Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние аналогов малых ядрышковых РНК на экспрессию генов человека

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние аналогов малых ядрышковых РНК на экспрессию генов человека"

На правах рукописи

СТЕПАНОВ ГРИГОРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ВЛИЯНИЕ АНАЛОГОВ МАЛЫХ ЯДРЫШКОВЫХ РНК НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2013

005545611

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химической биологии и фундаментальной медицины

СО РАН

Научный руководитель:

к.х.н., доцент Семенов Дмитрий Владимирович

Официальные оппоненты:

Карпова Галина Георгиевна, д.х.н., профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, зав. лабораторией

Карпенко Лариса Ивановна, д.б.н., доцент, Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», зав. лабораторией

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится « 20 » декабря 2013 г. в 12— часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, пр-кт ак. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан « » 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

Коваль В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Разработка новых искусственных регуляторов экспрессии генов на основе знаний о структуре и функциях малых некодирующих РНК (нкРНК) является важной задачей фундаментальной науки и практической медицины. К настоящему времени результаты многих работ убедительно показали эффективность применения синтетических аналогов коротких антисмысловых РНК для осуществления контроля над процессами жизнедеятельности клеток человека и стимулировали поиск новых природных механизмов регуляции экспрессии генов. Поскольку малые нкРНК выполняют в клетках разнообразные функции, они представляют собой перспективную основу для разработки искусственных модуляторов экспрессии генов. К классу нкРНК относятся малые ядрышковые РНК (мяоРНК), которые содержат в своей структуре так называемые С- и D-боксы (C/D-бокс-мяоРНК) или Н- и АСА-боксы (Н/АСА-бокс-мяоРНК). Эти РНК играют ключевую роль в пост-транскрипционной модификации нуклеотидов рРНК клеток эукариот. В комплексе со специфическим набором белков C/D-бокс-РНК направляют 2'-0-метилирование нуклеотидов рРНК, Н/АСА-бокс-РНК -псевдоуридилирование рРНК. Недавние исследования показали, что мяоРНК обладают широким спектром функций, которые не ограничиваются их участием в ядрышковом созревании рРНК. Некоторые мяоРНК вовлечены в процессы регуляции сплайсинга, пост-транскрипционной модификации нуклеотидов пре-мРНК и трансляции мРНК. Малые ядрышковые РНК, а также их микроРНК-подобные фрагменты транспортируются в цитоплазму клеток и секретируются во внеклеточное пространство, где они могут играть роль переносчиков внутри- и межклеточных сигналов. Исследования экспрессии генов C/D-бокс-РНК и Н/АСА-бокс-РНК в различных тканях млекопитающих показали, что изменение уровня этих РНК может быть напрямую связано с развитием заболеваний человека и животных.

Таким образом, изучение механизмов функционирования малых ядрышковых РНК и исследование нарушения экспрессии их генов в клетках могут открыть новые перспективы для разработки диагностических подходов и создания новых терапевтических средств.

Целью настоящей работы являлось исследование влияния синтетических аналогов малых ядрышковых C/D-бокс-РНК на экспрессию генов в клетках человека.

В ходе работы необходимо было решить следующие задачи:

- сконструировать и синтезировать аналоги малых ядрышковых C/D-бокс-РНК, направленные на нуклеотиды 18S и 28S рРНК человека, участвующие в формировании ключевых функциональных центров рибосом, а также на нуклеотиды, критичные для сплайсинга пре-мРНК гена белка теплового шока HSPA8;

- адаптировать метод определения первичной структуры РНК и

методы выявления 2'-0-метилированных нуклеотидов в составе рибосомных РНК к использованию обратной транскриптазы вируса лейкемии мышей Молони (M-MLV);

- исследовать влияние аналогов C/D-бокс-РНК на 2'-0-метилирование нуклеотидов рибосомных РНК в клетках человека;

- исследовать влияние аналогов C/D-бокс-РНК на уровень мРНК гена HSPA8 в клетках человека;

- провести анализ влияния аналогов C/D-бокс-РНК на жизнеспособность клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7;

- провести анализ изменения транскриптома клеток человека под действием синтетических аналогов C/D-бокс-РНК методом гибридизации РНК на полнотранскриптомных чипах Illumina.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе создан уникальный набор аналогов малых ядрышковых C/D-бокс-РНК, направленных на модификацию заданных нуклеотидов разных видов РНК. С помощью трансфекции раковых клеток человека MCF-7 созданными аналогами выявлены характеристические особенности влияния C/D-бокс-РНК на экспрессию генов и продемонстрирована возможность контролировать процессинг РНК-мишеней с помощью аналогов мяоРНК. Показано, что аналоги C/D-бокс-РНК, направленные на нуклеотиды рРНК влияют на пост-транскрипционное созревание рРНК-мишеней, а именно, вызывают увеличение глубины природного 2'-0-метилирования нуклеотидов этих РНК. Под действием аналогов C/D-бокс-РНК, направленных на нуклеотиды, критичные для сплайсинга пре-мРНК гена HSPA8, происходит снижение уровня мРНК терапевтически-значимого гена-мишени в клетках MCF-7, сопровождаемое частичным нарушением сплайсинга пре-мРНК. В ходе работы проведен сравнительный анализ индивидуального цитотоксического действия разных аналогов C/D-бокс-РНК на клетки человека MCF-7, а также действия C/D-бокс-РНК в комбинации с набором цитотоксических агентов. Впервые проведен полнотранскриптомный анализ изменения уровня экспрессии генов в клетках человека, трансфицированных аналогами C/D-бокс-РНК, и выявлены регуляторные каскады, которые активируются в клетках под действием этих РНК. Полученные результаты закладывают базис для разработки искусственных регуляторов экспрессии генов на основе структурных особенностей C/D-бокс-мяоРНК.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы и получен Патент РФ. Результаты работы представлены на конференциях: «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2009, 2010, 2012), «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2008, 2012), «Химическая биология - фундаментальные проблемы бионанотехнологии» (Новосибирск, 2009), международной

конференции «The EMBO meeting 2010: advancing the life sciences» (Барселона, Испания, 2010), первом симпозиуме «Supramolecular chemistry for materials and life sciences» (Новосибирск, 2010), международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 85-летию академика Д.Г. Кнорре (Новосибирск, 2011), 4-ом международный конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), 16-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2012), «Postgenomic Technology for Biomedicine» (Новосибирск, 2012), симпозиуме EMBOIEMBL «The Complex Life of mRNA» (Гейдельберг, Германия, 2012), международной конференции «High-throughput Sequencing in Genomics» (Новосибирск, 2013), 38-ом конгрессе FEBS «Mechanisms in Biology» (Санкт-Петербург, 2013).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 152 страницах, содержит 40 рисунков и 8 таблиц. Библиография содержит 297 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.1 Структура и синтез аналогов C/D-бокс-РНК человека

Для изучения свойств аналогов C/D-бокс-РНК человека были сконструированы серии олигодезоксирибонуклеотидных ДНК-матриц и праймеров, содержащих промотор РНК-полимеразы фага Т7. Схема синтеза C/D-бокс-РНК включала в себя стадии получения двуцепочечных ДНК-матриц методом ПЦР и транскрипцию РНК in vitro (Рисунок 1). Полученные аналоги содержали консервативные участки, а именно, С(С')- и D(D')-6oKCbi, идентичные малым ядрышковым РНК человека. В структуру искусственных C/D-бокс-РНК были включены измененные последовательности областей узнавания мишени, которые были комплементарны разным РНК клеток человека (Таблица 1).

Области узнавания у синтетических C/D-бокс-РНК были сконструированы таким образом, чтобы направлять 2'-0-метилирование в заранее заданные нуклеотиды 28S и 18S рРНК человека и нуклеотиды пре-мРНК гена HSPA8. Мишенями аналогов C/D-бокс-РНК являются нуклеотиды рРНК или пре-мРНК, комплементарные пятым нуклеотидам от D(D')-6okcob синтетических РНК (Таблица 1).

С-бокс

праймер 1

О'-бокс С'-бокс области узнавания мишени

СивА

Р-бокс

3. матрица I т праймер 2

ТАТА-бок«

ПЦР

транскрипция с помощью РНК-полимеразы фага Т7

ДНК-матрица

АиСАиви

]си] СиСА

С-бокс * Р'-бокс С'-бокс 1 О-бокс

т

область узнавания область узнавания мишени О'-бокса мишени О-бокса

Рис. 1. Структура и синтез аналогов С Ю-бокс-РНК. (А)

Структура и24 малой ядрышковой С/Б-бокс-РНК человека. (Б) Схема синтеза аналогов С/Б-бокс-РНК.

1.2 Анализ проникновения и локализации синтетических аналогов С/Б-бокс-РНК в клетках человека

Для оценки эффективности проникновения синтетических аналогов СЮ-бокс-РНК в клетки человека мы синтезировали флуоресцентно меченый аналог РНК8 и анализировали накопление этой РНК в клетках МСР-7 методами флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии. Было установлено, что РАМ-меченый аналог С/Б-бокс-РНК в комплексе с трансфицирующим агентом липофектамином эффективно проникает в клетки МСР-7 и детектируется в них через 24 ч после трансфекции (Рисунок 2).

Рис. 2. Локализация аналогов СЮ-бокс-РНК в клетках МСР-7. Фотографии трансфицированных (А - В) и контрольных (Г - Е) клеток в поле флуоресцентного микроскопа: (А) и (Г) - флуоресценция РАМ; (Б) и (Д) -флуоресценция ОАР1; (В) и (Е) - наложение двух изображений.

А • Б В

Г Д Е

Таблица 1. Последовательности аналогов СЯ)-бокс-РНК и дезоксирибоолигонуклеотиды, используемые для синтеза ДНК-матриц_

Обозначение аналога C/D-бокс-РНК Последовательность 5'—>3' (длина)* Мишень**

РНК1 GGGUGCAGAUGAUGUAAAAUAGCGACGGGCGGUGCUGAGAGAUGGUGAUGACC UUGUUACGACUUUCUGAUGCACCC (77 н.) I: G1702 18S рРНК И: U1827 18S рРНК

РНК1_4А GGGUGCAGAUGAUGUAAAAUAGCGACGGGCGGUGCUGAGAGAUGGUGAUGAAA AACCUUGUUACGACUUUCUGAUGCACCC (81 н.) I: G1702 18S рРНК II: U1827 18S рРНК

РНК1_6А GGGUGCAGAUGAUGUAAAAUAGCGACGGGCGGUGCUGAGAGAUGGUGAUGAAA AAAACCUUGUUACGACUUUCUGAUGCACCC (83 н.) I: G1702 18S рРНК II: U1827 18S рРНК

PHK1_8N GGGUGCAGAUGAUGUAAAAUAGCGACGGGCGGUGCUGAGAGAUGGUGAUGACA UUUUAACCUUGUUACGACUUUCUGAUGCACCC (85 н.) I: G1702 18S рРНК И: U1827 18S рРНК

РНКЗ GGGUGCAGAUGAUGUAAAAUAGCGACGGGCGGUGCUGAGAGAUGGUGAUGAAC GGUCUAAACCCAGCUGAUGCACCC (77 н.) I: G1702 18S рРНК II: G4499 28S рРНК

РНК4 GGGUGCAGAUGAUGUAAAAUAGCGACGGGCGGUGCUGAGAGAUGGUGAUGAGA CGGUCUAAACCCACUGAUGCACCC (77 н.) I: G1702 18S рРНК II: U4500 28S рРНК

РНК5 GGGUGCAGAUGAUGUAAAAUAGCGACGGGCGGUGCUGAGAGAUGGUGAUGAAC GACGGUCUAAACCCUGAUGCACCC (77 н.) I: G1702 18S рРНК II: U4502 28S рРНК

PHK5D/N GGGUGCAGAUGAUGUAAAAUAGCGACGGGCGGUGAGUCGAGAUGGUGAUGAAC GACGGUCUAAACCAGUCUGCACCC (77 н.) I: G1702 18S рРНК II: U4502 28S рРНК

PHKSmD GGGUGCAGAUGAUGUAAAAUAGCGACGGGCGGUGAAAAGAGAUGGUGAUGAAC GACGGUCUAAACCAAAAUGCACCC (77 н.) I: G1702 18S рРНК II: U4502 28S рРНК

РНК5шС GGGUGCAGACAGCACAAAAUAGCGACGGGCGGUGCUGAGAGAUGGCAGCAGAC GACGGUCUAAACCCUGAUGCACCC (77 н.) I: G1702 18S рРНК II: U4502 28S рРНК

PHK5mCD GGGUGCAGACAGCACAAAAUAGCGACGGGCGGUGAAAAGAGAUGGCAGCAGAC GACGGUCUAAACCAAAAUGCACCC (77 н.) I: G1702 18S рРНК II: U4502 28S рРНК

РНК7 GGGUGCAGAUGAUGUAAAAUAGCGACGGGCGGUGCUGAGAGAUGGUGAUGACA I: G1702 18S рРНК

AAUGAAAACACUUUCAAUCUGAUGCA (79 н.) II: А1411 HSPA8

PHK7mD GGGUGCAGAUGAUGUAAAAUAGCGACGGGCGGUGAAAAGAGAUGGUGAUGACA AAUGAAAACACUUUCAAUAAAAUGCA (79 н.) I: G1702 18S рРНК II: А1411 HSPA8

РНК8 GGGUGCAGAUGAUGUAAAAUAGCGACGGGCGGUGCUGAGAGAUGGUGAUGAAA AUUAGGAACUCACCAAAACUGAUGCA (79 н.) I: G1702 18S рРНК II: Gll17 HSPA8

PHK8mD GGGUGCAGAUGAUGUAAAAUAGCGACGGGCGGUGAAAAGAGAUGGUGAUGAAA AUUAGGAACUCACCAAAAAAAAUGCA (79 н.) I: G1702 18S рРНК II: GllП HSPA8

РНК9 GGGUGCAGAUGAUGUAAAAUAGCGACGGGCGGUGCUGAGAGAUGGUGAUGAAA AUUAGGAACUCACCAAACUGAUGCA (78 н.) I: G1702 18S рРНК II: G1118 HSPA8

РНК 10 GGGUGCAGAUGAUGUAAAAUAGCGACGGGCGGUGCUGAGAGAUGGUGAUGAAU CAGACGUUUGGCAUCUGUCUGAUGCA (79 н.) I: G1702 18S рРНК II: А1439 HSPA8

РНК 11 GGGUGCAGAUGAUGUAAAAUAGCGACGGGCGGUGCUGAGAGAUGGUGAUGAUC AGACGUUUGGCAUCUGUACUGAUGCA (79 н.) I: G1702 18S рРНК П: G1438 HSPA8

РНК 12 GGGUGCAGAUGAUGUAAAACAAAUGAAAACACUUUCAAUCUGAGAGAUGGUGA UGACAAAUGAAAACACUUUCAAUCUGAUGCA (84 н.) I: А1411 HSPA8 II: А1411 HSPA8

РНК25 GGGUUCCUAUGAUGAGGACCUUUUCACAGACCUGUACUGAGCUCCGUGAGGAU AAAUAACUCUGAGGAGA (70 н.) G1490 18S рРНК

РНК4518 GACUCAGCAUGCGUGUUCAUGCUAUGAUGAAAAAGUCAACUUAGGCGUGGUUG UGGCCUAAAACUAACCUGUCUCUGAUGGCAGAGGCAUGCUGAGUC (98 н.) А4518 28S рРНК

Примечание: * - в последовательности аналогов СЯ)-бокс-РНК подчеркиванием выделены области комплементарное™ к РНК-мишеням; С- и Б-боксы, а также заменяющие их последовательности выделены жирным шрифтом;

** - указан нуклеотид РНК-мишени, комплементарный пятому нуклеотиду аналога C/D-бокс-РНК от D'- и D-бокса. Номера нуклеотидов рРНК человека приведены в соответствии с GenBank: U13369 (7935-12969 н.) для 28S рРНК и Х03205 для 18S рРНК. Номера нуклеотидов пре-мРНК гена HSPA8 (NCBI RefSeq NM_006597.4) - в соответствии с геномом человека GRCh37/hgl9.

Для изучения распределения аналога СЛ)-бокс-РНК внутри трансфицированных клеток мы проводили выделение ядерной и цитоплазматической фракций РНК клеток МСБ-7 и анализ распределения синтетической РНК во фракциях методом ОТ-ПЦР. Как видно из данных Рисунка 3, аналог СЮ-бокс-РНК присутствует как в цитоплазматической, так и в ядерной фракциях трансфицированных клеток. С использованием 5'-[32Р]-радиоактивно меченых аналогов СЛЭ-бокс-РНК также было показано, что полноразмерные синтетические РНК сохраняются как в цитоплазме, так и в ядрах клеток МСР-7 в течение, как минимум, трех суток после трансфекции.

Время трансфекции, ч 3 3 21 21 26 21 3 3 21 21 26 21

Аналог СЛЭ-бокс-РНК + + + + + - + + + + + -Липофектамин - +- + + + - + . + + +

П. н. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

400-> 300—> 200-> 100—> WÊ ■■в : ll|§|í ¿II «■i

ядерная фракция цитоплазматическая фракция

Рис. 3. Стабильность и распределение аналога C/D-бокс-РНК в клетках MCF-7. Электрофоретическое разделение продуктов ОТ-ПЦР ядерной и цитоплазматической РНК трансфицированных (дорожки 1-5 и 7-11) и контрольных (дорожки 6 и 12) клеток MCF-7 с праймерами, специфичными к последовательности аналога C/D-бокс-РНК. Трансфекцию РНК8 в клетки проводили либо с применением липофектамина (дорожки 2, 4, 5, 8, 10 и 11), либо в условиях пассивной трансфекции (дорожки 1, 3, 7 и 9) в течение 3, 21 и 26 ч. M - маркер молекулярной массы ДНК.

1.3 Влияние аналогов C/D-бокс-РНК на 2'-0-метилирование нуклеотидов рРНК

Для анализа влияния аналогов C/D-бокс-РНК на процессинг рРНК синтезировали аналоги мяоРНК, направленные на заранее заданные нуклеотиды рРНК человека. В качестве мишеней синтетических C/D-бокс-РНК были выбраны нуклеотиды 28S и 18S рРНК человека, входящие в состав или находящиеся вблизи ключевых функциональных центров 80S рибосом: пептидилтрансферазного цетра- G4499, U4500, U4502 и А4518 28S рРНК и декодирующего центра- G1702 и U1827 18S рРНК (Таблица 1).

Для выявления 2'-0-метилированных нуклеотидов в составе рРНК мы использовали два метода: метод ограниченного щелочного гидролиза и метод терминации обратной транскрипции. Оба эти метода основаны на проведении ОТ анализируемой РНК с радиоактивно меченым праймером и разделении кДНК-продуктов электрофорезом в секвенирующем ПААГ с последующей авторадиографией. Для определения точного положения модифицированного нуклеотида в составе анализируемой РНК одновременно с продуктами ОТ в том же геле проводят разделение продуктов секвенирования РНК-матрицы. В ходе данной работы был разработан и запатентован способ определения первичной структуры РНК, позволяющий секвенировать протяженные РНК с использованием обратной транскриптазы M-MLV и дидезоксинуклеозидтрифосфатов в качестве ее специфичных терминаторов. В лаборатории биотехнологии ИХБФМ СО РАН метод терминации ОТ был адаптирован к анализу кДНК-транскриптов на автоматическом генном анализаторе, и в данном исследовании использовали оба варианта метода - стандартный (предполагающий применение радиоактивно меченого праймера) и модифицированный (позволяющий использовать флуоресцентно меченый праймер).

На Рисунке 4 представлены результаты анализа структуры 18S рРНК клеток MCF-7, трансфицированных аналогом РНК1. Одна из областей узнавания мишени в этом аналоге U24 C/D-бокс-РНК была направлена на U1827 18S рРНК (Таблица 1). Видно, что З'-фосфодиэфирная связь нуклеотида U1827 18S рРНК остается чувствительной к гидролизу щелочью, что свидетельствуют о том, что ОН-группа в 2'-положении нуклеотида-мишени не подвергалась метилированию. Аналогичный результат был получен для нуклеотидов G4499, U4500 и U4502 28S рРНК - мишеней остальных аналогов C/D-бокс-РНК - РНКЗ, РНК4 и РНК5 соответственно. Кроме того, было показано, что трансфекция клеток MCF-7 аналогами U24 C/D-бокс-РНК, направленными на G1702 18S рРНК также не вызывает 2'-0-метилирования нуклеотида-мишени. На Рисунке 4Б представлены результаты, полученные при анализе 2'-0-метилирования G1702 18S рРНК клеток MCF-7, трансфицированных аналогами РНК7, РНК8, РНК9, РНК10 и РНК11.

В то же время после трансфекции клеток MCF-7 синтетическими аналогами C/D-бокс-РНК, направленными на разные нуклеотиды 18S и 28S рРНК, происходит увеличение выхода специфичных наборов продуктов терминации ОТ рРНК-мишеней. Так, при ОТ 28S рРНК с праймером 28_3.2, комплементарным участку рРНК с 4529 по 4548 н., было установлено, что трансфекция клеток MCF-7 аналогом РНКЗ вызывает повышение выхода продукта терминации длиной 78 н., что соответствует увеличению глубины 2'-0-метилирования нуклеотида G4469 (Рисунок 5А и Б дорожки 1-3 и 4-6). При этом трансфекция клеток аналогом РНК5 вызывает повышение выхода другого продукта ОТ — длиной 81 н., что, в свою очередь, указывает на

увеличение глубины 2'-0-метилирования нуклеотида U4468 (Рисунок 5А и Б дорожки 1-3 и 7-9).

РНК1, нМ

# <?iS> о G А С и

G А С U

-U1827

-G1702

12345678 123456 789 10

Рис. 4. Влияние аналогов C/D-бокс-РНК на индукцию 2'-0-метилирования нуклеотидов U1827 и G1702 18S рРНК в клетках MCF-7. (А) Электрофоретическое разделение продуктов ОТ частично гидролизованной 18S рРНК контрольных клеток MCF-7 (дорожка 4) и клеток, трансфицированных аналогом РНК1 в концентрациях 160, 50 и 10 нМ Одорожки 1-3 соответственно). (Б) Электрофоретическое разделение продуктов ОТ частично гидролизованной 18S рРНК контрольных клеток MCF-7 (дорожка 6) и клеток, трансфицированных различными аналогами C/D-бокс-РНК: РНК7, РНК8, РНК9, РНК10 и РНК11 (дорожки 1-5 соответственно) в концентрации 160 нМ. Дорожки G, А, С и U - продукты секвенирования, образованные в присутствии ddCTP, dTTP, ddGTP и ddATP соответственно. Стрелками слева указаны положения кДНК-продуктов, снижение выхода которых может указывать на 2'-0-метилирование U1827 (А) и G1702 (Б) 18S рРНК.

В настоящей работе был также создан набор аналогов мяоРНК, содержащих в своей структуре различные замены в последовательности С(С')- или D(D')-6okcob: РНК5шС, PHK5D/N и PHK5mD (Таблица 1). Полученные с помощью таких аналогов данные позволили заключить, что Си D-боксы являются ключевыми элементами в структуре синтетических C/D-бокс-РНК, влияющих на глубину 2'-0-метилирования нуклеотидов рРНК при трансфекции их в клетки человека. Удаление С- и D-боксов из последовательности РНК отменяет действие аналогов мяоРНК на структуру рибосомных РНК трансфицированных клеток.

Таким образом, синтетические C/D-бокс-РНК, проникая в клетки человека, влияют на синтез 2'-0-метилированных нуклеотидов в структуре рибосомных РНК. Хотя трансфекция аналогов C/D-бокс-РНК в клетки MCF-7 не вызывает de novo 2'-0-метилирования заранее заданных нуклеотидов-

мишеней рРНК в клетках MCF-7, но под действием синтетических аналогов происходит увеличение глубины природного 2'-0-метилирования нуклеотидов 18S и 28S рРНК.

Д мишень Um

РНК5 44.68

I мишень

PIJK3 Gm

44691

4529' 28S рРНК 3' 5'-[32Р]-праймер

PIJK3

4506 U4502G4499

f Т

43 н. | 50 н.

ff

80 н.| 81 н.

•5'

Б контроль РНКЗ

[dNTP]

81 н,-

G А С U

_Um4468

~Gm4469

12345 6789 1011 1213

Рис. 5. Повышение выхода продуктов терминации ОТ 28S рРНК клеток MCF-7, трансфицированных аналогами C/D-бокс-РНК - РНКЗ и РНК5. (А) Расположение праймера, 2'-0-метилированных нуклеотидов 28S рРНК и нуклеотидов-мишеней аналогов C/D-бокс-РНК. (Б) Электрофоретическое разделение продуктов ОТ 28S рРНК контрольных клеток MCF-7 (дорожка 1-3) и клеток, трансфицированных различными аналогами C/D-бокс-РНК -РНКЗ (дорожки 4-6) и РНК5 (дорожки 7-9) в концентрации 160 нМ. Дорожки G, А, С и U - продукты секвенирования, образованные в присутствии ddCTP, dTTP, ddGTP и ddATP соответственно. Треугольники сверху показывают снижение концентрации dNTP от 0.1 мМ до 0.04 и 0.004 мМ. Стрелками слева указаны положения продуктов терминации ОТ длиной 78 н. и 81 н., соответствующих 2'-0-метилированным U4468 и G4469 28S рРНК.

1.4 Влияние аналогов С/О-бокс-РНК на сплайсинг пре-мРНК гена ШРА8

Для анализа влияния синтетических С/О-бокс-РНК на процессинг комплементарной пре-мРНК были синтезированы аналоги 1124 мяоРНК, направленные на пре-мРНК гена НБРА8. Продуктом этого гена является белок Н5С70, который относится к семейству белков теплового шока.

Области узнавания аналогов U24 РНК были сконструированы таким образом, чтобы 2'-0-метилированию подвергались нуклеотиды, критичные для сплайсинга второго интрона пре-мРНК-мишени: аденозин точки ветвления, первый и последний нуклеотиды второго интрона, а также последний нуклеотид второго экзона (донорный сайт сплайсинга) и первый нуклеотид третьего экзона (акцепторный сайт сплайсинга) пре-мРНК HSPA8.

Как видно из Рисунка 6, C/D-бокс-РНК, направленные на точку ветвления второго интрона, - РНК7, РНК 12 и PHK7mD вызывали снижение уровня мРНК-мишени на 50, 70 и 43% соответственно. Аналоги РНК8 и PHK8mD, направленные на последний нуклеотид второго экзона пре-мРНК HSPA8 снижали уровень мРНК на 40 и 32%. Аналоги U24 мяоРНК, направленные на другие нуклеотиды пре-мРНК, а именно, на первый и последний нуклеотиды второго интрона (РНК9 и РНК11 соответственно) и первый нуклеотид третьего экзона (РНК10) пре-мРНК HSPA8, снижали уровень мРНК-мишени на 25-30%. Аналог РНК5, направленный на нуклеотиды 18S и 28S рРНК и не имеющий существенной комплементарное™ к пре-мРНК гена HSPA8, не влиял на уровень анализируемой мРНК (Рисунок 7, РНК5).

Рис. 6. Относительный уровень мРНК гена HSPA8 в клетках MCF-7 через 21 ч после трансфекции аналогами C/D-бокс-РНК. Соотношение мРНК HSPA8/GAPDH в

контрольных клетках принимали за 100%. Представлено среднее значение соотношения количества мРНК

HSPA8/GAPDH, определенное методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с указанием стандартного отклонения, рассчитанного по данным трех независимых экспериментов. * - указывает на отличие от контроля с р < 0.05.

Как видно из данных Рисунков 7 и 8 относительное изменение количества мРНК гена HSPA8 в клетках MCF-7 зависит от концентрации синтетических C/D-бокс-РНК в культуральной среде и от времени трансфекции. При повышении концентрации РНК7 до 320 нМ уровень мРНК HSPA8 снижается приблизительно в 10 раз по сравнению с контрольными клетками через 24 ч после трансфекции (Рисунок 7). При этом увеличение

времени трансфекции клеток МСБ-7 аналогом СЮ-бокс-РНК до трех суток вызывает постепенное снижение уровня мРНК-мишени до 30% при концентрации РНК в культуральной среде равной 160 нМ (Рисунок 8).

Концентрация аналога C/D бокс РНК

20

80 160 320 нМ

120 100

,РНК7 « РНК5

I I

- 1 I

Щ1 ! ■ 1

*

мРНК HSPA8 28S рРНК мРНК HPRT

Рис. 7. Зависимость уровня мРНК гена ННРА8 в клетках МСИ-7 от концентрации аналога С/Г>-бокс-РНК, направленного на аденозин точки ветвления второго интрона пре-мРНК НБРА8. (А) Относительный уровень мРНК гена ШРА8 в клетках МСР-7 через 24 ч после трансфекции

аналогами СЛЭ-бокс-РНК. Уровень мРНК Н8РА8 в контрольных клетках

принимали за 100%. Представлено среднее значение количества мРНК

HSPA8 с указанием стандартного отклонения, рассчитанного по данным трех независимых экспериментов. * - указывает на отличие от контроля с р < 0.05. (Б) Электрофоретическое разделение продуктов ОТ-ПЦР мРНК гена HSPA8, 28S рРНК и мРНК гена HPRT в клетках MCF-7, трансфицированных РНК7.

Время трансфекции, ч

Рис. 8. Изменение уровня мРНК гена НБРА8 в клетках МСБ-7, трансфицированных аналогами СЛЭ-бокс-РНК, в зависимости от продолжительности трансфекции. Соотношение мРНК

Н8РА8/САРОН в контрольных клетках («О ч») принимали за 100%. Представлено среднее значение соотношения

количества мРНК Н8РА8ЮАРОН с указанием стандартного отклонения, рассчитанного по данным трех независимых экспериментов. * - указывает на отличие от контроля с р < 0.05.

Полученные нами данные позволили заключить, что ни Б-бокс в структуре аналогов СЮ-бокс-РНК, ни способность синтетических РНК направлять 2'-0-метилирование нуклеотидов РНК не являются необходимыми для направленного понижения уровня мРНК Н5РА8. Следовательно, ключевым фактором, обеспечивающим снижение уровня мРНК гена-мишени под действием синтетических С/Б-бокс-РНК, является комплементарное взаимодействие аналогов малых ядрышковых РНК с пре-мРНК-мишенью.

Снижение уровня мРНК гена НБРА8 сопровождалось накоплением в клетках МСР-7 коротких форм альтернативного сплайсинга пре-мРНК-мишени. Как показано на Рисунке 9, в нуклеотидной последовательности новых вариантов сплайсинга пре-мРНК белка Н8С70 отсутствует третий экзон или одновременно два экзона - третий и четвертый. Таким образом, показано, что трансфекция клеток МСР-7 созданными аналогами С/Б-бокс-РНК, направленными на нуклеотиды пре-мРНК Н8РА8, приводит к частичному нарушению сплайсинга пре-мРНК-мишени, а именно, к исключению экзонов из пре-мРНК и изменению соотношения между формами альтернативного сплайсинга. При исключении экзонов из структуры зрелой мРНК гена Н8РА8 происходит сдвиг рамки считывания, и в кодирующей области мРНК появляются стоп-кодоны. Следовательно, можно предположить, что образующиеся минорные формы мРНК гена НБРА8 подвергаются в клетках быстрой деградации по механизму, направленному на удаление продуктов РНК-полимеразы II, содержащих преждевременные стоп-кодоны.

Время трансфекции, ч

21

48

72

мРНК гена HSPA8

- III - IV - V

■m и - iv-v

II-v

Рис. 9. Влияние синтетических C/D-бокс-РНК на образование продуктов сплайсинга пре-мРНК гена HSPA8. Электрофоретическое разделение продуктов ОТ-ПЦР мРНК гена HSPA8 контрольных клеток MCF-7 (дорожка 1) и клеток, трансфицированных аналогом РНК7 в течение 6-72 ч (дорожки 2-5). Справа приведены схематические структуры соответствующих продуктов альтернативного сплайсинга пре-мРНК; цифрами II, III, IV и V обозначены номера экзонов мРНК HSPA8.

Представленные данные свидетельствуют о том, что СЛЭ-бокс-РНК изменяют уровень мРНК Н5РА8 за счет влияния на сплайсинг пре-мРНК гена-мишени. Трансфекция клеток человека аналогами С/Б-бокс-РНК приводит к изменению соотношения форм альтернативного сплайсинга комплементарной пре-мРНК-мишени.

1.5 Анализ цитотоксического действия синтетических СЛ)-бокс-РНК на клетки человека в культуре

Для оценки влияния синтетических СЛЭ-бокс-РНК на жизнеспособность клеток человека проводили сравнительный анализ действия аналогов 1124 мяоРНК на клетки аденокарциномы молочной железы человека МСР-7 (Рисунок 10). Показано, что в диапазоне концентраций 40-160 нМ аналоги Ш4 мяоРНК снижают МТТ-индекс раковых клеток в культуре вплоть до 45-60%.

40 нМ«80 нМ«160 нМ

Й Ч-

0 О

1 2 «о „

о То о *

О ®

110 Н 100 -) : 90 ) : 80 70 60 ! 50-

а 40

о

5 30-

т 20 Н 10 -

С=1

~¥т

ч

>..........^ ^ > ^ ^ X X

Рис. 10. Изменение жизнеспособности клеток аденокарциномы молочной железы человека МСР-7 под действием аналогов Ш4 СЛ>бокс-РНК человека. Представлено среднее значение МТТ-индекса относительно контроля + стандартное отклонение, рассчитанное по данным трех независимых экспериментов. Жизнеспособность контрольных клеток принимали за 100%. * и ** - указывает на отличие от контроля с р < 0.05 и р < 0.01 соответственно.

Данные по снижению жизнеспособности клеток МСР-7 в присутствии синтетических СЯЭ-бокс-РНК позволили предположить, что действие аналогов малых ядрышковых РНК на раковые клетки человека не ограничивается их влиянием на процессинг РНК-мишеней и что существуют дополнительные регуляторные механизмы, позволяющие аналогам мяоРНК снижать скорость пролиферации и жизнеспособность раковых клеток.

Для выявления клеточных процессов, в регуляции которых могут принимать участие синтетические аналоги малых ядрышковых РНК, а также для изучения механизмов, объясняющих наблюдаемое действие аналогов C/D-бокс-РНК на раковые клетки человека в культуре, был проведен сравнительный анализ действия аналога U24 мяоРНК - РНК5 в сочетании с цитотоксическими агентами. Для этого в работе использовали набор соединений, вызывающих нарушения процессов жизнедеятельности клеток человека (Таблица 3). Клетки MCF-7 обрабатывали одним из перечисленных соединений и одновременно трансфицировали аналогом C/D-бокс-РНК. В контрольном опыте синтетическая РНК в комплексе с липофектамином снижала жизнеспособность клеток MCF-7 на 18 ± 3.9%. Видно, что аналог C/D-бокс-РНК усиливает действие тамоксифена (CI=0.68, CI -комбинационный индекс), циклогексимида (С1=0.25) и интерферона а (С1=0.72) на 39.9, 36.6 и 30.4% соответственно, что указывает на синергизм действия РНК5 и цитотоксических агентов. При совместном действии РНК5 и цисплатина наблюдали аддитивное снижение жизнеспособности клеток. Наиболее выраженный антогонизм был выявлен при совместном воздействии на клетки MCF-7 аналога РНК5 и метотрексата.

Таблица 3. Влияние аналога C/D-бокс-РНК на жизнеспособность клеток MCF-7 в сочетании с цитотоксическими агентами

Цитотоксический агент МТТ-индекс (%) Дополнительное снижение МТТ-индекса*

- РНК5 + РНК5

Тамоксифен 95.0+3.7 55.1+2.8 39.9+4.6

Циклогексимид 84.9+7.0 48.3+2.1 36.6±7.3

Цисплатин 63.6+4.6 43.4±3.5 20.2±5.8

Бластицидин S 62.2+3.7 47.0±3.0 15.2±4.8

Гидрокортизон 61.0+5.3 46.9+1.8 14.1+5.6

Моненсин 44.0+5.1 40.3+6.5 3.7+8.3

Метотрексат 37.4±0.8 45.7+1.3 -8.3+1.5

Интерферон а 86.1+3.8 55.7±5.6 30.4±6.8

Примечание: * - представлено значение разности снижения МТТ-индекса под действием РНК5 в комбинации с соответствующим цитотоксиком и индивидуальным действием агента.

Проведенный нами анализ полученных данных по влиянию синтетических СЛЗ-бокс-РНК на жизнеспособность клеток МСР-7 в комбинации с действием набора цитотоксических агентов позволил предположить, что при трансфекции в клетки человека аналоги малых

ядрышковых C/D-бокс-РНК способны индуцировать интерфероновый ответ и за счет этого снижать скорость пролиферации раковых клеток.

1.6 Изменения транскриптома клеток человека MCF-7 под действием C/D-бокс-РНК

Для детального изучения механизмов влияния C/D-бокс-РНК на экспрессию генов в клетках человека был проведен полнотранскриптомный анализ РНК клеток MCF-7 с использованием метода гибридизации нуклеиновых кислот на микрочипах, позволяющего одновременно оценить уровень порядка 47000 транскриптов. Для этого клетки MCF-7 трансфицировапи аналогами U24 C/D-бокс-РНК - РНК7 и РНК5, а также аналогом U25 РНК человека - РНК25 (Таблица 1). В качестве контроля использовали клетки, инкубированные с трансфектантом - липофектамином.

Анализ результатов гибридизации РНК на микрочипах показал, что при трансфекции клеток MCF-7 синтетическим аналогом РНК7 происходит достоверное (Diff pValue < 0.01) повышение уровня 175 транскриптов, аналогом РНК5 - 135 транскриптов и аналогом РНК25 - 208 транскриптов. Сравнение наборов генов, экспрессия которых повышалась под действием разных C/D-бокс-РНК, позволило установить, что множества таких генов имеют значительное пересечение. Как видно из данных Рисунка 1 \А, под действием аналогов C/D-бокс-РНК происходит повышение уровня экспрессии группы из 125 генов, общей для всех трех проанализированных РНК. Уникальные гены составили всего 2% (3 из 135), 17% (30 из 175) и 30% (62 из 208) из множества генов с повышенной экспрессией для РНК5, РНК7 и РНК25 соответственно. Наблюдаемое сходство проанализированных наборов генов указывает на наличие общих биологических процессов, на которые оказывают влияние аналоги C/D-бокс-РНК при трансфекции их в клетки человека.

Для определения процессов, которые активируются в клетках человека под действием C/D-бокс-РНК, мы провели функциональный анализ выявленных 125 генов с повышенной экспрессией. Согласно аннотациям, представленным в базе данных GO (The Gene Ontology), в анализируемом наборе транскриптов наблюдали обогащение по мРНК, кодирующим белки, которые участвуют в следующих процессах: в активации врожденного иммунного ответа и реализации сигнальных путей паттерн-распознающих рецепторов; в процессах, направленных на подавление вирусной инфекции и активацию системы адаптивного иммунного ответа, а также в процессах апоптотических изменений митохондрий. Проведенный нами анализ состава выявленных групп генов, а также биоинформационный поиск транскрипционных факторов, участвующих в регуляции их экспрессии позволил заключить, что синтетические C/D-бокс-РНК индуцируют в клетках человека повышение уровня мРНК ключевых генов интерферонового ответа.

А

РНК7 РНК5

Б

РНК7 РНК5

РНК25 РНК25

Рис. 11. Сравнение наборов генов с изменившейся экспрессией через 24 ч после трансфекции аналогов C/D-бокс-РНК в клетки MCF-7. Представлены диаграммы сравнения (диаграммы Венна) наборов генов, уровень РНК которых повысился (А) или понизился (Б) по результатам анализа данных гибридизации суммарной РНК на микрочипах Illumina HT-12. Серым цветом отмечены области, отображающие множества «уникальных» генов.

Для подтверждения результатов дифференциального анализа экспрессии генов на микрочипах, мы использовали независимый метод ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Из данных Рисунка 12 видно, что после трансфекции клеток MCF-7 синтетическими аналогами C/D-бокс-РНК происходило значительное повышение уровня мРНК генов IFIT2, 1F1T3 и IL29. Однако существенного различия между уровнем мРНК анализируемых генов в клетках, трансфицированных разными аналогами C/D-бокс-РНК, не наблюдали.

Проведенный анализ структурных особенностей аналогов C/D-бокс-РНК, влияющих на транскрипцию генов интерферонового ответа, позволил предположить, что активация транскрипции интерферон-чувствительных генов в клетках MCF-7 под действием этих аналогов является следствием наличия в их структуре 5'-трифосфатов и коротких двуцепочечных участков, сформированных вблизи 5'-концов, при этом одновременное присутствие этих элементов в структуре аналогов C/D-бокс-РНК значительно усиливает их иммуностимулирующее действие.

о

Рис. 12. Увеличение уровня мРНК генов врожденного иммунного ответа через 24 ч после трансфекции аналогов СЮ-бокс-РНК (150 нМ) в клетки МСР-7. На рисунке представлено среднее значение кратного изменения уровня мРНК 1Р1Т2, 1Р1ТЗ и 1Ь29 относительно контрольных клеток с указанием стандартного отклонения, рассчитанного по данным как минимум трех независимых экспериментов.

С помощью полнотранскриптомного анализа экспрессии генов на микрочипах для каждого из аналогов РНК7, РНК5 и РНК25 были выявлены транскрипты, уровень которых снизился в трансфицированных клетках МСР-7. Как видно из Рисунка 11 Б, трансфекция клеток разными аналогами СЯЭ-бокс-РНК приводила к понижению экспрессии, в основном, уникальных наборов транскриптов. Общая группа из 25 транскриптов составляет менее 5% от всего множества транскриптов, уровень которых понизился в клетках МСР-7 под действием аналогов СЮ-бокс-РНК. Функциональный анализ группы генов с пониженной экспрессией не выявил общих биохимических процессов, влияющих на уровень РНК этих генов. В то же время биоинформационный анализ данных позволил предположить, что наблюдаемое понижение уровня большинства транскриптов в клетках МСР-7 происходит за счет активации специфичного набора микроРНК, направленных на подавление экспрессии генов, кодирующих транскрипционные факторы.

Таким образом, в данной работе продемонстрирована возможность регулировать экспрессию генов в клетках человека с помощью синтетических аналогов малых ядрышковых РНК. Полученные результаты позволили заключить, что аналоги СЯЭ-бокс-РНК способны влиять на

процессинг разных видов РНК-мишеней и выступать в качестве индукторов интерферонового ответа клеток человека. Результаты настоящей работы закладывают основу для разработки искусственных модуляторов экспрессии генов в клетках человека на основе знаний о структурных особенностях и функциях малых ядрышковых РНК.

ВЫВОДЫ

1. Разработан способ определения первичной структуры РНК, позволяющий секвенировать протяженные РНК с использованием обратной транскриптазы вируса лейкемии мышей Молони (M-MLV) и дидезоксинуклеозидтрифосфатов в качестве ее специфичных терминаторов, и оптимизированы методы выявления положений 2'-0-метилированных нуклеотидов в рРНК с помощью ревертазы M-MLV.

2. Создан набор аналогов малых ядрышковых C/D-бокс-РНК, направленных на модификацию заданных нуклеотидов разных видов РНК, и с помощью трансфекции клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 этими аналогами выявлены характеристические особенности влияния C/D-бокс-РНК на экспрессию генов. Установлено, что:

• трансфекция клеток аналогами C/D-бокс-РНК, направленными на нуклеотиды рибосомных РНК, формирующие ключевые функциональные центры рибосом, приводит к увеличению глубины природного 2'-0-метилирования нуклеотидов рРНК, не вызывая de novo 2'-0-метилирования нуклеотидов-мишеней;

• под действием аналогов C/D-бокс-РНК, направленных на нуклеотиды, критичные для сплайсинга второго интрона пре-мРНК гена HSPA8, происходит снижение уровня мРНК гена-мишени в клетках MCF-7, сопровождаемое частичным нарушением сплайсинга пре-мРНК, которое проявляется в увеличении уровня форм мРНК без одного или двух экзонов;

• трансфекция аналогов C/D-бокс-РНК в клетки MCF-7 снижает жизнеспособность раковых клеток в культуре, при этом комбинация аналогов C/D-бокс-РНК с тамоксифеном, циклогексимидом или интерфероном а оказывает синергетический эффект.

3. Проведен полнотранскриптомный анализ изменения уровня экспрессии генов в клетках MCF-7 под действием созданных аналогов малых ядрышковых C/D-бокс-РНК, и установлено, что в клетках, трансфицированных этими аналогами, происходит повышение уровня транскрипции группы генов интерферонового ответа и генов апоптотического каскада. Изменение уровня экспрессии интерферон-чувствительных генов может обуславливать цитотоксическое действие аналогов C/D-бокс-РНК.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Stepanov. G. A.. Semenov, D. V., Savelyeva, А. V., Koval, О. A., Kuligina, Е. V., Rabinov, I. V., Richter, V. A. Artificial box C/D RNAs affect pre-mRNA maturation in human cells // BioMed Research International. - 2013. - V. 2013. -ID:656158.

2. Степанов. Г. А.. Семенов, Д. В., Кулигина, Е. В., Коваль, О. А., Рабинов, И. В., Кит, Ю. Я., Рихтер, В. А. Аналоги малых ядрышковых C/D-бокс-РНК человека как регуляторы альтернативного сплайсинга пре-мРНК-мишени // Acta Naturae. - 2012. - Т. 4. - С. 34-43.

3. Semenov, D. V., Stepanov. G. A.. Baryakin, D. N.. Koval, О. A., Kuligina, E. V., Richter, V. A. Extracellular RNA as Regulators of Cellular Processes. // P.B. Gahan (ed.), Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum, Springer Science+Business Media B.V. - 2011. - P. 233-237.

4. Степанов. Г. А.. Семенов, Д. В., Фомин, А. С., Рихтер, В. А. Способ определения первичной структуры рибонуклеиновых кислот // Патент РФ № 2455362. Приоритет от 17 февраля 2011.

5. Stepanov. G. A.. Semenov, D. V., Filippova, J. A., Kuligina, Е. V., Koval, О. A., Rabinov, I. V., Richter, V. A. Comprehensive analysis of artificial box C/D RNAs action on human cells // FEBS Journal. - 2013. - V. 280 (Suppl. 1). - P. 37.

Подписано в печать 13.11.2013 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 2 Тираж 200 экз. Заказ № 190

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф.104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Степанов, Григорий Александрович, Новосибирск

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ

На правах рукописи

04201452136

Степанов Григорий Александрович

ВЛИЯНИЕ АНАЛОГОВ МАЛЫХ ЯДРЫШКОВЫХ РНК НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ

ЧЕЛОВЕКА

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: к.х.н., доцент Семенов Дмитрий Владимирович

Новосибирск - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ......................................................................................................................................2

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ...............................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................................................7

ГЛАВА 1 УЧАСТИЕ МАЛЫХ ЯДРЫШКОВЫХ РНК В РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).........................................................................9

1.1 Введение............................................................................................................................................9

1.2. Структура малых ядрышковых РНК.............................................................................................9

1.2.1 Структурные особенности малых ядрышковых С/О-бокс-РНК.............................................11

1.2.2 Структурные особенности малых ядрышковых Н/АСА-бокс-РНК.......................................12

1.2.3 Разнообразие форм РНК, содержащих С/О- и Н/АСА-боксы................................................13

1.2.4 Организация генов, кодирующих малые ядрышковые РНК...................................................15

1.3 Состав и структура рибонуклеопротеидов, осуществляющих 2'-0-метилирование

нуклеотидов рРНК...............................................................................................................................17

1.4. Участие С/О-бокс-РНК в процессинге РНК клеток эукариот..................................................21

1.4.1 Участие С/О-бокс-РНК в сайт-специфичном 2'-0-метилировании нуклеотидов рибосомных РНК..................................................................................................................................22

1.4.2 Функциональная роль 2'-0-метилированных нуклеотидов в составе рибосомных РНК клеток эукариот....................................................................................................................................24

1.4.3 Участие С/О-бокс-РНК в пост-транскрипционном созревании пре-мРНК и регуляции трансляции мРНК.................................................................................................................................26

1.4.3.1 Процессинг СЛЭ-бокс-РНК до коротких форм и их участие в регуляции экспрессии генов .....................................................................................................................................................28

1.4.3.2 Участие С/О-бокс-РНК в жизненном цикле вируса Эпштейна-Барра................................33

1.5 Искусственные ДНК-конструкции, кодирующие С/О-бокс-РНК, направленные на нарушение сплайсинга пре-мРНК......................................................................................................34

1.6 Методы выявления 2'-0-метилированных нуклеотидов в составе клеточных РНК...............38

1.7. Изменение уровня экспрессии малых ядрышковых РНК при заболеваниях человека..........41

1.8 Заключение.....................................................................................................................................48

ГЛАВА 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ..................................................................................49

2.1 Материалы и реактивы..................................................................................................................49

2.2 Ферменты........................................................................................................................................49

2.3 Олигодезоксирибонуклеотиды.....................................................................................................50

2.3.1 Олигодезоксирибонуклеотиды, используемые для ОТ рРНК клеток человека....................50

2.3.2 Олигодезоксирибонуклеотиды, используемые для ген-специфичного ОТ-ПЦР суммарной РНК клеток человека............................................................................................................................50

2.3.3 Олигодезоксирибонуклеотиды, используемые для синтеза ДНК-матриц аналогов C/D-бокс-РНК...............................................................................................................................................51

2.3 Олигорибонуклеотиды...................................................................................................................52

2.4 Буферные смеси..............................................................................................................................53

2.5 Методы............................................................................................................................................53

2.5.1 Конструирование и синтез аналогов C/D-бокс-РНК...............................................................53

2.5.2 Введение [32Р]-метки по 5'-концу нуклеиновых кислот.........................................................54

2.5.3 Культуры клеток..........................................................................................................................55

2.5.4 Трансфекция клеток MCF-7 синтетическими РНК..................................................................55

2.5.5 Выделение суммарной РНК клеток человека...........................................................................56

2.5.6 Выделение РНК из цитоплазматической и ядерной фракций клеток MCF-7.......................56

2.5.7 Выявление 2'-0-метилированных нуклеотидов в составе рРНК клеток человека..............56

2.5.8 Определение первичной структуры рРНК клеток человека...................................................57

2.5.9 Анализ накопления флуоресцентно меченой РНК в клетках MCF-7....................................58

2.5.11 Анализ стабильности аналогов C/D-бокс-РНК в клетках человека.....................................58

2.5.12 Анализ изменения уровня мРНК в клетках человека, трансфицированных аналогами C/D-бокс-РНК...............................................................................................................................................59

2.5.13 Анализ проапототических изменений цитоплазматической мембраны клеток человека MCF-7..........................................................:.........................................................................................60

2.5.14 Определение жизнеспособности клеток с помощью МТТ-теста.........................................60

2.5.15 Подготовка препаратов суммарной РНК клеток MCF-7 для анализа экспрессии генов на

чипе Illumina HT-12. Первичный и вторичный анализ данных гибридизации..............................61

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.............................................................................62

3.1 Структура и синтез аналогов C/D-бокс-РНК человека..............................................................62

3.2 Анализ накопления и локализации синтетических аналогов C/D-бокс-РНК в клетках человека.................................................................................................................................................66

3.3 Влияние аналогов C/D-бокс-РНК на 2'-0-метилирование рибосомных РНК клеток человека ..............................................................................................................................................70

3.3.1 Модификация метода выявления 2'-0-метилированных нуклеотидов РНК........................70

3.3.2 Влияние аналогов C/D-бокс-РНК на de novo 2'-0-метилирование нуклеотидов рРНК......75

3.3.3 Влияние аналогов C/D-бокс-РНК на глубину природного 2'-0-метилирования нуклеотидов рРНК клеток человека...................................................................................................80

3.4 Влияние аналогов C/D-бокс-РНК на сплайсинг пре-мРНК гена HSPA8..................................87

3.5 Анализ цитотоксического действия синтетических C/D-бокс-РНК на клетки человека в культуре.................................................................................................................................................98

3.5.1 Сравнительный анализ влияния аналогов C/D-бокс-РНК на жизнеспособность клеток MCF-7....................................................................................................................................................98

3.5.2 Влияние аналогов C/D-бокс-РНК на жизнеспособность клеток человека в сочетании с цитотоксическими агентами...............................................................................................................99

3.6 Изменения транскриптома клеток человека MCF-7 под действием C/D-бокс-РНК.............104

3.6.1 Функциональный анализ изменения экспрессии генов клеток MCF-7, трансфицированных аналогами C/D-бокс-РНК..................................................................................................................104

3.6.2 Активация транскрипции интерферон-стимулируемых генов под действием синтетических аналогов C/D-бокс-РНК.....................................................................................................................108

3.6.3 Повышение уровня мРНК проапоптотических генов в клетках MCF-7, трансфицированных синтетическими аналогами C/D-бокс-РНК.................................................111

3.6.4 Особенности структуры синтетических аналогов C/D-бокс-РНК, влияющие на активацию транскрипции генов врожденного иммунного ответа....................................................................114

3.6.5 Механизмы понижения уровня экспрессии генов при трансфекции клеток MCF-7

синтетическими аналогами C/D-бокс-РНК.....................................................................................120

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..................................................................................................................................126

ВЫВОДЫ............................................................................................................................................128

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................................129

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

AGO — семейство белков Аргонавт

AMV - вирус миелобластоза птиц

CI - комбинационный индекс

DAPI - 4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид

ddNTP (ddATP, ddGTP, ddCTP, dTTP, ddUTP) - дидезоксинуклеозид-5'-трифосфат

dNTP- дезоксинуклеозид-5'-трифосфат

FAM - 5(6)-карбоксифлуоресцеин

FITC - флуоресцеин изоцианат

Flu-12-UTP - флуоресцеин-5(6)- карбоксиамидокапроил-[5-(3-аминоаллил)-2'-дезоксиуридин-

5'- трифосфат]

HSP- семейство белков теплового шока

IFN- интерферон

IL- интерлейкин

IMDM- культуральная среда Дульбеко в модификации Пскова

lncPHK - длинная некодирующая рибонуклеиновая кислота

m3U- З-М-метилуридин

M-MLV - вирус лейкемии мышей Молони

MTT- бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-тетразолия

NaAc- ацетат натрия

Nra- 2'-0-метилированный нукпеотид

NTP- нуклеозид-5'-трифосфат

PI- пропидий йодид

RFU- средний уровень флуоресценции

SAM- Б-аденозилметионин

scaPHK- рибонуклеиновая кислота телец Кахаля

SDS - додецилсульфат натрия

shPHK - малая шпилечная рибонуклеиновая кислота

siPHK- малая интерферирующая рибонуклеиновая кислота

TEMED- 1Ч,К,М',К'-тетраметилэтилендиамин

TLR - То11-подобный рецептор

UTR- нетранслируемая область последовательности матричной РНК

в-мяоРНК - вирусная малая ядрышковая РНК

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДНКаза - дезоксирибонуклеаза

ДТТ - дитиотреит

дцРНК - двуцепочечная рибонуклеиновая кислота

е.а. - единица активности

МЕ - международные единицы

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

мяоРНК - малая ядрышковая рибонуклеиновая кислота

мяРНК - малая ядерная рибонуклеиновая кислота

н. - нуклеотид

НК - нуклеиновая кислота

нкРНК - некодирующая белок рибонуклеиновая кислота

НМКРЛ - немелкоклеточный рак легкого

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией

офВЭЖХ - обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография

оцРНК - одноцепочечная рибонуклеиновая кислота

п.н. - пара нуклеотидов

ПААГ - полиакриламидный гель

пре-микроРНК - предшественник микроРНК

пре-мРНК - предшественник матричной, рибонуклеиновой кислоты

пре-рРНК предшественник рибосомных рибонуклеиновых кислот

ПТЦ - пептидилтрансферазный центр рибосом

РМЖ - рак молочной железы

РНКаза - рибонуклеаза

РНП - рибонуклеопротеидные комплексы

рРНК - рибосомная рибонуклеиновая кислота

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан

тРНК - транспортная рибонуклеиновая кислота

ТСХ - тонкослойная хроматография

ТФ - транскрипционный фактор

УФ-излучение - ультрафиолетовое излучение

ФНО - фактор некроза опухоли

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ

Разработка новых искусственных регуляторов экспрессии генов на основе знаний о структуре и функциях малых некодирующих РНК (нкРНК) является актуальной задачей для фундаментальной науки и практической медицины. Открытие явления РНК-интерференции привело к развитию работ, посвященных роли малых РНК в регуляции процессов реализации генетической информации [1]. Результаты таких работ убедительно показали эффективность применения коротких антисмысловых РНК для осуществления контроля над процессами жизнедеятельности клеток человека и стимулировали поиск новых природных механизмов регуляции экспрессии генов. В настоящее время известно, что малые нкРНК выполняют в клетках разнообразные функции - они участвуют в регуляции пост-транскрипционного созревания и стабильности различных РНК, могут влиять на транскрипцию и трансляцию матричных РНК (мРНК), а также являются компонентами сложных рибонуклеопротеидных комплексов, в составе которых проявляют специфическую каталитическую активность [2-4].

К классу нкРНК относятся малые ядрышковые РНК (мяоРНК, от англ. «small nucleolar RNAs», snoRNAs), которые содержат в своей структуре так называемые С- и D-боксы (C/D-бокс-мяоРНК) или Н- и АСА-боксы (Н/АСА-бокс-мяоРНК). Эти РНК играют ключевую роль в пост-транскрипционной модификации нуклеотидов рибосомных РНК (рРНК) клеток эукариот [5, 6]. В комплексе со специфическим набором белков C/D-бокс-РНК направляют 2'-0-метилирование нуклеотидов рРНК, Н/АСА-бокс-РНК направляют псевдоуридилирование рРНК. Недавние исследования показали, что мяоРНК обладают широким спектром функций, которые не ограничиваются их участием в ядрышковом созревании рибосомных РНК. Некоторые мяоРНК вовлечены в процессы регуляции сплайсинга и пост-транскрипционной модификации нуклеотидов пре-мРНК [7, 8]. Кроме того, C/D-бокс и Н/АСА-бокс-РНК, как и другие нкРНК, являются предшественниками коротких регуляторных форм РНК в клетках эукариот. Короткие фрагменты мяоРНК взаимодействуют с мРНК и пре-мРНК и влияют на результат альтернативного сплайсинга и эффективность трансляции РНК-мишени. Отдельные мяоРНК, а также их микроРНК-подобные фрагменты транспортируются в цитоплазму клеток и секретируются во внеклеточное пространство, где они могут играть роль переносчиков внутри-и межклеточных сигналов [9-11]. Исследования экспрессии генов малых ядрышковых РНК в различных тканях млекопитающих показали, что изменение уровня мяоРНК может быть напрямую связано с развитием заболеваний человека и животных [12, 13]. Особый интерес представляют данные, свидетельствующие об изменении экспрессии генов, кодирующих C/D-бокс- и Н/АСА-бокс-мяоРНК при онкотрансформации клеток [14,15].

Ранее основным подходом к исследованию свойств малых ядрышковых РНК было создание ДНК-конструкций, экспрессирующих искусственные РНК внутри клеток. С помощью таких ДНК-конструкций было показано, что изменяя область узнавания мишени в структуре C/D-бокс-мяоРНК, можно модулировать специфичность действия мяоРНК и направлять модификации в заранее заданные нуклеотиды новой РНК-мишени [5]. Направленное сайт-специфичное введение дополнительных 2'-0-метилированных нуклеотидов в состав рРНК дрожжей может индуцировать нарушения трансляции мРНК на рибосомах и приводить к снижению скорости роста клеток [16].

Таким образом, малые ядрышковые РНК являются перспективной основой для разработки новых искусственных модуляторов экспрессии генов. Изучение механизмов функционирования малых ядрышковых РНК и исследование нарушения их экспрессии в клетках могут открыть новые перспективы для разработки диагностических подходов и создания средств терапии заболеваний человека. В настоящее время, в частности, открытым остается вопрос влияния малых ядрышковых РНК на ключевые клеточные процессы в результате проникновения этих РНК в клетки из внеклеточного пространства.

Целью данной работы являлось исследование влияния синтетических аналогов малых ядрышковых C/D-бокс-РНК на экспрессию генов в клетках человека. В ходе работы планировалось решить следующие задачи:

сконструировать и синтезировать аналоги малых ядрышковых C/D-бокс-РНК, направленные на нуклеотиды 18S и 28S рРНК человека, участвующие в формировании ключевых функциональных центров рибосом, а также на нуклеотиды, критичные для сплайсинга пре-мРНК гена белка теплового шока HSPA8;

адаптировать метод определения первичной структуры РНК и методы выявления 2'-0-метилированных нуклеотидов в составе рибосомных РНК к использованию обратной транскриптазы вируса лейкемии мышей Молони (M-MLV);

исследовать влияние аналогов C/D-бокс-РНК на 2'-0-метилирование нуклеотидов рибосомных РНК в клетках человека;

исследовать влияние аналогов C/D-бокс-РНК на уровень мРНК гена HSPA8 в клетках человека;

провести анализ влияния аналогов C/D-бокс-РНК на жизнеспособность клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7;

провести анализ изменения транскриптома клеток человека под действием синтетических аналогов C/D-бокс-РНК методом гибридизации РНК на полнотранскриптомных чипах Illumina.

ГЛАВА 1 УЧАСТИЕ МАЛЫХ ЯДРЫШКОВЫХ РНК В РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Введение

Различные РНК клеток эукариот в ходе созревания проходят стадии ядерного посттранскрипционного процессинга, к которым относятся химические модификации нуклеотидов и разрезание пре-рРНК-транскрипта, сплайсинг пре-мРНК, копирование и полиаденилирование матричных РНК, редактирование мРНК и модификации нуклеотидов малых ядерных РНК (мяРНК). Известно, что в регуляции процессов созревания пре-рРНК важную роль играют малые ядрышковые РНК - СЛЭ-бокс-РНК и Н/АСА-бокс-РНК. Первоначально считалось, что участие в пост-транскрипционном процессинге рРНК является основной и единственной функцией мяоРНК в клетках эукариот. Позже было показано, что часть модификаций малых ядерных РНК клеток эукариот и транспортных РНК (тРНК) клеток архей осуществляют каталитические рибонуклеопротеидные комплексы, содержащие СЛЭ-бокс-РНК и Н/АСА-бокс-РНК [17, 18]. В настоящее время появились экспериментальные данные, позволяющие предположить наличие у мяоРНК целого набора и других ре