Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная организация и особенности функционирования генов рибосомных РНК у диплоидного эгилопса Aegilops umbellulata в связи с явлениями ядрышкового доминирования

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Структурная организация и особенности функционирования генов рибосомных РНК у диплоидного эгилопса Aegilops umbellulata в связи с явлениями ядрышкового доминирования"

На правах рукописи

КУЛИКОВ Александр Маратович

РГБ ОД

- 7 ФЕЗ 2003

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ГЕНОВ РИБОСОМНЫХ РНК У ДИПЛОИДНОГО ЭГИЛОПСА АЕаЬОРБ иМВЕЬЬиЬА ТА В СВЯЗИ С ЯВЛЕНИЕМ ЯДРЫШКОВОГО ДОМИНИРОВАНИЯ

(03.00.12 — Физиология растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа - 2000

Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской Академии наук.

Научный руководитель

Научный консультант

Официальные оппоненты

Ведущая организация

Кандидат биологических наук, старший научный сотрудник A.B. Чемерис

Доктор биологических наук, профессор В.А. Вахитов

Доктор биологических наук Г.Р. Кудоярова

Доктор биологических наук Р.И. Ибрагимов

НИИ физико-химической биологии им.А.Н. Белозерского МГУ

Защита состоится февраля 2000 г. в ^^ часов

на заседании диссертационного совета К 064.13.09 в Башкирском государственном университете. *

Адрес: 450074, г. Уфа, ул. Фрунзе, 32., биологический факультет, ауд.332.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного университета.

Автореферат разослан " ^^ " 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, к.б.н.

Г.Г.Кузяхмегов

-/У, О

I 1

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Пристальное внимание к рибосомным РНК (рРНК) и, соответственно, к кодирующим их генам (рДНК), не ослабевает уже на протяжении многих лет, что объясняется той важной ролью, которую они выполняют в клетке. Известно, что физиологический статус растений в ходе онтогенеза в значительной мере определяется эффективностью синтеза белка. Поскольку рРНК формируют "скелет" рибосом, являющихся главной составной частью белок-сиятезирующего аппарата, то для сборки достаточного количества этих органелл, в клетке, наряду со специфическими рибосомными белками, необходимо присутствие определенного пула молекул рРНК. По этой причине рДНК является весьма интенсивно функционирующей генетической системой, и выяснение механизмов регуляции ее активности представляет значительный интерес.

Особую актуальность эта проблема приобретает в связи с явлением ядрышхового доминирования, присущего амфидиплоидным и аллополиплоидным видам растений, состоящих из двух или большего числа разнокачественных геномов, и заключающегося в функционировании только определенных локусов рДНК и подавлении ими остальных. Эффект доминирования ядрышка одной хромосомы над ядрышками других, получивший название "дифференциальная амфипласгия" (Navashin, 1928), известен давно, однако, его физиологическая и молекулярно-генетическая природа до сих пор до конца не ясна. Спустя несколько десятилетий изучения этого явления оказалось, что в его основе лежит дифференциальная экспрессия генов рРНК, которая, в свою очередь, обуславливается особенностями организации межгенных спейсеров рДНК, содержащих промоторную область и прочие регуляторные элементы. К тому времени данное явление получило название ядрышкового доминирования, и молекулярные причины, его вызывающие, стали предметом повышенного внимания. В настоящее время существует несколько гипотез, в той или иной мере объясняющих неодинаковую транскрипционную активность различных локусов рДНК в гибридных организмах (Pikaard, Chen, 1998), которые, однако, требуют получения дополнительной информации и экспериментальных доказательств.

Представители трибы пшеницевых, многие из которых являются полиплоидными формами, служат удобными объектами для изучения

дифференциальной экспрессии генов рРНК и, следовательно, причин возникновения адрышкового доминирования. Для мягкой гексаплоидной пшеницы Triticum aestivum — основной хлебной культуры в нашей стране — характерно доминирование локусов рДНК, расположенных на 1В и 6В хромосомах, тогда как ядрышковый организатор на хромосоме 5D значительно мельче (Flavell, O'Dell, 1979), а на 1А хромосоме его часто вообще не удается детектировать (Leitch et al., 1992). Выяснение структурно-функциональной организации рДНК, принадлежащих геному D (Lassner et al., 1987), геному В (Barker et al., 1988), а также являющейся предполагаемым донором генома А диплоидной пшенице T.urartu (Вахитов и др., 1989), и их сравнительный анализ позволили прийти к предварительному заключению о том, что возможными причинами доминирования локуса рДНК генома В над остальными служат определенные особенности структурной организации их межгенных спейсеров. Для подтверждения подобного предположения требовалось исследование какого-либо еще локуса рДНК, проявляющего доминирующий характер. И обнаружение того факта, что при включении в геном мягкой пшеницы хромосомы 1U от диплоидного вида эгилопса Aegilops umbellulata ядрышкообразуюпще регионы пшеницы (включая локусы рДНК на хромосомах 1В и 6В, также являющихся достаточно сильными) полностью супрессируются (Martini et al., 1982), вызывает к этой проблеме дополнительный интерес. Таким образом, становится ясно, что для лучшего понимания механизмов как супрессии, так и доминирования тех или иных, расположенных на разных хромосомах локусов рДНК гексаплоидной пшеницы, необходимо также знание структурной организации и особенностей функционирования рДНК диплоидного вида эгилопса Ae.umbellulata, обладающего очень мощными ядрышковыми организаторами, чем и был обусловлен выбор этого объекта для данного исследования. Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении структурной организации межгенного спейсера рДНК диплоидного эгилопса Ae.umbellulata и роли его отдельных элементов в дифференциальной экспрессии генов рРНК в связи с явлением ядрышкового доминирования.

В задачи исследования входило: 1) изучение геномной организации рДНК; 2) клонирование фрагмента повторяющейся единицы рДНК, включающего в свой состав межгенный спейсер; 3) определение структурной

организации межгенного спейсера рДНК; 4) секвенирование части межгенного сгтейсера рДНК, включая промоторнуго область, субповторы и межгенный транскрибируемый спейсер; 5) сравнительный анализ структурной организации межгенных спейсеров рДНК диплоидного эгилопса Ае.итЬеПиШа с другими представителями трибы пшеницевых; 6) идентификация участков межгенных спейсеров рДНК диплоидного эгилопса Ае.итЬеИиШа и диплоидной пшеницы Т.игаПи, взаимодействующих с факторами транскрипции.

Научная новизна и практическая ценность. Клонирован фрагмент рДНК диплоидного эгилопса Ае.итЪеИиШа, включающий межгенный спейсер, для большей части которого определена нуклеотидная последовательность. Обнаружено, что в состав межгенного спейсера, кроме промоторной области, входит несколько типов повторяющихся элементов, среди которых превалируют А-, В- и Е-субповторы. Е-тип субповторов выявлен впервые и является уникальным для АемтЬеШиШа, в отличие от остальных видов грибы пшеницевых, имеющих только единичные копии этой последовательности. Установлено, что Е-субповторы представляют собой инвертированные последовательности, способные формировать жесткие "шпилечные" структуры. Выявлен высокий уровень гомологии Е-субповторов с областью корового промотора генов рРНК. Показано взаимодействие Е-субповторов с белками ядерных экстрактов, содержащих факторы транскрипции. Выдвинуто предположение об участии А-, В- и Е-субповторов в возникновении эффекта ядрышкового доминирования у полиплоидных форм трибы пшеницевых. Результаты исследований на примере диплоидного эгилопса Ае.итЪеИиШа существенно углубляют представление об организации и особенностях функционирования генов рРНК у высших растений.

Практическая значимость работы заключается в выявлении элементов межгенного спейсера, взаимодействующих с присутствующими в экстрактах ядерных белков факторами транскрипции и ответственных, таким образом, за дифференциальную экспрессию генов рРНК у пшениц и их диких сородичей, что может способствовать прогнозированию особенностей интеграции геномов и определению функционального состояния генов рРНК при формировании новых искусственных видов полиплоидных пшениц с хозяйственно-полезными признаками.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III Всесоюзном совещании по хемосистематике и эволюционной биохимии высших растений (Москва, 1986), V съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (Москва, 1987), У конференции молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии (Пущино, 1988), III Всесоюзной конференции по физиологии растительной клетки (Петрозаводск, 1988), 8-ом двустороннем симпозиуме СССР—ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов" (Иркутск, 1989), конференции "Актуальные проблемы физико-химической биологии и биотехнологии" (Алма-Ата, 1989), VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1990), 10-ом двустороннем симпозиуме СССР—Франция "Организация и экспрессия геномов прокариотических и эукариогических организмов" (Киев, 1991), 4-ом Международном конгрессе по молекулярной биологии растений (Амстердам, 1994), международной конференции, посвященной памяти академика А.Н.Белозерского (Москва, 1995), Всероссийском симпозиуме "Изучение генома и генетическая трансформация растений" (Иркутск, 1999), IV съезде Общества физиологов растений России (Москва, 1999).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 169 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 146 страницах и содержит 31 рисунок.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследования служили отдельные представители семейства злаковых Роасеае, относящиеся к трибе пшеницевых Triticeae, подтрибе пшеницевых Triticinae. Основным объектом исследований являлся диплоидный вид эгилопса Aegilops umbellulata Zhuk., имеющий геномную формулу U. Кроме него в отдельных экспериментах были использованы диплоидная пшеница Triticum urartu Thum. ex Gandil. (геном А) и гексаплоидная мягкая пшеница T.aestivum L. с геномной формулой ABD. Эгилопс Ae.umbellulata несет наиболее сильный ядрышкообразующий регион среди пшениц и их

ближаших сородичей, тогда как диплоидная пшеница T.urartu, являющаяся предполагаемым донором генома А полиплоидных пшениц ряда twgidum-aestivum, характеризуется крайне слабым ядрышковым организатором и взята в исследование как резко контрастный вид.

В работе использованы следующие методы. Выделение высокомолекулярной растительной и бактериальной ДНК проводили по Грэхэму (Graham, 1978) с некоторыми модификациями. Выделение плазмидной ДНК, анализ рекомбинантных клонов, клонирование ДНК в плазмидных векторах, подготовку компетентных клеток и их трансформацию плазмидными ДНК, электрофорез фрагментов ДНК и их этоцию из легкоплавкой агарозы проводили по прописям, изложенным в лабораторном руководстве "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" (Sambrook et al., 1989). Перенос фрагментов ДНК из гелей на нейлоновые фильтры проводили с помощью вакуумного блоттирования (Peferoen et al., 1982). Концевое мечение рестршаазных фрагментов ДНК осуществляли с помощью Кленовского фрагмента ДНК полимеразы I и соответствующего [сс-32Р] дН'ГФ. Приготовление зондов для блот-гибридизации проводили с помощью набора Multiprime фирмы Amersharn. и [а-32Р] дАГФ как рекомендовано поставщиком. Гибридизацию фильтров проводили в приборе OmniBlot Processing System модели TBU-3000 фирмы "American Bionetics, Inc." (США). Одноцепочечные матрицы для секвенирования клонированных фрагментов ДНК нарабатывали при помощи хелперного фага М13К07. Секвенирование проводили методом химической деградации по Максаму-Гилберту (Maxam, Gilbert, 1977) в модификации Данилюка и соавт. (1986), а также ферментативным дидезокси-методоы Сэнгера (Sanger et al., 1977) с помощью секвеназы и (в ранних экспериментах) Кленовского фрагмента ДНК полимеразы I. Электрофоретическое разделение продуктов секвенирующих реакций проводили в приборе Macrophor (LKB-Pharmacia, Швеция). Взаимодействие ядерных белков с фрагментами межгенного спейсера рДНК изучали методом замедления в геле (Jofuku, Goldberg, 1988). Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью компьютерных программ DNASIS (Япония), а также пакета прикладных программ Lasergene (США).

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Геномная организация рДНК диплоидного эгипопса Ae.umbellulata и клонирование фрагмента, содержащего межгенный спейсер Для достижения поставленной цели требовалось решение ряда задач, первыми из которых было выяснение геномной организации повторов рДНК диплоидного эгилопса Ae.umbellulata и клонирование фрагмента, содержащего межгенный спейсер. Проведенные эксперименты позволили вывить в геноме диплоидного эгилопса Ae.umbellulata три класса повторов рДНК различающихся протяженностью межгенного спейсера.

Из радиоавтографа блот-гибридизации, представленного на рис. 1, можно видеть характерный набор фрагментов рДНК с размерами 3.75, 4.7, 5.4, 6.1, 9.4, 10.1 и 10.8 тпн. Полосы размером 4.7, 5.4 и 6.1 тпн представляют собой £соШ/5аотШ-фрагменты, включающие части генов 26S и 18S рРНК из соседних повторов рДНК и разделяющий их межгенный спейсер. Основываясь на полученной информации о размерах данных фрагментов рДНК, были проведены соответствующие эксперименты по их клонированию.

1 2

Рис. 1. Радиоавтограф блот-гибридизации тотальной ДНК диплоидного эгилопса Ае.итЬеИиЫа и рекомбинантной плазмиды рАи58, расщепленных рестриктазами ВатШ и £соШ. В качестве гибридизационной пробы служили радиоактивно меченные фрагмента рДНК диплоидной пшеницы Т.игагШ, составляющие в сумме полный повтор. 1 — тотальная ДНК; 2 — рекомбинантная плазмида рАи58. Размеры приведены в тпн

в

С использованием в качестве вектора плазмиды pBR327, предварительно расщепленной рестриктазами ВаотШ и £eoRI, была получена рекомбинантная плазмида, обозначенная как рАи58, в которой оказался клонированным £соК1/2?£шН1-фрагмент рДНК размером 5.4 тпн. Проведенное рестриктазное картирование клонированного фрагмента рДНК позволило построить его детальную рестриктазную карту, свидетельствующую о довольно типичной структурной организации этого участка повторяющихся единиц рДНК растений. При этом, однако, число субповторов в клонированном межгенном спейсере рДНК Ae.umbellulata оказалось довольно велико. Так, результаты картирования свидетельствуют, что Ae.umbellulata содержит в клонированном фрагменте рДНК 18 различающихся по длине основных А-субповторов, размеры которых были определены как 120 пн и 135 пн.

Рис. 2. Радиоавтограф агарозного геля после разделения в нем фрагментов фрагментов вставки из рекомбинантной плазмиды рАи58 после ее мечения по одному из концов и неполного расщепления рестршсционными эндонуклеазами.

1 — ApaU\ 2 — Ncol; 3 — Hhal\ 4 — Rsal; 5 — Hin 11; 6 — BspRI; M — маркерная 123-пн "лестница"

M 1 2 3 4 5 6 М

Секвенирование межгенного спейсерарДНК Ae.umbellulata и

компьютерный анализ нуклеотидной последовательности На основе проведенного картирования была разработана стратегия секвенирования отдельных участков межгенного спейсера, включающих область, прилегающую к 3'-концу гена 26S рРНК, промоторную область, зону, кодирующую пре-рРНК, и отдельные субповторы общей протяженностью около 2500 пн.

Компьютерный анализ, осуществленный методом поиска точечной гомологии, показал наличие в секвенированной нуклеотидной последовательности нескольких типов повторяющихся участков. Так, одна группа субповторов, обозначаемых как В, локализована после З'-конца гена 26S рРНК и представлена одним неполным и тремя полными прямыми повторами. Проведенное множественное выравнивание с помощью программы MegAlign позволило установить начало каждого субповтора.

si ccacaactctccttov\caagtiuc.5ttcc.^j^accgggcatatctgcaccc.caaa.b.t

121 catgggcaaaagj^ltaac.u^gtcccttgt.u.gacgtacgcajl.tcacccaataaggcca

181 gtcgcgaggacactcaaaactatttgtgccaagtgactaaaatacttc-gccgattcatgc i

241 ggatgccgtcgtcacaggctacccggctaagtcatggtcaagacaaatggtaaagtccct

301 tatatgacatatgciutcactacf.taaggccactggcgagcacactciaaaatatgtgaj.

1

3 61 gtaaccaagatacttgaccgattcatgcggatgccttcgtccc^ggctacacggctaagt

421 catggtcaagacaaatggtaaagtccattatatgacatacgcaatcactcgataaggcca

J

-у-

43 1 gtcgcgaggacactcaaaactatttctgccaagtcactaaaatacttggccgattcatgc

£41 atgatgacatcacaaataacgtcttatcgcagacacgggcaagagtggtggacgaactca

601 cagcg

Рис. 3. Локализация В-субповторов в секвенированном фрагменте межгенного спейсера рДНК Ae.umbellulata. Стрелки, расположенные над субповторами, показывают их границы. Двойной линией подчеркнут З'-конец гена 26S рРНК. Одинарной линией подчеркнут консервативный участок,-прилегающий к 3'-концу гена 26S рРНК

Размер первого, второго и третьего субповторов составляет 152, 148 и 153 пн соответственно, тогда как четвертый субповтор значительно короче и менее гомологичен. Для лучшего понимания причин дифференциальной экспрессии генов рРНК разных локусов мягкой гексаплоидной пшеницы значительно больший интерес представлял сравнительный анализ этой области межгенных спейсеров, принадлежащих различным геномам. Так, проведенное сравнение секвенированного фрагмента межгенного спейсера рДНК Ae.umbellulata с подобными участками T.aestivum NorB2 (Barker et al., 1988) и T.aestivum NorD3 (Lassner et al., 1987) свидетельствует о значительном сходстве В-субповторов этих видов, что позволяет предположить выполнение ими аналогичных функций. К отличительной черте В-субповторов Ae.umbellulata можно отнести повышенное содержание олиго(А)-последовательностей, которые, как показано в ряде работ (Echeveria et al., 1992; Zentgraf, Hemleben, 1992), могут связываться с белковыми факторами, возможно входящими в состав транскрипционного комплекса.

Отдельный интерес представляет собой консервативный участок после З'-конца гена 26S РНК и до начала В-субповторов, формирующий потенциальную "шпилечную" структуру, которая вероятно может выполнять роль терминатора транскрипции. Несмотря на то, что, казалось бы, роль терминаторов транскрипции в дифференциальной экспрессии генов рРНК неочевидна, тем не менее в литературе имеются свидетельства, что это связанный процесс и терминаторы могут выступать в качестве его цис-активных элементов (Vincentz, Flavell, 1989). При этом следует отметить, что и Ae.umbellulata и локус NorB2 T.aestivum, обладающие мощными ядрышковыми организаторами, характеризуются весьма схожими вторичными структурами, тогда как диплоидной пшенице T.urartu и ржи S.cereale, несущим слабые ядрышковые организаторы, присущи менее совершенные "шпильки" несколько иной конфигурации.

Резонно предположить, что В-субповторы и область терминации транскрипции межгенного спейсера могут иметь отношение к доминированию его ядрышковых организаторов в полиплоидных пшеницах и их межвидовых гибридах.

а

CCCTCCTTCACAAACTGAAGGGCAGGGGTCCCAAGGGGGGCTAAAACCCT

_________________________. .т......с...............

___ . . -А___. . . . ... .....т...............

........ ..... ..................т...............

. . .CT.. . . ____Г. .-........

.......А..................

+1 +28 CGGGTATAGT AGGG-AGGAGGGG—TCCTTCCTGGTGGGCG Aegilops umbellulata

. А. . . . СТА. G...G........— ....C..G.T...... Triticum urartu

..............-........—................ Triticum aestivum NorB2

..............-........—................ Triticum aestivum NorD3

..............-.....................Т.... Aegilopsspelloides

..............-........—. . . . С. . G . 1С.....Seeale cereale

........T. G...-........GC. . . .C. .CT.CTT.G. Hordeum vulgare

Рис. 4. Сравнение промоторных областей рДНК у различных представителей трибы пшеницевых. Точками показаны совпадающие нуклеотиды, дефис обозначает делению нуклеотида. Предполагаемая точка инициации транскрипции обозначена как +1 и стартовый нуклеотид подчеркнут. Нетранскрибируемая и транскрибируемая части разделены пробелом. Нумерация приведена для Aegilops umbellulata

Другим важным элементом межгенного спейсера рДНК, принимающим самое непосредственное участие в процессе транскрипции, является промотор. С целью его анализа было проведено секвенирование части межгенного спейсера Ae.vmbellulata, содержащего предполагаемую промоторную область, прилегающие последовательности, включая редуцированные А-субповторы. Особый интерес представляет участок промотора, окружающий старт транскрипции, поскольку он обеспечивает связывание РЖ полимеразы I и белковых факторов транскрипции и именно здесь происходит инициация этого процесса.

Взятый в сравнение с прочими видами трибы пшеницевых участок промоторной области Ae.umbellulata показал очень высокий уровень гомологии. Как можно видеть из рис. 4, для всех сравниваемых видов характерно лишь небольшое число замен в (-)-области, а первая делеция нуклеотида отмечается только в положении -45. Особым случаем является T.urartu, которая как и остальные диплоидные пшеницы, содержит довольно необычные мотивы, непосредственно прилегающие к промоторной области (Ахунов и др., 1997). Наличие у диплоидных пшениц, являющихся донорами генома А полиплоидных пшениц, таких необычных мотивов, в которых

отсутствует канонический ТАТА-элемент, вероятно "способствует" их супрессии в составе гексаплоидного генома. Однако, и Ae.umbellulata, и локусы NorB2 и NorD3 T.aestivum несу г в составе своего промотора ТАТА-бокс и, таким образом (учитывая очень высокую гомологию всего этого участка, свидетельствующую о сходной функции), видимо, можно предположить, что причины ядрышкового доминирования локуса рДНК 1U Ae.umbellulata в синтетических гибридах лежат не здесь.

Еще одним элементом межгенного спейсера рДНК, который, как показано в ряде работ (Labhart, Reeder, 1984; Doelling, Pikaard, 1993), выполняет роль усилителя транскрипции, являются субповторы, проксимально расположенные по отношению к промотору. Как уже отмечалось выше, данный тип субповторов представлен у Ae.umbellulata 18 копиями, слегка различающимися по своей длине. Для выяснения особенностей нуклеотидной последовательности основных А-субповторов Ae.umbellulata было проведено их направленное субклонирование и секвенирование.

GCCATGGAAAACTGGGCAAAACCACGTACGAGGCACACACA-CGTACACG Aegilops umbellulata

С.......................Т......С.........-........Aegilops umbellulata

..............................Т.-.....G.CG........ T.aestivum Norß2

.........................................-........ T.aestivum NorD3

............А........G...AG....T-TC... GATC........ Triticum urartu

.A....................G......T......GT..G-......T. Seeale cereale

GACCCTTACACGGACCCGTGAACGGGCTGTAC-GTGGACACGTGAAAAAA Aegilops umbeüulala

................................-.........G..............A egilops umbellulata

................................-.........G..............T.aestivum NorB2

................................-.........G..............T. aestivum NorD3

A. ... AG.....T. . . . -A........G.... -.........G..............Triticum urartu

.....G.G......-. . AAA.....C.C. . . .C. . .-.....G. . . TTTT Seeale cereale

ACGGCCG-ACGC-CGTC-GTGGACGGAACGTG-ACGCGC .C-

..AC...GT. ..AC....CG ..AC.G.GC. -..AC.G.GC.

С-. . . ......Г.

GT.C. .-...GC.

GT. . . ......С.

GTTC. .-..с.с.

TTTG. . G____С.

TT

133 пн Aegilops umbellulata 121 пн Aegilops umbellulata 133 пн T.aestivum NorB2 121 пн T. aestivum NorD3

133 ли Triticum urartu

134 пн Seeale cereale

Рис. 5. Сравнение А-субповторов межгенного спейсера рДНК отдельных представителей трибы пшеницевых

Проведенное сравнение нуклеотидных последовательностей А-субповторов Ае.итЬеИиЫа с таковыми у видов трибы пшеницевых свидетельствует, что несмотря на некоторую вариабельность по длине и

нуклеотидной последовательности, в них имеются эволюционно-консервативные, по всей видимости, функционально-важные участки.

Наиболее типичные размеры А-субповторов межгенного спейсера рДНК Ae.umbellulata как и остальных пшеницевых составляют 121 пн и 133 пн. Оба размерных класса А-субповторов содержат ряд олиго(А)-последовательностей, которые теоретически могут взаимодействовать с факторами транскрипции. Можно предположить, что субповторы меньшей протяженности возникли в результате характерной довольно протяженной делеции в 12 пн в средней части субповтора длиной 133 пн, не затронувшей при этом олиго(А)-участки. Исходя из их структурных различий не представляется, однако, возможным, оценить ту степень усиления транскрипции, которую обеспечивают 121-пн или 133-пн субповторы.

С точки зрения возможных механизмов ядрышкового доминирования (и, в частности, предположения о том, что каждый субповтор способен взаимодействовать с факторами транскрипции), вероятно, более существенную роль в его возникновений играют не столько имеющиеся незначительные различия в нуклеотидной последовательности данных субповторов, включая даже протяженную делецию, сколько само их число. Как уже отмечалось выше, в межгенном слейсере рДНК Ae.umbellulata содержится 18 А-субповторов, тогда как у остальных изученных видов трибы пшеницевых их число значительно меньше. Локусы рДНК, расположенные на В- и D-хромосомах, несут по 12 и 8 таких субповторов соответственно. Еще меньшее число А-субповторов (всего 6 полноразмерных) характерно для диплоидной пшеницы T.urartu, которую можно в какой-то степени отождествлять с геномом А мягкой пшеницы, обладающим наиболее слабым ядрышковым организатором хромосом, который часто даже не детектируется. Таким образом, можно считать, что число основных А-субповторов у представителей трибы пшеницевых влияет на дифференциальную экспрессию генов рРНК и оказывает заметное влияние на процесс ядрышкового доминирования.

Из данных литературы было известно, что у некоторых видов растений повторяющиеся элементы локализованы и в области межгенного транскрибируемого спейсера (Grellet et al, 1989; Kelly, Siegel, 1989; Zentgraf et al., 1990; King et al., 1993). В этой связи значительный интерес представляло выяснение существования подобных субповторов во внешнем

m •

транскрибируемом спейсере рДНК Ae.umbellulata. Так, секвенирование данной области межгенного спейсера рДНК Ae.umbellulata, включая 5'-конец гена 18S рРНК, и последовавший затем компьютерной анализ позволили выявить группу коротких повторов размером около 26 пн каждый, обозначенных нами как "Е-субповторы". Из рис. 6, на котором приведены части межгенного транскрибируемого спейсера сравниваемых видов трибы пшеницевых, для Ae.umbellulata видны границы Е-субповторов и их количество. Остальные виды имеют только по одной копии этой последовательности, проявляющей высокий уровень гомологии с последовательностью Е-субповтора. Так, можно видеть только единичные замены нуклеотидов, расположенные преимущественно в З'-концевой области (рис. 7).

+ 268

CGCCTîlCGGMJlllCCGTTGCCCCTCGGGGCAaCGCMllUiCfJGTTGCCCCTCGGGGCCWlCGi

.....А- .----------------------------------------------------

.....с.. .----------------------------------------------------

.....с.. .-----------------------------------------------------

3 4

вЗПГЕсссгтссхгётет

+343

ессисстсоеессзщсосюлр.ссоттесссстссизесссилстссу.тсосто ле. «.

-----------------------------Т. .С..........ОТ........ Т. и.

------------------..............Т.....от........ Т. л. (1ТОГВ2)

..........................................вт........ Т.л.ОГогОЗ)

Рис. 6. Сравнение фрагментов внешних транскрибируемых спейсеров у отдельных представителей трибы ТгШсеае, включающих Е-субповторы. Ае.и. - Ае.итЬеПиШа-, Т.н. - Т.игаПи\ Т.а. (МогВ2) - Т. аазНуит Г\гогВ2; Т.а. (N0^3) - Т. аезИ\:ит КогПЗ. Точки обозначают совпадающие нуклеотиды, дефис обозначает делецию нуклеотида. Стрелками и цифрами показаны Е-субповторы у Ае. итЬеПиШа. Нумерация приведена хю Ае.итЬеИиШа

ААААСССГТбССССТСвбввбСААСТСС Ае.и. Еб-субповтор

....................-....С.- Ае.и. ЕЬсубповтор

....................С.... в-- Ае.и. Е2-субповтор

....................А. . - . в . - Ае.и. ЕЗ-субповтор

. . .. Т...............А.... в. Т Ае.и. Е4-субповтор

-...................-....С,- Ае.и. Е5-субповтор

-..........Т.. С..........СТ. Т.и.

-...А.............Г......вТ. Т.а. ЫогВ2

.........................ОТ . Т.а. N0^3

Рис. 7. Сравнение Е-субповторов рДНК диплоидного эгилопса Ае.итЬеНиЫа и гомологичных участков внешнего транскрибируемого спейсера у отдельных представителей трибы ТгШсеае

Анализ нуклеотидной последовательности Е-субповторов показал, что они представляют собой почти совершенные инвертированные повторы, способные формировать жесткие "шпилечные" структуры. Так, из рис. 8 можно видеть, что для Ае.итЬе11иШа характерно 6 тандемно расположенных "шпилек", тогда как у других видов трибы пшеницевых имеется только их одиночные копии.

С С

т с т с т с т с Т С С

с-с с-й с-с с-с с-с т С

с-нз снз с-с с-с с-с с-с

с-с с-с с-с С-С с-с с-с

с-в с с с-о С А с-с с-с

ОТ- С с-с С А с-с с-с с-с

Т-А Т-А Т С Т-А Т-А с-с

Т-А Т-А Т-А Т-А Т-А Т-А

с-с с-с С-С С-С С-С Т-А

С-в с-с С-С С-С с-с С-С

>С СААААС ААААС СААААТ СТАААС СААААСС Т(

1 2 3 4 5 б

Рис. 8. Потенциальные "шпилечные" структуры, формируемые

Е-субповторами Ае.итЬеПиШа

Интересно отметить некое чередование данных "шпилек", отличающихся верхней "петлей", состоящей из двух или трех нуклеотидов. Олиго(А)-последовательности, расположенные в начале Е-субповторов, вместе с пиримидиновыми нуклеотидами выполняют роль своеобразных "перемычек" между этими "шпильками", предназначение которых, впрочем, не совсем ясно. Однако, учитывая их присутствие, хотя и виде одиночных структур, у остальных видов пшеницевых можно утверждать, что это не простой участок межгенного спейсера, а явно несущий функциональную нагрузку.

Составленный для Ае.итЬеНиШа консенсусный Е-субповтор может быть выражен следующей последовательностью нуклеотидов — ААААССОГГСССССТССССОАСААССС. Его сравнение с промоторной областью (рис. 9) показало существование довольно заметной гомологии между этими элементами межгенного спейсера рЦНКАе.итЬеПиШа. Подобное сходство позволяет предположить, что Е-субповторы не являются балластным элементом спейсера, а выполняют определенные функции, связанные, вероятнее всего, с транскрипционным процессом.

-72 -43

AAAACAGTGTACCCCTCCAGTACAAAC (1)

***** ** * ****** * *** *

AAAACCGT TGCCCCTCGGGGACAA CGC (2)

-18 +1

AAAA CCCTCGGGTATAGTA (1)

**** ******** * *

AAAACCGTTGCCCCTCGGGGACAACGC (2)

Рис. 9. Сравнение участков промоторной области рДНК Ае. umbellidata (1) с консенсусным Е-субповтором (2). Нумерация приведена в соответствии с предполагаемым стартом инициации транскрипции. Звездочки показывают совпадающие нуклеотиды. Пробелы использованы здесь для большей наглядности

Таким образом, основными отличиями межгенного спейсера рДНК Ae.umbellulata от таковых остальных пшеницевых можно считать присутствие во внешнем транскрибируемом спейсере дополнительного типа Е-субповторов, обнаруживающих заметную гомологию с промоторной областью и формирующих "шпилечные" структуры, а также увеличенное число А-субповторов. Можно предположить, что и те и другие могут взаимодействовать с фактором(-ами) транскрипции рДНК и функционировать в качестве усилителей этого процесса.

Взаимодействие элшентов межгенных спейсеров рДНК диплоидного эгилопса Ae.umbellulata и диплоидной пшеницы T.urartu с факторами

транскрипции

Выявленные отличительные черты в организации межгенного спейсера рДНК диплоидного эгилопса Ae.umbellulata от аналогичных областей остальных видов трибы пшеницевых потребовали выяснения их роли в транскрипционном процессе. С этой целью были проведены соответствующие эксперименты, позволяющие определить взаимодействие фрагментов межгенного спейсера с белками ядерных экстрактов методом сдвига электрофоретической подвижности. Использованные субклоны были получены на основе плазмиды рАи58, содержащей ¿wRIAffa/яШ-фрагмент, включающий весь межгенный спейсер, конец гена 26S рРНК и начало гена 18S рРНК

Ae.umbellulata, и плазмиды рТиЗ, содержащей ЛдтеШЛЗя/яШ-фрагмент T.urartu, включающий аналогичные участки рДНК этого вида. В качестве векторной молекулы для субклонирования служила фагмида pGEM3Zf(+), расщепленная по Ес1\3611-сайту.

В плазмиде рАи177 был субклонирован участок промоторной области с сайтом инициации транскрипции в виде ArcoI("I26)/Z><M(+51 '-фрагмента плазмиды рАи58 (здесь и далее в виде верхнего индекса указано расположение сайтов узнавания использованных ресгрикционных эндонуклеаз относительно предполагаемого сайта инициации транскрипции). Плазмида рАи95 несла А-субповтор, содержащийся в -фрагменте. Плазмида рАи305

содержала участок межгенного транскрибируемого спейсера с Е-субповторами, ограниченный саитами рестриктаз

В плазмиде рТи234

был субклонирован ApdLY -фрагмент плазмиды рТиЗ,

включающий промотор со стартом транскрипции. Пробы для анализа методом замедления в геле были получены расщеплением плазмид pAul77, pAu95, pAu305 и pTu234 рестрикционными эндонуклеазами £coRI и ВатШ, расположенными в полилинкере вектора pGEM3Zf(+). Вставки были мечены соответствующими 32Р-дНТФ заполнением З'-концов Кленовским фрагментом ДНК полимеразы I.

Электрофоретическое замедление, являющееся результатом специфической ассоциации ДНК с белковыми факторами транскрипции из ядерного экстракта, имело место со всеми исследованными фрагментами межгенного спейсера Ae.umbellulata. Строгое связывание белка наблюдалось при использовании пробы рАи177. При одновременной инкубации с ядерным экстрактом пробы рАи177, включающей промоторную область, наблюдалась "смазанная" протяженная полоса, являющаяся по всей видимости результатом взаимодействия промоторной области с целым комплексом транскрипционных факторов и самой РНК полимеразой I. Аналогичная картина ранее наблюдалась при исследовании связывания промоторной области межгенного спейсера рДНК локуса NorB2 T.aestivum (Flavell и Jackson, 1992). Отдельные эксперименты с использованием осажденных 0,35 М сульфатом аммония ядерных белков выявили образование двух комплексов ДНК-белок. Формирование после осаждения ядерных белков из экстракта сульфатом аммония двух комплексов с различными электрофоретическими

< ' •

подвижностями указывает, по-видимому, на связывание двух различных факторов транскрипции с пробой рАи177. Одновременное инкубирование меченого фрагмента промоторной области Ае.итЬеИиШа (рАи177) и сходного, но немеченого фрагмента рДНК Т.игаНи (рТи234) практически не препятствовало образованию комплексов белков ядерных экстрактов с промоторной областью Ae.umbellv.lata.

" . - ' ■ * . Г-- V-"'

12 3 4

Рис. 10. Конкурентное взаимодействие белков ядерных экстрактов с промоторной областью Ае.итЪе11иШа(_ 1); то же в присутствии Е-субповторов (2); то же в присутствии промоторной области Т.игагШ (3); 4 - свободная проба (промогорная область Ае.итЬе!Ыа(а без добавления ядерных экстрактов)

Инкубация фрагмента рДНК, содержащего Е-субповторы, изолированного из субклона рАи305, с ядерными белками также выявила образование ряда комплексов в виде протяженной полосы как и в случае с промоторной областью. В то же время, следует отметить, что предварительная инкубация ядерного экстракта с немеченым фрагментом рДНК из рАи305 лишь частично (несмотря на гомологию нуклеотидных последовательностей) препятствует образованию белок-ДНК комплексов с фрагментами рДНК из рАи177. Это свидетельствует о том, что с Е-субповторами, вероятно, взаимодействует только определенная часть белков ядерных экстрактов, из тех, что связываются с промоторной областью. Дополнительным подтверждением этому может служить то, что размер Е-субповторов относительно невелик и данные, говорящие о большей гомологии Е-субповторов с областью промотора от -72 до -43.

С целью подтверждения связывания ядерных белков с Е-субповгорами были специально синтезированы комплементарные друг другу 21-звенные олигонуклеотиды, формирующие после отжига двуцепочечную структуру, несколько отличающуюся от полноразмерного Е-субповтора, поскольку главный интерес представляло выяснение роли нуклеотидов, формирующих потенциальные "шпильки". В случае с использованием радиоактивно меченого синтезированного олигонуклеотида - аналога Е-субповтора мы смогли лишь констатировать факт связывания с ядерными белками в виду слабого мечения радиоактивным изотопом, по-видимому, в следствие образования вторичной структуры при отжиге двух комплементарных цепей.

Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что имеет место сдвиг электрофоре™ческой подвижности субклонированных фрагментов межгенных спейсеров рДНК Ас. итЬеИикиа, вызванный их ассоциацией с белковыми факторами ядерных экстрактов. Весьма интересным является обнаружение факта взаимодействия фрагмента межгенного транскрибируемого спейсера Ае.итЬе11иШа, включающего в свой состав Е-субповторы, с факторами транскрипции, что подтверждает их важную функциональную роль в регуляции транскрипционного процесса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сведения о том, что у мягкой гексаплоидной пшеницы ядрышковые организаторы хромосом 1В и 6В доминируют над таковыми хромосом 50 и 1А были получены в конце 50-х годов, однако, только к концу 80-х стало относительно ясно почему это происходит. В то же время, для воссоздания более полной картины проявления у полиплоидных форм пшениц феномена ядрышкового доминирования все же недоставало сведений о тонкой структурной организации межгенного спейсера рДНК у диплоидного эгилопса Ае.итЬеИиШа, который, как отмечалось выше, содержит в себе наиболее мощные ядрышковые организаторы хромосом, способные в синтетических гибридах с мягкой пшеницей супрессировать образование ядрышек даже на хромосомах 1В и 6В. Восполнить этот пробел и была призвана данная работа, в ходе выполнения которой получены приоритетные данные, касающиеся тонкой структурной организации регуляторных областей генов рРНК и особенностей их функционирования у АемтЬеПиШа. Так, обнаружено, что в состав

межгенного спейсера этого вида кроме промотора входит несколько типов повторяющихся элементов, среди которых превалируют А-, В- и Е-субповторы. При этом Е-тип субповторов, представляющих собой инвертированные последовательности, высоко гомологичные промоторной области, выявлен впервые и является уникальным для Ае.итЬеНиШа, тогда как у остальных видов трибы пшеницевых имеются только единичные копии этой последовательности. Все эти элементы межгенного спейсера (стандартный промотор с каноническим ТАТА-боксом, дистальные В-субповторы, сильно увеличенное число А-субповторов, дополнительный тип инвертированных Е-субповторов, формирующих "шпилечные" структуры) и дают локусу рДНК Ае.итЪеНиШа, расположенному на хромосоме Ш, преимущества в конкурентной "борьбе" за факторы транскрипции, приводящие в итоге к ядрышковому доминированию.

Полученные результаты позволяют сказать, что сделан еще один, важный шаг к пониманию причин возникновения ядрышкового доминирования у высших растений. Познание тонких механизмов регуляции грапскрипцип генома полиплоидных пшениц и, в том числе, такой его важной части, как рДНК, несомненно может позволить в будущем, используя эти сведения, рационально подбирать доноры геномов пшениц и эгилопсов для создания новых видов с наиболее полезными для народного хозяйства признаками.

ВЫВОДЫ

1. В рекомбинантной плазмиде рАи58 клонирован фрагмент рДНК диплоидного эгилопса Ае.итЪеПиШа, включающий межгенный спейсер, в котором сосредоточены регуляторные элементы, отвечающие за дифференциальный характер экспрессии генов рРНК.

2. Определена нуклеотидная последовательность части межгенного спейсера рДНК, включающая промоторную область, отдельные субповторы и внешний транскрибируемый спейсер, общей протяженностью около 2500 пн.

3. Показано, что в состав межгенного спейсера входит несколько типов повторяющихся элементов, среди которых превалируют А-, В- и Е-субповторы. Е-тип субповторов выявлен впервые и является уникальным для Ае.итЬеНиЫа, в отличие от остальных видов трибы пшеницевых, имеющих только единичные копии этой последовательности.

4. Установлено, что Е-субповторы представляют собой инвертированные последовательности, способные формировать жесткие "шпилечные" структуры, которых у Ае. umbellulata оказывается 6 тандемно расположенных копий против одиночных "шпилек" у остальных видов трибы пшеницевых.

5. Обнаружен высокий уровень гомологии Е-субповторов с областью корового промотора генов рРНК и показано их взаимодействие с ядерными белками, содержащими факторы транскрипции, что свидетельствует об участии данных элементов межгенного спейсера рДНК в регуляции транскрипционного процесса.

6. Выдвинуто предположение об участии А-, В- и Е-субповторов в проявлении дифференциальной экспрессии генов рРНК, приводящей у полиплоидных форм трибы пшеницевых к эффекту ядрышкового доминирования.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Чемерис A.B., Гималов Ф.Р., Куликов A.M., Султанова С.М., Никоноров Ю.М., Фатхутдинова P.A. Организация, первичная структура и функциональная активность генов рибосомных РНК у пшеницы и ее диких сородичей // Тезисы докладов 5-ой конференции молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии, Пущино, 1988. - С.96-97.

2. Куликов A.M. Клонирование нетранскрибируемого спейсера рДНК дипллоидного эгилопса Aegilops umbellulata, обладающего ядрышковой доминантностью // Тезисы докладов III Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки. Петрозаводск, 1988. - С. 12.

3. Вахитов В.А., Куликов A.M., Чемерис A.B. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов рДНК пшениц и эгилопсов // Генетика. - 1988. -Т.24. - №11. - С.1993-2005.

4. Вахитов В.А., Куликов A.M., Бикбулатова С.М. Клонирование нетранскрибируемого спейсера рДНК диплоидного эгилопса Aegilops umbellulata (Zhuk.) Chennav. //Генетика. - 1989. - T.25. - №4. - C.545-547.

5. Вахитов A.B., Чемерис A.B., Куликов A.M. Структура межгенного спейсера рДНК у двух представителей трибы Triticeae с разной активностью

ядрышкового организатора // Тезисы докладов 8 двустороннего симпозиума СССР-ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов". Иркутск, 1989.-С. 58.

6. Kulikov A.M., Vakhitov V.A. Aegilops umbellulata З'-end of 26S rRNA gene // 1992. The EMBL Data Library, Release 32. DDBJ/EMBL/GenBank Accession number X66109.

7. Kulikov A.M., Vakhitov V.A. Aegilops umbellulata subrepeat of rDNA intergenic spacer // 1992. The EMBL Data Library, Release 32. DDBJ/EMBL/GenBank Accession number X66110.

8. Kulikov A.M., Vakhitov V.A. Aegilops umbellulata. 5'-end of 18S rRNA gene // The EMBL Data Library, Release 32. DDBJ/EMBL/GenBank Accession number X66111.

9. Vakhitov V.A., Chemeris A.V., Kulikov A.M. Comparative study of rDNA promoter regions of Triticum urartn and Aegilops umbellulata // In: Abstracts of 4lh International Congress of Plant Molecular Biology, Amsterdam, 1994, 2137.

Ю.Куликов A.M., Вахитов B.A. Новый класс повторяющихся элементов в межгенном спейсере рДНК диплоидного эгилопса Aegilops umbellulata // Молекуляр. биология. - 1995. - Т.29. - №5. - С.1166-1171.

П.Чемерис А.В., Ахунов Э.Д., Куликов A.M., Вахитов В.А. Особенности организации межгенных спейсеров и промоторных областей рДНК у отдельных представителей трибы пшеницевых // Всероссийский симпозиум "Изучение генома и генетическая трансформация растений" Тезисы докладов. Иркутск 1999. - С.6-7.

12.Чемерис А.В., Ахунов Э.Д., Фатхутдинова Р.А., Куликов A.M., Вахитов В.А. Возможные причины ядрышкового доминирования у отдельных представителей трибы пшеницевых семейства злаковых // IV съезд общества физиологов растений, Тезисы докладов. Т.2., М., 1999. - С.785.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Куликов, Александр Маратович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. рДНК растений: локализация, повторяемость, структурная организация, дифференциальная экспрессия (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Рибосомные РНК и кодирующие их гены

1.2. Локализация генов рРНК. Ядрышковые организаторы хромосом

1.3. Копийность генов рРНК у растений

1.4. Рестриктазные карты рДНК растений

1.5. Пре-рРНК и зрелые 18S, 5,8S и 26S рРНК растений

1.6. Межгенный спейсер рДНК растений

1.7. Ядрышковое доминирование

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Краткая характеристика объектов исследований

2.2. Выделение и очистка ДНК растений

2.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК

2.4. Выделение и очистка одноцепочечной фагмидной ДНК

2.5. Ультрацентрифугирование ДНК в градиенте плотности хлористого цезия

2.6. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами

2.7. Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях

2.8. Препаративный гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях

2.9. Элюция ДНК из агарозных и полиакриламидных гелей

2.10. Перенос ДНК из агарозных гелей на мембранные фильтры (блоттинг)

2.11. Радиоактивное мечение препаратов ДНК

2.12. Блот-гибридизация ДНК

2.13. Клонирование фрагмента повторяющейся единицы рДНК Ае.итЪеИиШа, содержащего МГС

2.14. Подготовка компетентных клеток

2.15. Трансформация компетентных клеток Е.соИ плазмидной ДНК

2.16. Построение рестриктазной карты клонированного фрагмента ДНК

2.17. Субклонирование рестриктазных фрагментов межгенного спейсера рДНК Ае.итЪеИиШа

2.18. Секвенирование ДНК методом химической деградации

2.19. Секвенирование ДНК ферментативным методом

2.20. Электрофоретическое фракционирование ДНК в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (секвенирующий гель-электрофорез)

2.21. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

2.22. Получение экстрактов ядерных белков

2.23. Замедление движения в геле фрагментов межгенного спейсера рДНК Ае.итЪеИиШа, связанных с ядерными белками

2.24. Бактериальные штаммы, плазмидные и фагмидные вектора, рекомбинантные плазмиды

2.25. Векторы и использованные конструкции

2.26. Реактивы и материалы

2.27. Составы использованных стандартных растворов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Геномная организация рДНК диплоидного эгилопса Ае. итЪеПиШа

3.2. Клонирование фрагмента рДНК, содержащего межгенный

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурная организация и особенности функционирования генов рибосомных РНК у диплоидного эгилопса Aegilops umbellulata в связи с явлениями ядрышкового доминирования"

Актуальность темы. Пристальное внимание к рибосомным РНК (рРНК) несоответственно, к кодирующим их генам (рДНК) не снижается уже на протяжении многих лет, что объясняется той важной ролью, которую они выполняют в клетке. Известно, что физиологический статус растений в ходе онтогенеза в значительной мере определяется эффективностью синтеза белка. Поскольку рРНК формируют "скелет" рибосом, являющихся главной составной частью белок-синтезирующего аппарата, то для успешной сборки должного количества этих органелл, в клетке, наряду со специфическими рибосомными белками, необходимо присутствие определенного пула молекул рРНК. По этой причине рДНК является весьма интенсивно функционирующей генетической системой, и выяснение механизмов регуляции ее активности представляет значительный интерес.

Особую актуальность эта проблема приобретает в связи с явлением ядрышкового доминирования, присущего амфидиплоидным и аллополиплоидным видам растений, состоящих из двух или большего числа разнокачественных геномов, и заключающегося в функционировании только определенных локусов рДНК и подавлении ими остальных. Эффект доминирования ядрышка одной хромосомы над ядрышками других, получивший название "дифференциальная амфипластия" (ЫауаБЫп, 1928), известен давно, однако, его физиологическая и молекулярно-генетическая природа до сих пор до конца не ясна. Спустя несколько десятилетий изучения этого явления оказалось, что в его основе лежит дифференциальная экспрессия генов рРНК, которая, в свою очередь, обуславливается особенностями организации межгенных спейсеров рДНК, содержащих промоторную область и прочие регуляторные элементы. К тому времени данное явление стали называть феноменом ядрышкового доминирования, а молекулярные причины, его вызывающие, стали предметом повышенного внимания. В настоящее время существует несколько гипотез, в той или иной мере объясняющих неодинаковую транскрипционную активность различных локусов рДНК в гибридных организмах (Pikaard, Chen, 1998), которые, однако, требуют получения дополнительной информации и экспериментальных доказательств.

Представители трибы пшеницевых, многие из которых являются полиплоидными формами, служат довольно удобными объектами для изучения дифференциальной экспрессии генов рРНК и, следовательно, причин возникновения ядрышкового доминирования. Для мягкой гексаплоидной пшеницы Triticum aestivum — основной хлебной культуры в нашей стране — характерно доминирование локусов рДНК, расположенных на 1В и 6В хромосомах, тогда как ядрышковый организатор на хромосоме 5D значительно мельче (Flavell, О'Dell, 1979), а на 1А хромосоме его часто вообще не удается детектировать (Leitch et al., 1992). Выяснение структурно-функциональной организации межгенных спейсеров рДНК, принадлежащих геному D (Lassner et al., 1987), геному В (Barker et al., 1988), a также являющейся предполагаемым донором генома А диплоидной пшенице T.urartu (Вахитов и др., 1989), и их сравнительный анализ позволили прийти к предварительному заключению о том, что возможными причинами доминирования локуса рДНК генома В над остальными служат определенные особенности его структурной организации. Для подтверждения подобного предположения требовалось исследование какого-либо еще локуса рДНК, проявляющего доминирующий характер, и обнаружение того факта, что при включении в геном мягкой пшеницы хромосомы 1U от диплоидного вида эгилопса Aegilops umbellulata ядрышкообразующие регионы пшеницы (включая локусы рДНК на хромосомах 1В и 6В, также являющихся достаточно сильными) полностью супрессируются (Martini et al., 1982), вызывает к этой проблеме дополнительный интерес. Таким образом, становится ясно, что для лучшего понимания механизмов как супрессии, так и доминирования тех или иных, расположенных на разных хромосомах локусов рДНК гексаплоидной пшеницы, необходимо также знание структурной организации и особенностей функционирования рДНК диплоидного вида эгилопса Ae.umbellulata, обладающего очень мощными ядрышковыми организаторами, чем и был обусловлен выбор этого объекта для данного исследования.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении структурной организации межгенного спейсера рДНК диплоидного эгилопса Ae.umbellulata и роли его отдельных элементов в дифференциальной экспрессии генов рРНК в связи с явлением ядрышкового доминирования.

В задачи исследования входило: 1) изучение геномной организации генов рРНК; 2) клонирование фрагмента повторяющейся единицы рДНК, включающего в свой состав межгенный спейсер; 3) определение структурной организации межгенного спейсера рДНК; 4) секвенирование части межгенного спейсера рДНК, включая промоторную область, субповторы и межгенный транскрибируемый спейсер; 5) сравнительный анализ структурной организации межгенных спейсеров рДНК диплоидного эгилопса Ae.umbellulata с другими представителями трибы пшеницевых; 6) идентификация участков межгенных спейсеров рДНК диплоидного эгилопса Ae.umbellulata и диплоидной пшеницы T.urartu, взаимодействующих с факторами транскрипции .

Научная новизна и практическая ценность. Клонирован фрагмент рДНК диплоидного эгилопса Ae.umbellulata, включающий межгенный спейсер, для большей части которого определена нуклеотидная последовательность. Обнаружено, что в состав межгенного спейсера, кроме промоторной области, входит несколько типов повторяющихся элементов, среди которых превалируют А-, В- и Е-субповторы. Е-тип субповторов выявлен впервые и является уникальным для Ae.umbellula.ta, в отличие от остальных видов трибы пшеницевых, имеющих только единичные копии этой последовательности. Выявлен высокий уровень гомологии Е-субповторов с областью корового промотора генов рРНК. Показано взаимодействие Е-субповторов с экстрактами ядерных белков, содержащими факторы транскрипции. Выдвинуто предположение об участии А-, В- и Е-субповторов в возникновении эффекта ядрышкового доминирования у полиплоидных форм трибы пшеницевых. Результаты исследований на примере диплоидного эгилопса Ае.итЬеПиШа углубляют представление об организации и особенностях функционирования генов рРНК у высших растений.

Практическая значимость работы заключается в выявлении элементов межгенного спейсера, взаимодействующих с присутствующими в экстрактах ядерных белков факторами транскрипции и ответственных, таким образом, за дифференциальную экспрессию генов рРНК у пшениц и их диких сородичей, что может способствовать прогнозированию особенностей интеграции геномов и определению функционального состояния генов рРНК при формировании новых искусственных видов полиплоидных пшениц с ценными хозяйственно-полезными признаками.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на III Всесоюзном совещании по хемосистематике и эволюционной биохимии высших растений (Москва, 1986), V съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров (Москва, 1987), V конференции молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии (Пущино, 1988), III Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (Петрозаводск, 1988), 8-ом двустороннем симпозиуме СССР—ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов" (Иркутск, 1989), конференции "Актуальные проблемы физико-химической биологии и биотехнологии" (Алма-Ата, 1989), VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1990), 10-ом двустороннем симпозиуме СССР— Франция "Организация и экспрессия геномов прокариотических и эукариотических организмов" (Киев, 1991), 4-ом Международном конгрессе по молекулярной биологии растений (Амстердам, 1994), международной конференции, посвященной памяти академика А.Н.Белозерского (Москва, 1995), Всероссийском симпозиуме "Изучение генома и генетическая трансформация растений" (Иркутск, 1999), IV съезде Общества физиологов растений России (Москва, 1999). Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 168 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 145 страницах и содержит 31 рисунок.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Куликов, Александр Маратович

выводы

1. В рекомбинантной плазмиде рАи58 клонирован фрагмент рДНК диплоидного эгилопса Ае.итЪеИиШа, включающий межгенный спейсер, в котором сосредоточены регуляторные элементы, отвечающие за дифференциальный характер экспрессии генов рРНК.

2. Определена нуклеотидная последовательность части межгенного спейсера, включающая промоторную область, отдельные субповторы и зону пре-рРНК, общей протяженностью около 2500 пн.

3. Показано, что в состав межгенного спейсера входит несколько типов повторяющихся элементов, среди которых превалируют А-, В- и Е-субповторы. Е-тип субповторов выявлен впервые и является уникальным для Ае.итЪеИиШа, в отличие от остальных видов трибы пшеницевых, имеющих только единичные копии этой последовательности.

4. Установлено, что Е-субповторы представляют собой инвертированные последовательности, способные формировать жесткие "шпилечные" структуры, которых у Ае.итЪеИиШа оказывается 6 тандемно расположенных копий против одиночных "шпилек" у остальных видов трибы пшеницевых.

5. Обнаружен высокий уровень гомологии Е-субповторов с областью корового промотора генов рРНК и показано их взаимодействие с ядерными белками, содержащими факторы транскрипции, свидетельствующее об участии данных элементов межгенного спейсера рДНК в регуляции процесса транскрипции.

6. Выдвинуто предположение об участии А-, В- и Е-субповторов в проявлении дифференциальной экспрессии генов рРНК, приводящей у полиплоидных форм трибы пшеницевых к эффекту ядрышкового доминирования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выяснение причин, лежащих в основе давно известного феномена ядрышкового доминирования, находится в центре внимания широкого круга исследователей, поскольку ядрышковые организаторы хромосом, будучи легко выявляемыми объектами (достигаемого путем их простого окрашивания азотнокислым серебром или специальными красителями), служили и служат удобным маркерным признаком физиологического состояния организмов. Так, немалое число работ посвящено определению количественных характеристик ядрышек у растений в связи с проблемой адаптации видов к изменяющимся условиям окружающей среды. Долгое время подобные исследования проводились лишь на "фенотипическом" уровне, однако для более уверенной интерпретации получаемых данных возникла необходимость в познании организации ядрышкового "аппарата" клетки. Начиная с середины 60-х годов, после того как стало известно, что в ядрышках локализованы гены рРНК, исследования этих структур перешли на качественно новый уровень. Появление и развитие новых мощных методических приемов дало в руки ученых такие инструменты, которые позволили заняться функциональной "анатомией" генов рРНК и, таким образом, вплотную приблизиться к решению проблемы ядрышкового доминирования.

Представители трибы пшеницевых, помимо того, что среди них имеются важнейшие сельскохозяйственные культуры (новые знания о которых всегда будут актуальными) служат очень удобными объектами для изучения дифференциальной экспрессии генов рРНК, поскольку у них ярко выражено явление ядрышкового доминирования. Сведения о том, что у мягкой гексаплоидной пшеницы ядрышковые организаторы хромосом 1В и 6В доминируют над таковыми хромосом 50 и 1А были получены в конце 50-х годов, однако, только к концу 80-х стало относительно ясно почему это происходит. В то же время, для воссоздания более полной картины проявления у полиплоидных форм пшениц феномена ядрышкового доминирования все же недоставало сведений о тонкой структурной организации генов рРНК и особенностей их функционирования у других видов растений и в том числе у диплоидного эгилопса Ае.итЬе11и1Ма, который, как оказалось, содержит в себе наиболее мощные ядрышковые организаторы хромосом, способные в синтетических гибридах с мягкой пшеницей супрессировать образование ядрышек даже на хромосомах 1В и 6В.

Восполнить этот пробел и была призвана данная работа, в ходе выполнения которой получены приоритетные данные, касающиеся тонкой структурной организации межгенного спейсера рДНК Ае.итЪеИиШа, где сосредоточены промоторная область, субповторы и прочие регуляторные элементы. Так, было обнаружено, что в состав межгенного спейсера входит несколько типов повторяющихся элементов, среди которых превалируют А-, В- и Е-субповторы. При этом Е-тип субповторов, представляющих собой инвертированные последовательности, высоко гомологичные промоторной области, выявлен впервые и является уникальным для Ае.итЪеИиШа, тогда как у остальных видов трибы пшеницевых имеются только единичные копии этой последовательности. Проведенный нами сравнительный анализ межгенных спейсеров рДНК представителей трибы пшеницевых показывает, что виды со слабыми ядрышковыми организаторами (рожь и диплоидная пшеница Т.игагШ) характеризуются отсутствием В-субповторов и относительно небольшим числом субповторов типа А, которых у них всего от 6 до 8. Последний вид, впрочем, содержит в промоторной области довольно необычный мотив, в котором нет канонического ТАТА-бокса, что также может влиять на транскрипционный уровень таких повторов рДНК. Локус рДНК хромосомы 5Б мягкой пшеницы проявляет среднюю степень доминирующей активности и уже несет В-субповторы, а также несколько большее число (от 8 до 10) А-субповторов. Локус ЫогВ2 мягкой пшеницы способен супрессировать образование ядрышек всеми этими хромосомами и отличается от наиболее "сильного" среди них ядрышкового организатора ГЧогОЗ только увеличенным числом А-субповторов, которых у него уже 12. Что касается организации межгенного спейсера рДНК Ае.итЬеИиЫа, то в результате проведенной нами работы стали известны его характерные черты, которые, вероятно, и обеспечивают "превосходство" генов рРНК этого вида. Так, наряду с тем же количеством и "качеством" В-субповторов, что и в локусах рДНК ТЧогБЗ и ЫогВ2, межгенный спейсер Ае.итЬеПиШа содержит уже 18 А-субповторов и 6 субповторов типа Е. Последние высокогомологичны коровому промотору и, видимо отчасти поэтому взаимодействуют с факторами транскрипции. Другой интересной чертой Е-субповторов является то, что каждый из них способен формировать жесткие "шпилечные" структуры, которых у Ае.итЬеПиШа оказывается 6 против одиночных у остальных видов. Таким образом, все эти элементы межгенного спейсера (стандартный промотор с каноническим ТАТА-боксом, дистальные В-субповторы, сильно увеличенное число А-субповторов, дополнительный тип инвертированных Е-субповторов) и дают локусу рДНК Ае.итЪеИиШа, расположенному на хромосоме Ш, преимущества в конкурентной "борьбе" за факторы транскрипции, приводящие в итоге к ядрышковому доминированию.

По завершению данной работы можно сказать, что сделан еще один, важный шаг для понимания причин возникновения ядрышкового доминирования у высших растений. Познание тонких механизмов регуляции транскрипции генома полиплоидных пшениц и, в том числе, такой его важной части, как рДНК, несомненно может позволить в будущем, используя эти сведения, рационально подбирать доноры

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Куликов, Александр Маратович, Уфа

1. Вахитов В.А., Куликов A.M., Чемерис A.B. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов рДНК пшениц и эгилопсов // Генетика. -1988. Т.24. - С.1993-2005.

2. Вахитов В.А., Чемерис A.B., Ахметзянов A.A. Нуклеотидная последовательность межгенного и внешнего транскрибируемого спейсеров рДНК диплоидной пшеницы Triticum urartu Thum, ex Gandil. // Молекуляр. биология. 1989. - Т.23. - С. 336-342.

3. Данилюк Н.К., Ястребов С.И., Артамонова Т.П., Попов С.Г. Упрощенный вариант метода Максама-Гильберта для определения первичной структуры олигонуклеотидов и фрагментов ДНК // Биоорг. химия. 1986.- Т.12. С.1185-1188.

4. Дуброва А.Н. Ядрышковые организаторы хромосом как адаптивныйэлемент вида//Ж. общ. биол. 1989. -Т.1. - С.213-217.

5. Колоша В.О., Фодор И.И. Высокая гомология нуклеотидныхпоследовательностей цистрона 26S рРНК Citrus limon и Saccharomycescerevisiae II Докл. АН СССР. 1986. - Т.290. - С. 1006-1011.

6. Навашин С. О диморфизме ядер в соматических клетках у Galtoniacandicans II Изв. Имп. Акад. Наук. Сер. VI. 1912. - №4. - С.373-385.

7. Навашин С. Гетеро- и идиохромозомы растительного ядра, как причинаядерного диморфизма некоторых видов растений, и значение ядерногодиморфизма в процессе видообразования // Изв. Имп. Акад. Наук. Сер. VI.- 1915. №17. - С.1821-1834.

8. Савельев С.В. Ашапкин В.В., Вильчинскас Р., Ванюшин Б.Ф. Рибосомная ДНК гексаплоидной пшеницы: молекулярное клонирование, рестриктазное картирование, гетерогенность // Молекуляр. биол. 1990. -Т.24. - С.51-57.

9. Хвырлева Ц.Д., Чернышев А.И., Бочканов С.С., Яковлева Е.Ю., Ананьев Е.В. Межсортовой полиморфизм и организация генов 18S-26S рРНК у ячменя. // Генетика. 1987. - Т.23. - С.717-724.

10. Чемерис А.В., Вахитов В.А. Молекулярное клонирование генов рибосомных РНК диплоидной пшеницы Triticum urartu Thum ex Gandil. // Молекуляр. биология. 1987. - T.21. - С. 1092-1098.

11. Чемерис А.В., Вахитов В.А. Первичная структура гена 5,8S рРНК и внутренних транскрибируемых спейсеров рДНК у диплоидной пшеницы Triticum urartu Thum. ex Gandil. // Молекуляр. биология. 1989. - Т.23. -С.320-326.

12. Agarwal M.L., Aldrich J., Agarwal A., Cullis C.A. The flax ribosomal RNA-encoding genes are arranged in tandem at a single locus interspersed by 'non-rDNA' sequences // Gene. 1992. - V.120. - P. 151-156.

13. Appels R., Dvorak J. Relative rates of divergence of spacer and gene sequence within the rDNA region of species in the Triticeae: implications for themaintenance of homogeneity of a repeated gene family // Theor. Appl. Genet. -1982b. -V.63. -P.361-365.

14. Appels R., Gerlach W.L., Dennis E.S., Swift., Peacock W.J. Molecular and chromosomal organization of DNA sequences coding for the ribosomal RNAs in cereals // Chromosoma. 1980. - V. 78. - P. 293-311.

15. Appels R., Moran L.B., Gustafson J.P. The structure of DNA from the rye Secale cereale) nor rl locus and its behaviour in wheat backgrounds // Can. J. Genet. Cytol. 1986. - V.28. - P.673-685.

16. Borisjuk N.V., Davidjuk Y.M., Kostishin S.S., Miroshnichenco G.P., Velasco R., Hemleben V. Structural analysis of rDNA in the genus Nicotiana II Plant Mol. Biol. 1997. - V.35. - P.655-660.

17. Borisjuk N., Hemleben V. Nucleotide sequence of the potato rDNA intergenic spacer//Plant Mol. Biol. 1993. - V.21. - P.381-384.

18. Buescher P.J., Phillips R.L., Brambl R. Ribosomal RNA contents of maize genotypes with different ribosomal RNA gene number // Biochem. Genet. -1984. V.22. -P.923-930.

19. Capesius I. Nucleotide sequence of a 25S rRNA gene from mustard (Sinapis alba) II Plant Mol. Biol. 1991. - V. 16.-P. 1093-1094.

20. Carroza M.L., Giorgi L., Cremonini R. Nuclear DNA content and number of ribosomal RNA genes in cultivars and selected lines of Durum wheat // Z. Pflanzenzuchtg. 1980. - V.84. - P.284-293.

21. Cassidy, D.M., Blackler, A.W. Repression of nucleolar organizer activity in an interspecific hybrid of the genus Xenopus II Dev. Biol. 1974. - V.41. - P.84-96.

22. Castilho A., Heslop-Harrison J.S. Physical mapping of 5S and 18S-25S rDNA and repetitive DNA sequences in Aegilops umbellulata // Genome. 1995. -V.38. - P.91-96.

23. Chatterton N.J., Hsiao C., Asay K.H., Wang R.R-C., Jensen K.B. Nucleotide sequence of internal transcribed spacer region of rDNA in wheat, Triricum speltoides L. (Tausch.) Gren. ex Richter (Gramineae) // Plant Mol. Biol. -1992a. -V.20. -P.157-158.

24. Chatterton N.J., Hsiao C., Asay K.H., Wang R.R-C., Jensen K.B. Nucleotide sequence of the internal transcribed spacer region of the rDNA in wheat, Triticum aestivum L. (Gramineae) II Plant Mol. Biol. 1992b. - V.20. - P. 159160.

25. Chatterton N.J., Hsiao C., Asay K.H., Jensen K.B., Wang R.R-C. Nucleotide sequence of internal transcribed spacer region of rDNA in the primitive oatspecies, Avena longiglumis Durieu (Gramineae) // Plant Mol. Biol. 1992c. -V.20. - P.163-164.

26. Chipchase M.I.H., Birnstiel M. On the nature of nucleolar RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1963. - V.50. - P.l 101-1107.

27. Cohen S.N., Chang A.C.Y., Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1972. - V.69. - P.2110-2114.

28. Crosby A.R. Nucleolar activity of lagging chromosome in wheat. // Amer. J. Bot.- 1957.-V. 44.-P. 813-822.

29. Cullis C.A. Environmental induction of heritable changes in flax: defined environments inducing changes in rDNA and peroxidase isozyme band pattern // Heredity. 1981. - V.47. - P.87-94.

30. Danna K.J. Determination of fragment order through partial digest and multiple enzyme digest // In: Methods in Enzymology. Acad. Press. New York, 1980. -V.65. - P.449-467.

31. Doelling J.H., Gaudino R., Pikaard C.S. Functional analysis of Arabidopsis thaliana rRNA gene and spacer promoters by transient expression // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V.90. - P.7528-7532.

32. Doelling, J.H., Pikaard, C.S. Transient expression in Arabidopsis thaliana protoplasts derived from rapidly established cell suspension culture // Plant Cell Rep. 1993. - V.12. - P.241-244.

33. Eckenrode V.K., Arnold J., Meagher R.B. Comparison of the nucleotide sequences of Glycine max and other small-subunit rRNAs // J. Mol. Evol. -1985. V.21. - P.259-269.

34. Ellis T.H.N., Delseny M., Lee D., Burcham K.W.G. Methylated and undermethylated rDNA repeats are interspersed at random in two higher plant species // Plant Mol. Biol. 1989. - V. 14. - P. 73-80.

35. Flavell R.B. Repeated sequences and genome change // In: Genetic Flux in Plants. Springer; Wien, New York. 1985. - P. 139-156.

36. Flavell R.B. The structure and control of expression of ribosomal RNA genes // Oxford Surv. Plant Mol. Cell Biol. 1986. - V.3. - P.252-274.

37. Flavell R.B., O'Dell M. Ribosomal RNA genes on homoeologous chromosomes of group 5 and 6 in hexaploid wheat // Heredity. 1976. - V.37. -P.377-385.

38. Flavell R.B., O'Dell M. The genetic control of nucleolus formation in wheat // Chromosoma. 1979. - V. 71. - P. 135-152.

39. Flavell R.B., O'Dell M., Thompson W.F. Regulation of cytosine methylation in ribosomal DNA and nucleolus organizer expression in wheat // J. Mol. Biol. -1988. V.204. - P.523-534.

40. Flavell R.B., Smith D.B. The role of homoeologous group 1 chromosomes in the control of rRNA genes in wheat // Biochem. Genet. 1974. - V.12. - P.271-279.

41. Fribe B., Kim N-S, Kuspira J., Gill B.S. Genetic and cytogenetic analyses of the A genome of Triticum monococcum. VI. Production and identification of primery trisomies using the C-banding technique \\ Genome. 1990. - V.33. -P.542-555.

42. Friedrich H., Hemleben V., Meagher R.B., Key J.L. Purification and restriction mapping of soybean 18S and 25S ribosomal RNA genes // Planta. 1979. -V.146. - P.467-473.

43. Garoff, H., Ansorge, W. Improvements of DNA sequencing gels // Anal. Biochem. 1981. - V. 115. - P.450-457.

44. Gerbi S.A. Evolution of ribosomal DNA In: Molecular evolutionary genetics (ed. R.J. Mclntyre). Plenum Press, New York, 1985. P.419-517. Gerbi S.A. The evolution of eukaryotic ribosomal DNA // BioSystems. - 1986. - V.19.-P.247-258.

45. Grierson D. RNA processing and other post-transcriptional modification // In: Nucleic Acids and proteins in plants.- Springer; Berlin. 1982. - V.2. - P. 192223.

46. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids // J. Mol. Biol. 1983. - V.166. - P.557-580.

47. Hemleben V., Grierson D. Evidence that in higher plants the 25S and 18S rRNA genes are not interspersed with genes for 5S rRNA // Chromosoma. -1978. V.65. - P.353-358.

48. Honjo T., Reeder R.H. Preferential transcription of Xenopus laevis ribosomal RNA in interspecies hybrids between X.laevis and X.mulleri II J. Mol. Biol. -1973. V.80. -P.217-228.

49. Houchins K., O'Dell M., Flavell R.B., Gustafson J.P. Cytosine methylation and nucleolar dominance in cereals hybrids // Mol. Gen. Genet. 1997. - V.255. -P.294-301.

50. Hsiao C., Chatterton N.J., Asay K.H., Jensen K.B. Phylogenetic relatioships of 10 grass species: an assessment of phylogenetic utility of the internal transcribed spacer region in nuclear ribosomal DNA in monocots // Genome. -1994. -V.37. -P.l 12-120.

51. Hsiao C., Chatterton N.J., Asay K.H., Jensen K.B. Molecular phylogeny of the Pooideae {Poaceae) based on nuclear rDNA (ITS) sequences // Theor. Appl. Genet. 1995a. - V.90. - P.389-398.

52. Hsiao, C., Chatterton, N.J., Asay, K.H., Jensen, K.B. Phylogenetic relationships of the monogenomic species of the wheat tribe, Triticeae (Poaceae), inferred from nuclear rDNA (internal transcribed spacer) sequences // Genome. 1995b. -V.38.-P.211-223.

53. Humphreys G.O., Weston A., Brown M.G.M., Saunders J.R. Plasmid transformation of Escherichia coli II In: Transformation. Proc. 4th Eur. Meet. Bacter. Transform. Transfect. George Allen & Unwin; London, 1979. - P. 287-312.

54. Hutchinson J., Miller T.E.The nucleolar organisers of tetraploid and hexaploid wheats revealed by in situ hibridisation \\ Theor. Appl. Genet. -1982. V.61. -P.285-288.

55. Jackson, S.D., Flavell, R.B. Protein-binding to reiterated motifs within the wheat rRNA gene promoter and upstream repeats // Plant Mol. Biol. 1992. -V.20. -P.911-919.

56. Jiang J., Gill B.S. New 18S.26S ribosomal RNA gene loci: chromosomal landmarks for the evolution of polyploid wheats // Chromosoma. 1994. -V.103. -P.179-185.

57. Jorgensen R.A., Cuellar R.E., Thompson W.F. Modes and tempos in the evolution of nuclear-encoded ribosomal RNA genes in legumes // Carnegie Institute Year book' 81. 1982. - P.98-101.

58. Karvonen P., Karjalainen M., Savolainen O. Ribosomal RNA genes in Scots pine (Pinus sylvestris L.): chromosomal organization and structure // Genetika. 1993. - V.88. -P.59-68.

59. Katayama S., Hirano H.-Y., Tsukaya H., Naito S., Komeda Y. Analysis of intergenic spacer region in the nuclear rDNA of Pharbitis nil II Genome. -1992. V.35.-P. 92-97.

60. Kopp E., Mayr B., Schleger W. Species-specific non-expression of ribosomal RNA genes in a mammalian hybrid, the mule // Chromosoma. 1986. - V.94. -P.346-352.

61. Martienssen R.A., Richards E.J. DNA methylation in eukaryotes // Curr. Opin. Genet. Dev. 1995. - V.5. - P.234-242.

62. Martini G., Flavell R.B. The control of nucleolus volume in wheat: a genetic study at three developmental stages // Heredity. 1985. - V.54. - P.l 11-120.

63. Martini G., O'Dell M., Flavell R.B. Suppression of wheat nucleolus organizers by the nucleolus organizer chromosomes from Aegilops umbellulata II Chromosoma. 1982. - Y.84. - P.687-700.

64. May C.E. Selection for ribosomal-RNA gene numbers in commercial wheats // Proceedings of the 9th International Wheat Genetics Symposium. Saskatoon, Canada, 1998. - V.l. - P.95-98.

65. May C.E., Appels R. Variability and genetics of spacer DNA sequences between the ribosomal-RNA genes of hexaploid wheat (Triticum aestivum) II Theor. Appl. Genet. 1987. - V. 74. - P. 617-624.

66. Maxam A.M., Gilbert W. A new method for sequencing DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - V.74. - P.560-564.

67. McMullen M.D., Hunter B., Phillips R.L., Rubenstein I. The stricture of the maize ribosomal DNA spacer region // Nucl. Acids Res. 1986. - V.14. -P.4953-4968.

68. Messing J., Carlson J., Hagen G., Rubinstein I., Oleson A. Cloning and sequencing of the ribosomal RNA genes in maize: The 17S region // DNA. -1984. V.3.-P.31-40.

69. Miller O.J., Miller D.A., Dev V.G., Tantravahi R., Croce C.M. Expression of human and supression of mouse nucleolus organizer activity in mouse-humansomatic cell hybrids // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. - V.73. P.4531-4535.

70. Miller O.L., Jr. The nucleolus, chromosomes, and visualization of genetic activity // J. Cell Biol. 1981. - V.91. - P.15S-27S.

71. Miller Т.Е., Gerlach W.L., Flavell R.B. Nucleolus organizer variation in wheat and rye revealed by in situ hybridisation // Heredity. 1980. - V.45. - P. 377382.

72. Miesfeld R., Sollner-Webb В., Croce C., Arnheim N. The absence of a human-specific ribosomal DNA transcription factor leads to nucleolar dominance in mouse greater than human hybrid cells // Mol. Cell Biol. 1984. - V.4. -P.1306-1312.

73. Neves N., Silva M., Heslop-Harrison J.S., Viegas W. Nucleolar dominance in triticales: control by unlinked genes // Chromosome Res. 1997. - V.5. - P. 125131.

74. Olmedilla A., Delcasso D., Delseny M. Methylation pattern of nuclear ribosomal RNA genes from rice (Oryza sativa) II Plant Sci. Lett. 1984. - V.37. - P.123-127.

75. Oono K., Sugiura M. Heterogeneity of the ribosomal RNA gene clusters in rice // Chromosoma. 1980. - V76. - P.85-89.

76. Owen-Hughes T., Workman J.L. Experimental analysis of chromatin function in transcription control // Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 1994. - V.4. -P.403-441.

77. Paldi E., Devay M. Relationship between the cold-induced rRNA synthesis and the rRNA cistron number in wheat cultivars with varying degrees of frost hardiness // Plant Sci. Lett. 1983. - V. 30. - P. 61-67.

78. Phillips R.L., Wang S.S., Weber D.F., Kleese R.A. The nucleolar organizer in maize // Genetics. 1973. V.74. P.212.

79. Pikaard, C.S., Chen, Z.J. Nucleolar dominance. In Transcription of ribosomal RNA genes by eukaiyotic RNA polymerase I (ed. Paule M.R.). R.G. Landes, Austin, TX. 1998. - P.277-294.

80. Reddy P.S., Padayatty J.D. rDNA repeat unit in rice variety IR-20 // Ind. J. Biochem. Biophys. 1987. - V.24. - P.293-295.

81. Reeder R.H. Enhancers and ribosomal gene spacers // Cell. 1984. - V.38. -P.349-351.

82. Ritossa F.M., Spiegelman S. Localization of DNA complementary to ribosomal RNA in the nucleolus organizer region of Drosophila melanogaster II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1965. - V.53. - P.737-745.

83. Saghai-Maroof M.A., Soliman K.M., Jorgensen R.A., Allard R.W. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - V.81. - P.8014-8018.

84. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A laboratory manual, 1989. Second Edn. Cold Spring Harbor. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1682 P.

85. Schnapp A., Rosenbauer H., Grummt I. Trans-acting factors involved in species-specificity and control of mouse ribosomal gene transcription // Mol. Cell. Biochem. 1991. - V.104. - P.137-147.

86. Sealey P.G., Southern E.M. Gel electrophoresis of DNA // In: Gel Electrophoresis of Nucleic Acids. A practical approach. IRL Press. Oxford, 1982.-P.39-76.

87. Takaiwa F., Oono K., Iida Y., Sugiura M. The complete nucleotide sequence ofa rice 25S rRNA gene // Gene. 1985a. - V.37. - P.255-259.

88. Takaiwa F., Oono K., Sugiura M. The complete nucleotide sequence of a rice17S rRNA gene //Nucl. Acids Res. 1984. - V.12. - P.5441-5448.

89. Takaiwa F., Oono K., Sugiura M. Nucleotide sequence of the 17S 25S spacerregion from rice rDNA // Plant Mol. Biol. 1985b. - V.4. - P.355-362.

90. Thompson W.F., Flavell R.B. DNase I sensitivity of ribosomal RNA genes inchromatin and nucleolar dominance in wheat // J. Mol. Biol. 1988. - V.204. 1. P.535-548.

91. Toloczyki C., Feix G. Occurrence of 9 homologous repeat unit in the external spacer region of a nuclear maize rRNA gene unit // Nucl. Acids Res. 1986. -V. 14. - P.4969-4985.

92. Tucci G.F., De Dominies R.I., Ficca A.G., Celi M., Gregori C. Nucleoli, rRNA genes and ITS region in Posidonia oceanica (L.) Delile // Hereditas. 1998. -V.129. - P.59-65.

93. Unfried I., Stocker U., Gruendler P. Nucleotide sequence of the 18S rRNA gene from Arabidopsis thaliana Co 10 // Nucl. Acids Res. 1989. - V.17. -P.7513.

94. Van Loon L.C., Trewaras A., Chapman K.S.R. Phosphorylation of chromatin-associated proteins in Lemna and Hordeum // Plant Physiol. 1975.- V.55.-P.288-292.

95. Vincentz M., Flavell R.B. Mapping of ribosomal RNA transcripts in wheat // Plant Cell. 1989. - V.l. - P.579-589.

96. Walker T.A., Pace N.R. 5.8S ribosomal RNA // Cell. 1983. - V. 33. - P. 320322.

97. Wallace H., Birnstiel M.L. Ribosomal cistrons and nucleolar organizer // Biochim. Biophys. Acta. 1966. - V. 114. - P.296-310.

98. Yakura K., Tanifuji S. Molecular cloning and restriction analysis of EcoRI-fragments of Vicia faba rDNA // Plant Cell Physiol. 1983. - V.24. - P. 13271330.

99. Zentgraf U., Ganal M., Hemleben V. Length heterogeneity of the rRNA precursor in cucumber (Cucumis sativus) // Plant Mol. Biol. 1990. - V.15. -P.465-474.

100. Zhang Q.F., Saghai-Maroof M.A., Allard R.W. Effects on adaptedness of variations in ribosomal DNA copy number in populations of wild barley (Hordeum vulgare ssp. spontaneum) II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1990. -V.87. - P.8741-8745.

101. Zimmer E.A., Jupe E.R. Walbot V. Ribosomal gene structure, variation and inheritance in maize and its ancestors // Genetics. 1988. - V.120. - P.1125-1136.