Комплексное исследование метилотипов злокачественных новообразований: фундаментальные и прикладные аспекты

Стрельников, Владимир Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Комплексное исследование метилотипов злокачественных новообразований: фундаментальные и прикладные аспекты
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Комплексное исследование метилотипов злокачественных новообразований: фундаментальные и прикладные аспекты"

г\и О" ■ На правах рукописи

СТРЕЛЬНИКОВ Владимир Викторович

КОМПЛЕКСНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТИЛОТИПОВ

ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ

03.02.07 - генетика

15 [;:др гт

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2012

005014448

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Залетаев Дмитрий Владимирович

Официальные оппоненты:

Носиков Валерий Вячеславович, доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля» Российской академии наук, заведующий лабораторией постгеномных молекулярно-биологических исследований

Фаворова Ольга Олеговна, доктор биологических наук, профессор Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, заведующая кафедрой молекулярной биологии и медицинской биотехнологии

Иващенко Татьяна Эдуардовна, доктор биологических паук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта» СевероЗападного отделения Российской академии медицинских наук (Санкт-Петербург), ведущий научный сотрудник лаборатории пренатальной диагностики врожденных и наследственных заболеваний

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «1^» М 2012 г. в ^Л часов на заседании Диссертационног ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетно учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академш медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственног бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российско академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.016.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, про юнко Рена Абульфазовн

Автореферат разослан

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Значительная часть современных представлений о злокачественных новообразованиях основывается на предположении о том, что они развиваются в результате выхода клеток из-под контроля механизмов регуляции роста, деления и дифференцировки вследствие накопления соматических мутаций (Hanahan D., Weinberg R.A., 2000; Stratton M.R. et al., 2009). Наличие соматических мутаций, в число которых входят как структурные повреждения (нуклеотидные замены, небольшие инсерции и делении, хромосомные перестройки, численные аномалии), так и эпигенетические нарушения, - неотъемлемое свойство геномов всех клеток злокачественных новообразований (Pleasance E.D. et al., 2010).

Новейшие технологии полногеномного анализа ДНК позволяют определять практически все классы структурных соматических изменений на всем протяжении генома (Mardis E.R. et al., 2009; Beroukhim R. et al., 2010). Полногеномный анализ структурных изменений, основанный на методах секвенирования нового поколения, обеспечивает получение результатов с точностью до одного нуклеотида. Фактически дальнейшее развитие этой области исследования соматических мутаций в ближайшее время будет сводиться к совершенствованию существующих технологий (Ding L et al., 2010; Lee W. et al., 2010).

К полногеномному анализу метилирования ДНК методы секвенирования нового поколения на сегодняшний день применимы в очень незначительной степени, что объясняется в первую очередь сниженной информативностью последовательностей бисульфит-модифицированной ДНК, используемой в качестве матрицы для секвенирования (Stratton M.R. et al., 2009). Неметилированные участки ДНК после бисульфитной конверсии представляют собой последовательности из трех нуклеотидов, что значительно осложняет выравнивание фрагментов при формировании контигов; кроме того, прямые и обратные прочтения конвертированной ДНК не являются обратно комплементарными (Tost J., Gut I.G., 2007; Xi Y., Li W., 2009; Huss M. 2010). Таким образом, достоверная информация о характере метилирования ДНК с однонуклеотидным разрешением на сегодняшний день может быть получена только с использованием традиционных методов локус-специфического анализа, осуществление которого требует формирования принципов отбора кандидатных геномных локусов.

При разработке стратегия отбора кандидатных локусов для детальной характеристики метилирования следует принять во внимание все существующие возможности скрининга характеристик эпигеномов. Подходы к таким исследованиям не универсальны. Одни из них обеспечивают анализ с полногеномным покрытием, но низким разрешением; другие, при высоком разрешении, позволяют анализировать ограниченные выборки участков генома.

К первой группе относятся методы, основанные либо на аффинном обогащении фрагментировапной ДНК фракциями с определенными эпигенетическими характеристиками, либо на обработке препаратов ДНК различными типами нуклеаз. Таким образом можно проанализировать не только метилирование ДНК (Weber M. et al., 2005), но и химические модификации хроматина - гистоновые метки НЗК4Ме1, НЗК27АС, НЗК4МеЗ (Heintzman N. D. et al., 2009), области доступного хроматина (Crawford G.E. et al., 2006; Boyle A.P. et al., 2008), плотность иуклеосомной упаковки (Dennis J.H. et al., 2007). Надежно определяя эпигенетические изменения на полногеномном уровне, указанные методы страдают низкой прецизионностью:

исследуемые параметры характеризуются с разрешением около 100-200 нуклеотидных пар (Huebert D.J. et al., 2006; Crawford G.E. et al, 2006; Johnson D.S. et al., 2008; Serre D. et al., 2009).

Вторая группа подходов подразумевает скрининг дифференциального метилирования ограниченных выборок геномных локусов. В этой группе наиболее известны методы метилчувствительного рестрикционно-ориентированного геномного сканирования (Rush L.J. et al., 2001; Costello J.F. et al., 2009), метилчувствительного репрезентативно-дифференциального анализа (Ushijima T. et al., 1997), метилчувствительного фингерпринтинга (Gonzalgo M.L. et al., 1997), амплификации интерметилированных сайтов (Frigola J. et al., 2002). Огромным преимуществом перечисленных методов является непредвзятость скрининга, под которой понимается определение дифференциального метилирования заранее неизвестных локусов генома с последующей идентификацией их нуклеотидных последовательностей (Fraga M.F., Esteller M., 2002). Непредвзятый скрининг расширяет фундаментальные представления о роли метилирования ДНК в норме и при патологии, и способствует диверсификации основ разработки эпигенетических диагностических маркеров. Непредвзятость скрининга - краеугольный камень объективной оценки состояния изучаемых метиломов (Schumacher A. et al., 2006, Gebhard et al., 2006). В то же время оптимального метода непредвзятого скрининга дифференциального метилирования на сегодняшний день не существует (Воск, С., 2009). Указанные методы, разработанные более 10 лет назад, так и не нашли широкого применения. Требуется формирование принципиально новой концепции, учитывающей современный уровень генетических знаний и использующей преимущества завершения проекта по секвенированию генома человека.

Сопоставление результатов исследования полногеномного и локального метилирования ДНК и ряда характеристик хроматина в пределах хромосомных участков должно привести к формированию синтетического подхода к изучению метиломов злокачественных новообразований, который будет полезен как с точки зрения изучения фундаментальных основ эпигенетической регуляции при канцерогенезе, так и с точки зрения разработки молекулярно-генетических клинических диагностических маркеров. Применительно к фундаментальным и прикладным аспектам онкогеномики требуется разработка методологии анализа эпигеномов злокачественных новообразований на основе синтеза современных методов молекулярной генетики, медицинской биотехнологии, математического моделирования и биоинформатики.

Цель работы. Разработать оригинальную методологию скрининга дифференциального метилирования геномов и применить её к изучению фундаментальных характеристик метиломов злокачественных новообразований.

Задачи исследования.

1. Разработать оригинальную методологию непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов на основе синтеза современных методов молекулярной генетики, математического моделирования и биоинформатики.

2. Охарактеризовать состав репрезентаций генома, генерируемых разработанными методами скрининга районов дифференциального метилирования геномов.

3. Идентифицировать новые гены и локусы, вовлеченные в канцерогенез и подверженные аномальной эпигенетической регуляции при раке.

4. Провести анализ молекулярной патологии наиболее перспективного гена-

кандидата на роль супрессора опухолевого роста из набора новых генов, выявленных в процессе исследования.

5. Идентифицировать константно метилированные участки генома человека, которые могут служить основой для обоснованного дизайна конгролей эффективности метилчувствителыюй ПЦР.

6. Охарактеризовать локальные параметры хроматина, определяющие состояние метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе.

7. Сформировать синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез, на основе локальных характеристик генома в норме и при злокачественной трансформации.

8. Используя разработанный способ предсказания статуса метилирования участков генов, вовлеченных в канцерогенез, провести исследования эпигенетической патологии всех генов, кодирующих семейство белков, непосредственно вовлеченных в процессы канцерогенеза (12 генов субъединиц ламининов).

Научная новизна.

Разработана оригинальная методология непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов AFLOAT (анализ, ориентированный на длину амплифицируемых фрагментов). Предложены принципиальные модификации методов поиска дифференциального метилирования - метилчувствительного фингерпринтинга и амплификации интерметилированных сайтов (АИМС). Охарактеризован состав репрезентаций генома, генерируемых методами метилчувствительного фингерпринтинга и АИМС. Выявлено 26 новых локусов, дифференциально метилированных в опухолях, условно нормальных тканях молочной железы, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы. Из них 22 принадлежат генам LAMBI, RAI!, KCNH8, DOCK6 GPC2 SH3KBP1, PPP2R5C, PHF1, ATMIN, C2CD2, KIAA1324L, IQSEC2, АХ746725/АК127124, ТМЕМ176А/ТМЕМ176В, FOXM1/HKMT1188, LAMC3, SEMA6B, VCIP135, В IN I, KCNH2, CACNG4 и PS MF/. Четыре дифференциально метилированных района расположены в межгенных областях на хромосомах 1рЗЗ, 5р15.33, 12q]3.13 и 13q32.1. Проведена оценка частот аномального метилирования указанных локусов. Особенности метилирования выявленных областей охарактеризованы впервые. Анализ молекулярной патологии гена SEMA6B, аномальное метилирование которого при раке молочной железы впервые показано в настоящем исследовании, продемонстрировал наличие повреждений гена (метилирование, потеря гетерозиготности) в 75% образцов рака молочной железы (РМЖ). Впервые выявлена терминальная мутация SEMA6B у пациентки с РМЖ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что SEMA6B - один из наиболее реальных генов-кандидатов на роль супрессора опухолевого роста в области 19р13.3.

Скрининг метилирования ДНК из образцов рака молочной железы, светлоклеточного рака почки, рака мочевого пузыря, прилежащих условно нормальных тканей, аутопсийного материала молочной железы, лимфоцитов периферической крови и буккалыюго эпителия здоровых доноров впервые выявил константно метилированные участки генома человека, принадлежащие CpG-островку гена CUXI в составе альтернативного 3'-концевого экзона, первым экзонам генов LA МАЗ A, LAMB3, LAMC3, интронным областям генов MAD1L1, TAF4 и З'-CpG-островку гена ZBTB4.

Впервые проведено исследование эпигенетической патологии всех генов, кодирующих семейство белков, непосредственно вовлеченных в процессы

канцерогенеза (12 генов цепей ламининов). Шесть из них демонстрируют неметилированное состояние в нормальных тканях и аномальное метилирование при РМЖ, с частотами, составившими для генов LAMA1 - 36%, LAMA2 - 38%, LAMA3B -6%, LAMA4 - 2%, LAMBI - 16%, LAMC3 - 8%. Промотор гена LAMC2 показал дифференциальное метилирование в зависимости от тканевого происхождения образцов: в буккальном эпителии и лимфоцитах периферической крови метилирование отсутствует, в то время как образцы ДНК из нормальных и опухолевых тканей молочной железы метилированы в 100% случаев. Константное метилирование предсказано и подтверждено для промоторных областей двух генов субъединиц ламининов - LAMA3A и LAMB3.

Впервые проведенный прицельный анализ состояния метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе в зависимости от локальных характеристик хроматина показал совместное расположение константно метилированных участков с плотной упаковкой нуклеосом при закрытом хроматине, константно неметилированных участков - с низкой плотностью упаковки нуклеосом при закрытом хроматине, и дифференциально метилированных участков - с областями открытого хроматина при любой плотности нуклеосомной упаковки.

Теоретическая и практическая значимость.

Разработанные системы скрининга дифференциального метилирования геномов высоко воспроизводимы, подробно охарактеризованы и могут быть использованы в дальнейшем в работах по характеристике эпигенетических нарушений, ассоциированных с социально значимыми заболеваниями. Решена основная проблема непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов - определение геномной принадлежности дифференциально метилированных локусов. Благодаря созданию новой технологии анализа, ориентированного на длину амплифицируемых фрагментов, AFLOAT, из процедуры определения геномной принадлежности локусов полностью исключается многоэтапный блок лабораторного анализа - выделение фрагментов ДНК из гелей, их реамплификация, клонирование, экстракция плазмидной ДНК и секвенирование. Предложенные методы скрининга обеспечивают высокую воспроизводимость результатов, снижение токсичности, себестоимости и трудоемкости исследований, расширение возможностей визуального контроля на каждом этапе эксперимента. По результатам характеристики состава репрезентаций генома, генерируемых методами метилчувствительного фингерпринтинга и АИМС, предложены схемы экспериментов, обеспечивающие высокое содержание CpG-островков в составе репрезентаций дифференциально метилированных участков, что обеспечивает базу для эффективного выявления новых генов и локусов, вовлеченных в канцерогенез и подверженных аномальной эпигенетической регуляции при раке. Выявленные константно метилированные участки генома человека обеспечивают проведение обоснованного дизайна контролен эффективности метилчувствительной ПЦР. Результаты проведенного анализа геномных локусов и сформулированный синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов с учетом локальных характеристик хроматина представляют собой базу для разработки диагностических систем эпигенетических маркеров. Разработанные алгоритмы, методы и компьютерные программы оформлены в виде рекламно-технических описаний и описания новой медицинской ДНК-технологии, прошедших государственную регистрацию. Зарегистрирована заявка на патент «Способ формирования панелей маркеров метилирования ДНК».

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработаны алгоритмы, протоколы и компьютерные программы для проведения метилчувствительного фингерпринтиига и анализа, ориентированного на длину амплифицируемых фрагментов (AFLOAT), обеспечивающие повышение воспроизводимости результатов, снижение себестоимости и трудоемкости исследований, расширение возможностей визуального контроля на каждом этапе эксперимента.

2. Разработаны оригинальные подходы к картированию дифференциально метилированных локусов, решающие основную проблему непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов - определение геномной принадлежности выявляемых фрагментов ДНК.

3. Охарактеризован состав репрезентаций генома, генерируемых методами метилчувствительного фингерпринтиига и AFLOAT. Предложены схемы экспериментов, обеспечивающие высокое содержание CpG-островков в составе репрезентаций дифференциально метилированных участков.

4. Оригинальные методы непредвзятого скрининга позволяют идентифицировать дифференциально метилированные локусы геномов независимо от их расположения относительно кодирующих областей, промоторов и сайтов инициации транскрипции, что подтверждает непредвзятый характер скрининга.

5. Анализ молекулярной патологии гена SEMA6B, аномальное метилирование которого при раке молочной железы впервые показано в настоящем исследовании, свидетельствуют о том, что это один из наиболее реальных генов-кандидатов на роль супрессора опухолевого роста в области хромосомы 19р13.3.

6. Выявлены константно метилированные участки генома человека, предоставляющие базу для обоснованного дизайна контролей эффективности метилчувствителыюй ПЦР.

7. Предложена гипотеза, связывающая локальные характеристики хроматина и состояние метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе. На её основе разработан синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез.

8. Показан высокий предиктивный потенциал разработанной системы отбора для анализа метилирования кандидатных участков генов, па примере исследования эпигенетической патологии семейства генов ламининов.

Апробация работы.

Материалы исследования были доложены на конференции ГНТП "Геном человека" в 2000 г., ежегодных конференциях Европейского общества генетики человека в 2002, 2004, 2005, 2006 (диплом и премия), 2007, 2008 и 2009 гг., научно-практическом симпозиуме "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении" в 2002 г., 97-й ежегодной конференции Американского общества изучения рака (Вашингтон, 2006; премия), V и VI Международных конференциях «Молекулярная медицина и биобезопасность» (г. Москва) в 2008 и 2009 гг., V и VI съездах Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2009 и Ростов-на-Дону, 2010), V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (г. Москва) в 2008 г., V и VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» в 2009 и 2011 гг., 6-м симпозиуме "Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний" (г. Москва) в 2009 г., конференции молодых ученых, посвященной 40-летию МГНЦ РАМН (г. Москва) в'

2009 г., Всемирном эпигенетическом конгрессе (г. Берлин) в 2009 г., 11-й и 12-й Европейских конференциях по цитогенетике и молекулярной генетике солидных опухолей (г. Бильбао, 2008 и г. Неймеген, 2010).

Разработанные алгоритмы, новые медицинские технологии и компьютерные программы были использованы при выполнении научно-исследовательских работ по гранту РФФИ № 08-04-01685 «Общие закономерности структурно-функциональной организации эпигеномов клеток рака молочной железы», по государственному контракту № 8/3-655н-08 от 31 декабря 2009 «Поиск и характеристика новых молекулярных маркеров для ранней диагностики, прогноза течения, мониторинга эффективности лечения рака мочевого пузыря», по государственному контракту № 8/3-657н-08 от 31 декабря 2009 «Поиск и характеристика новых молекулярных маркеров для ранней диагностики, прогноза течения, мониторинга эффективности лечения рака почки», по государственному контракту № 02.740.11.0089 от 15 июня 2009 в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по теме «Разработка новых диагностических технологий на основе механизмов эпигенетической регуляции», по фанту Earlier Breast Cancer Test Foundation "Development and validation of a differential methylation screening technology applicable for the identification of early breast cancer diagnostic markers" (2007-2010 гг.).

Личный вклад автора.

Автором разработаны план исследования и основы методологии анализа метилирования ДНК, изложенные в работе, предложены ключевые модификации методов и протоколов скрининга метилирования ДНК (90%). Постановка и апробация всех новых методов проведены автором лично. Осуществлен дизайн 100 из 112 олигонуклеотидных праймеров для проведения ПЦР (90%). Выделение образцов ДНК и практическое исследование метилотипов различных типов злокачественных новообразований проведено совместно с коллегами из лаборатории эпигенетики ФГБУ «МГНЦ» РАМН. Проведен анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК, полученных в результате скрининга дифференциального метилирования, с использованием компьютерных программ и доступных баз данных метилирования ДНК, сформированы детальные карты метилирования соответствующих геномных локусов (100%). Охарактеризованы локальные параметры хроматина, определяющие состояние метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе (100%). Сформирован синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез, на основе локальных характеристик генома в норме и при злокачественной трансформации (100%).

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 66 печатных работ, в том числе 21 статья в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук, 8 глав в учебниках, 3 статьи в сборниках и коллективных монографиях, 28 тезисов, зарегистрированы 2 новые медицинские ДНК-технологии, 3 рекламно-технических описания компьютерных программ, 1 заявка на получение патента.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 238 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), описания результатов и их

обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 216 ссылок. Диссертация иллюстрирована 24 таблицами и 98 рисунками.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материал для исследования.

Образцы тканей опухолей молочной железы и прилежащих морфологически нормальных тканей получены от 270 больных РМЖ, 100 больных раком почки (РП), 55 больных раком мочевого пузыря (РМП) и 54 больных немелкоклеточным раком легких (НМРЛ), прооперированных в ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН, Урологической клинике им. P.M. Фронштейна ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.м' Сеченова Минздравсоцразвития России, ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России, ФГБУ «Медицинский радиологический научный центр» Минздравсоцразвития России. Гистологическую идентификацию тканей проводили в отделе патоморфологии опухолей НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН, отделе патоморфологии ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России и в патологоанатомическом отделении ФГБУ МРНЦ Минздравсоцразвития России, где были получены серийные срезы замороженных образцов опухолевых и прилежащих нормальных тканей. Образцы периферической крови и буккалыюго эпителия 90 больных B-клеточным острым лимфобластным лейкозом (B-OJUI) получены в ФНКЦ Детской гематологии, онкологии и иммунологии" Росздрава и ФГБУ "Гематологический научный центр" Минздравсоцразвития России. Диагноз В-ОЛЛ был поставлен и подтвержден с использованием стандартного набора методов: общего анализа крови с подсчетом лейкоцитарной формулы, микроскопического и цитохимического исследования мазков костного мозга, иммунофенотипирования бластных клеток, цитогенетического обследования. Клеточные линии РМЖ ZR-75-1, HBL-100, HS 578 Т, ВТ-474, T-47D и MCF7 предоставлены Федеральным государственным бюджетным учреждением науки Институтом биологии гена РАН. Образцы крови нормальных доноров предоставлены донорским пунктом ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (150 образцов). Образцы буккального эпителия (7 образцов) любезно предоставлены сотрудниками лаборатории эпигенетики ФГБУ «МГНЦ» РАМН.

Экстракция и анализ геномной ДНК.

Материалом для молекулярных исследований послужила геномная ДНК, выделенная из цельной крови и образцов солидных тканей стандартным методом фенол-хлороформной экстракции (Johns M.B.Jr., Paulus-Thomas J.E., 1989). Обработку ДНК бисульфитом натрия и последующую метилспецифическую ПЦР проводили в соответствии с самостоятельно разработанной и зарегистрированной ДНК-технологией (Стрельников В.В. с соавт., Разрешение ФС № 2011/134 от 27.05.2011 г.). Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции и лигирование фрагментов ДНК проводили по протоколам фирмы-производителя ферментов («Сибэнзим», Россия). Метилчувствительную ПЦР проводили по схеме, разработанной автором (Strelnikov V.V.et al., 1999). Для анализа метилирования импринтированных генов применяли собственную ДНК-технологию (Немцова М.В., Залетаев Д.В., Стрельников В.В., Разрешение ФС № 2011/131 от 27.05.2011 г.). Секвенирование и фрагментный анализ ДНК осуществляли по протоколам фирмы-производителя оборудования и реактивов («Applied Biosystems», США). Протоколы скрининга дифференциального

метилирования ДНК разработаны самостоятельно в соавторстве с сотрудниками лаборатории эпигенетики ФГБУ «МГНЦ» РАМН (Кузнецова с соавт., 2004; Стрельников с соавт., 2009).

Программное обеспечение планирования и анализа результатов экспериментов.

Дизайн олигонуклеотидных праймеров для ПЦР проводили с использованием публично доступных программ OLIGO (Rychlik, Rhoads, 1989), Methprimer (Li, Dahiya, 2002), Methyl Primer Express («Applied Biosystems», США). Визуализацию и анализ электрофореграмм капиллярного электрофореза обеспечивали самостоятельно разработанными и зарегистрированными компьютерными программами PeakPick и AIMS in silico (Танас A.C., Руденко В.В., Стрельников В.В.; регистрационные номера ВНТИЦ 50201050040 от 2010 г., и 50201151514 от 2011 г.). Планирование экспериментов и характеристику репрезентаций метиломов проводили с использованием программы AIMS in silico.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

В результате проведенного исследования разработана оригинальная методология скрининга дифференциального метилирования ДНК, проведена успешная апробация новых методов на материале клеточных линий рака молочной железы (РМЖ), после чего проанализированы репрезентации метиломов РМЖ, рака почки (РП), рака мочевого пузыря (РМП), немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), B-клеточного острого лимфобластного лейкоза (В-ОЛЛ), нормальных лимфоцитов периферической крови и буккального эпителия и выявлены характерные метилотипы, а также новые гены и локусы, дифференциально и постоянно метилированные в исследованных материалах. Проведен анализ состояния метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе в зависимости от локальных свойств хроматина и предложена гипотеза, связывающая эти характеристики.

На основе полученных результатов был сформирован синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез, на основе локальных характеристик генома в норме и при злокачественной трансформации. На завершающем этапе исследования была проведена апробация разработанного синтетического подхода на модели семейства генов, вовлеченных в канцерогенез (генов субъедшшц ламининов), продемонстрировавшая высокий предиктивный потенциал метода.

В области изучения дифференциального метилирования геномов нами разработана методология как предвзятого, так и непредвзятого скрининга. Предвзятые подходы подразумевают отбор локусов для исследования на основании той или иной гипотезы, предсказывающей наиболее вероятное выявление дифференциального метилирования именно этих локусов. Непредвзятый скрининг, напротив, предполагает определение дифференциального метилирования заранее неизвестных локусов генома с последующей идентификацией их нуклеотидных последовательностей. Непредвзятый скрининг эффективно выявляет дифференциальное метилирование геномных участков, которые, в силу недостаточной изученности эпигеномов, не подпадают под известные гипотезы и не включаются в анализ методами первой группы (Fraga M.F., Esteller M., 2002).

3.1. НЕПРЕДВЗЯТЫЙ СКРИНИНГ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ ГЕНОМОВ

Непредвзятый скрининг не только расширяет фундаментальные представления о роли метилирования ДНК в норме и при патологии, но и способствует диверсификации основ разработки эпигенетических диагностических маркеров. Непредвзятость скрининга - краеугольный камень объективной оценки состояния изучаемых метиломов (Schumacher A. el al., 2006, Gebhard С. et al., 2006). В то же время оптимального метода непредвзятого скрининга дифференциального метилирования на сегодняшний день не существует (Воск С., 2009). Была поставлена задача разработки такого метода и приняты за основу технологии метилчувствительного фингерпринтинга (МЧФП) и амплификации интерметилированных сайтов (АИМС).

Оптимизация метода МЧФП

Метод МЧФП разработан независимо от других авторов (наиболее ранний из опубликованных аналогов - MS-AP-PCR, methylation-sensitive arbitrarily primed PCR, Gonzaigo M.L. et al., 1997). Предложенный вариант отличается от «классического» и, поскольку он опубликован позднее (Дрозд О.В., Стрельников В.В., Немцова М.В., Залегаев Д.В., 2002), получил название «оптимизированного метода МЧФП».

МЧФП представляет собой один из наиболее наглядных способов визуализации дифференциально метилированных CpG-островков в составе различных геномов. Принципиальная схема метода представлена на рис. 1.

небогатые праймеры

Mspl

ПЦР

H pall

Отсутствие ПЦР-прсщукта

Roi Rial Rial Rial Rial Rial Rial Rial + + + + +

Mipl Hp all Mipl HpaH Mipl

KB В

I *ф

ЙЙШ

Н,.аП

Рис. 1. Схема метода МЧФП. Синим цветом обозначены С,0-богатые участки геномной ДНК, оранжевым - праймеры. Внизу справа - пример визуализации продуктов МЧФП в геле путем окраски нитратом серебра. 1, 2, 3 - образцы РМЖ, М -маркер молекулярной массы; стрелкой указан фрагмент, дифференциально метилированный в представленных образцах.

Для проведения анализа образцы ДНК подвергаются поэтапному гидролизу. На первом этапе ДНК гидролизуется частощепящей рестриктазой Ява!, сайт узнавания которой не содержит нуклеотидов С и б, с целью уменьшения размера фрагментов для дальнейшей амплификации и обогащения образцов фракцией СрО-островков. Аликвоты полученных рестриктов подвергаются параллельному гидролизу чувствительным и нечувствительным к метилированию изошизомерами Нра11 и Мхр1, имеющими сайт узнавания (ХХЗО.

Полимеразная цепная реакция с вырожденными С,С-богатыми праймерами проводится для каждой из групп рестриктов Ква1, КзаГ+Мйр!, ЯваГ+НраП при мягких условиях (низкая температура отжига). В результате амплификации рестриктов Ква1 формируется пул СО-богатых фрагментов. Амплификация проб, подвергнутых обработке Ява! и нечувствительным к метилированию ферментом М$р[, позволяет определить наличие сайта узнавания ССвО, при существовании которого происходит разрыв матрицы между праймерами и ПЦР-продукт не обнаруживается. Наконец, амплификация рестриктов Г^а^НраП позволяет проанализировать состояние метилирования фрагмента ДНК. Если внутренний СрО-динуклеогид в сайте узнавания неметилирован, фрагмент гидролизуется метилчувствительной рестриктазой и ПЦР-продукт отсутствует. В случае метилирования сайта матрица остается интактной и продукт амплификации детектируется в геле (Оопга^о М.Ь. е! а1., 1997; Кузнецова Е.Б., Стрельников В.В., 2006).

В классическом варианте метода МЧФП применяется ПЦР с радиоактивно мечеными праймерами с последующей радиоавтографией денатурирующих гелей с низкой концентрацией акриламида. Такой подход означает неприемлемую в современных лабораторных условиях токсичность, высокие материальные и временные затраты, неоправданную трудоемкость исследования.

Секвенирование фрагментов МЧФП опосредуется трудоемкой и многоэтапной процедурой клонирования ПЦР-продуктов, изоляция которых из геля происходит в отсутствие возможности непосредственного визуального контроля процесса. Этот блок протокола МЧФП требует заменены, желательно, прямым секвенированием с праймеров, использующихся при постановке МЧФП. Необходимо также обеспечить непосредственный визуальный контроль за изоляцией интересующих фрагментов, а также сократить промежуток времени от анализа геля и выявления фрагментов до их реамплификации, что должно способствовать сохранению целостности ДНК.

В разработанном оптимизированном варианте метода процедура клонирования фрагментов ДНК, извлеченных из геля, заменена непосредственным прямым секвенированием с праймеров, использующихся при постановке МЧФП. Основная проблема при этом заключается в том, что даже при использовании в МЧФП пары разных праймеров продукт амплификации с высокой вероятностью может быть фланкирован только одним из них. Решение основано на том, что все интересующие продукты МЧФП содержат, по крайней мере, один сайт узнавания рестриктазы М$р1, поскольку именно по этому признаку и производится их селекция. Гидролиз продуктов реамплификации фрагментов, элюированных из геля, этим ферментом приводит к образованию фрагментов различной длины, два из которых оканчиваются последовательностями, гомологичными праймеру. Секвенирование смеси рестриктов с этого праймера в подавляющем большинстве случаев приводит к получению информативной нуклеотидной последовательности, достаточно протяженной для однозначной идентификации искомого участка генома.

Критика основных недостатков классического варианта МЧФП в сопоставлении с предложенными усовершенствованиями на каждом из этапов представлены в табл. 1.

Таблица 1. Недостатки классического МЧФП и способы оптимизации метода.

Этап протокола Недостатки классического МЧФП Механизмы оптимизации метода

Фракционирование продуктов МЧФП Фракционирование в денатурирующих гелях низкой плотности (снижение сохранности фрагментов ПЦР, повышение трудоемкости процессов) Разработка протокола фракционирования продуктов МЧФП в неденатуриругащих гелях средней плотности (8% акриламида)

Визуализация продуктов МЧФП Использование в ПЦР радиоактивно меченых праймеров (токсичность, высокие материальные и временные затраты) Разработка протокола детекции ПЦР-продуктов, полученных с немеченых праймеров, с визуализацией фрагментов ДНК непосредственно в геле -окраска неденатурирующих гелей средней плотности нитратом серебра.

Детекция сигналов методом радиоавтографии (временные затраты, пространственное разделение носителя биологического материала -геля - и носителя визуальной информации - радиоавтографа)

Подготовка к секвенированию продуктов МЧФП Клонирование фрагментов ДНК (многоэтапный процесс, требующий неоправданных затрат времени, расходных материалов и оборудования) Реамплификация ПЦР-продуктов с праймеров, использованных для МЧФП, после предварительного определения специфических фланков продуктов МЧФП.

Состав репрезентаций генома, генерируемых методом МЧФП

С использованием разработанной модификации метода МЧФП проанализировано 40 парных (норма + опухоль) образцов ДНК больных РМЖ и выявлено 43 фрагмента, содержащих, по крайней мере, один сайт узнавания рестриктазы Mspl. Среди этих фрагментов 25(58%) были метилированы и 11(26%) неметилированы во всех образцах. Для 7(16%) фрагментов было показано дифференциальное метилирование, по крайней мере, в одной из пар образцов. Эффективность выявления дифференциально метилированных фрагментов ДНК с помощью разработанной модификации метода сопоставима с результатами, полученными другими авторами. Так в работе Liang, основанной на применении метода МЧФП (Gonzalgo M.L. et al., 1997), дифференциально метилированные фрагменты составили 13,5% от общего количества полученных фрагментов (Liang G. et al, 1998). Высокая эффективность нашего метода говорит об удачном дизайне последовательностей праймеров, выбранных для эксперимента, и об адекватности разрешающей способности применяемого способа разделения репрезентаций МЧФП.

Результаты прямого секвенирования выявленных дифференциально

метилированных фрагментов позволили провести компьютерный анализ их последовательности, на основании которого они были идентифицированы как участки CpG-островков генов LAMC3, SEMA6B, VC1P135, B1N1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1. Аномальное метилирование указанных CpG-островков при РМЖ продемонстрировано впервые. Из перечисленных генов лишь для одного, супрессора опухолевого роста BIN1, доказано участие в канцерогенезе (Ge R. et al., 1999), в то время как целенаправленного изучения роли молекулярной патологии других генов при раке не проводилось.

Полученные результаты показывают, что оптимизированный метод МЧФП позволяет эффективно выявлять новые гены, подвергающиеся аномальному метилированию при канцерогенезе. В то же время, в самой природе МЧФП заложен ряд принципиально неустранимых недостатков. В частности, как было показано, продукты МЧФП, соответствующие дифференциально метилированным участкам генома, составляют в среднем не более 15% всех продуктов реакции, содержащих сайты узнавания рестриктазы Mspl. На фоне же общей репрезентации доля дифференциально метилированных фрагментов не превышает единичных процентов. Таким образом, область разделения элементов репрезентации МЧФП занята в основном неинформативными элементами, доля которых может превышать 95%. Второй системный недостаток МЧФП - использование статистических праймеров, не допускающее ни малейшей стандартизации метода.

К началу 2000-х гг. назрела необходимость разработки подхода к скринингу дифференциального метилирования геномов, не уступающего по эффективности МЧФП и лишенного присущих ему недостатков. В 2002 году такая технология, основанная на адаптер-опосредованной амплификации интерметилированных сайтов (АИМС), была опубликована испанскими исследователями (Frigola J. et al., 2002).

Проведен критический анализ метода АИМС, результатом которого фактически стало создание не просто модифицированного метода АИМС, а принципиально новой технологии анализа длин амплифицируемых фрагментов -AFLOAT (Amplified Fragment Length Oriented Analysis Technique), которая может использоваться как для изучения дифференциального метилирования ДНК, так и в более широких геномных приложениях.

Разработка оригинального алгоритма непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов: технология AFLOAT

Биотехнологической основой разработки новой технологии стал метод АИМС (Frigola J. et al., 2002), представленный на рис. 2. На первом этапе ДНК обрабатывают метилчувствительной рестриктазой Smal (сайт узнавания CCC/GGG), которая оставляет фрагменты с «тупыми» концами. Метилированные гексануклеотиды CCCGGG, оставшиеся интактными, затем расщепляются рестриктазой Xmal (сайт узнавания C/CCGGG), формирующей фрагменты с «липкими» концами. Последние способны взаимодействовать с адаптерами в реакции лигирования и амплифицироваться в последующей ПЦР. ПЦР всей совокупности лигированных фрагментов проводится с радиоактивно меченых праймеров, в целом гомологичных адаптеру, но удлиненных на 1-4 случайно выбранных нуклеотида, составляющих удлинитель универсального праймера. Дальнейшие манипуляции аналогичны таковым, производимым при МЧФП для визуализации и секвенирования дифференциально метилированных фрагментов. Регуляция количества продуктов ПЦР осуществляется путем подбора длины и состава удлинителя универсального

праймера. Теоретически, исходя из представленности нуклеотидов в геноме человека, добавление каждого последующего снижает количество продуктов реакции примерно в 5 раз для С,О и в 3 раза для А,Т. Подбор оптимального размера репрезентации обеспечивает хорошее разделение и высокую информативность бэндов на радиоавтографах и облегчает изоляцию интересующих Срв-островков (Рпео1а J е1 а!.. 2002).

5та|

Хта!

Рис. 2. Схема метода амплификации ингерметилированных сайтов. Сплошная линия изображает участок геномной ДНК, содержащий семь сайтов ССССвв. I Неметилированные сайты обозначены синим цветом, метилированные - красным, адаптеры - зеленым. Радиоавтографы полиакриламидных гелей (ПААГ) иллюстрируют фингерпринты, полученные с использованием праймеров, удлиненных ) на 1-3 нуклеотида. Схема адаптирована из публикации Б1^о1а .1. с соавт. (2002), ' приводится по источнику: Стрельников В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В. в I учебнике "Системы генетических и эпигенетических маркеров в диагностике онкологических новообразований", 2009. С. 83.

Проведен критический анализ метода АИМС для каждого из технологических | этапов, в принципе свойственных любому методу скрининга дифференциального ' метилирования геномов: подготовки геномных репрезентаций, их редукции, разделения элементов репрезентаций, визуализации элементов репрезентаций, I определения их геномной принадлежности, сравнения репрезентаций.

На этапе подготовки геномных репрезентаций используются метилчувствительные рестриктазы (напр., 8та1, Нра11) и их нечувствительные к метилированию изошизомеры (Хта1, \lspl, соответственно). Не исключено, что этот технологический этап можно оптимизировать на уровне планирования набора рестриктаз на основе математического моделирования результатов АИМС, которое могло бы продемонстрировать ряд количественных и качественных характеристик репрезентаций, получаемых при работе с тем или иным геномом.

Редукция геномных репрезентаций в методе АИМС осуществляется двумя способами. Во-первых, это выбор используемых рестриктаз: гидролиз геномной ДНК более частощепящими ферментами приводит к формированию более представительных репрезентаций. Во-вторых, на этапе ПЦР могут использоваться удлинители универсальных праймеров, снижающие мощность репрезентации, причем с увеличением длины удлинителя репрезентативность падает. Оба способа редукции используются в настоящее время, однако определение их оптимального соотношения остается эмпирическим (Е51е11ег М., 2005). Оптимизация на этом этапе должна заключаться в разработке инструмента моделирования результатов АИМС при использовании различных способов редукции с целью получения репрезентаций, обеспечивающих наилучшие возможности их анализа на последующих этапах.

На этапах визуализации и определения геномной принадлежности продуктов реакции проблемы реализации АИМС идентичны таковым, описанным выше для МЧФП. Для метода, генерирующего такое значительное количество целевых фрагментов ДНК, как АИМС этап разделения должен быть реализован на платформе, обеспечивающей наиболее высокое разрешение фрагментов ДНК. Такая платформа представлена на сегодняшний день капиллярным электрофорезом (КЭФ) в формате фрагментного анализа. Предложен способ дискриминации продуктов АИМС, синтезированных с флуоресцентно меченых праймеров, с помощью КЭФ, который значительно повышает разрешающую способность метода, избавляет от необходимости использования радиоактивно меченых материалов, сокращает время получения результатов анализа образца. Данные КЭФ представлены в цифровом виде, что позволяет применить средства цифровой обработки сигналов для сравнения репрезентаций.

Высокая разрешающая способность капиллярного электрофореза в сочетании с компьютерным обеспечением анализа результатов обеспечивают высокоточное определение длин выявляемых дифференциально метилированных фрагментов генома. Такая информация может использоваться для определения геномной принадлежности интересующих фрагментов путем сравнения с виртуальными представлениями репрезентаций геномов, что исключает этапы физической изоляции их из геля, клонирования и секвенирования, снижая, тем самым, временные затраты, трудоёмкость и ресурсоёмкость исследования.

Сочетание преимуществ платформы АИМС, капиллярного электрофореза и математического анализа с современными возможностями биоинформатики позволяют сформировать блок-схему современного метода непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов (рис. 3). Было показано, что выбранный за основу разработки метод АИМС требует модификации каждого из ключевых этапов осуществления скрининга, причем многие модификации осуществимы только с применением методов биоинформатики и математического моделирования.

Рис. 3. Блок-схема метода непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов на основе технологии анализа длин амплифицируемых фрагментов - AFLOAT. Указаны ключевые необходимые модификации традиционных подходов.

Для обеспечения обоснованного дизайна экспериментов АИМС путем предварительного моделирования ожидаемых результатов разработана программа компьютерной симуляции «AIMS in silico». Алгоритм работы программы заключается в следующем. На первом этапе моделируется полный набор фрагментов ДНК, получаемых при обработке исследуемого генома основной рестриктазой АИМС (в классическом варианте это - Xmal). Фактически этот набор - полная репрезентация АИМС, представляющая собой субстрат для дальнейших исследований in silico с целью моделирования возможных результатов АИМС в реальном эксперименте при различных удлинителях универсального праймера. В дальнейшем полная репрезентация виртуально подвергается лигированию с предложенным пользователем адаптером и амплифицируется с универсальным праймером, содержащим заданный удлинитель. Таким образом, алгоритм моделирования результатов экспериментов практически воспроизводит протокол осуществления АИМС in vitro. С использованием разработанной компьютерной программы охарактеризован состав репрезентаций генома, генерируемых методом АИМС. Количественная иерархия продуктов в зависимости от длин и нуклеотидного состава удлинителей универсальных праймеров представлена в виде гистограммы на рис. 4. Гистограмма ясно демонстрирует ошибочность постулата авторов метода АИМС о том, что при прочих равных условиях добавление каждого дополнительного нуклеотида к универсальным праймерам предполагает снижение сложности результирующей картины в 5 раз для C,G и в 3 раза для А,Т. Важно, что

экспериментальное определение параметров, представленных на рис. 4, потребовало бы невероятных затрат труда, времени и материалов, а неопределение наверняка привело бы к ложной интерпретации опытных данных.

c"ccggg

Рис. 4. Иерархическая диаграмма продуктов АИМС, предсказанных для следующих условий эксперимента: сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции СлССООО, удлинители всех типов от 0 до 3 нуклеотидов, длина анализируемых продуктов АИМС - до 1 тыс. нуклеотидов. Синим цветом обозначено общее количество первичных фрагментов (при отсутствии удлинителей) - около 100 тыс. Красным указаны количества продуктов, получаемых при использовании однонуклеотидпых удлинителей, желтым - двухнуклеотидных, зеленым -трехнуклеотидных. Ось абсцисс представляет собой логарифмическую шкалу, поскольку разница в количестве фрагментов составляет от 1 до 100000. (В соавторстве с А.С.Танасом).

Для визуализации, анализа и дифференциации капиллярных электрофореграмм, полученных па автоматических генетических анализаторах и представленных в файлах формата АВШ, разработана компьютерная программа РеакРкк (рис. 5). Важнейшей функцией программы РеакРшк является осуществление дифференциального анализа электрофореграмм репрезентаций различных геномов (нормального/опухолевого геномов, геномов организмов разных штаммов/сортов/видов) для определения степени генетического сходства/различия исследуемых образцов биологического материала. Эта опция делает программу незаменимой при проведении сравнительного анализа геномных фингерпринтов.

^ >1 □ ^ 1а_

I- tumor- norm I

3000 , |

с 2000 с 1000 № --- - L. fi у

80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 Nucleotide length

Рис. 5. Фрагмент окна сравнительного анализа электрофореграмм компьютерной программы РеакРюк.

Традиционный дизайн АИМС предполагает клонирование и секвенирование интересующих фрагментов ДНК для определения их геномной принадлежности. Поскольку определение нуклеотидной последовательности генома человека практически полностью завершено и, соответственно, последовательности возможных продуктов АИМС также известны, этапы клонирования и секвенирования были заменены последовательными этапами рестриктазного картирования in silico и in vitro.

Для моделирования рестриктазного картирования был введен дополнительный модуль в программу AIMS in silico. Моделирование проводится на основе полной репрезентации АИМС, предсказанной для конкретных условий эксперимента, с использованием рестриктаз, выбираемых из заранее сформированного списка. I Программа предоставляет информацию о фрагментах, подвергающихся гидролизу ' выбранной рестриктазой. I

Разработан алгоритм интеграции рестриктазного картирования in silico и in ' vitro. Картирование продуктов АИМС, получаемых в эксперименте, проводится, как и в случае компьютерного моделирования, на основе полной репрезентации АИМС. Для создания полной репрезентации in vitro из лабораторного протокола АИМС исключается этап гидролиза ДНК метилчувствительной рестриктазой Smal. Таким образом моделируется состояние полного метилирования изучаемого генома. Пример полной репрезентации АИМС с удлинителем CCG и картирования трех из представленных на ней продуктов АИМС приведен на рис. 6.

Рис. 6. Пример рестриктазного картирования репрезентации АИМС in vitro (использована рестриктаза BssHII). Ось абсцисс - длины фрагментов ДНК в нуклеотидах, ось ординат - интенсивность сигналов флуоресценции. Красный график

- электрофореграмма интактной полной репрезентации АИМС-CCG. Черный график

- электрофореграмма полной репрезентации АИМС-ССС после гидролиза. Указана геномная принадлежность детектированных участков.

Валидация технологии AFLOAT: анализ дифференциального метилирования ДНК клеточных линий рака молочной железы

Демонстрацию возможностей технологии AFLOAT проводили на модели сравнения участков геномов клеточных линий РМЖ: ZR-75-1, HBL-I00, HS578T, ВТ-474, T-47D и MCF7. Для создания репрезентаций эпигеномов использовался протокол АИМС с удлинителем CCG. Сравнение электрофореграмм продуктов АИМС проводили в пределах длин от 150 до 200 п.н. При сравнении электрофореграмм выявлены дифференциально метилированные локусы в диапазонах длин 150-167 167-176 и 176-190 п.н. (рис.7).

- ZR MS HBL.MS HS.MS

Рис. 7. Сравнение электрофореграмм продуктов АИМС с удлинителем ССО для клеточных линий РМЖ. (В соавторстве с А.С.Танасом).

Моделирование с помощью программы AIMS in silico предсказывает получение в эксперименте АИМС с удлинителем CCG в указанном диапазоне трех групп продуктов: 1) ccgl64, ccgl65, ccgl68; 2) ccgl76, ccgI77.1, ccgl77.2, и 3) ccgl89. С помощью программы AIMS in silico разработан и реализован план рестриктазного картирования этих локусов. В качестве примера приведем локус ccgl65, для которого in silico предсказана уникальная картирующая рестриктаза SblL Гидролиз полной репрезентации АИМС этим ферментом позволил определить положение на электрофореграмме сигналов продуктов, соответствующих искомому локусу. Эти сигналы наблюдаются на уровне длин 160 и 162 п.н.; кроме того, на электрофореграмме виден один из продуктов гидролиза - 115 п.н. (рис. 8).

Size (nucleotides)

Рис. 8. Сравнение электрофореграмм полной репрезентации продуктов АИМС (черным) и после гидролиза Sbfl (красным). Зелеными стрелками обозначены пики продуктов, соответствующие продукту АИМС ccg)65, синей стрелкой - продукт гидролиза.

В результате серии экспериментов однозначно определено положение на электрофореграмме пиков продуктов АИМС с удлинителем CCG, соответствующих локусам, дифференциально метилированным в исследуемых клеточных линиях, и охарактеризована геномную принадлежность этих локусов. Четыре из них представляют собой участки промоторных CpG-островков генов ATMIN, ANK3, MAFK и C2CD2, распространяющихся на первые экзоны и первые интроны генов. Два локуса являются межгенными CpG-островками, расположенными на хромосомах 12q 13.13 и 13q32.1. Седьмой локус не принадлежит CpG-островку и соответствует первому экзону гена PURB.

Результаты анализа метилирования, полученные методом AFLOAT, подтверждали метилспецифическим секвенированием исследуемых локусов (рис. 9).

Рис. 9. Пример валидации результатов AFLOAT методом метилспецифического секвенирования. Фрагменты электрофореграмм секвенирования локуса ccgl77.2 в клеточной линии MCF7. Стрелками указаны сайты узнавания рестриктазы Smal в полностью метилированном состоянии (после бисульфитной обработки - TTCGGG).

Сравнение результатов, полученных методами AFLOAT и метилспецифического секвенирования, показало совпадение оценок статуса метилирования в 92% (33/36) случаев. В 3 случаях из 36 метилспецифическое секвенирование не подтвердило наличия метилирования, выявленного AFLOAT. Возможно, данные метилспецифического секвенирования в некоторых случаях не подтверждают метилированного статуса по причине недостаточной чувствительности собственно метода секвенирования. Опубликованные в литературе оценки различных методов выявления мутаций в отношении их способности определять мозаичные мутации показало следующие значения чувствительности (детектируемая доля молекул ДНК с мутацей в пуле ДНК дикого типа): секвенирование по Сэнгеру - 1550%, анализ полиморфизма конформации однонитевых фрагментов / анализ гетеродуплексов - 5-25%, денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография - 5-25% и параллельное секвенирование - 1%. Использования только секвенирования по Сэнгеру недостаточно для выявления мозаичных мутаций низкого уровня. Параллельное секвенирование при достаточном количестве прочтений (глубине покрытия) позволяет достичь наилучших результатов, однако возможности его использования на сегодняшний день ограничены сложностью, высокой стоимостью анализа и доступностью оборудования.

В настоящем исследовании в качестве дополнительного метода подтверждения результатов AFLOAT применен метилспецифический анализ конформации однонитевых фрагментов, показавший их аномальную электрофоретическую подвижность, говорящую о наличии метилированных клонов в спорных образцах. Проведенное исследование говорит о высокой чувствительности разработанного метода анализа дифференциального метилирования геномов.

Выявление и характеристика дифференциально н константно метилированных локусов в образцах рака молочной железы

Применение технологии AFLOAT к выборке операционных образцов РМЖ и нормальных тканей позволило идентифицировать 19 новых локусов генома, аномально метилированных при РМЖ. Совокупно с результатами применения МЧФП, в работе выявлено 26 таких локусов (табл. 2). Среди них 4 являются межгенными (области хромосом 1рЗЗ, 5р 15.33, 12ql3.13 и 13q32.1), 5 - интронными

(гены BIN1, RAI1, GPC2, PPP2R5C, PHF1), 2 расположены в первых экзонах (гены ATMIN, IQSEC2). Лишь около половины полученных фрагментов (относятся к генам LAMBI, KCNH8, DOCK6, SH3KBP1, C2CD2, KIAA1324L, АХ746725/АК127124. ТМЕМ176А/ТМЕМ176В, FOXM1/HKMT1188, LAMC3, SEMA6B, VCIP135, KCNH2, CACNG4 и PSMF1) имеют локализацию, каноническую для дифференциального метилирования при канцерогенезе. Таким образом, разработанные методы непредвзятого скрининга позволяют идентифицировать дифференциально метилированные локусы геномов независимо от их расположения относительно кодирующих областей, промоторов и сайтов инициации транскрипции.

Сравнение электрофореграмм полных репрезентаций и продуктов АИМС для образцов ДНК нормальной молочной железы, РМЖ, РП, РМП и мононуклеаров периферической крови выявило среди продуктов АИМС с удлинителями GCG и CCG четыре константно метилированных фрагмента (рис. 10). Картирование показало, что эти фрагменты соответствуют интронному СрО-островку гена TAF4, участку интрона гена MADIL1, CpG-островку гена CUX1 в составе альтернативного З'-концевого экзона, и З'-CpG-ocTpoBKy гена ZBTB4.

Nucleotide length

Рис. 10. Пример выявления константно метилированных локусов генома путем сравнения электрофореграмм полной репрезентации (синяя линия) и продуктов АИМС (красная линия) с удлинителем CCG для образца ДНК нормальной молочной железы. Сигналы константно метилированных локусов указаны стрелками.

Таким образом, разработана оригинальная методология непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов злокачественных новообразований, в основе которой лежат способы получения фингерпринт-подобных репрезентаций по протоколам гидролиза ДНК метилчувствительиыми рестриктазами с последующей амплификацией (методы МЧФП и АИМС). Использование разработанных технологий для скрининга дифференциального метилирования геномов клеточных линий РМЖ и операционных образцов РМЖ позволило выявить 26 участков генома, подверженных аномальному метилированию, значительная часть из которых характеризуется неканонической локализацией, что подтверждает высокую эффективность методов и непредвзятость проведенного скрининга.

Особенности метилирования участков генома, выявленных скринингом дифференциального метилирования, проанализированы локус-специфическими методами анализа метилирования ДНК.

3.2. ЛОКУС-СПЕЦИФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ ГЕНОМОВ

Методология анализа метилирования отдельных геномных

локусов

Методы анализа локус-специфических паттернов метилирования в большинстве своем требуют осуществления первоначальной амплификации исследуемой последовательности. Поскольку ДНК-полимераза в ходе синтеза ДНК не различает цитозин и 5-метилцитозин, в процессе иолимеразной цепной реакции и клонирования информация о метилировании утрачивается. Ряд ферментов и химических соединений, таких как, метилчувствительные рестриктазы, бисульфит (HS03"), гидразин (N2H4), перманганат (Мп04"), могут быть использованы для модификации оснований, что позволяет различить цитозин и 5-метилцитозин в ходе последующего анализа.

Для детекции продуктов расщепления ДНК метилчувствительными рестриктазами использован метод метилчувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР). Праймеры для проведения МЧ-ПЦР фланкируют сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции, поэтому исследуемый фрагмент амплифицируется только при отсутствии расщепления ДНК по этому сайту. Для предупреждения ложноположительных результатов, возникающих из-за неполного гидролиза матрицы, необходимо предпринимать ряд предосторожностей. Поскольку доступность ДНК для рестрикции обычно уменьшается вследствие наличия примесей, наилучшим способом обеспечения полноты гидролиза является тщательная очистка ДНК с применением протеиназы К (Singer-Sam J. et al„ 1990a). Следует учитывать и вероятность получения ложноотрицательных результатов, когда продукт МЧ-ПЦР с гидролизованной матрицы отсутствует не по причине полного гидролиза неметилированной ДНК образца, а по причине его плохого качества (деградация ДНК, ингибиторы ПЦР). Очевидно, адекватную техническую диагностику ложноположительных и ложноотрицательных результатов МЧ-ПЦР можно обеспечить лишь включением в систему двух типов контролей: эффективности ПЦР и полноты гидролиза матрицы.

За всю историю практического использования МЧ-ПЦР в исследованиях и диагностике вопросы о необходимости таких контролей поднимались (и решались) лишь на этапе разработки технологии как таковой (конец 80-х годов прошлого века, на уровне однолокусных реакций) и в последние годы (после 2005 г., в связи с внедрением высокопроизводительных технологий метилчувствителыюго анализа). В одной из ранних работ при формировании внутреннего контроля полноты гидролиза удачно эксплуатируется неметилированное состояние ДНК М13, которая использовалась в качестве носителя при экстракции ДНК исследуемых эукариот (Singer-Sam J. et al, 1990a). Теми же авторами был предложен и элегантный дизайн контроля эффективности ПЦР, для которого in vitro искусственно создавалась делеция тестируемого локуса, элиминирующая сайт узнавания метилчувствительной рестриктазы (Singer-Sam J. et al, 1990b).

Анализ литературы показывает, что предложенные в 1990 г. технические решения впоследствии на практике не применялись. Тем не менее, общая идеология дизайна контроля полноты гидролиза на основе матрицы, всегда содержащей сайты узнавания метилчувствительной рестриктазы в неметилированном состоянии, сохранилась в более поздних разработках. Так, в дизайне количественного теста для

определения аномалий метилирования при синдромах Прадера-Вилли и Ангельмана в формате MLPA (мультиплексной лигазной проба-зависимой амплификации) авторы использовали в качестве такой матрицы участок промоторного CpG-островка гена MLH1 (Procter М. et al., 2006). Другая технология определения количественного метилирования при тех же синдромах, основанная на ПЦР в реальном времени, использует в качестве контроля полноты гидролиза промоторный участок гена CFTR (von Kanel Т. et al., 2010).

Следует учитывать, что указанные контроли полноты гидролиза ДНК разработаны для использования в исследованиях, связанных с геномным импринтингом. При болезнях импринтинга нарушения характера метилирования ограничены достаточно небольшими хромосомными участками (в частности, при синдромах Прадера-Вилли и Ангельмана - 15qll-ql3). Это позволяет рассматривать практически весь остальной метилом как стабильную систему и как плацдарм для произвольного выбора контрольных локусов. Такая логика неприменима в исследованиях аномалий метилирования при канцерогенезе. В геномах злокачественных новообразований наблюдаются многочисленные нарушения нормального метилирования, в том числе гиперметилирование CpG-островков, что не позволяет использовать большую их часть в качестве контрольных. Так, для MLH1, который является классическим геном-супрессором опухолевого роста, показана частая инактивация в опухолях посредством метилирования промоторного CpG-островка (Залетаев Д.В. с соавт., 2009). Аномальному метилированию при канцерогенезе могут подвергаться и гены, предполагать роль инактивации которых в формировании фенотипа опухолевых клеток а priori трудно. Например, промотор гена CFTR, неметилированный во всех нормальных тканях, демонстрирует плотное метилирование в клеточных линиях РМЖ и РПЖ, HeLa, MCF7, и LNCaP. Таким образом, этот локус может служить контрольным лишь для исследований аномалий метилирования при врожденных генетических болезнях, в то время как в исследованиях метиломов опухолевых клеток состояние его метилирования может оказаться скорее маркерной, чем контрольной категорией.

В то же время принадлежность гена классу опухолевых супрессоров не означает автоматически возможности аномального метилирования его промоторной области в геномах опухолей. Одним из примеров такого рода служит ген INGI, продукт которого непосредственно взаимодействует с белком р53 и является компонентом соответствующего регуляторного пути, т.е. задействован в процессах остановки клеточного цикла и инициации апоптоза. Нарушения экспрессии ING1 характерны для самых разнообразных злокачественных опухолей, а частота потери гетерозиготности, в частности, в образцах HMPJI превышает 50% (Luo Z.G. et al., 2011). В промоторной области гена расположен классический CpG-островок, что обусловило проведение исследования, ставящего целью выявить его маркерное аномальное метилирование при канцерогенезе. Результат получен неожиданный: исследуемый CpG-островок неметилирован не только в нормальных тканях человека (кровь, буккальный эпителий, аутопсийный материал молочной железы), но и во всех исследованных типах опухолей - РМЖ, ОЛЛ, НМРЛ, РП, РПЖ, РЖ, РМП. Статус метилирования ING1, исследованный в общей сложности на более чем 1000 образцов биологического материала, во всех случаях оказался отрицательным. Результаты настоящего исследования подтверждаются недавно опубликованными на сайте Калифорнийского университета (http://genome.ucsc.edu) результатами ограниченного бисульфитного секвенирования CpG-островка гена ING1.

Таким образом, возможность дифференциального метилирования геномных локусов в опухолях далеко не в полной мере определяется функцией гена и промоторным расположением его СрО-островка. Вопрос о дополнительных предикторах дифференциального метилирования обсуждается ниже, однако необходимо принимать во внимание, что использование локуса в качестве субстрата для формирования контролей полноты гидролиза ДНК для МЧ-ПЦР должно предваряться подробными исследованиями характера его метилирования в широком спектре нормальных и опухолевых тканей. Результаты такого рода исследования, проведенного для СрС-островка гена /М7/, позволили впервые предложить обоснованные контроли полноты гидролиза для МЧ-ПЦР (рис. 11).

М N Л /11 21 2п 41 4п Л 5п Р

Ш ..............-

I. л

Ьщ1 1АМСЗ

тш муММММММУМ^!^-

Рис. 11. Пример анализа метилирования промотора гена ЬАМСЗ методом МЧ-ПЦР. М - маркер молекулярной массы ДНК. N - отрицательный контроль ПЦР. 1-5 -парные образцы тканей молочной железы (I - опухоль, п - норма). 1( и 21 -метилированное состояние промотора ЬАМСЗ в опухолях. Р - положительный контроль ПЦР (в качестве матрицы использована негидролизованная ДНК). Для контроля полноты гидролиза ДНК использован фрагмент гена ¡N0!, содержащий сайты узнавания метилчувствителыюй рестриктазы, но не подвергающийся метилированию в опухолях. Внутренний контроль ПЦР обеспечивает фрагмент гена МеСР2, не содержащий сайтов узнавания используемой рестриктазы. Приводится по источнику: Стрельников В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В. в учебнике "Системы генетических и эпигенетических маркеров в диагностике онкологических новообразований", 2009. С. 96.

Решение вопроса о формировании систем контролей эффективности амплификации для МЧ-ПЦР также оказалось неочевидным. В частности, предпринят подход к использованию в качестве контрольных участков нормально импринтированных генов. Для СрО-островков импринтированных генов показано постоянное метилирование одного из аллелей в тканях взрослого организма, за исключением довольно редких случаев болезней импринтинга (Немцова М.В., Залетаев Д.В., 2004). Проведен анализ характера метилирования импринтированного гена ЮР2 в образцах НМРЛ, РМЖ, ретипобластомы и ОЛЛ, показавший, что при этих злокачественных новообразованиях наблюдается потеря импринтинга, которая выражается в аномальном деметилировании гена Таким образом, критерий состояния метилирования гена ^GF2 можно использовать скорее как маркер опухолевого процесса, нежели как признак эффективности амплификации в МЧ-ПЦР.

После исключения возможности использования импринтированных локусов в качестве основы для дизайна контролей эффективности МЧ-ПЦР была предпринята попытка такого дизайна на основе последовательностей генома, полностью

лишенных сайтов узнавания используемых метилчувствительных рестриктаз (Hpall, Hhal). Важно, что кандидатные локусы должны обладать общими свойствами с последовательностями, тестируемыми методом МЧ-ПЦР, а именно, характеризоваться богатым 0,С-составом для обеспечения специфического отжига всех пар праймеров при проведении многолокусной реакции. Проведенный поиск таких последовательностей лишь подтвердил известный факт высокой плотности сайтов узнавания метилчувствительных рестриктаз в участках G,C-o6orautein«. По результатам нашей работы максимальная протяженность внутреннего контрольного продукта МЧ-ПЦР, для формирования которого приемлемы температуры отжига праймеров, превышающие 68°С, составила 105 п.н. (участок CpG-островка гена MeCPZ). Пример использования этого внутреннего контроля представлен на рис. 11. Очевидным его недостатком является малый размер ПЦР-продукта, не удовлетворяющий требованию к внутреннему контролю ПЦР о превышении размера тестируемого фрагмента.

Ключ к формированию внутренних контролей МЧ-ПЦР получен в настоящей работе по результатам использования методов непредвзятого скрининга метиломов, выявивших локусы, постоянно метилированные во всех исследованных нормальных и опухолевых тканях. В частности, с использованием AFLOAT выявлено константное метилирование участков генов CUX1, MAD1L1, TAF4, ZBTB4. Протяженности охарактеризованных константно метилированных последовательностей достаточны для формирования систем внутреннего контроля эффективности МЧ-ПЦР с любой разумной молекулярной массой и широким выбором температур отжига праймеров.

Метилчувствительная ПЦР идеальна для анализа метилирования индивидуальных локусов. В то же время многие ДНК-диагностические процедуры предполагают исследование нескольких генов (локусов) в рамках одного теста. Решение этой задачи при помощи традиционного подхода проведения многолокусной ПЦР в одной пробирке применительно к анализу метилирования наталкивается на препятствие в виде особенностей первичной структуры CpG-островков. От достаточно индивидуальных кодирующих областей генов CpG-островки отличаются сниженной информативностью нуклеотидных последовательностей, что не позволяет осуществлять дизайн удовлетворительно уникальных праймеров для ПЦР-анализа. Как следствие, проведение многолокусной метилчувствительной ПЦР чревато образованием неспецифических продуктов реакции, затрудняющих анализ и интерпретацию результатов диагностики.

Повышение специфичности достигается при использовании для анализа метилирования многих локусов технологии ДНК-микрочипов. Положительный эффект обеспечивается дополнительным этапом анализа - гибридизацией ПЦР-продуктов со специфичными ДНК-зондами. Однако, несмотря на то, что консенсусной последовательности CpG-островка как такового не существует, степень гомологии между различными CpG-островками значительно выше, чем между различными индивидуальными кодирующими последовательностями ДНК. Такая пониженная информативность последовательностей CpG-островков в случае применения ДНК-микрочипов создает технические проблемы, вызванные перекрестной гибридизацией. В целом, любые технологии анализа метилирования ДНК, включающие этап гибридизации (будь то отжиг праймеров или гибридизация зондов на последовательностях CpG-островков), исключительно требовательны к дизайну многолокусных реакций, а их специфичность прогрессивно снижается по мере увеличения количества локусов, анализируемых в рамках одного теста.

Один из подходов, позволяющих избежать этапа гибридизации ДНК в процессе анализа метилирования, - адаптер-опосредованная ПЦР фрагментов ДНК, полученных в результате гидролиза метилчувствительными рестриктазами. Такой подход использовался при разработке метода AFLOAT, направленного на поиск дифференциально метилированных локусов геномов. На сегодняшний день адаптер-опосредованная ПЦР, в частности, в формате АИМС, - единственная многолокусная система метилчувствительного анализа ДНК, полностью свободная от проблем, связанных с перекрестной гибридизацией C,G-o6oratueinibix участков ДНК с пониженной информативностью нуклеотидных последовательностей. Возможность расширения количества амплифицируемых локусов создает условия для эффективного всестороннего контроля метилчувствителыюй реакции на основе константно метилированных и константно неметилированных локусов, естественным образом присутствующих в репрезентациях АИМС (рис. 12).

Рис. 12. Электорофореграммы продуктов АИМС, полученных на ДНК из образцов рака молочной железы (красные графики), соотнесенных с полной репрезентацией АИМС (черные графики). Показано аномальное метилирование промоторных CpG-островков генов KIAA1324L, PURB, ATMIN, IQSEC2 и EST CN371412. Два раздвоенных высокоамплитудных сигнала метилирования в центре каждой электрофореграммы соответствуют фрагментам генов CUX1 и ZBTB4, характеризующимся метилированным состоянием в нормальных и опухолевых тканях человека и служащим контролем эффективности амплификации. Двоение некоторых пиков, соответствующих индивидуальным продуктам АИМС, объясняется различиями в электрофоретической подвижности комплементарных нитей амплификатов в высокоразрешающем денатурирующем полиакриламидном геле и не влияет на качество анализа результатов исследования. Естественный контроль полноты гидролиза ДНК обеспечивают облигатно неметилированные локусы генома (соответствующие продукты АИМС отмечены фиолетовыми стрелками).

Таким образом, в результате анализа нормальных и опухолевых тканей, в том числе с использованием методов непредвзятого скрининга дифференциального метилирования ДНК, впервые сформированы системы контролей полноты рестрикции геномной ДНК и эффективности амплификации, обеспечивающие достоверность исследований метилирования отдельных локусов геномов при канцерогенезе методом МЧ-ПЦР.

Характеристика метилирования отдельных локусов генома, выявленных методами непредвзятого скрининга

С использованием разработанных систем МЧ-ПЦР охарактеризованы частоты аномального метилирования локусов, выявленных методами непредвзятого скрининга, в образцах РМЖ (табл. 2).

Таблица 2. Частоты метилирования локусов, выявленных методами непредвзятого скрининга, в образцах ткани РМЖ и прилежащей условно нормальной ткани молочной железы, н/д - различия недостоверны.__

Ген/Локус Опухоль, % Условная норма, % Р

ЫМСЗ (9qi4.ll) 8,0 (8/100) 0(0/100) <0,05

БЕМАбВ (19р13.3) 38,0 (38/100) 3,0 (3/100) <0,01

УС1Р135 (8ц13.1) 3,0 (3/100) 0(0/100) н/д

ВШ1 (2ц14.3) 18,0(18/100) 0(0/100) <0,01

КСМН2 (7д36.1) 4,0(4/100) 0(0/100) н/д

СЛСШ4 (17д24.2) 3,0 (3/100) 0(0/100) н/д

РЯМП (20р13) 3,0 (3/100) 0(0/100) н/д

1АМВ1 (Щ31Л) 16,1 (14/87) 9,1 (3/33) н/д

ЯАИ(17р11.2) 72,4 (63/87) 0 (0/33) <0,01

К СМ! [8 (3р24.3) 80,8 (30/87) 12,1 (4/33) <0,05

ЭОСКб (19р13.2) 34,5 (70/87) 3(1/33) <0,01

СРС2 (7ц22Л) 56,3 (49/87) 9 (3/33) <0,01

БНЗКВР1 (Хр22.12) 64,4 (56/87) 54,5 (18/33) н/д

1рЗЗ 79,3 (69/87) 17 (4/33) <0,01

5р15.33 87,4 (76/87) 39,4(13/33) <0,01

РРР2Я5С (14д32.31) 14,5 (9/62) 0 (0/34) <0,01

РПГ15 (5Й31.1) 19,3(12/62) 0 (0/34) <0,01

ЛТМ1МП6д23.2) 17,7(11/62) 0 (0/34) <0,01

С2Сй2 (21я22.3) 6,5 (4/62) 3 (1/34) н/д

К1АА1324Ь (7ц21Л2) 59,7 (37/62) 50(17/34) н/д

Ю8ЕС2 (Хр11.12) 27,4(16/62) 3 (1/34) <0,01

12я13.13 22,6(15/62) 6 (2/34) <0,01

13ц32Л 14,5 (9/62) 6 (2/34) н/д

АХ746725/АК127124 (2д21.1) 8,1 (5/62) 6 (2/34) н/д

ТМЕМ176А/176В (7с/36.1) 27,4 (17/62) 8,8 (3/34) <0,05

РОХМ1/НКМТ1188 (12р13.33) 8,1 (5/62) 6(2/34) н/д

3.3. ПРЕДВЗЯТЫЙ ПОДХОД К ВЫЯВЛЕНИЮ НОВЫХ МАРКЕРОВ АНОМАЛЬНОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК В ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЯХ

Несмотря на элемент отрицательной эмоциональной окраски слова «предвзятый», такой подход обладает определенной эффективностью и занимает свою специфическую нишу в эпигенетических исследованиях, а до недавнего времени он лежал в основе большинства проводимых работ в этой области. В рамках настоящего исследования поставлена задача проанализировать основные предпосылки, определяющие выбор кандидатных локусов генома, для которых предполагается дифференциальное метилирование при злокачественных новообразованиях, и сформировать многофакторную систему отбора таких локусов.

Отбор кандидатных локусов для поиска дифференциального метилирования ДНК на основе функций известных генов

Поиск дифференциального метилирования участков генов с известными функциями, предположительно ассоциированными с процессами канцерогенеза, оправдан гипотетической перспективой формирования научно обоснованных панелей диагностических маркеров метилирования. При этом в качестве основной гипотезы принимается предположение об инактивации генов, вовлеченных в канцерогенез, метилированием их CpG-островков. Для хорошо изученных генов, мутации или нарушение экспрессии которых ассоциированы с определенными свойствами опухолей, предполагается сохранение этих ассоциаций для случаев аномального метилирования - предположение, которое, несомненно, требует проверки для каждого конкретного гена.

Определен профиль метилирования генов - супрессоров опухолевого роста RBI, P16/CDKN2a, Pl5/CDKN2b, P14/ARF, CDH1, ER, CALCA, MGMT, Н1С1 и N33 в опухолях разного типа, куда вошли РМЖ (85 образцов), НМРЛ (54 образца) и В-ОЛЛ (90 образцов). Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3. Частоты метилирования генов RBI, P16/CDKN2A, P15/CDKN2B, P14/ARF, CDH1, ER, CALCA, MGMT, HIC] и N33 в опухолях различного гистогенеза (в соавторстве с В.В.Земляковой).

■s, ее as ^ Q. plS > Cl CDH1 MGMT § as fe) CALCA

РМЖ 16% 14/85 24% 20/85 4% 3/85 26% 22/85 53% 45/85 65% 55/85 5% 4/85 4% 3/85 9% 8/85 17% 15/85

НМРЛ 20% 11/54 43% 23/54 1,8% 1/54 35% 19/54 74% 40/54 81% 44/54 0% 0/54 15% 8/54 7% 4/54 20% 11/54

В-ОЛЛ 17% 14/90 6% 5/90 1% 1/90 2% 2/90 14% 14/90 11% 10/90 0% 0/90 1% 1/90 0% 0/90 1% 1/90

Данные о значительном количестве генов, которые перестают функционировать в результате гиперметилирования их промоторных областей при различных типах опухолей, привели к попытке определить специфический набор генов, метилирование которых характерно только для определенного вида рака.

Esteller и сотр. (2001) предложили термин «метилотип», который представляет собой совокупность генов, наиболее часто метилированных при определенном типе опухоли. Предполагается, что гены, входящие в «метилотип», должны иметь частоту метилирования в определенном типе опухоли больше 10%. Например, «метилотип» для рака желудка и кишечника состоит из генов P16/CDKN2A, PI4/ARF, MGMT, АРС и MLH1, для опухолей печени и желчных путей - 14-З-За, APC, CDH1, GSTP1. На основании полученных результатов и данных литературы нами составлены метилотипы для РМЖ, НМРЛ и В-ОЛЛ (рис. 13).

100% 80% 60% 40% 20%

РМЖ

и;

0L о-

О m ï *

.. äs

О to §

A S S

A <o tu

3 &

rt to

4 <0

100% В-ОЛЛ 80% Y

60%

40%■ / Г°П

5 S Q 1 * 14 Q S

о S

Рис. 13. Метилотипы РМЖ, НМРЛ и В-ОЛЛ. Красным отмечены гены, добавленные по результатам настоящей работы, синим - по результатам анализа данных литературы.

Составленные метилотины для исследуемых типов опухолей различны. Однако, некоторые гены такие, как RBI, Р16, CDH1 и HIC1 входят во все метилотипы. Это может свидетельствовать о том, что в процессе опухолеобразования задействованы сходные механизмы. Так, высокий процент метилирования гена CDHI может говорить о высокой метастатической активности опухолей, что согласуется с клиническими характеристиками этих заболеваний.

Поиск кандидатных локусов для анализа дифференциального метилирования в областях потери гстерозиготности, характерных для отдельных типов опухолей

Изучение нарушений копийности ДНК в геномах опухолей с разрешением, превышающим возможности классической цитогенетики, привело к обнаружению специфичных для разных типов опухолей изменений копийности ДНК. Целенаправленное изучение соответствующих локусов позволило обнаружить новые гены, вовлеченные в канцерогенез (Futreal P.A. et al., 2004; Santarius T. et al., 2010). По некоторым оценкам, поиск генов, вовлеченных в канцерогенез, в областях потерь гетерозиготности более эффективен, чем описанный выше подход анализа генов с определенными функциями (Stratton M.R., 2011). Тем не менее, существуют известные исключения. Так, в областях частых сочетанных делеций lp/19q, маркирующих олигодендроглиомы, обнаружен только один ген, предположительно вовлеченный в канцерогенез - САМТЛ1 с локализацией 1р36.3 (Barbashina V. et al., 2005; Henrich K.O. et al., 2011). Другая загадочная область, в которой также часто наблюдаются потери гетерозиготности при злокачественных новообразованиях -19р13.3, дистальный сегмент короткого плеча 19-й хромосомы. Это C,G-6oraTbifi участок ДНК, содержащий большое количество генов (Puttaguntaet al., 2000). Потеря гетерозиготности по 19р13.3 была показана при различных видах злокачественных новообразований, в частности при РМЖ, при раке ободочной кишки, шейки матки, при миелоидном лейкозе (Wang Z.J. et al., 1999; Lee J.Y. et al., 1998; Tniwaki В.M. et al., 1994). Высокие частоты потерь гетерозиготности по ряду микросателлитных маркеров в локусе 19р13.3 и недавно продемонстрированная ассоциация частоты этих потерь со степенью злокачественности опухолей молочной железы заставляют предположить наличие в этой области одного или нескольких генов-супрессоров опухолевого роста (Yang T.L. et al., 2004). Проведенное исследование позволяет предложить на роль такого гена-кандидата идентифицированный методом МЧФП ген SEMA6B.

Анализ статуса метилирования SEMA6B в образцах РМЖ был выполнен методом мультилокусной МЧ-ПЦР, аномальное метилирование выявлено в 38% опухолей. В свете показанного в настоящей работе дифференциального метилирования промоторной области SEMA6B при РМЖ необходимо упомянуть, что гиперметилирование промотора другого представителя семейства семафоринов, SEMA3B, было ранее описано при НМРЛ (Kuroki et al., 2003), причем недавние эксперименты по реактивации SEMA3B в клетках рака молочной железы показали, что он обладает свойствами гена-супрессора опухолевого роста с проапоптотическим действием.

Учитывая высокую частоту метилирования SEMA6B в образцах РМЖ, мы предположили, что этот ген может служить одним из кандидатов на роль гена-супрессора в критической области 19р13.3, и изучили некоторые особенности его молекулярной патологии при РМЖ и других злокачественных опухолях.

Частота метилирования Срв-островка второго экзона гена 8ЕМА6В в образцах опухолевой ткани мочевого пузыря составила 31% (17/55), кроме того метилирование было обнаружено и в 16% (5/31) образцов прилежащей морфологически неизмененной ткани, причем в 4-х образцах наблюдалось наличие метилирования и в норме, и в опухоли. Наличие метилирования в прилежащей к опухоли ткани может быть связано с контаминацией исследуемого материала опухолевыми клетками или ; же с тем, что эпигенетическая модификация гена 5ЕМА6В может являться одним из ранних событий при опухолеобразовании. Достаточно высокое значение выявленной нами частоты аномального метилирования в опухолях мочевого пузыря позволяет предполагать, что метилирование гена БЕМАбВ может являться маркером опухолевого процесса при РМП.

Анализ метилирования СрО-островка гена БЕМАбВ в образцах РП методом метилчувствительной ПЦР показал наличие метилирования в 100% образцов, что | согласуется с выявленным нами методом метилспецифического секвенирования; моноаллельным метилированием этого локуса как в опухолевых, так и в нормальных | тканях почки (рис. 14).

ттттт g В G g н n !1 н hi targc 9 g с s в с ggtttttta

Рис. 14. Результат метилспецифического секвенирования участка CpG-( островка гена SEMA6B в ДНК из нормального образца почки. Наличие! полуметилированных остатков цитозина, отмеченных стрелками, указывает на| моноаллельный характер метилирования локуса.

Доля образцов РМЖ с признаками аллельного дисбаланса по результатам, микросателлитного анализа и анализа однонуклеотидных полиморфизмов составила! 59% (27/46). Полученное значение достаточно высоко и позволяет расценивать аллельный дисбаланс в области гена SEMA6B как маркер опухолевого процесса в молочной железе. Ранее для локуса 19р13.3 уже был показан высокий уровень; аллельных делеций, составивший от 29 до 38% в зависимости от расположений исследуемого локуса (Yang T.L. et. al, 2004), однако прицельного исследования, аллельной копийности гена SEMA6B прежде не проводилось.

Анализ аллельных потерь проведен также и для образцов РМП. Долд гетерозигот в исследуемой выборке составила 62% (36/58). Среди информативны;^ образцов потеря гетерозиготности была выявлена только лишь для одной пары (3%); Хотя хромосомные делеции являются одним из наиболее часто встречающихся нарушений при РМП, по данным литературы делеции локуса 19р не характерны дл^ опухолей мочевого пузыря (Prat Е. et al., 2001). Таким образом, полученные результаты согласуются с данными литературы, а выявленная деления може^ являться следствием общей нестабильности генома опухолевых клеток, и, по все? видимости, не является специфическим нарушением при РМП.

Одним из возможных событий, приводящих к инактивации супрессоров опухолевого роста при спорадических формах рака, являются соматические мутации. В поисках такого рода мутаций нами проведено секвенирование экзонов гена БЕМЛбВ в материале кДНК, полученной из образцов РМЖ.

В одном из опухолевых образцов была выявлена миссенс-мутация в 8 экзоне БЕМАбВ (рис. 15). Замена в 867 нуклеотиде кДНК приводит к изменению аминокислотной последовательности белка: к замене гистидина на аргнин. Высокая степень консервативности среди различных видов, характерная для данного аминокислотного остатка, позволяет предполагать, что обнаруженная нами мутация может влиять на функциональную активность белка БЕМА6В.

Выявленная при секвенировании кДНК мутация в 8 экзоне подтверждена рестриктазным анализом (рис. 15).

CTTG G A G Т CATGTTT С к С G G

Рис. 15. Результаты секвенирования (А, Б) и рестриктазного (В) анализа фрагмента SEMA6B-ex7-9. А - контрольный образец ДНК, не несущий нуклеотидиых замен; Б - образец РМЖ, стрелкой отмечена позиция обнаруженной мутации; В - в первой и четвертой дорожках представлены фрагменты SEMA6B-sxl-9, не обработанные рестриктазой, во второй и третьей - результаты гидролиза ПЦР-продукта SEMA6B-exl-9 рестриктазой FatI (выявленная мутация приводит к отсутствию одного сайта узнавания рестриктазы). Рядом с полосами указаны размеры фрагментов.

Таким образом, проведен анализ возможных путей инактивации гена SEMA6B при РМЖ, исследованы состояние зиготности, статус метилирования и сохранность нуклеотидной последовательности гена в образцах опухолевых и морфологически неизмененных тканях молочной железы, почки и мочевого пузыря. В целом, наличие в образцах РМЖ хотя бы одной из исследованных форм молекулярной патологии было обнаружено в 75% случаев. Полученные данные подкрепляют высказанное предположение о том, что SEMA6B - один из наиболее реальных генов-кандидатов на роль супрессора опухолевого роста в области хромосомы 19р13.3.

12 3 4

Отбор кандидатных локусов для поиска дифференциального метилирования ДНК на основе локальных характеристик хроматина. Синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов

Приведенные выше примеры говорят об эффективности отбора кандидатных локусов для поиска аномального метилирования при канцерогенезе на основе известных функций генов и в областях нарушенной копийности ДНК (потерь гетерозиготности). В то же время, остается открытым вопрос о том, какие именно участки кандидатных генов целесообразно тестировать в поисках аномального метилирования. Возникает необходимость выявления неких свойств геномных локусов, с учетом которых можно было бы осуществлять более эффективное предсказание участков генов, предрасположенных к тому или иному характеру метилирования: к постоянному (константному) метилированию, к постоянному неметилированию, и, наконец, к дифференциальному метилированию. Возможно, такими предсказательными признаками могут служить локальные характеристики хроматина: плотность нуклеосомной упаковки по результатам обработки ДНК нуклеазой микрококков и области доступного хроматина, определяемые ДНКазным тестом.

Свойства хроматина, ассоциированные с константным метилированием ДНК, рассмотрены на примерах константно метилированных локусов, выявленных нами непредвзятыми методами скрининга метилирования геномов: ТАР4, МАИ! 11, гВТВ4, С11Х1, ЬАМСЗ. Анализ локализации константно метилированных участков генов ТАР4, МАОШ и 2ВТВ4 показывает, что они пространственно совпадают с областями плотной упаковки нуклеосом и закрытого хроматина (рис. 16,17, 18).

Scale 500 Uasesf

chrZO:

599905001 59989000I 599в9500|

Vour Sequel YowSei

UCSC Genes Based on BefSeq. UnlProt. GenBant. CCDS ana Comparative Genomics TAF4 (ft--1 --H>

10 _ uw Predicted Nucleosome Occupancy - A375

-11 _

S DNase PK 3 DNase FD 5 DNase BO ¡2 DNase PH 2 ONase FD > DNase BO

Рис. 16. Сопоставление структурно-функциональных характеристик геномног локуса с помощью программы просмотра элементов генома UCSC Genome Browser Красным обведена выявленная область константного метилирования (фрагмен интрона гена TAF4), сиреневым - участок высокой концентрации нуклеосом, синим область открытого хроматина, оранжевым - область закрытого хроматина. Показан пространственное совпадение трех сравниваемых характеристик: константног метилирования, высокой нуклеосомной плотности и закрытого состояния хроматина.

Scale 200 bases)--—--

YpweUHUmim Injin BHl Jatuçh

VourSeÇHBHBHBHHD

__ __ ucsc Based on ReiSe^TTmiFnjl, ijliiUsih, CÇds arrn Comparative Genomics

MftOIU '0.

Cpû Islands (Manas < 300 Bases are LiqM Green) UW Predicted Nucleosome Occupancy - A37S

. „, ENCODE Open Chromatin, Dule/UNC/UT

.. DNase Pk

: DNase FD

; DNase 60

S DNase Pk

; DNase FD

I DNase BO

Рис. 17. Сопоставление структурно-функциональных характеристик для участка интрона гена MAD1L1. Красным обведена выявленная область константного метилирования, сиреневым - участок высокой концентрации нуклеосом. Нижняя часть рисунка показывает отсутствие значимых областей открытого хроматина по результатам обработки ДНКазой. Показано пространственное совпадение трех сравниваемых характеристик: константного метилирования, высокой нуклеосомной плотности и закрытого состояния хроматина.

Scale Chr17:

7305500|

1 fcb|-

7306000| 73065001

73070001 7307500|

«m Blat Search

73080001

ZBTB4

ZBTEJ4

CpG 25 10

UCSC Genes Based on ReTSeq UniProt, GenBann. CCDS ana Comparative Genomics

CpG Islands (Islands < :юо Pa^s are LigM Green)

UW Predicted Nucleosome Occupancy - A375

rjucl Occ: A

и - v w

и .1 ..in I и ifcÉA^^MÉtÉi^^4... ■■ь- 1Л iir_ ^

Рис. 18. Сопоставление структурно-функциональных характеристик фрагмента экзона гена гВТВ4. Красным обведена выявленная область константного метилирования, сиреневым - участок высокой концентрации нуклеосом, синим -область открытого хроматина, оранжевым - область закрытого хроматина. Показано пространственное совпадение трех сравниваемых характеристик: константного метилирования, высокой нуклеосомной плотности и закрытого состояния хроматина.

Один из локусов константного метилирования, выявленных методом AFLOAT, приходится на последний экзон одного из альтернативных транскриптов гена CUX1, содержащий CpG-островок (рис. 19). Поскольку этот участок гена CUX1 метилирован во всех исследованных нами нормальных и опухолевых тканях, мы предположили возможность его совместного расположения с областями плотной упаковки нуклеосом и закрытого хроматина, по аналогии с вышеописанными константно метилированными участками генов ZBTB4, TAF4 и MAD1L1. Однако проведенное для подтверждения этой гипотезы сопоставление структурно-функциональных характеристик (рис. 19) дало неожиданный результат: при высокой плотности нуклеосомной упаковки исследуемый CpG-островок пространственно совпадает с выраженным окном открытого хроматина.

Scale chr7;

с и 1 ) -CUX1 CUX1

S tb I—

Л 016800001

m 8lal Search

UCSC Genes Based on RefSeq, UmProj^OenBank, CCDS and Comparative Genomic?

........v.-.——.-——■—-•--■■••—— -C _ .-ДиЩЯД'ЛЬЦгст

cu/.i • \'-1---——---—~——

CUX1 <JJ...........

CpG islands (Islands < 3Cin Pases are Light Green)

CpG; 105

10 UW Predicted Nucieosome Occupancy - A375

irg

лт^ 'гп™?'

■'VVvJ

Jk-OlLiil

S DNase Pk

> DNase FD

> DNase BO

Рис. 19. Сопоставление структурно-функциональных характеристик CpG-островка альтернативного 3'-терминального экзона гена CUX1. Красным обведена выявленная область константного метилирования, сиреневым - участок высокой концентрации нуклеосом, синим - область открытого хроматина. Показано пространственное совпадение областей константного метилирования, высокой нуклеосомной плотности и открытого состояния хроматина.

Результаты хроматин-иммунопреципитации (Giresi P.G. et al., 2007) показывают, что окно открытого хроматина в области альтернативного 3'-терминального экзона гена CUX1 соответствует участку связывания транскрипционного фактора CTCF (СССТС-связывающий белок). В отличие о других распространенных факторов транскрипции, таких, как MYC или RNAPII CTCF взаимодействует преимущественно с дистальными участками генов внутригенными участками (Lee В.-К. et al., 2012). Связывание с CTCF определяв активность инсуляторов у позвоночных (Kim Т.Н. et al., 2007). Показано, чт метилирование ДНК в области сайта узнавания препятствует связыванию CTCF (Наг А.Т. et al., 2000). Известно также, что метилирование ДНК приводит к эффекту аналогичному делеции сайта связывания CTCF - утрате блока транскрипции гено (Bell А.С. et al., 2000).

Возможно, состояние метилирования описываемого участка ДНК определя возможность связывания транскрипционного фактора CTCF, регулируя, такиь

образом, образование различных изоформ транскрипта CUXJ. Наиболее выраженная экспрессия альтернативной изоформы CUX1 показана в клетках Сертоли и сперматидах (Kroll M.R. et al., 2011). В подтверждение этой гипотезы, результаты ограниченного бисульфитного секвенирования (http://genome.ucsc.edu) для нормальных тканей яичка демонстрируют преимущественно неметилированное состояние альтернативного З'-терминального экзона гена CUXI.

Таким образом, выявленный нами участок гена CUX1 не является истинно константно метилированным во всех тканях, чем и объясняется необычная комбинация характеристик хроматина в этой области. В то же время, в изучаемых нами образцах (нормальные и опухолевые ткани молочной железы) этот участок метилирован постоянно, что позволяет использовать его как положительный контроль реакции амплификации интерметилированных сайтов.

Совместное расположение области константного метилирования ДНК и высокой плотности нуклеосомной оккупации с участком закрытого хроматина показано для гена LAMC3. На примере этого гена демонстрируется и противоположная ситуация - низкая нуклеосомная оккупация и открытый хроматин в области дифференциального метилирования ДНК при РМЖ (рис. 20).

СрО-остроьок

LA A/CV-MC-Г LA\tC3-\\

r—i L/WICJ -MC-R1

UA/O-MM-R

контрольные образцы

образцы РМЖ

CM12070 1

iUCl Occi ПЭ7В

tSCiMi miRHfl Regularory S DNasel Peaks <FDI* - 1st <1n GM12878 cells) I DN*S*1 Horspor* - l*t ( ,ri GM12S78 c* I 1«) ----- tPN*S*I Hy»er-S»ni itivity By QigStAl DN*S#I

Peaks <roR a.S!t) - 1st < in KS62 ceils)

.set Hotspots - 1st < in K562 ceils)

iNasel Hypersensitivity oy Oigira

Mjcleosone OCCUBWICV - ft375

Рис. 20. Карта метилирования промоторного участка гена ЬАМСЗ (вверху), проксимальная часть которого предрасположена к дифференциальному метилированию при РМЖ, в то время как дистальная облигатно метилирована. Метилированные СрО-динуклеотиды изображены в виде зачерненных кружков, неметилированные незакрашены. Область перехода от первого ко второму участку характеризуется резким переходом к состоянию закрытого хроматина и к нарастанию плотности нуклеосом. Синим обведена область открытого хроматина, сиреневым -участок низкой концентрации нуклеосом.

Дифференциально метилированные участки генов С11Х1 и ЬАМСЗ ассоциированы с двумя различными комбинациями локальных характеристик хроматина: для СШ1 характерна плотная нуклеосомная упаковка при открытом хроматине, для ЬАМСЗ - низкая концентрация нуклеосом, также при открытом хроматине. Рассмотрение других выявленных в настоящем исследовании локусов показывает, что обе комбинации состояния хроматина могут пространственно совпадать с участками дифференциального метилирования ДНК (рис. 21, 22).

Scale

Chr16:

500 bases 736Z7000|

hglB

Restriction Enzymes from REBASE

I II III n

Cf>r, Klanrls UH^t Gt<?°M

UCSC Genes Based on RefSeq. UniProt. GenBank. CCDS and Comparative Genomics

atmin шЯЯШШЯЁЯШЯвШШЯ-

Рис. 21. Сопоставление локализации дифференциально метилированного межгенного Срв-островка гена А ТКШ с локальными характеристиками хроматина. Красным обведена область дифференциального метилирования, синим - область открытого хроматина, сиреневым - участок низкой концентрации нуклеосом. Показано пространственное совпадение трех сравниваемых характеристик.

Restr Enzymes

6» _

Ennancea H3K4«ei •

ONM« С lust »Г* Txn Factor СМ Г

СРО: 54

СМ12870 R*W 1

NUCl ©CCS Л375

20» Bases I----1

I I I V*'11" ■ il *

Your ¿fcguence from glat~ Yours* ШвШвШИШЁЯ1Л

UCSC Oene* Based on RefSe<3,\t4'Prot, Cenewik^jafl and Comparative GenorHe* ENCODE Enhancer ant» Promoter : <H3K4riei> on в Cell Lires

rfaltal DNaset Hypersensitivity ÇjustéTî ЮРЕ Transcript ion Factor ChIP-«e<s

: Green)

Taroetscan miRNfl ReguUtory sites ENCOOC UH 0 i9't«1 DNASel Peaks (FDR «,53> - 1st (in ©M12976 Cells)

ENCODE UW Digital DNasel MOtSOOtS - 1st <in OM1287S cells) ENCODE Ur»IV. Washington DN«S«I eM)*rs«t\sitWit'j fey Digit»! DNMeJ

emcode uw Digital DHasel feafcs (FDR e.63) - 1st cm K562 cells) ENCODE UN Digital DNasel Hotspots - 1st <in KS62 cells) encooe Univ. Washington DNasel ty^ersensitivity By Digital DNasel

Рис. 22. Сопоставление локализации дифференциально метилированног межгенного СрО-осгровка, хромосома 1рЗЗ, с локальными характеристикам хроматина. Красным обведена область дифференциального метилирования, синим область открытого хроматина, сиреневым - участок низкой концентрации нуклеосом

На основании проведенных исследований предложен синтетический подход к поиску новых локусов, аномально метилированных в процессе канцерогенеза, объединяющий: 1) эффективный способ предвзятого отбора собственно кандидатных генов на основе известных функций и/или ранее описанных областей потери гетерозиготности, характерных для определенных типов опухолей, и 2) способ выбора для анализа метилирования участков конкретных локусов с учетом особенностей локальных характеристик хроматина. Анализ дифференциального метилирования исследуемых генов целесообразно проводить на участках, пространственно совпадающих с областями открытого хроматина при любой плотности нуклеосомной упаковки.

Валндация синтетического подхода проведена на примере анализа метилирования всех генов, кодирующих семейство белков, непосредственно вовлеченных в процессы канцерогенеза (12 генов цепей ламининов).

Изучение эпигенетической патологии семейства генов ламининов на основе синтетического подхода к отбору для

анализа дифференциального метилирования кандидатных

участков генов

Семейство белков ламининов представляет собой гетерогенную группу гликопротеинов внеклеточного матрикса с молекулярной массой от 400 до 900 кДа. Структурно ламинины представляют собой гетеротримеры из a-, fi- и у- цепей, объединенных дисульфидными связями и образующих крестообразную структуру. Для ламининов описано три группы генов, кодирующих соответственно а-цепи (6 генов), (3-цепи (4 гена) и у-цепи (3 гена).

Ламинин является одним из главных компонентов базалыюй мембраны -оформленной структуры внеклеточного матрикса, регулирующей клеточный рост, дифференцировку и адгезию. Принимая участие в формировании тканей, базальная мембрана отделяет клетки эпителия от подлежащей стромы. В норме ламинин выполняет ряд функций, совершенно необходимых для роста, развития, дифференцировки и нормальной жизнедеятельности клеток. Наряду с этим, было показано вовлечение ламининов в патологические состояния различного генеза. Изменения экспрессии некоторых субъединиц ламининов при онкологических заболеваниях и ряде иных патологических состояний изучены достаточно подробно.

Участие ламининов в онкологической патологии значительно, хотя имеющиеся данные порой бывают весьма неоднозначными. Так, для цепей ламинина-5 отмечалось тканеспецифическое нарушение регуляции экспрессии в опухолях: в глиомах и карциномах желудка было показано увеличение экспрессии, тогда как при раке простаты и базалыюклеточных карциномах - снижение (Martin K.J. et al., 1998; Han J. et al., 1996). Иммуногистохимический анализ экспрессии общего ламинина при раке молочной железы показал отсутствие экспрессии приблизительно в 50 % карцином (Ioachim Е. et al., 2002). Ламинин-5 известен так же и как один из факторов, стимулирующих инвазию и образование метастазов для некоторых типов опухолей. Часть гистохимических исследований показывает, что у2-субъединица ламииина-5 активно экспрессируется при инфильтрации раковых клеток в здоровую ткань и расположена на фронте инвазии эпителиальных карцином. При этом наблюдается увеличение экспрессии у2-субъединицы в клетках опухоли, что ассоциировано с неблагоприятным прогнозом заболевания.

С целью выявления возможности изучения статуса метилирования их промоторных областей методом МЧ-ПЦР проведен анализ структурных C,G - состава последовательностей генов субъединиц ламининов. Необходимым условием для проведения МЧ-ПЦР является наличие CpG-островка или значительного C,G -обогащения изучаемой области, а также присутствие в последовательности сайтов узнавания метилчувствительных рестриктаз. В настоящей работе с помощью методов МЧ-ПЦР проведен анализ метилирования CpG-динуклеотидов, присутствующих в промоторных областях генов LAMA1, LAMA2, LAMA3A, LAMA3B, LAMA4, LAMA5, LAMBI, LAMB2, LAMB3, LAMC1, LAMC2 и LAMC3. Исходя из принципов синтетического подхода к поиску новых локусов, аномально метилированных в процессе канцерогенеза, оценена возможность обнаружения дифференциального метилирования ДНК в промоторных областях этих генов.

Предрасположенность к дифференциальному метилированию предсказана нами для участков промоторов генов LAMA1, LAMA2, LAMA3B, LAMA4, LA MAS, LAMBI, LAMB2, LAMC1.LAMC2, LAMC3. Для промоторных областей генов субъединиц ламининов LAMA3A и LAMB3 предсказано константное метилирование. Был осуществлен дизайн праймеров для МЧ-ПЦР и проведен анализ метилирования выбранных участков генов. Полученные результаты подтвердили предсказанное дифференциальное метилирование 70% промоторных областей этих генов при РМЖ. Шесть промоторных областей демонстрируют неметилированное состояние в нормальных тканях и аномальное метилирование при РМЖ, с частотами, составившими для генов LAMA1 - 36%, LA МЛ 2 - 38%, LA МАЗ В - 6%, LA МЛ 4 - 2%, LAMBI - 16%, LAMC3 - 8%. Промотор гена LAMC2 показал дифференциальное метилирование в зависимости от тканевого происхождения образцов: в буккалыюм эпителии и лимфоцитах периферической крови метилирование отсутствует, в то же время образцы ДНК из нормальных и опухолевых тканей молочной железы метилированы в 100% случаев. Константное метилирование предсказано и подтверждено для промоторных областей генов субъединиц ламининов LAMA3A и LAMB3. Полученные результаты говорят о высоком предиктивном потенциал разработанного синтетического подхода к отбору для анализа дифференциальног метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез.

Таким образом, в ходе исследования разработана новая универсальна стратегия и оригинальная методическая база анализа метиломов в норме и пр патологии для поиска и характеристики аномального метилирования генов геномных локусов, вызывающего заболевания у человека. На значителыюл экспериментальном материале (более 1 ООО образцов операционного материала рак молочной железы, рака мочевого пузыря, светлоклеточного рака почки и прилежащи тканей, немелкоклеточного рака легких, острого лимфобластного лейкоза аутопсийного материала молочной железы, буккалыюго эпителия и лимфоцито периферической крови здоровых доноров) показана эффективность разработанны подходов, охарактеризованы новые гены и районы, вовлеченные в процес канцерогенеза.

ВЫВОДЫ.

1. Разработанные в настоящем исследовании алгоритмы, протоколы и компьютерные программы для проведения метилчувствителыюго фингерпринтинга и анализа, ориентированного на длину амплифицируемых фрагментов (AFLOAT), эффективно решают основную проблему непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов - определение геномной принадлежности дифференциально метилированных локусов, поскольку исключают многоэтапный блок лабораторного анализа - выделение фрагментов ДНК из гелей, их реамплификацию, клонирование, экстракцию плазмидной ДНК и секвенирование. Предложенные методы скрининга обеспечивают высокую воспроизводимость результатов, снижение себестоимости и трудоемкости исследований, расширение возможностей визуального контроля на каждом этапе эксперимента.

2. Методами анализа in vitro и in silico охарактеризован состав репрезентаций генома, генерируемых методами метилчувствителыюго фингерпринтинга и AFLOAT. Предложенные схемы экспериментов обеспечивают высокое содержание CpG-островков в составе репрезентаций дифференциально метилированных участков, что создает базу для эффективного выявления новых генов и локусов, вовлеченных в канцерогенез и подверженных аномальной эпигенетической регуляции при раке.

3. Разработанные методы непредвзятого скрининга позволяют идентифицировать дифференциально метилированные локусы геномов независимо от их расположения относительно кодирующих областей, промоторов и сайтов инициации транскрипции. Среди выявленных в работе 26 новых локусов, аномально метилированных при раке молочной железы, 4 являются межгенными (области хромосом 1рЗЗ, 5р15.33, 12ql3.13 и 13q32.1), 5 - интронными (гены BIN1, RAI1, GPC2, PPP2R5C, PHF1), 2 расположены в первых экзонах (гены ATMIN, IQSEC2). Лишь около половины (гены LAMBI, KCNH8, DOCK6, SH3KBP1, C2CD2, KIAA1324L АХ746725/АК127124, ТМЕМ176А/ТМЕМ176В, FOXM1/HKMT1188, LAMC3, SEMA6B, VCIPI35, KCNH2, CACNG4 и PSMF1) полученных фрагментов имеют локализацию, каноническую для дифференциального метилирования при канцерогенезе, что подтверждает непредвзятый характер скрининга. Дифференциальное метилирование указанных локусов подтверждено методами метилспецифического секвенирования, метилчувствительной ПЦР и метилспецифического анализа конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК.

4. Анализ молекулярной патологии гена SEMA6B, аномальное метилирование которого при раке молочной железы впервые показано в настоящем исследовании, продемонстрировал наличие повреждений гена (метилирование, потеря гетерозиготности) в 75% образцов рака молочной железы. Впервые выявлена терминальная мутация SEMA6B у пациентки с раком молочной железы. Полученные результаты свидетельствуют о том, что SE MA б В - один из наиболее реальных генов-кандидатов на роль супрессора опухолевого роста в области хромосомы 19р13.3.

5. Скрининг метилирования ДНК из образцов рака молочной железы, светлоклеточного рака почки, рака мочевого пузыря, прилежащих условно нормальных тканей, аутопсийного материала молочной железы, лимфоцитов периферической крови и буккального эпителия здоровых доноров выявил константно метилированные участки генома человека, принадлежащие CpG-островку гена CUX1 в составе альтернативного З'-концевого экзона, первым экзонам генов LAMA3A, LAMB3, LAMC3, интронным областям генов MAD1L1, FLNA и З'-СрО-островку гена

ZBTB4. Полученные результаты впервые предоставили базу для обоснованного дизайна контролен эффективности метилчувствительной ПЦР.

6. Анализ состояния метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе в зависимости от локальных характеристик хроматина показал совместное расположение константно метилированных участков с плотной упаковкой нуклеосом при закрытом хроматине, константно неметилированных участков - с низкой плотностью упаковки нуклеосом при закрытом хроматине, и дифференциально метилированных участков - с областями открытого хроматина при любой плотности нуклеосомной упаковки. Это позволило разработать синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез.

7. Использование разработанной в ходе исследования методологии локус-специфического анализа метилирования для изучения эпигенетической патологии семейства генов ламининов подтвердило предсказанное дифференциальное метилирование 70% промоторных областей этих генов при раке молочной железы. Шесть промоторных областей демонстрируют неметилированное состояние в нормальных тканях и аномальное метилирование при раке молочной железы, с частотами, составившими для генов LAMA1 - 36%, LAMA2 - 38%, LAMA3B - 6% LAMA4 - 2%, LAMBÍ - 16%, LAMC3 - 8%. Промотор гена LAMC2 показ; дифференциальное метилирование в зависимости от тканевого происхождени образцов: в буккальном эпителии и лимфоцитах периферической кров метилирование отсутствует, в то время как образцы ДНК из нормальных опухолевых тканей молочной железы метилированы в 100% случаев. Константно метилирование предсказано и подтверждено для промоторных областей гено субъединиц ламининов LA МАЗ А и LAMB3. Полученные результаты говорят высоком предиктивном потенциале разработанного синтетического подхода к отбор для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов вовлеченных в канцерогенез.

8. Разработана новая универсальная стратегия и оригинальная методическа база анализа метиломов в норме и при патологии для поиска и характеристик функциональных нарушений, вызывающих различные заболевания у человека. Н значительном экспериментальном материале (более 1000 образцов операционног материала рака молочной железы, рака мочевого пузыря, светлоклеточного рак почки и прилежащих тканей, немелкоклеточного рака легких, острог лимфобластного лейкоза, аутопсийного материала молочной железы, буккальног эпителия и лимфоцитов периферической крови здоровых доноров) показан эффективность разработанных подходов, охарактеризованы новые гены и районь вовлеченные в процесс канцерогенеза.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Strelnikov V., Nemtsova M., Chesnokova G., Kuleshov N., Zaletayev D. A simple multiplex FRAXA, FRAXE, and FRAXF PCR assay convenient for wide screening programs // Human Mutation, 1999. V. 13. № 2. P. 166-169

2. Бабенко O.B., Саакян C.B., Бровкина А.Ф., Козлова В.М., Стрельников В.В., Залетаев Д.В., Немцова М.В. Спектр и частота структурной патологии гепа RB1 при ретинобластоме // Молекулярная биология, 2002. Т. 36. № 4. С. 623-629

3. Бабенко О.В., Землякова В.В., Саакян C.B., Бровкина А.Ф., Стрельников В.В., Залетаев Д.В., Немцова М.В. Функциональная патология генов RB1 и CDKN2A, приводящая к развитию ретинобластомы // Молекулярная биология, 2002. Т.36 № 5, С. 777-783

4. Землякова В.В., Жевлова А.И., Зборовская И.Б., Стрельников В.В., Залетаев Д.В., Немцова М.В.. Аномальное метилирование некоторых генов-супрессоров при немелкоклеточном раке легкого // Молекулярная биология, 2003. Т.37 № 6 С.983-988

5. Землякова В.В., Жевлова А.И., Стрельников В.В., Любченко Л.Н., Вишневская Я.В., Третьякова В.А., Залетаев Д.В., Немцова М.В. Аномальное метилирование некоторых генов-супрессоров при спорадическом раке молочной железы // Молекулярная биология, 2003. Т.37 № 4, С. 696-703

6. Залетаев Д.В., Немцова М.В., Стрельников В.В., Бабенко О.В., Васильев Е.В., Землякова В.В., Жевлова А.П., Дрозд О.В. Диагностика эпигенетической патологии при наследственных и онкологических заболеваниях // Молекулярная биология, 2004. Т.38 № 2, С. 213-223

7. Землякова В.В., Стрельников В.В., Зборовская И.Б., Балукова О.В., Майорова O.A., Васильев Е.В., Залетаев Д.В., Немцова М.В. Сравнительный анализ аномального метилирования CpG-островков, расположенных в промоторных областях генов pl6/CDKN2A и pl4/ARF при немелкоклеточном раке легкого и остром лимфобластном лейкозе // Молекулярная биология, 2004. Т.38 N° 6

C. 966-972

8. Кузнецова Е.Б., Дрозд О.В., Бабенко О.В., Землякова В.В., Немцова М.В., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Идентификация генов, вовлеченных в канцерогенез, методом метилчувствительного ПЦР-фингерпринтинга // Медицинская генетика, 2004. Т.З № 12, С. 563-568

9. Klinkov A.A., Strelnikov V.V., Babenko O.V., Zemlyakova V.V., Zaletayev

D.V., Ivanov M.A., Kuznetsova E.B., Nikitin E.A., Maiorova O.V. TNR/1 lq#l Trinucleotide (GCC)n Repeat Alleles and Predisposition to Acute and Chronic Leukemia // Annals of Human Genetics, 2004. T. 68. № 4. C. 362-366.

10. Михайленко Д.С., Любченко Л.H., Зборовская И.Б., Стрельников В.В., Залетаев Д.В. Анализ полиморфных вариантов CGG-повтора гена GIPC1 в норме, при раке молочной железы и немелкоклеточном раке легкого // Генетика, 2005. Т.41 №9, С. 1289-1295

П.Немцова М.В., Стрельников В.В., Бабенко О.В., Землякова В.В., Залетаев Д.В. Молекулярная диагностика эпигенетических нарушений при синдроме Видеманна-Беквита // Медицинская генетика, 2005. № 1, С. 33-38

12. Кузнецова Е.Б., Стрельников В.В. Методы анализа метилирования ДНК // Медицинская генетика, 2006. № 11. С. 3 -11

13.Kuznetsova E.B., Kekeeva T.V., Larin S.S., Zemlyakova V.V., Khomyakova A.V. Babenko O.V., Nemtsova M.V., Zaletayev D.V., Strelnikov V.V. Methylation of the BIN1 gene promoter CpG island associated with breast and prostate cancer // Journal of Carcinogenesis, 2007. 6: 9.

14. Кузнецова Е.Б., Кекеева T.B., Ларин C.C., Землякова В.В., Бабенко О.В., Немцова М.В., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Новые маркеры метилирования и экспрессии генов при раке молочной железы // Молекулярная биология, 2007. Т.41 №4, С. 624-633

15. Залетаев Д.В., Немцова М.В., Стрельников В.В., Бабенко О.В., Пальцева Е.М., Землякова В.В., Кузнецова, Кекеева Т.В., Михайленко Д.С., Манохина И.К. Эпигенетическая регуляция экспрессии генов в процессах канцерогенеза // Молекулярная медицина, 2008. № 4, С. 46-51

16. Стрельников В.В., Танас A.C., Шкарупо В.В., Кузнецова Е.Б., Кекеева Т.В., Завалишина Л.Э., Франк Г.А., Залетаев Д.В. Современный высокотехнологичный метод скрининга дифференциального метилирования геномов на основе амплификации интерметилированных сайтов // Молекулярная медицина, 2009. № 4, С. 18-26

17. Tanas A.S., Shkarupo V.V, Kuznetsova E.B., Zaletayev D.V., Strelnikov V.V. Novel tools for unbiased DNA differential methylation screening // Epigenomics, 2010. V.2 No. 2, P. 325-333

18. Залетаев Д.В., Стрельников B.B., Немцова M.B., Бабенко О.В., Кузнецова Е.Б., Землякова В.В., Кекеева Т.В., Михайленко Д.С., Шкарупо В.В., Танас A.C. Маркеры метилирования в диагностике онкологических заболеваний // Медицинская генетика, 2010. Т. 9 №1, С. 15-21

19.Танас A.C., Шкарупо В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Дизайн эксперимента и анализ результатов амплификации интерметилированных сайтов с использованием компьютерной программы AIMS in silico // Молекулярна биология, 2010. Т.44 № 2, С. 355-365

20. Стрельников В.В., Малышева A.C., Землякова В.В., Кузнецова Е.Б. Алексеева Е.А., Смолин A.B., Прозоренко Е.В., Залетаев Д.В. Делеции обласп расположения гена MGMT на хромосоме 10q26.3 в глиомах // Молекулярна медицина, 2011. №2, С. 28-31

21. Залетаев Д.В., Стрельников В.В., Кекеева Т.В., Землякова В.В. Кузнецова Е.Б., Михайленко Д.С. Аномалии метилирования в процесса канцерогенеза: поиск новых генов, разработка методов и систем ДНК-маркеров дл диагностики // Экологическая генетика, 2011. T.IX. № 3. С. 27-32.

Публикации в других изданиях:

22. Немцова М.В., Стрельников В.В., Бабенко О.В., Васильев Е.В. Залетаев Д.В. Методические аспекты анализа метилирования при генетических онкологических заболеваниях // Сборник трудов ГНТП "Геном человека", 200 С.167-168

23. Немцова М.В., Землякова В.В., Жевлова А.И., Бабенко О.В Стрельников В.В., Васильев Е.В., Дрозд О.В., Бочков Н.П., Залетаев Д.В.. Профил метилирования генов-супрессров опухолевого роста при различных формах рака. Вестник НИИ Молекулярной медицины ММА им. Сеченова, 2002. № 2, С. 65-84

24. Zemlyakova V., Lubchenko L„ Zborovskaya I., Strelnikov V., Artamonov V Nemtsova M. P16INK4a, pl5INK4b, pl4ARF, Rbl and ECAD Genes Aberrant Methylation m Various Cancers.// European Journal of Human Genetics 2002 V 10 Suppl. 1, P. 99 ' ' '

25. Дрозд O.B., Стрельников B.B., Немцова M.B., Залетаев Д.В. Метилчувствительный фингерпринтинг как метод выявления структурных и функциональных изменений в геноме опухолевых клеток // Материалы научно-практического симпозиума "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении", 2002. С. 130-134

26. Kuznetsova Е„ Mikhaylenko D., Liubchenko L., Zborovskaya I., Strelnikov V Differential methylation of LAMC3 and TGFBR1 CpG islands in non-small cell lung and breast cancer identified by methylation-sensitive restriction fingerprinting (MSRF) // European Journal of Human Genetics, 2004. V.12 Suppl. 1, P. 190

27.Zemlyakova V., Babenko O., Zborovskaya I., Yakubovskaya M., Lyubchenko L., Maiorova 0., Strelnikov V., Nemtsova M. Methylation of a number of tumor suppressor genes in various cancers // European Journal of Human Genetics, 2004. V.12 Suppl. 1,

28. Кузнецова Е.Б., Стрельников B.B., Дрозд O.B., Бабенко О.В., Землякова В.В., Кекеева О.В., Немцова М.В., Залетаев Д.В. Поиск и характеристика новых маркеров метилирования и генов, вовлеченных в канцерогенез, методом метилчувствительного фингерпринтинга // Вестник НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М.Сеченова, 2005. № 5, С. 73-88

29. Kuznetsova Е„ Lubchenko L., Zborovskaya I., Strelnikov V, Zaletayev D Differential methylation of LAMC3, SEMA6B, VCIP135 and BIN1 CpG islands in breast cancer identified by methylation-sensitive restriction fingerprinting (MSRF) // European Journal of Human Genetics, 2005. V. 13 Suppl. 1, P. 192

30.Nemtsova M, Zemlyakova V, Kusnetsova E, Strelnikov V, Lyubchenko L, Zaletayev D. Methylation profiling of carcinogenesis-associated genes in sporadic breast cancer // Breast Cancer Research, 2005. № 7 Suppl. 2, P. 4.17

31. Кузнецова Е.Б., Стрельников B.B., Дрозд O.B., Немцова М.В., Залетаев Д.В. Поиск и характеристика новых маркеров метилирования и генов, вовлеченных в канцерогенез, методом метилчувствительного ПЦР-фингерпринтинга // Тезисы второй международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» Москва, 2005. С. 168

32. Кузнецова Е.Б., Дрозд О.В., Немцова М.В., Стрельников В.В. Идентификация генов, вовлеченных в канцерогенез, методом метилчувствительного ПЦР-фингерпринтинга // V съезд российского общества медицинских генетиков, Уфа, Россия, Медицинская генетика, 2005. № 5, С. 214

33. Strelnikov V.V., Kuznetsova Е.В., Nemtsova M.V., Zaletayev D.V. Identification of methylation and expression abnormalities associated with breast cancer // European Journal of Human Genetics, 2006. V.14 Suppl. 1, P. 87

34. Залетаев Д.В., Немцова M.B., Стрельников B.B., Кузнецова Е.Б. Диагностика эпигенетических нарушений при наследственных заболеваниях // Медицинская генетика, 2006. Т. 5. Прил. 1. С. 54

35. Strelnikov V.V., Kuznetsova Е.В., Larin S.S., Nemtsova M.V., Zaletayev D.V. Novel cancer related genes and methylation/expression markers associated with breast cancer. // AACR Meeting Abstracts, 2006. В129

36.Strelnikov V.V., Kuznetsova E.B., Larin S.S., Nemtsova M.V., Zaletayev D.V. Identification of novel methylation/expression markers and genes associated with breast cancer // AACR Meeting Abstracts, 2006. A96

37.Kuznetsova E.B., Mikhaylenko D. S., Pudova E.A., Larin S.S., Nemtsova M.V., Zaletayev D.V., Strelnikov V.V. Inactivation of the laminin gamma 3 chain (LAMC3) gene

in various cancers//European Journal ofHuman Genetics, 2007. V. 15 Suppl. 1,P. 160.

38. Strelnikov V.V., Kuznetsova E.B., Pudova E.A., Larin S.S., Nemtsova M.V., Zaletayev D.V. SEMA6B is a candidate tumor suppressor gene on 19pl3.3 // European Journal ofHuman Genetics, 2007. V.15 Suppl. 1, P. 170

39. Shkarupo V.V., Tanas A.S., Kuznetsova E.B., Zavalishina L.E., Frank G.A., Zaletaev D.V., Strelnikov V.V. A semi-automated unbiased differential methylation screening assay for applications in cancer epigenetic research // European Journal ofHuman Genetics, 2008. V.16 Suppl. 2, P. 223

40.Pudova E.A., Kuznetsova E.B., Zavalishina L.E., Frank G.A., Zaletaev D.V., Strelnikov V.V. Dissection of allelic molecular pathology of the SEMA6B gene frequently altered in breast cancer // European Journal ofHuman Genetics, 2008. V.16 Suppl. 2, P. 206

41.Пудова E.A., Кузнецова Е.Б., Стрельников B.B., Залетаев Д.В. Механизмы инактивации предполагаемого гена - супрессора опухолевого роста SEMA6B при раке молочной железы // Тезисы V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» Москва, 2008. С. 349

42.Шкарупо В.В., Танас А.С., Кузнецова Е.Б., Стрельников В.В.,Залетаев Д.В. Метод анализа структурно-функциональной организации эпигеномов клеток рака молочной железы // Тезисы V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» Москва, 2008. С. 489

43.Strelnikov V.V., Tanas A.S., Shkarupo V.V., Kuznetsova E.B., Zaletaev D.V Unbiased differential methylation screening assay for applications in cancer epigeneti research // Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology, 2008 P. 59-60

44.Танас A.C., Стрельников B.B., Шкарупо B.B., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В Современный высокотехнологичный метод диагностики маркеров метилирования онкологии // Онкогематология, 2008. №4, С. 73-74

45. Стрельников В.В., Танас А.С., Шкарупо В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В Современные высокотехнологичные методы диагностики маркеров метилировани. ДНК в онкологии // Пятый московский международный конгресс «Биотехнология состояние и перспективы развития», Москва, 16-20 марта 2009. С. 90-91

46. Strelnikov V. A State-of-the-Art Differential Methylation Screening Techniqu Based on the Amplification of Intermethylated Sites // Epigenetics World Congress - Eve

Proceedings, 2009. P. 27

47. Залетаев Д.В., Немцова М.В., Стрельников В.В. Эпигенетическая регуляци экспрессии генов на ранних стадиях и в эмбриональных стволовых клетках Учебник под ред. М.А.Пальцева «Биология стволовых клеток и клеточны технологии» для студентов медицинских вузов. М.: ОАО «Идательство «Медицина)

2009. Т. 1.С. 107-140

48. Стрельников В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В. Поиск и характеристик новых маркеров метилирования и генов, вовлеченных в канцерогенез // Учебник по ред. М.А.Пальцева и Д.В.Залетаева «Системы генетических и эпигенетически

маркеров в диагностике онкологических новообразований» для студентов медицинских вузов. М.: ОАО «Идательство «Медицина», 2009. С. 76-113

49. Стрельников В.В., Танас A.C., Залетаев Д.В. Разработка новых методов диагностики метилирования ДНК в онкологии // Учебник под ред. М.А.Пальцева и Д.В.Залетаева «Системы генетических и эпигенетических маркеров в диагностике онкологических новообразований» для студентов медицинских вузов. М.: ОАО «Идательство «Медицина», 2009. С. 349-384

50.Танас A.C., Шкарупо В.В., Стрельников В.В. Программное обеспечение для скринига дифференциального метилирования геномов на основе амплификации интерметилированных сайтов// Медицинская генетика, 2009, Т.8 №12 (90), С. 33

51. Tanas A.S., Shkarupo V.V., Kuznetsova Е.В., Zaletaev D.V., Strclnikov V.V. Amplification of intermethylated sites, Bioinformatics and Capillary electrophoresis: the ABC of the cancer methylomes // European Journal of Human Genetics, 2009. V.17 Suppl 2, P. 284

52. Strelnikov V., Tanas A., Shkarupo V., Kuznetsova E., Gorban N., Zaletaev D. Non-microarray DNA differential methylation screening in breast cancer // Cancer Genetics and Cytogenetics, 2010. Vol.203 No 1, P. 93

53. Tanas A., Shkarupo V., Kuznetsova E., Zaletaev D., Strelnikov V. AIMS in silico & PeakPick: a software package supporting unbiased screening of DNA differential methylation in cancer// Cancer Genetics and Cytogenetics, 2010. Vol.203 No 1, P. 94

54. Алексеева E.A., Шубина M.B., Землякова B.B., Кузнецова Е.Б., Смолин A.B., Прозоренко Е.В., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Молекулярно-генетическая диагностика опухолей головного мозга. Сборник научных работ по материалам I Международного российско-американского симпозиума «Инновационные технологии в генетике и детской эпилептологии». Москва, 27-28 июня 2011. С. 72-84

55. Танас A.C., Руденко В.В., Стрельников В.В., Залетаев Д.В. Алгоритмы и программное обеспечение скрининга эпигенетических нарушений при раке. // Шестой московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 21 -25 марта 2011. С. 139 -140

56.Бабенко О.В., Стрельников В.В., Залетаев Д.В. Классификация, номенклатура и классические методы детекции мутаций // Учебник под ред. М.А.Пальцева и Д.В.Залетаева «Введение в молекулярную диагностику» для студентов медицинских вузов. ОАО «Издательство «Медицина», 2011. Т. 2. С. 11-36

57. Стрельников В.В., Кузнецова Е.Б., Танас A.A. Методы анализа метилирования ДНК // Учебник под ред. М.А.Пальцева и Д.В.Залетаева «Введение в молекулярную диагностику» для студентов медицинских вузов. М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2011. Т. 2. С. 80-99

58. Стрельников В.В., В.В.Землякова, И.П.Белецкий. ДНК-диагностика с использованием биологических микрочипов // Учебник под ред. М.А.Пальцева и Д.В.Залетаева «Введение в молекулярную диагностику» для студентов медицинских вузов. М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2011. Т. 2. С. 148-165

59. Залетаев Д.В., В.В.Стрелышков, О.В.Бабенко, Землякова В.В., Немцова М.В. Общие подходы к молекулярпо-генетической диагностике в онкологии // Учебник под ред. М.А.Пальцева и Д.В.Залетаева «Введение в молекулярную диагностику» для студентов медицинских вузов. М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2011. Т. 2. С. 402-448

60. Стрельников В.В., В.В.Землякова, М.В.Шубина. Молекулярно-генетическая диагностика опухолей головного мозга // Учебник под ред. М.А.Пальцева и

Д.В.Залетаева «Введение в молекулярную диагностику» для студентов медицинских вузов. М.: ОАО «Идательство «Медицина», 2011. Т. 2. С. 486-503

Зарегистрированные новые медицинские технологии, алгоритмы и компьютерные программы, заявки на патент:

61. Руденко В.В., Танас A.C., Стрельников В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В. Скрининг аномального метилирования ДНК на основе метода амплификации интерметилированных сайтов для диагностики злокачественного опухолевого процесса // Медицинская ДНК-технология. Разрешение ФС № 2011/132 от 27.05.2011г.

62. Немцова М.В., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Молекулярная диагностика нарушений метилирования импринтированных районов IGF2, H19, KCNQ10T1 у пациентов с синдромом Видеманна-Беквита // Медицинская ДНК-технология. Разрешение ФС № 2011/131 от 27.05.2011 г.

63. Танас A.C., Шкарупо В.В., Стрельников В.В. Компьютерная программ AIMS in silico // Рекламно-техническое описание, описание программы, описани применения. Регистрационный номер ВНТИЦ 50201050017. Москва, 2010 г.

64. Танас A.C., Руденко В.В., Стрельников В.В. Компьютерная программ PeakPick // Рекламно-техническое описание, описание программы, описани применения. Регистрационный номер ВНТИЦ 50201050040. Москва, 2010 г.

65. Танас A.C., Руденко В.В., Стрельников В.В. Программа для ЭВМ "AIMS i silico 2". Рекламно-техническое описание, описание применения. Регистрационны' номер ВНТИЦ 50201151514, Москва, 2011 г.

66. Руденко В.В., Танас A.C., Кузнецова Е.Б., Стрельников В.В., Залетаев Д.В Способ формирования панелей маркеров метилирования ДНК // Заявка на получени патента, регистрационный номер 2011119871, Роспатент, Москва, 2011 г.

Список сокращений.

АИМС - амплификация интерметилированных сайтов

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИБГ - Институт биологии гена

КЭФ - капиллярный электрофорез

МРНЦ - Медико-радиологический научный центр

МЧ-ПЦР - метилчувствительная полимеразная цепная реакция

МЧФП - метилчувствительный фингерпринтинг

НМРЛ - немелкоклеточный рак легких

п.н. - пара нуклеотидов

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РМЖ - рак молочной железы

РМП - рак мочевого пузыря

РОНЦ - Российский онкологический научный центр РП - рак почки

РПЖ - рак предстательной железы

РФФИ - Российский фонд фундаментальных исследований

AFLOAT - Amplified Fragment Length Oriented Analysis (анализ,

ориентированный на длину амплифицируемых фрагментов)

B-OJIJI - В-клеточный острый лимфобластный лейкоз

MLPA - мультиплексная лигазная проба-зависимая амплификация

Подписано в печать. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 2,0 Тираж 120 Экз. Заказ № 961 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Стрельников, Владимир Викторович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Основные направления молекулярно-генетическнх исследований в онкологии.

1.1.2. Хронология изучения соматических мутаций геномов злокачественных новообразований: технологии и достижения.

1.1.2. Каталоги соматических мутаций геномов злокачественных новообразований.

1.1.3. Часы молекулярной эволюции опухолей.

1.1.4. Молекулярно-генетические изменения в тканях, окружающих опухоль. Теория полей канцеризации и её клинические приложения.

1.1.5. Низкоинвазивная пресимптоматическая молекулярная диагностика рака на материале периферической крови и других биологических жидкостей.

1.1.6. Роль биологических микрочипов в изучении и диагностике злокачественных новообразований.

1.2. Аномальное метилирование ДНК и другие эпигенетические маркеры канцерогенеза.

1.2.1. Аномальное метилирование генов, вовлеченных в канцерогенез.

1.2.2. Методы изучения эпигенетической патологии при канцерогенезе.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Клинический материал.

2.2. Забор крови, операционного и биопсийного материала.

2.3. Выделение геномной ДНК.

IМЧФП. ндонуклеазами рестрикции. гаьная полимеразная цепная реакция (МЧ-ПЦР югатых праймеров. ашивание нитратом серебра. рагментов СрО-островков и определение стельности. гаьная ПЦР со специфическими праймерами. гское секвенирование.

IАИМС. геномов.У о

3.1.1. Метилчувствительный фингерпринтинг (МЧФП).

3.1.2. Современный алгоритм непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов. Технология AFLOAT.

3.2. Локус-специфический анализ дифференциального метилирования геномов.

3.2.1. Методы, основанные на применении метилчувствительных рестриктаз.

3.2.2. Характеристика частот метилирования отдельных локусов генома, выявленных методами непредвзятого скрининга.

3.2.3. Методология анализа бисульфит-конвертированной ДНК.

3.2.4. Детальные карты дифференциально метилированных участков генома человека.

3.3. Предвзятый подход к выявлению новых маркеров канцерогенеза, основанных на аномальном метилировании ДНК.

3.3.1. Отбор кандидатных локусов для поиска дифференциального метилирования ДНК на основе функций известных генов.

3.3.2. Поиск кандидатных локусов для анализа дифференциального метилирования в областях потери гетерозиготности, характерных для отдельных типов опухолей.

3.4. Отбор кандидатных локусов для поиска дифференциального метилирования ДНК на основе локальных характеристик хроматина. Синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов.

3.5. Изучение эпигенетической патологии семейства генов ламининов на основе синтетического подхода к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Комплексное исследование метилотипов злокачественных новообразований: фундаментальные и прикладные аспекты"

Актуальность проблемы.

Значительная часть современных представлений о злокачественных новообразованиях основывается на предположении о том, что они развиваются в результате выхода клеток из-под контроля механизмов регуляции роста, деления и дифференцировки вследствие накопления соматических мутаций (Hanahan D., Weinberg R.A., 2000; Stratton M.R. et al., 2009). Наличие соматических мутаций, в число которых входят как структурные повреждения (нуклеотидные замены, небольшие инсерции и делеции, хромосомные перестройки, численные аномалии), так и эпигенетические нарушения, - неотъемлемое свойство геномов всех клеток злокачественных новообразований (Pleasance E.D. et al., 2010).

При разработке стратегии отбора кандидатных локусов для детальной характеристики метилирования следует принять во внимание все существующие возможности скрининга характеристик эпигеномов. Подходы к таким исследованиям не универсальны. Одни из них обеспечивают анализ с полногеномным покрытием, но низким разрешением; другие, при высоком разрешении, позволяют анализировать ограниченные выборки участков генома.

К первой группе относятся методы, основанные либо на аффинном обогащении фрагментированной ДНК фракциями с определенными эпигенетическими характеристиками, либо на обработке препаратов ДНК различными типами нуклеаз. Таким образом можно проанализировать не только метилирование ДНК (Weber M. et al., 2005), но и химические модификации хроматина - гистоновые метки НЗК4Ме1, НЗК27Ас, НЗК4МеЗ (Heintzman N. D. et al., 2009), области доступного хроматина (Crawford G.E. et al., 2006; Boyle A.P. et al., 2008), плотность нуклеосомной упаковки (Dennis J.H. et al., 2007). Надежно определяя эпигенетические изменения на полногеномном уровне, указанные методы страдают низкой прецизионностью: исследуемые параметры характеризуются с разрешением около 100-200 нуклеотидных пар (Huebert D.J. et al., 2006; Crawford G.E. et al., 2006; Johnson D.S. et al., 2008; Serre D. et al., 2009).

Вторая группа подходов подразумевает скрининг дифференциального метилирования ограниченных выборок геномных локусов. В этой группе наиболее известны методы метилчувствителыюго рестрикционно-ориентированного геномного сканирования (Rush L.J. et al., 2001; Costello J.F. et al., 2009), метилчувствителыюго репрезентативно-дифференциального анализа (Ushijima T. et al., 1997), метилчувствительного фингерпринтинга (Gonzalgo M.L. et al., 1997), амплификации интерметилированных сайтов (Frigola J. et al., 2002). Огромным преимуществом перечисленных методов является непредвзятость скрининга, под которой понимается определение дифференциального метилирования заранее неизвестных локусов генома с последующей идентификацией их нуклеотидных последовательностей (Fraga M.F., Esteller M., 2002). Непредвзятый скрининг расширяет фундаментальные представления о роли метилирования ДНК в норме и при патологии, и способствует диверсификации основ разработки эпигенетических диагностических маркеров. Непредвзятость скрининга -краеугольный камень объективной оценки состояния изучаемых метиломов (Schumacher A. et al., 2006, Gebhard et al., 2006). В то же время оптимального метода непредвзятого скрининга дифференциального метилирования на сегодняшний день не существует (Воск, С., 2009). Указанные методы, разработанные более 10 лет назад, так и не нашли широкого применения. Требуется формирование принципиально новой концепции, учитывающей современный уровень генетических знаний и использующей преимущества завершения проекта по секвенированию генома человека.

Цель исследования. Разработать оригинальную методологию скрининга дифференциального метилирования геномов и применить её к изучению фундаментальных характеристик метиломов злокачественных новообразований.

Задачи исследования:

4. Провести анализ молекулярной патологии наиболее перспективного гена-кандидата на роль супрессора опухолевого роста из набора новых генов, выявленных в процессе исследования.

5. Идентифицировать константно метилированные участки генома человека, которые могут служить основой для обоснованного дизайна контролей эффективности метилчувствительной ПЦР.

8. Используя разработанный способ предсказания статуса метилирования участков генов, вовлеченных в канцерогенез, провести исследование эпигенетической патологии всех генов, кодирующих семейство белков, непосредственно вовлеченных в процессы канцерогенеза (12 генов субъединиц ламининов).

Научная новизна.

Проведена оценка частот аномального метилирования указанных локусов. Особенности метилирования выявленных областей охарактеризованы впервые.

Анализ молекулярной патологии гена SEMA6B, аномальное метилирование которого при раке молочной железы впервые показано в настоящем исследовании, продемонстрировал наличие повреждений гена (метилирование, потеря гетерозиготности) в 75% образцов рака молочной железы (РМЖ). Впервые выявлена терминальная мутация SEMA6B у пациентки с РМЖ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что SEMA6B - один из наиболее реальных генов-кандидатов на роль супрессора опухолевого роста в области 19р13.3.

Скрининг метилирования ДНК из образцов рака молочной железы, светлоклеточного рака почки, рака мочевого пузыря, прилежащих условно нормальных тканей, аутопсийного материала молочной железы, лимфоцитов периферической крови и буккального эпителия здоровых доноров впервые выявил константно метилированные участки генома человека, принадлежащие CpG-островку гена CUX1 в составе альтернативного 3'-концевого экзона, первым экзонам генов LAMA3A, LAMB3, LAMC3, интронным областям генов MAD1L1, TAF4 и З'-CpG-островку гена ZBTB4.

Впервые проведено исследование эпигенетической патологии всех генов, кодирующих семейство белков, непосредственно вовлеченных в процессы канцерогенеза (12 генов цепей ламининов). Шесть из них демонстрируют неметилированное состояние в нормальных тканях и аномальное метилирование при РМЖ, с частотами, составившими для генов LAMA1 - 36%, LAMA2 - 38%, LAMA3B - 6%, LAMA4 - 2%, LAMBI -16%, LAMC3 - 8%. Промотор гена LAMC2 показал дифференциальное метилирование в зависимости от тканевого происхождения образцов: в буккальном эпителии и лимфоцитах периферической крови метилирование отсутствует, в то время как образцы ДНК из нормальных и опухолевых тканей молочной железы метилированы в 100% случаев. Константное метилирование предсказано и подтверждено для промоторных областей двух генов субъединиц ламининов - LAMA3A и LAMB3.

Практическая значимость.

Разработанные системы скрининга дифференциального метилирования геномов высоко воспроизводимы, подробно охарактеризованы и могут быть использованы в дальнейшем в работах по характеристике эпигенетических нарушений, ассоциированных с социально значимыми заболеваниями. Решена основная проблема непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов -определение геномной принадлежности дифференциально метилированных локусов. Благодаря созданию новой технологии анализа, ориентированного на длину амплифицируемых фрагментов, AFLOAT, из процедуры определения геномной принадлежности локусов полностью исключается многоэтапный блок лабораторного анализа - выделение фрагментов ДНК из гелей, их реамплификация, клонирование, экстракция плазмидной ДНК и секвенирование. Предложенные методы скрининга обеспечивают высокую воспроизводимость результатов, снижение токсичности, себестоимости и трудоемкости исследований, расширение возможностей визуального контроля на каждом этапе эксперимента. По результатам характеристики состава репрезентаций генома, генерируемых методами метилчувствительного фингерпринтинга и АИМС, предложены схемы экспериментов, обеспечивающие высокое содержание Срв-островков в составе репрезентаций дифференциально метилированных участков, что обеспечивает базу для эффективного выявления новых генов и локусов, вовлеченных в канцерогенез и подверженных аномальной эпигенетической регуляции при раке. Выявленные константно метилированные участки генома человека обеспечивают проведение обоснованного дизайна контролей эффективности метилчувствительной ПЦР. Результаты проведенного анализа геномных локусов и сформированный синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов с учетом локальных характеристик хроматина представляют собой базу для разработки диагностических систем эпигенетических маркеров. Разработанные алгоритмы, методы и компьютерные программы оформлены в виде рекламно-технических описаний и описания новой медицинской ДНК-технологии, прошедших государственную регистрацию. Зарегистрирована заявка на патент «Способ формирования панелей маркеров метилирования ДНК».

Апробация работы.

Материалы исследования были доложены на конференции ГНТП "Геном человека" в 2000 г., ежегодных конференциях Европейского общества генетики человека в 2002, 2004, 2005, 2006 (диплом и премия), 2007, 2008 и 2009 гг., научно-практическом симпозиуме "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении" в 2002 г., 97-й ежегодной конференции Американского общества изучения рака (Вашингтон, 2006; премия), V и VI Международных конференциях «Молекулярная медицина и биобезопасность» (г. Москва) в 2008 и 2009 гг., V и VI съездах Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2009 и Ростов-на-Дону, 2010), V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (г. Москва) в 2008 г., V и VI Московских международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» в 2009 и 2011 гг., 6-м симпозиуме "Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний" (г. Москва) в 2009 г., конференции молодых ученых, посвященной 40-летию МГНЦ РАМН (г. Москва) в 2009 г., Всемирном эпигенетическом конгрессе (г. Берлин) в 2009 г., 11-й и 12-й Европейских конференциях по цитогенетике и молекулярной генетике солидных опухолей (г. Бильбао, 2008 и г. Неймеген, 2010).

Разработанные алгоритмы, новые медицинские технологии и компьютерные программы были использованы при выполнении научно-исследовательских работ по гранту РФФИ № 08-04-01685 «Общие закономерности структурно-функциональной организации эпигеномов клеток рака молочной железы», по государственному контракту № 8/3-655н-08 от 31 декабря 2009 «Поиск и характеристика новых молекулярных маркеров для ранней диагностики, прогноза течения, мониторинга эффективности лечения рака мочевого пузыря», по государственному контракту № 8/3-657н-08 от 31 декабря 2009 «Поиск и характеристика новых молекулярных маркеров для ранней диагностики, прогноза течения, мониторинга эффективности лечения рака почки», по государственному контракту № 02.740.11.0089 от 15 июня 2009 в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по теме «Разработка новых диагностических технологий на основе механизмов эпигенетической регуляции», по гранту Earlier Breast Cancer Test Foundation "Development and validation of a differential methylation screening technology applicable for the identification of early breast cancer diagnostic markers" (2007-2010 гг.).

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработаны алгоритмы, протоколы и компьютерные программы для проведения метилчувствительного фингерпринтинга и анализа, ориентированного на длину амплифицируемых фрагментов (AFLOAT), обеспечивающие повышение воспроизводимости результатов, снижение себестоимости и трудоемкости исследований, расширение возможностей визуального контроля на каждом этапе эксперимента.

3. Охарактеризован состав репрезентаций генома, генерируемых методами метилчувствительного фингерпринтинга и AFLOAT. Предложены схемы экспериментов, обеспечивающие высокое содержание CpG-островков в составе репрезентаций дифференциально метилированных участков.

5. Анализ молекулярной патологии гена SEMA6B, аномальное метилирование которого при раке молочной железы впервые показано в настоящем исследовании, свидетельствует о том, что это один из наиболее реальных генов-кандидатов на роль супрессора опухолевого роста в области хромосомы 19р13.3.

6. Выявлены константно метилированные участки генома человека, предоставляющие базу для обоснованного дизайна контролей эффективности метилчувствительной ПЦР.

8. Показан высокий предиктивный потенциал разработанной системы отбора для анализа метилирования кандидатных участков генов, на примере исследования эпигенетической патологии семейства генов ламининов.

Личный вклад автора.

Публикации.

По теме диссертационного исследования опубликовано 66 печатных работ, в том числе 21 статья в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук, 8 глав в учебниках, 3 статьи в сборниках и коллективных монографиях, 28 тезисов, зарегистрированы 2 новые медицинские ДНК-технологии, 3 рекламно-технических описания компьютерных программ, 1 заявка на получение патента.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Стрельников, Владимир Викторович

выводы.

1. Разработанные в настоящем исследовании алгоритмы, протоколы и компьютерные программы для проведения метилчувствительного фингерпринтинга и анализа, ориентированного на длину амплифицируемых фрагментов (AFLOAT), эффективно решают основную проблему непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов - определение геномной принадлежности дифференциально метилированных локусов. Предложенные методы скрининга обеспечивают высокую воспроизводимость результатов, снижение себестоимости и трудоемкости исследований, расширение возможностей визуального контроля на каждом этапе эксперимента.

2. Методами анализа in vitro и in silico охарактеризован состав репрезентаций генома, генерируемых методами метилчувствительного фингерпринтинга и AFLOAT. Предложенные схемы экспериментов обеспечивают высокое содержание CpG-островков в составе репрезентаций дифференциально метилированных участков, что создает базу для эффективного выявления новых генов и локусов, вовлеченных в канцерогенез и подверженных аномальной эпигенетической регуляции при раке.

КСЫН2, САСЫС4 и РБМП) полученных фрагментов имеют локализацию, каноническую для дифференциального метилирования при канцерогенезе, что подтверждает непредвзятый характер скрининга.

4. Анализ молекулярной патологии гена БЕМА6В, аномальное метилирование которого при раке молочной железы впервые показано в настоящем исследовании, продемонстрировал наличие повреждений гена (метилирование, потеря гетерозиготности) в 75% образцов РМЖ. Впервые выявлена терминальная мутация БЕМАбВ у пациентки с РМЖ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что БЕМА6В - один из наиболее реальных генов-кандидатов на роль супрессора опухолевого роста в области хромосомы 19р13.3.

5. Скрининг метилирования ДНК из образцов рака молочной железы, светлоклеточного рака почки, рака мочевого пузыря, прилежащих условно нормальных тканей, аутопсийного материала молочной железы, лимфоцитов периферической крови и буккального эпителия здоровых доноров выявил константно метилированные участки генома человека, принадлежащие Срв-островку гена С11Х1 в составе альтернативного 3'-концевого экзона, первым экзонам генов ЬАМАЗА, ЬАМВЗ, ЬАМСЗ, интронным областям генов МАЭ1Ы, ПИ А и З'-СрО-островку гена 2ВТВ4. Полученные результаты впервые предоставили базу для обоснованного дизайна контролей эффективности метилчувствительной ПЦР.

6. Анализ состояния метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе в зависимости от локальных характеристик хроматина показал совместное расположение константно метилированных участков с плотной упаковкой нуклеосом при закрытом хроматине, константно неметилированных участков - с низкой плотностью упаковки нуклеосом при закрытом хроматине, и дифференциально метилированных участков -с областями открытого хроматина при любой плотности нуклеосомной упаковки. Это позволило разработать синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез.

7. Использование разработанной в ходе исследования методологии локус-специфического анализа метилирования для изучения эпигенетической патологии семейства генов ламининов подтвердило предсказанное дифференциальное метилирование 70% промоторных областей этих генов при РМЖ. Шесть промоторных областей демонстрируют неметилированное состояние в нормальных тканях и аномальное метилирование при РМЖ, с частотами, составившими для генов LAMA1 - 36%, LAMA2 - 38%, LAMA3B - 6%, LAMA4 - 2%, LAMBI -16%, LAMC3 - 8%>. Промотор гена LAMC2 показал дифференциальное метилирование в зависимости от тканевого происхождения образцов: в буккальном эпителии и лимфоцитах периферической крови метилирование отсутствует, в то время образцы ДНК из нормальных и опухолевых тканей молочной железы метилированы в 100% случаев. Константное метилирование предсказано и подтверждено для промоторных областей генов субъединиц ламининов LAMA3A и LAMB3. Полученные результаты говорят о высоком предиктивном потенциале разработанного синтетического подхода к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез.

8. Разработана новая универсальная стратегия и оригинальная методическая база анализа эпигеномов в норме и при патологии для поиска и характеристики функциональных нарушений (аномальное метилирование генов и геномных локусов), вызывающих различные заболевания у человека. На значительном экспериментальном материале (более 1000 образцов операционного материала рака молочной железы, рака мочевого пузыря, светлоклеточного рака почки и прилежащих тканей, немелкоклеточного рака легких, острого лимфобластного лейкоза, аутопсийного материала молочной железы, буккального эпителия и лимфоцитов периферической крови здоровых доноров) показана эффективность разработанных подходов, охарактеризованы новые гены и районы, вовлеченные в процесс канцерогенеза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Значительная часть современных представлений о злокачественных новообразованиях вращается вокруг центрального принципа, согласно которому рак развивается в результате выхода клеток из-под контроля механизмов регуляции роста, деления и дифференцировки вследствие накопления соматических мутаций. Наличие соматических мутаций, в число которых входят нуклеотидные замены, небольшие инсерции и делеции, хромосомные перестройки, численные аномалии, эпигенетические нарушения, - неотъемлемое свойство геномов всех клеток злокачественных новообразований.

Новейшие технологии полногеномного анализа ДНК позволяют определять практически все классы структурных соматических изменений (нуклеотидные замены, инсерции/делеции, хромосомные перестройки, нарушения копийности ДНК) на всем протяжении генома (экзоны, интроны, межгенные области). Результаты полногеномного анализа структурных изменений, основанного на секвенировании ДНК, характеризуются разрешением, близким однонуклеотидному. Фактически дальнейшее развитие этой области исследования соматических мутаций в ближайшее время будет сводиться к совершенствованию существующих технологий.

К полногеномному анализу метилирования ДНК методы секвенирования нового поколения на сегодняшний день применимы в очень незначительной степени, что в объясняется в первую очередь сниженной информативностью последовательностей бисульфит-модифицированной ДНК, используемой в качестве матрицы для секвенирования. Неметилированные участки ДНК после бисульфитной конверсии представляют собой последовательности из трех нуклеотидов, что значительно осложняет выравнивание фрагментов при формировании контигов.

Оценка интенсивности метилирования ДНК в масштабах генома с использованием иммунопреципитации характеризуется разрешением в 100 нуклеотидных пар, вследствие чего может использоваться лишь как метод первичного скрининга дифференциального метилирования, предваряющий детальные локус-ориентированные исследования. К эпигенетическим изменениям, которые также достаточно надежно, но с низкой прецизионностью диагностируются на полногеномном уровне, относятся химические модификации хроматина (гистоновые метки) -НЗК4Ме1, НЗК27Ас, НЗК4МеЗ; области доступного хроматина, определяемые ДНКазным тестом; открытые сайты связывания транскрипционных факторов по результатам хроматин-иммунопреципитации (СЫР); плотность нуклеосомной упаковки по результатам обработки нуклеазой микрококков. Перечисленные параметры хроматина определяются с разрешением около 200 нуклеотидных пар.

Информация, полезная как с точки зрения изучения фундаментальных основ эпигенетической регуляции при канцерогенезе, так и с точки зрения разработки молекулярно-генетических клинических диагностических маркеров, может быть получена при сопоставлении результатов исследования полногеномного и локального метилирования ДНК и ряда характеристик хроматина в пределах хромосомных участков. Применительно к фундаментальным и прикладным аспектам онкогеномики такой подход требует разработки методологии анализа эпигеномов злокачественных новообразований на основе синтеза современных методов медицинской биотехнологии, математического моделирования и биоинформатики.

Метилирование ДНК, не нарушая структуры генов, предоставляет информацию о том, где и когда должны экспрессироваться конкретные гены. Присоединение метальной группы к молекуле цитозина катализируется ферментами семейства ДНК-метилтрансфераз и происходит только на пострепликативной стадии, поскольку молекулы 5-метилцитозина в свободном виде в клетке отсутствуют. За редким исключением метилированию подвергаются только молекулы цитозина в составе Срв-динуклеотидов. Рассеянные СрО-динуклеотиды в норме метилированы, в то время как в Срв-обогащенных участках, часто в промоторных областях генов, метилирование, как правило, отсутствует. Метилирование таких областей (Срв-островков) коррелирует со снижением транскрипционной активности генов.

Исследования профилей метилирования Срв-островков показали, что не все они неметилированы в нормальных клетках. Такое дифференциальное метилирование объясняют, в частности, вовлечением метилирования в тканеспецифическую регуляцию экспрессии генов. Обширные исследования дифференциального метилирования и патологических последствий аномального метилирования ДНК проводятся в рамках онкогеномики. В отличие от нормальных, опухолевые клетки часто демонстрируют общее гипометилирование генома, сопровождающееся гиперметилированием Срв-островков генов-супрессоров опухолевого роста и потерей геномного импринтинга. Свойство паттернов метилирования ДНК сохраняться (наследоваться) в ряду клеточных делений потенцирует формирование опухолеспецифичных метилотипов, и создает предпосылки для разработки надежных средств молекулярной диагностики рака.

Аномальное метилирование Срв-островков генов-супрессоров опухолевого роста, приводящее к их инактивации, является одним из наиболее значимых механизмов канцерогенеза и может выступать как одно из событий в двухударной модели Кнадсена. В то же время, любые изменения метилирования, ассоциированные с онкологическим процессом, представляют диагностическую ценность, независимо от их влияния на экспрессию генов, поэтому при разработке новых эпигенетических онкомаркеров должны рассматриваться все варианты метилирования Срв-островков генов, вовлеченных в канцерогенез. Например, было показано, что только метилирование небольшой области промоторного Срв-островка СОКЫ2А приводит к подавлению экспрессии гена. Метилирование же других участков этого СрС-островка, который захватывает весь первый экзон гена, не влияет на эффективность транскрипции. В то же время, именно метилирование первого экзона СОКЫ2А наблюдается при раке молочной железы значительно чаще, чем метилирование промотора и, вероятно, может служить более информативным диагностическим маркером. Метилирование Срв-островков непромоторной локализации также может быть ассоциировано с опухолевой трансформацией. Например, метилирование непромоторных З'-нетранслируемых и внутригенных Срв-островков ассоциировано с гиперэкспрессией или эктопической экспрессией генов РАХ6 и СОКША.

Всплеск интереса к изучению эпигенетической регуляции функционирования геномов стимулировал разработку десятков методов, позволяющих оценивать метилирование как тотальной ДНК, так и отдельных её участков. Эти методы можно разделить на группы на основании характера получаемой информации: первая группа включает методы определения уровней метилирования геномов в целом (соотношение метилированных и неметилированных Срв-динуклеотидов), вторая - методы исследования статуса метилирования специфических последовательностей, третья позволяет идентифицировать новые «горячие точки метилирования», т.е. области ДНК, аномально метилированные в патологически измененной ткани, четвертая предполагает полногеномный скрининг метилирования Срв-динуклеотидов. Первые две группы относятся в основном к диагностическим; третья и четвертая группы - в большей степени к поисковым. В онкогенетике методы второй группы подразумевают исследование статуса метилирования уже известных генов, вовлеченных в канцерогенез, на основе информации о структуре их промоторных областей и CpG-островков. Подобные исследования абсолютно необходимы для характеристики эпигенетического портрета того или иного типа опухолей и обычно охватывают ограниченный круг хорошо охарактеризованных генов, вовлеченных в канцерогенез (pl6/CDKN2A, pl4/ARF, pl5/CDKN2B, RBI, HIC, CDH1 и ряд других), что позволяет унифицировать результаты исследований метилотипов опухолей. Такой стандартизированный подход имеет определенные преимущества, поскольку позволяет сравнивать результаты десятков исследований, что значительно повышает их статистическую достоверность и практическую диагностическую ценность. В то же время, ограниченность круга генов, включенных в такие панели метилирования, не позволяет решить одну из главных задач онкогенетики по созданию наборов молекулярных, в том числе эпигенетических, диагностических маркеров, способных эффективно дифференцировать различные типы злокачественных новообразований, в том числе, в зависимости от их тканевого происхождения. Решение этой задачи сопряжено с идентификацией новых генов, вовлеченных в канцерогенез, путем выявления аномалий их эпигенетического статуса в опухолях, точнее, скрининга дифференциального метилирования геномов нормальных и опухолевых клеток.

Существует два принципиально различных подхода к скринингу дифференциального метилирования ДНК. Первый подразумевает предварительный отбор локусов для исследования, осуществляемый на основании некоторой гипотезы, предсказывающей наиболее вероятное выявление дифференциального метилирования именно этих локусов. Задача методов, осуществляющих такую стратегию, - проверка исходной гипотезы о наличии дифференциального метилирования заранее отобранных последовательностей ДНК. Второй подход подразумевает непредвзятый скрининг, в ходе которого сначала определяется дифференциальное метилирование заранее неизвестных локусов генома, а затем проводится идентификация их нуклеотидных последовательностей. Непредвзятый скрининг эффективно выявляет дифференциальное метилирование геномных участков, которые, в силу недостаточной изученности эпигеномов, не подпадают ни под одну из современных гипотез и не включаются в анализ методами первой группы. Непредвзятый скрининг не только расширяет фундаментальные представления о роли метилирования ДНК в норме и при патологии, но и способствует диверсификации основ разработки эпигенетических диагностических маркеров. Именно непредвзятость исследования является краеугольным камнем объективной оценки состояния изучаемого эпигенома в целом. С этим согласны все исследователи, работающие в области эпигеномики; в то же время оптимального метода непредвзятого скрининга дифференциального метилирования на сегодняшний день не существует. В качестве основы для разработки современных алгоритмов анализа дифференциального метилирования геномов мы приняли два ранее разработанных метода, метилчувствительный фингерпринтинг (МЧФП) и амплификацию интерметилированных сайтов (АИМС). Обеспечивая полную непредвзятость скрининга, эти методы характеризуются наибольшей простотой, экономичностью, высокой производительностью (возможность сравнения в рамках одного эксперимента десятков геномов по значительному количеству локусов). Главные их недостатки прослеживаются в области скорости и простоты идентификации геномной принадлежности детектируемых фрагментов ДНК. Нами предложены и апробированы принципиальные модификации обоих подходов.

Модификации МЧФП затронули этапы разделения и визуализации продуктов реакции, а также их геномного картирования.

Проведенные нами эксперименты показали возможность четкого разделения продуктов МЧФП в неденатурирующем полиакриламидном геле. Примененный способ окраски фрагментов ДНК в геле нитратом серебра позволил проводить непосредственный визуальный контроль за изоляцией интересующих фрагментов, а также обеспечил значительное сокращение промежутка времени от анализа геля и выявления интересующих фрагментов до их реамплификации, что способствовало сохранению их целостности. Традиционная процедура клонирования фрагментов ДНК, извлеченных из геля, заменена непосредственным прямым секвенированием с праймеров, использующихся при постановке МЧФП.

В составе репрезентаций генома, генерируемых модифицированным методом метилчувствительного фингерпринтинга, 58% были метилированы и 26% неметилированы во всех опухолевых образцах. Для 16% фрагментов было показано дифференциальное метилирование в образцах РМЖ. Эффективность выявления дифференциально метилированных фрагментов ДНК с помощью разработанной нами модификации метода сопоставима с результатами, полученными другими авторами. Результаты прямого секвенирования выявленных дифференциально метилированных фрагментов позволили провести компьютерный анализ их последовательности, на основании которого они были идентифицированы как участки CpG-островков генов LAMC3, SEMA6B, VCIP135, BIN1, KCNH2, CACNG4 и PSMF1. Аномальное метилирование указанных CpG-островков при РМЖ продемонстрировано впервые. Из перечисленных генов лишь для одного, супрессора опухолевого роста BIN1, доказано участие в канцерогенезе, в то время как целенаправленного изучения роли молекулярной патологии других генов при раке не проводилось.

Полученные результаты показывают, что оптимизированный метод МЧФП позволяет эффективно выявлять новые гены, подвергающиеся аномальному метилированию при канцерогенезе. В то же время, в самой природе МЧФП заложен ряд принципиально неустранимых недостатков. На фоне общей репрезентации МЧФП доля дифференциально метилированных фрагментов не превышает единичных процентов, таким образом, область разделения элементов репрезентации МЧФП занята в основном неинформативными элементами. Второй системный недостаток МЧФП - использование статистических праймеров, не допускающее ни малейшей стандартизации метода.

К началу 2000-х гг. назрела необходимость разработки подхода к скринингу дифференциального метилирования геномов, не уступающего по эффективности МЧФП и лишенного присущих ему недостатков. В 2002 году испанскими исследователями была опубликована такая технология, основанная на адаптер-опосредованной амплификации интерметилированных сайтов (АИМС).

Нами проведен критический анализ метода АИМС, результатом которого фактически стало создание не просто модифицированного метода, а принципиально новой технологии анализа длин амплифицируемых фрагментов - AFLOAT (Amplified Fragment Length Oriented Analysis Technique), которая может использоваться как для изучения дифференциального метилирования ДНК, так и в более широких геномных приложениях. Технология AFLOAT соединила в себе преимущества АИМС, капиллярного электрофореза и математического анализа с современными возможностями биоинформатики. Адекватный дизайн экспериментов обеспечивается путем предварительного моделирования ожидаемых результатов in silico. Такая возможность предоставляется разработанной нами программой компьютерной симуляции AIMS in silico. Алгоритм моделирования результатов экспериментов программой AIMS in silico практически воспроизводит протокол осуществления АИМС in vitro.

Для предоставления исследователям возможности обоснованного выбора удлинителей праймеров, используемых для амплификации продуктов АИМС, мы, пользуясь программой AIMS in silico, сформировали представление количественной иерархии продуктов АИМС генома человека. Полученная гистограмма ясно показывает, что для подавляющего числа семейств удлинителей достаточно трех нуклеотидов, чтобы снизить сложность картины АИМС таким образом, чтобы продукты ПЦР можно было четко дифференцировать после разделения в полиакриламидном геле. Экспериментальное определение этих параметров потребовало бы невероятных затрат труда, времени и материалов, а неопределение наверняка привело бы к ложной интерпретации опытных данных.

Традиционный дизайн АИМС предполагает клонирование и секвенирование интересующих фрагментов ДНК для определения их геномной принадлежности. Пользуясь тем, что определение нуклеотидной последовательности генома человека уже практически полностью завершено и, соответственно, последовательности возможных продуктов АИМС также известны, мы заменили этапы клонирования и секвенирования последовательными этапами рестриктазного картирования in silico и in vitro. Для моделирования рестриктазного картирования был введен дополнительный модуль в программу AIMS in silico.

Для визуализации, анализа и дифференциации капиллярных электрофореграмм продуктов АИМС, полученных на автоматических генетических анализаторах и представленных в файлах *.fsa формата ABIF, разработана компьютерная программа PeakPick. Важнейшей функцией программы PeakPick является осуществление дифференциального анализа электрофореграмм репрезентаций различных геномов (нормального/опухолевого геномов, геномов организмов разных штаммов/сортов/видов и т.п.) для определения степени генетического сходства/различия исследуемых образцов биологического материала. Эта опция делает программу незаменимой при проведении сравнительного анализа геномных фингерпринтов.

В качестве модели для демонстрации возможностей технологии AFLOAT нами выбраны клеточные линии РМЖ: ZR-75-1, HBL-100, HS578T, ВТ-474, T-47D и MCF7. Анализ дифференциального метилирования их геномов выявил 6 геномных локусов, которые ранее не изучались с этой точки зрения. Среди них - участки CpG-островков, расположенных в первых интронах генов ANK3 и MAFK, в промоторной области гена C2CD2, в межгенных областях на хромосомах 12ql3.13 и 13q32.1, а также участок первого экзона гена PURB, не являющийся CpG-островком. Выявление дифференциального метилирования неканонической локализации подтверждает непредвзятость разработанного алгоритма скрининга.

Для подтверждения результатов анализа метилирования, полученных методом AFLOAT, проведено метилспецифическое секвенирование исследуемых локусов. Сравнение результатов, полученных методами AFLOAT и метилспецифического секвенирования, показало совпадение оценок статуса метилирования в 92% (33/36) случаев. В 3 случаях из 36 метилспецифическое секвенирование не подтвердило наличия метилирования, выявленного AFLOAT. Мы предположили, что данные метилспецифического секвенирования в некоторых случаях не подтверждают метилированного статуса по причине недостаточной чувствительности собственно метода секвенирования. Опубликованные в литературе оценки различных методов выявления мутаций в отношении их способности определять мозаичные мутации показало следующие значения чувствительности (детектируемая доля молекул ДНК с мутацей в пуле ДНК дикого типа): секвенирование по Сэнгеру - 15-50%, анализ полиморфизма конформации однонитевых фрагментов / анализ гетеродуплексов - 5203

25%, белковый тест РТТ - 10-100%, денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография - 5-25% и параллельное секвенирование - 1%. Использования только секвенирования по Сэнгеру недостаточно для выявления мозаичных мутаций низкого уровня. Параллельное секвенирование при достаточном количестве прочтений (глубине покрытия) позволяет достичь наилучших результатов, однако возможности его использования на сегодняшний день ограничены сложностью, высокой стоимостью анализа и доступностью оборудования.

В нашем исследовании в качестве дополнительного метода подтверждения результатов AFLOAT применен метилспецифический анализ конформации однонитевых фрагментов, показавший их аномальную электрофоретическую подвижность, говорящую о наличии метилированных клонов, в спорных образцах. Проведенное исследование говорит о высокой чувствительности разработанного метода анализа дифференциального метилирования геномов.

Применение технологии AFLOAT к выборке операционных образцов РМЖ и нормальных тканей позволило нам идентифицировать 19 новых локусов генома, аномально метилированных при РМЖ. Совокупно с результатами применения МЧФП, в работе выявлено 26 таких локусов. Среди них 15% являются межгенными (области хромосом 1рЗЗ, 5р15.33, 12ql3.13 и 13q32.1), 19% - интронными (гены В INI, RAH, GPC2, PPP2R5C, PHF1), 8% расположены в первых экзонах (гены ATMIN, IQSEC2). Лишь около половины, (56%, гены LAMBI, KCNH8, DOCK6, SH3KBPI, C2CD2, KIAA1324L, АХ746725/АК127124, ТМЕМ17 6А/ТМЕМ176В, FOXM1/HKMT1188, LAMC3, SEMA6B, VCIP135, KCNH2, CACNG4 и PSMF1) полученных фрагментов имеют локализацию, каноническую для дифференциального метилирования при канцерогенезе. Таким образом, разработанные методы непредвзятого скрининга позволяют идентифицировать дифференциально метилированные локусы геномов независимо от их расположения относительно кодирующих областей, промоторов и сайтов инициации транскрипции.

Один из новых генов, вовлеченных в канцерогенез, выявленных в настоящем исследовании, - БЕМАбВ - расположен в дистальном сегменте короткого плеча 19-й хромосомы, 19р13.3. Эта область, в которой часто наблюдаются потери гетерозиготности при злокачественных новообразованиях, представляет собой С,С-богатый участок ДНК, содержащий большое количество генов. Высокие частоты потерь гетерозиготности по ряду микросателлитных маркеров в локусе 19р13.3 и недавно продемонстрированная ассоциация частоты этих потерь со степенью злокачественности опухолей молочной железы заставляют предположить наличие в этой области одного или нескольких генов-супрессоров опухолевого роста. Анализ молекулярной патологии гена БЕМАбВ, аномальное метилирование которого при раке молочной железы впервые показано в настоящем исследовании, продемонстрировал наличие повреждений гена (метилирование, потеря гетерозиготности) в 75% образцов РМЖ. Впервые выявлена терминальная мутация БЕМАбВ у пациентки с РМЖ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что БЕМАбВ - один из наиболее реальных генов-кандидатов на роль супрессора опухолевого роста в области хромосомы 19р13.3.

Скрининг метилирования ДНК из образцов рака молочной железы, светлоклеточного рака почки, рака мочевого пузыря, прилежащих условно нормальных тканей, аутопсийного материала молочной железы, лимфоцитов периферической крови и буккального эпителия здоровых доноров выявил не только дифференциально метилированные локусы, но и ряд константно метилированных участков генома человека. Это Срв-островок гена СШ7 в составе альтернативного З'-концевого экзона, первые экзоны генов ЬАМАЗА, ЬАМВЗ, ЬАМСЗ, интронные области генов MAD1L1, FLNA и З'-CpG-ocipoBOK гена ZBTB4. Полученные результаты впервые предоставили базу для обоснованного дизайна контролей эффективности метилчувствительной ПЦР.

Анализ состояния метилирования участков ДНК в норме и при канцерогенезе в зависимости от локальных характеристик хроматина показал совместное расположение константно метилированных участков с плотной упаковкой нуклеосом при закрытом хроматине, константно неметилированных участков - с низкой плотностью упаковки нуклеосом при закрытом хроматине, и дифференциально метилированных участков

- с областями открытого хроматина при любой плотности нуклеосомной упаковки. Это позволило разработать синтетический подход к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез.

Использование разработанной в ходе исследования методологии локус-специфического анализа метилирования для изучения эпигенетической патологии семейства генов ламининов подтвердило предсказанное на основании анализа локальных свойств хроматина дифференциальное метилирование 70% промоторных областей этих генов при РМЖ. Шесть промоторных областей демонстрируют неметилированное состояние в нормальных тканях и аномальное метилирование при РМЖ, с частотами, составившими для генов LAMA1

- 36%, LAMA2 - 38%, LAMA3B - 6%, LAMA4 - 2%, LAMBI - 16%, LAMC3 - 8%. Промотор гена LAMC2 показал дифференциальное метилирование в зависимости от тканевого происхождения образцов: в буккальном эпителии и лимфоцитах периферической крови метилирование отсутствует, в то время образцы ДНК из нормальных и опухолевых тканей молочной железы метилированы в 100% случаев. Константное метилирование предсказано и подтверждено для промоторных областей генов субъединиц ламининов LAMA3A и LAMB3. Полученные результаты говорят о высоком предиктивном потенциале разработанного синтетического подхода к отбору для анализа дифференциального метилирования кандидатных участков генов, вовлеченных в канцерогенез.

Таким образом, в ходе исследования разработана новая универсальная стратегия и оригинальная методическая база анализа эпигеномов в норме и при патологии для поиска и характеристики функциональных нарушений (аномальное метилирование генов и геномных локусов), вызывающих различные заболевания у человека. На значительном экспериментальном материале (более 1000 образцов операционного материала рака молочной железы, рака мочевого пузыря, светлоклеточного рака почки и прилежащих тканей, немелкоклеточного рака легких, острого лимфобластного лейкоза, аутопсийного материала молочной железы, буккального эпителия и лимфоцитов периферической крови здоровых доноров) показана эффективность разработанных подходов, охарактеризованы новые гены и районы, вовлеченные в процесс канцерогенеза.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Стрельников, Владимир Викторович, Москва

1. Залетаев Д.В. ДНК-диагностика в онкологии // Молекулярная биология. 2000. - Т. 34. - С. 578-589.

2. Залетаев Д.В., Немцова М.В., Бочков Н.П. Метилирование ДНК как этиологический фактор канцерогенеза // Вестник РАМН. 2002. - № 4. - С. 6-11.

3. Залетаев Д.В., Немцова М.В., Стрельников В.В. и др. Диагностика эпигенетической патологии при наследственных и онкологических заболеваниях // Молекулярная биология. 2004. Т. 38(2), С. 213-223.

4. Залетаев Д.В., Горбунова В.Н., Бабенко О.В. Онкогеномика и молекулярная диагностика в онкологии // 2005. Геномика медицине. Научное издание / Под ред. академика РАМН В.И. Иванова и академика РАН JI.JL Киселева. -М.: ИКЦ «Академкнига» - 392 е.: ил.

5. Кузнецова Е.Б., Стрельников В.В. Методы анализа метилирования ДНК // 2006. Медицинская генетика, 5(11), 3 11.

6. Немцова М.В., Землякова В.В., Жевлова А.И. и др. Профиль метилирования генов-супрессоров опухолевого роста при различных формах рака // Вестник Института молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова. 2002. - № 2. - С. 65-84.

7. Abrams E.S., Stanton V.P. Jr. Use of denaturing gradient gel electrophoresis to study conformational transitions in nucleic acids // Methods. Enzymol. 1992. - Vol. 212. - P. 71-104.

8. Aaroe J., Lindahl T, Dumeaux V. et al. Gene expression profiling of peripheral blood cells for early detection of breast cancer // Breast Cancer Res. -2010.-Vol. 12(1).-P. R7.

9. Anglim P.P., Galler J.S., Koss M.N. Identification of a panel of sensitive and specific DNA methylation markers for squamous cell lung cancer // Mol. Cancer. 2008. - Vol. 7. - P. 62.

10. Beroukhim R., Mermel C.H., Porter D. et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers // Nature. 2010. - Vol. 463. - P. 899-905.

11. Bhusari S., Yang В., Kueck J., Huang W., Jarrard D.F. Insulin-like Growth Factor-2 (IGF2) Loss of Imprinting Marks a Field Defect Within Human Prostates Containing Cancer // The Prostate. 2011. - Vol. 71. - P. 1621-1630.

12. Bianco T., Hussey D., Dobrovic A. Methylation-sensitive, single-strand conformation analysis (MS-SSCA): A rapid method to screen for and analyze methylation // Hum. Mutat. 1999. - Vol. 14(4). - P. 289-293.

13. Bock C. Epigenetic biomarker development // 2009. Epigenomics, 1(1), 99-110.

14. Boyle A.P., Davis S., Shulha H.P. et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome // Cell. 2008. - Vol. 132(2).-P. 311-322.

15. Bozic I., Antal T., Ohtsuki H. et al. Accumulation of driver and passenger mutations during tumor progression // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. -Vol. 107.-P. 18545-18550.

16. Brock G.J.R., Huang T. H., Chen C., Johnson K.J. A novel technique for the identification of CpG islands exhibiting altered methylation patterns (ICEAMP) //2001. Nucleic Acids Res., 29, el23.

17. Buyse M., Loi S., van't Veer L. et al. Validation and Clinical Utility of a 70-Gene Prognostic Signature for Women With Node-Negative Breast Cancer // J. Natl. Cancer Inst. 2006. - V. 98. - P. 1183 - 1192.

18. Costello J.F., Hong C., Plass C., Smiraglia D.J. Restriction landmark genomic scanning: analysis of CpG islands in genomes by 2D gel electrophoresis//Methods Mol. Biol. -2009. Vol. 507. - P. 131-148.

19. Crawford G.E., Davis S., Scacheri P.C. et al. DNase-chip: a highresolution method to identify DNase I hypersensitive sites using tiled microarrays // Nat. Methods. 2006. - Vol. 3(7). - P. 503-509.

20. Dakubo G.D., Jakupciak J.P., Birch-Machin M.A., Parr R.L. . Clinical implications and utility of field cancerization // Cancer Cell Int. 2007. - Vol. 7. - P. 2.

21. Dalgliesh G.L., Furge K., Greenman C. et al. Systematic sequencing of renal carcinoma reveals inactivation of histone modifying genes // Nature. -2010. Vol. 463(7279). - P. 360-363.

22. Davies H., Bignell G.R., Cox C. et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer // Nature. 2002. - Vol. 417(6892). - P. 949-954.

23. Dennis J.H., Fan H.-Y., Reynolds S.M. et al. Independent and complementary methods for large-scale structural analysis of mammalian chromatin // Genome Res. 2007. - Vol. 17. - P. 928 - 939.

24. Deng D., Deng G., Smith M.F., et al. Simultaneous detection of CpG methylation and single nucleotide polymorphism by denaturing high performance liquid chromatography // Nucleic Acids Res. 2002. - Vol. 30: el3.

25. Ding L., Ellis M.J., Li S. et al. Genome remodelling in a basal-like breast cancer metastasis and xenograft // Nature. 2010. - Vol. 464(7291). - P. 9991005.

26. Durinck S., Ho C., Wang N.J. et al. Temporal Dissection of Tumorigenesis in Primary Cancers // Cancer Discovery. 2011. - Vol. 1. - P. 137-143.

27. Eads C.A., Danenberg K.D., Kawakami K., et al. MethyLight: a high-throughput assay to measure DNA methylation // Nucleic Acids Res. 2000. Vol. 28: e32 - e.

28. El-Maarri O, Herbiniaux U, Walter J., Oldenburg J. A rapid, quantitative, non-radioactive bisulfite-SNuPE- IP RP HPLC assay for methylation analysis at specific CpG sites // Nucleic Acids Res. 2002. - Vol. 30: e25.

29. Esteller M., Corn P., Baylin S., Herman J. A gene hypermethylation profile of human cancer // Cancer Res. 2001. - Vol. 61. - P. 3225-3229.

30. Esteller M. DNA Methylation: Approaches, Methods and Applications // 2005. CRC Press, FL, USA, (2005).

31. Euhus D.M., Cler L., Shivapurkar N. et al. Loss of heterozygosity in benign breast epithelium in relation to breast cancer risk // J. Natl. Cancer Inst. -2002. Vol. 94(11). - P. 858-860.

32. Fraga M.F., Esteller M. DNA methylation: a profile of methods and applications // BioTechniques. 2002. - Vol. 33. - P. 632-649.

33. Frigola J., Ribas M., Risques R., Peinado M.A. Methylome profiling of cancer cells by amplification of inter-methylated sites (AIMS) // Nucleic Acids Research. 2002. - Vol. 30(7). - e28.

34. Futreal P.A., Coin L., Marshall M. et al. A census of human cancer genes // Nat. Rev. Cancer. 2004. - Vol. 4(3). - P. 177-183.

35. Ge K., Duhadaway J., Sakamuro D., Wechsler-Reya R., Reynolds C., Prendergast G.C. Losses of the tumor suppressor BIN1 in breast carcinoma are frequent and reflect deficits in programmed cell death capacity. // 2000. Int. J. Cancer. 85(3), 376-383.

36. Gebhard C., Schwarzfischer L., Pham T.-H., Schilling E., Klug M., Andreesen R., Rehli M. Genome-Wide Profiling of CpG Methylation Identifies Novel Targets of Aberrant Hypermethylation in Myeloid Leukemia // 2006. Cancer Res., 66, 6118 6128.

37. Gitan R.S., Shi H., Chen C.-M., et al. Methylation-Specific Oligonucleotide Microarray: A New Potential for High-Throughput Methylation Analysis // Genome Res. 2002. - Vol 12. - P. 158- 164.

38. Glas A.M., Floore A., Delahaye L.J. et al. Converting a breast cancer microarray signature into a high-throughput diagnostic test // BMC Genomics. -2006 V. 7. P. 278.

39. Gonzalgo M.L., Jones P.A. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE) // Nucleic Acids Res. 1997. - Vol. 25. - P. 2529 - 2531.

40. Greenman C., Stephens P., Smith R. et al. Patterns of somatic mutation in human cancer genomes // Nature. 2007. - Vol. 446(7132). - P. 153-158.

41. Gruvberger S., Ringner M., Chen Y. et al. Estrogen Receptor Status in Breast Cancer Is Associated with Remarkably Distinct Gene Expression Patterns //Cancer Res.-2001.-V. 61.-P. 5979-5984.

42. Ha P.K., Tong B.C., Westra W.H. et al. Mitochondrial C-tract alteration in premalignant lesions of the head and neck: a marker for progression and clonal proliferation // Clin. Cancer Res. 2002. - Vol. 8. - P. 2260-2265.

43. Hackenberg M., Barturen G., Oliver J.L. NGSmethDB: a database for next-generation sequencing single-cytosine-resolution DNA methylation data // Nucleic Acids Res. 2011. - Vol. 39. - D. 75-79.

44. Han M., Liew C.T., Zhang H.W. et al. Novel blood-based, fivegene biomarker set for the detection of colorectal cancer // Clin. Cancer Res. 2008. - Vol. 14. -P. 455-460.

45. Hanahan D., Weinberg R.A. The hallmarks of cancer // Cell. 2000. -Vol. 100(1).-P. 57-70.

46. Harbour J.W., Onken M.D., Roberson E.D.O. et al. Frequent Mutation of BAP1 in Metastasizing Uveal Melanomas // Science. 2010. - Vol. 330. - P. 1410-1413.

47. Heaphy C.M., Bisoffi M., Fordyce C.A. et al. Telomere DNA content and allelic imbalance demonstrate field cancerization in histologically normal tissue adjacent to breast tumors // Int. J. Cancer. 2006. - Vol. 119. - P. 108-116.

48. Heintzman N.D., Hon G.C., Hawkins R.D. et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression // Nature. -2009. Vol. 459(7243). - P. 108-112.

49. Herman J.G., Graff J.R., Sanna M, et al. Methylation-specific PCR: A novel PCR assay for methylation status of CpG islands // PNAS. 1996. - Vol. 93. P. 9821-9826.

50. Hodges E., Smith A.D., Kendall J., et al. High definition profiling of mammalian DNA methylation by array capture and single molecule bisulfite sequencing // Genome Res. 2009. - Vol. 19. - P. 1593 - 1605.

51. Hong K.M., Yang S.H., Guo M., Herman J.G., Jen J. Semiautomatic detection of DNA methylation at CpG islands // Biotechniques. 2005. -Vol.38(3).-P. 354-358.

52. Hu Z., Fan C., Oh D.S. et al. The molecular portraits of breast tumors are conserved across microarray platforms // BMC Genomics. 2006. - V. 7. - P. 96.

53. Huebert D.J., Kamal M., O'Donovan A., Bernstein B.E. Genome-wide analysis of histone modifications by ChlP-on-chip // Methods. 2006. - Vol. 40(4).-P. 365-369.

54. Huss M. Introduction into the analysis of high-throughput-sequencing based epigenome data // Brief Bioinform. 2010. -Vol. 11. - P. 512 - 523.

55. Jacinto F.V., Ballestar E., Esteller M. Methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP): hunting down the DNA methylome // 2008. BioTechniques, 44(1), 35 -39.

56. James S.J., Pogribny I.P., Pogribna M., Miller B.J., Jernigan S., Melnyk S. Mechanisms of DNA Damage, DNA Hypomethylation, and Tumor Progression in the Folate/Methyl-Deficient Rat Model of Hepatocarcinogenesis // 2003. J. Nutr., 133,3740-3747.

57. Jelinic P., Shaw P. Loss of imprinting and cancer // J. Pathol. 2007. -Vol. 211.-P. 261-268.

58. Jiao Y., Shi C., Edil B.H. et al. DAXX/ATRX, MEN1, and mTOR Pathway Genes Are Frequently Altered in Pancreatic Neuroendocrine Tumors // Science. 2011.-Vol. 331.-P. 1199-1203.

59. Johnson D.S., Li W., Gordon D. B. et al. Systematic evaluation of variability in ChlP-chip experiments using predefined DNA targets // Genome Res. 2008.-Vol. 18.-P. 393 -403.

60. Jones P.A., Baylin S.B. The epigenomics of cancer // Cell. 2007. - Vol. 128(4).-P. 683-692.

61. Kanel T., Gerber D., Schaller A., Baumer A., Wey E., Jackson C.B., Gisler F.M., Heinimann K., Gallati S. Quantitative 1-Step DNA Methylation Analysis with Native Genomic DNA as Template // 2010. Clin. Chem., 56, 1098 1106.

62. Kantlehner M., Kirchner R., Hartmann P., Eilwart J.W., Alunni-Fabbroni M., Schumacher A. A high-throughput DNA methylation analysis of a single cell // 2011. Nucleic Acids Res., 10, 1093/nar/gkql357.

63. Kaneda A., Kaminishi M., Yanagihara K. et al. Identification of silencing of nine genes in human gastric cancers // Cancer Res. 2002. - Vol. 62. - P. 6645-6650.

64. Kerangueven F., Noguchi T., Coulier F., et al. Genome-wide search for loss of heterozygosity shows extensive genetic diversity of human breast carcinomas. // 1997. Cancer Res. 57, 5469-5474.

65. Kuppuswamy M.N., Hoffman J.W., Kasper C.K., et al. Single Nucleotide Primer Extension to Detect Genetic Diseases: Experimental Application to Hemophilia B (Factor IX) and Cystic Fibrosis Genes // PNAS. 1991. - Vol. 88.-P. 1143-1147.

66. Lee W., Jiang Z., Liu J. et al. The mutation spectrum revealed by paired genome sequences from a lung cancer patient // Nature. 2010. - Vol. 465(7297). - P. 473-477.

67. Leemans C.R., Braakhuis B.J.M., Brakenhoff R.H. The molecular biology of head and neck cancer // Nat. Rev. Cancer. 2011. - Vol. 11. - P. 9-22.

68. Ley T.J., Mardis E.R., Ding L. et al. DNA sequencing of a cytogenetically normal acute myeloid leukaemia genome // Nature. 2008. - Vol. 456(7218). -P. 66-72.

69. Li L., Carroll P., Dahiya R. Epigenetic changes in prostate cancer: implication for diagnosis and treatment // J. Natl. Cancer Inst. 2005. Vol. 97. -P. 103-115.

70. Liang G., Carol E., Hung D. et al. DNA methylation differences associated with tumor tissues identified by genome scanning analisis. // 1998. Genomics. 53, 260-268.

71. Lister R., Pelizzola M., Dowen R.H. et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences // Nature. 2009. -Vol. 462(7271).-P. 315-322.

72. Liu R., Wang X., Chen G.Y., et al. The prognostic role of a gene signature from tumorigenic breast-cancer cells // N Engl J Med. 2007. - Vol. 356(3). -P. 217-226.

73. Luo Z.G., Tang H., Li B., Zhu Z., Ni C.R., Zhu M.H. Genetic alterations of tumor suppressor ING1 in human non-small cell lung cancer // Oncol. Rep. -2011. Vol. 25(4). - P. 1073-1081.

74. Lydiatt W.M., Anderson P.E., Bazzana T. et al. Molecular support for field cancerization in the head and neck // Cancer. 1998. - Vol. 82(7). - P. 1376-1380.

75. Mardis E.R., Ding L., Dooling D.J. et al. Recurring mutations found by sequencing an acute myeloid leukemia genome // N. Engl. J. Med. 2009. -Vol. 361(11).-P. 1058-1066.

76. Maxwell A., McCudden C.R., Wians F., Willis M.S. Recent Advances in the Detection of Prostate Cancer Using Epigenetic Markers in Commonly Collected Laboratory Samples // LabMedicine. 2009. - Vol. 40. - P. 171-178.

77. Meissner A., Mikkelsen T.S., Gu H. et al. Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells // Nature. 2008. - Vol. 454(7205).-P. 766-770.

78. Mitelman F., Johansson B., Mertens F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation // Nat. Rev. Cancer. 2007. - Vol. 7(4). - P. 233-245.

79. Miyamoto K., Asada K., Fukutomi T. et al. Methylation-associated silencing of heparan sulfate D-glucosaminyl 3-0-sulfotransferase-2 (3-OST-2) in human breast, colon, lung and pancreatic cancers // Oncogene. 2003. - Vol. 22.-P. 274-280.

80. Nemtsova M., Zemlyakova V., Kusnetsova E., Strelnikov V., Lyubchenko L., Zaletayev D. Methylation profiling of carcinogenesis-associated genes in sporadic breast cancer // 2005. Breast Cancer Research, 7(Suppl 2), P4.17.

81. O'Shaughnessy J.A., Kelloff G.J., Gordon G.B. et al. Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development // Clin. Cancer Res. 2002. - Vol. 8(2). - P. 314-346.

82. Paulin R., Grigg G.W., Davey M.W., Piper A.A. Urea improves efficiency of bisulphite-mediated sequencing of 5'- methylcytosine in genomic DNA // Nucleic Acids Res. 1998. - Vol. 26. - P. 5009 - 5010.

83. Perou C.M., Sorlie T., Eisen M.B. et al. Molecular portraits of human breast tumours // Nature. 2000. - Vol. 406(6797). - P. 747-752.

84. Pleasance E.D., Cheetham R.K., Stephens P.J. et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome // Nature. 2010. - Vol. 463(7278). - P. 191-196.

85. Quackenbush J. Microarray analysis and tumor classification // N Engl J Med. 2006. - Vol. 354(23). - P. 2463-2472.

86. Raizis A.M., Schmitt F., Jost J.P. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation // Anal. Biochem. 1995. - Vol. 226(1).-P. 161-166.

87. Rush L.J., Dai Z., Smiraglia D.J., et al. Novel methylation targets in de novo acute myeloid leukemia with prevalence of chromosome 11 loci // Blood. -2001.- Vol. 97.-P. 3226-3233.

88. Santarius T., Shipley J., Brewer D., Stratton M.R., Cooper C.S. A census of amplified and overexpressed human cancer genes // Nat. Rev. Cancer. 2010. - Vol. 10(1). - P. 59-64.

89. Seelan R.S., Pisano M.M., Greene R.M., Casanova M.F., Parthasarathy R.N. Differential methylation of the gene encoding myo-inositol 3-phosphate synthase (Isynal) in rat tissues // 2011. Epigenomics, 3(1), 111 -124.

90. Serre D., Lee B.H., Ting A.H. MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome // Nucleic Acids Res. 2010. - Vol. 38. - P. 391 - 399.

91. Shen L., Kondo Y., Rosner G.L. et al. MGMT promoter methylation and field defect in sporadic colorectal cancer // J. Natl. Cancer Inst. 2005. - Vol. 97.-P. 1330-1338.

92. Shin S.H., Kim B.H., Jang J.J., Suh K.S., Kang G.H. Identification of novel methylation markers in hepatocellular carcinoma using a methylation array // 2010. J. Korean Med. Sci., 25(8), 1152 1159.

93. Singer-Sam J., Robinson M.O., Bellve A.R., Simon M.I., Riggs A.D. Measurement by quantitative PCR of changes in HPRT, PGK-1, PGK-2, APRT, MTase, and Zfy gene transcripts during mouse spermatogenesis // Nucleic Acids Res.-1990b.-Vol. 18.-P. 1255- 1259.

94. Slaughter D.P., Southwick H.W., Smejkal W. "Field cancerization" in oral stratified squamous epithelium // Cancer. 1953. - Vol. 6. - P. 963-968.

95. Stratton M.R. Exploring the Genomes of Cancer Cells: Progress and Promise// Science.-2011.-Vol. 331.-P 1553-1558.

96. Stratton M.R., Campbell P.J., Futreal P.A. The cancer genome // Nature. -2009. Vol. 458. - P. 719-724.

97. Sui G., Zhou S., Wang J. et al. Mitochondrial DNA mutations in preneoplastic lesions of the gastrointestinal tract: A biomarker for the early detection of cancer // Mol. Cancer. 2006. - Vol. 5. - P. 73.

98. Suijkerbuijk K. P. M., van Diest P. J., van der Wall E. Improving early breast cancer detection: focus on methylation // 2011. Ann. One., 22, 24 29.

99. Tabor M.P., Brakenhoff R.H., Ruijter-Schippers H.J. et al. Multiple head and neck tumors frequently originate from a single preneoplastic lesion //Am. J. Pathol.-2002.-Vol. 161(3).-P. 1051-1060.

100. Tanas A.S., Shkarupo V.V., Kuznetsova E.B., Zaletayev D.V., Strelnikov V.V. Novel tools for unbiased DNA differential methylation screening // Epigenomics. 2010. - Vol. 2. - No. 2. - P. 325-333.

101. Tost J., Gut I.G. Analysis of gene-specific DNA methylation patterns by pyrosequencing technology // Methods Mol Biol. 2007. - Vol. 373. - P. 89102.

102. Ushijima T., Morimura K., Hosoya Y., et al. Establishment of methylation-sensitive-representational difference analysis and isolation of hypo-and hypermethylated genomic fragments in mouse liver tumors // PNAS. 1997. -Vol. 94.-P. 2284-2289.

103. Wang W., Srivastava S. Strategic Approach to Validating Methylated Genes as Biomarkers for Breast Cancer // 2010. Cancer Prevention Research, 3, 16-24.

104. Wang Z., Sturgis E.M., Zhang F. Genetic variants of p27 and p21 as predictors for risk of second primary malignancy in patients with index squamous cell carcinoma of head and neck // Molecular Cancer. 2012. - Vol. 11.-P. 17.

105. Weber M., Davies J.J., Wittig D. et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells // Nat. Genet. 2005. - Vol. 37(8). - P. 853-862.

106. West M., Blanchette C., Dressman H. et al. Predicting the clinical status of human breast cancer by using gene expression profiles // PNAS. 2001. -Vol. 98.-P. 11462- 11467.

107. Wojdacz T.K. Current methylation screening methods // 2009. Epigenomics, 1(2), 223 226.

108. Worm J., Aggerholm A., Guldberg P. In-Tube DNA Methylation Profiling by Fluorescence Melting Curve Analysis // Clin. Chem. 2001. - Vol. 47.-P. 1183 - 1189.

109. Xi Y., Li W. BSMAP: whole genome bisulfite sequence MAPping program // BMC Bioinformatics. 2009. -Vol. 10. - P. 232.

110. Xiao W., Oefner P.J. Denaturing high-performance liquid chromatography: A review // Hum. Mutat. 2001. - Vol. 17(6). - P. 439-474.

111. Xiong Z., Laird P.W. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay // Nucleic Acids Res. 1997. - Vol. 25. P. 2532 - 2534.

112. Zerilli F., Bonanno C., Shehi E., Amicarelli G., Adlerstein D., Makrigiorgos G. M. Methylation-Specific Loop-Mediated Isothermal Amplification for Detecting Hypermethylated DNA in Simplex and Multiplex Formats // 2010. Clin. Chem., 56, 1287 1296.

Информация о работе

Стрельников, Владимир Викторович
доктора биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.02.07

Диссертация

Комплексное исследование метилотипов злокачественных новообразований: фундаментальные и прикладные аспекты - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы