Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм накопления белков в ядрышке

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Механизм накопления белков в ядрышке"

На правах рукописи

Мусинова Яна Рафаеловна

МЕХАНИЗМ НАКОПЛЕНИЯ БЕЛКОВ В ЯДРЫШКЕ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДГІР

Москва-2012

005020133

Работа выполнена в отделе электронной микроскопии Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Поляков Владимир Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Макарова Ольга Васильевна

доктор химических наук, доцент Сергиев Петр Владимирович

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Защита состоится «__„ у 2012 г. в 15 часов 30 минут на заседании

диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, МГУ, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова

Автореферат разослан «16» марта 2012 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета, , }

кандидат биологических наук

Калистратова Елена Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Нормальное функционирование интерфазного ядра (как и других органоидов эукариотической клетки, ограниченных липидными мембранами) обеспечивается механизмами, контролирующими селективный транспорт белков и РНК между цитозолем и внутренним компартментом. Макромолекулы, импортирующиеся в ядро или экспортирующиеся из ядра в цитозоль, несут специальные сигналы, которые узнаются белками комплексов ядерных пор. В случае импортируемых макромолекул эти сигналы обозначаются как сигналы ядерной локализации (Nuclear Localization Signal, NLS). После вхождения в ядро импортированные белки (например, белки хроматина, факторы транскрипции и процессинга РНК и многие другие) перераспределяются по ядерным субдоменам. В настоящее время в интерфазных ядрах описано большое число структурно-функциональных субдоменов: ядрышки, тельца Кахаля (Cajal bodies), интерхроматиновые гранулы (nuclear speckles), тельца, содержащие белки «молчания» генов (Polycomb bodies), стрессовые белки (PML bodies) и многие другие (Мао et al., 2011).

Вопрос о том, каков механизм «узнавания» импортированными белками мест своей локализации в сложной системе интерфазного ядра, остается открытым. При этом необходимо учитывать, что ядерные субдомены не ограничены мембранами, а большинство ядерных белков (за исключением коровых гистонов и ламинов) являются высоко динамичными, т.е. связаны со своими сайтами не стабильно, а только на протяжении небольшого времени, называемого «временем удержания».

Наиболее значимые факты, проливающие свет на эту проблему, получены при анализе белков ядрышка. Показано существование особого класса аминокислотных последовательностей, которые обеспечивают накопление белков в ядрышке. Эти последовательности принято называть «сигналами ядрышковой локализации» (Nucleolar Localization Signal, NoLS). Интересно, что некоторые NoLS перекрываются с хорошо известными NLS (Kubota et al, 1999; Rowland and Yoo, 2003; Zemach et al, 2006; Melen et al, 2007; Wang et al, 2010).

Последовательности аминокислот в составе NLS хорошо охарактеризованы, что позволяет достаточно точно предсказывать их присутствие в белках (Cokol et al, 2000). В отличие от NLS предсказание NoLS представляет сложную задачу. Недавно

3

было показано, что NoLS некоторых клеточных и вирусных белков обогащены аргининами (Reed et al, 2006), однако, существование NoLS без аргининов говорит о том, что данный вариант не является универсальным (Favre et al, 1994; Shu-Nu et al, 2000). По-видимому, NoLS крайне гетерогененны по структуре. Возможно, механизм взаимодействия NoLS с компонентами ядрышка не требует какой-либо определенной последовательности аминокислот.

Таким образом, механизмы, контролирующие динамические взаимодействия белков с ядрышком, остаются неизвестными. Выяснение природы этих механизмов чрезвычайно важно для понимания принципов организации, функционирования и формирования ядерных субдоменов, не содержащих мембран.

Цель исследования

Изучение механизмов накопления белков в ядрышке за счет специализированных сигнальных последовательностей - сигналов ядрышковой локализации (NoLS).

Задачи исследования

1. Разработать метод количественной оценки эффективности действия сигналов, обеспечивающих накопление белков в ядрышке.

2. Изучить эффективность накопления искусственных сигналов ядрышковой локализации (NoLS) в зависимости от состава аминокислотных остатков.

3. Выявить в гистоне Н2В мотивы, обладающие свойствами сигнала ядрышковой локализации (NoLS).

4. Изучить динамику передислокаций гистона H2B-EGFP из ядрышка в хроматин ядер культивируемых клеток.

5. Определить возможный молекулярный механизм взаимодействия гистона Н2В с компонентами ядрышка.

Научная новизна

Предложен метод количественной оценки эффективности тестируемой последовательности в качестве NoLS. Показано, что эффективность искусственных сигналов ядрышковой локализации зависит от величины и плотности суммарного

4

заряда аминокислотных остатков. Показано наличие в гистоне Н2В участка, обладающего свойствами сигнала ядрышковой локализации. Этот участок включает также сигнал ядерной локализации. Детально изучена динамика передислокаций гистона Н2В-ЕОРР в ядрах культивируемых клеток. Показано, что депонирование избыточного белка в ядрышках является временным событием, по-видимому, связанным с медленным обменом гистонов в хроматине. На основании полученных данных предложена гипотеза, согласно которой накопление гистона ШВ-БОБР в ядрышке определяется электростатическими взаимодействиями N01^ с компонентами, содержащими РНК.

Практическое значение

Знания о механизме накопления белков в ядрышке могут быть использованы при разработке методов направленного транспорта веществ. В частности, это может иметь значение для поиска новых, более специфических противоопухолевых препаратов, цитотоксическая активность которых связана с подавлением транскрипции рибосомальных генов.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на 50-м симпозиуме американского общества клеточных биологов, АБСВ (Филадельфия, США, 2010), на XXIII Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, Россия,2010), на XVI Всероссийском совещании "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, Россия, 2010), на XVII Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (Черноголовка, Россия, 2011) и на 22-м симпозиуме Вильгельма Бернхарда по клеточному ядру (Рига, Латвия, 2011). Основные результаты работы были доложены на заседании Ученого Совета НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ и на заседании кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 5 тезисов.

5

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на ^З/ страницах, включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, выводы и список цитируемой литературы. Материал диссертации содержит рисунков и ^ таблицы. В списке цитируемой литературы приведены_источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирования эукариотических клеток

Клетки HeLa-M культивировали на среде DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) с добавлением противомикробно-противогрибкового препарата (Sigma, США), 10%-ой эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США) и /-глутамина Для проведения экспериментов клетки высаживали на покровные стекла или чашки Петри с адгезионным покрытием (Costar).

Трансфекцня

Для исследования локализации гистона Н2В в клеточном цикле использовали клетки, трансфецированные плазмидой, кодирующей EGFP-гистон Н2В. Плазмида была любезно предоставлена G. Wahl. Трансфекцию производили непосредственно перед каждым экспериментом с использованием препарата Turbofect (Fermentas) в соответствии с инструкцией производителя.

Получение конструктов

Конструкты с короткими фрагментами изготавливались путем вставки адаптера. Более длинные вставки готовились с помощью полимеразной цепной реакции (с использованием Pfu-полимеразы). Адаптеры и праймеры для полимеразной цепной реакции подбирались с помощью программы SerialCloner. Лигирование производили с использованием Т4-лигазы (Fermentas) в соответствии с инструкциями производителя.

Метод иммуноцитохимического выявления белков во внутренних районах ядра

Некоторые ядрышковые белки не могут быть выявлены иммуноцитохимически из-за высокой плотности материала в ядрышке. Был разработан метод, позволяющий

6

выявлять такие антигены с помощью специфических антител. Для этого клетки, фиксированные формальдегидом, после пермеабилизации обрабатывали трипсином, что увеличивало доступность внутренних районов ядрышка для антител.

Микроскопия

Препараты изучали и фотографировали с использованием оптического микроскопа Axiovert 200М (Cari Zeiss), оборудованного объективом Planapochromat 100/1.4 и цифровой камерой Hamamatsu ORCAII-ERG2 (1300x1030, 12 бит), управляемой программным комплексом AxioVision v4,5. Полученные изображения обрабатывали в программах ImageJ и Adobe Photoshop (Adobe Inc).

Трехмерную деконволюцию серий оптических срезов осуществляли по алгоритму Constrained Iterative Filter с помощью соответствующего модуля из комплекта поставки программы AxioVision v3.1 (Cari Zeiss, Германия).

Прижизненные наблюдения

Для проведения прижизненных наблюдений клетки рассаживали на чашки Петри со стеклянным дном. Наблюдения осуществляли на второй день после трансфекции. Для сохранения жизнеспособности клеток температура предметного столика и объектива микроскопа поддерживали на уровне 37°С. Чтобы предотвратить испарение среды и насыщение ее углекислотой на поверхность наносили минеральное масло. Фотографирование проводили с использованием конфокального микроскопа LSM510 (Cari Zeiss, Германия).

Для определения времени полуобмена химерных белков в ядрышке использовали метод FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching-восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания). FRAP проводили при помощи конфокального микроскопа LSM510 (Cari Zeiss). После 4-ого кадра с помощью лазера осуществляли обесцвечивание интересующей области. Для обработки результатов использовали макрос для программы ImageJ (любезно предоставлен С.А. Голышевым). Данные обрабатывали с помощью программы Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Все известные ЫоЬБ обогащены положительно заряженными аминокислотами

На первом этапе работы был проведен анализ литературы, и собраны данные об экспериментально доказанных ЫоЬ5 в белках вирусов, животных, растений и грибов. На рисунке 1 представлена диаграмма, показывающая, что почти половина всех аминокислот в составе N0!^ - положительно заряженные аминокислоты (26% лизинов и 23% аргининов). В настоящее время не описано ни одной последовательности N0!^, имеющей нейтральный или отрицательный заряд.

Данное наблюдение позволило выдвинуть следующую рабочую гипотезу: накопление белков в ядрышке может опосредоваться электростатическими взаимодействиями положительно заряженных ЫоЬБ с какими-то отрицательно заряженными компонентами ядрышка. Данная гипотеза предполагает, что эффективность накопления белка в ядрышке будет пропорциональна заряду ЫоЬ8. Именно это следствие было использовано для верификации гипотезы.

Уровень накопления химерных белков в ядрышке зависит от аминокислотного состава искусственных >}оЬ8

Для изучения механизмов действия сигнальных последовательностей, обеспечивающих накопление и временное удержания белков в ядрышке, мы использовали модель искусственных МоЬБ. Искусственные ЫоЬБ - это последовательности произвольного состава (не существующие в природе), которые способны обеспечить накопление маркерного белка (например, БОБР) в ядрышке. Удобство состоит в том, что меняя количество аминокислот в составе искусственного N01,8, можно варьировать уровень накопления белка в ядрышке. Для того чтобы оценивать уровень накопления количественно, мы измеряли отношение концентраций ЕСБР в ядрышке и нуклеоплазме. Эта величина (активность N0!^) характеризует эффективность тестируемой последовательности в качестве ИоЬ8.

Для проверки идеи зависимости эффективности накопления от заряда мы создали серию конструктов, кодирующих ЕОРР, слитого с участками, кодирующими искусственные ЫоЬ8 разного заряда (разное число лизинов или аргининов). Как видно из рисунка 2, существует корреляция между зарядом и эффективностью аминокислотной последовательности в качестве №)Ь8. Причем, на участке графика,

8

с

К

26%

Р

6%

Н

3%

Рис. 1. Аминокислотный состав N01.8. Остатки положительно заряженных аминокислот -лизина (К) и аргинина (К) - составляют почти половину от всех аминокислот в N01.8.

где заряд экспериментальных последовательностей варьирует от 0 до 5, наблюдается слабое, постепенное увеличение активности ИоЬБ; затем на участке, где заряд изменяется от 5 до 17, происходит более быстрый рост активности ЫоЬЗ.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что эффективность сигнала, отвечающего за накопление белка в ядрышке (КоЬЭ) может определяться его зарядом. Возникает вопрос - удержание белков в ядрышке, осуществляемое за счет активности МоЬБ, определяется только общим зарядом >)оЬ8, или зависит от плотности распределения заряда по последовательности сигнала? Для проверки были созданы два типа искусственных КоЬБ - с положительно заряженными аминокислотами расположенными блоком, либо разбитые незаряженными глицинами (рис. ЗА). Как видно из гистограммы на рисунке ЗБ, химерные белки с не разделенными заряженными аминокислотами интенсивно накапливаются в ядрышке, а при разделении аргининов глицинами накопление идет намного слабее (различия статистически значимы, р<0.01).

Рис. 2. Зависимость эффективности накопления химерных белков с искусственным МоЬБ (активность ЫоЬЭ) от количества остатков аргинина во вставке (т.е. от заряда искусственного ЫоЬЗ). Аналогичные данные были получены с использованием искусственных ИоЬ8, содержащих различное количество лизинов.

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19

Количество аргининов во вставке

Все эксперименты были поставлены также с искусственными NoLS, сконструированными на основе другой заряженной аминокислоты (лизина), при этом были получены схожие результаты. По-видимому, данные эффекты не зависят от типа аминокислотных остатков, создающих заряд.

Таким образом, эксперименты с искусственными NoLS, описанные в этом разделе, показывают два важных факта. Во-первых, для эффективного накопления в ядрышке белки должны содержать положительно заряженные аминокислоты. Во-вторых, эффективность искусственно сконструированного сигнала ядрышковой локализации (NoLS) зависит не только от характера суммарного заряда, но и от его плотности. Однако такие данные не являются достаточными, а потому важно проверить гипотезу и на белке, содержащем NoLS.

Гистон Н2В содержит потенциальный NoLS

Для работы был выбран гистон Н2В, в котором присутствует участок (28KKRKRSRK35), содержащий мотивы, характерные для NoLS - (R/K)(R/K)X(RK) или (R/K)X(R/K)(R/K) (Weber et al., 2000). Можно предположить, что он содержит NoLS (далее - putative NoLS или pNoLS).

Чтобы проверить эффективность данного участка в качестве сигнала ядрышковой локализации, был синтезирован адаптер, кодирующий аминокислоты KKRKRSRK. Адаптер вставлен на 5' конец EGFP для создания конструкта pEGFP-

10

(1^6)6 60РР| -Я«51К361166Н«511«;И<><;-ббйббб ЕСРР|

ЕСРР-<Рв)9 ЕОРР- ЕОР*' ЕСРР*

азпэад (наор

Рис. 3. Зависимость активности МоЬЗ от распределения плотности заряда по его последовательности. А - схематическое изображение сконструированных химерных белков, Б - активности ЫоЬЭ для данных белков (среднее значение ± стандартное отклонение).

pNoLS. pEGFP локализуется, преимущественно, в нуклеоплазме и в цитоплазме (рис. 4А). Химерный белок pEGFP-pNoLS локализуется в ядрышках и в нуклеоплазме (рис. 4А). С помощью метода FRAP показано, что время полуобмена pEGFP-pNoLS в ядрышках крайне невелико (ti/2~0.6 сек), т.е. данный белок взаимодействует с компонентами ядрышка динамически.

Важно подчеркнуть, что в гистоне Н2В предсказываются два участка (23QKKGGKKRK31 и 28KKRKRS33), которые могут выступать в качестве сигналов ядерной локализации (NLS). Эти участки перекрываются друг с другом и с pNoLS (28KKRKRSRK35). Обнаруженные участки были названы NLS1 ("QKKDGKKRK31) и NLS2 (28KKRKRS33). Были созданы конструкты на основании pEGFP и адаптеров, кодирующих NLS1 и NLS2. После трансфекции оба химерных белка накапливаются в ядрышке и отсутствуют в цитоплазме (рис. 4Б).

Таким образом, анализируемый участок гистона Н2В, по-видимому, играет роль NLS и потенциально может играть роль NoLS. Но способен ли гистон Н2В накапливаться в ядрышке за счет этого участка или нет?

Избыток гистона Н2В накапливается в ядрышке

Через 24 часа после трансфекции плазмидой, кодирующей гистон H2B-EGFP, в популяции выявляется два типа клеток (рис. 5). Первый тип представлен клетками с типичной локализацией гистона в хроматине. Второй тип - клетки, с выраженным накопление белка в ядрышке. Анализ препаратов показал, что выявленные

Рис. 4. 1ЧоЬЭ в гистоне Н2В. А - локализация рЕвРР-СІ (контроль) и рЕОРР-рЫоЬЗ. Б - локализация рЕОРР-ЖЭ! и рЕОРР-Ж82. Масштабная линейка 5 цш.

морфологические типы не сводятся к двум крайним вариантам: на препаратах можно найти любые промежуточные по уровню накопления экзогенного белка в ядрышке варианты. Через 48 часов после трансфекции в популяции выявляются только клетки с нормальной (хроматиновой) локализацией гистона Н2В-ЕОРР.

Является ли ядрышковая локализация гистона нормой или нет? Одна из частых причин ненормальности локализации белка - гиперэкспрессия. Возникает вопрос, не является ли гиперэкспрессия гистона ШВ-БОБР непосредственной причиной накопления белка в ядрышке? Измерения показывают, что максимальный уровень экспрессии достигается не через 24, а через 48 часов после трансфекции. Кроме того, были проведены раздельные измерения интегральной интенсивности флуоресценции для клеток с ядрышковой и нуклеоплазматической локализацией гистона ШВ-БОБР. Среди клеток с низким уровнем экспрессии доля клеток с ядрышковой локализацией относительно невелика (-12%), в то время как среди клеток с высоким уровнем экспрессии их доля увеличивается до -50%. Следовательно, гиперэкспрессия не может считаться причиной накопления в ядрышке гистона Н2В-ЕСРР.

Что же является причиной исчезновения клеток с ядрышковой локализацией гистона, спустя 48 часов после трансфекции? Можно предположить, что клетки с ядрышковой локализацией не погибают, а постепенно становятся клетками с

V

И^опе Н2В-ЕСРР

I *

. *

, /

рЬаэе согйга^

% * V

Рис. 5. Распределение гистона Н2В-ЕОРР в ядрах клеток НеЬа (24 часа после трансфекции). В популяции одновременно выявляются два типа клеток: клетки с включением химерного белка

преимущественно в хроматин и клетки с включением белка в ядрышки (треугольные стрелки). Масштабная линейка 5 цт.

нормальной локализацией гистона (например, вследствие перемещения белка из ядрышек в хроматин). Для проверки данного предположения мы проследили за судьбой клеток с ядрышковой локализацией гистона Н2В-ЕОРР. С помощью прижизненных наблюдений мы смогли проследить процесс постепенного перемещения гистона из ядрышка в хроматин. Также необходимо подчеркнуть, что такие клетки способны делиться, что говорит о физиологичности выявленного явления.

По-видимому, в ядрышке накапливается избыток гистона Н2В, который образуется после начала экспрессии белка с плазмиды. В пользу этого также свидетельствуют подсчеты соотношения клеток с ядрышковой и преимущественно хроматиновой (нормальной) локализацией гистона Н2В-ЕОРР. Максимальное число клеток с ядрышковой локализацией гистона наблюдается через 6 часов после трансфекции, затем доля постепенно падает.

Гистон Н2В-НСГР взаимодействует с ядрышком и хроматином посредством различных механизмов

Коровые гистоны характеризуются низкой подвижностью в живых клетках. Для большинства изученных ядрышковых белков характерно динамичное поведение, причем, гистон Н2В относится к немногочисленным нединамичным ядерным белкам. Чрезвычайно важно выяснить, как влияет накопление гистона в ядрышке на его динамические характеристики. С этой целью было проведено изучение динамики гистона Н2В методом FRAP.

В составе ядрышек гистон обладает высокой подвижностью (рис.бА). Время полуобмена составляет 7 секунд (рис. 6Г). При этом не наблюдается полного восстановления флуоресценции, что может свидетельствовать о наличии в ядрышке небольшой малоподвижной фракции (~22% от общего количества ядрышкового гистона). Можно предположить, что в состав этой фракции входит гистон ядрышкового хроматина.

В нуклеоплазме выявляются две фракции: с высокой (время полуобмена ~1сек) и низкой динамикой (рис. 6Б, Д). Доля фракции с низкой динамикой в нуклеоплазме значительно выше, чем в ядрышке (~62% от общего количества ядрышкового гистона). В составе хроматина гистон H2B-EGFP обладает низкой подвижностью (рис. 6В, Е), что соответствует опубликованным данным (Kimura and Cook, 2001).

Для того чтобы выяснить, с какими компонентами ядрышка связывается гистон Н2В, была проведена обработка пермеабилизированных клеток нуклеазами. После обработки ДНКазой I яркость флуоресценции в нуклеоплазме снижается, а яркость флуоресценции в ядрышке не меняется (рис. 7). Обработка РНКазой А, снижает интенсивность флуоресценция белка в ядрышке (рис. 7). На этом основании можно предположить, что в ядрышке гистон H2B-EGFP взаимодействует либо с РНК, либо с РНК-содержащими комплексами.

Картирование активности NoLS в гистоне Н2В

Таким образом, были установлены два принципиально новых факта. Во-первых, гистон Н2В содержит участок, играющий роль NLS, но который потенциально может играть роль NoLS. Во-вторых, гистон Н2В, будучи в некотором избытке, способен накапливаться в ядрышке. Возникает вопрос - это накопление обеспечивается именно выявленным сигналом?

—

О* 4 4

prebleach 0 sec 8.0 sec 16.0 sec 87.6 sec

в

prebleach о 0 sec 4* 3.2 sec 6.4 sec 87.6 sec

j «fc-», t | .V prebleach О 0 sec л** У * 8.0 sec * 4. . 16.0 sec 4, 87.6 sec

О 20 40 60 80 Time (sec)

20 40 60 80 Time (sec)

20 40 60 80 Time (sec)

Рис. 6. Динамика гистона ШВ-ЕйРР в ядрышках (А, Г) и нуклеоплазме (Б, Д) клеток с ядрышковой локализацией. Динамика гистона Н2В-ЕОРР в клетке с преимущественной локализацией химерного белка в хроматине (В, Е). Масштабная линейка 5 цт.

После удаления участка, содержащего сигнал ядрышковой локализации (Д22-41) выявляется слабое накопление белка в ядрышке (рис. 8).Это свидетельствует о том, что NoLS в гистоне Н2В может представлять собой более сложную структуру, чем выявлено изначально. Также было показано, что N-концевой участок гистона Н2В (1-35) накапливается в ядрышке, в то время как остальная часть (36-126) не способна накапливаться в ядрышке (рис. 8). Можно сделать вывод, что сигнал ядрышковой локализации сосредоточен на N-концевой части гистона Н2В. Поэтому было проведено более детальное исследования N-концевого участка белка.

15

before DNase I after DNase I before RNase A after RNase A

ф Ф ^ л

• ' • \ ¿С* ф , ' ж. 1 Т&г**.**

Рис. 7. Обработка клеток ДНКазой I уменьшает интенсивность флуоресценции гистона Н2В-ЕОРР в нуклеоплазме; обработка клеток РНКазой А уменьшает интенсивность флуоресценции в ядрышке. Масштабная линейка 5 цт.

Histone Н2В/36-126

Рис. 8. Картирование NoLS в гистоне Н2В. А - химерные белки, использованные в работе (pNoLS отмечен красным). Б - локализация химерных белков. Масштабная линейка 5 цт.

Histone H2B{Ü22-41)

ЕЖЕ-

Histone Н2В/1 -35

I д

Histone H2B-EGFP

Histone Н2В{Д22-41 J-EGFP

Histone H2B/1-35-EGFP

Histone H2B/36-126-EGFP

Для этого была создана серия конструктов (рис. 9А) и произведена оценка активности 1ЧоЬ8 химерных белков (рис. 9Б). Только один из исследуемых белков (ЕОКР-гистон Н2В(1-11)) не имел ядрышковой локализации, остальные - в той или иной степени накапливались в ядрышке. Была произведена количественная оценка эффективности накопления белков в ядрышке (рис. 9В) и выявлена корреляция между активностью сигнала ядрышковой локализации и зарядом. Сигналом с наиболее сильным эффектом накопления оказался рЕОРР-гистон Н2В(21-35). Было отмечено,

16

Д MPEPAKSAPAPKKGSKKAVTKAQKKGOKKRKRSRK g 11 а 135 11 126 1-11 1-26 1-35 • •

——

1 111 211 ■ •ъа 1-1-1-а* 12-35 • 21-35 # % 24-35

24 L________________ J 35 NoLS 28! 135 NLS1 231 131 NLS2 281 133 28-35 23-31 28-33

Рис. 9. А - N-концевой участок гистона Н2В (положительно заряженные аминокислоты выделены красным) и участки белка, использованные для анализа. Б - все участки за исключением 1-11 приводят к накоплению EGFP в ядрышке. Масштабная линейка 5 цш. В -активность участка в качестве сигнала ядрышковой локализации (NoLS activity) коррелирует с зарядом тестируемой последовательности (Predicted charge). Г - наибольшей активностью обладают участки с наибольшей плотностью заряда, что косвенно свидетельствует об отсутствии четких границ у сигналов ядрышковой локализации.

что более длинные участки (12-35 и 1-35) имели наибольший положительный заряд, но их активность была ниже, чем рЕОБР-гистон Н2В(21-35). По-видимому, не только заряд, но и длина участка гистона оказывает влияние на эффективность ЫоЬЗ. Была подсчитана отдельно удельная активность ЫоЬЗ (активность ЫоЬБ/длина последовательности) и удельный заряд (предсказываемый заряд/длина последовательности) (Рис. 9Г). График демонстрирует четкую корреляцию между

этими величинами. Из графика видно, что участок pNoLS обладает наибольшей удельной активностью NoLS и наибольшим удельным зарядом.

Заключение

Согласно опубликованным данным, существует отдельный класс последовательностей, которые обеспечиваю накопление белков в ядрышке - сигналы ядрышковой локализации (NoLS). В настоящее время большое количество таких последовательностей описано в белках вирусов, растений, животных и грибов. Все известные NoLS обогащены положительно заряженными аминокислотами, однако четкой структуры последовательности данного сигнала пока не выявлено. В случае гистона H2B-EGFP выявлен участок, который может потенциально выполнять роль NoLS. Действительно, искусственный белок содержащий сигнал NoLS из гистона локализуется в ядрышке, что может объяснить накопление гистонов в этом субдомене ядра. Накопление белка в ядрышке, по-видимому, может определяться не только функционированием белка в том или ином компартменте ядрышка (такой типа накопления принято называть накоплением, сопряженным с функционированием, activity-dependent retention). Накопление, не сопряженное с функционированием (activity-independent retention), может обладать особыми свойствами, что в литературе до сих пор еще не обсуждалось. Сигналы, обеспечивающие не сопряженное с функционированием накопление, первоначально назывались неспецифическими, так как предполагалось, что такой сигнал может быть характерен для белков с принципиально разными функциями.

Наличие неспецифического NoLS в гистоне не удивительно. Этот участок обогащен положительно заряженными аминокислотами, что характерно для классических NLS. Согласно опубликованным данным, некоторые известные NoLS перекрываются с хорошо известными NLS (Kubota et al,1999; Rowland and Yoo,2003; Zemach et al, 2006; Melen et al, 2007; Wang et al, 2010). В нашем случае у гистона Н2В-EGFP присутствует участок, который функционально ведет себя как NLS и одновременно может выступать в качестве NoLS.

Полученные данные позволяют утверждать, что наличие некоторых типов NLS может автоматически приводит к накоплению белка в ядрышке. Нельзя исключить, что присутствие в ядрышке огромного количества разнообразных белков как раз и

18

связано с тем, что присутствие NLS (или других участков, обогащенных положительно-заряженными аминокислотами) может вести к ядрышковой локализации.

Состав последовательности NLS хорошо известен, и это позволяет достаточно точно предсказывать их присутствие в белках (Cokol et al, 2000). В отличие от NLS предсказание NoLS представляет сложную проблему. Учитывая тот факт, что все сигналы ядрышковой локализации обогащены положительно заряженными аминокислотами и несут собой положительный заряд, можно предположить, что основной механизм реализации активности данного типа сигналов связан с электростатическим взаимодействием. Если это предположение верно — то последовательность аминокислот не столь важна, в отличие от аминокислотного состава сигнала. Если ядрышко обогащено отрицательно заряженными компонентами, все белки с положительными заряженными участками будут неспецифически накапливаться в ядрышке. Конечно, на накопление может сильно влиять окружающие участки белка, включая наличие отрицательно заряженных мотивов, а так же общий отрицательный заряд белка. В случае гистона, который обогащен основными аминокислотами - эта проблема не возникает. Действительно, обнаружено, что предполагаемый NoLS (28-35) представляет собой только часть сигнала ядрышковой локализации (21-35). Основываясь на полученных данных участок NoLS с наибольшим положительным сигналом (плотностью заряда) будет давать наибольший вклад в накопление белка в ядрышке, в то время как окружающие участки будут только усиливать это накопление. Проведенное исследование показывает, что экспериментальное определение таких сигналов, как и выявление границ сигналов невозможно без количественной оценки активности NoLS, что существенно отличает данный тип сигналов от других известных мотивов.

Очень мало известно о том, как NoLS взаимодействует с ядрышком. Накопление белка в ядрышке может быть связано с электростатическим взаимодействием положительно заряженных NoLS с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами и белками. К примеру, было показано, что кластеры основных аминокислот отвечают за связывание белком РНК, что обеспечивает ядрышковую локализацию рибосомального белка L22 (Houmani and Ruf,2009). Кроме того, было показано, что некоторые NoLS могут взаимодействовать с мажорным

19

ядрышковым белком В23 (Wang et al, 2010,Lechertier et al,2007; Endo et al,2009). Факт наличия в B23 длинных отрицательно заряженных участков 120EEDAESEDEEEED132 и l61DEDDDDDDEEDDDEDDDDDDFDDEEAEE188 позволяет предположить что такого рода взаимодействия могут иметь электростатическую природу, как в случае взаимодействия с РНК. Также необходимо отдавать отчет, что не все механизмы накопления белков в ядрышке опосредованы NoLS. Например, было показано, что РНК связывающие мотивы отвечают за накопление нуклеолина в ядрышке (SchmidtZachmann and Nigg, 1993).

Аккумуляция белка в ядрышке, вызванная наличием NoLS, может быть биологически значимой. В случае белка, функционирующего в ядрышке, неспецифическое накопление в пределах этой структуры повысит вероятность случайного взаимодействия со специфическими сайтами связывания. В других случаях ядрышковая локализация может быть либо безразличной в функциональном плане, либо даже вредной (если белок функционирует вне ядрышка). В любом случае, накопление белка в ядрышке не следует автоматически считать функционально-значимым, по крайней мере, до получения экспериментального доказательства обратного.

выводы

1. Разработан метод количественной оценки эффективности действия сигналов, обеспечивающих накопление ядерных белков в ядрышке.

2. Показано, что эффективность действия искусственных сигналов ядрышковой локализации (NoLS) зависит от величины заряда и от плотности расположения положительно заряженных аминокислот в последовательности.

3. Показано наличие в гистоне Н2В участка, обладающего свойствами сигнала ядрышковой локализации (NoLS).

4. Изучена динамика передислокаций гистона H2B-EGFP в ядрах культивируемых клеток HeLa. Показано, что накопление «избыточного» белка в ядрышках является временным событием, по-видимому, связанным с медленным обменом гистона Н2В в хроматине.

5. На основании полученных данных предложена гипотеза, согласно которой накопление гистона Н2В в ядрышке определяется электростатическими взаимодействиями с компонентами, содержащими РНК.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Musinova Y.R., Lisitsyna О.М., Golyshev S.A., Tuzhikov A.I., Polyakov V.Y., Sheval E.V. Nucleolar localization/retention signal is responsible for transient accumulation of histone H2B in the nucleolus through electrostatic interactions // Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 2011. V. 1813. P. 27-38.

2. Svistunova D.M., Musinova Y.R., Polyakov V.Y., Sheval E.V. A simple method for the immunocytochemical detection of proteins inside nuclear structures that are inaccessible to specific antibodies. Journal of Histochemistry & Cytochemistry // 2012. V. 60. P. 152-158.

3. Musinova Y.R., Lisitsyna O.M., Golyshev S.A., Polyakov V.Y., Sheval E.V. Nonspecific retention as a possible mechanism for histone H2B accumulation in the nucleolus // American Society for Cell Biology 50th Annual Meeting. 2010. P. 1133.

4. Мусинова Я.Р., Шеваль E.B., Поляков В.Ю. Сигнал ядрышковой локализации в гистоне Н2В // Структура и функции клеточного ядра: Тезисы докладов и сообщений XVI Всероссийского совещания. Цитология. 2010. Т. 52. № 8. Стр.

5. Мусинова Я.Р., Лисицына О.М., Шеваль Е.В. Несопряженное с функционированием удержание белков в ядрышке: к вопросу о механизме действия сигналов ядрышковой локализации // XXIII Российская конференция по электронной микроскопии. Черноголовка. 2010. Стр. 394.

6. Мусинова Я.Р., Кананыхина Е.Ю., Лисицына О.М., Шеваль Е.В. Количественный анализ выраженности действия естественных и искусственных сигналов ядрышковой локализации // XVII Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел. 2011. С. 254.

7. Musinova Y.R., Lisitsyna О.М, Kananykhina E.Y., Polyakov V.Y., Sheval E.V. The region of histone H2B with potential nucleolar localization signal (NoLS) activity // 22 Wilhelm Bernhard Workshop on Cell Nucleus. Annual Meeting. 2011. P. 99.

675-676.

Соискатель

Я.Р. Мусинова

Заказ № 65-П/03/2012 Подписано в печать 16.03.2012 Тираж 50 экз. Усл. п.л.1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мусинова, Яна Рафаеловна, Москва

61 12-3/745

Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова

На правах рукописи Мусинова Яна Рафаеловна

Механизм накопления белков в ядрышке

03.03.04- клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Поляков Владимир Юрьевич

Москва - 2012

Оглавление

Список условных обозначений........................................................................................................3

Введение..........................................................................................................................................4

Цель и задачи исследования...........................................................................................................6

Научная новизна..............................................................................................................................6

Практическое значение...................................................................................................................7

Обзор литературы............................................................................................................................8

1. Ядрышко...................................................................................................................................8

1.1. Структурная организация ядрышка......................................................................................9

2. Белки ядрышка........................................................................................................................11

2.1. Фибрилларин как маркерный белок ПФК..........................................................................11

2.2. В23 как маркерный белок ГК...............................................................................................13

3. Динамика белков ядрышка.....................................................................................................15

4. Инактивация транскрипции рДНК: сегрегация ядрышка.......................................................16

5. Hub-белки ядрышка................................................................................................................17

6. Сигналы ядрышковой локализации (NoLS).............................................................................17

Материалы и методы......................................................................................................................24

Результаты.......................................................................................................................................43

1. Все известные NoLS обогащены положительно заряженными аминокислотами................43

2. Уровень накопления химерных белков в ядрышке зависит от аминокислотного состава искусственных NoLS.....................................................................................................................57

3. Гистон Н2В как модель для анализа сигналов ядрышковой локализации в системе in vivo.68

4. Избыток гистона Н2В накапливается в ядрышке....................................................................77

5. Гистон H2B-EGFP взаимодействует с ядрышком и хроматином посредством различных механизмов.................................................................................................................................89

6. Гистон Н2В локализуется в компартментах ядрышка, оккупированных белками гранулярного компонента...........................................................................................................93

7. Картирование активности сигнала ядрышковой локализации в гистоне Н2В.....................100

8. Заключение............................................................................................................................105

Выводы..........................................................................................................................................110

Список цитируемой литературы...................................................................................................111

Список условных обозначений

Для аминокислот и их производных использовались обозначения, рекомендуемые комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (ШРАС)и Международного союза биохимиков (IUP).

В работе использовались также следующие сокращения и обозначения:

ПААГ полиакриламидный гель

ПЦР полимеразная цепная реакция

ТЕМЕД N, N, N', N'- тетраметилэтилендиамин

ЭДТА этилендиаминтетраацетат

(E)GFP зеленый флуоресцирующий белок (green fluorescent protein) mCherry белковый тэг, флуоресцирующий в красном спектре NLS сигнал ядерной локализации (nuclear localization signal) NoLS сигнал ядрышковой локализации (nucleolar localization signal) PMSF фенил-метилсульфонил-фторид (phenylmethanesulfonylfluoride)

Введение

Известно, что нормальное функционирование интерфазного ядра (как и других органоидов эукариотической клетки, ограниченных липидными мембранами) обеспечивается механизмами, контролирующими селективный транспорт молекул между цитозолем и внутренним компартментом. В интерфазных ядрах роль своеобразного «молекулярного сита» выполняет ядерная оболочка, в которую встроены специализированные структурные комплексы - ядерные поры. Именно в ядерных порах локализована система нуклеоплазматического транспорта белков и рибонуклеопротеиновых частиц. Показано, что макромолекулы, импортирующиеся в ядро или экспортирующиеся из ядра в цитозоль, несут специальные сигналы, которые узнаются белками комплексов ядерных пор. В случае импортируемых макромолекул эти сигналы обозначаются как сигналы ядерной локализации (Nuclear Localization Signal, NLS) После вхождения в ядро импортированные белки (например, белки хроматина, факторы транскрипции и процессинга РНК и многие другие) перераспределяются по ядерным субдоменам. В настоящее время в интерфазных ядрах описано несколько структурно-функциональных субдоменов: ядрышки, тела Кахаля (Cajal bodies), интерхроматиновые гранулы (nuclear speckles), протеасомы, тельца, Polycomb bodies, стрессовые белки (PML bodies) и некоторые другие (Мао et al., 2011).

Поскольку субдомены ядра не имеют ограничивающих мембран, очевидно, что поддержание их устойчивого структурно-функционального состояния требует наличия специальных механизмов, кардинально отличающихся от механизмов, обеспечивающих общий гомеостаз ядра и других мембранных органелл клетки. При этом необходимо учитывать, что большинство ядерных белков (за исключением коровых гистонов и ламинов) являются высоко динамичными, т.е. связаны со своими сайтами не стабильно, а только на протяжении небольшого времени, называемого «временем удержания».

Вопрос о том, каков механизм «узнавания» импортированными белками мест своей локализации в сложной системе интерфазного ядра, остается открытым.

Наиболее значимые факты, проливающие свет на эту проблему, получены при анализе белков ядрышка. В ряде работ показано, что для белков, участвующих в синтезе и процессинге рибосомной РНК, существует особый класс аминокислотных последовательностей, которые обеспечивают их накопление в ядрышке. Эти последовательности принято называть сигналами ядрышковой локализации (Nucleolar Localization Signal, NoLS). В настоящее время большое количество таких сигнальных последовательностей обнаружено в белках вирусов, растений, животных и грибов. Интересно, что некоторые NoLS перекрываются с хорошо известными NLS (Kubota et al, 1999; Rowland and Yoo,2003; Zemach et al, 2006; Melen et al, 2007; Wang et al, 2010).

Состав последовательности NLS хорошо известен, и это позволяет достаточно точно предсказывать их присутствие в белках (Cokol et al, 2000). В отличие от NLS, предсказание NoLS представляет сложную проблему. Недавно было показано, что NoLS некоторых клеточных и вирусных белков обогащены аргининами (Reed et al,2006), однако, существование NoLS без аргининов говорит о том, что данная структура не является универсальной (Favre et al, 1994; Shu-Nu et al, 2000). Можно допустить, что консенсуса сигнальных последовательностей для различных белков вообще не существует, а механизм взаимодействия NoLS с компонентами ядрышка не требует какой-либо определенной последовательности аминокислот.

Подводя итог сказанному, можно констатировать, что проблема специфического накопления и удержания специфических белков в субдоменах ядра до настоящего времени остается не решенной. Выяснение природы этих механизмов чрезвычайно важно для понимания принципов организации, функционирования и формирования ядерных субдоменов, не содержащих мембран.

Целью данной работы стало изучение механизмов накопления белков в ядрышке за счет специализированных сигнальных последовательностей - сигналов ядрышковой локализации (МоЬБ).

Цель и задачи исследования.

В связи с заявленной целью в работе были последовательно поставлены следующие конкретные задачи:

1. Разработать метод количественной оценки эффективности действия сигналов, обеспечивающих накопление белков в ядрышке.

2. Изучить эффективность накопления искусственных сигналов ядрышковой локализации (1ЧоЬ8) в зависимости от состава аминокислотных остатков.

3. Выявить в гистоне Н2В мотивы, обладающие свойствами сигнала ядрышковой локализации (1МоЬ8).

4. Изучить динамику передислокаций гистона Н2В-ЕСРР из ядрышка в хроматин ядер культивируемых клеток.

5. Определить возможный молекулярный механизм взаимодействия гистона Н2В с компонентами ядрышка.

Научная новизна

Предложен метод количественной оценки эффективности тестируемой последовательности в качестве 1ЧоЬ8. Показано, что эффективность искусственных сигналов ядрышковой локализации зависит от величины и плотности суммарного заряда аминокислотных остатков. Показано наличие в гистоне Н2В участка, обладающего свойствами сигнала ядрышковой локализации. Этот участок включает также сигнал ядерной локализации. Детально изучена динамика передислокаций гистона ШВ-ЕСРР в ядрах культивируемых клеток. Показано, что депонирование избыточного белка в ядрышках является временным событием, по-видимому, связанным с медленным обменом гистонов в хроматине. На основании полученных данных предложена гипотеза,

согласно которой накопление гистона Н2В-ЕОРР в ядрышке определяется электростатическими взаимодействиями N01^ с компонентами, содержащими РНК.

Практическое значение

Знания о механизме накопления белков в ядрышке могут быть использованы при разработке методов направленного транспорта веществ. В частности, это может иметь значение для поиска новых, более специфических противоопухолевых препаратов, цитотоксическая активность которых связана с подавлением транскрипции рибосомальных генов.

Обзор литературы

1. Ядрышко

Ядрышко - наиболее крупная субструктура клеточного ядра (рис. 1). В клетках млекопитающих ядрышко формируется в конце митоза и разбирается в профазе следующего деления. У дрожжей, напротив, активное ядрышко сохраняется па протяжении всего клеточного цикла (D'Amours et al., 2004, Sullivan el al., 2004, Torrcs-Rosell et al., 2004).

Ядрышко представляет собой «фабрику» рибосом клетки (Sirri et al., 2007), в которой происходит транскрипция рибосомных генов (рДНК), процессинг рибосомальной РНК (рРНК) и её взаимодействие с рибосомштьными белками (Gebrane-Younes et al., 2005, Hernandez-Verdun , Junera 1995, Scheer et al., 1993, Scheer, Hock 1999, Shaw, Jordan 1995, Thiry, Goessens 1996). В процессах синтеза и созревания рибосом активное участие принимают малые ядрышковые РНК (мякРНК), а также различные рибонуклеопротеиновые (РНП) комплексы (Heidelberg de la Cruz el al., 2004, Fatica, Toilervey 2002, Fromont-Racine et al., 2003, Sollner-Webb et al., 1996, Tollervey 1996).

Ядро клетки млекопитающих

Рис. I. Клетка НеЬа в световом микроскопе. Внутри ядра хорошо различимы ядрышки (Лыоин и др., 2011).

Число ядрышек в клетке не превышает числа активных ядрышковых организаторов, но может быть меньше, вследствие слияния ядрышек. Размеры ядрышек определяются особенностями биогенеза рибосом в данной клетке.

1.1. Структурная организация ядрышка

Не смотря на высокую подвижность ядрышковых белков, принимающих участие в процессинге рРНК и сборке пре-рибосомных частиц (Phair, Misteli 2000), ядрышки клеток млекопитающих характеризуются четкой компартментализацией молекулярных комплексов, отвечающих за различные этапы биогенеза рибосом (Strouboulis, Wolle 1996).

С помощью электронной микроскопии было выявлено три основных ядрышковых компонента: фибриллярный центр (ФЦ), плотный фибриллярный компонент (ПФК) и гранулярный компонент (ГК) (Рис, 2).

Рис. 2. Ультраструктура ядрышка клетки HeLa: фибриллярный центр (отмечен звездочкой), die - плотный фибриллярный компонент, gc - гранулярный компонент (Sheval et al., 2009)

Фибриллярными центрами (ФЦ) ядрышка называют участки скопления фибрилл с низкой электронной плотностью, окруженные зоной фибрилл более высокой электронной плотности - плотным фибриллярным компонентом (ПФК). ФЦ и ПФК находятся внутри гранулярного компонента (ГК), представляющего собой скопления гранул диаметром около 15-20 им (предшественников рибосом). В различных типах клеток количество и размер ФЦ непостоянны - наблюдается обратная зависимость между их размерами и количеством. Обычно клетки с высоким уровнем биогенеза рибосом обладают множеством мелких ФЦ. И наоборот - клетки с низким метаболизмом (обменом) и низкой транскрипционной активностью имеют небольшие ядрыщки с одним крупным ФЦ, как, к примеру, в лимфоцитах.

ФЦ содержат РНК-пол имеразу I и транскрипционный фактор UBF, ответственные за синтез рРНК. Однако транскрипции непосредственно в фибриллярных центрах не происходит (Casafont et al., 2007). Синтез рРНК осуществляется на границе ФЦ и ПФК (Puvion-Dutilleul et al., 1997; Cmarko et al., 2000, Guillot et al., 2005,). В этом регионе ядрышка располагаются белки раннего процессинга - фибрилларин и нуклеолин (Biggiogera et al., 1989, Gautier et al., 1994, Ochs et al., 1995a, Puvion-Dutilleul et al., 1991). Новосинтезированный 47S транскрипт процессируется в ПФК до 18S, 5.8S и 28S рРНК, которые затем направляются в ГК, где располагаются белки более поздних этапов биогенеза рибосом В23, PM-Scl, Nop52 и др. (Biggiogera et al., 1989, Gautier et al., 1994, Ochs et al., 1995a, Puvion-Dutilleul et al., 1991). Таким образом, для каждого структурного компонента ядрышка характерно наличие собственной «молекулярной кухни», отвечающей определенному этапу синтеза рибосом в ядре (рис. 3).

В состав ядрышка также входит хроматин. Однако количество его крайне мало, и в ряде случаев хроматин не удается выявить стандартными методами световой микроскопии (Sirri et al., 2007).

. RN4

O^SOKJ-Î, piOtf.S

О Prc-e n-prccess'ï-acres ("Jos rt;i=--f :

© Ч4*4 poi>r-erase i ----

о sr.=RNF5 C_J> fbosoroe suburtt

Us

Granular component

О

о

1 x^ <

О s es -£-¿285

О

Cytoplasm

О

Рис. 3. Функциональная организация ядрышка (Boisvert et.al., 2007). На границе ФЦ и ПФК посредством РНК-полимеразы I происходит транскрипция рДНК. Далее с помощью мяк-РНП в ПФК осуществляется процессинг пре-РНК. Полное созревание пре-рРНП и взаимодействие с рибосомалышми белками осуществляется главным образом в ГК, где 5.8 S и 28S рРНК вместе с 5S рРНК участвуют в формировании 60S субъединицы, a 18S рРНК - 40S субъединицы. Затем 40S и 60S рибосомные субъединицы экспортируются в цитоплазму, где, взаимодействуя с мРНК, формируют функциональные рибосомы

2. Белки ядрышка

2.1. Фибрилларин как маркерный белок ПФК

Фибрилларин человека - белок ПФК, участвующий в различных постраискрипционных процессах рРНК, таких как процессинг и метилирование пре-РНК, а также сборка рибосом (ТоИегуеу е1 а1., 1993). У дрожжей белок 1Чор1, который

является гомологом фибрилларина человека, входит в состав мяк-РЫП комплекса класса C/D (Туе, Steitz 1989, Aris, Blobcl 1991, Baserga et al., 1991).

Среди эукариотических белков фибрилларин является высококонссрвативным белком не только но аминокислотной последовательности, но и по структуре и функции (Aris, Blobel 1991; Schimmang et al., 1989; Henriquez et al., 1990; Lapeyre et al., 1990; Jansen et al., 1991; Girard et al., 1993; Turley et al., 1993; Cappai et al., 1994; David et al., 1997). Фибрилларин человека содержит 321 аминокислотный остаток и имеет молекулярную массу около 36 кДа. Структурно в фибрилларине выделяют три основных домена (Aris, Blobel 1991): домен, обогащенный аминокислотными остатками глицина и аргинина (Glycine and Arginine-rich Domain, GAR-domain), предположительно PHK-связывающий домен (putative RNA-binding domain, RNP-domain) и альфа-спиральный домен (рис. 4).

GAR

RNP

alfa

80

133

222 274 306

Рис. 4. Доменная организация фибрилларина (Aris, Blobel 1991): G AR-домен, РНК-связывающий домен, альфа-спиральный домен.

GAR-дoмeн фибрилларина человека включает в себя первые 80 аминокислотных

остатков последовательности белка. Не смотря на то, что различные САЛ-домены

других ядрышковых белков обладают свойством направлять и удерживать белки в

ядрышке (Воиуе1 е1 а1„ 1998; Ои е1 а1., 1999; РЖ е1 а1„ 2000), для ОАЛ-домена

фибрилларина человека это не является характерной чертой. Данный домен, по-

видимому, увеличивает сродство фибрилларина к компонентам ядрышка, однако не

отвечает за его правильную локализацию в ПФК (8пааг & а1., 2000). Данные об

12

ортологах фибрилларина человека свидетельствуют о том, что GAR-домен вероятно, также не обладает какой-либо ферментативной активностью. Так, например, точечные мутации в GAR-домене Nopl никак не влияют на его функциональность (Tollervey el al., 1993), а у прокариот этот домен в фибрилларине вообще отсутствует (David et al., 1997, Wang et al., 2000).

Центральный регион фибрилларина, содержащий около 90 аминокислотных остатков, представлен РНК-связывающим доменом, характерным для многих белков, входящих в состав мяк-РНП комплексов. Делеционный анализ последовательности РНК-связывающего домена фибрилларина человека показал, что он необходим для правильной локализации белка в ПФК ядрышка. Вероятно, РНК-связывающий домен отвечает за непосредственное связывание фибрилларина с мяк-РНК (Snaar et al., 2000). Для нахождения белка в сайтах транскрипции необходимо не только наличие РНК-связывающего домена, но и альфа-спирального домена, который расположен в С-концевой части фибрилларина (Wang el al., 2000) и, по-видимому, обладает ферментативной активностью метил-трансферазы (Snaar et al., 2000; Wang et al., 2000; Niewmierzycka ., Clarke 1999).

2.2. B23 как маркерный белок ГК

Белок В23, известный также как пуклеофозмин (nucleophosmin, NPM), N038 и нуматрин (numatrin) - мультифункциональный нерибосомальны