Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и характеристика цитозиновой ДНК-метилтрансферазы пшеницы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и характеристика цитозиновой ДНК-метилтрансферазы пшеницы"

и ь "од .

московский государственный университет имени м.в.ломоносова

_______I-------—

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 577.112.083:577.218

ДЕЩДЕНКО Зоя Николаевна

выделение и характеристика щг03ин0в0и днк-мет илтрансфер азы пшеницы.

03.00.03 - молекулярная биология

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995 г.

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ онтогенеза Научзо-дсследовательского института физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Московского государственного университета им. М.Б.Ломоносова.

Наг-шый руководитель: доктор биологических наук,

профессор Б.Ф.Ванюшин

асоциальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Я.И.Бурьянов доктор биологических наук А.А.Колесников

Ведущая организация: Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН

Загзгга состоится " 1995 г. в часов на

заседании Специализированного Совета Д.053.05.70. при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, ГСП-3. Москва, Воробьевы горы, Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ, аудитория 536. -

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан: "/У" ¿^¿¿^ 1995 г.

¥

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

В.Н.Каграманов

оншл характеристика. работы Актуальность проб лет. Энзиматическоз метилирование шгтозиновых остатков ДНК у эукариот рассматривается как один из способоз модуляции активности ГвНОЫа- клетки (Ваншин 5.С., 1933; Adams, 1985; Razm,cedar, 1984). Анализу уровня к специфического характера распределения метилированных оснований в ДНК в связи с транскрипцией, репликацией и другими генетическими процессами посвящено немало работ. В то же время сами ферменты, осусест-влящие модификации генома, - цитозиновые ДЕК-метидтрансферазы (ДНК-мт Ее 2.í.i.37),стали пристально изучаться линь в последнее время. В отношении же ДНК-мт высших растений к зачал;.- нашей работы практически ничего не Сало известно. Оставались открытыми вопросы оО их размере, множественности и структурно-функциональной организации в клетке. Отчасти это определялось специфической протеолитической фрагментацией этих ферментов ir. vivo и их нестабильностью при попытках выделения m vitro. Интерес к этим ферментам вызывало и то обстоятельство, что ДНК растений на два порядка сильнее метилирована, чем ДКК прокариот г на порядок больше, чем ДНК животного происхождения (Ванн-ин,1Э72,- Элтонов и др. ,1972).

К началу настоящей рзботы в отделе молекулярных основ онтогенеза было установлено, что метилирование реплицирующегося генома растений осупествляется на двух этапах: репликативном и пострепликативном (Кирнос и др., 1938). Этапы различается как скоростью, так и специфичностью метилирования ДНК. Оставалось неясным, одинаковые или разные белки Функционирует на этих двух этапах метилирования ДНК. Всеми этими обстоятельствам; определились цель работы и постановка экспериментальных задач. Цель работы. Выделение и изучение свойств цитсзинсзой ДНК-мт из п^ениш, в том числе, возможной регуляции ее активности фито-гормонами.

Экспериментальные задачи. Выделение ядерной ДНК-мт из растений пшеницы и характеристика субстратной специЗгчности фермента,-разработка метода выделения репликативной ДНК-мт пзеницы и изучение ее спЙности метилировать ДНК вне репликативного комплекса,- сравнение выделенных ферментов по молекулярной массе и субстратной специфичности,- исследование влияния íetогормонов на ш vitro метилирование гомологичной ДНК очищенным препаратом ДНК-мт и ядерным экстрактом из пшеницы.

Научная новизна и практическая значимость. Зперзые выделена высокомолекулярная форма ДНК-мт из растений шгэницы. Предложен

оригинальный метод выделения репликативной формы ДНК-мт с помопью афишного связывания с формирующейся 5-агас-содержакей ДНК upa репликации генома. Впервые показано, что репликативная ДНК-мт способна метилировать ДНК вне реплккативного комплекса, при этом по молекулярной массе, активности и субстратной специфичности она практически не отличается от ДНК-мт, выделенной из ядерной фракции. В ядре растительной клетка впервые выявлена модулируемая фитогормонами система контроля за метилированием ДНК. Полученные результаты ва?лы для понимания структурно-функциональной организации процесса метилирования ДНК в растительной клетке. Работа имеет теоретический характер. Мояет быть использована в курсах лекций по молекулярной биологии, биохимии и физиологии растений на Биологических факультетах университетов. Разработанные подходы и результаты уже используются в НИР в Институте Физико-Химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на семинарах в лаборатории молекулярных основ онтогенеза НИИ Физико-Химической биологии им. Белозерского, на ш съезде Всероссийского общества физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993), на Third New England

Biclabs Workshop on Biological DNA Modification (Vilnius, 1994).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Работа проиллюстрирована 8 рисунками и 7 таблицами. Список цитируемой литературы содержит í Y-á наименования.

содержание работы i. выделение и свойства ЦИТОЗИКОВОИ днк-метилтрднссеразы из

зародышей и проростков пшеницы.

Наибольшая активность ДНК-мт растений выявлена в ядре в s-фазе клеточного цикла (Кудряшова и др., 1984; 1991; Власова и др., I9B9; Theiss et al., 1980; Yesufu et al., 1991). Поэтому для выделения ДНК-мт мы использовали 24-часовые проросое зародыш (первый ЦИКЛ синхронной репликации ДНК) (Theiss et al., 1987) И 72-ЧЭ-совые синхронизированные проростки гзенииы. в клетках первого листа которых проходит ранняя s-фаза третьего клеточного цикла (Кирнос и др., 1983).

ДНК-мт экстрагировали из ядерной фракции зародышей ж проростков пшеницы 0,35 М Nací. На первой стадии очистки использовали ионообменную хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе (рис. IA).Затем -

аффинную хроматографа) на гепарин-сефарозе (рисЛБ). Заключительную стадию очистки проводили с помощью ионообменной хроматографа на nono о-сорбенте в системе fplc (рис.IB). Активные фракции ДНК-мт как из проростков, так и зародышей элпгровались примерно в одном и том гг интервале концентраций Nací. Степени очистки Сежа приведены в та: л Л. Видно, что из ядерной фракции удается очистить фермент в 35 раз (зародыш ) и 18 раз (проростки).

Из результатов cs-Na-электрофореза в ПААГе следует, что по Сзлковсму спектру ядерЕые экстракты зародышей z проростков пшеницы заметно различаются (рис. 2).

Активная фракция из зародышей и проростков пшеницы цредстэвлена в DS-Na-ПААГ электрофорезе мажорными белками с мг б7ооо и во - 85000 соответственно (рис.За). По удельной активности ДНК-мт, выделенные из проростков и зародышей, заметно не различались (габлЛ).

Увеличение продолжительности выделения и очистки ДНК-мт (медленная элшия, продолжительный диализ и пр.) приводит к образованию нескольких низкомолекулярнкх полипептидов. Так, в препарате ЛНК-мт из зародышей выявляются 33-40 и 25 kDa белки (рис.36, дорожка I), а из проростков - 67, 40 и 25 мэа белки, (рис.36, дорожка 2). То se самое мы наблюдали и при хранении препаратов ДНК-мт (уже через 24 - 48 ч после их выделени^. При этом ДНК-метилтранс-фэразная активность ферментных препаратов существенно не изменяется. Например, препарат ДНК-мт с кг 67000 шел удельную активность 216, а фрагменгированный белок - IB2 ед. акт./мг белка. Наши результаты согласуются с данными Бзсторз (Bestor et ai.,1992), показавшего, что протеолитическое расцепление связи мевду к- и с-домена-га ЛНК-мт мыши не сказывается на скорости (степени) метилкрозания полуметилированвой ДНК.

Выделенные нами белки относятся к штозиновым ДНК-метилтрансфе-разам, поскольку при инкубации в присутствии (метил-3н) sam метка в основном включается в остатки 5-метилцитозина ДНК. В mÉA метки не выявлено. Около io-is% метки вклшалось в остатки тимина. Это совпадает с данными Фоллмана и flp.(Theiss et ai.,i9B7), полученными для ЛНК-мт из зародышей пшеницы. Не исключено, что эукариоти-ческие ДНК-мт обладают и дезаминирупцей тьс активностью.

Мы установили, что выделенные ДНК-мт проявляют максимальную активность при 25°с, рн = 7.5 и низкой ионной силе (не вше ол и NaCl).

Мы сравнили выделенные ферменты и по субстратной специфичности. Это одна из ванных характеристик эукариотических цитозиновых

Таблица I. Очистка ядерной ДНК-иетилтрансферазы из зародышей и проростков пшеницы.

Стадии очистки Обиий белок (мг) Удельная активность (ед.акт./мг бежа) Обшая активность, 'о Степень очистки

из зародышей

Ядерный экстракт 9.00 б 100 i

ДЕАЕ-целлшоза 1.00 22 41 3.7

Гепарин-сефароза 0.10 157 29 26.1

Mono Q (FPLC) 0.02 216 8 36.0

из проростков

Ядерный экстракт 2.70 13 100 1

ДЕАЕ-целлюлсза 0.70 42 84 3.2

Гепарин-сефароза 0.10 145 41 11.1

Mono Q (FPLC) 0.01 236 7 18.1

а) ДНК-металтрансферазную активность определяли по ранее описанному методу (Власова и др., 1989). Пробы в 40 (ясл буфера ( 20 мм натрий-фосфат. рН 8.0/1Ш ЭДТА/ImM ДТТ ) содержали 2 мкг очищенной ядерной ДНК из проростков пшеницы, 2 мкКи (метил- н) s-адено-зил-метионина с удельной радиоактивностью 15.4 Ки/шоль, 20 мкл раствора фермента, содержащего до 10 мкг белка (в зависимости от от степени очистки соответствующих фракций). Образцы инкубировали-I час при 25°С. Отшвку меченой ДНК от не включенной в ДНК радиоактивности проводили восходящей хроматографией этих проб в 0.2 м Naneo . 1000 paсп/мин соответствовали образованию 0.03 пмоль5-ме-

тил-штозина. I ед.акт. бежа соответствует включению I рмоль

снз-групп/час или 33000 расп./мин.

ДНК-мт. Известно, что они обладают как поддерживающей, так и de novo активностями. Как правило, в норме преобладает поддерживающая активность. Для выявления поддерживающей активности выделенных нами ферментов использовали гомологичную ДНК из 72-часовых проростков пзеницы, большую часть которой составляет ДНК первого листа с высоким содержанием полуметшированЕых сайтов. Для выявления de novo активности ИСПОЛЬЗОВЭЛИ бактериальную ДНК (E.coli в 834) и ДНК тимуса теленка.

Видно (табл.2), что ДНК-мт как из зародышей, так и из проростков пиеницы обладают как поддерживающей, так и de novo активностями. При этом, в отличие от клеточных экстрактов (Кудряшова и др., 1984), в которых поддерживашая активность на порядок превышает активность de aovo, у очищенного фермента она оказывается

всего .тишь в 1.5 раза выше de novo активности (табл.2).Из данных

vo

a

л

H

I.O1

о ;

P t

Q г ^ :

CX

о

10 20 10 20 IO 20

номера фракций

Рис.1. Стадии хроматографическсй очистки ДНК-мегиггрансфэразы

из зародышей пшеницы. А - ЛЕАЕ-цеЛ-ШЛОЗа,- Б - геПЗрИЕ-сефароза ( Pharmacia ) ; В- Мопсе ( FPLC ) ( Pharmacia ).

А28о (-активность (<***); Градиент Nací *--

Ядерный экстракт из зародышей пшеницы, полученный по описанном: ранее методу ( Theist et ai., 1987 ) i диализовали 2.5 часа претив стандартного буфера А <50 мМ nici.50mM тп»-нс1, рН 7.5. 1мМ ЭДГА, 0.5 1Г-Ч ДТТ, 0.1 мМ pksf, 8.7* глицерин) и наносила на колонку с ДЭАЗ-целлглозой (A) (Whatman de 52;2.0х2.0 см) предварительно уравновешенную буфером А. Белки элюировали 60 мл линейного градиента nací (0.05-0.5 М) в том же буфере А со скоростью 20 ил/ч. Обладающие днк-метилтрансферазной активностью фракции элюировались 0.12-0.18 М Nací. Эти фракции оОьединяли. концентрировали ультрафильтрацией через фильтры Amicon с помощью центрифугирования, диализовали е течение 2.5 ч. против Оуфера А и наносили на КОЛОНКУ С гепарин-сефарозой (Б) (Pharmacia CL-6B; X . 5Х 6 . О СЫ ) , предварительно уравновешенную стандартным буфером А. Элюцис белков с колонки проводили линейным градиентом nací (0.05-1 К Kaci. 80 мл, скорость 10 мл/ч) в буфере А. Фракции с ДНК-ыетил-трансферазноП активностью элюировались 0.35-0.45 м н»С1. Эти фракции объединяли, концентрировали ультрафильграцией через фильтры Ami con с помощью центрифугирования и наносили на колонку Mono о (fplc) (В), предварительно уравновешенную буфером А. После нанесения препарата промывали колонку буфером А для удаления несвязавшихся белков. Элкцию белков с колонки проводили 30 мл линейного градиента Nací (0.05-0.3 М) в том же буфере А со скоростью I мл/мин. Фракции с ДНК—метилтрансферазной активностью элюировались 0.20-0.30 М NaCl .

Бее работы проводили строго на холоду (2-4*С).

Определение ДНК-метилтрансФеразной активности см. в подписи к

таОл.I.

Бис.2. о.it sds-124 ПМГ-электрофорез ядерных экстрактов зародышей и проростков пшеницы.

kDa

ДОРОЖИ: I- ядерный экстракт зародышей пшеницы; 2- ядерный экстракт проростков пшеницы; 3- белки-маркеры (фос-форилаза В, мг=94ооо,- овальбумин, мг—43000; карСоангидраза, мг=зоооо,-ингибитор трипсина, Мг=20100; а-лактальбумин, Mr=14 о о о). Окрашивание белков проводили 0.25%-НЫМ Кумасси R-250 (Serva, Германия).

Для получения ядерного экстракта прорастающие зародыши (6г) или проростки (ЗОг) осторожно гомогенизировали в растворе, содер-

розу; гомогенат фильтровали через два слоя марли и слой мираклоса И центрифугировали 20 МИН. при IOOO <3 (Tbei«« et «1..1987).

Для экстракции растворимой ядерной ДНК-метилтрансферазы содержащий ядра осадок суспензировали в 15 мл (для зародышей) пли 5 мл (для проростков) 0.3 М waci в стандартном буферном растворе А (си. подписи к рис.1) и перемешивали в течение I ч. при 2 С. Осадок удаляла центрифугированием 20 мин. при 26000 я. а надоса-дочную ЖИДКОСТЬ фильтровали через слой стекловаты.

Рис.з; sds-12% ПМГ-электрофорез очищенных препаратов ДНК-метилтрансферазы зародышей и проростков пшеницы.

i

3

Препараты ДНК-мт, полученные после трех хрома тографических стадий очистки ОАЭ-целлюлоза, гепарин-сефароза и Mono q (fplcj-cm. -пдтшггг к рис.!) ядерных экстрактов зародышей и проростков пшени-ды. (а) Препараты, полученные при "быстром" режиме выделения из зародышей пшеницы ( дорожка I ) и проростков шеницы (дорожка 2) (б) Препараты ДНК-мт, полученные при "медленном" режиме выделения 23 зародышей ( доронка Г ) и проростков пшеницы ( дорожка 2 ). в варианте а) бедки оквашены Кумасси r-250; в варианте б) белки окрашеш сереСоом (Bio-Rad,Австрия). Справа указаны молекулярные массы тэх не рёпершх белков, что и на рис.2.

таблицы 2 следует, что по субстратной специфичности фериенты из зародышей и проростков пшеницы практически не различаются.

В настоящей работе нам удалось наделить из растений пшеницы на двух стадиях ее развития ДКК-мт с молекулярными массами 67 kDa (зародыш пшеницы) и 80-85 kDa (проростки пшеницы). На сегодняшний день это самые высокомолекулярные белки с ДНК-ыетЕлируюсими активностями из растений пшеницы. Эти ферменты обладают практически одинаковыми как поддерживавшей, так к de novo активностями (табл. 2). Не исключено, что эти ферменты - продукты одеого гена по аналогии с 150, 175 и 190 kDa - ДНК-«т, выявленными на разных СТаДИЯХ РЗЗВИТИЯ КУЛЬТУРЫ MEL КЛеТСК (Bestor et al. , 1985, 19S3) . Можно предположить, что фрагментация IHK-мт in vivo служит природным механизмом регуляции ее активности в клетке на разных стадиях онтогенеза растения и при клеточной диффэренцирсзке.

Таблица 2.МЕТИЛИРОВАНИЕ in viteo РАЗНЫХ ДНК ЦИТ031Ш0В0И ДНК-мт ИЗ

зародышей и проросткоз пшеницы.

1 ! а ) 1

Источник выделения j Источник (Радиоактивность Относительнее

ДНК-метилтрансферазы j ДНК ) íb прсбе,имп./мин 1 i метилирование %

Зародыши пшеницы ¡Проростки : пшениш ! (72 часа) ¡ 1500 - 154 100

i Е.coli I ¡ 975 - 107 : 65

1 !Тимус теленка Í 795 - 138 53

Проростки пшеницы Проростки пшенипы (72 часа) ! ; 1 1100 1 131 : 100

Е,coli ' 800 — 95 72.7

а ) Определение ДКК-мзтилтрансферазной активности см. в подписи к табл.1. Даиные приведены для концентрации (3h-sam), равной IiIO"5 К, концентрации ДНК, равной 100 мкг/мл.

2. ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА РЕПЛИКАТИВНОЙ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ ИЗ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИШ.

3 реплицирующемся геноме меристематических клеток проростков пшеницы яДНК метилируется на двух этапах: репликативном и постреп-репликативном (Кирнос и др., 1988). Скорость метилирования одной и той же последовательности ДНК при репликации (секунды- минуты) заметно превосходит скорость ее последующего дометилирования (часы). Кроме того, эти этапы метилирования генома различаются и по специфичности (Кирнос и др., 1988). Поэтому встал вопрос о возможной множественности форм ферментов, осуществляющих метилирование ДНК в составе репликативного комплекса и в "свободном" виде. Целью этого этапа нашей работы явилось сравнение уже выделенных ДНК-мт с репликативной ДНК-мт из проростков пшеницы (по молекулярной массе, активности и субстратной специфичности).

Ранее уже было постулировано, что ДНК-мт входит в состав репликативного комплекса животных (Кирьянов и др., 1982). и, действительно, ДНК-метилазная активность была выявлена в Функциональном комплексе белков репликации из клеток тимуса теленка (Albert et al., 1982; Ottinger,Hubscher,1984) . В ОТНОЩеНИИ растений аналогичных данных к началу нашей работы получено не было.

Кы разработали метод выделения репликативной ДНК-мт из проростков пшеницы, учитывающий свойство S-azaC-содеряащей ДНК прочно связывать цитозиновую ДНК-мт (Jones, 1984; Веножинскис и др., 1985).

Наша идея состояла в том, чтобы in vivo "досрочно" освободить ДНК-мт из репликативного комплекса путем связывания с остатками 5-азацитозина, включенного в ДНК тем же репликативным комплексом. Репликативный комплекс продолжит репликацию ДНК, а репликатиЕяая ДНК-мт останется связанной с новообразованной ДНК (ноДНК). По данным Я.И. БурьяЕОва и др.(Веножинскис и др., 1985) связь цитози-новой ДНК-мт eco ни с 5-агас-ДНК нековалентна и.может быть разрушена повышением ионной силы раствора до I M Nací с частичным восстановлением активности фермента. Поскольку действие репликативной и пострешшкативной ДНК-мт в реплицирующих геном клетках первого листа проростков пшеницы практически разделено во времени (Кирнос и др., 1984, 1987, 1993), нам удалось избирательно связать с реплицирующейся в присутствии 5-азаци-тидина ядерной ДНК репликативную ДНК-мт.

В начале s-фазы клеточного цикла в клетках первого листа (72 ч)

проростки срезали и инкубировали в растворе 5-азаштидина (50 мкг/ мл) в течение 3-4 часов. По нашим данным цри этой концентрации 5-азацитидин практически полностью ингибирует метилирование ноДНК.

Хроматин ИЗ инкубированных в присутствии 5-azaC проростков выделяли и растворяли по методу Носкова с соавт. (Носков и др.,1985). Растворенный хроматин связывали с ДЭАЭ-целлшозой, промывали 0.5 M Nací в стандартном буфере с см. подпись к рис.4) и элюировали ДНК-мт линейным градиентом концентрации Nací (0.5-Г.5 М). ДНК-метилазная активность, соответствующая несвязавшейся с 5-агас-ДНК ДНК- метилазе выходит с ДЭАЭ-целлюлозной колонки во фракциях промывки 0.5 M Nací (данные не приведены). ДНК-метилазная активность фермента, связанного с 5-azac-JIHK, выходит в интервале между О.Э и 1.0 M Nací (рис.4). Любопытно, что комплекс репликативной ДНК-мт с s-azac- содержащей ДНК проростков пшеницы диссоциирует при тех не концентрациях Nací, что и комплекс бактериальной ДНК-мт Eco ri i с б-агас-содержааей ДНК е. coli (Веноживскис и др., 1935 ).

Выявление днк-метила зной активности во фракциях элзоата (0.9 -1.0 М) Nací означает, что репликативная днк-мт способна метилировать днк вне репликативного комплекса. Репликативная днк-мт in vitro метилирует как полуметилированную пшеничную днк, так и симметрично метилированную дек из эритроцитов цыпленка и немеблированную днк Е.coli (табл.3). Следовательно, фермент обладает как поддерживающей, так и de novo метилирующей активностями. Однако, использованные субстраты заметно различаются по способности акцептировать метальные группы из sam в присутствии выделенного фермента (табл.3). Лучшим субстратом для фермента является гомологичная днк из клеток первого листа проростков пшеницы. днк из е.coli и эритроцитов цыпленка на зо% и 5о% менее эффективны как субстраты метилирования in vitro репликативной днк-мт из хроматина проростков пшеницы. Синтетический поли ¡di-dc), который, как известно, является хорошим субстратом для днк-мт из клеток животных (Pedraii-Noy and Weissbach,1986), практически не метилируется репликативной пшеничной ДНК-мт. Из таблиц 2 и 3 видно, что по активности и субстратной специфичности репликативная днк-мт мало отличается от днк-мт из проростков и зародышей пшеницы.

Бри электрофорезе активной фракции в DS-Na-ПААГ выявляются две мажорные фракции, соответствующие 35 и 40- kDa белкам. Один из них идентичен (40 kDa), а второй- близок (35 kDa) по молекулярной массе протеолнтическш фрагментам ДНК-мт из ядерной фракции проростков пшеницы (40 s 25 kDa) (рис.3).

о

Табл.3. Метилирование m vitro вне репликативного комплекса разных ДНК репликативной днк-ыт из хроматина проростков пшеницы.

Источник ДНК

Р адио активность в пробе *, расп/мин

Относительное метилирование, %

Проростки пшеницы (72 ч) Первый лист проростков Е. coli

эритроциты цыпленка

П0ЛИ(с11-с1С)

1092 ± 191 1696 ± 245 787 ± 109 532 ± 136 96 ¿ 44

100,0 155,3 71,8 48,7 8,8

* В пробах содержалось по 10 мкг субстрата.

Следует отметать, что выделение активной фэрмы репликативной ДНК-мт - процесс достаточно продолжительный из-за медленного (12-14 ч) растворения хроматина. При выделении ДНК-мт из зародышей и проростков пшеницы (глава I) мы убедились, что препараты ДНК-мт довольно быстро фрагментируются. Причиной тому, по-видимому, являются следовые количества высокоактивных растительных протеаз (Storey,Wagner, 1986; Vierstra,1993). Чтобы Определить Молекулярную массу репликативной ДНК-мт, связывающейся с новообразованной 5-агас-содержащей ДНК, ш провели ее выделение в "жестких" условиях, хотя и инактивирувдих фермент, но препятствующих его деградации.

Для этого измельченные в жидком азоте проростки обрабатывали 0.5%-НЫМ ТрИТОЕОМ Х-100 В 0.05М Tris-HCl буфере, рН 7.5,- 0.1М NaCl (условия минимальной растворимости хроматина), промывали хроматин тем же буфером, растворяли его в o.oosm Tris-HCl, рн 7.5, - 0.01м ЭДТА - 0.1% DS-Na и связывали с ДЭАЭ-целлвлозой в свободном объеме (batcb-процедура). Элюцшо белков осуществляли ступенчатым градиентом концентрации Kaci (0.5-1-1.5-2-2,5 И), Процедура тритоно-вой обработки и растворения хроматина занимала около двух часов. Белки из каждой фракции ступенчатого градиента концентрировали депротеинизацией элюата хлороформом и фракционировали с помощью электрофореза в DS-ка-ПААГ.

На рис.5 приведена электрофоре грамма белков из элюата с ионной силой, соответствующей IM Nací. Рис.5 показывает, что в опыте с ДНК связываются один мажорный и два минорных компонента (дорожка 2). Сканирование геля и подсчет площадей пиков (рис.6) показали, что наблюдаемый мажорный компонент сответствует белку

:о

с молекулярной массой 67 ма, а два минорных - 64 и 57 коа (табл. 4). В контроле (проростки, инкубированные в воде ) связанных с ДНК белков не выявлено (рис.5 (дорожка 3) и рис.6 (3)).

Таблица 4. ВЫХОД БЕЛКОВ, СВЯЗАННЫХ С 5-АгА-с-С0ДЕРЖДЩЕИ ДНК.

молекулярная масса ПОЛИПеПТИДа,kDa количество белка.мкг

67 2

64 I

57 0.5

Затем мы несколько модифицировали способ получения комплекса 5- azac-ДНК-ДНК-мт. После гритоЕовой обработки ядерную фракцию ли-зировэли 0.5%-НЫИ DS-Na В 0.05 .4 Tris-HCl буфере, рН 7,5-0.01 М ЭДТА в течение 3-5 минут. По окончании лизиса к смеси добавляли 1/9 объема 5 М Nací и осаждали ДНК 2.5 объема этанола на холоду. Образовавшуюся "медузу" промывали 80%-ным спиртом, перерастворяли в 0.001 М ЭДТА и ДНК связывали с ДЭАЭ-целлюлозой. После ступенчатой элюции белки злюата (I М Nací) концентрировали, как описано выше, и разделяли электрофорезе;.! в DS-Na- ПААГе. Видно (рис.7, дорожка 3), что и в этом варианте выделения мы также выявляем три белковые фракции - две мажорных (78 и 67 kDa) и одну минорную (69 kDa). В контроле (проростки, инкубированные в воде) связанных с ДНК белков ие обнаружено (рис.7, дорожка 2).

Выделенные в эгом варианте белки оказались более высокомолекулярными, чем в первом варианте. Зто достигается сокращением времени выделения комплекса ( 5-агас-ДНК-ДНК-мт ). Один из выделенных белков (78 kDa) очень близок по молекулярной массе ДНК-мт (80-65 kDa) из ядерной фракции 72-часовых проростков пшеницы. Другой 67 kDa-Селок щенгичен по молекулярной массе ДНК-мт из зародышей пшеницы и одному из протеолитических фрагментов 80-85 kDa ДНК-мт из проростков пшеницы. Таким образом, в присутствии s-azac с реплицирушейся ДНК связываются всего два мажорных белка, близких или идентичных по молекулярным массам выделенным нами ДНК-мт из зародышей и проростков пшеницы.

рис.4. Профиль элюции ДНК-ыетилтрансферазной активности из б-агас-ДНК-содеркащего хроматина.

Растворенный в стандартном буфере (0.005 М тп.-HCi. pH 7.2. 0.002 и ЭДТА. 0.001 И p«sf) гроиатин связывали с ДЭАЭ-целлюлозой и злюировали градиентом «aci <0.5-1.5 М). фракции диализовали против стандартного буфера и определяли в них ДНК-метилазную активность (см. подпись к табл.1).

Рис.5. Е5-на-электрофэреграмма белков, связанных с 5-агас-содержз-щей ДНК (дорожка 2) и ДНК контрольных проростков (дорожка 3); дорожка 1-белки-ыаркеры (фосфорилазз В, мг 94000, альбумин, мг 67000; овальбумин, мг 43000; карбоангидраза, Мг 30000).

Электрофоретическое разделение белков проводили по методу Лэмли (ЬаеттИ, 1970) . После электрофореза гель окрашивали 0.25%-ным Кумас-си 11-250.

Рис.6. Сканограммы геля после ЕБ-на-электрофореза (рис.5, 1-3). I-белки-маркеры,- 11-ошт; Ш-контроль.

дорокки

и

и

г..

:

33. г

. . ... 141-1

к

¡он.ио ии.ой

ш

= : = .

V У

|

гУ-

:: я ч 1.

:

|| |

1 д В

Й

И

кБа

94 — 67 —

43 —

30 —

1 2 3

£ —«

йгс.7. ББ-ка-злектрофореграша Оелков, связанных с 5-агас-содерна-сей ДНК (дорохка 3) и ДНК контрольных цроростков (дорожка 2); дорожка I-белки-маркеры те же, что и на рис. 5.

Хзтэды электрофоретического разделения и окрашивания Оелков см. Е^лге, в подписи к рис.5

Ранее мы установили, что фрагментация ДНК-мт при длительном Екделении (до 67, 40 с 25 коа или до 40 и 25 кса полипептидов) стдестЕенно не сказывается на ее поддергивающей актгвности и субстратной специфичности. Поэтому есть основания считать, что резликативная НК-мт, выделенная в мягких условиях из 5-агаС-ссдергашего хроматина, является фрагментами 78 и 67 и>а оелков, полученных в результате быстрого и "жесткого" выделения из Б-агас-содержвшей ДНК, и также идентичны по происхождению 80 и 6~ кБа ДНК-мт из ядерной фракции проростков и зародышей шениш.

Таким образом, реплжативная ДНК-мт и ДНХ-метидэза, выделенная из клеток, Ее обработанных 5-агас, характеризуются близкими молекулярными массами, одинаковой активностью и субстратной специфичностью. Все это позволяет нам предположить, что эти фермы происходят от одного и того же белка (продукта одного гена), способного функционировать как в составе репликативного комплекса, та:-: и в свободном виде. По-видимому, "свободный" белок функционально соответствует пострепликзтивной ДНК-мт. Наше дредполоЕзнпе о С идентичности репликативной и суммарной клеточной ЕНК-мт пшеницы подтвердилось Б отношении ДКК-МТ МЫШИ (ЬеопЬаг^ et ь1., 1992) .

Анализ собственных экспериментальных и литературных данных позволяет сделать следующие вызолы:

1. репликативнзя ДНК-мт способна функционировать как в решшкатиь-ном комплексе, так к в свободном виде.

2. Предположительно оба типа метилирования (репликатиЕное и пост-решшкативное ) осуществляются одной и той же или близкими формами ДНК-мт.

3. модуляция фитогормонаш IN VITRO метилирования

ядерной пшеничной днк цит03ин0в0и днк-метилтрансферазои пшеницы.

Известно, что фитогормоны способны модулировать метилирование ядерной пшеничной ДНК m vivo (Кирнос И др.,1586; Vanyushin, Kirnos. 1988). Нам предстояло выяснить, влияют ли фтогормоны непосредственно на активность ядерной пшеничной ДНК-мт или же они действуют на уровне ядерного экстракта, содержащего факторы, опосредующие фитогормональное воздействие. Мы испытали действие представителей трех разных классов фитогормонов на метилирование пшеничной ДНК очиаенными ДНК-мт и ядерными экстрактами, содержащими множество ядерных негистоновых белков (рис.2).

3.1. Модуляция фтогоряоиахи лежшщовахия ЛИК яЗеркыт эксщхшат проростов тшенщы.

Среди представителей трех классов фгтогормонов (ауксины, цитокинины и гиббереллины) были обнаружены два - гибберелловая кислота (ГК) и 6-бензиламинопурин (ЕАД)- которые при концентрациях 10"'-Ю-4 М в реакционной смеси существенно увеличивают степень метилирования ДНК. Максимальный эффект (130-165%) достигался при концентрациях фитогормонов Ю-0 М (табл.5). Принципиально важно было установить, обусловлено ли стимулирующее действие фитогормонов появлением в ДНК новых потенциально метилируемых сайтов, узнаваемых ДНК-мт. Из табл.6 видно, что даже после длительного и, интенсивного метилирования ДНК добавление в инкубационнуЕ среду гиббереллиЕа с последующей инкубацией этой смеси в течение одного часа приводит более, чем 1.5- кратному увеличению включения метки в ДНК по сравнению с аналогичными инкубируемыми в тех же условиях пробами без добавленного фитогормона (табл.6). Учитывая, что при работе с очищенными ферментами из проростков и зародышей пшеницы стимулирушего действия фитогормонов на метилирование гомологичной ДНК не обнаружено (см. далее, раздел 3.2), то вероятно,что при метилировании ДНК ядерными экстрактами сод влиянием ГК могут появляться (высвобождаться) дополнительные сайты метилирования ДНК.

ТАБЛИЦА 5. Влияние различных концентраций фитогормонов на

метилирование m vitro пшеничной ДНК ядерным экстрактом из проростков пшеницы.

Ситагормов Концентрация Рздиоэктибностъ ДНК Относительное

фитогормока в пробе (имп/юн) метилирование (%)

X ± <г

ХдООереллины ГК

Глтокинины БАЛ

затин

Кинетин

Ауксины 2,4-d

ИМК

ИУК

Абсцизовая кислота о

_9 10J м 10"? м 10"? м ю--* м

_9

ю J и 101 м

10"? М

ю-4 м

_9 10 I м 10"? и 10 -1 м Ю"4 и

Г0"^М

в

10 1 м ю"5 11 10"? м

ю-4 м

щ

м

10 £ К

10 ? м ю-4 м

1225 ± 135 1425 ± 150 2015 i 187 1758 ± 191 1518 t 166

1154 1227 1542 1498 1433 979 1075 976 936 855 1248

1248 1488 1248 1316 502 540 472 546 522

± 126 ± 138 ± 176 ± 180 ± 135 ± 103 ± 115 ± III ± 123 t 93 ± 164 1408

+ 164 ± 120 + 164 ± 176 i 94 t 68 i 70 ± 81 i 61

619 642t 64 652 г 81 650 г 69 585 г 79

60

72

100,0 116,3 164,5

143.5 123,9

100,0 106,3

133.6 125,8 124,2 100,0 109,8

99,7 95,6

88.4 100,0 112,8

100,0

119.2 100,0

105.5 100,0

107.6 94,0

108,8 104,0

100,0

103.7

105.3 105,0

94.5

>:-средняя величина,-а-среднее квадратичное отклонение,- п = 4 - 5

Таблица б. Ступенчатое метилирование пшеничной ДНК ядерным экстрактом из проростков ппеницы.

относительное

метилирование, %

Опыт Условия инкубации

гадиоактишость дгш. в пробе (расп./мия.) X ± ( <г

а) Начальная инкубация: 60 мин., 1300 25°, 80 мкл стандартного буфера содержали 2 мкг пшеничной ДНК,

40 мкл ядерного экстракта, 8,6 мкКи (3,3 "Ю"6!«) [^н]-БАМ

б) Последушая инкубация: 60 мин, 25°, Без ГК + Ю-6 М ГК

1-5

10 М ГК

309 572 406

31

46 39

100,0'

23,8 44,0 31,2

2. а) Начальная инкубация: 60 мин, 25°; 15АМ]: 5,4 МККИ (4,4 ' 10~6 М) [3н]-зам + 5-10~6 М нэрадиоактив-ного зам, остальные условия как в I. б) Последующая инкубация: 60 мин, 25°,

Без ГК + Ю-5 М ГК

780 ± 65 100,0

738 ± 73 1068 ± 98

94,6 136,9

*)

20 мМ ма-фосфатный буфер, рН 8,0; 7 мМ 2-меркзптоэтгнол; 3 мМ ЭДТА

3.2. Метилирование тшеничной ЛЕК очищенной ядерной ШК-летищхзнсферазой из проростов и зародышей тхзеници.

Метилирование ДКК с помощью частично очищенной (включая стадию очистки на гепарин-сефарозе) (рис.8, табл.7) ДНК-ыт из зародышей и проростков пшеницы, в отличие от метилирования ядерными экстрактами не увеличивается в присутствии изученных фиютормоЕов (табл.7). Более того, мы выявили угнетащее метилирование ДЕК действие фитогормонов. Ннгибирущее действие БАЛ на метилирование ДНК очищенным ферментом лз проростков пшеницы выявляется почти при всех изученных концентрациях этого цитокинина, а метилирозание ферментом из зародышей практически не чувствительно к НАЛ и сильно ингибируется только при очень высокой (Ю-4 М) его концентрации. В отличие от фермента из проростков, метилирование ДЕК очищенной ДНК-мт из зародышей пшеницы подавляется более, чем на =0% при кон-

центрацин ГК Ю-5 М (табл. 7)

Разиый характер действия ГК и БАП на метилирование ЛЕК ферментами из зарохндей и проростков пшеницы свидетельствует о различиях в модуляции фитогормонами активности ДНК-мт на разных стадиях развития растения.

Рис.S. DS-Ha-3jeKTpoJoperpaiaia частично очищенных препаратов ядерной ДНК-ыетилтрансферазы зародышей и проростков пшеницы.

1 3 КСа ИВГ-^

и —94

0Ю.43

еД'зо 20.1 14

2 " 3kDa

Si . .

if

Г -

94

67

43 30 20.1 •14

Препараты ДНК-мт из зародапей (I) и проростков (2) получены из ядерных экстрактов путем очистки на ДЭАЭ-целлюлозе и гепарин-сефарозе; 3 - белки-маркеры те же, что и на рис.5.

Стадии хрсматографической очистки см. б описании к рис.2.

Итак, ш не можем исключить действие фитогормонов собственно на цитозиновут ДНК-мт. А с другой стороны, выраженное ингибирую-щее действие гиббереллина, например, может быть связэео с изменением акцепторных свойств субстратной ДНК в результате возможной интеркаляции гиббереллина в ДНК ( Witham, Hendry, 1992 ).

Таким с "разом, выявленное нами значительное стимулирущее действие ряха фитогормонов на реакцию метилирования гомологичной пшеничной ДНК в ядерных экстрактах (табл.5) противоположно действию згих фитогормонов in vivo ( Кирнос и др., 1987; Vanyushin, Kirnos, 1938 ) и отличается от их действия при метилировании in vitro той гз ДНК частично очищенной пшеничной ДНК-мт (табл.7).

is

Таблица 7. Влияние гиббере длина и б-<5ензиламинспурина нк метилирование ДКК очищенной растворимой ядерной ДНК-метилтракферазой

пшеницы.

Концентрация фитогормонов

Радиоактивность дНК в пробе (имп./мин)

X ♦ о-

ОтЕоагтельное метилгрование Ш

ГК

БАЛ

ДНК-метилтрансфераза из проростков гпт-пш

га 0 453 39 100,0

Ю-7 м 411 42 90,7

ю-6 м 438 * 36 96,7

ю-5 м 389 £ 26 85,9

Ю"4 м 283 ± 29 62,5

БАЛ 0 443 ± 45 100,0

ю-7 м 376 + 40 84,9

1СГ5 м 373 32 84,2

ю-5 м 333 * 35 76,3

ю-4 м 197 + 28 44,5

ДНК-метилтрансфераза из зародышей пшенш

0 185 26 100.0

ю-7 м 198 + 30 107,0

Ю-6 м 180 + 26 97,3

Ю"5 м 13 + 10 7,0

ю-4 я 5 + 4 2,7

0 609 103 100,0

Ю"7 я 609 ± 95 100,0

ю-6 м 578 71 34,9

ю-5 а 571 + 66 93,8

Ю"4 м 154 ± 27 25,3

X - средняя величина,- <т - среднее квадратичное отклонение,-

Это, скорее всего, объясняется тем, что з ядерных ^сстрактах действие фитогормонов на реакцию метилирования ДНК в значительной мере опосредовано различными ядерными факторами ( белкамг ), в том числе и такими, которые могут потенциально связываться : сайтами ДНК, узнаваемши ДНК-мт.

Вообще, ядерные белки могут го-разному узнавать з взаимодействовать с со и с::о последовательностями, а также с неиетилиро-ванными, полуметилированными и полностью метилированными сайтами ДНК. Поэтому, присутствие тех или иных фитогормонов южет по-разному модулировать метилирование этих различных последовательностей и сайтов ДНК.

Как бы не было, в ядре растительной клетки существует

сложная опосредованная ядерными белками система контроля за

метилированием ДНК, модулируемая $итогорыэнами.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые выделены высокомолекулярные шггозиновые ДНК-метилтранс-феразы (ДНК-мт,ес 2.1.1.37) из ядерной фракции зародышей (67kDa.) и проросткоз (80-85 kDa) пшеницы.

2. Оба фермента используют в качестве донора метальных груш s-аденозилмэтионин и характеризуются одинаковыми активностями и субстратными специфичнэстями.

3. разработан метод выделения и впервые выделена репликативная цитозиновая ДНК-метилтрансфераза с мг около 80000 из проростков пшеницы. Фермент способен осуществлять de novo и поддер-киваксее метилирование ДНК вне репликативного комплекса.

4. По молекулярной мзссе, активности и субстратной специфичности репликативная ДНК-мт практически не отличается от ядерной ДНК-мг. Вероятно, и репликативное, и псстрепликативное метилирование геиома может осуществляться одеим е тем же ферментом.

5. Впервые показано, что фитогормоны способны модулировать m vitro метилирование ДНК: 6-бензиламивопурин (БАП) и гкбберелловая кислота (ГК) стимулирую: метилирование гомологичной пшеничной ДНК ядерными экстрактами. Максимальный эффект (130 и 165 fe, соотв.) наблюдается при их концентрации Ю~° К.

6. Эти же фитогормоны в концентрации Ю-6 М не влияют, а в больших концентрациях (до Ю-4 К) - ингибируют in vitro метилирование ДЕК очищенной ДНК-мт пшеницы.

Таким образом, в ядре растительной клетки существует модулируемая фитогормонами система контроля за метилированием ДНК, опосредованная ядерными факторами.