%. Не выявлено больших, чем указано выше, различий и в уровне метилирования суммарной ДНК эмбрионов мыши на разных (начиная с 2-4-клеточного зародыша) стадиях развития.

Ранние работы указывали на значительные колебания уровня метилирования ДНК в раннем эмбриогенезе (Grippo et al., 1968), Комб и соавт. (Comb et al.,1968) показали, что на ранних стадиях эмбрионального развития ДНК морского ежа совершенно не метилируется.

Эти интригующие данные были переисследованы в дальнейшем неоднократно. Интерес к этому объекту понятен, так как в раннем эмбриогенезе морского ежа синхронность делений в течение довольно длительного времени при дроблении сочетается с четкой стадийностью дифференцировочных процессов в дальнейшем. Детально проанализировав метилирование ДНК на 7 различных стадиях развития, Поллок и соавт. (Pollock et al.,1978) не выявили значительных колебаний в уровне метилирования суммарной ДНК. Эти данные были в дальнейшем подтверждены на другом виде морского ежа ( Ваиг et al.,1979). Противоречивость данных, на наш взгляд, определяется различиями в методических подходах. Комб и соавт. (Comb et al., 1968) и Адаме с соавт. ( Adams, 1973) определяли нуклеотидный состав вновь образованной ДНК (конечно, после завершения нескольких циклов репликации) по радиоактивной метке из метионина, который использовался в качестве донора метилъных групп. Естественно, что утилизация метильной группы метионина сильно опосредована факторами метаболизма его в эмбрионе: пулом в клетках, проницаемостью мембран, активностью активирующих метионин ферментных систем, наконец пулом s -аденозилметионина. Все это делает использование метионина не вполне корректным в данной модели. В то же время прямое определение нуклеотидного состава ДНК эмбрионов, по крайней мере, на самых ранних стадиях, также может быть не вполне корректным. Действительно, яйцеклетка морского ежа содержит большое количество цитоплазматической ДНК, которая не синтезируется в эмбрионе и постепенно "разводится" при дроблении. Изменение соотношений цитоплазматической ДНК и ядерной могло бы маскировать возможные изменения уровня метилирования ядерной ДНК. Однако, по нашим данным, уровень метилирования ядерной ДНК морского ежа, оцениваемый по соотношению m ^С/С по радиоактивности в ДНК после включения "^С-дезоксицитидина, не меняется в ходе эмбриогенеза. При использовании набора CpG- -рестриктаз Берд показал, что ни уровень метилирования ДНК морского ежа в раннем эмбриогенезе ни характер его (сохранение компартментализации неметилированных и метилированных блоков - см.выше) не меняется ( Bird, 1979).

В свете данных работ последних лет об изменении уровня и характера метилирования ДНК отдельных генов при их экспрессии (см.далее), рестрикционный анализ представляется идеальным методом изучения метилирования ДНК. При этом ясно однако, что этот метод может быть малоинформативным при исследовании тотальных ДНК. Так, например, при анализе уровня и характера метилирования суммарной ДНК клеток двух линий тератокарцином было обнаружено, что в линии, в которой происходит инактивация одной из двух X-зфомосом, наблюдается небольшое, но вполне достоверное повышение уровня метилирования ДНК. Доля метилированного цитозина возрастает в суммарной ДНК от 2.73+0,26 ДО 3,32+0,26 ( Singer et al., 1980). Однако различий в картинах рестрикции при этом не наблюдается. В принципе, это может объясняться равновероятным повышением уровня метилирования большого набора разных CpG--сайтов.

Таким образом, ранние работы, а также позднейшие переисследования уровня и характера метилирования тотальной ДНК клеток выявляют клеточную специфичность в ряде случаев, но, в целом, очевидна необходимость исследования определенных последовательностей ДНК. При исследовании коррелятивных соотношений между характером экспрессии генов и метилирования ДНК. эта необходимость определяется самим характером изучаемых моделей. Так, например, генная индукция, в том числе и гормональная, скорее всего, не сопровождается изменениями, затрагивающими значительную долю генома.

П.6. Исследование характера метилирования отдельных генов

П.6.1. Влияние 5-аза-цитозина на метилирование ДНК и экспрессию генома

Интерес к исследованию характера метилирования отдельных генов в связи с их функциональным состоянием во многом индуцирован работами Джонс,Тейлор и соавт. ( Constantinides et al., 1977), обнаружившими поразительный эффект действия аналога цитозина 5- ^ аза-цитозина (аза-С) на клетки культуры. Инкубируя эмбриональные > клетки мыши в культуре в присутствии аза-С в различных дозах,авторы наблюдали появление функционально различимых мышечных клеток ( Constantinides et al.,1979). Позднее на эмбриональных клетках мыши линии 10 Т^/2 и клетках линии ЗТЗ было показано,что после инкубации с аналогом цитозина наблюдаются и другие типы дифференцировки: появление хондроцитов и адипоцитов (костных и жировых клеток) ( Taylor, Jones, 1979).

Причин наблюдаемых дифференцировочных изменений может быть много, в частности, селекция предсуществующих клеток с заданным типом дифференцировки или извращение метаболизма клеток, например, на уровне синтеза бежа. Ранее было показано, что 5-аза-цитозин включается в РНК, в том числе и в мРНК (Yurovic et al., 1965). 7

Однако авторы показали, что только инкуаацш клеток с aJ логом цитозина во время s -фазы вызывает последующие дифферен-цировочные проявления. Более того, сам эффект наблюдается не сразу после инкубации с аза-С, но отдален от момента инкубации несколькими клеточными циклами (Constantinides et al., 1979)0нкоген-но трансформированные клетки также оказались способными экс-прессировать фенотип типа миобластного. Индуцированная таким образом дифференцировка оказывалась стабильной, так что сохранялась при клонировании трансформированных с помощью аза-С клеток.

Таким образом, однократное введение в клетку аза-С во время s -фазы индуцирует в ней четко выраженные дифференцировочные изменения. Авторы предположили, что мишенью изменений при этом является ДНК, т.е. что включение 5-аза-цитозина в ДНК собственно и является причиной наблюдаемого феномена ( Taylor,, Jones, 1979). В дальнейшем авторы прямо показали факт включения аза-С в ДНК и при этом выявили падение уровня метилирования ДНК ( Jones, Taylor, 1980).

Уровень метилирования суммарной ДНК клеток снижался скорре-лированно с дозой аза-С (до определенного предела), так что максимальное снижение уровня метилирования ДНК составляло около 50%. При этом более эффективным оказывался 5-аза-дезоксицитозин, дру-^7 гие аналоги цитозина с заменой в 5-том положении также были эффективными ингибиторами метилирования ДНК in vivo и индуцировали дифференцировочные изменения: 5-аза-2-дезоксицитидин, псевдо-изоцитидин, 5-фтор-2-дезокси^итидин ( Jones, Taylor, 1980). Показательно, что недометилированность ДНК сохранялась затем в ряду клеточных поколений, что проявлялось через 2 цикла репликации ДНК (после сформирования полностью неметилированных сайтов) по изменению картины рестрикционного анализа (рестриктаза НраП). Частота превращения клеток в дифференцирующиеся ("трансформация") в определенных интервалах доз ингибитора коррелировала со снижением уровня метилирования суммарной ДНК.

Интересны данные детализованного изучения включения 5-аза-цитозина в ДНК и падения уровня метилирования ( Jones, Taylor, 1981). Используя 5" -бром-дезоксиуридин для отделения гибридных молекул ДНК (родительская нить и дочерняя, вновь синтезированная в присутствии аза-С),авторы показали реальное включение аза-С в ДНК при репликации и уменьшение уровня метилирования в дочерней нити ДНК. При увеличении дозы аза-С (0,2 мкМ, 3 мкМ, 10 мкМ) уровень метилирования дочерней нити ДНК уменьшался от 3,36 до 2,36, 2,08 и 1,7 (т^С/С + т^С), соответственно. Интересно при этом, что замена Ь% цитозина на его аналог в ДНК снижает уровень ее метилирования вдвое. Таким образом, падение уровня метилирования определяется не только прямой невозможностью модификации 5-аза-производного цитозина в ДНК. Действительно, ДНК, выделенная из клеток, культивируемых в присутствии 5-аза-цитозина,служит хорошим акцептором метильных групп при реакции метилирования in vitro , намного более эффективным, чем ДНК исходных клеток ( Jones, Taylor, ^981 ). С другой стороны, акцепторная способность 5-аза-цитозин-содержащей ДНК в реакции метилирования in vitro падает с увеличением содержания в ней аналога. Так, при замене Ъ% цитозина на азапроизводное акцепторная способность (уровень метилирования ДНК in vitro) падает более чем на 85$. Фридман ( Friedman, 1981) показал, что бактериальная ДНК ( E.coli KI2), в которой при репликации Q% цитозина замещено на азапроизводное, не может служить субстратом для цитозиновых ДНК-метилаз in vitro. При этом выявлено, что ДНК-метилаза образует в сайтах, содержащих 5-аза-цитозин,суперстабильный неактивный комплекс, т.е. необратимо связывается с ДНК.

По-видимому, в клетках in vivo реализуются оба эти механизма: невозможность замены аза-группы цитозина в 5-ом положении на метильную и выведение ДНК-метилазы из работы прямым "арестом" фермента в 5-аза-цитозин-содержащих сайтах, что и приводит к некоррелированному с содержанием 5-аза-цитозина в ДНК падению уровня метилирования.

Таким образом, впервые прямо показана корреляция между диф-ференцировочными изменениями клеток и изменением характера метилирования их ДНК. Побочные эффекты 5-аза-цитозина, по-видимому, можно исключить. Упоминавшийся вше факт включения аза-С в мРНК вряд ли может определять какие-либо дифференцировочные изменения. Во-первых, включение аза-С в РНК имеет следствием ингибиро-вание ее матричной активности ( Yurovic et al. ,1965).Главное же состоит в том, что дифференцировочные изменения фенотипа наблюдаются через 8-II клеточных делений после однократного введения 5-аза-цитозина в ДНК ( Jones, Taylor,1980). Таким образом, именно уменьшение метилированности ДНК является основой индукции клеток к дифференцировке. Интригующим, однако, остается, по крайней мере, один вопрос. Почему при тотальном падении уровня метилирования ДНК во всем геноме (до 50$) реализуется ограниченное число направлений дифференцировки? Прогрессирующее падение уровня метилирования ДНК в клетках лишь увеличивает частоту возникновения двух-трех фенотипов. Более того, возможно, что в обоих типах клеток индуцируется не 2-3, а один тип дифференцировки. Действительно, для этих линий клеток показана способность клеток к спонтанному превращению в адипоциты ( Green, Kehind, 1974), а возможно, и к селекции при изменениях культуральных условий.

Превращение клеток обеих изученных линий в хондроциты наблюдается с малой частотой и нерегулярно ( Taylor, Jones, 1979)e Собственно, только возникновение миобластоподобного фенотипа характеризуется четкой дозовой зависимостью от 5-аза-цитозина и наблюдается с высокой частотой и константно.

Следует, по-видимому, признать отсутствие прямой связи между характером метилирования (вернее,изменением характера метилирования ДНК) и фенотипическим ответом. Причинно-следственная связь при этом может быть сложной, так что изменения метилирования ДНК только реализуют возможность экспрессии определенных генов, но не определяют селекцию индуцируемых последовательностей. Другими словами, изменение метилирования ДНК (в данном случае,уменьшение) может быть механизмом реализации генной активности, но не собственно механизмом генной индукции.

Есть еще один яркий пример корреляции между уровнем метилирования суммарной ДНК клетки и дифференцировочной направленностью. Так,-Кристиан и соавт. (Christman et al»,1977) показали, что эритролейкемические клетки Фрейда в культуре могут быть индуцированы в эритроидном направлении с помощью этионина. В этом случае также выявляется обратная корреляция между уровнем метилирования суммарной ДНК и экспрессией глобинового гена. Этионин реально снижает уровень метилирования суммарной ДНК. Это следует из прямого определения и из факта, что ДНК из этионин-обработанных клеток является значительно лучшим акцептором метильных групп при метилировании in vitro . чем ДНК из контрольных клеток ( Christman et al.f 1977; Sneider et al» ,1975).Однако и в этом случае обращает на себя внимание несоответствие между глобальностью эффекта и индукцией одного гена (или ограниченного их числа). Кроме того, известно, что этионин таким же образом действует на ДНК и в других клетках, например, он сильно снижает уровень метилирования ДНК печени, являясь, может быть именно по этой причине, гепатоканцерогеном. Но синтез глобина в печеночных клетках при такой индукции не проявляется ( Hancock et al., 1976)., Это еще раз подтверждает v необходимость некоего механизма селекции генов при их активации, которая, возможно, включает в себя (в последующих стадиях) изменение характера метилирования гена.

Дополнительная, большая информация о корреляции между генной активностью и характером метилирования ДНК получена при изучении отдельных генов или их групп.

П.6.2. Характер метилирования экспрессируемых последовательностей ДНК

В предыдущих работах, где выявлена корреляция между уровнем метилирования суммарной ДНК и способностью определенных генов к экспрессии, не было данных о состоянии метилирования собственно экспрессируемой последовательности.

Наиболее ранние и четкие данные о характере метилирования экспрессируемой последовательности получены в экспериментах на системе вирус-клетка (Desrosiers et al., 1979; Sutter, Doerfler, 1980; Cohen, 1980).

Саттер и Дерфлер выявили наличие обратной корреляции между уровнем метилирования ДНК аденовируса типа 12 и экспрессией вирусных генов.

Коэн показал, что геном провируса рака молочной железы мышей (невстроенный в геном клетки хозяина) метилирован и не транскрибируется. Встраивание его в геном сопровождается экспрессией, причем такая ДНК неметилирована ( Cohen, 1980).

Вардимон и др. (Vardimon et al,,1980,1981 ) исследовали состояние отдельных последовательностей аденовируса типа 2, введенного в клетки 5 различных линий китайского хомячка. В трех из этих линий присутствовал Eco RI -фрагмент ДНК аденовируса, соответствующий гену одного из ДНК-связывающих белков. Только в одной из этих трех линий обнаружена мРНК этого белка и сам белок. CCGG-сайты в ДНК этого фрагмента в экспрессирующих клетках оказались полностью неметилировэнными, но были полностью метилированы в двух других клеточных линиях, не обнаруживающих экспрессии.

Фрагмент ДНК аденовируса типа 2, соответствующий этому гену ДНК-связывающего белка, полученный с помощью рестриктазы Hind Ш, был испытан на возможность экспрессии в системах транскрипции in vitro. Метилирование ДНК этого гена метилазойНраД (сайт CCGG^ резко ограничивает возможность его транскрипции в ооцитах ксенопуса или в сопряженной РНК-полимеразной системе ( Vardimon, Doerfler, 1980).

Desrosiers и соавт. исследовали характер метилирования ДНК вируса герпеса в опухолевых клетках кролика. Трансформированные вирусом герпеса клетки содержат множественные копии вирусного генома. L -ДНК этого вируса (уникальные последовательности) в сильной степени метилирована по CpG~динуклеотиду в зрелом вирусе. Н-ДНК (повторяющиеся последовательности) оказалась немети-лированной или сильно недометилированной по этому же сайту в клетках с активной продукцией инфекционного вируса (Desrosiers et al., 1979). Ингибиторы метилирования ДНК и индукторы вирусной репликации действовали однонаправленно. Таким образом, и в этом случае показано, что метилирование вовлечено в процессы экспрессии и размножения вируса. Интересно, что в ъ-ДНК, где метилирование сильно выражено (более 90-95% CpG--сайтов метилировано), расположение неметилированных сайтов одинаково в ДНК вируса во всех клеточных линиях, т.е. консервативно ( Desrosiers et al., 1979) ДНК самого аденовируса типа 12 практически неметилирована (0,06 шль% m ( Auer,I979), но сильно метилируется, будучи интегрированной в геном клеток китайского хомячка. Участки вирусной' интегрированной ДНК, соответствующие транскрибирующимся в двух клеточных линиях ранним генамвируса, однако, неметилиро-ваны, или сильно недометилированы, в то время как поздние гены полностью метилированы и не экспрессируются. Напротив, в двух линиях клеток опухоли мозга крыс, где поздние гены аденовируса транскрибируются, ДНК этих последовательностей неметилирована (Desrosiers, 1982).

Несколько работ выполнено на интересной модели трансформации эукариотических клеток, дефектных по гену тимидинкиназы (ТК~-клетки) ТК -геном из различных источников. Виглер и соавт. ( Vigler et al.,1981) показали, что клонированный ТК-ген цыпленка и клонированный ТК-ген вируса герпеса, метилированные in vitro Нра П-метилазой включаются в клетки с одинаковой частотой, но частота трансформации (ТК+-фенотип) при использовании метилированных ДНК существенно ниже. Поллак и соавт.( Pollack et al.,1980) показали, что введенный в ТК"~-клетки мыши ТК-ген в 90% клонов неметилирован. В тех случаях, когда метилированная ДНК ТК-генов все же обнаруживается в клетках, неизвестно, метилированные ли ТК-гены экспрессируются. Корреляция между метилированием ТК-генов, вносимых в клетки мыши вирусом герпеса и блокированием экспрессии показана в работе ( pellicer et al.,1980).B единственном клоне, где не было экспрессии, ТК-ген был метилирован.

Все данные, полученные при исследовании характера метилирования вирусных ДНК в клетке, отдельных вирусных и эукариотических последовательностей, интегрированных в геном эукариотической клетки однозначно показывают наличие довольно строгой обратной корреляции между метилированием определенной последовательности и возможности ее экспрессии. Исследования на интродуцируемых генах дали так же интересную информацию о некоторых механизмах, определяющих или поддерживающих тот или иной характер метилирования ДНК, что мы обсудим далее.

Какова же ситуация с метилированием экспрессируемых и не-экспрессируемых последовательностей собственно в геноме эукариотической клетки? Наиболее подробно и детально исследован в этой связи характер метилирования рибосомальных генов.

П.6.3. Метилирование ДНК рибосомальных генов

Четкие данные об обратной корреляции между уровнем метилирования рДНК и транскрипционной активностью получены при исследовании ДНК миксомицета РЬуэагит ро1усерЬа1-шп(Еех11у et а1.,1980.) Миксомицет содержит активно транскрибируемую экстрахромосомаль-ную рДНК. В отличие от хромосомной рДНК, которая не вся транскрибируется, внехромосомная рДНК полностью неметилирована по сайту СССЗС-. Хромосомная рДНК в этом сайте метилирована.

Такую же обратную корреляцию выявили Миллер с соавт. ( ТаЕгЪгалгаЬа et а1., 1981 ) на другой модели. В одной из линий клеток гепатомы крыс (НА-11 Е-СЗ) наблюдается значительная (10-ти кратная) амплификация рДНК, ассоциированной с хромосомой. Эта ДНК высокометилирована по тесту на связывание антител к 5-метилцитозину и рестрикционному анализу, и большинство из этих амплифицированных генов транскрипционно неактивно. Детальный анализ показал, что только транскрипционно неактивная рДНК высоко-метилированна, так что большая часть СС(5£ и 060(2- сайтов метилирована. Это относится и к непосредственно кодирующим участкам генов внутри Блока последовательностей ДНК, кодщ>ующих 18 и 28s рРНК ( Tantravahi et al., 1981).

Ситуация, однако, более сложна, нежели прямая корреляция между степенью недометилированности ДНК и ее способностью к экспрессии, так как уровень метилирования ДНК, в том числе и рДНК определяется так же общим характером (типом) метилирования генома. Берд выделил три типа метилирования суммарной ДНК у животных. 1-ая группа, включающая в себя насекомых и ракообразных (исследовано 2 вида дрозофил, 2 других вида мух, комар и I вид ракообразных), практически или полностью не содержит m 5С в CpG-динуклеотиде. В соответствии с этим рДНК животных этой группы так же неметилирована (полностью или практически полностью по этому сайту). Вторая группа - иглокожие (4 вида морских ежей, моллюски - I вид и I вид морских анемон), как выше указывалось, содержат два физически разделенных блока-компартмента метилированных и неметилированных последовательностей. Все рДНК относятся к компартменту неметилированных последовательностей.

В третьей группе - позвоночные (лягушки - ксенопус, рыбы, млекопитающие) характер метилирования суммарной ДНК более сложен, а общий уровень метилирования CpG- -сайтов выше. ДНК рибосомных генов в этой группе может быть как неыетилированой, так и метилированной в высокой степени, например, большая часть рДНК у ксенопуса и костистых рыб ( Bird et al.,1981; Bird, Taggart, 1980).

На первый взгляд, такой сложный, эволюционно определяемый характер метилирования генома в ряду таксонов, делает наличие обратной корреляции между степенью метилирования ДНК отдельных генов, в том числе и рДНК, выявленный у млекопитающих, скорее исключением, нежели общим правилом. Однако, надо отметить, некоторые обстоятельства. Во-первых, в геномах, метилированных по типу иглокожих, все исследованные активные в транскрипции гены (гистоновые, гены актина, 5s РНК, рибосомальные гены) локализуются в компартменте неметилированных последовательностей ( Bird et al.,1979). Во-вторых, рДНК в третьей группе недометилирована по сравнению с тотальной ДНК ( Bird,Taggart, 1980). В-третьих, даже в тех случаях, когда рДНК сильно метилирована (ксенопус и костистые рыбы), имеются отдельные неметилированные сайты внутри транскрибируемых последовательностей и в нетранскрибируемом спенсере ( Bird, Southern, 1978).

Таким образом, можно допустить, что деметилирование цитози-на, т.е. недометилированность ДНК, возможно даже в незначительной степени, является необходимой для транскрипции.

Более детальный последующий анализ подтверждает это предположение. Так, при исследовании характера метилирования рДНК мыши, Берд и соавт. ( Bird et al.,1981) показали, что в геноме есть блоки метилированных ( т^С+) и неметилированных (т^С") рДНК. Такой характер сблоченности характерен для всех тканей крысы и с мыши. В то же время, только т°С рДНК транскрипционно активна. В геномах амфибий и костистых рыб, где все рДНК метилированы в сильной степени, разные ткани отличаются уровнем метилирования нетранскрибируемых спейсеров, причем, в клетках, где синтез рРНК не идет (спермии), спейсерная рДНК, по-видимому, полностью метилирована.

Таким образом, общим правилом, по-видимому, является блокировка возможности транскрипции полным метилированием (CpG--сайтов) ДНК всего гена, или только его транскрибирующейся части. С с; другой стороны, отсутствие m С в соответствующем участке определяет возможность транскрипции гена, но не является собственно запускающим транскрипцию механизмом.

Б этой связи, виды животных первого типа метилирования, с где отсутствует т^С в CpG- -динуклеотиде, можно было бы рассматривать как геномы со снятым контролем за экспрессией со стороны гу^тилированш ДНК. Действительно, во всех клетках и для всех генов у этих видов (например, дрозофила) нет этого дополнительного ограничения транскрипции (Rae, Steele, 1979). Однако, интересно, что этот механизм регуляции все таки не утрачен нацело. Так, m С, невыявляемый прямым методом анализа и по рестрикционному анализу в диплоидных клетках, по-видимому, присутствует в ДНК политенных хромосом. Показано, что CGC6 и CCGG-сайты в ДНК полиГ тенных хромосом сильно метилированны по сравнению с ДНК диплоидных клеток, что можно рассматривать как механизм локальной инактивации генов в политенных хромосомах ( Eastman et al., 1980).

П.6.4. Метилирование индивидуальных эукариотических генов

Данных о характере метилирования индивидуальных генов вообще и в связи с экспрессией, в частности, пока немного. Впервые исследована тканевая специфичность метилирования yi-глобинового гена кролика ( Waalwiök,Plaveil, 1978). Авторы показали действительно разный характер метилирования этого гена в разных тканях, используя клонированную последовательность^^глобинового гена для выявления рестриктов после фрагментации ДНК CCGG- рестрикта-зами. По крайней мере, один из сайтов в большом интроне ß -гло-бинового гена был полностью метилирован в ДНК сперматозоидов, с 80%-ной частотой в ДНК клеток мозга и не метилирован в ДНК эритроидных клеток. тем же методом МакГи и Гиндер исследовали характер метилирования ß -глобинового гена цыпленка ( Мс Ghee, Ginder, 1979). Нра II-рестриктаза фрагментировала ДНК зрелых эритроцитов до фрагментов в 1,3 и 4,2 тысяч пар оснований, что таким образом, соответствовало расстоянию между двумя неметилированными CCGG-сайтами. Однако ,Мзррестриктаза фрагментирует ДНК этого гена в эритроцитах на меньшие фрагменты. Количественный расчет соответствует отсутствию m ^С на границах 1,3 т парного фрагмента в 90% случаев. По крайней мере два других CC6G- сайта в гене ß-глоби-на в зрелых эритроцитах метилированы полностью. Картина рестрк-ции j3-глобинового гена зрелых эритроцитов отличалась от таковой в клетках яйцевода и мозга, где количество метилированных сайтов было больше. Принципиально важны два факта. Во-первых, характер метилирования ß-глобинового гена в зрелых эритроцитах и ретику-лоцитах не различался, хотя как сказано выше, отличался от характера метилирования ß-глобинового гена в мозге и яйцеводе. Во-вторых, характер метилирования этого гена в зрелых эритроцитах эмбриона цыпленка, где синтез глобина "взрослого" типа не идет, не отличался от характера метилирования гена в яйцеводе и мозге.

Таким образом, недометилированность ДНК активного р -глобинового гена реально отличает его от ДНК тех тканей (клеток), где синтез глобина не происходит. Однако, эта недометилированность не исчезает и после выключения синтеза глобина (в зрелых эритроцитах). Это вновь подтверждает ограниченность функции не-дометилированности гена, как условия "разрешающего" транскрипцию, но не определяющего ее прямо.

Близкие данные получены при исследовании характера метилирования гена овальбумина и кональбумина цыпленка ( Kuo et al., 1979; Mandel, Chambon, 1979). Тестом на активность соответствующих генов была в данном случае ДНКазо-1-чувствительность их хроматина.

Недавно, Вайнтрауб и соавт. ( №е:т1;гаиЪ et а1., 1981) используя набор клонированных фрагментов <1 -глобинового гена цыпленка показали, что недометированность активно транскрибируемого гена касается как собственно транскрибируемой, так и не кодирующей части. Они выявили довольно точное соответствие расположения области недометилированности ДНК, повышенной чувствительности к ДНКазе I, в том числе участков "суперчувствительных" к ДНКазе I (см.гл.1), и области экспрессии. Интересно, что с потерей транскрипционной активности гена (переход от 5-дневного эмбриона к 14-дневному) исчезает, по крайней мере, одно ДНКазо-1-суперчувст-' вительное место, а также некоторая недометилированность ДНК. Последнее является, по-видимому, первым свидетельством о возможности дометилирования ДНК (определенного гена) в онтогенезе.

Суммируя все вышеизложенное, надо отметить, что метилирова- ^ ние ДНК эукариот является вновь открытым механизмом регуляции \ генной активности, со всеми вымазанными выше оговорками о спе- \ цифичности этого механизма. Характер метилирования отдельного

I/'гена динамичен и хорошо коррелирует с транскрипционной его активностью. Вместе с тем, ясно,\ что исследования последних лет с использованием современных методологических подходов и практических методов, лишь подтвердили и детализовали коррелятивную связь между характером метилирования и экспрессией. Четко установленная корреляция^окаеще ничего\не говорит о механизмах с помощью которых недометилированность отдельных сайтов в ДНК реализуется при активации транскрипции. Поднявшись еще на один виток серпантина, мы получили возможность с лучшим разрешением рассматривать все ту же недоступную вершину. Мы уже знаем, что происходит,хотя бы отчасти, с метилированием ДНК при активации гена, но не знаем, почему это происходит, как это происходит, и как эти изменения узнаются регуляторными механизмами и РНК-полимеразной машиной.

В ряде работ высказываются предположительные ответы на поставленные выше вопросы. Попытка объединить их представлена в обсуждении результатов данной работы.

ГЛАВА П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные

В опытах использовали белых беспородных крыс обоего пола весом 100-150 г.

Культуры клеток

Опыты проводили на ь-клетках - трансформированных 2-0-ме-тилхолантреном фибробластах эмбриона мыши линии СЗН. Клетки культивировали в монослое в стеклянных матрасах на питательной среде, состоящей из 45% среды 199,45$ среды с 0,5% гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса и 10% сыворотки крупного рогатого скота. Клетки инкубировали в присутствии 100 ед/мл пенициллина и 0,2 мкг/мл стрептомицина. Культуру пересевали каждые 4-5 о дней, суспензию клеток вносили в матрас из расчета 3,5*10 клеток на 100 мл-матрас. Количество клеток при посеве и снятии определяли подсчетом в камере Горяева. За 12 часов до постановки опыта клетки стимулировали к пролиферации сменой среды.

Клетки суспензионной культуры табака ( умны-ляпя ^яьяшт

Суспензию клеток выращивали в жидкой модифицированной среде Мурасиге и Скуга ( мигаэМде, Бкоод, 19 62 ) в 750-мл колбах в темноте при 26-28° и перемешивании. Культуру поддерживали пересевами через каждые 14 дней. Начальная плотность материала составляла 8-10^ клеток в мл среды.

Выделение ядер клеток печени крысы

Ядра клеток печени крысы получали по модифицированному методу Агутера (Ади«ег, 1972 ). Изолированную печень крысы после перфузии продавливали через сито из нержавеющей стали, гомогенизировали с 5-7 объемами раствора, содержащего 0,32 М сахарозу, 30 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 6,2 и 3 мМ мдс12 (раствор № I) в гомогенизаторе из нержавеющей стали с тефлоновым пестиком и центрифугировали 10 мин при 800 д.Осадок ядер суспендировали в небольшом объеме раствора № I, смешивали с 3-мя объемами 2,3 М сахарозы в 30 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 6,2 с 3 мМ Mgci2 (раствор Jé 2), наслаивали на 4 мл раствора № 2 и осаждали центрифугированием в роторе sw 25.1 (или sw 27) при 23 000 об/мин. Очищенные таким образом ядра переосаждали центрифугированием из раствора А I.

Выделение ядер т. -клеток

Для выделения ядер осадок l -клеток гомогенизировали в растворе )& I с 1% тритоном X 100, затем после осаждения ядер центрифугированием в вышеуказанном режиме промывали раствором № I с 0,5% тритоном X 100. Осадок ядер дважды промывали раствором 20 мМ три-этаноламин-HCi , рН 7,3 и 2 мМ Mgci2 при переосаждении. Аналогичным образом выделяли ядра печени крысы из гомогената печени для выделения препарата суммарной ДНК.

Гидролиз хроматина в ядрах нуклеазами

Ядра суспендировали в растворе 20 мМ триэтаноламин-НС1, рН 7,3-7,4, содержащем 0,5 мМ CaCig, 0,5 мМ Mgci2 из расчета 3-4 мг ДНК (ядер) в I мл. К суспензии добавляли стафилококковую нуклеазу (10-40 ед на I мг ДНК) и инкубировали при 37° различное время. Таким же образом инкубировали ядра без добавления нуклеазы (гидролиз эндогенной нуклеазой). Реакцию останавливали быстрым охлаждением или одновременным добавлением ЭДТА до конечной концентрации 4 мМ. Затем осадки суспендировали мягкой ультразвуковой обработкой на дезинтеграторе МбЕ (Англия), осаждали центрифугированием при 1500 9Ю мин. Материал надое ад очной фракции разделяли в линейном градиенте концентрации сахарозы.

В каждом опыте оценивали глубину гидролиза, определяя долю фракции кислоторастворимого материала, растворимого хроматина, нерастворимого хроматина. В зависимости от глубины гидролиза выход кислоторастворимой фракции составлял 2-20$ от суммарной ДНК, выход растворимого хроматина цри этом составлял 40-90%. Фракционирование гидролизатов хроматина нуклеазой Гидролизаты хроматина нуклеазами фракционировали в линейных сахарозных градиентах. При остановке гидролиза охлаждением градиенты содержали 20 мМ ТЭА-HCi, I мМ mgci2 при остановке гидролиза ЭДТА - раствор 20 мМ ТЭА-HCi с 4 мМ ЭДТА. Для получения нук-леомеров и их олигомеров материал центрифугировали в градиенте 5-30$ сахарозы 15 часов при 19 ООО об/мин в роторе sw 27 в ультрацентрифуге spinco L или при 21 000 об/мин в роторе С 30 центрифуги К 32 (СССР). Для получения нуклеосом и их олигомеров материал центрифугировали в градиенте 5-20$ сахарозы 24 часа цри 24 000 об/мин в роторе sw25.I. Для получения длинных цепочек нуклеосом ( Butler, Thomas,198 0) материал центрифугировали в градиенте 5-30$ сахарозы, приготовленном на растворе 20 мМ ТЭА с 2 мМ ЭДТА. Уоловия центрифугирования те же, что при получении нуклеомеров. В качестве реперов для оцределения коэффициента седиментации использовали субчастицы рибосом 30 s и 50s е.coli или суммарную РНК клеток асцитной карциномы Эрлиха, центрифугировавшиеся в отдельной пробирке. Разрешение: при получении нуклеомеров: 2s , при получении нуклеосом: 0,5 s, при получении цепочек нуклеосом: 2-4 s. Изучение конформациоиных переходов нуклеомера Конформационные переходы исследовали при рецентрифугировании материала пиков, полученных из первого градиента. Материал диали-зовали от сахарозы против соответствующих растворов. Негистоновые белки удаляли обработкой 0,35 MNaci с последующим центрифугированием, гистон HI так же после обработки 0,6 M Nací. Рецентрифугирование проводили в градиентах 5-30$ сахарозы, приготовленных на соответствующих растворах, в роторе sw 50.1 IS5 мин при 40 ООО об/мин.

Определение длины ДНК фрагментов хроматина ДНК из фракции градиента, соответствующих материалу с определенным коэффициентом седиментации, выделяли при помощи проназ-ной обработки (проназа без нуклеаз) в присутствии 0,5% доцецил-сульфата натрия (sds ). Длину фрагментов ДНК определяли электро-форетически в агарозном геле по методу ( мс Doneil et. al.,1977). Использовали 1% гель для определения длины ДНК из ди- и тринук-леомеров, и 1,5% гель для определения длины ДНК нуклеомеров. Б качестве маркеров использовали 0,25% раствор бромфенолового синего. Электрофорез проводили в течение 2,5-3,5 часов при 5 в/см. Гели обрабатывали раствором бромистого этидия и просматривали в УФ-свете на ультрахемископе. Гели калибровали по рестриктам ДНК фага Т5, полученным при действии ( Endo R* HindIII, EndoR* Eco RI. Препараты ДНК любезно предоставлены А.А.Колесниковым, рестрик-таз - В.Г.Дебабовым и К.Г.Скрябиным. Электрофореграммы фотографировали на пленку "Микрат-300".

Метилирование ДНК и ДНК в составе хроматина бактериальными метилазами

Для метилирования использовали препараты хроматина: Моно- и динуклеосомы - материал с коэффициентами седиментации Ils и I5s , соответственно.

Моно- и динуклеомеры - материал с коэффициентами седиментации 37s и 45s , соответственно, очищенные рецентрифугированием. Цепочки нуклеосом - материал с коэффициентом седиментации 60-80s, состоящие ИЗ 30-70 нуклеосом (Butler,Thomas,1980) . ГИСТОН HI удаляли, как указано выше.

Коровые частицы нуклеосом получали обработкой фракции мононуклео-сом из градиента стафилококковой нуклеазой (0,4-0,8 ед на I мкг ДНК). Гомогенность полученного препарата контролировали электро-фоторетически.

ДНК выделяли из ядер печени крысы, полученных методом с использованием тритона Х-100 (см.выше). Ядра обрабатывали проназой без нуклеазы в присутствии 0,25^-ного додецилсульфата натрия при 37°, а затем ДНК депротеинизовали смесью хлороформ: изоамиловый спщ)Т, осаждали этанолом, после перерастворения обрабатывали РНКазой, повторно децротеинизовали. После осаждения этанолом растворяли в 20 мМ ТЭА-HCi , рН 7,3.

ДНК нуклеомеров получали, обрабатывая фракцию мононуклеоме-ров проназой без нуклеаз, с последующим отделением ДНК в нейтральном сахарозном градиенте.

Энзиматическое метилирование ДНК и ДНК в составе хроматина

Использовали ДНК-метилазы e.coü любезно предоставленные Я.И.Бурьяновым: цитозин-метилирующий фермент M.Eco RII и аденин-метилирующий фермент M'Ecodam (Перепеленко и др., 1980). Инкубационная смесь реакции метилирования содержала 4 мкг ДНК (свободной или в составе хроматина) в 50 мкл раствора № 3 (20 мМ ТЭА-HGi ,рН 7,3 и 4 мМ ЭДТА), 200 ед акт. M'Eco RII в 15 мкл или 200 ед акт. M-Ecodam в 25 млк, 5x10""% метил-% - s -аденозил-ь-метионина (sАМ) с удельной радиоактивностью 7,5 Кд/ммоль "Amersham" (Англия) и I M К-фосфатный буфер, рН 8,0 с 70 мМ 2-меркаптоэтанола (2-МЭ) и 50 мМ ЭДТА - в объеме 7,5 мкл ("высокая" ионная сила) или 2,3-3,4 мкл ("низкая" ионная сила). При коротких временах инкубации реакцию останавливали добавкой немеченого sAM в десятикратном избытке. Максимальное время инкубации не превышало ЭО мин. Определение радиоактивности после инкубации проводили как описано в работе (Нестеренко и др.,1979). Для обнаружения метилированных оснований в ДНК после энзиматического метилирования ДНК реакционной пробы, отделяли, гидролизовали 57^-ной НС1О4 при 100° в течение часа, Гидролизат хроматографировали в присутстс с вии нерадиоактивных ш С и ш А, как описано в работе (Бурьянов и др.,1974).

Нуклеазная обработка метилированных ДНК-метил азами частиц хроматина

К препаратам хроматина после инкубации в ДНК-метилазной системе добавляли СаС12 » мдС12 до конечной концентрации каждого, равной 0,5 мМ, стафилококковую нуклеазу (0,4-0,8 ед акт.на I мкг ДНК) и инкубировали при 37°, отбирая аликвоты через 60 и 90 мин. К отобранным аликвотам добавляли ЭДГА в избытке, ДНК-носитель и ДНК осаждали 5^-ной НС104, пробы отмывали холодной 5%-ной НС104 и осадок ДНК гидролизовали в 5%-ной Нй04 при 100°. Б гидролиза-тах определяли радиоактивность.

Получение меченого по ДНК хроматина

Для получения радиоактивно меченого хроматина крысам вводили внутрибрюшинно 5-метил-%-тимидин (ЧССР) с удельной радиоактивностью 25 Ки/ммоль через 19 и 21 час после частичной гепатэктомии в дозе 10-20 мкКи/г веса. Крыс забивали через 4-5 дней после инъекции.

Изучение динамики репликации и метилирования ДНК

Инкубация ь-клеток с метил-^Н-тимидином, б-^Н-уридином. метил-%-метионином ^

Для изучения динамики репликации клетки инкубировали с. метил-^-тимидином с удельной радиоактивностью 14,4 Ки/ммоль (СССР), 24,2 Ки/ммоль (ЧССР), 47 Ки/ммоль (Англия) в концентрации 1-5 мкКи/мл.

Для определения уровня метилирования клетки инкубировали в присутствии 6-%-уридина с удельной радиоактивностью 18 Ки/ммоль в концентрации 30-50 мкКи/мл или ь-метил-%-метионина с удельной радиоактивностью 15 Ки/ммоль в концентрации 100-250 мкКи/мл. Б последнем случае среда инкубации содержала дополнительно 1,5 мг/мл формиата натрия, 20 мкг/мл тимидина, 20 мкг/мл аденина.

Инкубацию клеток проводили в течение различного времени в 10 мл раствора Хэнкса или полной питательной среды при 37°. При импульсных инкубациях экспозицию клеток с радиоактивными предшественниками останавливали быстрым охлаждением и добавлением азида натрия до концентрации 10 мМ.

После инкубации клетки снимали с поверхности матраса с помощью трипсина с 10 мМ азида натрия и отделяли центрифугированием.

Седиментационный анализ радиоактивномеченной ДНК

Осадок клеток обрабатывали лизирующей смесью, содержащей 100 мкг/мл проназы (без нуклеаз) и 0,5% додецилсульфата натрия в растворе Ix ssC (0,15 М Nací - 0,015 М -*в-цитрат). Бремя лизиса - 1,5 часа при 37°. Лизис останавливали добавлением sds до 1% и NaOH до 0,3 М. Осветленный лизат (после центрифугирования 5 мин при 1000 д) наносили на линейный (5-20%) сахарозный градиент. Растворы сахарозы готовили на 0,1 М NaOH и 0,2%sds . Градиентные центрифугирования проводили в роторе sw-50 и sw-27 на ультрацентрифуге spinco l при 18°, соответственно, 4 часа при 40 000 об/ мин или 18 часов при 25 000 об/мин. Пробы после раскапывания осаждали и промывали 5%-ной HCi04, а при использовании меченого ури-дина проводили дополнительно щелочной гидролиз РНК (1,5 часа в 0,5 М NaOH при 60°). После гидролиза проб 5%-ной HCiO^ при 60° в течение ночи в них просчитывали радиоактивность.

Выделение препаратов суммарной ДНК для определения уровня метилирования

Препараты ДНК для хроматографического разделения оснований получали по методу Шмидта и TaHray3epa(Schmidt,Thannhauser, 1945) 1945) в модиФикадииЗанюшина (Ванюшина,1964

Гидролиз ДНК до оснований и их последующее разделение Гидролиз ДНК до оснований проводили как описано в статье (Васильев,]!971 ) и основания разделяли с помощью хроматографии в тонком слое целлюлозы " Filtrat » (ЩЧ. Уровень метилирования 5

ДНК определяли по величине отношения радиоактивности в С и m С: 100 • п?С/ п^С + С после элюции соответствующих пятен на хрома-тограмме.

Основания так же разделяли с помощью хроматографии высокого давления на жидкостном хроматографе 'Varianï (США) на колонке с " Aminex а7). условия разделения и анализа подробно описаны в работе (Кирьянов и др.,1982).

Изучение динамики синтеза ДНК клеток культуры табака с;

К 50 мл суспензии клеток плотностью 2 • 10 в I мл (5-й день ростакультуры) добавляли *%-тимидин (200 мкКи/мл) и суспензию инкубировали различное время. Инкубацию останавливали добавлением азида натрия до конечной концентрации 0,01 М, клетки отмывали холодной средой, содержащей немеченый тимидин (100 мг/мл), и замораживали жидким азотом.

Получение клеточного лизата для седиментационного анализа вновь синтезированной ДНК

Замороженные клетки заливали 0,1 M трис-НС1-буфером, рН 8,08,2, содержащим 0,1 M ЭДТА и 0,5^-ный sds , растирали в ступке с карборундом и инкубировали при 37° в течение 90 мин с проназой Е ("мегск" ФРГ, 100 мкг/мд). Проназу предварительно прогревали в стандартном солевом растворе (ss С, 60°, 20 мин). Лизат клеток центрифугировали 20 мин при 15 000д. В надосадочнуго жидкость добавляли sos д0 концентрации 1% и 10 М NaOH до 0,3 М концентрации. Лизат наносили на линейный щелочной градиент концентрации сахарозы (5-20$).

Разбор проб градиента, обработку проб и определение радиоактивности проводили так же, как для ь-клеток.

Исследование влияния ауксина (2,4-Д) на синтез ДНК. Клетки на 4-й день роста культуры промывали и суспендировали в стерильной среде, не содержащей регуляторов роста (2,4-Д и 6-бензил-аминопурин). Через трое суток культуру суспендировали в 50 мл среды, содержащей 5 мг/л 2,4-Д, и инкубировали 30 или 60 мин с 40 мкКи/мл "^Н-тимидина (плотность клеток 2*105 клеток в I мл). Кроме того, влияние 2,4-Д на репликацию и метилирование ДНК исследовали при плотности суспензии клеток 4*10 клеток в I мл в присутствии 100 мкКи/мл %-урацила (4 ч). . ; , . /> ••

Обнаружение метилирования вновь синтезированной ДНК. Культуру ру на 5-й день-роста концентрировали до плотности 4*10 клеток в I мл и инкубировали 4 ч с метил-%- метионином (100 мкКи/мл, удельная радиоактивность 101,2 мКи/ммоль, Венгрия) в 25 мл среды, содержащей аденин (20 мкг/мл) и формиат натрия (1,5 мг/мл).

Анализ связывания годаон-рецепторного комплекса (ГРК) гидрокортизона с хроматионом

Гормон-^-гидрокортизон (удельная радиоактивность 6,8 Ки/ ммоль) вводили крысам внутривенно (0,5 мКи на 100 г веса) сроком на 30 мин через 30 мин после внутривенного введения немеченного гидрокортизона (5 мг на 100 г веса). Ядра клеток печени выделяли, как описано выше. Очищенные ядра переосаждали из раствора № I, суспендировали в растворе, содержащем 50 мМ ТЭА-HCi, рН 7,2 и

-983 мМ мдс12 (раствор № 4) и гомогенизировали 75 сек в гомогенизаторе при 14 ООО об/мин. Фракцию "плотного" хроматина осаждали центрифугированием гомогената 10 мин при 1000 д , фракцию "активного" хроматина отделяли из надосадочной жидкости центрифугированием при 70 000д в течение 60 мин через слой сахарозы в растворе № 4. Полученная при этом надосадочная жидкость обозначена как ядерный сок. Из фракции плотного хроматина отделяли фракцию ядрышек. Для этого осадок плотного хроматина суспендировали в растворе № 2, обрабатывали ультразвуком и центрифугировали 20 мин при 1200дчерез слой I М сахарозы в растворе № 2. Плотный хроматин и контрольный образец суммарного хроматина осаждали 2 часа при 350 000 д . Во всех выделенных фракциях определяли содержание ДНК и радиоактивность из %-гидрокортизона.

Фракция "активного" хроматина, выделенная таким образом, содержит 0,5-2% ДНК (от суммарной ядерной), 6-12% РНК (от суммарной ядерной) и не менее 25% всей новообразованной РНК АУ-типа. Морфологически фракция представляет собой зоны связанных между собой фибриллами ДНП РНП-гранул (Поляков и др.,1979).

Электронная микроскопия

Ядра или субъядерные фракции фиксировали 10-12 часов при +1° нейтрализованным глютаровым альдегидом (конечная концентрация 0,25% в буфере выделения). Фиксированный материал промывали водой и дополнительно фиксировали I час при +4° 1% ОэО^, промывали 50% этанолом и обезвоживали в этаноле возрастающих концентраций с последующей заливкой материала в ЭПОН-812. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме гКВ и окрашивали цитратом свинца. Срезы просматривали в электронном микроскопе Ф -12. Тотальные препараты хроматина и субъядерных фракций помещали на пленки-под-ложи для электронной микроскопии, отмывали от сахарозы в буфере выделения и обезвоживали в этаноле возрастающих концентраций, контрастировали их 2% раствором уранилацетата в 70% этаноле или проводили напыление палладием.

Определение концентраций РНК, ДНК и белка Концентрацию РНК и ДНК в препаратах определяли спектрофото-метрически по методу Спирина (Спирин,1958), в ряде случаев концентрацию ДНК определяли по методу Бартона ( Burton ,1956 ) а концентрацию бежа по методу Лоури ( Lowry, 1951 )• Определение радиоактивности

Радиоактивность препаратов определяли жидкостно-сцинтилля-ционным методом в диоксановом сцинтилляторе или в ЖС-8, а также в толуольном сцинтилляторе в гетерогенной системе (на стеклянных фильтрах и ионообменной бумаге). Измерения проводили на счетчиках: - Mark 1,11,III.

ГЛАВА Ш. НУКЛЕОМЕРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ХРОМАТИНА

Ш.1. Ультраструктура хроматина в ядрах in situ и в изолированных ядрах

Как известно, нуклеосомный уровень организации фибрилл хроматина не выявляется в интактных ядрах. При фиксации ядер в клетках электронномикроскопияеский анализ обнаруживает, что хроматин представлен фибриллами диаметром 20-30 нм (Ченцов,1971; Ris 1975). Такие же фибриллы выявляются, как главный компонент хроматина, на срезах замороженных ядер, полученных щадящими методами ( Du Praw,1973, Ris,1969 ) а ТЭКЖе В составе профазных ( Yunis , Bahr, 1979 ) И МетафЭЗНЫХ хромосом ( Du Praw, 1965 ; Ratter , Hamkaio ,1978а,б). Таким образом, фибриллу с диаметром 20-25 нм ("фибрилла-20 нм"), по-видимому, следует считать нативной. Первой задачей нашего исследования, в связи с этим,была попытка установить, в каком соответствии находится фибрилла-20 нм с нуклео-сомной фибриллой. Мы попытались ответить на этот вопрос, изучая ультраструктуру хроматина в ядрах, выделенных в различных условиях (ионная сила и концентрация ионов магния). При этом, требования к исходному препарату ядер определялись принципом максимальной сохранности ультраструктуры фибриллы хроматина, наблюдаемой в ядрах, фиксированных в ткани, т.е. принципом некоей "нативности" препарата. В качестве отправной точки исследования принималось, что фибрилла-20 нм представляет собой какой-то уровень компактизации нуклеосомной фибриллы. При этом учитывалось, что нуклеосомный хроматин (фибрилла-10 нм) выявляется в ядрах при их переводе в безион-НЫе Среды (Woodcock,1973 , 01ins,0lins,1974, Langmore , Wooley , 1975 ) применении при выделении ядер хелатных агентов ( Van Holde et âl.,1974, Ris, Korenberg, 1979> ШЖ ИСПОЛЬЗОВа

НИИ хлористого натрия Б ВЫСОКИХ концентрациях ( Oudet et al., 1975).

Хроматин в ядрах, фиксированных в клетках, как и хроматин в ядрах, выделенных в изотоничных средах, при поддержании "умеренно" высокой ( ? 50 мМ по Nací ) ионной силы и концентрации ионов магния довольно сильно компактизован и представлен агрегатами фибрилл диаметром 20-25 нм, которые удается проследить, однако, только на небольшом протяжении (рис.1,2). Агрегированность хро-матиновых фибрилл снимается при переводе ядре в растворы низной ионной силы в присутствии небольших концентраций ионов магния о ,

20-30 мМ ТЭАД-2 мМ Щ ). Диаметр фибриллы хроматина при этом не меняется, но диффузность всего хроматина ядра позволяет на ультратонких срезах проследить характер строения фибриллы на значительном протяжении. Обращает на себя внимание факт неоднородности диаметра фибриллы 20-25 нм по ее длине. Как в ядрах in situ так и в ядрах с диффузным хроматином, фибрилла представлена тесно сближенными между собой глобулами среднего диаметра 20-25 нм (рис. 1,3). Отмывка ядер (переосаждением) растворами низкой ионной силы о. в присутствии ионов магния (20 мМ ТЭА и 1-2 мМ Mg .) делает чет-ковидность структуры фибриллы еще более контрастной, возможно,за счет вымывания из ядер довольно большого количества нехроматино-вых белков (Манамшьян и др.,1978). В отсутствие ионов магния в низкой ионной силе фибрилла-20 нм трансформируется в фибриллу-10 нм, в составе которой выявляются глобулы, соответствующие нуклео-сомам (рис.4).

Хроматин ядер, выделенных в растворах низкой ионной силы в присутствии ионов магния, фрагментируется (при мягком гидролизе) Са,Мд-зависимой эндогенной нуклеазой ядер или стафилококковой нук-леазой с выщеплением из фибрилл отдельных глобул, их олигомеров и A

• ■ чк - ч V *4""

-V- ; VT-, - i л

•-•л. * * JV '.fv - ч ' 14 ' * » T f- 1

A f* ' У >-■ л-- * V /

V • - a ^ * * • » - ~ JP 4 •

V> * 4 * «

-A' Ч 'ГЧ?^

Л. Л л - * J s t • «»a "V*■-¿ / • / w .Д* . V a • д vw • Ä • ■ •

JV »

• * *» * * * ä * tу 9 г ч

NM h ■ с 4 4 h 7 fc A . «

• lA'tV . ï* , -/M 1; . ' "Л'',

V • ' .

V4 л ■.

Jr ■» Л, 8 . fV.t .i,- .i .Л ' 1 . 'T » - ^ i

-t ' rt л ' л .- * .

Рис. I.

- 104

Электроннограмма ядра печени крысы при фиксации клеток in situ.Участок конденсированного хроматина.

Рис. 2. Электронограмма ядра печени крысы, изолированного по модифицированному методу Агуттера. Буквами отмечены участки конденсированного хроматина.

Рис. 3. Электроннограмма ядер печени крысы. Ядра фиксированы в растворе, содержащем 20 ыМ ТЭА-НС1, рН 7,3 и 1-2 мМ Мдс12. Стрелками указаны нуклеомеры.

Рис. Электроннограмма ядер печени крысы. Ядра фиксированы в растворе, содержащем 20 мМ ТЭА-НС1, рН 7,3 без мдс12 Стрелками указаны пуклеосомы.

Увеличение на рис. 1-4 - 81000.

Рис. 5.Электроннограмма фракции изолированного хроматина, ограниченный гидролиз хроматина в ядрах стафилококковой нук-леазой. Стрелками указаны отдельные нуклеомеры.

Рис. 7. Электроннограмма фракции изолированных нуклеомеров.

Рис. 8. Электроннограмма цепочек нуклеосом, полученных при "развертке" нуклеомеров.

Увеличение на рис. 5,7,8 - 72000. длинных цепочек глобул (рис.5). Таким образом, фибрилла 20 нм, расщепляется нуклеазой преимущественно в участках между глобулами, подобно нуклеосомной фибрилле.

Мономеры глобул фибриллы 20-нр/, названные нами нуклеомерами, могут быть выделены градиентным ультрацентрифугированием. В линейном (5-30%) сахарозном градиенте гидролизат хроматина Са-Мд-завиг симой эндогенной нуклеазой разделяется на два основных пика: "тя- . желый" материал, седиментирующий в области 40-48з(с максимумом 45 э) и легкий - с максимумом материала в зоне седиментации нук- ^ леосом 11-12 б (рис.6). Электронномикроскопически фракция хроматина "тяжелого" пика представлена глобулами диаметром 20-25 нм (рис.7).

Нуклеомеры из зоны седиментации "тяжелого материала", обработанные ЭДТА, разворачиваются во фрагменты нуклеосомной цепи. При этом, наряду с сохраняющимся глобулами с диаметром 20-25 нм можно видеть цепочки из 4-8 нуклеосом (рис.8). Важно при этом, что такой переход реализуется без существенных изменений химического состава фибриллы или ее компонентов соотношение ДНК: гистон негистоновый белок существенным образом не меняется (Манамшьян, 1974).

Определение длины ДНК, входящей в состав нуклеомера, элек- ^ 1 тронномикроскопическим методом выявилонесколько классов ДНК, 1 выделенной из фракции (40-48э ). Наиболее представителен класс | ДНК с длиной молекулы, соответствующей 8 нуклеосомам. Кроме того, представлены классы, соответствующие 15-17 нуклеосомам и 22-24 1 нуклеосомам. Таким образом, можно было сделать предварительный вывод, о том, что в состав нуклеомера входит цепочка из 8 нуклеосом. Нуклеазная обработка продуцирует так¡же ди- и тримеры нуклео сом, а также фрагментЕфует ДНК внутри самого нуклеомера (Манамшьян, ис.6# Седиментограмма гидролизата хроматина Са/^д-зависимой эндогенной нуклеазой. (Линейный сахарозный градиент с I ММ МдС1^ .

-107- (0

1978). Таким образом, нуклеомерная фибрилла-20 нм дискретна, I ■ субъединична в своей структуре, а каждый нуклеомер образован фрагментом нуклеосомной цепи, состоящей, по-видимому, из 8 нуклео-сом.

Удаление ионов магния из среды выделения ядер приводит, как упоминалось выше, к разворачиванию нуклеомерной фибриллы в нук-леосомную. Обратный переход реализуется неполностью: диаметр фибриллы восстанавливается, но глобулярность, т.е. упорядоченность ее организации восстанавливается только частично.

Дополнительная информация о структуре фибриллы-20 нм получена в экспериментах по изучению динамики фрагментации хроматина стафилококковой нуклеазой.

Ш.2. Динамика фрагментации хроматина стафилококковой нуклеазой

В линейном сахарозном градиенте, соржащем магний, пик моно-нуклеомеров, выявляемый по УФ-поглощению (рис.6) имеет нечетко выраженный максимум и достаточно широк. Причиной этого может быть, в частности, как низкое разрешение, так и соосаждение в этой зоне наряду с фрагментами хроматина и других УФ-поглощающих компонентов ядра, например, РНП-чаСТИЦ (Samarina et al., 1968, walker et al., 1980). В дальнейшем, мы анализировали хроматин, ДНК в котором была предварительно радиоактивно мечена %-тимиди-ном (см.Материалы), что повысило чувствительность анализа динамики фрагментирования хроматина и позволило исключить из рассмотрения ядерные частицы, не содержание ДНК. Весь материал нуклеаз-ного гидролизата хроматина ядер, распределенный в различных зонах градиента при ультрацентрифугировании, представляет собой дезоксирибонуклеопротеид: после проназной обработки радиоактивность всех "тяжелых" компонентов переходит в зону с максимумом седиментации 4-10з в нейтральном сахарозном градиенте (рис.9). Практически вся радиоактивность, с другой стороны, принадлежит ДНК. В дальнейших опытах для фрагментации хроматина использовали стафилококковую нуклеазу, что позволило стандартизовать гидролиз.

Характер распределения фрагментов хроматина, полученных после нуклеазной обработки ядер в градиенте сахарозы представлен на рис.10. При ограниченном действии нуклеазы (доля кислотораствори-мой фракции 1,5-2%) большая часть материала локализована в "тяжелой" зоне градиента с нечетко выраженными пиками в области 76 б и 67 б (рис.Юа). При увеличении глубины гидролиза четче выявляются пики с коэффициентами седиментации 673 , 62б, 56б, 51 эй 45 э (рис.Пб), при этом увеличивается доля материала в зоне мононук-леосом. Дальнейший гидролиз (до 7-10% кислоторастворимой фракции) приводит к смешению всего материала к зоне нуклеосом (рис.ТОв). Таким образом, расщепление хроматина на блоки, более крупные, чем нуклеосомы, можно выявить только на начальной стадии фрагментации хроматина нуклеазой в довольно узком интервале (2-6%) выхода кислоторастворимой фракции.

Несмотря на то, что хроматин фрагментируется на дискретные субъединицы, распределение которых в градиенте хорошо воспроизводимо, трудно говорить о преимущественном выщеплении мононуклео-меров на каком-либо этапе гидролиза стафилококковой нуклеазой. Пик с коэффициентом седиментации 45б, материал которого представ- ! ляет собой нуклеомер, состоящий из 8 нуклеосом (см.выше), не ; является основным компонентом гидролизата хроматина. Одной из возможных причин этого может быть продолжающееся действие стафилококковой нуклеазы, которое лишь частично блокируется при быстром охлаждении. Длительность анализа продуктов фрагментации (подготовл о о й д к

Й га о

Рч

1200

800

400

50Б ЗОБ

10

20

Фракции

Рис.9. Седиментограмма Фрагментированного нуклеазой хроматина после его обработки проназой.

-НО- ■ ка материала к седиментации, собственно седиментация) при продолжающемся действии нуклеазы приводит к появлению новых разрывов в хроматиновой фибрилле. Наличие большого количества скрытых (на уровне хроматина) разрывов ДНК подтверждается при определении длины выделенных из них ДНК (рис.П). Кроме того, фракционирование фрагментов хроматина в градиентах с магнием имеет еще один недостаток - агрегацию отдельных фрагментов между собой (см. далее), что еще более затрудняет анализ динамики их выщепления.

В связи с этим мы были вынуждены ввести остановку реакции гидролиза хроматина с помощью ЭЛТА. Фракционирование гидролиза-тов хроматина проводили при этом в линейных градиентах сахарозы, содержащих ЭДТА в тех же концентрациях, которые использовались для остановки реакции гидролиза. Предварительно была определена минимальная концентрация ЭДТА, необходимая для остановки гидролиза и достаточная для предотвращения дальнейшей фрагментации материала. Для этого сопоставляли размеры фрагментов хроматина (коэффициент седиментации) после остановки гидролиза ЭДТА в разных концентрациях в первом градиенте и после рецентрифугирования. В дальнейшем использовали ЭДТА в концентрации 4 мМ, которая эффективно блокировала гидролиз ДНК.

Распределение фрагментов хроматина после гидролиза нуклеазой в градиентах, содержащих ЭДТА, представлено на рис.12. При мягком гидролизе (2-3% кислоторастворимой фракции, рис.12а) основными компонентами "тяжелой" части градиента являются пики с коэффициентами седиментации 55 б и 47 б . С углублением гидролиза наблюдается последовательное перераспределение материала в более "легкие" зоны: 47э и 37э (рис.126). На стадии "глубокого" гидролиза (4-6% кислоторастворимой фракции) преобладающим становится материал в зоне 37 б (рис.12в). гм

675 76Б .

I 1 I

-ЮБ I а

6

8

12

8

50 -10

Фракции

•ис.Ю. Седиментограмма фрагментированного стафилококковой нуклеазой хроматина (линейный сахарозный градиент с I мМ ндса^. Кислоторастворимая фракция составляет: а) 1,5-2,0%, б) 2,0 - 6,0 в) 7,0 - 10,0 %.

Фракции йс.П. Седиментограмма фрагментированного стафилококковой нуклеазой хроматина (линейный сахарозный градиент с I мМ мдС1^ -и электрофореграммы ДНК, выделенных из зон градиента 76в и 67з (заштрихованы).

Кислоторастворимая фракция (доля от суммарной ДНК.хроматина) составляет:

2 - 3 %

3 - 4 %

5 - 6 %

10[ 20, 30; 40, 50 Фракции

Рис.12. Седиментограммы гидролизата хроматина стафилококковой нуклеазой в линейном сахарозном градиенте с ЭДТА.

-114«

Таким образом, хроматин в ядре фрагментируется стафилококковой нуклеазой так же, как и эндогенной Са,Мд-зависимой нуклеазой, на дискретные крупные блоки. Остановка реакции гидролиза ДНК в хроматине с помощью ЭДТА позволяет более четко выявить на ранних стадиях нуклеазного гидролиза стадию плато с выщеплением фрагмента с коэффициентом седиментации 37э в градиенте с ЗДТА.

Ш.З. Анализ длин ДНК во фрагментах хроматина

Для оценки размеров выщепляемых фрагментов хроматина, материал из зон градиента с ЭДТА, соответствующий дискретным пикам 37э, 47 эй 55з, рецентрифугировали в таком же градиенте для дополнительной очистки. При этом фрагменты хроматина седиментируют в Гузкой зоне гомогенным пиком с сохранением исходного коэффициента седиментации (рис.13-14). Этот прием позволил в значительной мере освободиться от фрагментов хроматина с внутренними разрывами в ДНК. Действительно, ДНК фрагментов каждого пика после первого градиентного центрифугирования содержала, помимо главной полосы, также серию минорных полос меньшего размера (рис.13а). Рецентрифуги-рование эффективно освобождало пик 37э от фрагментов меньшего размера (рис.13б,в). На рис.13-14 приведены электрофореграммы ДНК в агарозном геле и калибровочные кривые зависимости молекулярного веса фрагментов ДНК их относительной подвижности. ДНК из фрагментов хроматина с коэффициентом седиментации 37в в геле представлена 2-3 полосами (рис.136), соответствующими длине 1400-1600 пар оснований, т.е. 7-8 нуклеосомам. ДНК из фрагментов хроматина с коэффициентом седиментации 47б (рис.14а) имеет длину 2800-3200 пар оснований, что соответствует 14-16 нуклеосомам. ДНК из пика 55 эсодержит набор фрагментов с длиной 4200-4800 пар оснований, что соответствует 21-24 нуклеосомам (рис.146).

В1

1600 иоо

ГГ

1*

1200

•1600, ^ о о И

800

37£>, 4 8

О I

И §

РМ оо

10| 20; Фракции ас.13. Электрофореграммы ДНК из фракции нуклеомеров (37а) Справа седиментограмма фракции нуклеомеров при повторном центрифугировании. в

3200-2800.

Л Ен О О К оо 9 к

200

20

55Б|

10.21 0.4! '061 ОТН. ПОДВИЖНОСТЬ мо; . зо[ : 101 1351

Фракции

Рис. 14.' Электрофореграммы ДНК из фракции ди- ( А ) и тринуклеомеров ( Б ). Внизу седиментограммы фракции ди- и тринуклеомеров при повторном центрифугировании.В - калибровочные кривые.

Таким образом, фрагменты хроматина, выщепляемые нуклеазой из ядер, локализуются при центрифугировании в сахарозном градиен-.те с ЭДТА в дискретных пиках, соответствующих нуклеомеру (7-8 нуклеосом), его ди- и тримеру, т.е. расщепление 20 нм-фибриллы ) действительно происходит по межнуклеомерным участкам. При более 1 глубоком гидролизе происходит, однако, постепенная деградация нуклеомера до нуклеосом: выщепленный нуклеомер деградирует с концов, укорачиваясь на 1,2,3 нуклеосомы. Так снижение коэффициента седиментации нуклеомера до 34 эсоответствует уменьшению длины его нуклеосомной цепочки на 2-3 нуклеосомы.

Н1.4. Конформационные переходы нуклеомера

Как показано выше, структурный переход фибриллы-20 нм в изолированных ядрах, сопровождающийся появлением нуклеосомной организации, реализуется при удалении ионов магния из среды выделения. Ранее на препаратах хроматина исследовались также роль гистона Н1 в конформационных превращениях фибрилл, и вклад негистоновых белков в поддержание суперструктуры хроматина. В настоящей работе исследовали вклад этих факторов в поддержание нуклеомерной структуры на препаратах изолированных нуклеомеров.

Фракция мононуклеомеров, полученная градиентным центрифугированием (в присутствии ЭДТА), при рецентрифугировании в таком же градиенте представлена гомогенным пиком с коэффициентом седиментации 37э (рис.15). При рецентрифугировании этого материала в градиенте с магнием (I мМ 20 мМ ТЭА) мононуклеомеры седнментируют относительно гомогенным пиком с коэффициентом седиментации 45б (рис.15). С другой стороны, фракция мононуклеомеров 45 б полученная градиентным центрифугированием с магнием (гидролиз эндогенной нуклеазой), и имеющая минимальное число внутренних разрывов, при удалении ионов магния переходит в зону с коэффициентом седиментации 37s (рис.16). Таким образом, структурныймд-зависимый переход, наблюдаемый при исследовании фибрилл хроматина в ядре, реализуется также и в случае отдельных нуклеомеров. Можно говорить о двух конформационных состояниях нуклеомера: "компактном" - частица 45 s и "рыхлом" - частица 37s . По-видимому, I мМ концентрация магния при низкой ионной силе (20 мМ ТЭА) является пороговой, так как частица 37s не компактизуется при более низких концентрациях магния, а с увеличением концентрации магния до I мМ компактизация происходит скачком (рис.15 ). В то же время, при I мМ концентрации магния возможно образование и более тяжелых структур, обусловленных агрегацией компактизованных нуклеомеров друг с другом. Это четко проявляется при увеличении концентрации нуклеомеров в градиенте (рис.17).

Удаление негистоновых белков из нуклеомера (диализ против 0,35 м Nací) не изменяет его седиментационных свойств (рис.18а) и не приводит к потере частицей способности компактизоваться, такая частица, как и "нативный" нуклеомер, превращается в компактную форму в присутствии ионов магния (рис.186). Таким образом, большая часть негистоновых белков не определяет конформации нуклеомера и его структурных переходов. Седиментационные характеристики нуклеомера не изменяются и при удалении гистона HI, однако, такой, лишенный гистона HI, нуклеомер не способен компактизоваться при добавлении ионов магния (рис.18в-г).

При более полном удалении магния из хроматина (диализ против 20 мМ ТЭА, 4-8 мМ ЭДТА, с последующим центрифугированием в градиенте, приготовленном на этом же растворе) наблюдается дальнейшее разворачивание нуклеомера: коэффициент седиментации снижается от 37s до 30s (рис.19а). Этот переход, по-видимому, соответствует

420 Л о 80 о Я н « сб о а се

Рч

45Б37Б 1

-10 20 30 АО 50

Фракции

Рис.15. Седиментограмма нуклеомеров (37з) при центрифугировании в градиенте с мдС12 (I - градиент безмдс!,). л

Ен О О а я

Ен «

Л О

Рч

200

100

45Б 375

I I

10

20

Фракции

Рис.16. Седиментограмма нуклеомеров (45з) в градиенте без мдс12 (I - градиент с I мМ Мдс12).

10] 20 30; 40 50 Фракции

Рис.17. Седиментограмма нуклеомеров цри повышении их концентрации ( I о.е./мл),(1 - градиент без мдС12) х

Фракции

Рис.18, Седиментограммы нуклеомеров (37з) после удаления негистоновых белков ( А,Б) и гистона Н1 ( В,Г). А,В - зфадиент без мдс12. Б,Г - градиент с I мМ Мдс12.

I ЗОБ * а ЗОБ . 1 6

600 -

•ч о МО и 0 - -

0 Ен 9 § гоо

--

2-1-I----I I

10 30 Ю 30

Фракции

Рис.19. Седиментограммы нуклеомеров (37э) при повторном центрифугировании в градиенте с 4 мМ ЭДТА после диализа против 20 мМ ТЭА с 4 мМ ЭДТА (а) и при повторном центрифугировании в градиенте с 4 мМ ЭДТА после удаления гистона Ш (б). полному разворачиванию нуклеосомной фибриллы. Удаление гистона Н1 в этих условиях не приводит к дополнительной декомпактизации частицы (рис.196).

Таким образом, нуклеомер, выделенный в "рыхлой" конформации сохраняет способность компактизоваться в присутствии ионов магния. Эта компактизацин, скорее всего, представляет собой резкий структурный переход, а не постепенную конденсацию и происходит количественно. Можно предполагать, что характер укладки фрагмента нуклеосомной фибриллы в нуклеомер при этом не хаотичен, а упорядочен. Возможность такого структурного перехода определяется сохранением в нуклеомере гистона Н1, взаимодействие молекул которого в присутствии ионов магния, по-видимому, и определяет упорядоченность компактизации.

Таким образом, на отдельном нуклеомере моделируются структурные переходы, наблюдающиеся на интактном волокне -20 нм, и они определяются теми же факторами, что и при структурных переходах в хроматине выделенных ядер. Скачкообразность перехода, по-видимому, отражает регулярность укладки нуклеосомной цепи в составе нуклеомера (возможно, спиральность), так что мононуклеомер может ! представлять собой минисоленоид. Возможность структурного перехода определяется наличием в нуклеомере гистона Н1, взаимодействие которого с соседними нуклеосомами в нуклеомере, по-видимому, и обеспечивает упорядоченность его компактизации.

Ш.5. Обсуждение результатов главы Ш

Главный вывод, следующий из данных, представленных в гла- 1| в^Ш1состоит в том, что фибрилла-?20 нм дискретна, субъединична в п своей структуре. Субъединица фибриллы - нуклеомер образована фрагментом нуклеосомной цепи, характер укладки которой в нуклеомере определяется, в частности, гистоном HI.

Наднуклеосомная организация структуры хроматина в последние годы исследуется широко и с привлечением различных методических подходов. На основании полученных данных сформулировано несколько моделей укладки нуклеосомной фибриллы в наднуклеосомную, из которых две основных, в определенной степени, альтернативны, и требуют обсуждения.

Нуклеомерность, субъединичность структуры фибрилл хроматина нашла подтверждение, во-первых, в многочисленных электронномикро-скопических исследованиях ядер и выделенных препаратов хроматина. Так, все основные результаты, представленные в нашей работе, подтверждены ПрИ ИЗучеНИИ ХрОМаТИНа ЯДер ЭрИТрОЦИТОВ ПТИЦ (Zentgraf et al., 1980, Pruitt, Grainger, 1980, ) глобулярность фибриллы-20 нм выявлена так же в ядрах других клеток ( Subirana et al., 1981, Colquehown, Holmes, 1980 ).

Близкие к представленным здесь данным получены и на препаратах хроматина: тимуса теленка (Бенгеров и др.,1977), лимфоцитов теленка ( Hozier et al., 1977 ) ЭрИТрОЦИТОВ ЦЫПЛеНКа ( Meyer, r^^

1979; Ruiz - carriio et al.,1980) рлеток культуры фибробластов человека ( Yunis, Bahr, 1979 ) подтверждены на ядрах печени крысы ( Tanaka, Oda, 197 6 ) .

Нами показано, что фибрилла-20 нм расщепляется стафилококковой или эндогенной ядерной нуклеазой на дискретные субъединицы -моно- и олигонуклеомеры. Выщепление этих частиц наблюдается в мягких условиях нуклеазного гидролиза. В составе фракции моно- и оли-гшеров нуклеомеров обнаруживается до 80-90% всего хроматина. При исследовании динамики нуклеазного расщепления хроматина выявлены последовательные переходы частиц (три-^ димононуклеомер) с достижением стадии плато при выщеплении мононуклеомеров. Таким образом, фибрилла-20 нм фрагментируется нуклеазами аналогично нуклео-сомной фибрилле по межнуклеомерным участкам. Следует отметить,что в некоторой части нуклеомеров наблюдаются скрытые разрывы ДНК при сохранении целостности самого нуклеомера. Эти данные были подтверждены и на других объектах при исследовании стабильности нуклеомеров И ИХ олигомеров ( Ruiz - Carrilo et al., 1980; Statling, Klingholz, 1981 ).

Сам факт фрагментации фибрилл-20 нм на дискретные субъединицы (супербиды - по употребляемой в зарубежной периодике терминологии) нуклеазами нашел подтверждение на целом ряде объектов (Харченко и др.,1979; Butt' et al;1979, Meyer, Rffinz,1979, Renz, 1979, Ruiz - Carrilo et al., 1980, Sigiu, 1979, Stratling et al., 1978. ).

Количество нуклеосом в нуклеомерах из разных источников (а, может быть, и выделенных разными методами) варьирует от 6-8 до 12 и даже до 20-26 (zentgraf et al., 1980 ). фрагмент хроматина, состоящий из 8 нуклеосом, выщепляется в ходе деградации хроматина тимоцитов крыс после у-облучения (Уманский и др.,1981).

Фрагментация хроматина на дискретные наднуклеосомные субъединицы (наряду с визуализацией глобулярной структуры фибрилл хроматина) отражает, таким образом, определенный характер упаковки нуклеосомной цепи в наднуклеосомное волокно. Ясно, что такой характер фрагментации определяется двумя причинами, возможно, взаимосвязанными: относительно большей доступностью для нуклеаз линкер-ного участка хроматина между двумя соседствующими нуклеомерами (супербидами) и стабильностью нуклеомера как частицы, сохраняющейся в ходе нуклеазного гидролиза (в довольно узком интервале выхода кислоторастворимой фракции).

Относительно большая доступность межнуклеомерных линкеров, в свою очередь, может отражать как особый характер их суперспира-лизации, как и отличия в ДНК-белковом взаимодействии, например, характер взаимодействия молекул гистона Н1 или негистоновых белков между собой и с коровыми гистонами.

В пользу этого косвенно свидетельствуют данные о кластиро-ванности расположения в хроматине гистона Н1 (Иткес и др.,1979; также некоторых негистоновых белков, например, поли- (АДР-рибо-За)-ПОЛИМераЗЫ ( Ви^ et а1., 1979 ).

Стабильность нуклеомера, как частицы, в дополнение к большей доступности межнуклеомерных линкеров, может обеспечивать избирательность накопления мононуклеомеров в ходе нуклеазного гидролиза. Действительно, как было указано выше, часть нуклеомеров имеет внутренние разрывы в ДНК, но ведет себя как "нативная" частица при сохранении гистона Н1 в условиях, обеспечивающих компак-тизацию нуклеомера. Нуклеомеры, или их мультимеры, лишенные внутренних разрывов в их ДНК, стабильны при ингибировании нуклеазной и протеазной активности; в частности, они не меняют седиментацион-ных характеристик при 2-3-кратном рецентрифугировании (с сопровождающим диализом), а также и некоторых функциональных характеристик (см.далее).

Выделенный мононуклеомер - динамическая структура. Структурные переходы в настоящей работе исследованы на мононуклеомере в "рыхлой" форме, т.е. частице с коэффициентом седиментации 37 б В присутствии ионов магния частица 37 б переходит в компактную форму - частицу с коэффициентом седиментации 45 б. Этот переход полностью обратим. Удаление гистона Н1 в сочетании с удалением прочносвязанного магния из частицы (или только удаление магния) приводит к полному разворачиванию нуклеомера в линейную форму -частицу 30 э. Удаление только гистона Н1 ке изменяет коэффициент седиментации частщы 37 s . Следовательно, присутствие гистона HI не является необходимым для поддержания нуклеомера в его "рыхлой" конформации и не определяет переход частицы в развернутую форму. Однако, присутствие гистона HI необходимо для компактиза-ции нуклеомера; удаление гистона HI из частицы 37s делает невозможным магний-зависимый переход в частицу 45s .

Таким образом, на изолированном мононуклеомере моделируются те же структурные переходы, которые реализуются на интактном волокне - фибрилле-20 нм. Роль ионов магния, гистона HI в определении этих конформационных состояний, а также отсутствие вклада негистоновых белков в возможность конформационных переходов показана так же И В других ратоотах ( Azorin et al., 1980, Hozier et al., 1977, Renz, 1979, Thoma, Koller, 1981, Vengerov , Popen-ko, 1977, Zentgraf et al., 1980 ) .

Эти экспериментальные данные не входят в противоречие с данными, полученными в работах, авторы которых обосновывают модель соленоидной укладки нуклеосомной фибриллы в "толстое" волокно. ( Finch,Klug, 1976, Thoma et al., 1979 ). Показано, что переход нуклеосомной фибриллы в "толстую" фибриллу опосредуется теми же факторами, что и компактизация нуклеомера из "рыхлой" формы, хотя характер укладки такой реконструированной фибриллы скорее регулярный соленоидный, чем дискретный, нуклеомерный. Мы показали, что конформационный переход нуклеомерной фибриллы в нуклеосомную в изолированных ядрах, наблюдаемый при переводе ядер из среды с магнием в среду без магния (20 мМ триэтаноламина), обратим, при этом, хотя бы частично, восстанавливается нуклеомерность. В то же время, обработка ядер ЭДТА с последующим добавлением магния приводит только к восстановлению диаметра фибриллы, но не к восстановлению ее нуклеомерности.

При анализе спектров кругового дихроизма и электронномикро-скопическом исследовании установлено, что нуклеомерная структура не восстанавливается при добавлении ионов магния после обработки ЭДТА и на препаратах выделенного хроматина (Венгеров,1979). По-видимому, явления такого же порядка наблюдаются при попытках реконструировать 20 нм - вое волокно из развернутой нуклеосомной цепочки. Данные работ, в которых показан соленоидный тип структуры фибриллы диаметром 20-25 нм, получены при изучении конденсации хроматина, предварительно обработанного ЭДТА, либо выделенного в растворах крайне низкой ионной силы в-отсутствие ионов магния. Во всех этих случаях хроматин либо приобретает конформацию типа "бусин-на-нитке", где отсутствует контакт между нуклеосомами,либо связь между нуклеосомами дестабилизируется, во всяком случае, по-видимому, нарушается структуризация спейсерной, межнуклеосомной ДНК. Деструктуризация спейсерных участков (неважно, чем она вызывается - удалением гистона Н1 или нарушением взаимодействия гисто-на Н1 или других спейсерных белков с нуклеосомой) может делать все спейсеры между нуклеосомами одинаковыми, равнозначными в структурном смысле. Дискретность фибриллы диаметром 20 нм, с другой стороны может (или должна) предполагать неравнозначность спейсеров между нуклеосомами, реализующуюся, в частности, в избирательной доступности одних из них к действию нуклеазы и большей защищенности других, что и может приводить к выщеплению нуклеомеров при мягких условиях гидролиза. Равномерное чередование доступных и менее доступных спейсеров вне зависимости от рода факторов, определяющих это чередование, и приводит к выщеплению мононуклеомеров и его мультимеров. Структурная равнозначность же всех спейсеров в развернутой нуклеосомной фибрилле хотя и не запрещает компактизации фибриллы, но такая компактизация будет запрограммированно регулярной

-130соленоидной, но не дискретной.

Не исключено, что принцип спиральной укладки нуклеосомной цепи реализуется на уровне отдельного нуклеомера. Данные, представленные в настоящей работе, о кооперативном характере компак-тизации нуклеомера могут быть объяснены нехаотическим расположением нуклеосом внутри нуклеомера, например, наличием двух витков спирали по четыре нуклеосомы в каждом. Таким образом, нуклеомер-ная организация может быть интерпретирована как сочетание спиральной укладки нуклеосомной цепи (внутри нуклеомера) с нарушением спиральности между нуклеомерами. Такая модель близка к предложенной в работе Ворсела модели минисоленоидов ( worcei, 1978 ).

В то же время, допущение резких структурных различий меж-нуклеомерных линкеров для объяснения разделения одного мононуклео-мера от другого в фибрилле может быть излишним. Показано, что в довольно узком интервале изменения ионной силы (45-55 мМ) на уровне цепочки нуклеосом с гистоном HI совершается резкий "скачок" в компактности, визуализирующийся в появлении в наднуклеосомной фибрилле нерегулярности, аналогичной супербидности. Дальнейшее повышение ионной силы приводит к появлению плотной монотонной спирали (Butter , Thomas, 198 0 ). Частицы, напоминающие супер-биды, выявляли электронномикроскопически и другие авторы при исследовании солезависимой компактизации развернутой нуклеосомной фибриллы как "метаетабиЛЬНОе" СОСТОЯНИе фибриллы (Hamkalo , Rat -ter , 1980, Thoma, Koller, 1981, Thoma et al., 1979 ). г

В целом, противоречия между нуклеомерной и соленоидной мо- ' делью определяются, во многом, различиями в подходе к исследованию и в изначальном различии в исследуемом материале. Дальнейший прогресс в постижении принципов наднуклеосомной организации хроматина требует, очевидно, новых подходов. В последнее время получены новые данные об отсутствии нарушения спиральной укладки нуклеосомной цепи во фрагментах хроматина, больших по размеру, чем мононуклеомер ( вауукз.п еь а1., 19о|" ). Эти данные, однако, не могут быть однозначно интерпретируемыми в пользу соленоидной модели укладки нуклеосомной цепи.

Как уже указывалось, резкое нарушение спиральности укладки нуклеосомной цепи может и не быть обязательным условием нуклео-мерности. Стабильность нуклеомера как единицы, выщепляемой из фиб-риллы-20 нм, может опосредоваться рядом факторов. Кроме того, характер фрагментации хроматина (выщепление частиц хроматина) и характер фрагментации выделенной из хроматина ДНК могут довольно сильно различаться. Так, например, динуклеосома, как единица фибриллы хроматина, при определенных условиях, выщепляемая преимущественно, выявляется только при анализе фрагментов хроматина. Анализ фрагментов ДНК, выделенных из гидролизата хроматина стафилококковой нуклеазой не приводит к заключению о наличии динуклеосом

НОСТИ ( КЬасЬа^1ап, et а1., 1979 ).

Нуклеомерность как принцип структурной организации хроматина, может возникать в процессе репликации ДНК и отражать либо ступенчатость синтеза молекулы ДНК (в частности, лигирование фрагментов Оказаки блоками), либо ступенчатость процесса формирования комплексов ДНК с белками хроматина.

Функциональное значение нуклеомерного уровня организации хроматина, по-видимому, не ограничивается только достижением дальнейшей компактизации ДНК в ядре. Можно допустить, что при этом достигается дополнительное ограничение операбильности ДНК в процессах репликации и реализации генетической информации. Нуклео-мерная упаковка нуклеосомной фибриллы делает возможным локальное изменение конформации хроматина, реализующееся, возможно, в клетке на начальных этапах активации генов. Такая локальная деком-пактизация нуклеомерной фибриллы может существенным образом изменять доступность ДНК в ней для взаимодействия с другими белками, в частности, для узнавания сайт-специфическими белками (например, ДНК-метилазами), могущими модулировать активность генов. Мы получили экспериментальные подтверждения этого предположения при исследовании характера метилирования ДНК в хроматине разных уровней организации бактериальными ДНК-метилазами.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Кирьянов, Глеб Иванович

ВЫВОДЫ

I.(^Открыт и детально исследован нуклеомерный уровень структурной организации хроматина. При ограниченном нуклеазном гидролизе фибрилла фрагментируется на субъединицы - мононуклеомеры и мультимеры. Нуклеомер представляет собой упорядочений уложен

П п' ный фрагмент нуклеосомной цепи из 8 нуклеосом. ■

2. Установлено, что нуклеомер может существовать в различных конформационных состояниях: компактном (45 s), деконденсиро-ванном (37 в) и полностью развернутом (30 s). Конформационные переходы опосредованы гистоном HI и ионами магния.

3. Разработан количественный метод оценки доступности ДНК в составе хроматина для сайт-специфического узнавания с помощью бактериальных ДНК-метилаз м.есо rii, м.есо dam.

4. Впервые показано, что нуклеомерная и нуклеосомная организации хроматина резко ограничивают возможность узнавания в нем ДНК: а) показано, что ДНК нуклеосомного кора полностью недоступна для сайт-специфического узнавания ДНК-метилазами, а доступность ДНК линкера варьирует в соответствии с уровнем организации фибрилл и минимальна у нуклеомера в его компактной конформации; б) с использованием разработанного метода выделения фракции активно транскрибирующегося хроматина показано, что эта фракция является главной мишенью для взаимодействия с глюкокортикоид-рецепторным комплексом, причем, установлено, что этот гормон-ре-цепторный комплекс связывается преимущественно с участками, максимально свободными от белка.

Предполагается, что нуклеосомная и, в еще большей степени, нуклеомерная организация хроматина блокированы для начальных специфических" этапов транскрипции.

5. Функциональная значимость определенного уровня компакти-зации хроматина исследована на клеточной модели - репликации ДНК в культуре клеток. Обнаружена тесная скоординированность процесса репликации ДНК, изменения доступности для узнавания ее последовательности ферментами в ходе репликативного метилирования и синтеза хроматина: а) открыт феномен физиологического блокирования лигирования фрагментов Оказаки при репликации ДНК в культуре животных и растительных клеток с большой плотностью клеток. Это позволяет в эксперименте разобщить два этапа репликации; б) открыты два дискретных этапа репликативного метилирования ДНК в культуре животных и растительных клеток. На первом - модифицируется ДНК фрагментов Оказаки (примерно половина всех имеющихся в ней сайтов), после чего фрагмент Оказаки входит в состав нуклеосомного кора. На втором, этапе метилируется ДНК линкерных участков (все сайты); в) установлено, что в культуре животных клеток второй этап метилирования блокируется эл-Ьа 5 а в клетках культуры табака ауксином (2,4-Д); г) сформулирована общая схема репликативного метилирования ДНК, включающая возможность существования двух ДНК-метилаз, реализующих разные этапы метилирования, различающихся по свойствам сайтовой специфичности действия и сопряженности с работой ДНК-полимера з; д) при использовании ингибитора синтеза белка показано, что взаимодействие ДНК-метилаз с ДНК в ходе репликации и характер метилирования вновь образующейся ДНК определяется не только сайтовой специфичностью ферментов, но и различной степенью экспонированности ДНК в формирующейся структуре хроматина.

6. Данные о принципах структурной и функциональной организации хроматина положены в основу гипотезы о механизме сопряжения изменений характера метилирования ДНК и возможности экспрессии определенного гена. Развито представление о трех функциональных состояниях гена (неактивном, активированном и активном). Переход гена из неактивного а активированное состояние может определяться избирательным недометилированием части сайтов при репликации, что детектируется гипотетическим СрС - узнающим белком, взаимодействие которого с линкерным участком хроматина запрещает формирование нуклеомерной структуры и дестабилизирует нуклеосомный кор. Таким образом, активированное состояние гена, характеризующееся резким повышением степени экспонированности его ДНК, делает его потенциально компетентным для взаимодействия и узнавания регуляторными белками аппарата транскрипции.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Кирьянов, Глеб Иванович, Москва

1. Башките Е.А., Александрушкина Н.И., Кирнос М.Д., Кирьянов Г.И., Ванюшин Б.Ф. 1980. Метилирование ДНК в суспензионной культуре клеток табака при обработке фитогормонами. - Биологические науки, № 4, с. 1.3-II0.

2. Бурьянов Я.И., Ерошина Н.В., Вагабова JI.M., Ильин A.B. 1972. О нахождении 6-метиламинопурина в ДНК пыльцы высших растений. Докл. АН СССР, т.206, с. 992-994.

3. Бурьянов Я.И., Андреев Л.В., Ерошина Н.В., Корсунский О.Ф. 1974. О возможности присутствия в ДНК редких дезаминированных азотистых оснований. Биохимия, т. 39, с. 31-38.

4. Ванюшин Б.Ф., Белозерский А.Н. 1959. Нуклеотидный состав ДНК высших растений. Докл. АН СССР, т. 129, с. 944-946.

5. Ванюшин Б.Ф. 1964. Определение нуклеотидного состава нуклеиновых кислот. В кн. Современные методы в биохимии М., Медицина.

6. Ванюшин Б.Ф., Кадырова Д.Х., Каримов Х.Х., Белозерский А.Н. 1971. Минорные основания в ДНК высших растений. Биохимия, т. 36, с. I25I-I258.

7. Ванюшин Б.Ф. 1874. Метилирование ДНК в клетках различных организмов. Усп. совр. биол., т.77, с. 68-90.

8. Васильев В.К. 1971. Определение нуклеотидного состава ДНК с помошью тонкослойной хроматографии на ДЭАЭ-целлкшозе. Биологические науки, 9, с. 323-327.

9. Венгеров Ю.Ю., Попенко В.И., Тихоненко A.C. 1977. Структурная организация нитей хроматина толщиной 100-200$. . ДАН СССР,т.232 с. 1442-1444.

10. Венгеров Ю.Ю. 1979. Электронномикроскопическое исследование структуры хроматина в растворе. Канд. дисс.

11. Дохием M., Сулимова Г.Е., Ванюшин Б.Ф. 1978. Нуклеотидный состав и пиримидиновый олигонуклеотиды в ДНК некоторых высших растений. Вестник МГУ, Биология, т. 1с. 70-74.

12. Дрожденюк А.П., Сулимова Г.Е., Ванюшин Б.Ф. 1977 . Содержание 5-метилцитозина в разных классах повторяющихся последовательностей ДНК некоторых высших растений. Биохимия, т. 42, с. 1439 -1444.

13. Иткес A.B., Глотов Б.О., Николаев Л.Г., Прээм, Северие Е.С. 1979. Повторяющиеся олигонуклеосомные блоки. Новый элемент структуры хроматина. ДАН СССР. т. 249, с. 739-743.

14. Кирнос М.Д., Алексанцрушкина Н.И.,Ванюшин Б.Ф. 1981. 5-метилцитозин в пиримидиновых последовательностей ДНК растении и животных: специфичность метилирования. Биохимия, т. 46,с. 1458-1474.

15. Е5. Кирьянов Г.И., Ванюшин Б.Ф., Кудряшова И.Б., 1971. ДНК метила-за зародышей вьюна Misqumus fossiiis • - Докл.

16. АН СССР, т. 200, с. 729-732.

17. Е6. Кирьянов Г.И., Романов Г.А., Ванюшин Б.Ф. 1974. Внутригеномное распределение 5 метилвдтозина в ДНК некоторых эукариотов. -Докл. АН СССР, т. 219, с. 1007-1009.

18. Е7. Кирьянов Г.И., Исаева Л.В., Кирнос М.Д., Ганичева Н.И., Ванюшин Б.Ф. 1982. Репликативное метилирование ДНК в I клетках действие s- изобутиладенозина и циклогексимида и возможное существование двух ДНК - метилаз. - Биохимия, т. 47, с. I53-I6I.

19. Нестеренко В.Ф., Бурьянов Я.И., Баев A.A. 1979. Выделение и свойства ДНК цнтозинметилазы ИЗ Escherichia coli MEE 600. - Биохимия, т. 44, с. I30-141.

20. Пахомова М.В., Зайцева Г.Н., Белозерский А.Н. 1968. Наличие5 метилцитозина и 6 - метиламинопурина в составе ДНК некоторых водорослей. - Докл. АН СССР, т. 182, с. 712-716.

21. Перепеленко С.Д., Бурьянов Я.И., Баев A.A. 1980. Особенности метилирования бактериальными ДНК метилазами эукариотных ДНК, содержащих различное количество 5 - метилцитозина. - ДАН СССР, т.250, с. 1480-1483.

22. Поляков В.Ю., Кирьянов Г.И., Манамшьян Т.А., Файс Д., Ченцов Ю.С. 1979. Ультраструктура фибрилл ДНП и интерхроматиновых гранул в изолированных ядрах печени крысы. Цитология, т. 21, с. 514-519.

23. Романов Г.А., Ванюшин Б.Ф. 1981. I. Метилирование ДНК у эукариот. П.Биологическое значение. Биологические науки, № I, с. 5-13.

24. Спирин A.C. 1958. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот. Биохимия т. 23, с. 656-662.

25. Сулимова Г.Е., Мазин А.Л., Ванюшин Б.Ф., Белозерский А.Н. 1970. Содержание 5 метилцитозина в различных по составу Г^ахцтях ДНК высших растений. - Докл. АН СССР, т. 193, с. 1422-1425.

26. Уманский С.Р., Король Б.А., Нелипович П.А. 1981. Деградация ДНК in vivo в гибнущих тимоцитах модель для изучения структуры хроматина. - Мол. биол. т. 15 с. I028-1039.

27. Харченко Е.П., Колесникова ЕЛО., Мюльберг A.A.,Тищенко Л.Н., Федотова Е.А. 1979. Исследование гетерогенности эндонуклеазных фрагментов хроматина электрофорезом в свободном потоке. Биохимия, т. 44, с. I427-1435.

28. Ченцов Ю.С. 1971. Данные электронной микроскопии и строениихромосом. сб. "Успехи современной генетики" М. "Наука? с. 56-75.

29. Adams R.L.P. and Hogarth C. 1973, DNA methylation in isolated nuclei*, old and new DNAs are methylated. Bioohem.,

30. Biophys. Acta, v.331, p.214-218.

31. Adams R.L.P. 1973. Delayed methylation of DNA in developingsea urchin embryos.- Nature new Biol., v.244, p.27-29.

32. Adams R.L.P., 1974. New synthesised DNA is not methylation.

33. Biochem. Biophys. Acta, v.335, p.365-373.

34. Adams R.L.P., McKay E.L., Craig L.M., Burdon R.H., 1979.

35. Methylation of Mosquito DNA.- Biochem. Biophys. Acta, v.563, p.72-81.

36. Adams R.L.P., McKay E.L., Craic L.M. a. Burdon R.H., 1979,

37. Mouse DNA methylase: Methylation of native DNA.- Biochem. Biophys. Acta, v.561, p.345-357.

38. Agutter P.S., 1972. The isolation of the envelopes of ratliver nuclei.- Biochim. et Biophys. Acta, v.255, N 1, p.397-401.

39. Alberga A., Tran A., Baulieu E.E., 1980. Distribution ofestradiol receptor and vitellogenin gene in chick liver chromatin fractions.- Nucl. Acids Res., v.5, p.2031-2044.

40. Alberts Gr., Worcel A., Weintraub H., 1977. On the biologicalimplication of chromatin structure. In Bradbury E.M. and Javaherian K. (ed.) The organization and expression of the eukaryotic genome.-Academic Press Inc., New York, p.165-191.

41. Albright S.C., Wiseman J.H., Lang R.A., a. Garrard W.T. 1980.

42. Subunit structure of different electrophoretic forms of nucleosomes.- J. Biol. Chem., v.255, p.3673-3680.

43. Amin Mirza M. a J.M. Weber, 1981. Structure of adenoviruschromatin as probed with restriction endonucleases.-Virology, v.108, p.351-360.

44. Anderson S., Kaufman G., De Pamphilis M.L., 1977. RNA primersin SV40 DNA replication: identification of transient RNA-DNA covalent linkages in replicating DNA.- Biochemistry, V.16, p.4990-4998.

45. Anderson S., De Pamphilis M.L., 1979. Metabolism of Okazakifragments during SV40 DNA replication.- J. Biol. Chem., v.254, p.11495-11504.

46. Annunziato A.T., Seale R.L., 1982. Maturation of nucleosomaland nonnucleosomal components of nascent chromatin: differential requirements for concurrent protein synthesis.-Biochemistry, v.21, p.5431-5438.

47. Arfmann H.-A., Haese E., a. Schröter H., 1981. High mobilitygroup protein from CHO cells and their modification during cell cycle.- Biochim. Biophys. Res. Commun., v.101, p.137-143.

48. Auer B., Ghuthert U., Wagner E.F. a. Schweiger M., 1979»1. the DNA of Virus T7 methylated.- J. Gen. Virol., v.44, p.609-613.

49. Azorin P., Pörez-Grau L., Subirana J.A. 1980. Supranucleosomalorganization of chromatin.- Chromosoma 85» N 2, p.251-260.

50. Baer B.W. a. Homberg R.D., 1979. Random location of nucleosomes on genes for 5S rRNA.- J. Biol. Chem., v.254, p. p.9678-9681.

51. Bavykin S.G., Karpov V.L., Preobrazhenskaya O.V., Belyavsky

52. Bellard M., Gannon P., Chambon P., 1978. Nucieosome structureof the chromatin containing the ovalbumin and globin genes in chick oviduct nuclei.- Cold Spring Harbor Symp. on Quant. Biol., v.42, p.779-791.

53. Bellard M., Kuo M.T., Dretxen G. a. Chambon P., 1980. Differential nuclease sensitivity of the ovalbumin and /?glo-bin regions in erythrocytes and oviduct cells of laying hen.- Nucl. Acids Res. 8, p.2737-2750.

54. Berkowitz E.M., Doty P., 1975. Chemical and physical preperties of fractionated chromatin.- Proc. Natl, Acad. Sci. USA, v.72, p.3328-3332.

55. Berkowitz E.M. a. Riggs E.A., 1981. Characterization of ratliver oligonucleosomes enriched in transcriptionally active genes: evidence for altered base composition and a shortened nucieosome repeat.- Biochemistry, v.20, p.7284--7290.

56. Bird A.P., 1978. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: II The symmetry of methylated sites supports semi-conservative copying of the methylation pattern.- J. Mol. Biol., v.118, p.49-60.

57. Bird A.P., 1980. DNA methylation and the frequency of CpG inanimal DNA.- Nucl. Acids Res., v.8, p.1499-1504.

58. Bird A.P. a. Taggart M.H., 1980, Variable patterns of total

59. DHA and rDNA methylation in animal.- Hucl. Acids. Res. v.8, p.1485-1497.

60. Bird A.P., Taggart M.H. a. Ch.A. Gehring, 1981. Methylatedand ummethylated ribosomal RNA genes in the Mouse.- J. Mol. Biol. v.152, p.1-17.

61. Bloom K.S., Anderson J.N., 1978. Fractionation of hen oviductchromatin into transcriptionally active and inactive regions after selective micrococcal nuclease digestion.- Cell v. 15,P. 141-150.

62. Bloom K.S., a. Anderson J.N., 1979. Conformation of ovalbuminand globin genes in chromatin during differential gene expression.- J. Biochem., v.254, p. Ю533-Ю539.

63. Bode J., Henco K. a. Wingender E., 1980. Modulation of thenucleosome structure by histone acetylation.- Eur. J. Biochem. , v.110, p.143-152.

64. Boehm T.L.J, a. D.Drahavsky , 1979. Effect of carcinogen ethionine on enzymatic methylation of DNA sequences with various degress of repetitiveness.- Eur. J. Cancer, v.15» p.1167--1173.

65. Boehm T.L.J, a. Drehovsky D., 1979. Distribution and enzymatichypermethylation of inverted DNA repeats in different murine and human cells.- Z. Haturforsch., v.340, p.558-564.

66. Bohen L., Hutt T.-Y., a M.W. Gray., 1980. Can partial methylation explain the complex fragment patterns observed when plant mitochondrial DHA is cleaved endonucleases.- FEBS1.t., v. 111, p.340-346.

67. Bokaer J., Dahmus M.E., Fambrough D., Huang R.C., Marushige

68. K., (Euan D.V.N., 1968. The biology pf isolated chromatin, Science, v.159, p.47-68.

69. Boulikas T., Wiseman J.M., Garrard W.T., 1980. Points ofcontact between histone H1 and the histone octamer.- Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.77, p.127-131.

70. Browne M.J., A.C.B. Cato, R.H. Burdon, 1978. The distribution of modified and non-modified C-6 doublets in BHK-21 cell DNA.- FEBS Let., v.91, p.69-73.

71. Brun G., Weissback A., 1978. Initiation of HeLa cell DNAsynthesis in a subnuclear system.- Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v. 75, p.5931-5935.

72. Burdon R.M. and Dowlas S.T., 1974. The influence of subcellular fraction on the enzymatic methylation of DNA in ascites cell nuclei.- Nucleic Acids Res., v.1, p.97-103.

73. Burton K., 1956. A study of the conditions and mechanism ofthe diphenylamine reaction for the colorimetric estimation of deoxyribonucleic acid.- Biochem. J. v.62, p.315--326.

74. Burton W.G., Grabowy C.T. a. Sager R., 1979. Role of methylation in the modification and restriction of chloroplast DNA in Chlamidomonas.- Proc. Nat, Acad. Sci. USA, v.76, p.1390-1394

75. Busting., 1978. Binding of E.coli polymerase to chromatinsubunits.- Nucl. Acids Res., v.5, p.925-932.

76. Butler P.J.G., Thomas J.O., 1980. Changes in chromatin folding dja solution.- J. Mol. Biol., v. 140, N 4, p.505-529.

77. Butt T.R., Jump D.B., SmulsonM.E., 1979. Nucleosome periodicity in HeLa oell chromatin, as probed by micrococcal nuclease.- Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v.76, N 4, p.1628-1632.

78. Cagierini-Otero R.D., Pelsenfeld G., 1977. Supercoiling energyand nucleosome formation the role of arginine-rich histone kernel.- Nucl. Acids Res. v.4, p.1159-1181.

79. Camerini-Otero R.D., a. Zasloff M.A., 1980. Nucleosomal packaging of the thymidine kinase gene of herpes simplex virus transferred into mouse cells: an actively expressed single-copy gene.- Proc. Natl. Acad. Sci, v.17, p.5079-5083.

80. Cartwright I.L., Abmayr S.M., Fleischmann G., Lowenhaupt K.,

81. Elgin S.C.R., Keene M.A., 1982. Chromatin structure and gene activity: the role of nonhistone chromosomal proteins.-CRC Critical Reviews in Biochemistry, v.13, p.1-86.

82. Cato A.C.B. a. Burdon R.H., 1979, Mammalian DNA methylationand a nuclear S-adenosyl-L-methionine-dependent nuclease activity.- PEBS Let., v.99, p.33-38.

83. Cedar H., Solage A., Glaser G., Razin A., 1979. Direct detection of methylated cytosine in DNA "by use of the restriction enzyme Mspl.- Nucl. Acids Res., v.6, p.2125-2132.

84. Cedar H., Pelsenfeld G., 1973. Transcription of chromatinin vitro.- J. Mol. Biol. v.77, p.237-254.

85. Chambon P., 1978. The molecular biology of the eukaryoticgenome is coming of age.- Cold Spring Harbor-Symposium on Quant. Biol., v.42, p.1208-1214.

86. Chao H.V., Gralla J.D. a. H.G. Martison, 1980a. Lac operator nucleosomes. 1. repressor binds specifically to operator within the nucleosome core.- Biochemistry, v.19, p.3254-3259.

87. Chao M.V., Martinson H.G., a. J.D. Gralla, 1980b. Lac operator nucleosomes. 1. lac nucleosomes can change conformation to strengthen binding by lac repressor.- Biochemistry, v.19» p.3260-3269.

88. Christensen M.E., a G.D. Dixon, 1981. Comparison of the Highmobility group proteins and their chromatin distribution in trout testis and liver.- J. Biol. Chem., v.256, P.7549-7556.

89. Christman J.K., Price P., Pedrinan L. a. Acs G., 1977. Correlation between hypomethylation of DNA and expression of globin genes in i'riend erythroleukemia cells.- Eur. J. Biochem. v.81, p.53-61.

90. Climent P., Doenecke D., Beato M., 1977. Properties of thepartially purified activated glucocorticoid receptor of rat liver binding to chromatin subunits.- Biochemistry, v.16, p.4694-4699.

91. Cohen J.C., 1980. Methylation of milk-borne and geneticallytransmitted mouse mammary tumor virus proviral DNA.-Cell, v.19, p.653-662.

92. Colquhoun W.R., Holmes D.S., 1980. Structure of the chromosomal material in inactive nuclei of chicken red blood cells.- Chromosoma,v79, p.159-167.

93. Comb D.G., 1965. Methylation of nucleic acids during seaurchin embryo development.- J. Mol. Biol. v.11, p.851--855.

94. Constantinides P.G., Jones P.A. a. W.Gevers, 1977. Functional striated muscle cells from non-myoblast precursorsfollowing S-azacytidine treatment.- Nature, v.267» p.364--366.

95. Constantinides P.G., Taylor S.M., a. Jones P.A., 1979.

96. Phenotypic conversion of culture mouse embryo cells by aza pyrimidine nucleosides.- Dev. Biol., v.66, p.37-71.

97. Couloudre C., 1978. Molecular basis of base substitutionhotspots in E.coli.- Nature, v.274, p.5673.

98. Cox R., Prescott P. and Irving C.C., 1977. The effect of

99. S-adenosulhomocystein on DNA methylation in isolated rat liver unclei.- Biochem. Biophys. Acta, v.474, p.493-499.

100. Cremisi C., Pignatti P.P., Croissant 0., a. Yaniv I., 1976.

101. Chromatin-like structure in polyoma virus and simian virus 40 lytic cycle.- J. Virol, v.17, p.204-211.

102. Cremisi C., 1979. Chromatin replication revealed by studiesof animal cells and Papova-viruses (Simian virus 40 and Polyoma virus).- Microbiological Reviews, v.43, p.297-310.

103. Creusot P. and J.K. Christman, 1981. Localization of DNAmethyltransferase in the chromatin of Friend erythroleu-kemia cells.- Nucl. Acids Res., v.9, p.5359-5381.

104. Culard P. a. J.C. Maurizot , 1981. Lac repressor.lac operator interaction. Circular dichoism study.- Nucl. Acids Res., v.9, p.5175-5184.

105. De Pamphilis M.L., Wasserman P.M., 1980. Replication of eukaryotic chromosomes: a close-up of the replication fork.-Ann. Rev. Biochem., v.49, p.627-666.

106. Davie J.R., a. G.A. Saunders, 1981. Chemical composition ofnucleosomes among domain of coif thymus chromatin differing in : micrococal nuclease accessibility and solubility properties.- J. Biochem. v.256, N 23, p.12574-12580.

107. Desrosiers R.C., Mulder C. a. Fleckenstein B. 1979.

108. Methylation of herpesvirus saimiri DNA in lymphoid tumor cell lines.- Proc. Nat. Acad. Soi. USA, v.76, p.3839-3843.

109. Desrosiers R.C., 1982. Specifically unmethylated cytidylieguanylate sites in Herpes virus saimiri in Eumor cells.-J. Virol., v.43, p.427-435.

110. Dieterich A.E., Axel R., Cantor C.R., 1979. Salt-inducedstructural changes of nucleosome core particles.- J. Mol. Biol. v.129, p.587-602.

111. Doenecke D., 1977. Binding of polylysine to chromatin subunits and cleavage by micrococcal nuclease.- Eur. J. Biochem., v.76, p.355-363.

112. Doenecke D., 1977. Ethidium bromide (EB) bindings to nucleosomal DNA. Effect on DNA cleavage patterns.- Exp. Cell. Res. v.109» p.309-315.

113. Doskocil J. and Sorm P., 1962. Distribution of 5-methylcytosine in pyrimidine sequences of deoxyribonucleic acids.-Biochem. Biophys. Acta, v.55, p.953-959.

114. Drahovsky D., Kaul S., Boehm T.L.J, a. A.Wacker, 1980. Enzymatic hypermethylation of DNA in mouse-mouse somatic cell hybrids.- Biochim. Biophys. Acta, v.607, p.201-205.

115. Drahovsky D., Boehm T.L.S., Kaul S. a. Wacker A., 1981,

116. The persistence of chromosomes in somatic cell hybrids correlates with the enzymatic hypermethylation of their DNA.- Int. J. Biochem., v.13, p.565-570.

117. Du Praw E.J., 1965. Macromolecular organization of nucleiand chromosomes. A folded fibre model on whole-mount electron microscopy.- Nature 206, N 4982, p.338-345.

118. Du Praw E.J., 1973. Quantitative constraints in arrangement ofhuman DNA.- Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol .v. 38, p. 87-98.

119. Eastman E.M., Goodman R.M., Erlanger B.F., Miller O.J., 1980.

120. Chromosoma, v.79, p.225-239.

121. Eden P.O., Musti A.M. a. D.A. Sobieski, 1981. Clusters ofepeated equences of chioken DNA are extensively methylated but contain specific undermethylated region.- J. Mol. Biol., v.148, p.129-151.

122. Edenberg H.G., Huberman G.A., 1975. Eukaryotic chromosomereplication.- Annu. Rev. Genet., v.9, p.245-284.

123. Egan P.A. a. B. Levy-Wilson, 1981. Structure of transcriptionally active and inactive nucleosomes from butyrate-treated and control HeLa cells.- Biochemistry, v.20, p.3695-3702.

124. Ehrlich M., Wang Y.H., 1981, 5-methylcytosine in eukaryotic

125. DNA, Science, v.212, p.1350-1357.

126. Eliasson R., Reichard P., 1979. Replication of polyoma DNAin isolated nuclei. VII. Initiator RNA synthesis during nucleotide depletion.- J. Mol. Biol., v.129, p.393-409.

127. Pais D., Prusov A.H., Polyakov V.Yu., 1982. Cell Biology Int.1. Reports, v.6, p.433-441.1976.

128. Pinch J.T., Klug A. Solenoidal model for superstructure inchromatin.- Proc. Natl.,Acad. Sci. USA, v.73, N 6, p.1897-1901.

129. Poe V.E., L.E. Wilkinson, C.D. Laird, 1976. Comparativeorganization of active transcription units in Oncopeltus fasciatus.- Cell, v.9, p.131-136.

130. Pranke W.W., U.Scheer, M.P. Trendelenberg, H. Spring, H.

131. Zentgraf. . 1976. Absence of nucleosomes in transcriptionally active chromatin Cytobiologie, v.13, p.401-434.

132. Pranke W.W., U. Scheer, 1978. Morphology of transcriptional units on different states of activity.- Phil.Trans. R. Soc. Lond. v.283, p.333-342.

133. Pranke W.W., U. Scheer, H. Spring, M.E. Trendelenberg,

134. G. Bohne, 1978. Morphology of transcriptional units of rDNA: Evidence for transcription in apparent spacer intercepts and cleavages in the elongating nascent RNA.- Exp. Cell Res. p.233-244.

135. Gabrielli F., Hancock R. a. A.J. Faber, 1981. Characterization of a chromatin fraction bearing pulse-labelled RNA. 2. Quantification of histones and h.igh-mobility-group Proteins.- Eur. J. Biochem., v.120, p.363-369.

136. Galili G., Levy A., Jakob K.M., 1983. Changes In chromatinstructure at the replication fork.- J. Biol. Chem., v.258, p.11274-11279.

137. Galili G., Levy A., Jakob K.M., 1981. Changes in chromatinstructure at the replication fork. The DNPs containing nascent DNA and a transient chromatin modification detection by DNA ase I.- Nucl. Acids. Res., v.9, p.3901-4005.

138. Garel A., Axel R., 1976. Selective digestion of transcriptionally active ovalbumin genes from oviduct nuclei.- Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.73, N 11, p.3966-3970.

139. Garel A., Zolan M., Axel R., 1977. Genes transcribed athci sdiverse rates a similar conformation in chromatin.- Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v.74, p.4867-4871.

140. Gazit B., Panet A. a. Cedar H., 1980. Reconstitution of adeoxyribonuclease I-sensitive structure on active genes.-Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v.77, p.1787-1790.

141. Gazit B. à H.Cedar, 1980. Nuclease sensitivity of activechromatin.- Nucl. acids Res.8, p. 5143-5155.

142. Genest D., Sabeur G., ffahl P. a. J.-C. Auchet, 1981.

143. Georgieva E.J., Pashev J.G. a. R.G. Tsanev, 1981. Distribution of high mobility group and other acid-soluble protein in fractionated chromatin.- Biochim. Biophys. Acta, v.652, p.240-244.

144. Georgieva B.J., Pashev J.G., a. R.G. Tsanev, 1982. Distribution of acetylated forms of nucleosomal histones in fractionated chromatin.- Arch. Biochim. Biophys. v.216, p.88-92.

145. Gerari D., Eremenko T., Coechiara R., Granieri A., Scarano

146. E., and Volpe P., 1974. Correlation between synthesis and methylation on DNA in HeLa cells.- Biochim. Biophys., Res. Comm., v.57, p.353-359.

147. Goeddel D.V., Jansura D.G. a. Caruthers. M.H., 1978. How lacoperator.- Proc. Nat. Acad.Sci. USA, v.75, p.3578-3583.

148. Gold M., Hurwitz J., 1963. The enzymatic methylation ofthe nucleic acids.- Cold, Spring, Harbor Symp. Quant.Biol., 1963, v.28, p.149-156.

149. Goodwin G., Woodhead L. a. E. Johns, 1977. The presence ofhigh mobility group non-hist>one chromatin proteins in isolated nucleosomes.- FEBS Lett., v.73, p.85-88.

150. Goodwin G.H., Walker J.N., John E.W., 1978. The high mobility group (HMG) nonhistone chromosomal proteins. The cell nucleus ed. H. Busch.- Acad. Press. New York, v.6, p.182--217.

151. Gordon J.S., Rosenfeld B.I., Kaufman R., Williams D.L.,1980.

152. Evidence for a quantitative tissue-specific distribution of the high mobility group chromosomal proteins.- Biochemistry, v.19, p. 4395-4402.

153. Gottesfeld J,M. a. L.S. Bloomer, 1980, Nonrandom alignmentof nucleosomes on 5S KNA genes of X.laevis.- Cell, v.21, p.751-760.

154. Gould H.J., Cowling G.J., Harborne N.R. and J. Allan, 1980.

155. An examination of models for chromatin transcription.-Nucl. Acids Res., v.8, p.5255-5266.

156. Green H. a. Kehincd.e 0., 1974. Sublines of mouse 3T3 oellsthat accumulate lipid.- Cell, v.1, p.113-116.

157. Grippo L., Jaecarino P., Parisi E. a. Scarano E., 1968.

158. Methylation of DNA in developing sea urchin embryo.- J.Mol. Biol., v.36, p.195-208.

159. Guseinov V.A., Kiryanov G.J., Vanyushin B.F., 1975. Intragenome distribution of 5-methylcytosine ia, DNA of healthyand wilt-infected cotton plants.- Mol, Biol. Reports,v, 2, p.59-63.

160. Hamkalo B.A., Rattner J.B., 1980. VI Folding up genes andchromosomes.- The Quartenary Review of Biology, v.55, p.409-417.

161. Hancock R.L., Forrester P.J., Lorshaider F.L., Lai P.C.Y/. a.

162. Hay D.M., 1976. Ethionine-induced activation of embryonic genes. In: Oncodevelopmental gene Expression. (Ed. W.H. Fishman a. S. Selt). Acad. Press New York, p.247.

163. Hemminki K. a. Vanjikohen M., 1977. Distribution of estrogenreceptors in hen oviduct chromatin fractions in thecourse of DNAase II digestion.- Biochem Biophys. Acta, v.474, p.109-116.

164. Herman T.M., De Pamphilis M.L., Wasserman P.M., 1981.

165. Structure of chromatin at deoxyribonucleic aoid replication forks: location of the first nucleosomes on newly synthesized simian Virus 40 deoxyribonucleic acid,- Biochemistry, v.20, p.621-630.

166. Hewish D.R., 1976. DNA replication in eukaryotes;a modelfor the specific iruvolvement of chromatin subunits.-Nucl. Acids Res., v.3, p.415-421.

167. Hildebrand C.E., Walters R.A., 1976. Rapid assembly of newlysynthesized DNA into chromatin subunits prior to joining of small DNA replication intermediates.- Biochem. Biophys. Res. Com., v.73, p.157-165.

168. Holliday R., 1980. Possible relationships between DNA damage,

169. DNA modification and carcinogenesis.- in Progress in Environmental Mutagenesis, p.93-100.

170. Holliday R. a. Pugh J.E. 1975. DNA modification mechanismsand gene activity during development.- Science, v.187, p.226-232.

171. HÖrz W., Igo-Kemenes T., Pfeiffer W., zachau H.G., 1976.

172. Specific cleavage of chromatin by restriction nucleases.-Nucleic, Acids. Res. v.3, N 11, p.3213-3226.

173. HÖrz W. a. W.Altenburger, 1981. Sequence specific cleavageof DNA by micrococcal nuclease.- Nucl. Acids. Res., v.9, p.2643-2658.

174. Hozier John, Renz, Manfred, Nehls Peter, 1977. The chromosome fiber: evidence for an ordered superstructure of nucleosomes.- Chromosoma 62, p.301-317.

175. Igo-Kemenes T., Omori A. a. Zachau H.G., 1980. Non-randomarrangement of nucleosomes in satellite I containing chromatin of rat liver.- Nucl. Acids Res. v.8, p.5377--5341.

176. Isackson P.J., Fishback J.L., Bidney D.L. a. Reeck G.R. ,1979.

177. Prefential affinity of high molecular weight high mobility group non-histone chromatin proteins for single-stranded DNA.- J. Biol. Chem., v.254, p.5569-5576.

178. Itkes A.V., Glotov B.O., Nikolaev L.G. a. E.S. Severin,1980.

179. Clusters of nonhistone chromosomal protein HMG 1 molecules in intact chromatin.- FEBS Letters, v.118, p.63-66.

180. Jack P.L. a. P.Brookes, 1981, The distribution of benzo(a)pyrene DNA adducts in mammalian chromatin.- Nucl. acids. Res. v.9, p.5533-5551.

181. Jakobovits E.B., Bratosin S. a. Aboni G., 1980. A nucleosome-free region in SV40 minichromosomes.- Nature, v.285, p.263-265.

182. Javaherian K., Lice L.F., Wang J.C., 1978. Nonhistone proteins HMG1 and HMG2 change the DNA helical structure.-Science v.199, p.1345-1346.

183. Jerzmanowski A., Staron K., Tyniec B. a. K.Toczko, 1978.

184. Effect of ethidium bromide on the digestion of chromatin DNA with micrococcal nuclease.- Biochim. Biophys. Acta, v.521, p.493-501.

185. Jones P.A. and Taylor S.M., 1980. Cellular differentiationcytidine analogs and DNA methylation.- Cell, v.20, p.85--93.

186. Jones P.A. a. S.M. Taylor, 1981. Hemimethylated duplex

187. DNAs preparaded from 5-azacytidine-treated cells.- Nucl. Acids Res., v.9, p.2933-2947.

188. Josse J., Kaiser A.D., Kornberg A., 1961. Enzymatic synthesisof deoxyribonucleic acid. VIII. Frequencies of nearest neighbor base sequences in deoxyribonucleic acid.- J. Biol. Chera., v.236, p.864-875.

189. Jurovik M.K., Raska Jr., Sorm P., Sormova Z., 1965. Anabolictransformations of the new antimetabolite 5-azacytidine and its incorporation into RNA.- Collect. Czech. Chem. Commun., v.30, p.3370-3376.

190. Kallos J., Pasy T.M., Hollander V.P.H., 1981. Assessment ofestrogen receptor-histone interactions.- Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v.78, p.2874-2878.

191. Khachatrian A.T., Pospelov V.A., Svetlikova S.B., Vorob'ev

192. V.J., 1981. Nucleodisome- a new repeat unit of chromatin revealed in nuclei of pigeon erythrocytes by LNase I digestion.- PEBS Lett., v.128, p.90

193. Kaput J. a. T.W. Sneider, 1979. Methylation of somatic VSgerm cell DNAs analyzed by restriction endonuclease digestion.- Nucl. Acids Res. v.8, p.2303-2322.

194. Kierszenbaum A.L., Très L.L., 1975. Structural and transcriptional areas of the mouse spermatid genome.- J. Cell Biol., v. 60, p.258-270.

195. Kierszenbaum A.L., Très L.L., 1978. RNA transcription andchromatin structure during meiotic and postmeiotic stages of spermatogenesis.- Red. Proc.v37, p.2512-1516.

196. Klempnauer K.H., Panning E., Otto B., Knippers R., 1980.

197. Maturation of newly replicated chromatin of Simian Virus 40 and its host cell.- J. Mol. Biol., v.136, p.359-374.

198. Kuehl L., 1979. Synthesis of high mobility group proteinsin regenerating rat liver.- J. Biol. Chem., v.254, p.7276--7281.

199. Kuehn G.D., Affolter H.-U., Atmar V.J., Seebeck T., Gubler

200. U. a. Brown R., 1979. Polyamine-mediated phosphorylation of a nuclear protein from p>hysarum polycephalun that stimulates rRNA synthesis.- Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v.76, p.2541-2545.

201. Kuo M.T., 1976. Sahasrabuddhe C.G., Saunders G.P., 1976.

202. Presence of messenger specifying sequences in the DNA of chromatin sub-units.- Proc. Nat.Acad.Sci.USA, v.73, N 5, p.1572-1575.

203. Kuo M.T., Mandel J.L. a. P.Chambon, 1979, DNA methylation:correlation with DNAse I' sensitivity of chicken ovalbumin chromatin.- Nuol. Acids Res., v.7, p.2105-2113.

204. Lacy E., Axel R., 1975. Analysis of DNA of isolated chromatin subunits.- Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v.72, N 10, p.3978-3982.

205. Laird C.D., Wilkinson C.E., Poe, Chooi W.G., 1976. Analysisof chromatin-associated fiber arrays.- Chromosome, v.58, p.169-192.

206. Laird C.D., Chooi, 1976. Morphology of transcription unitsin Drosophila melanogpster.- Chromosome, v. 58, p.193-199.^

207. Laird Ch.D., L.E.Wilson, V.E. Poe, W.J. Chooi, 1976. Analysis of chromatin-associated fiber ar»rays.- Chromosome, v.58, p.169-192.

208. Lamb M.M., Daneholt B., 1979. Characterization of activetranscription of units in Balbiani rings of chironomus tentants, Cell, v.17, p.835-848.

209. Langmore J.P., Wooley J.C., 1975. Chromatin architecture:investigation of a subunit of chromatin by dark field electron microscopy,- Proc. Nat. Acad. Sci, USA, v.72, N 7, p.2691-2695.

210. Leibovitch S.A., Guiller M. a. J.Harel, 1981. Accessibilityof some regions of chromatin of leukemic chicken cells to single strand nuclease S^.- Biochem. Biophys. Res. Commun. v. 101, p. 719-726.

211. Levy A., Jakob K.M., 1978. Nascent DNA in nucleosome-like structures from chromatin.- Cell, v.14, p.259-267.

212. Levy W.B., Wong N.C.W., Watson D.C., Peters E.H., a. Dixon

213. Levy A. a, M.Noll, 1981, Chromatin fine structure of activeand repressed genes.- Nature 289, p.198-203.

214. Levy W.B., Dixon G.H., 1978. A study of the localization ofhigh mobility group proteins in chromatin,- Can,J.Biochem,, v.56, p,480-491•

215. Levy A. a. M. Noll, 1980. Multiple phases of nucleosomes Inthe hsp 70 genes of Drosophila melangaster.- Nucl. Acids, Res., v.8, p.6059-6079.

216. Levy-Wilson B., Gjerset R.A., McCarthy B.J., 1977. Acetylation and phosphorylation of Drosophila histones.- Biochim. Biophys. Acta, v.475, p.168-175.

217. Lilley D.M.J., Jacobs M.F., a. M.Houghton, 1979. The natureof the interaction of nucleosomes with a eukaryotic RNA polymerase II.- Nucl. Acids Res. v.7, p.377-399.

218. Louis C., Schedl P., Samal B., a. Worcel., 1980. Chromatinstructure of the 5sRNA genes of D. melangaster.- Cell, v.22, p.387-393.

219. Lowry O.H., Rosenbrough N.G., Farr A.L., Randall R.J., 1951.

220. Protein measurement with the folin phenol reagent.- J. Biol. Chem.v193, p.265-275.

221. Mandel J.L. a. Chambon P., 1979. DNA methylation: organ specific variations in the methylation pattern within and around ovalbumin and other chicken genes.- Nucl. Acids Res. v.7, p.2081-2103.

222. Manser T., Thacher T. a. Rechsteiner M., 1980. Arginine-richhistones do not exchange between human and mouse chromosomes in hybrid cells.- Cell, v.19, p.993-1003.

223. Mardian J.K.W., Paton A.E., Bunich G.J. a. Olins D.E., 1980.

224. Nucleosome cores have two specific binding sites for nonhistone chromosomal proteins HMG 14 and HMG 17.- Science, v.209, p.1534-1536.

225. Martin R.F., Radford I., Pardeè M., 1977. Accumulation ofshort DNA fragments in hydroxyurea treated mouse L-cells.--Biochem. Biophys. Res. Com., v.74, p.9-15.

226. Marushige К. a. J. Bonner, 1971. Fractionation of liverchromatin.- Proc. Nat. Acad. Sci. v.68, p.2941-2944.

227. Matfeew C.G.P., Goodwin G.H., I^o-Kemenes T. a. E.W.Johns, •1981. The protein composition of rat satellite chromatin.- PEBS Let., v.125» p.25-29.

228. Mathis D.J., Gorovsky M.A., 1978. Structure of rDNA-containing chromatin of Tetrahymena pyriformis analyzed by nuclease Digestion.- Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, v.42, p.773-778.

229. Matsukage A., Nishizawa M., Takahashi Т., Hozumi Т., 1980.1. vitro synthesis of short DNA pieces by DNA polymerase <L from mouse myeloma.- J. Biochem., v.88, p. 1869-1877.

230. Mc Done11 M.W., Simon M.N., Studier J.W., 1977. Analysisof restriction fragments of T-7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels.- J. Mol. Biol., v.110, p.119-146.

231. Mc Ghee J.D. a. G.D. Ginder, 1979. Specific DNA methylationsites in the vicinity of the chicken Д-globin genes.-Nature, v.280, p.419-420.

232. Mc Ghee J.D., Felsenfeld G., 1979. Reaction of nucieosome

233. DNA with dimethyl sulfate.- Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.76, p.2133-2137.

234. Mc Knight S.L., Bustin M., Miller O.L., 1978. Electron microscopic analysis of chromosome metabolism in the Drosophila melanogaster embryo.- Cold Spring Harbor, v.42, p.34.

235. Mac Leod M.C., Kootstra A., Mausfield B.K., Slage T.J., a.

236. J.K. Selkirk., 1981, Binding of benzo(a) pyrene derivates to specific proteins in nuclei of infact hamster embryocells.- Cancer Res., v.41, p.4080-4086.

237. Meneguzzi G., Chenciner N., a. G.Milanesi, 1979. Transcription of nucleosomal DNA in SV40 minichromosomes by eukary-otic and procaryotic RNA polymerases.- Nucl. Acids Res., v.6, p.2947-2960.

238. Meyer G.F., Renz M., 1979. Native and reconstituted chromosome fiber fragments.- Chromosoma v. 75, N 2, p.177-184.

239. Mirzabekov A.D., Melnikova A.F., 1974. Localization of chromatin proteins within DNA grooves by methylation of chromatin with dimethyl sulphate.- Mol. Biol. Reports, v.1, p.385-390.

240. Molitor H., Drahovsky D., a. Wacker A., 1976. Unmethylated

241. DNA in mouse L-cells. 1. DNA fibre autoradiography.- Bio-chim. Biophys. Acta, v.432, p.28-36.

242. Montagna R.R., Maizel A.L., Becker F.F., a. L.V. Rodriguez,1981. Chromatin conformation modulates repair of single strand interruptions by polynucleotide ligase AMP.

243. Chem.- Biol. Interact, v.33, p.149-161.

244. Musich P.R., Brown P.L. a. J.J.Maio, 1977. Subunit structureof chromatin and the organization of eukaryotic highly repetitive DNA: nucleosomal proteins associated with a highly repetitive mammalian DNA.- Proc. Nat. Acad. Sci USA, v. 74, p.3297-3301.

245. Musich R.R., Maio, J.J., a. Brown P.L., 1977. Subunit-structure of chromatin and the organization of eukaryotic highly repetitive DNA.- J. Mol. Biol., v.117, p.657-663.

246. Murashige T., Skoog P., 1962. A revised medium for rapidgrowth and bioassags with tobacco tissues cultures.-Plant. Physiol., v.15, p.173-179.

247. Nedospasov S.A., a. Georgiev G.P., 1980. Non-random cleavage of SV40 DNA in the compact minichromosome and free in solution by micrococcal nuclease.- Biochem. Biophys. Res. Coramun., v.92, p.532-540.

248. Nelson D.A., Perry W.H., a. Chalkley R., 1978. Sensitivityof region of chromatin containing hyperacetylated histones to DNAse I.- Biochim. Biophys. Res. Commun., v.82, p.356--363.

249. Nelson P.P., Albright S.C., a. W,T, Garrard, 1979. Nucleosome arrangement with regard to DNA base composition.-J. Biol. Chem., v.254, p.9194-9199.

250. Nielsen P.E., 1981. Photoaffinity labelling of chromatin:nuclease-sensitive chromatin shows preferential labeling of histone Hr- FEBS Lett., v. 135, p. 173-176.

251. Nose К., Тапайа A., a. H. Okamoto, 1961. Transcription ofglobin genes in murine Erythroleukemic cell chromatin by RNA polymerase II from Mouse cells.- J. Biochem., v.90, p.103-111»

252. Oda Т.Т., Nakamura, S., Watanabe, 1977. Transcription complexes of chromatin showing a bead-like structure of heterogeneous ribonucleoprotein chains.- J. Electron. Microsc., v.26, p.203-207.

253. Okazaki R., Okazaki Т., Sakabe K., Sugimoto K., Kuimima R.,

254. Sugino A., 1968. In vivo mechanism of DNA chain growth.-Cold Spring Harb. Symb. Quant. Biol., v.39, p.129-134.

255. Okazaki R., Okazaki Т., Sakate K., Sugimoto K., Sugino A.,1968.

256. Mechanism of DNA chain growth, I. Possible discontinuity and unusual secondary structure of newly synthesizedchains.- Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v.59, p.598-605.

257. Olins A.L., Olins D.E., 1974. Spheroid chromatin units

258. O -bodies).- Science, v.183, p.330-332.

259. Oudet P., Gross-Bellard M., Chambon P., 1975. Electronmicroscopic and biochemical evidence that chromatin structure is a repeating unit.- Cell v.4, N 4, p.281-300.

260. Pederson T., 1978. Chromatin structure and gene transcription: nucleosomes permit a new synthesis.- Int. Rev. Cytol. v.55, p.1-22.

261. Pellicer A., Robins D., Wold B., Swlet R., Jackson J., Lowy

262. J., Roberts J.M., Sim G.K., Silverstein J.S., Axel R.(1980). Altering genotype and phenotype by DNA-mediated gene transfer.» Science, v.209, p.1414-1422.

263. Perry M. a. R.Chalkley, 1981. The effect of histone hyperacetylation on the nuclease sensitivity and the solubility of chromatin.- J. Biol. Chem., v.256, p.3313-3318.

264. Persico-Dibauro M., Martin R.G. a. Livingston D.N., 1977.1.teraction of simian virus 40 chromatin with SV40 T-anti-gen.- J. Virology, v.24, p.451-460.

265. Petrov P., Raitcheva E., Tsanev R., 1980. Nucleosomes and nonribosomal RNA transcription in early mouse embryo. An electron microscopic study.- Eur. J. of Cell Biol. v.22, p.708--713.

266. Pfeiffer W. a. H.G. Zachan, 1980. Accessibility of expressedand non-expressed genes to a restriction nuclease.- Nucl. Acids Res., v.8, p.4621-4637.

267. Polloch J.M., Swihart M. a. Taylor J.H., 1978. Methylationof DNA in early development 5-methylcytosine content of

268. DNA in sea urchin sperm and embryos.- Nucl. Acids Res., v.5, p.4855-4864.

269. Pollack J., Stein R., Razin A, a. H. Cedar, 1980. Methylation of foreign DNA sequences in eukaryotic cells.- Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v.77, p.6463-6467.

270. Pruitt S.C., Grainger R.M., 1980. A repeating unit of higherorder chromatin structure in chick red blood cell nuclei.-Chromosoma, v.78, N 2, p.257-274.

271. Prune 11 A. a. Kornberg R.D., 1978. Relation of nwcleosomes to

272. DNA sequences.- Cold Spring Harbor Symp. Quant, Biol.,v.42, p.103-109.

273. Puvion-Dutilleul T.E. Puvion, W.Bernader, 1978. Visualization of nonribosomal transcriptional complexes after Cortisol complexes after stimulation of isolated liver cells.-J. Ultrestr. Res., v.62, p.118-131.

274. Quint A. a. H.Cedar, 1980. Hybridization analysis of themethylated bases of Escherichia coli DNA.- Biochim. Bio-phys. Acta, v.606, p.387-389.

275. Rabbani A., Goodwin G.H., Johus E.W., 1978. High mobilitygroup non-histone chromosomal proteins from chichen erythrocytes.- Biochim. Biophys. Res. Commun., v.81, p.351-358.

276. Rae P.M.M. a. R.E. Steele, 1979. Absence of cytosine methylation at C-C-G-G and G-C-G-C sites in the rDNA coding regions and intervening sequences of Drosophila and the rDNA of other higher insects.- Nucl. Acids Res., v.6, p.2987--2995.

277. Rattner J.B., Hamkalo B.A., 1978. Higher order structure inmetachromosomes. II. The relationship between the 250 Afiber, superbeads and beads-on-a-string.- Chromosoma, v.69» N 3, p.373-379.

278. Razin A. a. S. Razin, 1980. Methylated bases in mycoplasmal

279. DNA.- Nucl. Acids Res., v. 8, p.1383-1390.

280. Razin A., Riggs A., 1980. DNA methylation and gene function.

281. Science, v.210, p.604-609.

282. Reeves R., 1976. Ribosomal genes of Xenopus laevis: evidenceof nucleosomes in transcriptionally active chromatin.-Science, v.194, p.529-532.

283. Reeves R., 1977. Analysis and reconstruction of Xenopus ribosomal chromatin nucleosomes.- Bur. J. Biochem., v.75» p.545-510.

284. Reeves R., 1978. Nucleosome structure of Xenopus oocyte amplified ribosomal genes.- Biochemistry, v.17» p.4908-4916,1976.

285. Reeves R., Jones A. Genomic transcriptional activity andthe struoture of chromatin.- Nature, v.260, p.495-500.

286. Reichard P., Eliusson R., Sçderman G., 1974. Initiator RNAsynthesis.- Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v.71» p.4901-4905.

287. Reilly J.G., Braun R. a. C.A. Thomas, Jr., 1980. Methylation in Physarum DNA.- FEBS Let., v.116, p.181-184.

288. Rennie P.S., 1979, Binding of androgen receptor to prostatic chromatin requires intact linker DNA.- J. Biol. Chem., v.254, p.3947-3952.

289. Renz M., 1979. Heterogeneity of the chromosome fiber.- Nucl.

290. Acids Res., v.6, N 8, p.2761-2767.

291. Riggs A.D.X., 1975. Inactivation, differentiation and DNAmethylation.- Cytogenet. Cell Genet., v.14, p.9-11.

292. Riley D. a. Weintraub H., 1979. Conservative segregation ofparental histones during replication in the presence of cycloheximide.- Proc. Natl. Acad. Sci, USA, v.76, p.328--332.

293. Ris H., 1975. Chromosomal structure as seen by electronmicroscopy. In: Ciba Foundation Symp. 28. The structure and function of chromatin.-Exc. Med.-North Holland Amster-dam:Elsevier, p.7-23.

294. Ris H., 1969. The molecular organization of chromosomes.1.: Handbook of molecular cytology (A.Lima-de-Faria, ed.), p.221-250, North-Holland, Amsterdam.

295. Ris H., Karenberg J., 1979. Levels of chromosome organization. in: Cell Biology (L. Goldstein, D.Prescott, eds.) v.II New York, Academic Press.

296. Robert-Gero M., Lowrence F., Farrugia G., 1975. Inhibitionof virus-induced cell transformation by synthetic analogues of S-adenosyl homocysteine.- Biochem. Biophys. Res. Com., v.65, p.1242-1249.

297. Roberts R.J., 1980. Restriction and modification enzymes andtheir recognition sequences.- Hucl. Acids Res., v.8, p.63--80.

298. Roy P.H., Weissbach A., 1975. DHA methylase from HeLa cellnuclei.- Hucl. Acids Res., v.2, p.1669-1684.

299. Royer H.-D. a. Sager R., 1979. Methylation of chloroplast

300. DHAs In the life cycle of chlamydomonas.- Proc. Hat. Acad. Sci USA, v.76, p.5794-5798.

301. Rosenberg B.H., 1976. The periodic structure of chromatin,implication for DNA function.- Biochem. Biophys. Res.Com., v.72, p.1374-1391.

302. Ruiz-Carrillo A., Puigdomenech P., Eder G., Lurz R., 1980.

303. Siability and reversibility of higher ordered structure of interphase chromatin: continuity of deoxyribonucleic acid is not required for maintenance of folded structure.-Biochim., v.19, H 12, p.2544-2554.

304. Russev G., Hancock R., 1982. Assembly of new histones intonucleosomes and their distribution in replicating chroma-tin.- Proc. Hat. Acad. Sci USA, v.79, p.3143-3147.

305. Saffer J.D. a. J.E. Coleman,1980. Reversible phosphorylation of a nucleosome binding protein that stimulated transcription of nucleosome deoxyribonucleic acid.-Biochemistry, v.79, p.5874-5883.

306. Samarina O.P., Lukanidin E.M., Molnar J., Georgiev G.P.,1968.

307. Structural organization of nuclear complexes containing DNA-like RNA.- J. Mol. Biol. 33, N 1, p.251-263.

308. Sandeen G., Wood W.J., Felsenfeld G., 1980. The interactionof high mobility proteins HMG14 and 17 withjm cleosomes.-Nucl. Acids Res., v.8, p.3757.

309. Saragosti S., Moyne G., a. M. Yanic, 1980. Absence of nucleosomes in a fraction of SV40 chromatin between the origin of replication and the region coding for the late leader RNA.- Cell, v.20, p.65-73.

310. Scheer U., 1978. Changes of nucleosomal frequency in nuclearand non-nuclear chromatin as a function of transcription: an electron microscopic study.- Cell, v.13, p.535-549.

311. Scheer U., H. Zentgraf, Sauer H.W., 1981. Different chromatin structures in physarum polycephalum. A special form of transcriptionally active chromatin devoid of nucleosomal particles.- Chromosoma, v.84, p.279-290.

312. Scheindermann M.H. and Billen D., (1973) Methylation ofrapidly reannealing DNA during the cell cycle of Chinese hamster cells.- Biochem. Biophys. Acta, v.308, p.352-360.

313. Schlaeger E.J., Klempanov K.-H., 1978. The structure of chromatin replicated in vitro.- Eur. J. Biochem., v.89, p.567-574.

314. Schmidt G., Thannhauser S.J., 1945. A method for the determination of deoxyribonucleic acid, ribonucleic acid and phosphoproteins in animal tissues.- J. Biol. Chem.v. 161, p. 83-89.

315. Seale R.L., 1975. Assembly of DNA and protein during replication in HeLa cells.- Nature (London), v.225, p.247-249.

316. Seale R.L., Simpson R.T., 1975. Effects of cycloheximide onchromatin biosynthesis.- J. Mol. Biol., v.94, p.479-501.

317. Seale R.L., 1976. Studies on the mode of segregation ofhistone Nu bodies during replication in HeLa cells.- Cell, v.9» p.423-429.

318. Seale R.L., 1977. Persistence of nucleosomes on DNA duringchromatin replication.- Cold Spring Harbor Symp.Quant. Biol., v.42, p.433-438.

319. Sealy L. a. Chalkley R., 1978. The effect of sodium butyrateon histone modification inhibition of sodium deacetylase.-Cell, v.14, p.115-121.

320. Senear A.W., R.D. Palmiter, 1981. Multiple structural features are responsible for the nuclease sensitivity of the active ovalbumin gene.- J. Biol. Chem. v.256, N 3, p.1191-1198.

321. Seyedin S.M. a. Kistler W.S., 1979. Levels of chromosomalprotein high mobility group 2 parallel the proliferative activity of testis, skeletal muscle and other organ.

322. J. Biol. Chem., v.254, p.11264-11271.

323. Shaw P.A., Schasrabuddhe C.G., Hodo H.G. III. a. C.P. Saunders, 1978. Transcription of nucleosomes from human chromatin.- Nucl. Acids Res., v.5, p.2999-3012.

324. Sharp P.A., Sugden B. and Sambrook J., 1973. Detection of tworestriction endonuclease activity in Haemophilus parainfluen-zae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis.- Biochemistry, v.10, p.2761-2769.

325. Sheffery, M., Rifkind R.A. a. P.A. Marks, 1982. Murine erythroleukeemia ceel differentiation: DNAse I hypersensitivity and DNA methylation near the globin genes.- Proc.Nat.Acad. Scius£ v.79, p.1180-1184.

326. SheIton R.E., Kang J., Wasserman P.M., De Pamphilis, 1978.

327. Chromatin assembly in isolated mammalian nuclei.- Nucl.Acids Res., v.5, p.349-362.

328. Sigin D,, 1979. Multi-nucleosomic fragmentation of chromatinin mouse cell nuclei by endogenous alkaline endonucleases.-St. biophys. v.77, N 1, p.51-60.

329. Simpson R.T., Reeck G.R., 1973. A comparison of the proteinsof condensed and extendet chromatin fractions of rabbit liver and calf thymus.- Biochemistry, v.12, p.3153-3858.

330. Sista H.S., Loder R.T., Caruthers M.H., 1979. Studies on genecontrol region X. The effect of specific adenin-thymine transversions on the lao-represor lac operator interaction.-Nucl. Acids Res., v.6, N 7

331. Singer J., Robert-Ems J., Luthardt F.W. a. Riggs A.D., 1979.-Methylation of DNA In mouse early embryos, teratocarcinoma cells and adult tissues of mouse and rabbit.- Nucl.Acids Res., v.7, p.2369-2385.

332. Singer J., Roberts-Ems J., Riggs A.D., 1979. Methylationof mouse liver DNA studies by means of the restriction enzymes MSP1 and Hpa II.- Science, v.203, p.1019-1021.

333. Sinsheimer R., 19U5& The action of pancreatic deoxyribonuclease. II. Isomeric dinucleotides.- J. Biol. Chem., v.215, p.579-583.

334. Smerdon M.J. a. Isenberg J., 1976. Conformational changes insulfractions of calf thymus histone H1.- Biochemistry, v.15, p.4233-4241.

335. Smerdon M.J., M.W. Lieberman, 1981. Removal of histone H1from intact nuclei alters the digestion of nucleosome core DNA by staphylococcal nuclease.- J. Biol. Chem. v.256, p. 2480-2483.

336. Smith R.G., Schwartz R.J., 1979. Isolation and purificationa hen nuclear oestrogen receptor and its effect on transcription of chick chromatin.- Biochem. J., v.184, p.331--343.

337. Smith B.J. a. E.W. Johus, 1980. Histone H1°: its locationin chromatin .- Nucl. Acids Res., v.8, p.6069-6079.

338. Sneider T.W., 1972. Methylation of mammalian deoxyribonucleic acid III. Terminal versus internal location of 5-methylcytosine in oligodeoxyribonucleotides from Novi-koff hepatoma cell deoxyribonucleic.- J. Biol. Chem., v.247, p.2877-2875.

339. Sneider T.W., Teagne N.N., Rogachevsky L.M., 1975. S-adenosylmethionine DNA-cytosine 5-methyltransferase from a Novikoff rat hepatoma cell line.- Nucleic Acids Res., v.2, p.1685-1690.-248304. Sneider T.W. a Potter V.R., 1969. Methylation of mammalian

340. DNA: studies on Novikoff hepatoma cells in tissue culture.-J. Mol. Biol., v.42, p.271-284.

341. Solage A. a. H. Cedar, 1978. Organization of 5-methylcytosine in chromosomal DNA.- Biochemistry 17. w; , p.2934-2938

342. Spiker S., Mardian J.K.W. a. Isenberg J., 1978. Chromosomal

343. HMG proteins occur in three eukaryotic Kingdoms.- Biochim. Biophys. Res. Commun., v.82, p.129-135.

344. Spring H., Franke W.W., 1981. Transcriptionally active chromatin in loops of lampbrush chromosomes at physiological salt concentrations as revealed by electron microscopy of sections.- Eur. J. Cell Biol, v.24, p.298-308.

345. Stalder J., Groudine M., Dodgson J.B., Engel J.D. a. Weintraub H., 1980a. Hb switching in chickens.- Cell, v.19, p.973-980.

346. Stalder J., Larsen A., Engel J.D., Dolan M., Groudine M. a.

347. H.Weintraub, 1980. Tissue-specific DNA cleavages in the globin chromatin domain introduced by DNase I.- Cell, v.20, p.451-460.

348. Steele R.E. a. P.M.M. Rae, 1980. Ordered distribution ofmodified bases in the DNA of a dinoflagellate.- Nucl. Acids Res. v.8, p.4709-4725.

349. Stratling W.H., Muller U., Zentgraf H., 1978. The higherorder repeat structure of chromatin is built up of globular particles containing eight nucleosomes.- Exp. Cell Res. v.117, p.301-311.

350. Stratling W.H., 1979. Role of histone H1 in the conformationof oligonucleosomes as a function of ionic strength.

351. Bioehem. v.18, N 4, p.596-603.

352. Strâtling W.H., Klingholz R., 1981. Supranucleosomal structure of chromatin: digestion by Calcium/Magnesium endo-nuclease proceeds via a discrete size class of particles with elevated stability.- Biochemistry, v.20, N 5» p.1386--1392.

353. Subirana J.A., Munoz-Guerra S., Martinez A.B., Pérez-Grau Z.,

354. Marcet X., Fita I., 1981. The subunit structure of chromatin fibres.- Chromosoma, v.83» N 4, p.455-471.

355. Sutter D. a. W.Doerfler, 1980. Methylation of intergratedadenovirus type 12 DNA sequences in transformed cells in inversely correlated with viral gene expression.- Proc. •Nat. Acad. Sci USA, v.77, p.253-256.

356. Swartz H.N., Trautner T.A., Kornberg A., 1962. Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. XI. Further studies on nearest neighbor base sequences In deoxyribonucleic acids.-J. Biol. Chem., v.237, p.1961-1967.

357. Tahourdin C.S.M., Neihart U.K., Isenberg J., a. M.Bustin,1981.1.munochemical detection of chromosomal protein HM6-17 in chromatin subunits.- Biochemistry, v.20, p.910-915.

358. Tanaka T., Oda T., 1976. Configurâtional changes in rat livernuclear chromatin and nucleoli caused by dissociation and reassociation of F1 histone.- Exp. Cell Res. v.103 p.143— -149.

359. Tanaka M., Hibasami H., Nagai J. a. T.Ykeda, 1980. DNA methylation in isolated nuclei during development of chick embryos.-Austral. J. Exp. Biol, and Med. Sci., v.58, p.301-307.

360. Tantravahi U., Guntaka R.V., Erlanger B.P., a. O.J. Miller,1981. Amplified ribosomal RNA genes in a rat hepatoma cell line are enriched in 5-methylcytosine.- Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.78, p.489-493.

361. Taylor S.M. a. P.A. Jones, 1979. Multiple new Phenotypes induced in 10 T 1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.-Cell, v.17, p.771-779.

362. Tew K.D., Schein P.S., Lindner D.J., Wang A.L., a. M.E. Smulson, 1980. Influence of hydrocortisone on the "binding of nitrosoureas to nuclear chromatin subfractions.- Cancer Res, v.40, p.3697-3703.

363. Thoma P., Koller T., 1981. Untravelled nucleosomes, nucleosome beads and higher order structures of chromatin: influence of non-histone components and histone H1.- J. Mol. Biol., v.149, N 4, p.709-733.

364. Thoma T., Koller T., Klug A., 1979. Involvement of histone

365. H1 in the organization of the nucleosome and of the salt-dependent superstructures of chromatin.- J. Cell Biol., v.83, N 2, p.403-427.

366. Trendelenburg M.P., Mathis D., Oudet P., 1980. Transcription units of chicken ovalbumin genes observed after injection of cloned complete genes in to Xenopus oocyte, nucleic. Proc. Nat. Acad. Sei, v.77, p.5984-5988.

367. Tseng B.J., Goulian M., 1975. DNA synthesis in human Lymphocytes Intermediates in DNA synthesis in vitro and in vivo.-J. Mol. Biol., v.99, p.317-337.

368. Vardimon L., Neumann R., Kuhlman J., Sutter D., Doerfler W.,1980. DNA methylation and viral gene expression in adenovirus- transformer and infected cells.- Nucl. Acids Res., v.8, p.2461-2473.

369. Vengerov Yu.Yu., V.I.Popenko, 1977. Changes in chromatinstructure induced Ъу EDTA treatment and partial removal of histone H1.- Hucl.Acids Res., v.4, p.3017-3027.

370. Venkatesan N., 1977. Regulation of DNA chain elongation in

371. SV 3T3 cells in relation to growth rate.- Biochem. Biophys. Acta, v.478, p.454-460.

372. Vidali G.L., Boffa K.C. a. Allfrey V.G., 1977. Selective release of chromosomal proteins during limited DHAase I digestion of avian erythrocyte chromatin.- Cell, v.12, p.409-415.

373. Vovis G.F., Horiuchi K., Zinder N.D., 1974. Kinetics of methylation of DNA by a restriction endonuclease from Escherichia coli В.- Proc. Natl. Acad. Sci, USA, v.71, p.3810-3813.

374. Waalwijk C. and Flavell R.A., 1978. DNA methylation at a CCGGsequence in the large intron of the rabbit уЗ-globin gene: tissue specific variation.- Nucleic Acid Res., v.5, p.4631--4641.

375. Walker B.W., Lothstein L., Baker C.L., Le Stourgeon W.M.,1980. The release of 40S hn RHP particles by brief digestion of HeLa nuclei with micrococcal nuclease.- Hucl. Acids Res., v.8, H 16, p.3639-3657.

376. Walker J.M. Walker, Goodwin G.H. a. Johus E.W., 1979.

377. The primary structure of the nucleosome-associated chromosomal protein HMG 14.- FEBS Lett. v.100, p.394-398.

378. Walker J.M., Stearn C. a. E.W. Johna, 1980. The primarystructure of non-histone chromosomal protein HMG617 from chicken erythrocyte nuclei.- FEBS Let., v.112, p.207-210.

379. Wasylyk В., Thevenin G., Oudet P. a. P.Chambon, 1979. Transcription of in vitro assembled chromatin by Escherichiacoli RNA polymerase.- J. Mol. Biol., v.128, p.411-440.

380. Wasylyk B. a. P.Chambon, 1980. Studies on the mechanism oftranscription of nucleosomal complexes. Eur. J. Biochem. v.103» p.219-226.

381. Weideli H., Brack Ch. a. W.J. Gehring, 1980. Characterizationof Drosophila DNA-binding protein DB-2: demonstration of its sequence-specific interaction with DNA.- Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.57, p.3773-3777.

382. Weintraub H., 1980. Recognition of specific DNA sequences ineukaryotic chromosomes.-Nucl. Acids Res.v8 , N 20, p.4745--4753.

383. Weintraub H., Groudine M., 1976. Chromosomal subunits inactive genes have an altered conformation.- Science, v.193» N 4256, p.848-856.

384. Weintraub H., 1976. Cooperative alignment of Nu bodies during chromosome replication in the presence of cycloheximide. Cell, v.9, p.419-422.

385. Weintraub H., Worcel A., Alberts B., 1976. A model for chromatin based upon two symmetrically paired half nucleosomes.-Cell, v.9, p.409-417.

386. Weintraub H., 1979. Assembly of an active chromatin structureduring replication.- Nucl. Acids Res., v.7, p.781-792.

387. Weintraub H., Larsen A., a. M.Groudine, 1981. «¿.-globin-geneswitching during the development of chicken embryos: expression and chromosome structure.- Cell, v.24, p.333-344.

388. Wigler M., Levy D., Perucho M., 1981. The somatic replication of DNA methylation.- Cell, v.24, p.33-40.

389. Williamson P. a. G.Felsenfeld, 1978. Transcription of histonecovered T7 DNA by Escherichia coli RNA polymerase.- Biochemistry, v.17, p.5695-5705.

390. Woodcock C.L.F., 1973. Ultrastructure of inactive chromatin.

391. J. Cell Biol. 59, N 2, p.368a.

392. Woodcock C.L.P., Pracho L.L.J., Hatch C.C., Rieciardrello L.,1976. Pine structure of active ribosomal genes.- Chromosoma, v.58, p.33-39.

393. Woodcock C.L.P., Safer J.P., Stanchfield J.E., 1976a. Structural repeating units in chromatin. Evidence for their general occurrend.

394. Worcel A., 1978. Molecular architecture of the chromatinfiber C.S.H.S. on Q.B. XLII p.313-323.

395. Worcel A., Han S., Wong M.L., 1978. Assembly of newly replicated chromatin.- Cell, v.15, p.969-977.

396. Wu C. a. W.Gilbert, 1981. Tissue-specific exposure of chromatin structure at the 5' terminus of the rat preproinsulin II gene.- Proc. Nat. Acad. Sci USA, v.78, p.1577-1580.

397. Wyatt G.R., 1950. Occurence of 5-methylcytosine in nucleicacids.- Nature, 1950, v.166, p.237-241.

398. Yu S.S., Li H.J., Goodwin G.H. a. E.W.Johus, 1977. Interaction of non-histone chromosomal proteins HMG1 and HM62 with

399. DNA.- Eur. J. Biochem., v. 78, p.497-502.

400. Yiunis J.J., Bahr G.P., 1979. Chromatin fiber organizationof human interphase and prophase chromosomes.- Exp. Cell. Res. 122, p.63-72.

401. Zach&u H.G., a. T.Igo-Kemenes, 1981. Pace to phase with nucleosomes.- Cell, v.24, p.597-598.

402. Zannis-Hadj opoulos M., Taylor M.W., Hand R., 1980. Inhibitionof DNA chain elongation in a purine- auxotrophic mutant of Chinese hamster.- J. Cell Biol., v.85, p.777-785.

403. Zeutgraf H., Müller U., Pranke W.W., 1980. Reversible invitro packing of nucleosomal filaments into globular supra-nucleosomal units in chromatin of whole chick erythrocyte nuclei.- Eur. J. Cell Biol. v.23, N 1 , p.171-188.

404. Zeutgraf H., Müller U., Pranke W.W., 1980. Supranucleosomalorganization of sea urchin sperm chromatin in regularly arranged 40 to 50 nm large granular subunits.- Eur. J. Cell Biol, v.20, N 2, p.254-264.