Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Локализация транспортного белка гордеивируса в ядрышке и его взаимодействие с белками ядрышка и телец Кахаля

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Локализация транспортного белка гордеивируса в ядрышке и его взаимодействие с белками ядрышка и телец Кахаля"

На правах рукописи

СЕМАШКО Мария Александровна

ЛОКАЛИЗАЦИЯ ТРАНСПОРТНОГО БЕЛКА ГОРДЕИВИРУСА В ЯДРЫШКЕ И ЕГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С БЕЛКАМИ ЯДРЫШКА И

ТЕЛЕЦ КАХАЛЯ

03.02.02 - Вирусология

005017278

АВТОРЕФЕРАТ ] 0 ыДп ¿012

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2012

005017278

Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета и в отделе биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии имени Л.Н.Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова».

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Калинина Наталья Олеговна

Официальные оппоненты:

Прасолов Владимир Сергеевич, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии имени В.А.Энгельгардга РАН, заведующий отделом

Эльдаров Михаил Анатольевич, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр «Биоинженерия» РАН, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена РАН

Защита состоится " 24 " мая 2012 г. в_ асов на заседании диссертационного совета

Д 501.001.76 по защите кандидатских и докторских диссертаций при Московском государственном университете имени М.ВЛомоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские Горы, МГУ, Биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан

апреля 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Крашенинников И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одним из актуальных направлений молекулярной биологии вирусов является изучение функций клеточного ядра и субъядерных структур в процессе вирусной инфекции. Локализация вирусоспецифических белков и нуклеиновых кислот в клеточном ядре показана для вирусов человека, животных и растений (Hiscox, 2002; 2007; Greco, 2009, Taliansky et al., 2010). Для многих вирусов подобная локализация объясняется репликацией их геномов в ядре клетки с использованием аппарата репликации клеточной ДНК. Однако в настоящее время получены данные о том, что ядерные белки выполняют важные функции практически на всех этапах инфекционного цикла, начиная с проникновения вируса в клетку и заканчивая сборкой вирионов (Greco, 2009). Вместе с тем роль ядра в жизненном цикле РНК-содержащих вирусов с геномом положительной полярности, которые реплицируются и собираются в цитоплазме клетки и к числу которых относится большинство вирусов растений, долгое время оставалась неочевидной. Исследования последних лет показали, что вирусоспецифические белки этих вирусов также обнаруживаются в ядре. Эта стадия является необходимой для развития вирусной инфекции, в частности для реализации таких функций вирусов, как распространение (транспорт) вируса в растениях, репликация вирусного генома и подавление специфического защитного механизма растений - посттранскрипционного умолкания генов (Taliansky et al., 2010). Исследования молекулярных механизмов взаимодействия РНК-содержащих вирусов растений с ядром и субъядерными структурами позволяет не только выявить неизвестные аспекты взаимодействия вируса и клетки, но и в перспективе разработать новые стратегии защиты растений от вирусных инфекций.

Объектом данной работы является транспортный белок, кодируемый первым геном специального транспортного модуля - тройного блока генов (ТБГ), гордеивируса полулатентного вируса мятлика (белок ТБГ1 ПЛВМ). Белок ТБГ1 гордеивирусов образует рибонуклеопротеидный (вРНП) комплекс с геномной и субгеномными РНК вируса для ближнего транспорта между соседними клетками растения и дальнего транспорта по проводящей системе растения флоэме. Два других транспортных белка ТБГ2 и ТБГЗ обеспечивают внутриклеточный транспорт вРНП-комплекса к плазмодесмам клеточной стенки (Jackson et al., 2009). Белок ТБГ1 ПЛВМ содержит протяженную N-концевую область и С-концевой НТФазный/хеликазный домен (HELD), который проявляет

НТФазную и РНК-хеликазную активности и кооперативно связывает РНК in vitro (Morozov and Solovyev, 2003). N-концевая область состоит из двух структурно и функционально различающихся доменов, а именно полностью неупорядоченного NTD и внутреннего домена ID с преимущественно Р-структурой и, видимо, выполняет основную роль в структурной организации вРНП-комплекса (Makarov et al., 2009, 2010). В составе NTD гордеивируса ПЛВМ выявлены два кластера положительно заряженных аминокислотных остатков, ответственных за некооперативное связывание с РНК и дальний транспорт вирусной инфекции (Kalinina et al., 2001). О важной роли NTD в дальнем транспорте по флоэме вирусов с ТБГ гордеивирусного типа свидетельствуют данные, полученные на помовирусе скручивания верхушек картофеля (ВСВК). Делеция значительной части NTD белка ТБГ1 ВСВК сопровождается блокированием дальнего, но не ближнего транспорта вируса (Wright et al., 2010). Дополнительно показано, что NTD отвечает за локализацию белка ТБГ1 ВСВК в ядре/ядрышке растительной клетки (Wright et al., 2010).

Цель и задачи исследования

Цель данной работы состояла в изучении предполагаемой локализации белка ТБГ1 ПЛВМ в ядре/ядрышке клеток растений табака Nicotiana benthamiana и выявлении взаимодействия между белком ТБГ1 и основными белками ядрышка и телец Кахаля (ТК), субъядерной структуры, физически и функционально связанной с ядрышком.

В ходе работы решались следующие основные задачи:

1. Получение конструкции, содержащей ген белка ТБГ1 ПЛВМ, слитый с геном зеленого флуоресцентного белка (GFP), и изучение локализации белка ТБГ1 в ядре клеток растений табака Nicotiana benthamiana в условиях временной экспрессии индивидуального белка с помощью системы агробактериальной инокуляции. Создание конструкций для экспрессии мутантных вариантов белка ТБГ1, слитых с GFP, и изучение их локализации в клетке.

2. Картирование участков в составе белка ТБГ1, необходимых для его локализации в ядре и ядрышке.

3. Изучение взаимодействия белка ТБГ1 с основным белком ядрышка фибрилларином и с белком телец Кахаля коилином методами in vitro и vivo.

4. Идентификация участков взаимодействия между вирусным белком и белками ядрышка и телец Кахаля.

Научная новизна и практическая ценность работы

В ходе данной работы впервые показано, что транспортный белок ТБГ1 гордеивируса ПЛВМ, слитый с зеленым флуоресцентным белком, способен локализоваться в ядрышке эпидермальных клеток N. benthamiana при индивидуальной экспрессии (в отсутствии других вирусных белков). Участки белка ТБГ1, необходимые для его локализации в ядре и ядрышке (предполагаемые NLS и NoLS), выявлены в составе положительно заряженных кластеров неупорядоченного N-концевого домена белка ТБГ1 (NTD). Показано, что рекомбинантный белок ТБГ1 ПЛВМ способен взаимодействовать in vitro с белком ядрышка фибрилларином (AtFib2 из Arabidopsis thaliana) и белком телец Кахаля коилином (Atcoilin из Arabidopsis thalianá). Определены участки, отвечающие за взаимодействия белков. С помощью метода бимолекулярной флуоресцентной комплементации продемонстрировано взаимодействие вирусного белка и белков ядрышка и телец Кахаля in vivo и выявлена субклеточная локализация белковых комплексов в растительной клетке. В ходе исследования показано, что во взаимодействиях транспортного белка ТБГ1 и ядра определяющую роль играет неструктурированный домен NTD, в составе которого расположены как участки, необходимые для локализации вирусного белка в ядре/ядрышке, так и участки взаимодействия с фибрилларином и коилином. Полученные результаты впервые на модели гордеивирусов демонстрируют связь между ядром клетки и цитоплазматическим РНК-содержащим гордеивирусом, свидетельствуя в пользу участия ядра/ядрышка в инфекции растений гордеивирусами. Высказано предположение о биологической роли локализации транспортного белка ТБГ1 в ядрышке клетки для осуществления дальнего транспорта гордеивируса.

Результаты работы могут быть использованы в практике научных исследований в области молекулярной биологии и вирусологии, а также при чтении курсов лекций по вирусологии на биологических факультетах высших учебных заведений.

Апробация работы

Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии

Биологического факультета и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-

3

химической биологии имени А.Н.Белозерского МГУ имени М.В.Ломоносова. Материалы работы докладывались на семинарах кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ, на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008» (Москва, Россия, 2008), на семинаре Европейской Организации молекулярной биологии «Геномные подходы к взаимодействию вирусов растений, их хозяев и переносчиков» (Фенестрелле, Италия, 2010), на 35-ом Конгрессе Федерации Европейских биохимических обществ «Молекулы жизни» (Гетеборг, Швеция, 2010), на Международной конференции по сосудистой биологии растений (Колумбус, Огайо, США, 2010), на конференции Международных достижений растительной вирусологии (Амстердам, Нидерланды, 2010).

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 7 печатных работ, из них статьей в реферируемых отечественном и международном журналах - 2, материалов международных конференций - 5.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 102 страницах, содержит 21 рисунок, 4 таблицы и включает следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение результатов», «Выводы» и «Список цитируемой литературы» (191 цитируемая работа).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Белок ТБП ПЛВМ локализуется в ядрышках эпидермальных клеток растений N. Ьеп/Иат/апа.

Для изучения внутриклеточной локализации белка ТБП ПЛВМ (белок с молекулярной массой 63 кДа или белок 63К) в отсутствие вирусной инфекции листья табака N. ЬешИатгапа агроинфильтрировали полученной конструкцией ОРР-63К, несущей ген белка ТБП, слитый с геном зеленого флуоресцентного белка (GFP). Флуоресценцию в эпидермальных клетках анализировали методом конфокальной лазерной сканирующей

4

микроскопии (KJ1CM) на 3-4 день после инфильтрации. Диффузная флуоресценция в основном обнаруживалась в цитозоле клеток, видимо, в ассоциации с эндоплазматическим ретикулумом и/или микротрубочками, что согласуется с показанной ранее локализацией GFP-ТБП гордеивируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) и GFP-ТБП ВСВК (Lawrence & Jackson, 2001; Lim et al„ 2009; Wright et al„ 2010; Shemyakina et al., 2011) (Рис. 1A). Кроме того, слабая флуоресценция была выявлена в ядре, где она аккумулировалась в структурах, напоминающих ядрышко. Действительно, когда GFP-63K ко-экспрессировали с маркером ядрышка фибрилларином (Fib), слитым с мономерным красным флуоресцирующим белком (mRFP) (конструкция mRFP-Fib), оба белка ко-локализовались в ядрышке (Рис. 1В). Известно, что индивидуально экспрессируемый GFP локализуется в цитоплазме и в ядре, но не ядрышке (данные не показаны). Для подтверждения полученных данных была сделана конструкция, где ген белка ТБГ1 ПЛВМ был слит с геном GFP в противоположной ориентации (конструкция 63K-GFP). В этом случае флуоресценция обнаруживалась также в цитозоле эпидермальной клетки и в ядрышке (Рис. 1Б).

Таким образом, белок ТБГ1 ПЛВМ, экспрессированный в отсутствии других вирусных белков, локализуется преимущественно в цитозоле, но некоторое количество белка обнаруживается в ядрышке клетки. Расположение GFP с N- или С-конца белка ТБГ1 не влияет на внутриклеточное распределение флуоресценции. Присутствие белка ТБГ1 ПЛВМ в ядрышке не может быть объяснено неспецифической диффузией белка, т.к. большая молекулярная масса слитого белка GFP-ТБП (примерно 90 кДа) превышает предел для пассивной диффузии белков в ядро (40-60 кДа) (Nigg, 1997).

Полученные результаты согласуются с данными биоинформатического анализа аминокислотной последовательности белка ТБГ1. Сервер PSORT (http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/fonn.htmll предсказывает ядерную локализацию белка.

Потенциальный сигнал ядерной локализации (NLS) предсказывается программой PredictNLS (http://cubic.bioc.columbia.edu/cgi/var/nair/resonline.pl.) в N-концевом домене (NTD) в участке, включающем аминокислотные остатки с 119 по 154 (Рис. 2А, Б).

GFP-63K

' ^ i 'ч

у

•.i.-'

63K-GFP

tr~f

йГ

1 «аь jp Ь

/л4 • \

X

—

GFP63K AtFib2 mRFP # Mergo •

63K-GFP DAPI Merge

Рис. 1. Внутриклеточная локализация белка ТБГ1 ПЛВМ (белка 63К), слитого с вРР, при агроинфильтрации листьев N. ЬеМкат'шпч соответствующими конструкциями. А -

локализация белка ОБР-бЭК, эпидермальная клетка и ядро. Б -локализация белка бЗК-вРР, эпидермальная клетка и ядро; В-Г - изображения ядер, В - ко-экспрессия вРР-бЗК и тЯРР-фибрилларина, маркера ядрышка и телец Кахаля; сигнал вРР показан слева, сигнал тЯРР в центре и наложение изображений - справа; Г - ко-экспрессия 63 КОБР с нефлуоресцирующим фибрилларином, сигнал ОРР показан слева, окраска ядра ОАР1 в центре, совмещенное изображение ядер - справа. Изображения получены

наложением серии

конфокальных оптических

срезов. Масштабная линейка: 10 мкм (А и Б, левое изображение) и 5 мкм (все остальные изображения).

Ы-конаевой домен белка ТБГ1 ПЛВМ отвечает за его локализацию в ядрышке

В следующей серии экспериментов была изучена внутриклеточная локализация делеционных мутантов белка ТБГ1. Для этого были получены делеционные мутанты, соответствующие ]Ч-концевой половине белка (Ы63К), С-концевому НТФазно/хеликазному домену (С63К) и домену ЫТБ, слитые с ОРР (Рис 2А). Конструкция вРР-КбЗК оказалась нестабильной в растительной клетке. По данным Вестерн блот анализа с антителами к ОРР и к полноразмерному белку ТБГ1 продукт,

в

ТБГ1 (63К)

N63K

NTD

С63К

NTD-Amut NTD-Bmut NTD-ABmut NTD-ABCmut

NTD182 NTD82'200

А 1 с V

1 1 1_1 NLS NoLS

с и

А 1 с ш г

[

I т\ с 1» 1

А Е с 39J

Е Ж] с L

ШЖЖЗ

□

Iе Iе

Рис. 2. Схематическое изображение белка ГБГ1 Г1ЛВМ (белка 63К) и его мутантов. А -

Показаны основные домены белка ТБГ1 ПЛВМ: N-концевой домен (NTD), центральный или внутренний домен (ID) и С-концевой НТФазный/хеликазный домен (HELD). Консервативные мотивы суперсемейства 1 НТФаз/хеликаз показаны как прямоугольники темно-серого цвета. Черные прямоугольники обозначают положительно заряженные кластеры А, В и С. Положение предсказанного NLS и предполагаемого NoLS обведено контуром. Делеционные мутанты обозначены как N63 К (N-концевая область), NTD (N-концевой домен) и С63К (С-концевой НТФазный/хеликазный домен, HELD). Б - Точечные мутанты NTD: кластеры А, В и С, в которых положительно заряженные аминокислотные остатки аргинина и лизина заменены на нейтральные остатки аланина, показаны перечеркнутыми. Положительно заряженные кластеры А и В были мутированы отдельно (NTD-Amut и NTD-Bmut). Одновременно мутировали кластеры А и В (NTD-ABmut) и А, В, С (NTD-ABCmut). В - Делеционные мутанты NTD: мутант NTD1"82, содержащий аминокислотные остатки с 1 по 82, и мутант NTD82 2"", содержащий аминокислотные остатки с 82 по 200. Аминокислотные остатки, входящие в состав полноразмерного белка ТБГ1 и его мутантов указаны справа.

образующийся при экспрессии этой конструкции, деградировал в клетке, образуя фрагмент, состоящий из вРР, слитого с последовательностью Оконца N63 К с молекулярной массой около 35 кДа. Наблюдаемый характер распределения флуоресценции в целом соответствовал флуоресценции свободного йЕР: продукт деградации локализовался в ядре, но не в ядрышке и в цитоплазме, в том числе во включениях различного размера (данные не показаны).

GFP-NTD AtFib2-mRFP Merge щш GFP-NTD

C63K-GFP AtFib2-mRFP Merge C63K-GFP

Рис. 3. Субклеточная локализация делециоииых мутантов белка ТБГ1 ПЛВМ, слитых с GFP, экспреесированиых при агроинфильтраиии листьев N.benthamiana. А - ко-экспрессия GFP-NTD и mRFP-фибрилларина, сигнал GFP показан слева, далее показаны сигнал mRFP и наложение изображений; справа показан общий план клеток; Б - ко-экспрессия C63K-GFP и mRFP-фибрилларина, сигнал GFP показан слева, далее показаны сигнал mRFP и наложение изображений; справа показан общий план клеток. Изображения получены наложением серии конфокальных оптических срезов. Масштабная линейка: 20 мкм для крайних правых изображений и 5 мкм для всех остальных.

При агроинфильтрации конструкции GFP-NTD, совместно с фибрилларином, слитым с mRFP, флуоресценция выявлялась в ядрышке, а также в цитоплазме клетки (Рис. ЗА). В целом распределение флуоресценции было сходно с наблюдаемой для полноразмерного белка. Напротив, при экспрессии конструкции C63K-GFP НТФазно/хеликазный домен белка ТБГ1 локализовался только в цитоплазме в виде гранул. Флуоресценция не обнаруживалась ни в ядре, ни в ядрышке, которое визуализировалось при ко-экспрессии mRFP-фибрилларина (Рис. ЗБ). Таким образом, эти результаты свидетельствуют о том, что сигнал локализации белка ТБГ1 в ядре/ядрышке расположен в домене NTD.

Картирование сигнала ядерной локализации в кластере А домена NTD.

Мотивы, богатые положительно заряженными аминокислотами аргинином и

лизином, способны функционировать как сигналы ядерной локализации (NLS), формируя

одночастные NLS, состоящие из одного кластера положительно заряженных аминокислот

(NLS класса 1) или двухчастные, состоящие из двух кластеров, разделенных 10-12-

членным аминокислотным линкером (NLS класса 2) (Lange et al., 2007; Kosugi et al.,

8

2009). М-концевой домен белка ТБГ1 ПЛВМ богат такими мотивами: он содержит несколько положительно заряженных кластеров, в том числе РНК-связывающие кластеры А и В (КаПшпа е/ а/., 2001). Предсказанная последовательность ¡МЬЭ (119-154 аа остатки) находится в домене 1ЧТО и частично перекрывается с кластером А и кластером С (Рис. 2А).

Для картирования 1\Ш5 были сконструированы четыре точечных мутанта ЫТО (Рис. 2Б), слитые с вРР: ОРР-МТО-АтШ, ОРР-ЫТО-ВтЩ, ОРР-МТО-АВтШ и СРР-1МТО-АВСши!. Кластер А (114-125 аа) содержит 9 остатков лизина и аргинина; кластер В (175190 аа) содержит 8 остатков лизина; кластер С (147-156 аа) содержит 5 остатков лизина. Положительно заряженные кластеры А и В (конструкции МТР-Атш и 1ЧТО-Впш1) были мутированы отдельно. Одновременно были мутированы кластеры А и В и кластеры А, В и С (конструкции 1МТО-АВггиЦ и МТО-АВСпШ соответственно). В 1ЧТО были внесены следующие мутации (положительно заряженные аминокислоты, которые были заменены, обозначены жирным шрифтом): в ОРР-ЫТО-Аши1 исходная последовательность ""КАКБКККККМКК125 была заменена на 114КАА5ЫОАЬККАА125; в СРР-ЫТО-ВтШ исходная последовательность 17'ККЛТККН8ККОТКГЖО,9° была заменена на 175АЕАТТЫА8ААС)ТЕ0К0190; в ОРР-ЫТО-АВши! были внесены обе эти мутации, и в ОРР-ОТВ-АВСтШ кроме указанных выше мутаций в кластерах А и В исходная последовательность кластера С 147КЕ5ККОТКРК156 была заменена на |47АЕ8АЬС>ТЬРА156. Мутации в кластерах А и В были аналогичны тем, которые были сделаны ранее в составе Ы-концевой половины белка ТБГ1 ПЛВМ для изучения ее РНК-связывающих свойств (КаНпша е; а!., 2001). Конструкции были экспрессированы в листьях N. ЬеыИат^апа с помощью агроинфильтрации. Флуоресценция СИР-МТО обнаруживается в ядрышке клетки (Рис. ЗА). Локализация ОРР-ЫТО-АтШ в ядре и ядрышке не выявляется (Рис. 4А). Присутствие в ядре/ядрышке также не выявлено для мутантов ОРР-МТО-АВпиЛ и ОРР-ЫТО-АВСти! (Рис. 4В и Г). Фоновая флуоресценция мутантных белков в нуклеоплазме может быть обусловлена неспецифической диффузией «слитых» белков, молекулярная масса которых (45-50 кДа) меньше или соответствует молекулярной массе белков, способных попадать в ядро за счет простой диффузии (40-60 кДа). Напротив, мутант ОРР-МТО-ВтЩ распределяется равномерно в нуклеоплазме, но практически отсутствует в ядрышке (Рис. 4Б). Экстракты листьев были проанализированы Вестерн блот анализом с использованием антител к белку ТБГ1 и ОБР и подтвердили

отсутствие деградации «слитых» мутантных белков в растительной клетке (данные не показаны).

Рис. 4. Локализация в ядре мутантов ОТО по положительно заряженным кластерам, слитых с вГР. Изображения общего плана клетки (слева) и ядер (справа), полученные КЛСМ листьев на 3-4 дни после агроинфильтрации листьев N. ЬеМка1п1апа конструкциями, экспрессирующими: А -ОРР-ЫТО-АттИ, Б - ОРР-МТО-ВпиП, В - ОРР-ЫТО-АВши1, Г - ОРР-ЫТО-АВСти!. Изображения получены наложением серии конфокальных оптических срезов. Масштабная линейка: 5 мкм ядра и 20 мкм эпидермальные клетки.

В связи с тем, что мутации в кластере А отменяют локализацию NTD в ядре/ядрышке, предположено, что необходимая для ядерной локализации белка ТБГ1 последовательность расположена в кластере А в составе последовательности "6KSKRKKKNKK125. Интересно, что правая часть этой последовательности напоминает классический одночастный NLS (K(K/R)X(K/R), взаимодействующий с импортином а (Hödel et al., 2001; Rajamaki & Valkonen, 2009), который опосредует ядерный импорт белков по импортин а/ß пути. Мутации в кластере В отменяют локализацию NTD в ядрышке: мутантный белок преимущественно локализуется в нуклеоплазме. Таким образом, весьма вероятно, что последовательность 175KKATKKESKKQTK187 необходима для локализации белка в ядрышке и содержит NoLS.

Полученные результаты являются вторым сообщением о присутствии в ядрышке белка ТБГ1, кодируемого вирусом, содержащим ТБГ гордеивирусного типа. Недавно было показано, что белок ТБГ1 помовируса ВСВК локализуется в ядре/ядрышке (Wright et al., 2010). Интересно, что сигнал/сигналы, отвечающие за ядрышковую локализацию,

10

расположены в составе доменов NTD белков ТБГ1 обоих вирусов. Показано, что NTD ВСВК, слитый с GFP, локализуется в ядре/ядрышке, а белок ТБГ1 ВСВК с делецией NTD нет. Авторы предположили, что два мотива положительно заряженных аминокислотных остатков в составе NTD могут функционировать как сигналы локализации в ядре и ядрышке (Wright et al., 2010). Таким образом, полученные нами данные согласуются с результатами, полученными для белка ТБГ1 ВСВК, и локализуют вероятные NLS и NoLS мотивы в составе домена NTD.

GAR домен фибрилларина взаимодействует с NTD белка ТБГ1 ПЛВМ in vitro.

Вирусоспецифические белки некоторых вирусов растений взаимодействуют с основным белком ядрышка, фибрилларином, и это взаимодействие необходимо для успешного инфекционного цикла (Taliansky et al., 2010). В экспериментах, описанных выше, было продемонстрировано, что белок ТБГ1 ПЛВМ ко-локализуется с фибрилларином при агроинфильтрации листьев растений табака N. benthomiana конструкциями, экспрессирующими GFP-63K и mRFP-AtFib2. Кроме того, наши предварительные данные указывали на то, что флуоресценция GFP-63K становится более интенсивной, при ко-экспрессии GFP-ТБП и фибрилларина. Прямое взаимодействие между фибрилларином и белком ТБГ1 ПЛВМ было изучено in vitro методом Фар-Вестерн анализа. Рекомбинантный полноразмерный белок ТБГ1 и его делеционные и точечные мутанты были экспрессированы в Е. coli, очищены аффинной хроматографией в денатурирующих условиях и ренатурированы. Для анализа белок-белковых взаимодействий рекомбинатный фибрилларин (Arabidopsis fibrillarin 2, AtFib2) и его мутант с делецией глицин-аргинин богатого N-концевого домена (GAR-домена), слитый на N-конце с глутатион-8-трансферазой (GST-FibAGAR), переносили на нитроцеллюлозную мембрану после фракционирования методом ЭФ в ДЦС-ПААГ, ренатурировали и инкубировали с полноразмерным белком ТБГ1 или его делеционными мутантами. Взаимодействие между белками выявляли с использованием поликлональных антител против белка ТБГ1 ПЛВМ или его N-концевой половины. Белок His6-AtFib2 (около 35 кДа) связывается с белком ТБГ1 ПЛВМ. В отличие от него белок GST-FibAGAR не способен взаимодействовать с белком ТБГ1 ПЛВМ. Взаимодействия между GST и белком ТБГ1 обнаружено не было (данные не показаны). Эти результаты демонстрируют, что белок ТБГ1 способен прямо взаимодействовать с фибрилларином in vitro, и что N-концевой GAR-домен фибрилларина необходим для этого взаимодействия. Известно, что

GAR-домен фибрилларина отвечает за взаимодействие с транспортным белком ORF3 умбравируса (Kim et al., 2007b). Для выявления участков в составе белка ТБГ1, отвечающих за взаимодействие с фибрилларином, первоначально проверяли делеционные мутанты, соответствующие N- и С-концевым половинам белка ТБП - N63K и С63К, соответственно. Данный эксперимент демонстрирует, что с фибрилларином взаимодействует N63K, но не С63К (Рис. 5). В составе N-концевой половины белка ТБП с полноразмерным фибрилларином связывается домен NTD. Таким образом, опытами in vitro показано, что N-концевой домен (NTD) транспортного белка ТБП гордеивируса взаимодействует с GAR-доменом фибрилларина.

контроль (-)

понциэновыи красный

Рис. 5. Фар-Вестерн анализ взаимодействия белка ТБП ПЛВМ и его делеционных мутантов с фибрилларином. AtFib2-6His (дорожка 1), GST-AtFib2AGAR (дорожка 2), маркеры молекулярного веса (дорожка 3) и NTD (положительный контроль, дорожка 4), перенесенные на НЦ после ЭФ в ДДС-ПААГ, инкубировали с полноразмерным белком ТБП (белок 63К) и его делеционными мутантами N63K, С63К и NTD или в отсутствии белка (отрицательный контроль) и выявляли белок-белковое

взаимодействие антителами к полноразмерному белку ТБП. На правом нижнем блоте показана окраска белков понциановым красным (Ponceau S) и положение маркеров молекулярной массы.

Визуализация взаимодействия белка ТБП и фибрилларина in vivo методом бимолекулярной флуоресцентной комплементации (БиФК).

Для подтверждения взаимодействия между белком ТБП и фибрилларином т vivo был использован метод бимолекулярной флуоресцентной комплементации (БиФК). Принцип метода заключается в том, что предположительно взаимодействующие друг с другом белки «сшиваются» с нефлуоресцирующими половинами желтого флуоресцентного белка (YFP) - sYFPN и sYFPC, соответственно. Взаимодействие слитых белков при ко-экспрессии конструкций в клетках растения сопровождается восстановлением флуорофора YFP и соответственно появлением флюоресценции YFP.

12

Конструкции, содержащие ген фибрилларина да N. benthamiana, слитые с различными половинами гена YFP - sYFPN и sYFPC, соответственно, экспрессировали в листьях N. benthamiana и а[1ализировали КЛСМ на третий день после инфильтрации. В листьях, инфильтрированных этими конструкциями, наблюдалась интенсивная флуоресценция, аккумулированная в ядрышках и тельцах Кахаля, что полностью соответствует локализации нативного фибрилларина (Рис. 6А). Флуоресценция не выявлялась при ко-экспрессии отдельных половин YFP - sYFPN и sYFPC (данные не показаны).

При ко-экспрессии конструкций sYFPN-бЗК и sYFPC-бЗК флуоресценция YFP распределялась в цитоплазме клетки в виде включений различного размера. Флуоресценция внутри ядра отсутствовала. (Рис. 6Б). Эти результаты подтвердили ранее полученные биохимические данные о способности белка ТБГ1 ПЛВМ к гомологическим взаимодействиям (Lechshiner et al., 2006; Makarov et al., 2009). Однако характер распределения флюоресценции отличался от данных, полученных при экспрессии конструкций GFP-63K или 63K-GFP. Наблюдаемые различия могут объясняться особенностями метода БиФК. Известно, что взаимодействие между молекулами белков, связанными с половинами YFP, приводит к образованию стабильных белковых комплексов. Восстановление флуорофора YFP носит практически необратимый характер, что делает метод БиФК непригодным для мониторинга динамического взаимодействия молекул (Tilsner and Oparka, 2010). В случае ко-инфильтрации вектора, содержащего конструкцию sYFPN-бЗК с вектором, экспрессирующим только sYFPC, а также вектора, содержащего sYFPC-бЗК с вектором, экспрессирующим sYFPN, флуоресценция в клетках полностью отсутствует (данные не показаны).

Визуализацию взаимодействия между белком ТБГ1 ПЛВМ и фибрилларином в

клетках N. benthamiana, также проводили методом БиФК. При агроинфильтрации

бинарных векторов, экспрессирующих sYFPC-бЗК и sYFPN-Fib, в листья N. benthaniana

заметная флуоресценция наблюдалась в ядрышке и тельцах Кахаля. Флуоресценция также

выявлялась и в цитоплазме в виде включений различного размера (Рис. 6В). Аналогичное

распределение флуоресценции в клетке наблюдалось и в случае ко-экспрессии N-

концевой половины белка ТБГ1 (длиной 290 аа остатков), слитой с половиной sYFPC, и

sYFPN-Fib - вирусный и клеточный белки взаимодействовали в ядрышках, тельцах

Кахаля и цитоплазме (Рис. 6Г). При ко-экспрессии sYFPC-NTD и sYFPN-Fib

флуоресценция была зафиксирована только в ядрышках одиночных клеток, что, очевидно,

обусловлено низкой экспрессией белка (Рис. 6Д). Вестерн блот анализ

инфильтрированных листьев подтвердил накопление в листьях белков, слитых с

13

половинами YFP (данные не показаны). При ко-инфильтрации конструкций sYFPC-СбЗК. и sYFPN-Fib флуоресценции выявлено не было, что согласуется с отсутствием взаимодействия между С-концевым доменом белка ТБГ] и фибрилларином in vitro (Рис. 6Е).

Таким образом, и предполагаемые NLS/NoLS, и участок связывания фибрилларина находятся в N-концевом домене NTD белка ТБГ1. Данные, полученные методом БиФК, также показывают, что взаимодействие между вирусным транспортным белком ТБГ1 и фибрилларином происходит не только в ядрышках и тельцах Кахаля, но и в цитоплазме. Последнее может означать, что либо белки взаимодействуют в местах их синтеза, либо фибрилларин может ре-локапизоваться в комплексе с белком ТБГ1 из ядрышка в цитоплазму.

А Fib + Fib Б 63К ♦ 63К N

N

В 63К * Fib N Г ЦбЗК + Fib N

% CB No - •

Д PJTD+ Fib N Е С63К + Fib

N

Рис. 6. Визуализация белок-белковых взаимодействий in vivo методом бимолекулярной флуоресцентной комплементации. А - флуоресценция, детектированная KJICM на 3 день после инфильтрации листьев N. benthamiana. конструкциями, которые экспрессировали фибрилларин, слитый на N-конце с различными половинами желтого флуоресцирующего белка (YFP) (sYFPN-Fib и sYFPC-Fib) и окраска DAPI. Б - sYFPN-63K и sYFPC-бЗК - флуоресценция и окраска DAPI. В - sYFPN-бЗК и sYFPC-Fib - флуоресценция и окраска DAPI. Г - SYFPN-N63K и sYFPC- Fib -флуоресценция и окраска DAPI, Д - sYFPN-NTD и sYFPC-Fib флуоресценция и окраска DAPI, Е -

sYFPN-СбЗК. и sYFPC-Fib - окраска DAPI. Во вставках показаны отдельные ядра (флуоресценция) и наложение изображений флюоресценции и окраски DAPI. Ядра (N), ядрышки (No) и тельца Кахаля (СВ) отмечены стрелками. Масштабная линейка - 5 мкм для ядер и 20 мкм для общего плана.

N-кониевой домен белка ТБГ1 отвечает за взаимодействие с фибрилларином.

Картирование участка связывания фибрилларина с NTD проводили с помощью описанных ранее мутантов NTD (NTD-Amut, NTD-Bmut, NTD-ABmut, NTD-ABCmut) (Рис. 2Б), которые были экспрессированы в Е. coli как рекомбинантные белки, содержащие последовательность из шести остатков гистидина (Hisr,) на N-конце для выделения с помощью аффинной хроматографии. Белок-белковые взаимодействия изучали ранее описанным Фар-Вестерн методом. На рис. 7А показано, что мутанты с заменами положительно заряженных аминокислотных остатков нейтральными взаимодействуют с фибрилларином так же, как и NTD дикого типа. (Рис. 7А). Таким образом, замена остатков лизина и аргинина на аланин не влияет на взаимодействия между доменом NTD и фибрилларином. Эти результаты позволяют предположить, что участок взаимодействия с фибрилларином расположен за пределами положительно заряженных кластеров.

Недавно в нашей лаборатории было показано, что NTD - это полностью неупорядоченный домен (Makarov et al., 2009; 2011). NTD состоит из протяженной N-концевой области (1-82 аа) с теоретически рассчитанной изоэлектрической точкой pl 4,62, за которой следуют чередующиеся положительно и отрицательно заряженные участки длиной 14-16 аа остатков. Теоретические изоэлектрические точки для этих участков составляют: pl 9,53 для 82-97 аа; pl 4,31 для 98-113 аа; pl 10,87 для 114-129 аа (кластер А); pl 6,28 для 130-145 аа; pl 10,18 для 146-161 аа (кластер С); pl 4,37 для 162-175 аа и pl 10,22 для 176-190 аа (кластер В) (Makarov et al., 2011). Таким образом, отрицательно заряженный участок может отвечать за взаимодействие белка ТБГ1 с фибрилларином. Для проверки этого предположения были сконструированы два дополнительных мутанта NTD: мутантный белок, содержащий аминокислотные остатки с 1 по 82 (мутант NTD1"82), и мутантный белок, содержащий аминокислотные остатки с 82 по 200 (мутант NTD82"200) (Рис. ЗВ). Фар-Вестерн анализ показал, что только мутант NTD1"82 связывается с фибрилларином (Рис. 7Б). Интересно, что теоретически рассчитанная pl GAR-домена фибрилларина составляет 12,4. Таким образом, возможно, имеет место

электростатическое взаимодействие между положительно заряженным ОАЯ-доменом фибрилларина и отрицательно заряженной областью ЫТЭ белка ТБГ1.

-i. £ о

NTD-ABmut NTD-ABCmut понциановый

красный

понцианрвыи красный

Рис. 7. Картирование участка NTD, взаимодействующего с

фибрилларином in vitro методом Фар-Вестерн анализа. А - AtFib2 (дорожка 1), GST-AtFib2AGAR (дорожка 2), маркеры молекулярного веса (дорожка 3) и NTD (положительный контроль, дорожка 4), перенесенные на НЦ после ЭФ в ДДС-ПААГ инкубировали с NTD и его мутантами по положительно заряженным кластерам - кластер А (NTD-Amut), кластер В (NTD-Bmut), кластеры А и В (NTD-ABmut) и кластеры А,В и С (NTD-ABCmut) и выявляли белок-белковое

взаимодействие антителами к полноразмерному белку ТБГ1. На правом нижнем блоте показана окраска белков понциановым красным (Ponceau S) и положение маркеров молекулярной массы. Б - блоты, содержащие те же белки, что и в (А) инкубировали с делеционными мутантами NTD - NTD1" 82 и NTD82"200 и антителами к белку ТБГ1. На правом нижнем блоте показана окраска белков понциановым красным (Ponceau S) и положение маркеров молекулярной массы. Мутант NTD8-"200 использован как

положительный контроль.

Вирусные белки ряда вирусов растений не только ко-локализуются в ядрышках с их главным белком фибрилларином но и способны прямо взаимодействовать с этим белком ядрышка (Taliansky et al., 2010). Это взаимодействие требуется для реализации различных функций вируса: так фибрилларин совместно с транспортным белком умбравируса ORF3 принимает участие в образовании вирусных цитоплазматических РНП-частиц для дальнего транспорта вируса (Kim et al., 2007а; 2007b), вместе с белком VPg потивируса требуется для репликации вирусной РНК и/или супрессии посттранскрипционного умолкания генов (Rajamaki & Valkonen, 2009). Предположено, что взаимодействие с фибрилларином может быть общим свойством белков вирусов растений из различных таксономических групп. Полученные нами данные о

взаимодействии транспортного белка ТБГ1 горлеивируса и фибрилларина свидетельствуют в пользу этого предположения.

Транспортный белок ТБГ1 ПЛВМ способен взаимодействовать с коилином in vitro. Кластер A NTD отвечает за связывание с коилином

На рис. 6В видно, что наряду с ядрышками, белок ТБГ1 ПЛВМ локализуется и в тельцах Кахаля, субъядерных структурах, которые обнаруживаются в ядрах клеток многих представителей эукариот и в том числе в ядрах клеток растений и физически и функционально связаны с ядрышками. ТК принимают участие в процессах сборки, модификации и транспорта ряда РНК-белковых комплексов, включая малые ядерные рибонуклеопротеидные комплексы, контролирующие сплайсинг РНК (Cioce and Lamond, 2005). Предполагается, что наряду с ядрышками ТК участвуют в регуляции клеточного цикла и развития, а также в ответе на стресс различного происхождения (Cioce and Lamond, 2005; Boulon et al., 2010). Известно, что ядро и ядрышко играют важную роль в процессе вирусной инфекции. Роль ТК в этих процессах остается мало изученной и ограничена несколькими примерами. Показано, что при заражении клеток вирусами герпеса простого тип 1 и аденовирусом происходит перераспределение коилина и некоторых других компонентов из ТК в различные структуры внутри ядра, в том числе и во вновь образующиеся структуры, вовлеченные в вирусспецифические процессы (Morency et al., 2007; James et ai, 2010). При инфекции растений умбравирусом происходит реорганизация ТК в содержащие вирусный транспортный белок (ТБ) ТК-подобные структуры, которые сливаются с ядрышком. На следующем этапе вирусный белок в комплексе с белком ядрышка фибрилларином ре-локализуется в цитоплазму, где формирует вирусные РНП-частицы, участвующие в дальнем транспорте вирусной инфекции (Kim et al., 2007а; 2007b). Коилин является основным структурным компонентом ТК и также присутствует в нуклеоплазме в диффузном состоянии (Cioce and Lamond, 2005; Collier et al., 2006). Непосредственное физическое взаимодействие коилина с вирусными белками не изучалось.

Для выявления взаимодействия белка ТБГ1 ПЛВМ и его мутантов с рекомбинантным коилином из Arabidopsis thaliana in vitro использовали Фар-Вестерн анализ. Рекомбинантные белки разделяли электрофорезом в ДДС-ПААГ, переносили на нитроцеллюлозную мембрану, ренатурировали, инкубировали с рекомбинантным

17

коилином, и белок-белковое взаимодействие выявляли антителами к коилину. Как показано на рисунке (Рис. 8) с коилином взаимодействует полноразмерный белок ТБГ1, его N-концевая половина, но не С-концевая половина белка ТБГ1. В составе N-концевой половины белка коилин связывается с доменом NTD, но не с доменом ID. Замена основных аминокислот на нейтральные в кластере А сопровождается практически полной потерей способности NTD взаимодействовать с коилином. Аналогичная замена в кластере В приводит к незначительному снижению связывания. При одновременных заменах в кластерах А и В связывание коилина полностью ингибируется. Таким образом, в составе белка ТБГ1 выявляются участок/участки, которые специфически взаимодействуют с коилином растений. Главную роль в этом взаимодействии играет положительно заряженный кластер А. Кластер В, возможно, выполняет вспомогательную роль. Интересно, что оба этих кластера отвечают за связывание NTD с РНК in vitro, причем кластер А также выполняет основную роль в этих взаимодействиях (Kalinina eta/., 2001).

<

о

< ó

Рис. 8. Взаимодействие белка ТБГ1 ПЛВМ, его делеционных и точечных мутантов с коилином in vitro (Фар-Вестерн анализ).

Рекомбинантные вирусные белки, перенесенные на НЦ после ЭФ в ДДС-ПААГ, окрашивали понциановым красным (Ponceau S) (А) или инкубировали с рекомбинантным коилином из Arabidopsis thaliana и выявляли белок-белковое взаимодействие антителами к коилину (Б).

Визуализация взаимодействия белка ТБГ1 и коилина \п vivo методом бимолекулярной

флуоресцентной комплементации (БиФК).

Временная экспрессия конструкций sYFPN-coilin/sYFPC-coilin при агроинфильтрации листьев N. benthamiana сопровождается появлением флуоресценции,

которая локализуется в субъядерных частицах, соответствующих ядрышку и множественным включениям различного размера в нуклеоплазме (Рис. 9). Подобная локализация коилина не является типичной, поскольку в норме белок локализуется в ТК и диффузно в нуклеоплазме. В то же время для клеток HeLa показано, что суперэкспрессия экзогенного коилина сопровождается разрушением ТК с одновременным увеличением диффузного нуклеоплазматического компонента и накоплением коилина в ядрышках (Hebert and Matera, 2000). В условиях нашего эксперимента заметное увеличение размеров ядрышка, занимающего значительный объем ядра, и появление в некоторых случаях множественных включений в нуклеоплазме, вероятно, также является следствием суперпродукции экзогенного коилина. Представляется вероятным, что множественные включения коилина в нуклеоплазме не являются ТК, а представляют собой комплексы нуклеоплазматического коилина. В тоже время в некоторых клетках флуоресценция обнаруживается в периферической области ядрышка и единичных структурах, видимо, представляющих собой тельца Кахаля.

Рис. 9. Визуализация методом бимолекулярной флуоресцентной комплементации взаимодействия между коилином и вирусным белком ТБГ] в клетках эпителия растений табака N. benthamiana. Локализация флуоресценции при взаимодействии между молекулами коилина (sYFPN-coilin + sYFPC-coilin) и молекулами коилина и белка ТБГ1 (sYFPN-coilin + sYFPC-бЗК), слитыми с половинами YFP, флуоресценция и окраска DAPI. Общий план и изображения отдельных ядер. Масштабная линейка - 5 мкм для ядер и 20 мкм для общего плана.

Полученные результаты по локализации экзогенного коилина требуют дальнейшего детального изучения. Однако появление флуоресценции при использовании метода БиФК согласуется с данными о способности молекул коилина к олигомеризации (Hebert and Matera, 2000).

На рис. 6Б показано, что взаимодействие между молекулами белка ТБГ1, слитого с различными половинами YFP, происходит исключительно в цитоплазме клеток во включениях различного размера. Однако при временной экспрессии в клетках N.

19

benthamiana конструкций sYFPN-coilin и sYFPC-63K или sYFPC-coilin и sYFPN-63K флуоресценция выявляется в тех же структурах ядра, что и при экспрессии соответствующих конструкций, содержащих только коилин, а именно в ядрышке, размер которого увеличен, или в ядрышке и включениях различного размера в нуклеоплазме (рис. 9). Флуоресценция в цитоплазме полностью отсутствует. Полученные методом БиФК результаты свидетельствуют о взаимодействии между коилином и белком ТБГ1 гордеивируса in vivo в клетках растения и подтверждают результаты, полученные in vitro.

Таким образом, в экспериментах in vitro и in vivo показано, что вирусный транспортный белок способен специфически взаимодействовать с ядерными белками фибрилларином и коилином. В настоящее время неизвестно, как вирусные белки попадают в ядрышко. Предполагается, что первоначально они входят в ядро посредством классического NLS, а затем транспортируются в ядрышко прямо или опосредованно при взаимодействии с компонентами ядрышек (белками ядрышек или РНК) (Hiscox, 2007; Emmott & Hiscox, 2009). Полученные нами данные показали, что кластер В вовлечен в локализацию белка ТБГ1 ПЛВМ, являясь NoLS или частью NoLS. Однако специфическое взаимодействие с фибрилларином и коилином, оба из которых способны локализоваться в ядрышке, не позволяют исключить участие этих белков/белка в транспортировке вирусного белка ТБГ1 в ядрышко. Таким образом, локализация белка ТБГ1 ПЛВМ может зависеть от нескольких факторов, как, например, показано для транспортного белка умбравируса - белка ORF3. Локализация его в ядрышке зависит от NLS и остатка лейцина в составе лейцин-богатого домена белка (NES), вовлеченного в прямое взаимодействие с фибрилларином (Kim et al., 2007b). Мутации в этом домене предотвращают связывание фибрилларина с белком ORF3 и перемещение вирусного белка в ядрышко (Kim et al., 2007а).

Заключение

В настоящей работе в составе N-концевого домена (NTD) гордеивируса ПЛВМ обнаружены последовательности, необходимые для локализации белка ТБГ1 в ядре (предполагаемый NLS), в ядрышке (предполагаемый NoLS) и участки взаимодействия с основным белком ядрышка фибрилларином и основным белком телец Кахаля коилином. NTD вирусов различных таксономических групп с ТБГ гордеивирусного типа не имеют гомологии в аминокислотной последовательности, заметно различаются по длине, но характеризуются наличием кластеров, обогащенных аргинином/лизином, как правило,

20

обладающих РНК-связывающей активностью (Morozov and Solovyev, 2003). Эти кластеры (и в целом N-концевые домены белков ТБГ1) выполняют важную роль в дальнем транспорте вирусов по флоэме растений. Мутация одного кластера в случае короткого NTD белка ТБГ1 бенивируса некротического пожелтения жилок свеклы (ВНПЖС) (Erhardt et al., 2000), любого из двух кластеров - в случае длинного NTD гордеивируса ПЛВМ (Kalinina et al., 2001) и делеция части NTD белка ТБГ1 помовируса ВСВК (Wright et al., 2010) не влияют на межклеточный транспорт, но отменяют системный транспорт вирусов. NTD в соответствии с нашими данными (Makarov et al., 2009, 2012) является полностью внутренне неупорядоченным доменом, высокая степень структурной лабильности (подвижности) которого делает его вероятным кандидатом на взаимодействие с различными партнерами - белками и нуклеиновыми кислотами. Поскольку сигналы, отвечающие за ядерную/ядрышковую локализацию и за взаимодействие с коилином, локализуются в составе РНК-связывающих кластеров А и В, возможно, что именно эти активности, а не РНК-связывающие свойства кластеров определяют функциональную роль NTD в вирусной инфекции. Интересно, что распространение инфекции при заражении растений рекомбинантными вирусами ВСВК и ВШМЯ, содержащими в своем геноме ген GFP, слитый с геном белка ТБГ1, ограничено межклеточным транспортом (Lawrence and Jackson, 2001; Wright et al., 2010). Предполагается, что GFP, слитый с N-концом вирусного белка, может нарушать конформацию домена NTD и влиять/отменять на его свойства/активности, необходимые для обеспечения дальнего транспорта вирусного генома.

Обнаружение в составе белка ТБГ1 ПЛВМ специфических участков, отвечающих за локализацию белка в ядрышке и взаимодействие с ядерными белками, свидетельствует в пользу существования специфических функций белка ТБГ1 в ядре клетки и важную роль ядра/ядрышка в инфекционном цикле гордеивирусов. Полученные данные позволяют высказать несколько предположений: 1) локализация в ядре/ядрышке необходима для взаимодействия вирусного транспортного белка с клеточными компонентами, обеспечивающими формирование вирусного РНП-комплекса для выхода в проводящую систему растения (дальний транспорт); 2) ядерные белки удерживают в ядре вирусный белок, необходимый для обеспечения транспорта вирусного генома в растениях, что, может приводить к ингибированию системного распространения вирусной инфекции; 3) учитывая важную роль, которую выполняют фибрилларин/ядрышко и коилин/тельца Кахапя в разнообразных процессах в ядре клетки, в частности, в ответе на стресс, можно

предположить, что вирусный белок влияет на функции ядерных белков и опосредованно на развитие вирусной инфекции.

Выводы

1. Показано, что транспортный белок ТБГ1 гордеивируса полулатентного вируса мятлика, слитый с зеленым флуоресцентным белком, способен локализоваться в ядрышке эпидермальных клеток N. benthamiana при индивидуальной экспрессии (в отсутствии других вирусных белков).

2. Показано, что сигналы, необходимые для локализации белка ТБГ1 в ядре и ядрышке, картируются в составе неупорядоченного N-концевого домена (NTD) в пределах кластера A U6KSKRKKKNKK125 и кластера В '"KKATKKESKKQTK187, соответственно.

3. Выявлено, что рекомбинантный белок ТБГ1 ПЛВМ взаимодействует in vitro с белком ядрышка фибрилларином (AtFib2 из Arabidopsis thaliana) и белком телец Кахаля коилином (Atcoilin из Arabidopsis thaliana). С глицин-аргинин-богатым (GAR) доменом фибрилларина связывается участок домена NTD, включающий первые 82 аминокислотных остатка белка ТБГ1. С молекулой коилина взаимодействует кластер А домена NTD.

4. Взаимодействия между вирусным белком и белками ядрышка (белок ТБГ1 и фибрилларин) и (белок ТБГ1 и коилин) подтверждены опытами in vivo при ко-экспрессии в растениях N. benthamiana белка ТБГ1 или его делеционных мутантов и каждого из ядерных белков, слитых соответственно с различными половинами желтого флуоресцентного белка. Комплексы фибрилларин-белок ТБГ1 локализуются в ядрышках, тельцах Кахаля и включениях в цитоплазме эпидермальных клеток. Комплексы коилин-белок ТБГ1 локализуются в ядрышках и во включениях в нуклеоплазме.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Semashko М.А., González I., Shaw J., Leonova O.G., Popenko V.I., Taliansky M.E., Canto Т., Kalinina NO. The extreme N-terminal domain of a hordeivirus TGB1 movement protein mediates its localization to the nucleolus and interaction with fibrillarin// Biochimie. 2012. V.94. 2012. P. 1180-1188.

2. Семашко M.A., Ракитина Д.В., Гонзалес И., Канто Т., Калинина Н.О., Тальянский М.Э. Транспортный белок гордеивируса взаимодействует in vitro и in vivo с коилином, основным структурным белком телец Кахапя.// Доклады Академии Наук. 2012. Т. 442. № 6. С. 833-836.

3. Kalinina N., Shaw J., Semashko M, Canto Т. and Taliansky M. Re-localization of fibrillarin from the nucleolus to cytoplasm in the presence of hordeivirus TGB1 proteins.// International Advances in Plant Virology. The Netherlands, Arnhem. 2010.

4. Semashko M., Gonzales I., Shaw J., Rakitina D., Canto Т., Taliansky M. and Kalinina N. Clusters of Positively Charged Aminoacids of Hordeivirus TGB1 Movement Protein Indispensable for Virus Long-distance Transport Contain Presumable NLS and Interact with Nucleolar Protein Fibrillarin.// International conference on plant vascular biology. PVB2010. USA. OH.Columbus. 2010. P. 91.

5. Semashko M., Gonzales I., Canto T. and Kalinina N. Hordeivirus movement protein interacts with a nucleolar protein fibrillarin.// 35th FEBS Congress. Molecules of Life. Sweden. Gothenburg. 2010. YSF-104.

6. Kalinina N., Semashko M., Shaw J., Gonzales 1., Rakitina D., Canto Т., Taliansky M. Hordeivirus TGB1 movement protein is able to interact with fibrillarin both in vitro and in vivo.// EMBO Workshop. Genomic approaches to interactions between plant viruses, their hosts and their vectors. Italy. Fenestrelle. 2010. P. 49.

7. Семашко M.A. Транспортный белок ТБГ1 гордеивируса взаимодействует in vitro с белком ядрышка фибрилларином.// Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008». Секция Биология. Москва. 2008. С. 155.

Подписано в печать:

23.04.2012

Заказ № 7264 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autorefcrat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Семашко, Мария Александровна, Москва

московский государственный университет

имени м.в. ломоносова биологический факультет

61 12-3/947

1а правах рукописи

Семашко Мария Александровна

ЛОКАЛИЗАЦИЯ ТРАНСПОРТНОГО БЕЛКА ГОРДЕИВИРУСА В ЯДРЫШКЕ И ЕГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С БЕЛКАМИ ЯДРЫШКА И ТЕЛЕЦ

КАХАЛЯ

03.02.02 - Вирусология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Калинина Наталья Олеговна

Москва 2012

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ..........................................................................................................................................1

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................................................................3

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................................................5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................................................7

1. Общая характеристика ядра и ядерных компартментов.....................................................................7

1.1 Ядро.....................................................................................................................................................7

1.2. Ядрышко............................................................................................................................................8

1.2.1.Фибриллари н........................................................................................................................11

1.2.2. Нуклеолин...........................................................................................................................11

1.2.3. Белок В23............................................................................................................................12

1.2.4. Дополнительные функции ядрышка.................................................................................12

1.3. Тельца Кахаля.................................................................................................................................14

2. Ядрышко и вирусная инфекция..........................................................................................................15

2.1. Взаимодействие вирусспецифических белков вирусов человека и животных с белками ядра и ядрышка..................................................................................................................................................15

2.2. Локализация вирусспецифических белков вирусов растений в ядрышке клеток....................17

3. Сигналы ядерной и ядрышковой локализации в составе клеточных и вирусных белков.............20

3.1. Сигналы ядерной локализации......................................................................................................20

3.2. Сигналы локализации в ядрышке..................................................................................................21

4. Вирусы растений, белки которых локализуются в ядрышках зараженных клеток......................24

4.1. Умбравирусы...................................................................................................................................24

4.2. Вирусы с тройным блоком транспортных генов.........................................................................25

4.3. Потивирусы.....................................................................................................................................26

4.4. Другие белки вирусов растений, роль локализации которых в ядрышке не ясна...................27

5. Особенности транспорта в растениях вирусов с тройным блоком транспортных генов на моделях гордеивирусов и помовирусов.................................................................................................29

5.1. Характеристика гордеивирусов.....................................................................................................29

5.2. Характеристика помовирусов........................................................................................................31

5.3. ТБГ гордеивирусного типа и транспорт вируса...........................................................................32

5.4. Свойства белков ТБГ1 гордеивирусного типа.............................................................................33

5.5. Транспортная форма гордеи-подобных вирусов.........................................................................34

5.6. Субклеточная локализация белков ТБГ1......................................................................................36

5.7. Модель внутриклеточного и межклеточного транспорта вирусов с гордеи-подобным ТБГ.. 38

5.7.1. Модель транспорта гордеивирусов...................................................................................39

5.7.2. Модель транспорта помовирусов.....................................................................................40

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ........................................................................................................44

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ....................................................................................................................44

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..........................................................................................................58

При индивидуальной экспрессии белок ТБГ1 ПЛВМ выявляется в ядрышках эпидермальных клеток растений N. benthamiana...........................................................................................................58

Биоинформатический анализ аминокислотной последовательности белка ТБГ1 ПЛВМ..............62

N-концевой домен отвечает за локализацию белка ТБГ1 ПЛВМ в ядрышке.................................64

Картирование сигнала ядерной локализации в кластере А домена NTD.........................................67

Картирование сигнала ядерного экспорта...........................................................................................69

GAR домен фибрилларина взаимодействует с NTD белка ТБГ1 ПЛВМ in vitro...........................71

Визуализация взаимодействия белка ТБГ1 и фибрилларина in vivo методом бимолекулярной флуоресцентной комплементации (БиФК)..........................................................................................72

N-концевой участок домена NTD отвечает за взаимодействие с фибрилларином.......................76

Транспортный белок ТБГ1 ПЛВМ способен взаимодействовать с коилином in vitro. Кластер А NTD отвечает за связывание с коилином............................................................................................78

Визуализация взаимодействия белка ТБГ1 и коилина in vivo методом бимолекулярной флуоресцентной комплементации (БиФК)..........................................................................................80

ВЫВОДЫ..................................................................................................................................................86

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................................87

ВВЕДЕНИЕ

Взаимодействия между вирусом и клеткой растения-хозяина играют центральную роль в жизненном цикле вирусной инфекции. Анализ взаимодействий вирус-хозяин является критически важным для понимания механизмов вирусной инфекции и для развития новых стратегий противодействия вирусам. Вирусы являются облигатными внутриклеточными патогенами с геномом небольшого размера и, таким образом, основывают свою стратегию на обращении в свою пользу и эксплуатации клеточных функций и механизмов для обеспечения их собственной репликации. Клеточное ядро является одним из ключевых отличий эукариотической клетки от прокариотической. Это высоко динамичная, окруженная мембраной органелла, в которой происходят главнейшие события жизни клетки, включая репликацию ДНК, синтез и процессинг информационной РНК, а также биогенез субъединиц рибосом. Поскольку ядро играет ключевую роль в функционировании клетки растения-хозяина, неудивительно, что вирусы взаимодействуют с этой органеллой и ее компартментами, и что эти взаимодействия играют ключевую роль в цикле вирусной инфекции. Действительно, некоторые вирусы, включая ДНК-содержащие бегомовирусы растений, РНК-содержащие (с обратной транскрипцией) каулимовирусы и обладающие негативным РНК-геномом рабдовирусы реплицируются в ядре, и, таким образом, представляется логичным, что эти вирусы модифицируют структуру ядра с целью захвата некоторых функций ядра и обеспечения соответствующего окружения для собственной репликации. Напротив, вирусы с одноцепочечным РНК геномом положительной полярности реплицируются в цитоплазме. Цель взаимодействия подобных РНК-содержащих вирусов с ядром не столь очевидна. Однако все возрастающее количество сообщений свидетельствует, что цитоплазматические РНК-содержащие вирусы, включая вирусы растений, также могут локализоваться в ядре, конкретнее, в ядрышке. Стадия локализации в ядрышке является необходимой для успешного развития вирусной инфекции. Взаимодействие с белками ядрышка у различных вирусов требуется для обеспечения различных этапов жизненного цикла вирусов, в том числе для защиты от посттранскрипционного умолкания генов, репликации вирусного генома и распространения вируса в инфицированных растениях. Нарушая стадию локализации вирусных белков в ядрышке и их взаимодействие с белками ядрышка, можно влиять на эффективность вирусной инфекции.

Таким образом, исследования причин и путей, которыми РНК-содержащие вирусы растений взаимодействуют с ядрышком, преследуя свои собственные цели, позволяет не только лучше понять молекулярную биологию вирусов растений и ускорить разработку новых стратегий для контроля вирусных заболеваний. Эти исследования также могут прояснить фундаментальные принципы структуры и функционирования растительного ядрышка.

Объектом данной работы является транспортный белок, кодируемый первым геном специального транспортного модуля - тройного блока генов (ТБГ), гордеивируса полулатентного вируса мятлика (белок ТБГ1 ПЛВМ). Белок ТБГ1 гордеивирусов образует рибонуклеопротеидный (вРНП) комплекс с геномной и субгеномными РНК вируса для ближнего транспорта между соседними клетками растения и дальнего транспорта по проводящей системе растения флоэме. В составе М-концевого домена (ЫТХ)) белка ТБГ1 гордеивируса выявлены два кластера положительно заряженных аминокислотных остатков, ответственных за некооперативное связывание с РНК и дальний транспорт вирусной инфекции. Данные, полученные на помовирусе скручивания верхушек картофеля (ВСВК), акже свидетельствуют важной роли домена ЫТО белка ТБГ1 ВСВК в дальнем транспорте для вирусов с ТБГ гордеивирусного типа: делеция значительной части N11) сопровождалась блокированием дальнего, но не ближнего (межклеточного) транспорта вируса; кроме того, было показано, что ЫТВ отвечает за локализацию белка ТБГ1 ВСВК в ядре/ядрышке растительной клетки.

Модели транспорта гордеивирусов и помовирусов во многом сходны, в связи с чем, цель данной работы состояла в выявлении предполагаемой локализации белка ТБГ1 ПЛВМ в ядре/ядрышке клеток растений табака Шсойапа ЬеШкат'шпа и изучении взаимодействия между белком ТБГ1 и основными белками ядрышка и телец Кахаля (ТК), субъядерной структуры, физически и функционально связанной с ядрышком.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БАР1 4',6-диамидино-2-фенилиндол

ОАК глицин-аргинин богатый домен

СЕР зеленый флуоресцирующий белок

ОБТ глутатион-Б-трансфераза

НЕЬО хеликазный/НТФазный домен

1РТС (ИПТГ) изопропил-1 -тио-Р-Б-галактозид

тИФ мономерный красный флуоресцирующий белок

ЫЕБ сигнал ядерного экспорта

№-НТА Ыг' нитрилотриацетатная агароза

N1,8 сигнал ядерной локализации

№>Ь8 сигнал ядрышковой локализации

ЫРС комплекс ядерной поры

N10 М-концевой домен

БУЕР разделенный желтый флуоресцирующий белок

БиФК бимолекулярная флуоресцентная комплементация

БСА бычий сывороточный альбумин

ВКПЛ вирус кольцевой пятнистости лихниса

ВЛБДК вирус латентной бледности душистого колоска

ВНПЖС вирус некротического пожелтения жилок свеклы

вом вирус огуречной мозаики

ВРА вирус розетчатости арахиса

вРНП вирусный рибонуклеопротеид

ВСВК вирус курчавости верхушек картофеля

ВШМЯ вирус штриховатой мозаики ячменя

дсн додецилсульфат натрия

дцРНК двучепочечная РНК

мякРНК малые ядрышковые РНК

мяРНК малые ядерные РНК

НТФ Нуклеозидтрифосфат

нц Нитроцеллюлоза

ОРТ открытая рамка трансляции

оцРНК одноцепочечная РНК

ПААГ полиакриламидный гель

ПЛВМ полу латентный вирус мятлика

ПМСФ Фенилметансульфонилфторид

пре-рРНК предшественник рибосомальной РНК

ПТУГ посттранскрипционное умолкание генов

ПЦР полимеразная цепная реакция

сгРНК субгеномная РНК

ТБ транспортный белок

ТБГ тройной блок генов

ТК тельце Кахаля

ХВК Х-вирус картофеля

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Общая характеристика ядра и ядерных компартментов

1.1 Ядро

Ядро клетки представляет собой высоко специфическую органеллу, отвечающую за организацию, репликацию и деление хромосом, за экспрессию генов и за регуляцию и интеграцию весьма разнообразного спектра функций, которые являются необходимыми для нормального функционирования клетки. Для ядра характерны регионы, богатые хроматином, состоящие из конденсированного гетерохроматина, более диспергированного эухроматина и интерхроматиновые регионы. Организация хроматина определяет регуляцию и экспрессию генов, ДНК репликацию и разделение хромосом (Schneider and Grosschedl, 2007; Trinkle-Mulcahy and Lamond, 2008). Дополнительно в клеточном ядре выделяют множество различных структур или телец различного размера, присутствующих в разном количестве в зависимости от типа клеток, стадии клеточного цикла и внешних условий. Наиболее значимым и изученным из них является ядрышко. Кроме того, в ядре идентифицированы такие субъядерные структуры как тельца Кахаля (ТК), пятна сплайсинга, парапятна, тельца про-миелоидной лейкемии и ряд других (Рис. 1). В настоящее время проводятся исследования для всесторонней характеристики этих структур на основании выявляемых в их составе белков и РНК и выполняемых ими функций (Boisvert et al, 2007; Cioce and Lamond, 2005; Lamond and Spector, 2003; Matera et al, 2009; Rippe, 2007)

Nucleus

Nuclear envelope —

—Nucleolus

# ™

1 -—Cytoplasm У

Рис. 1. Изображение ядра клетки млекопитающего, полученное методом конфокальной лазерной микроскопии. Ядро отделено от цитоплазмы клетки ядерной мембраной (Hiscox, 2007).

1.2. Ядрышко

Ядрышко является внутриядерным компартментом, формируемым вокруг кластера генов, кодирующих рибосомальную РНК (рРНК), и является сайтом их транскрипции, процессинга синтезированной пре-рРНК и сборки рибосомньтх субъединиц (Olson and Dundr, 2005; Rubbi and Milner, 2003; Sim et al., 2008). До недавнего времени эксклюзивной функцией ядрышка считался синтез рРНК и биогенез рибосом. Результаты исследований последних лет способствовали пересмотру классических представлений о функциях ядрышка, ограниченных биогенезом рибосом. В настоящее время показана вовлеченность ядрышка во многие иные аспекты функционирования клетки, в частности, в регуляцию клеточного цикла, феномен умолкапия генов, активность теломераз, старение, реакцию на стресс и биогенез множества различных рибоиуклеоиротеидных (PHI i) частиц (Boisvert el al., 2007; Olson and Dundr, 2005; Sirri el al., 2008).

При помощи трансмиссионной микроскопии было показано, что ядрышко - это не однородная структура, оно содержит фибриллярный центр, плотный фибриллярный компонент и гранулярный компонент (Рис. 2).

Е

D

7-2/MRP snoRl

snoK2 snoR3

С

BrlH'P loci

В

Рис. 2. Схема ядрышка (по Brown and Shaw, 1998)

A. Электронно-микроскопическая структура. Показаны фибриллярный центр (FC), гранулярный (GC) и плотный фибриллярный (DFC) компонент, ядрышковая полость (V) и тельца Кахаля (СВ).

B. Возможная молекулярная организация комплексов транскрипции рДНК.

C. Показаны участки, в которых обнаруживаются внешние спейсерньте последовательности (ETS) пре-рРНК и участки, в которых ETS удалены, но все еще присутствуют внутренние спейсерные последовательности (ITS).

D и Е. Локализация различных малых ядрышковых РНК.

F. Локализация фибрилларина. 1 ¡оказано, что фибрилларин обнаруживается в фибриллярном компоненте ядрышка и тельцах Кахаля.

В ядрышках млекопитающих фибриллярные центры малы: это плохо окрашиваемые структуры, окруженные более густо окрашиваемыми зонами плотного фибриллярного компонента. Плотный фибриллярный компонент окружен регионом гранулярного компонента. Ядрышко растительной клетки имеет более правильную структуру, чем ядрышко животной клетки. В ядрышках растительных клеток наблюдается организация регионов, отличная от животных клеток. Здесь плотный фибриллярный компонент не так густо окрашивается, как в животной клетке и занимает большую часть ядрышка.

Основная функция ядрышка - транскрипция и процессинг предшественников рибосомальных РНК и сборка рибосомных субъединиц. Динамический механизм сборки включает в себя серию промежуточных пре-рибосомальных комплексов для 40S и 60S рибосомных субъединиц. Транскрипция предшественников рРНК происходит со многих сайтов (около 200-400) внутри региона плотного фибриллярного компонента. Предшественники рРНК подвергаются процессингу в регионах плотного фибриллярного компонента и гранулярного компонента. В растительных клетках часто имеется центральный регион - ядрышковая впадина (Brown and Shaw, 1998; Shaw and Brown, 2004). Функции ее не известны. В сборке рибосомальных субъединиц участвуют промежуточные пре-рибосомальные комплексы 40S и 60S субъединиц и рибосомальные белки. В целом, этот процесс требует более 200 вспомогательных белков. Процессинг пре-рРНК включает процесс нуклеотидной модификации (главным образом метилирование по 2'-0-рибозе и присоединение псевдоуридина). Процесс модификации и процессинга пре-рРНК происходит с участием малых ядрышковых РНП (мякРНП). Существует мощный поток белков и РНП-комплексов внутрь и из ядрышка. Рибосомальные белки активно синтезируются и быстро накапливаются в ядрышке, где они объединяются в рибосомальные субъединицы или быстро деградируют (Lam et al., 2007). Структурная целостность ядрышка зависит от активности РНК полимеразы I и правильной экспрессии ядрышковых белков. Наиболее распространенными и хорошо изученными являются три белка ядрышка - фибрилларин, нуклеолин и белок В23.

1.2.1. ФИБРИЛЛАРИН

Фибрилларин - мажорный белок ядрышка, требующийся для процессинга пре-рРНК (Venema and Tollervey, 1999). Фибрилларин обладает метилтрансферазной активностью