Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активность транскрипции генов рРНК у полиплоидных видов пшеницы и их диких сородичей на ранних этапах онтогенеза растений

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фатхутдинова, Римма Ахметовна, Уфа

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УФИМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ОТДЕЛ БИОХИМИИ И ЦИТОХИМИИ

На правах рукописи

ФАТХУТДИНОВА Римма Ахметовна

АКТИВНОСТЬ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ рРНК У ПОЛИПЛОИДНЫХ ВИДОВ ПШЕНИЦЫ и их диких СОРОДИЧЕЙ НА РАННИХ ЭТАПАХ ОНТОГЕНЕЗА РАСТЕНИЙ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

(03.00.12. — физиология растений)

Научный руководитель: Кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

A.B. Чемерис

Научный консультант: Доктор биологических наук, профессор, академик АН РБ

B.А. Вахитов

Уфа - 1999

Оглавление

Стр.

Введение 4 Глава 1. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОВ РИБОСОМНЫХ РНК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ, ТРАНСКРИБИРУЕМЫХ РНК ПОЛИМЕРАЗОЙI (Обзор

литературы) 8

1.1. Рибосомные РНК растений и структурная организация кодирующих их генов 8

1.2. Области рДНК, кодирующие 18S, 5,8S и 26S рРНК растений

и разделяющие их транскрибируемые спейсеры 21

1.3. Межгенный спейсер рДНК растений 26

1.4. Метилирование дитозиновых остатков и транскрипция генов

рРНК растений 30

1.5. Локализация генов рРНК растений и их повторяемость 39 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 53

2.1. Краткая характеристика объектов исследования 53

2.2. Определение активности РНК полимеразы I в изолированных

ядрах прорастающих зародышей пшеницы 54

2.3. Приготовление цитологических препаратов 56

2.4. Выявление ядрышек после их окрашивания серебром 58

2.5. Выделение и очистка ДНК растений 59

2.6. Выделение и очистка рекомбинантной плазмидной ДНК 63

2.7. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами 64

2.8. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозных гелях 65

2.9. Блот-гибридизация нуклеиновых кислот по Саузерну 65

2.10. Радиоактивное мечение рекомбинантной плазмидной ДНК 67

2.11. Денситометрирование 67

2.12. Статистическая обработка результатов 68

2.13. Реактивы и материалы 68

Глава 3. ТРАНСКРИПЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ ГЕНОВ рРНК У ДИ- И ПОЛИПЛОИДНЫХ ВИДОВ ПШЕНИЦЫ И ИХ ДИКИХ СОРОДИЧЕЙ ЭГИЛОПСОВ (Результаты исследований и их обсуждение) 70

3.1. Активность РНК полимеразы I у ди~, тетра- и гексаплоидных

видов пшениц в системе изолированных ядер 70

3.2. Активность транскрипции генов рРНК у ди- и полиплоидных видов пшениц и эгилопсов, выявляемая путем окрашивания

ядрышек серебром 79

3.3. Особенности метилирования цитозиновых остатков в рДНК диплоидной пшеницы Triticum urartu и диплоидного эгилопса

Aegilops umbellulata 88

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 107

ЛИТЕРАТУРА 112

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Пшеница — одна из главных хлебных культур в нашей стране. В связи с проблемой создания новых сортов и искусственных гибридов пшеницы с заданными свойствами необходима детальная оценка геномного материала и определение эффективности его функционирования. Наиболее активно работающей генетической системой можно считать мультигенное семейство, кодирующее рибосомные РНК. Известно, что рРНК может составлять свыше 85% от всей РНК, присутствующей в растительной клетке. Для поддержания такого высокого содержания молекул рРНК требуется большое количество повторов кодирующих их генов и интенсивный процесс транскрипции, регуляция которого осуществляется разными способами. Существование близкородственных растений, сильно различающихся между собой по числу повторов рДНК, заставляет предполагать, что для нормального функционирования клетки достаточно лишь какой-то их части. Таким образом, значительный интерес представляет определение у растений пшеницы доли транскрибирующихся генов рРНК и выяснение соответствующих механизмов, лежащих в основе перевода этих генов в функциональное состояние. Особый интерес эта проблема приобретает в связи с изучением амфидиплоидных и аллополиплоидных растений, состоящих из двух и более разнокачественных геномов, поскольку у них наблюдается дифференциальная экспрессия генов рРНК, приводящая к известному и широко распространенному среди растений эффекту ядрышкового доминирования, молекулярно-генетическая и физиологическая природа которого до сих пор не ясна.

То, что ядрышковые организаторы у мягкой гексаплоидной пшеницы локализованы на 1А, IB, 6В и 5D хромосомах, известно уже давно (Crosby, 1957). Однако на хромосомах 1А и 5D их часто вообще не

удается детектировать (Flavell, Smith, 1974; Miller et al., 1980; Leitch et al., 1992). Причины этого кроются в особенностях организации повторов рДНК, локализованных на данных хромосомах и привнесенных диплоидными видами пшеницы и эгилопсов. Считается, что одним из механизмов регуляции работы данных генов у мягкой пшеницы является метилирование цитозиновых остатков (Flavell, Thompson, 1983). Так, в целом ряде работ показана взаимосвязь уровня транскрипционной активности рДНК растений и степени метилирования цитозиновых остатков в ней (Савельев и др., 1990; Sardana et al., 1993; Houchins et al., 1997). Однако, изучение рДНК только мягкой гексаплоидной пшеницы без сравнительного анализа активности транскрипции у диплоидных видов пшениц и эгилопсов не способно пролить свет на особенности процесса интеграции разнокачественных геномов при формировании аллополиплоидных организмов, где все гены функционируют сбалансированно. Поэтому выбор в качестве объектов исследования ряда видов ди-, тетра- и гексаплоидных пшениц и их диких сородичей -эгилопсов, в том числе и доноров геномов культурных полиплоидных форм, позволяет вплотную подойти к решению проблемы феномена ядрышкового доминирования.

Цель и задачи исследования. Цель нашего исследования заключалась в выявлении основных закономерностей изменения функционального состояния генов рРНК в полиплоидном ряду пшениц и эгилопсов. В задачи исследования входило: 1) изучение транскрипционной активности РНК полимеразы I в системе in vitro у полиплоидного ряда пшениц; 2) определение активности рибосомных генов в формирующихся ядрышках в интерфазных ядрах у полиплоидного ряда пшениц и эгилопсов; 3) сравнительный анализ степени метилирования цитозиновых остатков в рДНК диплоидной пшеницы Triticum urartu и диплоидного эгилопса Aegilops umbellulata.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые показано, что у диплоидного эгилопса Ае.итЪеИиШа более 95% повторов рДНК оказываются метилированными, тогда как у диплоидной пшеницы Т.игаПи на долю таких повторов приходится менее 65% всей рДНК.

Впервые показано, что в рДНК диплоидной пшеницы Т.игаПи и диплоидного эгилопса Ае.итЪеИиШа цитозиновые остатки метилированы, главным образом, в положениях Св. Однако, если у Ае.итЪеЫиШа преимущественное метилирование происходит по СО-типу, то у Т.игаПи СО-тип метилирования лишь незначительно превышает СЫО-тип.

Обнаружено, что у тетра- и гексаплоидных видов пшеницы по сравнению с диплоидными отмечается заметное снижение отношения активности транскрипции к числу генов рРНК, которое свидетельствует о том, что у полиплоидных видов пшениц, в отличие от диплоидных, несколько большая доля повторов рДНК находится в неактивном состоянии. У пшениц и эгилопсов происходит заметное уменьшение числа активно транскрибирующихся генов рРНК при переходе с диплоидного на тетраплоидный уровень, тогда как при сравнении тетраплоидов и гексаплоидов между собой эта разница не так существенна.

Полученные в ходе данной работы результаты углубляют представление об особенностях функционирования генов рРНК у близкородственных видов пшениц и эгилопсов разного уровня плоидности на ранней стадии онтогенеза.

Практическая значимость данной работы заключается в оценке функционального состояния генов рРНК у различных видов трибы пшеницевых, являющихся донорами и потенциальными донорами пшеничных геномов, на молекулярно-генетическом и биохимическом уровнях, что может способствовать прогнозированию взаимодействия геномов и функционального состояния генов рРНК при формировании

новых искусственных видов полиплоидных пшениц с ценными хозяйственно-полезными признаками.

Положения, выносимые на защиту. У амфидиплоидных и аллополиплоидных видов пшениц и эгилопсов происходит заметное уменьшение пропорции между долей функционально активных повторов рДНК и их общим количеством, тогда как тетраплоидные и гексаплоидные пшеницы различаются по этому признаку не так существенно.

Транскрипционная активность отдельной повторяющейся единицы рДНК у Ае.итЪе11и1Ша значительно выше, чем у Т.игагШ. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на V съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (Москва, 1987), VI Всесоюзном совещании "Структура и функции хромосом" (Пущино, 1988), V конференции ученых социалистических стран по биоорганической химии (Пущино, 1988), II Всесоюзном съезде физиологов растений (Москва, 1990) и некоторых других конференциях. Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, список которых приводится в автореферате.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 199 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 132 страницах и содержит 7 таблиц и 14 рисунков.

Глава 1

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОВ РИБОСОМНЫХ РНК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ, ТРАНСКРИБИРУЕМЫХ

РНК ПОЛИМЕРАЗОЙI (Обзор литературы)

1.1. Рибосомные РНК растений и структурная организация кодирующих

их генов

Рибосомные РНК (рРНК) служат основным структурным компонентом рибосом и интерес к кодирующим их генам (рДНК и 58 ДНК) объясняется той важной ролью, которую выполняют рибосомы, являясь главной составной частью белок-синтезирующего аппарата клетки. Эффективность синтеза белка (не в последнюю очередь зависящая от количества рибосом и, соответственно, от количества синтезируемой рРНК) во многом определяет физиологический статус растения на разных этапах его онтогенеза. Тот пул молекул рРНК, который должен быть в функционирующей клетке, формируется за счет процесса транскрипции, регуляция которого осуществляется различными способами. Так, немаловажное значение для транскрипционной активности имеет общее число генов рРНК, присутствующее в данной клетке. Еще большее значение в этом процессе принадлежит функционально активным генам. У растений, как известно, копийность рДНК весьма высока и поэтому находиться в физиологически активном состоянии теоретически может лишь какая-то их часть. В случае же амфидиплоидных и аллополиплоидных растений, состоящих из двух и более разнокачественных геномов (как например, полиплоидные пшеницы), эффективность транскрипции кластеров рДНК, расположенных на разных хромосомах, определяется особенностями структурной организации их регуляторных областей, конкурирующих за факторы транскрипции. Следствием этого является дифференциальная экспрессия генов рРНК,

приводящая к известному эффекту ядрышкового доминирования, широко распространенному среди растений, молекулярно-генетическая и физиологическая природа которого, к сожалению, далеко не ясна.

У растений, как и прочих эукариотических организмов, выявлено 4 различных типа молекул рРНК, входящих в состав рибосом. Так, каркасом для малой субъединицы эукариотической рибосомы служит молекула 18S рРНК. Большую же субчастицу вместе с 26S и 5,8S рРНК формирует еще одна низкомолекулярная рРНК длиной 120 нуклеотидов, называемая 5S рРНК. Следует отметить, что в литературе для обозначения рРНК, входящей в состав малой субъединицы рибосом у растений, вместо 18S в ранних работах даже несколько более часто использовался коэффициент седиментации 17S. Аналогично, в отдельных статьях большая 26S рРНК у растений обозначается как 25S. Обозначение 28S характерно для рРНК большой субъединицы рибосом животных организмов. Здесь (кроме отдельных случаев), во избежании путаницы, будут использованы коэффициенты седиментации этих молекул рРНК растений равные 18S и 26S.

Известно, что гены так называемых высокомолекулярных рибосомных РНК у эукариот организованы в виде тандемных повторов, расположенных по типу "голова к хвосту" (Long, Dawid, 1980). Гены, кодирующие 18S, 5,8S и 26S рРНК, у высших организмов входят в состав таких повторов рДНК и транскрибируются РНК полимеразой I. Гены, кодирующие 5 S рРНК у растений, как и других эукариот, отделены от генов высокомолекулярных рРНК, транскрибируются РНК полимеразой III и здесь рассматриваться не будут. Гены 18S, 5,8S и 26S рРНК в составе повторяющейся единицы рДНК разделены двумя внутренними и одним внешним транскрибируемыми спейсерами. В результате их транскрипции РНК полимеразой I образуется первичный транскрипт в виде пре-рРНК, содержащий в своем составе транскрибируемые спейсеры и имеющий

коэффициент седиментации около 45 S. Во время процессинга транскрипты спейсерных последовательностей, входящих в его состав, удаляются, что приводит к образованию зрелых 18S, 5,8S и 26S рРНК.

Нетранскрибируемый межгенный спейсер (МГС), расположенный между З'-концом гена 26S рРНК и 5'-концом внешнего транскрибируемого спейсера, предшествующего гену 18S рРНК из следующего повтора, разделяет соседние транскрипционные единицы рДНК. МГС рДНК в свою очередь обычно содержит короткие повторяющиеся последовательности, называемые субповторами. Считается, что МГС рДНК выполняет важную роль в функционировании этих генов, поскольку содержит в своем составе регуляторные элементы и сайт инициации транскрипции.

Рис. 1.1. Схема организации повторов рДНК высших растений.

А - чередование повторяющихся единиц рДНК, кодирующие области которых изображены в виде закрашенных стрелок, указывающих направление транскрипции. Б - расположение генов 18S, 5,8S и 26S рРНК, а также транскрибируемых (ТС, ВТС-1, ВТС-2) и нетранскрибируемого (МГС) спейсеров в повторе рДНК. Стрелками показаны входящие в состав МГС субповторы. В - Организация МГС рДНК. Стрелками разной формы показаны субповторы. СИТ (сайт инициации транскрипции) обозначен как +1.

На рис.1.1 приведена общая, несколько упрощенная схема организации рДНК высших растений, типичная и для прочих эукариотических организмов. Следует отметить, что несмотря на то, что конечными продуктами транскрипции рДНК у высших растений являются 18S, 5,8S и 26S рРНК, кодирующие их генетические системы отличаются довольно большим разнообразием по их локализации, копийности и по структурной организации. Однако, у разных видов растений главные отличия в организации рДНК заключены в нетранскрибируемой части этих повторов, представляющей собой МГС, который несет промоторную область, включающую старт транскрипции и прочие регуляторные элементы.

Важным этапом в изучении организации рДНК высших растений, предшествующим исследованию особенностей их функционирования, являлось выяснение размеров повторяющихся единиц и построение их рестриктазных карт, проводимые обычно с помощью экспериментов по блот-гибридизации. Однако, точность определения молекулярных масс фрагментов рДНК при их разделении гель-электрофорезом была невысока, в связи с чем приводимые размеры повторов рДНК иногда заметно отличались от настоящих, ставших известными несколько позже после завершения секвенирования ряда полных повторов рДНК некоторых растений. В то же время, полученные в ходе тех экспериментов данные позволяли проводить определенный сравнительный анализ генов рРНК у разных видов растений и делать важные выводы и заключения.

Считается, что у высших растений размеры повторяющихся единиц рДНК варьируют в пределах от 7,8 тпн у риса (Oono, Sigiura, 1980) и некоторых других растений до 18,5 тпн у одного из видов Trillium (Yakura et al., 1983) и Posidonia oceanica (Tucci et al., 1998). В настоящее время не вызывает сомнений, что такие межвидовые различия в размерах повторов

рДНК обусловлены, главным образом, неодинаковой протяженностью внешнего транскрибируемого и межгенного нетранскрибируемого спейсеров. Несомненно то, что подобная гетерогенность размеров повторяющихся единиц рДНК не связана с длиной нуклеотидных последовательностей, кодирующих непосредственно сами 18S, 5,8S и 26S рРНК, поскольку у всех изученных к настоящему времени видов растений их протяженность практически идентична. В связи с этим необходимо отметить, что минимальный размер повтора рДНК у высших растений, как это будет видно из дальнейшего изложения, может составить около 7 тпн или немногим более. Что касается верхнего предела, то рассчитать его просто невозможно, но при этом надо отметить, что отдельные виды растений, у которых исследована рДНК, характеризуются значительной протяженностью повторяющихся единиц. Так, довольно большие размеры рДНК типичны для представителей семейства лилейных (Yakura et al., 1983) и хвойных (Karvonen et al., 1993). Для животных организмов длина основного повтора рДНК варьирует еще в более широких пределах, составляя от 6,8 тпн у простейшего Stylonichia до 44 тпн у крысы (Gerbi, 1986). Такая гетерогенность по размеру рДНК проявляется, главным образом, за �