Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модуляция метилирования ДНК и реорганизация структуры хроматина под влиянием витамина B12 и адреналина у эукариот

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Модуляция метилирования ДНК и реорганизация структуры хроматина под влиянием витамина B12 и адреналина у эукариот"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Р Г Б ОД

УДК 577.1:547.96.32 На правах рукописи

КЛЯШЕВА РАИСА ИВАНОВНА

МОДУЛЯЦИЯ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДИК И РЕОРГАНИЗАЦИЯ СТРУКТУРЫ ХРОМАТИНА ПОД ВЛИЯНИЕМ ВИТАМИНА В12 И АДРЕНАЛИНА УЭУКАРИОТ

03.00.04 — биохимия

АВТОР ЕФ ЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Рязань — 19%

Работа выполнена в Чувашском государственном университете

им. И. П. Ульянова н г. Институте биомеднцннскон химии РЛМН, г. Москва.

Научный консультант: д. м. к., профессор Макарова П. Г.

Официальные оппоненты: д. б. н., чл.-корр. РАМН, профессор

Вотрнн И. II.

д. б. и., профессор Винтер С. Г. д. м. п., профессор Узбскова Д. Г.

Ведущая организация: Московская медицинская академия

им. II. М. Сеченова.

Защита состоится «_»__1996 года в_часов

на заседании Диссертационного Совета Д 084.67.02 при Рязанском государственном медицинском университете имени академика II. П. Павлова по адресу: ЗЭ1000, г. Рязань, ул. Высоковольтная, 9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Рязанского государственного медицинского университета имени академика II. П Павлова (ул. Шевченко, 34).

Автореферат разослан «_ »______19У0 года.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета кандидат биологических наук

Рпяяноза П. А.

ОБЩАЯ Ш>АКГЕРИСТЖА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Исследование состояния структурной и -функциональной организации ДНК и хроматина под действием витаминов з гормонов необходимо для понимания реализации генетической информации в эукаркотических клетках (Б.Ф.Ваншин, Н.И.Александ-рушкина, О.А.Огаркова, 1989; Т.Н.Смирнова, Л.Н. Кинпурашвили, Г.И.Кирьянов и др. ,1989; . в.глахзгазьап* нл>„к1гаэау 1983 ; е»Но111йау, 1988).

Следует подчеркнуть, что сложные механизмы метилирования ДНК под влиянием гормонов (Г.А.Романов, Е.Н.Жаворонкова, С.В.Савельев, 1984; И.И.Никольская, Е.В.Иаркова, Е.Н.Зенина и др., 1993) и фитогормонов (Т.И.Власова, М.Д.Нирнос, З.Н.Дешденко, Б.Ф.Ванюшин, 1994) остаются недостаточно выясненными.

В отечественной и зарубежной литературе тлеется ограниченное" количество работ по изучению характера действия цианокобаламина и адреналина на функциональное состояние клеток на генетическом уровне. •

Данная работа посвящена мало изученному вопросу о влиянии витамина В^ и адреналина на. особенности метилирования ДНК в св^ зи о изучением организации структуры'хроматина, что является на сегодня одной из актуальных проблем в области биологии и медицины.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы явилось изучение'организации структуры хроматина ядер клеток некоторых тканей и органов кивоткнх, а такие процессов метилирования цитозина з ДНК под действием витамина Зр и адреналина.

Для достижения поставленной цели в работе решались еле-душцие задачи.

1. Изучить органцую специфичность содергания метилированного цитозина (5-Щ) в ДНК у разных животных в эксперименте.

2. Выявить в условиях. т!лго • влияние разных доз витамина на содержание 5-Щ в ДНК из печени, почек и сердечной мышцы морской свинки.'

3. Исследовать действие -метлица и АТФ в разных сочетаниях на содержание 5-МЦ в ДЗК из ядер печени и дочек морской свинки при введении витамина В^.

4. Изучить содержание 54Щ в ДНК из ядер регенерирующей печени морской свинки под влиянием витамина Б^.

. 5. Методом электронной микроскопии изучить организацию структуры хроматина ядер интактной я регенерирующей печени морской свинки при введении витамина В^, и установить взашосвязь мезду площадью плотного примеибрандого храштина (ПмХ) и- содержанием &-Щ в ДНК. ' '•

6. Изучить включение ,1л т1-ь» меченых метальных групп по водороду от 8 + - адеюзилметиойина [%]&ш и ыетилкобалами-ва [%]меСЬ1 в стандартные препараты ДИК тауса и шсхо -еоссш 1о1еив . в присутствии суммарнцх и индивидуальных эукариошческих ДНН-метилаз.

7. Изучить влияние адреналина на метилирование ДНК из сердечной мышцы собаки, а также при острой гшокеш сердца.

8. Методом электронной микроскопии* изучить состояние структуры хроматина ядер кардаоадоцктов.и гепатрдатов собак при введении адреналина и установить взаимосвязь меаду площадью плотного ЛмХ и содержа ниш "МЩ в ЛНК из сердечной ыышда.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

' Экспериментально доказана и теоретически обоснована биохимическая взаимосвязь влияния высоких доз витамина В^ 2 аД~ реналина на содержание 5-ОД в ДНК и состояние хроматина из разных органов животных» ' .

Впервые щ получены данные о связи различных доз

витамина В^ с содержанием 5-Щ в ДНК из разных органов швот-ных, в регенерирутацей печени животных, а также в присутствии метионина и АТФ в разных сочетаниях. /

Установлено влияние высокой дозы.витамина В^ на изменение' структуры хроматина в ядрах клеток регенерирующей печени.

Показано 1» ■, что метилкобаламан -рн]месЪ1 является источником метальных групп ДНК по цитозиновым основаниям.

Получены и теоретически обоснованы результаты, экзогенного . и эндогенного. (острая гипоксия) воздействия высоких доз адрена-.. лина на генетический аппарат клетки, в-частности, на-уменьшение содержания 5-Щ в ДНК из' сердечной мышца собаки.

Впервые сочетанием биохимических методов и метода электронной микроскопии показано наличие взаимосвязи мезду изменением состояния хроматина в ядрах кардасмиоцитов собаки и уменьшением метилирования ДНК по пдтозиновым основаниям при воздей- ' ствии высоких доз адреналина.

Предложены дополнения к схемам биохимических процессов,, приводящих к изменению содерЕЗНИя 5-Щ в ДНК во взаимосвязи с реорганизацией структуры хроматина в клетках-мшенях еизотных тканей под влиянием высоких доз витамина Вт? и адреналина.

НАУЧНО-ПРМИНЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Подученные результаты расширяют представление о действии цианокобаламина и адреналина в высоких дозах и показывают наличие существенных изменений в биохимических процессах.

Обнаружено, что в ядрах клеток-мишеней в ДНК и хроматине : происходят структурные перестройки, связанные с изменением уров-на метилирования ДНК и реорганизацией плотного ПмХ, что должно отразиться на. функции органов и тканей.

Доказана рациональность сочетания.биохимических и морфологических методов для изучения модификации ДНК и структурных перестроек хроматина в.тканях животных.

Впервые сформулирована общая биохимическая взаимосвязь между уровнем метилирования ДНК по датозину и реорганизацией хрсш-тина в ядрах, клеток-мишеней эукариот под влиянием высоких доз витамина В^ и адреналина.

.Результаты собственных исследований могут служить основой для дальнейшего углублений исследований, связанных с действием других лекарственных препаратов на структуру и функцию наследственного вещества клетки.

Материалы•диссертации используются при чтении лекций на кафедре•фармакологии и курсе биохимии, медицинской биологии и гистологии, нормальной физиологии, патологической физиологии медицинского института при Чувапском государственном университете им.И.Н.Ульянова, на кафедре биохкмпп бполого-почвенного факультета Казанского государственного университета им.В.Й.Улъа-ноза-Леыика.

АДРОЕАЩЯ РАБОТЫ

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на ежегодных научных конференциях Чувашского государственного университета в 1971-1995 г.г., на итоговых научных конференциях Казанского государственного университета ям.В.И.Ульянова-Ленина ( 1285, 1990, 1992 ), на и и У Всесоюзных биохимических съездах. Работа обсугдалась на заседаниях научны:! биохимических коллективов в НПО"Витамины", з Институте биомедпцннской химии Р-ЭДН, в Научно-исследователь-скс.м институте физико-химической сяологпи шл.А.К.Еалозерского УГУ шл.М.В.Ломоносова, .'а госрегистрации С193 ;0С7995 от 10.01.91 г.

ПУЕйШШИ

По теме диссертации опубликована.31 научная работа.

СТРУКТУРА И ОБЪЕЛ ДКССЗРТАШЕ

Диссертация представлена в объеме 223 страницы мапппо-ппсного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка литературы , включа^лего 325 отачествзн:^ и 229 заэу-без:да зссочшкоз, иллюстри^оззкз двумя сСсхзмзгли, 13 таблицами и 20 рисунками.

ШЯОЕЕЩЩ, БЩОСДаЫЕ НА ЗАЩИТУ

I. У интактных гивотных подтверждена органная спедифич-нооть по содержанию Г-ЧЩ в ДНК из ядер клеток в эксперименте, ' при этом наибольшее-количество обнаружено в головном мозге кроликов по сравнении с другими органам.

- 2. Введение витамина Bj2 viT0 в высоких дозах приводит • ■ к увеличении содержания 5-МЦ в ДНК печени и почек к не влияет на кардаогзюдаты морсксх свинок.

' 3. Витамин В£2» введенный в высокой дозе вызывает увели. чение 5-МЦ в ДНК из ядер регекерирунцей печени кивотных по сравнению с ДНК регенерируздей печени без введения витамина Bj9.

Высокие дозы витамина В^ приводят к уменьшению сло:сади • плотного-ЕмХ в регенерирующей печени, что установлено методом электронной кикро скопил.

4. В опытах vitro odispyssHO включение меченых: кетиль-ше групп от[%]SM1 е рн]ь'еСЫ . в стандартные црепараты дНК при использовании ядерных суммарных и индивидуальных ДНК-ыетплаз. В случае применения [%] Кссы активность ДНК-метилаз была менее ззырааена, о чем судили по включению в .ДНК в имц/мин ■на 1,0 мг белка. Подвержен цуть прямого метилирования ДНК npz участаи метилкобалакана.

5. При введении адреналина в высоких дозах происходит однонаправленное уменьшение содержания 5-4Щ в ДНИ и площади плотного шХ в лсардиомиодатах у собаки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования были проЕедены на 293 яивстнш: - самцах : 40 беспородных собак, 40 кроликов, 203 морских сзпккп, 10 крыс. Т^лт проведены 13 серий экспериментов.

Ядерную Фракшэд и ДЕК получали по методу .2»Say, Я. Simons, A.20UECC (1952) з модз&шзпга Г.П-Ьенлнгз (I9S9) с кекото-^ pías изменениями B.JLstitt er (1972). При выделение ДНК органы и ткани помещали на лед и з охлаздекныЗ раствор, ссдерзасдй 0,015 Ц раствор трехземешеянсго лимоннокислого натрия для'лнгп-бзрования дезокспргбонуклеаз а трпс-буфер pH = 7,3. Полученную ДЕК очищала от лкпидов, белков, рибонуклеиновых кголот z ■ хранили при С-4°С з SO % этаноле z/'И пксуинвйлл з закуумясм эксикаторе.

Препарата ДНК дкелп следугезе характеристик::. Выход : 0,5-2,0 г. ДЕК з пересчете ка ICO г ткани. Препаратн ДНК содержали 0,2-1,5 ^ бедка {C.Iowiy et al., 1551) и 0.5-1,0 % РНК. 2 260/ Б 230 = 2,1 - 2,3 ( А.С.Спирин, IS5B).

Определение молекулярной ссн ДНК проводили методом электрофореза з агарознсм геле (Т.Ь^нпатио, 3.5рпч, Дд.Сгмбрр:,1234) на приборе 1X3-"Steden*. Расчета пскэзали, что препараты имели молзнудярпуз массу 2 мегалзлзтон ( :,5Д ).

Нунлестпдный состав з ссд-ржалнэ 5-Мц в ДНК изучали по спектрам поглспекля з Jí-озета З.Х.Вас2льез, 1371)

на спептрсфстсметре з тлзгрзоблает:: и вырагала з молярных процентам: (мол.Л).

Взаимодействие :срсматдна о гн^еркал.тгором анрддановка срак-зевкм было изучено з регенерирующей печени морских езлмок по

— в —

методу л.Е1е1ег .(1955),в кодифшсадги Л. А. Карнауховой,!. А. Сергеевич (1935).

По данным флуоркметрпи определяли соотношение однодепочечщк ( Л = 620 ям) л двухцепо .зчных ( Л - 530 ем ) куклепковых кислот ( отитерий о1 ) л использовали его в качестве теста для оценки функционального состояния хроматина (В.Н.Кзрнаухов, 1975).

Структуру хроматика изучали в ядрах регенерирулцей печени морской свинки при введении высокой дозы витамина В^ ( О,В мг/'кг ) в течение'3-х дней методом электронной микроскопия.

Кусочки печени брали через 24 часа на расстоянии 0,5 см от разреза. Затем их фиксировали в '2,5 % растворе глутарового альдегида фирмы «2ег?ав на фосфатном буфере ( рН = 7,3 ) в течение 3 час, при температуре - 4сС.' По с л едущие этапы осущестзля-ли по описании Г.Гайэр (1974) с использованием смол : эпон-45 , кка-20,юб А-3 и ускорителя - игр -30. Срезы толщиной 60 ем получали па ультрамглфотоме " хев - 4800 "" (Швеция). Ультрзтон-кпе срезы изучали в электронном микроскопе "Ш -100 СХ "(Япония ).

Б серии •вдектрошо-ыщзоскоЕпчесЕЯХ исследований, связанных с введением адреналина, было использовано 10 беспородных собак массой 10-14 кг. В течение пяти дней похосыскне Еивотные получали внутривенно адреналина игдрсхлоряд по 100 ккг/кг массы екеошевяс. Контрольным аЕвотным вводили по 10 мл физиологического раствора.

Еа пятые сутки собгха были подвергнута эюгедоЯЕ: путем вцут» ривеыного введения тиопгктала штрпя, поме чего брзлк ткани сердечно!: г^дды и печени на злег^ошо^к?оег.одачеоп-:е };сследов&-епя (А.И.Годубев, 1.1.Гглкза, ?.Я.ЛнггноЕЗ, 1286).

Получение суммарных препаратов эукариотических ДЕЖ-метилаз и изоэлектрофокуспрование (ИЭФ)

Источником ДНК-метилаз служили ядра печени крысы, которые выделяли согласно работе P-¿=el СIS75). Суммарные препараты ДНК-метилаз, полученные из ядерных экстрактов при высаливании белков 0,8 н сульфатом атония (В.В.П!эркова, Н.Г.Лопатина, И.И.Никольская, и др., 1993), использовали для разделения методом ИЭФ на амфолкнах (I.I.nü:ol'Eí:aya„ E.V.Sbaitosva, S.T.Such-koi et ..ai.» 1993). Белковые фракция с ДНК—метилазами хранили при + 4° С.

В работе использовали акцептор' ые ДНК тиг/уса теленка фирмы "Oalbiocfcca (сша) и Шетососсггз. l'item ' фиргк "Sorra» .

(Германия). Изоэлектрофхэкусирование белко* яа колонка проводили с амфолинами диапазона рЯ 3,5-10 фирмы " г КЗ " (Швеция). В качестве доноров метильных групп использовали меченые [%]алн с удельной активностью 15 .КнД'-М фирмы " ¿jssrchca ** (Англия) а . [%]iíGObl , который бцл. получен по методу Е.М.Тачковой, И.П.Ру^ковой, Н.В.МясицеЕой п др. (I97G).

Определение ыетилззной активности. проводили в 130 мкл ин-кубасронкой смеся, которая содержала 10,0 m!.í натрпй-фосфаишй буфер рН =7,5 ; 5 кет акцепторной ДНК, 40 мкл [%]üóckL (удельная зктиепость рабочего раствора 0,1 Кп/мМ)илп 20 -.тел Рн] Sil! • (удельная активность рабочего раствора 0,2 Кп/мМ), 20-10 гаг белка и фэгпг-'етапсульйоетлфторид ( Pía?) «"raids» (Гермаш!я) в конечной концентрации IxICT4 M. После 18-часовой шиубации при 37°С пробы обрабатывали по описанию метода 1.1.lîikol• abaja, S.V.Snchfcov et al.,,

За единицу активности ДНК-метилаз цриниыали радиоактивность ДНК индуса в имц/шн в расчете на I мг белка. Концентрацию белка определяли по методу м.к.В1'е.«о:кз. (1976).

Результаты исследований обрабатывали методом вариационной статистики с использованием критерия Стьвдента {П.Ф.Рокицкпй, 1973, Г.Г.Автавдилов, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЖШВАЩЙ И ИХ СШЗДЕНИЕ

В клетках животных «одайшация ДНК по цитозиновым' основаниям играет важную роль в регуляции транскрипции ( ^.ВоегПег, 1983; н.оейаг , 1988; М.Д.Кирнос, Я.И.Апексавдрушкина,Б.Ф.Ванюшин, 1993 ).

В ходе навдх экспериментов была подтвергдена видовая и органная специфичность метилирований ДНК по цитозиновым основаниям. Так, в ДНК мозга кроликов содержание 5-ВД равнялось'2,27+0,14 мол.#; в ДНК сердечной мышцы - 1,84 + 0,13 мол.$; в ДНК легоч ной ткани - 1,62 + 0,12 тя.%. Разница оказалась достоверной между содержанием 5-4Щ в: составе.ДНК, выделенной из мозга и сер», дечной мштгрт ( р< 0,05)$ мозга и легочной. ткаш С Р <0,001).

Количество, 5-Щ в ДНК го разных органов морской свинки составило: в печени - 1,71+0,13 долпочках - 1,30+0,15 мол.$; сердечной, шпще - 1,48+0,13 иол.%. Различие в содержании 5-ВД оказалось достоверным между ДНК из печени, и почек (Р -<0,05).

Установленный факт различия по содержанию 5-ЫЦ в ДНК из разных тканей животных может быть следствием тонких биохимичео-- ких механизмов метилирования, которые являются причиной цитодаф-ференцировки, что в конечном итоге приводит к разнокачественное® та наследственного материала.

Влияние витамина В^ 113 содержание 5-ВД в ДНК и состояние хроматина в разных органах морских свинок.

Изучение влияния разных доз витамина В^, (рис.1) 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 мг/кг массы животного в течение трех дней свидетельствует о том, что только высокие дозы витамина В^р достоверно увеличивают содержание 5-МЦ в ДНК из печени морских свинок до 3,5 +0,15 мол.$ , увеличение в 2 раза (Р ^0,001); из почек до 2,07 +0Д6 тл.%, увеличение в. 1,6 раза (Р 0,001).

Содержание 5-Щ .( мол % )

12 ал о.б аа

ДОЗЫ ; витамина ( мг/кг )

Рис.1. Содержание 5-Щ з Ш из печет - I, почек - 2, сердечной мышцы - 3 морской свинки при введении разных доз витамина ВТ? ( а = 10 ).

Исходя из полученных собственных результатов факт увеличения метилирования ДНК ло датозиду в ДНК печени и почек можно объяснить непосредственным участием м е ти лк о б а л амина в метилировании ДНК по цитозиновыг: основаниям. На Возможность прямого участия витамина В^.в модифицирующем метилировании ДНК бактерии РгорАоМЪасгетШа вЬемаашИ указывали Н.В.Антошкина, Л.И.Воробьева, Е.П.Иордан (1979).

При изучении количества 5-Щ в ДНК сердечной мышцы разница между опытными и контрольными значениями оказалась недостоверной 0,05). Можно заключить,- что кардиомиоциты не являются клет-ками-мшенями для витамина В^»»

В следующей серии экспериментов изучали влияние высокой дозы витамина В^ на содержание, 5-МЦ в ДНК в присутствии ыетио-нина н АТФ. Известно, что активной формой метионина выступает .'б аденозилметионин, участвующий в метилировании ДНК по цдто»' зиновым основаниям в определенных сайтах и нв - определенном этапе реализации эпигенетической программы ( Е»Но111йау , 1985). Активная форма метиошша образуется в присутствии АТФ.

Цсрским свинкам I, 2 и 3 групп вводили подкожно по 40 г.Ц{Т витамина В^ через -I день в течение 20 дней. Второй'группе животных дополнительно с II по. 15 дни вводили ежедневно по 4,0 мг метионина подкожно, а в период с . 16 — 20 дни вводили по 2 мг дикатриевой соли АТФ внутримышечно.. Еивотным третьей группы с II по 15 дни вводили АТ£ , с с 16 по 20 дни - кртярщн В тех г.е дозах (табл.1).

Из полученных результатов видео, что метлонрн и АТ$ уг.е.Щ-«-пают метилирование ДНК в печени в 1,5 раз? (Р^ д в почках В! 1,6 раза (Р1 д 2 ^ вз^тшз^ое под Шттй высокой дозы витамина В^*

Таблица I

Влияние высокой дозы впташна В^, на со дергание 5-ВД в ДНК из печени и почек морской свинки в присутствии метионина.и АТФ ..........

Серии Г 1 Содержание 5-Щ в ДНК в тл.%

1 1

опытов ' " " i т печень . ! почки

I. В^ 2,38 + 0,14 2,07 + 0,16,

2.. В-^* метионин+ АТ5 1,60 + 0,13 1,30+0,14 .

3. АТФ +ыетионин 1,82 + 0,13- .1,52 + 0,15 - .

Примечание : в кандой серии опытов а = 10

Для подтверждения результатов ш тг±то , нами были поставлены опиты т пЛто . Однако использование кетионннз привело к уменьшению включения меченых ыетильных групп от [^н] Пссы в ДНК из тимуса теленка только на 5 % от исходного уровня (см. табл.3).

Влияние витамина В^ на содержание 5-МЦ в ДНК и структуру хроматина исследовали также в экспериментах с регенерирующей печенью морских свинок.

Было установлено, что при введении витамина В^ произошло увеличите содержания 5-?Щ в ДНК из регенерирующей печени на 23,0 %, которое составило 1,90 ¿0,03 мол.,'? по сравнению с 1,47 + 0,03 мод,;? без введения виташша ВТ2 (Р 0,01).

Анализируя полученные данные можно прийти к выводу, что витамин Bjg в высокой дозе увеличивает метилирование ДНК в регенерирующей печени морской свинки, однако в меньшей степени, чем в интактной печени.

Результаты наших опытов согласуются с исследованиями Н.Н.ОДушкабарова, И.И.Вотрина, С.С.Дебова (1981), в которых авторы обнаружили высокую метилазную активность в регенерирующей печени крысы. .-

Увеличение метилирования могло повлиять на ДНК-белковое взаимодействие и на формирование определенной ультра структуры хроматина (Г.И.Кирьянов, 1983). Мы изучали состояние хроматина по соотношению одноцепочечных и двухцепочечных нуклеиновых кислот в ядрах клеток регенерирующей печени ( критерий ). Это дало нам возможность судить об изменении состояния хроматина при введении витамина В^ vivo ■ и последу ззцего взапмодейсяг вия. хроматина с интеркалирувдим веществом акридиновым оранжевым. Связывание акридинов не изменяет компонентов нуклеиновых кислот, ю в значительной мере нарушает их биологические функции, ^следствии изменения конфигурации молекул (С.Б.Бреслер, Э.Р.Дохман, А.Михелер, 1976).

Результаты но определению критерия ct, в условных единицах оказались следующими. У интактвдх животных - 0,304 +0,012 в регенерирующей печени без введения витамина В-^ - 0,331+0,011; в регенерирующей печени с введением витамина Bj^ - 0,494+0,016. Разница между подопытными вариантами оказалась достоверной (Р< 0,001).

-Витамин Bj£ в высокой дозе i» vivo изменяет структуру хроматина путем увеличения метилирования ДНК по цитрайну. В декомпактизированном хроматине происходит большее связывание

с акридиновым оранжевым, что мы наблюдали по увеличению свечения его комплексов с нуклеиновыми кислотами.

Методом электронной микроскопии бнди изучены величины пло— . щадеи ядер гепатоцитов, нуклеоплазштического хроматина (НпХ, эухроматин), плотного примембранного хроматина (ПмХ, гетеро— хроматин) в печени морских свинок.

При изучении структурной организации хроматина в ядрах гепатоцитов у интактных животных было обнаружено, что ПмХ тонким равномерным слоем примыкает к кариолемме. •

В ядрах гепатоцитов регенерирующей печени у подопытных пи-вотных обнаружено увеличение ПмХ по сравнению с интактными: в •опыте с введением витамина В-^ - на 9,7 % (Р ^ 0,05). В опыте без введения витамина В^, - ка 19,8 % (Р "^0,01). Сравнение результатов опытов показало, что в ядрах гепатоцитов регенерирующей печени на фоне введенного витамина В^ произошло уменьшение плотного ПмХ на 10,1 % по сравнению с регенерирующей печенью без применения витамина В^ (В < 0,01).

Таким образом, витамин В-^ » введенный кивотным в еысокой дозе, способствует увеличению содержания 5-Щ в ДЕК и уменьшению площади плотного ПмХ в регенерирующей печени морских свинок. Следовательно, происходит декомпактизащщ, разрыхление хромзтина , а декомпакткзированный (менее уплотненный) хроматин становится более доступным для воздействия разных ферментов, участвующих в процессе метилирования ДНК.

Увеличение количесвта 5-МЦ з ДНК вероятно сачзано с ослаблением характера электростатического взтаюдейстзпя между ДНК и окружающими протеинами, чем можно объяснить изменение структуры хроматина, уменьшение площади плотного ПмХ.

При изучении активности ДНК-метилаз 1а тал та было установлено существование ДНК-метллазной активности з:. суммарном

препарате из ядерных экстрактов печени крысы при использовании в качестве доноров метальных групп меченые [%]£ам и [Зн] КеСКи-".

Таблица 2

Сравнение. включения метальных групп от [3 н]иесъ1

и^адм. в ДНК тимуса. ал --—-!----1-----

Источник ДНК- ' } Доноры метальных групп

метилаз | [%] КеСЫ | t р н] sm

Суммарный препарат •

из дцер печени крысы 29821 I232I

Фермент после ИЭФ

с ИЭТ 5,2 56250 25938

Примечание : за единицу активности ДНК-метилаз принимала радио-• активность ДНК в емц/шн в расчете на I иг белка.

ИЭТ — изоэлектрическая точка.

\ ' ■ ■

Из данных {табл.2 ) видно, что ДНК-метилазы суылзрной белковой фракции способны метилировать in vitro тимусцув ДНК в присутствии как аденозилметионина, так и ыетилкобадамипа. Были идентифицированы ДНК-метилазкые фракции, различающиеся по способности использовать в качестве донора метильных групп s - . аденозилметионин и ыетидкобаламив. 1

Профиль активности ДШ-метилаз при использовании в качестве донора метильных групп j^r]j54H приведен на рис. 2.

я- 17 г-

Ряс,2. Изоэлен-трофо^дарраще препарата ДЕК-мейшаз'" из печеш крысд, Донор. метальной группы-Примечание? по оси ординат: I ¡г ра^до.актнвность субстрата,--?мцДяш хЮ3 ; 2 к- значение рН; от оси абсшсс .- номера фрдквдй. Сплошная линия- активность метилаз, птрпхпунктпр-ная - градиент рН. Нами обнаружено 6 пиков активности, различапются по значениям ИЭТ - 3,7; 4,8; 5,2; 7,6; 8,3; 8,8. Максимальная активность обнаружена в щелочной зоне.

1В -

Феномен множественности эукарио.тических ДНК-ыетилаз был описан ранее при ИЭФ суммарных препаратов ДНК-метилаз из ядер щитовидной железы в норме и при нарушении её функции (И.И.Никольская, Е.В.Шаркова, Н.Г.Допатина и др., 1989); из ядер био-птатов щитовидно! железы человека при диффузном и узловом зобе (И.И.Никольская, Е.В.Шаркова, Е.Н.Зенина, и др., 1993; И.И.Никольская, Е.В.Шаркова, Н.Г.Лопатина и др., 1989). Наш результаты согласуются с приведенными литературными данными.

Профиль ыатЕлазной активности в присутствии донора метальных группой] Месъ1 характеризуется меньшим числом метилазных пиков и более низкой активностью (рис.3).

• - I, ' ' 2 " 3

10 , ч > \ .... ю 1Л

& V ^ & (Ш

6 6 06

<1 1' М ХА / Ч 04

2- А-' кНУ\ 2 0.2

5 10 15 20 • •

Рис.3. Изоэлектрофокусйрование препарата ДНК-метилаз из печени крысы. Донор метальной группы -[^н]цб<5Ы Примечание : по оси ординат:I -радиоактивность субстрата, емц/мин х-10 ; 2 - значение рН; 3 -концентрация белка, ыг/мл» Сплошная линия - актганость метклаз, пунктирная -.концентрация белка, штрихпунктирная - храдаент рН.

Как суммарный препарат ДНК-метилаз, так и индивидуальный фермент могут использовать в качестве доноров метальных групп . Б+— аденозилметиоцин и метилкобаламин, однако в случае -аденозйлметионина активность более выражена.

Известно, что ДДЕб-метилаза может использовать в реакции метилирования ДНК доноры метальных групп, отличавдиеся по химической структуре. В стандартных условиях указанный фермент проявляет разную активность с ддд • и несЪ1 и можно предположить, что доноры' взаимодействуют с разными участками фермента и обладают неодинаковом сродством к негду.

Для подтверждения этого предположения метилирование ДНК 1п viiго • проводин с [%]§ал и ИеСЫ в присутствии второго донора метилышх групп - немеченых ' КеСЫ или ЕАН , соответственно.

Исходя из факта существования в эукариотической клетке 2-х типов. ДНК-метилаз, мы идентифицировали ДНК»-метилазы - да аэто используя в качестве субстрата неметилировавдую ДНК Ш-стоссосва З-пгеиа и ДНК-метилазы поддерздзапцегр типа, используя в качестве акцептора ДНК ткцуса. " '

Из данных (табл.З) следует, что немеченый ггесы в кон» дентрадаи 0,05 мкМ не препятствует реакции метилирования ДНК и даже активирует ее на 38 % с тимуено* ДНК и на 29 % с ДНК Шсюсоссш а^еиа при использовании в качестве донора метальной группы [3 . Ыетионш! в концентрации 0,02 мкМ полностью тормозит реакцию иетилироваитя как метилированной, так и неметиотрованной ДНК.

" V, Таблйца 3 Влияние второго донора метальных групп на ферментативное. метилирование ДНК ■rtti» . .

Компоненты, добавленные в реакцию

1

Уровень метилирования ДНК в % по отношению к исходному

N

Доноры метильных групп

SAU.

!

N

MeCHI

.....'.■ .■ ....г;..—•— { . ——1---

ДНК тимуса !ДНК M.Iuteua i ДНК тшуса ¡ДНК K.Xutaua

1 _i_;__L_

MeCbl

(0,005 мкМ) 1X6

(0,05 мкМ) ' . 138

131. 129

SAH • .(1,0 шм)

104"

218

DL -метионин35.

О

■95"

141

Примечание: в вь.-метионин в реакции с Р н]SAK - 0,02 ыкМ.

Немеченый SAii на препятствует реакции метилиройания тпмус-ной ДНК и активирует метилирование ДНК l^Iuteuo цри ибпользо-вании в качестве донора метальной группы н]сгсЪ1«

Метионин уменьшает метилирование ДНК тимуса на 5,0 % и увеличивает в ДНК K.tuteus . на 41,0 %.

Эти результаты указывают на то, чтоiiscbl наш взаимодействуют с разными участками фермента. Кроме того, цаоы. п sau могут выступать в роли агентов, стимулирующих участие другого донора метильных групп в реакции метилирования ДНК.

Результаты наших опытов согласуются с данными, представ» ленными в работе А.глИ1-1в02ко*1с2. G.Eoith, o.Dirioi^r

(1Э31). Авторы показали, что . '[14с] хгесы моает быть донором метальных- групп in vitro в реакции метилирования ДНК de -ото и поддерЕивавдзго'типа при использовании в качестве фермента частично очищенную ДНК-метилазу на селезёнки крысы. Немеченый Кесм . в концентрации 1,0 мкМ в присутствии [з н] Б1Л стимулирует метилирование ДНКае sovo и не влияет на метилирование поддергивающего типа. s аденозилметионин не иагибгрует включение метальных групп в.ЩК от [14с] ^гоъ! з присутствии ДЖ-метилазы. . • "

В наших опытах 1!сС"Ы в меньших концентрациях (0,005 -0,05 мкМ) активирует оба тида метилирования ДНК. Немеченый зли ке прицятствует реакции метилирования ДНК в присутствия nji'ecU. На основании результатов наших опытов а данных литературы мозга утверждать, что существуют даэ независимых пути метилирования ДНК in vitro : в одном случае метилирование ДНК происходит при участки зденознлмгтионзща, а в другом - цри участии метилкоба- : яагдана. _ - 4

Существует ли дуть прямого ьжтялиррвания ДНК кетялкобала-.®ном in ?iro ? -Предпосылкой для такого предположения послу-шда наши данные о повышении оодарсакия 5г£!Ц в ДНК ядер печени i почек рмвотнкх при введении пм больших доз ¡витамина Bjg. Зн-Е?ко, нельзя объяснить однозначно, что пто обусловлено только кетилироващ!ем ДЩС мет?шсобалшя!ном. Образующийся рз .ватемира Bj2 метцякобрлвмЕН ( 2.1^Ряу1ог, 382) служит источником метального остатка для з +~адепозпл~ геттснлпа, основного донора кетальи^х групп при «атжгаросзтш ЩК (£,3or?k at al 1966). Опыты с метиопптсм показали воз-'■ ■отесать непрямого участия . г.г;одЪ1 . в .менгаиррвашн ДНК. По данным литературы (Д.Мецлер, IS80) и наши данным

(табл. 3), метионин тормозит реакции, связанные с переносом метальных груш на пути образования здн и последующего мети—

о "

лкрования ДНК. '.

.Известно, что в печени крыс суммарная концентрация кобала-минов на три порядка яхт^а концентрации аденозилметионина ( A.Pfohl-beaekowicz, G.Keith, G-.DiÄeiner, 1991).

В опытах in vivo мы наблвдали достоверное повышение содержания 5-Щ в ДНК ядер печени и почек животных при введении больших доз витамина В-^ * при которых- его концентрация в тканях становилась соизмеримой-с концентрацией зле .. Это увеличивало вероятность прямого участия Меси, • в качестве донора метшшных групп для ДНК ■ in vivo. Кроме того, в наших опытах и в работе JUÍfohl-leasücowics, fl.Keith, G.DiAeimer (1991) показано, что существует прямое метилирование ДНК метилкобала-мином íq vitro . Реакция не зависит от присутствия второго донора метальных групп - немеченого аденозилметионина.

Следует отметить, что длительное введение высоких концентраций витамина В^ мышам привело к изменению количества нуклеиновых кислот в активно пролиферкрутадих и нормальных тканях (А.А.По-знанская, 1989).

При выполнении экспериментов, связанных с изучением влияния высоких доз витаминаВ^ нами <5ыла предложена схема, в которой обобщены собственные и литературпыа данные (A.A.Познанская,

Т.Л.Корсова, .1984; O.Berteur, R.V*lemia, 1978; b.za«alak , W. Filed rich, 1979).

Схема I

Биохимические пути процессов при введении высокой дозы витамина Вв регенерярувщую печень морской свинки

Витамин В«- отанокобалатн (5,6*диметилбензимидазолил -| кобиаидаанид) .

Превращение в датсщлазме в коферментну» форму

Метилкобаламин- СЙд*. -■

| + АК ' ' . • Источник СН^-грутш Иетдаяив -;->

по" цитозш^у в ДНК при участии в и

в присутствии фер :еята ДНК.-цитозип»-5-чгетилтрансферазы . . .

I нетиошн^аденозжнтрансферазн

^ + I '

Метилирование ДНК ПО'"рторриу" 8. аденозилметаонин ( г+лк ) . пути

| + ДНК

Увеличение содержания-ЫЩ В-ДНК

1 ■

Уменьшение площади ПмХ Метилирование ДШ по "лервомувпути

11 '

Реорганизавдя структуру зсроиатина ■

Влияние адреналина на содержание 5-Щ в ДНК и ультраструктуру хроматина .

Известно, что стрессовые ситуации связаны с большим выбросом адреналина, который приводит к сдвигам биохимический процессов в организме. .

Механизмы воздействия гормонов и фитогормонов на генетический аппарат клеток к настоящему времени остаются недостаточно изученнши (Т.И.Власова, М.Д.Клрнос, З.Н.Дешденко, Б.Ф.Ванюыин, 1994; Г.И.Кирьянов, Д.Н.Кинцураивили, Т.А.Манамшьян и др. ,1996).

В серии наших .опытов был исследован нуклеотидный состав и содержание 5-МЦ в ДНК кардиошоцитов собаки под влиянием разных доз адреналина.

Содергание 5-МЦ ( мол.50

2,0 1.5 1.0

50

Ш'

130

Дозы адреналина ( мкг/КГ )

Рис.4. Содержание 5-МЦ в ДНК из сердечной мышцы собаки при введении разных доз адреналина ( ь = 10). Примечание: по оси ординат ~ содержание 5-МЦ .абсцисс - дозы ад-

■реналина, О-подопытшй, К - контрольные животные. Подопытным животным вводили внутривенно ежедневно в течение 5 дней адреналина гидрохлорид в дозах 50, 100, 150 мкг/кг массы

слученные результаты показали, что у интактных животных содет— апие 5—!£Ц в Д5К из сердечной мышцы равнялось - 1,50*0,03 кол.£; ри введении адреналина в дозе 50 мкг/кг - 1,45 +0,01 мол./=; г юзе 103 мкг/кг - 1,30 +0,03 мол.£, Р < 0,002; в дозе 150 мкг/кг-,21+ 0,01 иол.%, ? < 0,002 (рис.4).

Таким образом, разнила в количестве 5—ГЛД з ДНК сказалаci-;остозер;юЁ (Р<" 0,002) только в случаях с введением адреналина высоких дозах. Наин обнаружена отрицательная корреляция (r=-0,9S) ;ежду дозат адреналина и количеством 5-Щ в ДНК из сердечноЕ ггжы ссбекк.

ЛзвестЕО, что ГЕпоксическое состояние связано с большим абросрк адреналина. Уменьшение 5-ЭД в ДНК на 15,ваш обш-•ужено при пеоксхгз (острая ташовада) в сердечной мышпе в огште-:,23+0,03 мол.55; в контроле - 1,50*0,03 яэл.£, (Р< 0,001). / При исследовании слизистой желудка собаки нами обнаружено кезьзеяие содержания o—IZi в ДНК на II % при введении адреналн- ■ в з дозе 100 мкг/кг. Так содержание 5—в ДНК у контрольных гвоткых равнялось 1,3% 0,03 мол.%\ у подопытных -1,25+0,03 :зл.£, (? <" 0,05).

¿¿охаппзгс» выявленного уменьшения метялпровакия ДЕК по да? 'сзпну под влхяшге.4 здреналпкз,вероятно, связаны с запуском дгпг ■игхямшческхх реаз;де:с, веду^лх к сбрзгозалпз да!й пли дш? к ; протеипкпкэз, каталиэрругп^х йосфорплгрозаппе хрсмо-

юкальпых белков-ферментов которые могут пзкенсть свою активность, : ток «теле z кегглазцузэ (Б,Длбертр, Д,Ьрей, и др.,1594).

. В серил опытов ке^о^дм электронной гягкросиоппп

ггучалд влият-те адреналина пз длру^^ь плотного ПкХ в ядрах kej-хсхюшптоб и гепнтецгтов собаки. По.лучедные результаты зырзжэлп : условна едхзппаг (Б.Ф.йаятейфезь, Б,Б,Ро!-инеысо, Д.П.Бзб=д-вкяк е'дз., 19Э0).

При введении адреналина в высокой дозе в ядрах кардаомио-ндтов плотеый Ш2 прилегает е кариолемме тонким равномерным слоем и занимает аенкцув площадь относительно площади ядра.

• Илстадь плотного ЕмХ от площади ядра у контрольных животных составляет 10,7 %, а у подопытных - 5,1 %, уыеньзенае в 2 уаза, (?с 0,001).

Аналогичные результаты были получены под влиянием высоких дез адреналина в ядрах гепатоцитов. Площадь плотного ПиХ составляет 21,3 % в контроле и 13,0 % в опыте, уыензление в 1,6 раза;_(? < 0,05).

Суммируя полученные результаты по уменьиению метилирования ДНК в клетках-маиенях под влиянием экзогенного и эндогенного адреналина в связи с изменением состояния хроматина, можно заключить следунцее.

Известно, что адреналин в клетки-шппенн .глохо проникает, а запускает каскадную цепь биохимических реакций, которые в конечном итоге изменяют структурную .организацию хроматина, а точнее плотного ПмХ. '

Согласно современный представлениям с регуляции экспрессии генов эукариот усиление транскр-лпццоннсй активности того иди .иного гена сопровождается дакалпактигацле! или разрыхлением структуры хроматина, в результате чего лзякерная £НК становится солее доступной для воздействия разных, з тем числе метилнруп^пх или деметилиругщнх сер;ентсЕ ( D.r.Ccaper , I9E3, Б.Ф.Вангпин, 1963; Г.И.:\дрьянсз ,ГЗсЗ; Я.П.^урьлнев, Г.И.Кирьянов ,1987).

¿.»¿'.^лйсдьская, .¿«.¿.¿lapsGBa, л. *. —сгснтина и др. укззьзлгт на то, что етепзкъ ¡¿етилйсьания аа: ведсматилдро-ванзд J2K wCshg сзссгатрд-згь как срйеЕ^ньсвечпьЗ тест гевноИ

Возможен к другой механизм уменьшения метилирования ДНК :о пптозкну год влиянием адреналина.

Известно, что инъекции высоких доз адреналина или стрес-;оаые ситузхет гедут к подавлении митозов (Р.5эсе, 1377). Подавление митотических яиклоэ может привести к уменьшению реп-1икативного синтеза ДНК. Если Ее количество вновь синтезиро-анной ДНК не увеличивается, то уровень 5«МЦ в ДНК должен ггеньпвться, что могло быть в наших опытах при действии адре-1алина. Собственные и литературные данные' (Б.Албертс, Л,Брей, Зд.Льшс и др., 1394) обобщены в виде схемы 2.

Биохимическая схема процессов в кардиомиоцитах

собаки при введении высокой дозы адреналина

АДРЕНАЛИН (катехоловнй емгн)

действие .на тлЬ -рецепторы, сопряжение с . адентштллклазной системой и образование ; Ц-ГМ5

I

|— Фосфсрплпровэвие белков, в том числе z хрсмосомальнкх (Н--) '! при учас пи' активных шзотеинкиназ

; I

Изменение взаимодействия Бт с ДЕК

' Уменьшение 5-ЗД в ДНК

! I

■ 7мегйшенг.е плсгадк плотного Им!

; и

-^Реоргапкза^я структуры зфомзакна

Зримечание: п обозначены собственные данные

г,- г- „ ) -оджзрсмешёк вероятность другого ^похпмгческого сути.

- 23 - ' ВЫВ 0""Д Ы

1. Определение уровня метилирования ДНК по пдтозину в органах и тканях, можно рассматривать как тест, позволяющий судить о функционировании геном клеток при различных состояниях .организма.

2. Впервые ¿a vivo установлено увеличение содержания 5-Щ з ДНК из печени и почек у*морских сванок под влиянием высоких д;з витамина Вт«.

3. ^атионин и ДТЗ уменьпают содержание 5-Щ з ДЕК из пенсии и почек при нагрузке животных'витамином Bjo-

4. Высокие дозы витамина 3T-j приводят к увеличению содер-.■капля 5-МЦ в ДНК и уменьшению площади плотного ПмХ в регенери-руюсей печени морской свинки.

5.' В опытах . i» Titro изучена интенсивность включения меченых метальных групп от Лесы и • Рн] sah в стандартные препараты ДНК при использовании эукариотических ДЕч-метнлаз.

В случае I? HjHectt их активность была менее выражена. .

6. При зведепии животным адреналина в высоких дозах наб-лгдэлось уменьшение содержания 5-МЦ в ДНК кардиокиоцитов собаки. Снижение содержания 5-Щ в ДЕК выявлено также пои острой гипоксии. 'сердца.

7. Найдена положительная взаимосвязь меяду содержанием -5—MIX з ДНК кардисмпопитсз собаки и плсщагью плотного ДмХ под ле;:отзиом адреиалин^. Открытая нами модуляция мотллпрозагсш ДНК г.о пдтозкн/ под злллнда! високос дез адреналина мохет быть зозимаом мгхаядсмом молекулярного зездайадйпл ¿та функцзокаро-

ronera клетки.

3. Дгедлсжснк депелкзкпл 'Л ^ас^'резке Ййс'хьглчсс:-:^: про-д-cccn ргзкцпД мйталироЕапхх J2S при участи;: витамина Вт*> г. адреналина.

- 29 -

СПИСОК ' РАБОТ- ГО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Антитела к ДНК у больных и здоровых людей. /Д.Я.Клейменов,

М.Т.Туликова, Р.И.Кляшева, В.И.Самаркиц// Артериальная гипертония, атеросклероз л уремическая болезнь сердца : Сб.с?"зтей.-Чебоксары, 1975.^.104-1X2.

2. Клейменов Д.Я;, Клязева Р.И., Изменения ДНК при озвучивании // 71 Поволжская конференция физиологов с участием биохимиков, фармакологов и морфологоз : Материалы конференции.-Чебоксары, 1973. г-Т. 2. »-C. 100-10 J.

3. Клейтонов Д.Д., Кляпера Р.И. К вопросу'об антигенных свойствах ДНК //УХ Поволжская конференция физиологов с участием биохимиков, фармакологов и морфологов : Материалы конференции.- Че-

. боксары, 1973.-Т.2.ИЗ.99-100.

4. Клейменов Д.Я., Кляшева Р.И. К вопросу о воздействии ультразвука на ДНК // Морфо-физиологвя нервной и сердечно-сосудистой системы в норме и патологии: "Сб. статей.-Чебоксары, 1974., С.2X5-221. ' .

5. Клейменов Д.Я., Клдаёра'Р.И. Об анитгешюста ДЕК /Д!орфо-фазио-логпя нервной и сердечно-сосудистой системы в норме и патологии:

' Сб,статей.-Чебоксары, 1974.-С.213-2X7.

6. Кляаева Р.И. Влияние адреналина на нуклеотидщй состав и уровень метилирования остатков цитозина -в ДНК слизистой' желудка собак.«41. ,1985.«-- 7 с.-Деп в БИВШИ 27.05.85, й 63BI.

7. Кляшева Р.И. Влияние вптадаа В12 на метилирование ДВК пз разных органов морских свинок.в присутствии АТФ и метиопина //

У Всесошный биотический 'съезд: Тез.до::л.-£!. ,IS66.- Т.2.-С.358-359. ' '

8."Князева Р.И. Влияние внтгмява В^, яэ метилирование ДЕК печени и почек морских свинок в -присутствии метдощша и АТФ // Биол. -науки.- 1983.-й I0.-C. 17-19.

• 9. Кляшева Р.И. Влияние витамина Bjg на содержание.метилированного цитозина в ДНК регенерирующей печени морской свинки.-С М., 1987.-7 е.- Дел.в ВИНИТИ 20.01.87, Л Ш6.

10. Кляшева Р.И. Изменение метилирования ДНК печени и почек мор- ' ских свинок при введении витамина В^ //Биол.науки.—1981.-

Л 7.— С.24-26.

11. 'Кляшева Р.И. Качественный состав цуриновых оснований ДНК из различных органов животных //Экспериментальная и клиническая аллергология: Сб. статей.-Чебоксары.-1977.-С.29-31.

32. Кляшева Р.И. Метилирование ДНК в опухолях легкого человека // Вопр. онкологии.-1990.-Т.36.-té I0.-C.II86-II89.

13. Кляшева.Р.И. Модуляция'метилирования ДНК и реорганизация хроматина в ядрах животных клеток год влиянием высоких доз вита. мина Вд2 и: адреналина // Влияние' антропогенных факторов на

отруктурные преобразования органов, тканей, клеток человека и животных: Д Всерос.ков£. Тез. докл.- Саратов,1993.-й 3.-С.97.

14. Кляшева Р.И. Нуклеотидный состав ДЩ и'з разных органов кролика//Еиол.вау1Щ.-1978.-й 8.-C.3I-33.

15. Кляшева Р.И. Нуклеотидный состав и уровень метилирования цитозина в ДНК из раковой опухоли желудка // Труды 14 конференции "ФЭБО.- Эдинбург (Англия), I98L.-C.2.

16. Кляшева Р.И, Нуклеотидный состав и уровень метилирования цитозина в ДНК из раковой опухоли желудка //17 Ёсесоюзный биохимический съезд: Тез.науч.сообщений.-М., 1979.-Т.2.- С.286--287.

17. Кляшева Р.И. Электрошо-шкроскопнческое исследование хроматина в ядрах кардаомиоцитов собаки под влиянием адреналина// Балл.эксдерим. биологии и медицины.-I993.-T. 115, а 3.- С.305-307,

18» Кляшева Р.И. Ультраструктура хроматина в ядрах гепатоцнтов регенерирующей печени морской свинки при введении вита: "яна

//Бэл.эксперт,биологии и медицины.- I993.-T.II5 , Л 5,-С.544-545.

19. Кляшева Р.И. Ультрасзруктура хроматина в яярах гепатоцитов собаки под влиянием адреналина //Вт. экслерим.биологии и медицины.- 1993.- Т.Л5, & 5.- 0.538*539. '

20. Кляшева Р.И, , Андреев Г.Ф., Бодрова В.В. Воздействие некоторых фосфорорганических соединений на цуриновые основания • ДНК из различных органов кролика //Артериальная гипертония, атеросклероз и ишемическая болезнь сердца: Сб. статей.- Чебоксары, 1Э75.— С.Н5-117.

21. Кляшева Р.И., Бодрова &В* Влияние ультразвука на А1Ф, А№ и их компоненты // Вопросы теоретической медицины : Сб.ста-тей.-Чебоксары, 1976.~Вш.2.- С. 124-127.

22. Кляшева. Р.И., Бочкарев В.А. Влияние витамина В^ аа связывание ДНК-с акридиновым оранжевым л ва активность некоторых

• ферментов лрови при регенерации язчейхг у морских свивок, «й.-, . 1988.- 9 е.- Дел. в ШИШ J2.X0.88, & 8387.

23. Кляшева Р.И., Васильев 2.Х.. Вшвде адреналина ва нунлеотид-ный состав и степень метщщ>ова?шя ЛШ в сердечной мшще. собаки// Биол.науки.- 1964.-,» 10.- 0.31-33."

24. Кляшева Р.И., Васильев-&Х»-* Иванова З.И. Влияние.тампонады • на нуклеотидный состав в уровень метилироващтя цитозина ДНК В мышце сердцз собака //Биол.науки.- 1987.- & 32,- С.32-34.

>5." Кляшева Р.И., Васильев 2.Х,, Иванова З.И..Изменение азтиЕноо-та некоторых фермедтов а связи с метилированием ДНК шокарда ■ при острой тамподаде серяда в эксперименте.-^!., 1990.-10 с,-Деп. в ВИНИШ J5.QJ.90, Я 1427.

26. Чляшева Р.И., Волков A.B. Цуклеотидный состав и уровень метилирования цитозина в ДНК из слизистой ткани желудка при

'■ язвенной болезни двенадцатиперстной кшки в связи с изучением гистоновой фракции// Актуальные проблемы современной клинической хирургии.- Чебоксары, 1981.- С.73-76.

27. Кдяшева Р.И., Волков В.Е., Панфилова Г.А. Цуклеотидный состав и уровень, метилирования цитозина в ДНК из раковой опухоли желудка// Вопр.онкологии.- 1980.- Т.26, & 9.-С.45-48.

28. Кляшева Р.И., Иванов Ю.В., Краскльников А.М. Определение показателя' специфичности ДНК из различных органов животных// Экспериментальная и клиническая аллергология : Сб.статей.-Чебоксары, 1977.- С.63-67.

29. Кляпева Р.И., Клейменов Д.Я. Качественный состав пуриновых оснований.ДНК органов животных // Шкро-макроструктура тканей в норме , патологии и эксперименте: Cd.статея.-Чебоксары, 1975.- Вып.2,- 0.3-6.

30. КлявщваР.И., Цыльков В. Е. Цуклеотидный состав и уровень метилирования цитозина в ДНК из слизистой ткани желудка цри

■ язвенной болезни двенадцатиперстной кишки //Вопр.мед.химии.-1981.-Т.27, Вып.5.-С.719-720.

31. Участиё.'метилкобаламина в метилировании ДНК in vitro / Р.И.Кляшева, Е.В.Шаркова, й.И.Никольская, Е.В.Белозерова, А.М.Юркевич// Вюл.эксперим.биологии и медицины.- 1995.-Т.119, й 6 .- С.616-618.

Формат 60x84/16. Объем 2,0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ №356. Тип. ЧГУ