Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная реорганизация ядрышек, индуцированная действием раствора низкой ионной силы на живые клетки

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная реорганизация ядрышек, индуцированная действием раствора низкой ионной силы на живые клетки"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ . ИМ. М.В.ЛОМОНОСОВА

РГВ Ой

БИОЛОГИЧЕСКОЙ ФАКУЛЬТЕТ

. <? > » и !.*>пг и и;ЛИ и-:-л

На правах рукописи

ДУДНИК ОКСАНА АЛЕКСЕЕВНА

УДК 576.353:576.311

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РЕОРГАНИЗАЦИЯ' ЯДРЫШЕК. ИНДУЦИРОВАННАЯ ДЕЙСТВИЕМ РАСТВОРА НИЗКОЙ ИОННОЙ СИЛЫ НА ЖИВЬЕ КЛЕТКИ

03.00.11

эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1995 г.

Работа выполнена в лаборатории электронной микроскопии Института физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского (директор - академик РАН В.П.Скулачев) Московского Государственного Университета им.М.В.Ломоносова.

V

Научный руководитель: доктор биологических наук.

О.В.Зацепина

Официальные оппоненты: доктор биологических наук.

В.Н.Сахаров

кандидат биологических наук, В.М.Мантейфель

Ведущее учреждение: Институт биологии развития

им.Н.К.Кольцова. РАН

Защита диссертации состоится "/$" ^ЛЩЛ 1995 г. в " часов на заседании специализированного совета Д 053.05.68 в Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899. Москва. Воробьевы горы. Биологический факультет МГУ. Ученый совет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан Си-^и^ С-Ч. 1995 г.

Ученый секретарь совета кандидат биологических наук

Е.Н.Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Ядрышко - это структура, возникающая в интерфазных ядрах клеток эухариотов в результате транскрипционной активности ри-босомных генов, кодирующих 18S, 28S и 5.8S рРНК. В составе ядрышка, в соответствии с современной терминологией, выделяют несколько* структурных компонентов: фибриллярные центры (ФЦ), плотный фибриллярный компонент (ПФК). гранулярный компонент, ядрышковые вакуоли и ассоциированный с ядрышком хроматин (Jordan,1984). Ультраструктурная организация компонентов ядрышка. их судьба на разных стадиях клеточного цикла изучены достаточно подробно (Goessèns, 1984: Hadjiolov,1985; Hozak et al.. 1986; Челидзе, Зацепина, 1988; Scheer et al.. 1993). В последнее время достигнут значительный прогресс в изучении специфических ядрьшжовых белков (Olson. 1990; Hernandez-Verdun. 1991).

Однако до сих пор остается открытым вопрос о локализации внутри ядрышка транскрибирующихся рибосомных генов (Jordan, 1991). Не установлены локализация и функции большинства ядрыш-ковых белков. Остаются не выясненными закономерности нуклеоло-генеза, происходящего после деления клетки (Sheer. Weisenberger, 1994). Трудности, возникающие при изучении этих вопросов, отчасти обусловлены плотной упаковкой материала ядрышка и тесной пространственной взаимосвязью его структурных компонентов.

Удобным методическим подходом для изучения компактных клеточных структур (например, митотических хромосом) является обработка живых клеток растворами низкой ионной силы (Бураков и др., 1980; Зацепина и др.. 1988; Киреев и др.. 1988). Предварительные данные показывают, что гипотоническая обработка приводит также к значительному разрыхлению материала ядрыйек в лимфоцитах человека (Hozak et al.. 1990).

Однако, не исключено, что экспериментальные воздействия, вызывающие искусственную^ декомпактизацию клеточных структур, могут приводить к возникновению артефактных изменений. Одним из критериев, позволяющих оценить физиологичность применяемого воздействия, является обратимость вызываемых им изменений. В данной работе использовался именно такой подход.

Целью настоящей работы было исследование поведения ядрышка и его структурных компонентов (фибриллярных центров, плотного фибриллярного компонента, гранулярного компонента) в культиви-

- г -

руемых in vitro клетках под действием гипотонии, а также после прекращения гипотонической обработки.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить изменения структуры, белкового состава и функциональной активности ядрышек живых клеток, происходящие под действием гипотонической обработки.

2. Исследовать обратимость этих изменений и динамику восстановления (реконструкции) ядрышек после прекращения гипотонического воздействия .

3. Сравнить процесс восстановления ядрышек после их искусственной декомпактизации с динамикой

естественного нуклеологенеза. происходящего во время митоза.

Научная новизна и практическое значение работы. Полученные в работе данные представляются важными для понимания взаимодействия индивидуальных компонентов в составе ядрышка. Показано, что действие раствора низкой ионной силы приводит к выходу большей части гранул из ядрышка и пространственному разобщению фибриллярных центров и плотного фибриллярного компонента. Использованная методика гипотонической обработки может быть рекомендована для выделения ФЦ и ПФК в виде отдельных фракций. Получены данные, говорящие об отсутствии синтеза рРНК в условиях гипотонического шока.

Показано, что изменения структуры и функциональной активности ядрышка, происходящие под действием гипотонического раствора . являются полностью обратимыми. Реконструкция ядрышек после снятия гипотонического воздействия происходит как за счет синтеза de novo, так и за счет материала "исходного" ядрышка. Процесс реконструкции ядрышек сопровождается образованием в кариоплазме многочисленных РНП-содержащих включений (проядрышко-подобных телец), которые по своей ультраструктуре, белковому составу, реакции на действие актиномицина Д соответствуют предьядрышкам нормального митоза. Реконструкция ядрышек после прекращения гипотонической обработки в основном повторяет процесс формирования ядрышек, происходящий в телофазе митоза, и может использоваться в качестве экспериментальной модели нуклеологенеза. Предложенная модель предоставляет возможность провести выделение в виде отдельной фракции проядрышкоподобных те-

лец. формирующихся в интерфазных клетках после прекращения действия гипотонии, что позволит получить более полную информацию об их биохимическом составе и функциях.

На основании собственных и литературных данных предложены схемы, иллюстрирующие реорганизацию структуры ядрышка и поведение белка В23 при обратимом действии раствора низкой ионной силы.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 13 Европейской конференции по организации клеточного ядра (Венгрия,1993); на 4 Европейском конгрессе по клеточной биологии (Прага,Чехия,1994); на 5 Европейском конгрессе по клеточной биологии (Хайдельберг,Германия,1995), а также на ряде семинаров в НИИ физ-хим. биологии им.А.Н.Белозерского МГУ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования использовали клетки культуры ткани почки эмбриона свиньи (СПЭВ; Султанова и др., 1968). Клетки высаживали на покровные стекла в концентрами 100-150 тыс. кл/мл за 1.5-2 суток до эксперимента. Клетки выращивались при 37°С на среде 199 с добавлением 10% сыворотки крови крупного рогатого скота и антибиотиков.

В качестве гипотоничной среды использовали раствор Хенкса, который разводили дистиллированной водой до конечной концентрации 20%. Клетки инкубировали в этом растворе от 1 мин до 1 часа. Для изучения процесса реконструкции ядрышек клетки переносили в полную кондиционированную среду после 15 мин гипотонического воздействия и инкубировали от 30 сек до 4 часов.

Для изучения реконструкции ядрышек в условиях подавления синтеза рибосомной РНК в изотоническую культуральную среду после прекращения гипотонической обработки вводили актиномицин Д (Sigma) в конечной концентрации 1 мкг/мл.

Прижизненные наблюдения клеток СПЭВ. Прижизненные наблюдения за клетками в контроле и на разных стадиях обработки производили в проточной камере (Зеленин и др., 1979) с помощью фазового контраста на микроскопе "0птон-3" (об. 100 ,ок.10).

Электронная микроскопия. В работе использовалась стандартная процедура подготовки образцов для электронной микроскопии

(по Уикли, 1975, с некоторыми модификациями). Клетки фиксировали 2.555-ным глутаровым альдегидом, разведенным на растворе Хенкса соответствующей тоничности в течении 1 часа, затем до-фиксировали 1% четырехокисью осмия в течение 1-2 часов при 20°С. Далее контрастировали 2%-ным спиртовым раствором уранилацетата Na и заключали в Эпон 812 (Serva). В экспериментах по селективному окрашиванию рнк-содержащих структур по методу Бернхарда (Bernhard.1969) фиксация четырехокисью осмия и контрастирование, спиртовым раствором уранилацетата не проводились. Дальнейшая подготовка для электронной микроскопии была стандартной.

Площадь ядрышек измеряли на 20 случайных ультратонких сре-sax (увеличение на негативах 4000Х). Измерения производили с помощью компьютерной программы "2D tools" (Россия). Площадь ядрышек выражали в условных единицах. . "

РадиоавтограФическое изучение клеток СПЭВ. Во всех экспериментах использовали 3Н-уридин (конечная активность 370 кБк/мл; удельная активность 814 ГБк/моль). Для оценки функциональной активности ядрышек на различных этапах обработки меченый предшественник вводили в среду культивирования на 15 мин перед фиксацией клеток.

Для изучения поведения РНП-материала ядрышка на различных стадиях обработки 3Н-уридин вводили в среду культивирования на 15 мин до начала гипотонической обработки. Затем клетки отмывали от изотопа и переносили сначала в 20%-ный раствор Хенкса на 15 мин, а потом - в нормальную культуральную среду на. срок от 15 мин до 4 часов. Обе среды содержали избыток "холодного" (немеченного) уридина (8.3 мкМ/мл). В качестве контроля использовали клетки, не подвергавшиеся гипотонической обработке.

Во всех опытах клетки фиксировали смесью этанола и ледяной уксуксной кислоты (3:1) в течение 1 часа. Для удаления невклю-чившегося предшественника препараты промывали 5Ж-ной трихло-руксусной кислотой (20 мин при 4°С) и высушивали на воздухе. Дальнейшая подготовка препаратов для радиоавтографии была стандартной (Епифанова и др. .1977). На каждом препарате количество зерен серебра над ядрышками, кариоплазмой и цитоплазмой подсчитывали в 100 клетках. Статистическую обработку результатов проводили используя критерий х2.

Методика окрашивания азотнокислым серебром. С целью выяв-

ления Ag-белков на светооптическом уровне использовали методику Хоуэлла и Блэка (Howell,Black, 1980). Для этого клетки фиксировали смесью этанола и ледяной уксусной кислоты (3:1) в течение 30 мин и окрашивали 50%-ным AgNO 3 в присутствии 1% желатины при 60°С. На каждом препарате количество зерен серебра над ядрышками определяли в 50 клетках. Статистическую обработку результатов проводили используя критерий х .

Электронно-микроскопическое выявление Ag-белков проводили по методу, ранее описанному Зацепиной и Сметаной (1985). Клетки фиксировали 1.6% глутаровым альдегидом, разведенном на фосфатном солевым буфере (ФСБ) соответствующей концентрации, ■ при 4°С в течение 10 мин,затем дофиксировали в смеси этанола и уксусной кислоты (3:1) при 4°С в течении 10 мин. Окрашивание серебром проводили как указано' выше. Затем препараты обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (без контрастирования урани-лацетатом) и заключали в Эпон-812 по стандартной методике.

Иммуноцитохимическое изучение клеток. Для выявления индивидуальных ядрышковых белков клетки 10 мин фиксировали 3%-ным параформальдегидом. разведенном на ФСБ соответствующей тонич-ности и обрабатывали 0.5%-ным раствором Тритона Х-100 (на ФСБ) в течении 5 мин. Затем клетки инкубировали с первыми антителами (AT), разведенными на ФСБ. Далее, после отмывки ФСБ, клетки окрашивали вторыми AT. конъюгированными с ФИТЦ или ТРИТЦ (Sigma). Для выявления белка В23 использовали моноклональные мышиные антитела; охарактеризованные ране? (Ochs et,al., 1983), в качестве вторых антител использовали AT к иммуноглобулинам мыши. Для выявления белка фибрилларина использовали сыворотку крови аутоиммунных больных, содержащую AT к фйбрилларину (Ochs et al.,1985), в качестве вторых антител использовали AT к иммуноглобулинам человека. Локализацию белка-фактора инициации транскрипции РНК-полимеразы I изучали окрашивая клетки сывороткой (Р419). полученной от больных ревматоидным артритом, содержащей, как было описано ранее (Zatsepina et al.,1993), AT к этому белку. В качестве вторых антител использовали AT к иммуноглобулинам человека. В случае двойного окрашивания клетки инкубировали с AT к В23 и AT к фибрилларину, а в качестве вторых антител использовали ФИТЦ-меченые AT к иммуноглобулинам мыши и ТРИТЦ-меченые AT к иммуноглобулинам человека. Полученные препараты заключали

в Мовиол (СаШосЬет).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Структурные изменения ядрышка в условиях гипотонического воздействия и после переноса клеток в полную культуральную среду (прижизненные наблюдения).В контроле в интерфазных клетках культуры СПЭВ обычно обнаруживается 1-3 ядрышка, имеющих округлую форму и высокую оптическую плотность. Размеры ядрышек составляют в среднем 2-4 мкм. Значительная часть хроматина ядра деконденсирована. Замена нормальной культуральной среды на 20Ж-ный раствор Хенкса приводит к полной деконденсациг хроматина и разрыхлению материала ядрышка. Оптическая платность ядрышек постепенно падает и к 15 мин гипотонического воздействия они перестают выявляться в световой микроскоп. Ядра в этих условиях выглядят однородными.

При более длительной инкубации в 20Я-ном растворе Хенкса клетки частично-адаптируются к гипотоническим условиям среды: наблюдается конденсация хроматина ядра, однако восстановления структуры ядрышек не происходит.

Для оценки обратимости действия гипотонии, клетки возвращали в полную культуральную среду через 15 мин после начала гипотонической обработки, т.е. на стадии, когда наблюдается наибольшая степень декомпактизации материала ядра и полное исчезновение ядрышка. Это приводило к постепенному восстановлению ядрышек. К 15 мин после снятия гипотонического воздействия ядрышки однозначно идентифицируются, хотя имеют неровные контуры и меньшие, чем в контроле, размеры и оптическую плотность. Через 1-2 часа форма, размеры, оптическая плотность ядрышек в клетках, за которыми велось наблюдение, полностью возвращаются к исходному состоянию. Более того, полностью восстанавливаются число ядрышек, их положение в ядре и взаимное расположение друг относительно друга.

Следовательно, ядрышки после 15-минутного воздействия 20Ж-ного раствора Хенкса. приводящего к практически полному исчезновению структуры ядрышек на светооптическом уровне, способны к восстановлению. Полученные результаты свидетельствуют о том. что ядрышко определенным образом фиксировно в объеме ядра. На фиксированное положение ядрышек внутри ядра указывают

также данные других авторов, в частности, анализ расположения ядрышек в разных фазах клеточного цикла с помощью цейтраферной киносъемки (Bourgeois et al., 1981).

С первых минут инкубации клеток в полной среде восстановление ядрышек сопровождается появлением в кариоплазме многочисленных оптически-плотных включений округлой формы (размером 0.1-0.3 мкм). С течением времени их количество уменьшается и к 4 часам инкубации клеток в изотонии они полностью исчезают из ядер.

Электронно-микроскопическое изучение динамики структурных изменений ядрышка. Ядрышки контрольных клеток СПЭВ по ультраструктурным характеристикам относятся к'ядрышкам компактного типа (Челидзе,Зацепина,1988). Основной объем ядрышка занят гранулами. хорошо выражены фибриллярные центры (ФЦ: диаметром 0.1-0.2 мкм), окруженные плотным фибриллярным компонентом (ПФК). Совокупность ФЦ и тесно связанного с ними ПФК в литературе принято называть фибриллярными комплексами (Гозак и др..1983).

Действие гипотонического раствора приводит к резкому уменьшению плотности упаковки гранулярного компонента в ядрышках. Через 1 мин после помещения клеток в гипотонический раствор в ядрышках отчетливо видны только фибриллярные комплексы, по форме, размерам и структуре полностью соответствующие таковым интактных ядрышек. ПФК в них плотно прилегает к поверхности ФЦ.

При дальнейшей инкубации клеток в 20%-ном растворе Хенкса происходит постепенный распад фибриллярных комплексов: ФЦ и ПФК пространственно разобщаются. К 15 мин действия гипотонии ФЦ и ПФК располагаются обособленно друг от друга и приобретают вид округлых телец разной электронной плотности. На отдельных ультратонких срезах тех ФЦ и ПФК, которые расположены достаточно близко друг от друга, можно наблюдать соединяющие их фибриллы.

Измерение площадей "остаточных" ядрышек в условиях гипотонии показало, что по площади (4081+302) они мало отличаются от ядрышек в контрольных клетках (3638+404). Так как, плотность упаковки гранул в условиях гипотонической обработки намного ниже, чем в интактных ядрышках, можно предположить, что под действием гипотонической среда происходит выход большей части гранул из ядрышек. Не исключено также, что под действием гипо-

тонии гранулы разворачиваются, так как известно, что рибосомные субъединицы изменяют свою конформацию при понижении ионной силы раствора (Спирин,1984; Ченцов,1984).

Таким образом, основными этапами структурной перестройки ядрышка, происходящей под действием гипотонии , являются: сначала, выход в кариоплазму и (или) разворачивание гранулярного компонента ядрышка, а затем пространственное разделение ФЦ и ПФК. .

При возвращении клеток из разбавленного раствора Хенкса в изотоничную среду в первые 30 сек реконструирующиеся ядрышки имеют неправильную форму и размеры 1-3 мкм. В их составе выявляются ФЦ, окруженные ПФК, которые по ультраструктуре, размерам и форме не отличаются от соответствующих компонентов интактных ядрышек. Однако, гранулярный компонент ядрышек на данном этапе выражен слабо и ядрышки в основном состоят из фибрилл.

По мере инкубации клеток в полной культуральной среде ультраструктура ядрышек постепенно возвращается к исходной, наблюдаемой в контрольных клетках.

Через 30 мин - 1 час после переноса клеток в изотоническую среду в ядрышках хорошо выражены ФЦ (размером 0.1-0.2 мкм). окруженные непрерывным слоем ПФК. основной объем ядрышек занят гранулами.

С первой минуты после снятия гипотонического воздействия в кариоплазме наблюдаются также многочисленные округлые электронно-плотные тельца размером 0.1-0.2 мкм, в составе которых различаются гранулы и фибриллы. Эти тельца дают положительную реакцию при регрессивной окраске ЭДТА-свинцом (Bernhard.1969). что свидетельствует о наличии в их составе РНК. С течением времени количество РНК-содержащих включений в кариоплазме уменьшается и к 4 часам после прекращения действия гипотонии они полностью исчезают из ядер.

Данные электронно-микроскопического анализа свидетельствуют о полном восстановлении ультраструктурной организации ядрышек после снятия гипотонического воздействия. Можно полагать, что "центрами" реконструкции ядрышек являются фибриллярные центры (и, возможно, плотный фибриллярный компонент) - единственные компоненты ядрышка, которые отчетливо выявляются в условиях гипотонической обработки. Действительно. ФЦ соот-

ветствуют ядрьшкообразующим районам хромосом, вокруг которых, как известно, происходит образование ядрышек в дочерних ядрах в конце митоза (Hadjlolov.1985). Кроме того, определенную роль в восстановлении ядрышек может играть ядрышковый матрикс' (Hubert et al.1985; Verheijen et al.1988).

Анализ функциональной активности ядрышек. Уровень синтеза рРНК в клетках на различных этапах обработки оценивали по включению 3Н-уридина. Клетки инкубировали с изотопом в течении 15 мин перед фиксацией.

После инкубации контрольных клеток культуры СПЭВ с 3Н-ури- ' дином наибольшая концентрация метки обнаруживается над ядрышками. Значительная часть зерен серебра располагается также над кариоплазмой (табл.1).

После инкубации клеток в гипотоничной среде, содержащей изотоп, метка оказывается практически равномерно распределена над ядрами. При этом количество зерен серебра над ядрами значительно уменьшается по сравнению с контролем (табл.1). Полученные результаты свидетельствуют о снижении транскрипционной активности ядрышек и хроматина в целом. Однако, не исключено, что снижение количества зерен серебра отчасти связано с увеличением объема клеток в условиях гипотонии,- в результате чего число р-частиц радиоактивного трития, достигающих слоя эмульсии, уменьшается. Тем не менее, результаты ультраструктурного анализа ядрышек в клетках, инкубировавшихся в гипотонической среде в течении 15 мин. свидетельствуют в пользу того, что синтез рРНК в данных условиях отсутствует. Действительно, известно, что свободные ФЦ обнаруживаются в клетках , характеризующихся полным отсутствием синтеза рРНК (Челидзе,Зацепина, 1988).

После снятия гипотонического воздействия реконструирующиеся ядрышки вновь интенсивно включают3Н-уридин (табл.1). При этом-уже в первые 15 мин инкубации в изотоничной среде характер мечения ядрышек не отличается от такового в контроле (табл.1). Это говорит о том. что реконструирующиеся после прекращения гипотонического воздействия ядрышки полностью восстанавливают способность к синтезу рРНК.

Судьба РНП-содержашего матери;ала ядрышек в процессе их де-компактизации в условиях гипотонии и последующей реконструкции (радиоавтографическое исследование). Особый интерес представляет

Таблица 1. Распределение зерен серебра над клетками СПЭВ при 15-минутном мечении 3Н-уридином до фиксации.

Условия инкубации клеток Время инкубации, . мин. Доля зерен серебра над разными компонентами клетки, % от общего числа зерен серебра над клеткой, Число зерен серебра над клеткой

Над ядрышками Над кариоплазмой Над цитоплазмой

В изотонической среде (контроль) 48.0 + 0.7 44.0 + 0.8 8.0 + 03 115

В гипотонической среде 15 9.0 + 0.3* 58.0 + 0.7 33.0 + 0.7 28

В изотонической среде после гипотонической обработки 15 30 53.0 ±0.6 53.0 + 0.7 39.0 + 0.7 41.0 + 0.7 8.0 ±0.3 6.0 ±0.3 108 112

*

Количество зерен серебря над ядрышкам рассчитывали как произведение числа зерен серебра над ядром на площадь "остаточного" ядрышка, деленое на площадь ядра.

вопрос о механизме восстановления ядрышек после прекращения гипотонической обработки. Для того, чтобы на него ответить и проследить судьбу РНП-материала ядрышка на различных этапах обработки клетки инкубировали с 3Н-уридином в течении 15 мин до начала гипотонического воздействия. Этого времени достаточно, чтобы пометить фибриллярный и частично гранулярный компоненты ядрышка (На<ШоЮу. 1985).

Оказалось, что после 15 мин инкубации клеток в 20%-ном растворе Хенкса метка, соответствующая РНП-продуктам. синтезированным до гипотонической обработки, практически равномерно распределяется над ядрами и преимущественного мечения ядрышек не наблюдается (табл.2). Это говорит о выходе части РНП-материала ядрышек в кариоплазму в условиях гипотонии.

Однако, после переноса клеток в нормальную среду наблюдается постепенное восстановление преимущественного мечения ядрышек (табл.2). И через 30 мин после возврата клеток в полную среду около половины всех зерен серебра вновь располагается над ядрышками (табл.2).

Явная концентрация метки над реконструирующимися ядрышками в случае их мечения до воздействия гипотонии показывает, что

часть РНП-материала "исходного" ядрышка после снятия гипотонического воздействия может мигрировать из кариоплазмы в восстанавливающееся ядрышко. В целом, данные радиоавтографии говорят о том, что восстановление ядрышек, по-видимому, происходит за счет двух процессов: как за счет синтеза de novo, так и за счет материала, входившего в состав "исходного" ядрышка.

Таблица 2. Влияние гипотонической обработки на распределение зерен серебра над клетками СПЭВ после 15-минутного мечения ^Н-уридином до начала действия гипотонии.

Условия инкубации клеток Время инкубации, мин. Доля зерен серебра над разными компонентами клетки, % от общего числа зерен серебра над клеткой, х±

Над ядрышками Над кариоплазмой Над цитоплазмой

В изотонической среде (контроль) 52.0 ±0.6 38.0+0.7 10.0 ±0.3

В гипотонической среде 15 11.0 +0.7* 72.0 ±0.7 17.0 ±0.5

В изотонической среде после гипотонической обработки 15 30 33.0 + 0.6 50.0 ± 0.6 51.0 + 0.7 39.0 ± 0.6 16.0 ±0.4 11.0 ±0.3

См. примечание к таблице 1.

Изучение структурной реконструкции ядрышек в клетках в условиях подавления синтеза рибосомной РНК с помощью актиноми-цина Д. Для получения дополнительной информации о механизме восстановления ядрышек была исследована их способность реконструироваться в присутствии актиномицина Д - антибиотика, подавляющего синтез рРНК.

Электронно-микроскопический анализ показал, что в клетках инкубировавшихся в течение 15 мин после снятия гипотонического воздействия в полной культуральной среде, содержащей актиноми-цин Д. ядрышки образуются, но оказываются сегрегированными и имеют относительно небольшие размеры (около 1 мкм). Крупные ФЦ (0.4 мкм) локализуются в периферической части ядрышек. В состав ядрышек, тем не менее, входят фибриллы и гранулы, по структуре

- 12 -

соответствующие компонентам интактного ядрышка.

В ходе дальнейшей инкубации клеток в полной среде в присутствии актиномицина Д роста ядрышек не происходит.

К 2-4 часам после переноса клеток в полную среду упаковка структурных компонентов в ядрышках отличается высокой плотностью. гранулярный компонент сильно редуцирован. Фибриллярные центры располагаются на поверхности ядрышек, образуя так называемые "светлые шапочки".

С первых минут после снятия гипотонического воздействия и вплоть до 4 часов в кариоплазме видны фибриллярно-гранулярные тельца размером 0.2-0.5 мкм. В них также наблюдается сегрегация структурных компонентов.

Таким образом, даже в условиях подавления синтеза рРНК ядрышки способны частично восстанавливаться после прекращения действия гипотонии. Это наблюдение свидетельствует в пользу того. что восстанавление ядрышек отчасти происходит за счет материала "исходных" ядрышек.

изучение распределения Ае-белков в клетках СПЭВ. Чтобы получить сведения 9 поведении ядрышковых белков в ходе обратимых структурных изменений, происходящих- с ядрышком под действием растворов низкой ионной силы, была изучена локализация аргенто-фильных белков, входящих в состав фибриллярных центров и плотного фибриллярного компонента (Сабанеева,1989; Негпапйег-Уегйип, 1991).

При окраске азотнокислым серебром интактных интерфазных клеток СПЭВ гранулы серебра, соответствующие местам локализации А^-белков. выявляются исключительно над ядрышками. Гранулы имеют черный цвет и располагаются кластерами.

Замещение культурапьной среды на 20%-ный раствор Хенкса приводит к разрыхлению кластеров и пространственному обособлению А£-зерен друг от друга. На первых минутах инкубации клеток в гипотонической среде А§-гранулы разобщаются настолько, что это значительно облегчает их выявление и подсчет. Вероятно, этим может объясняться увеличение числа Ag-зepeн, выявляемых над ядрышками на данном этапе обработки (табл.3).

Через 15 мин воздействия гипотонии А§-гранулы также образуют рыхлые скопления, соответствующие ядрышкам. Однако. Аё-гранулы уменьшаются в размерах и теряют четкие контуры. Их

количество в данных условиях сопоставимо с таковым в контроле (табл.3). Одновременно, в кариоплазме появляется аргентофильный материал, имеющий коричневую окраску.

После прекращения гипотонического воздействия, к 30 мин инкубации клеток в изотонии ^-зерна над ядрышками отчетливо выражены и формируют рыхлые скопления. По мере инкубации клеток в полной среде, количество Аппозитивного материала, выявляемого, вне ядрышек, в кариоплазме, постепенно уменьшается. И через 4 часа характер Ag-oкpaшивaния клеток практически не отличается от такового в контроле. Количество Ag-гpaнyл. выявляемых в условиях изотонической среды над реконструированными ядрышками оказывается в 1.2-1.5 раза больше, чем в контроле (табл.3).

Таблица 3. Зависимость количества гранул серебра, выявляемых над ядрышками после окрашивания , от условий

гипотонической обработки клеток СПЭв.

Условия инкубации клеток Длительность инкубации Число гранул серебра над ядрышками, х

В изотопической среде (контроль) 30+1

В_гипотонической среде 1 мин 37 + 1

5 мин 29 ± 1

15 мня 29 + 1*

В изотопической среде после гипотонической обработки 30 мин 4 часа 36 + 1* 45 + 2

Подсчитывали исключительно Ag-rpaнyлы, окрашенные в черный цвет и расположенные кластерами, соответствующими зонам ядрышек.

Электронно-микроскопический анализ показал, что в контрольных интерфазных клетках аргентофильный материал сосредоточен в ядрышках в виде дискретных зон (Ай-зон). имеющих сложные очертания. А^-зоны соответствуют фибриллярным комплексам ядрышек (Зацепина,Сметана, 1985: Сабанеева. 1989).

В ядрах клеток, инкубировавшихся в 20%-ном растворе Хенкса

в течении 15 мин, Аё-зоны имеют округлую форму и ровные контуры. Их диаметр составляет 0.1-0.2 мкм. Сопоставление числа и рамеров Аё~зон с числом и размерами фибриллярных телец различной электронной плотности, обнаруживающихся на ультратонких срезах ядер после 15 мин гипотонической обработки, свидетельствует. что оба типа телец, соответствующие ФЦ и ПФК. содержат Аб-белки.

В реконструированных ядрышках (к 30 мин инкубации в изотонии) Аб-зоны вновь приобретают неровные очертания, характерные для контрольных клеток. Кроме того, в ходе реконструкции ядрышек Ag-бeлки выявляются в РНК-содержащих включениях в кариоплазме.

В целом. Ag-oкpacкa клеток указывает на то. что значительная часть белков в условиях гипотонии остается связанной с ядрышками, хотя некоторая часть Ag-бeлкoв мигрирует из ядрышек в кариоплазму.

Известно, что количественный анализ Ая-окраски ядрышек мо. жет быть использован для оценки уровня синтеза рРНК (НиЬЬеН, 1985). Полученные результаты показывают, что обработка живых клеток раствором низкой ионной силы может повысить точность подсчета Ag-гpaнyл. поскольку в этих условиях происходит пространственное разобщение индивидуальных Аб-зерен. К аналогичному выводу пришли также другие авторы, изучавшие характер серебрения ядрышек в трансформированных клетках человека после гипотонической обработки (Матаеуа ег а1.,1991).

Анализ А£-окраски также показал, что реконструкция ядрышек сопровождается восстановлением исходной локализации Ag-бeл-ков. Наблюдаемое при этом увеличение числа Ag-зepeн. вероятно, свидетельствует о повышении функциональной активности ядрышек.

Иммунолокализация ядрышковых белков - маркеров основных структурных компонентов ядрышка. Для получения дополнительных сведений о судьбе основных компонентов ядрышка в процессе их обратимых структурных изменений, происходящих под действием гипотонии. в работе изучали локализацию индивидуальных ядрышковых белков, являющихся их иммуноцитохимическими маркерами.

Локализация белка В23. Согласно литературным данным В23 входит в состав гранулярного компонента ядрышка (БресЪог еЪ а!.. 1984; Негпап<1ег-Уег<11т.1991). В интактных интерфазных клет-

ках СПЭВ антителами к В23 ядрышки окрашиваются практически равномерно (рис.1, а).

Действие 20%-ного раствора Хенкса вызывает миграцию белка В23 в кариоплазму. При окраске АТ к В23. ядра клеток, инкубировавшихся в гипотонической среде, флуоресцируют практически гомогенно. Лишь в ядрах отдельных клеток видны зоны отличающиеся несколько более ярким свечением (рис.1,6).

Через 5 мин после переноса клеток в изотоничную среду В23 преимущественно выявляется в многочисленных кариоплазматических включениях (размером 0.1-0.2 мкм). Восстанавливающиеся ядрышки на данном этапе АТ к В23 окрашиваются слабо (рис.1,в). По мере инкубации клеток в изотонической среде наблюдается постепенное - усиление интенсивности флуоресценции ядрышек при окраске антителами к В23. Через 45 мин после возврата клеток в нормальную" среду характер внутриядрышковой локализации белка В23 соответствует таковому в контроле (рис.1.г). Одновременно с восстановлением ядрышек, количество В23-содержащих гранул в кариоплазме падает, а их размеры увеличиваются. Уменьшение количества В23-содержащих включений в кариоплазме по времени совпадает с миграцией .метки в реконструирующиеся ядрышки после их импульсного мечения до воздействия гипотонии (см. табл.2). Это наблюдение косвенно свидетельствует о том. что кариоплазмати-ческие включения могут участвовать в восстановлении ядрышек, сливаясь с ними.

К 4 часам инкубации клеток в изотоничной среде" В23-содер-жащие гранулы полностью исчезают из ядер (рис.1,а).

Результаты локализации белка В23 в процессе восстановления ядрышек, происходившем в присутствии актиномицина Д. также,свидетельствуют в пользу того, что часть РНП-материала "исходного" ядрышка включается в состав новообразованного ядрышка.

Через 5 мин после переноса клеток в полную культуральную среду, содержащую актиномицин Д, В23 выявляется в составе многочисленных кариоплазматических включений (рис.1,в). Появление В23 в формирующихся ядрышках по времени совпадает с уменьшением количества В23-содержащих включений в кариоплазме (рис.1,д). Однако, ядрышки в данных условиях не вырастают до исходных размеров н окрашиваются АТ к В23 не равномерно (рис.1,д). Послед-

нее отражает сегрегацию гранулярного и фибриллярного компонентов ядрышка. Кроме того, при длительной инкубации клеток в среде. содержащей актиномицин Д. белок В23 выходит из ядрышек и кариоплазматических включений в кариоплазму (рис.1,е). Эти наблюдения полностью соответствуют литературным данным о поведении В23 под действием ингибиторов синтеза рРНК (Chan et al.,1985; Yung et al..1985; Chan,1992).

Рис.1. Локализация белка В23 в.ядрах клеток СПЭВ в контроле (а).

в условиях гипотонии (б) и на различных этапах реконструкции ядрышек в среде полного состава, не содержащей (в,г) и содержащей актиномицин Д (д.е). Время инкубации в полной среде:

в - 5 мин; г - 45 мин;

Локализация белка Фибрилларина. В интактных интерфазных клетках СПЭВ белок фибрилларин. специфичный для плотного фибриллярного компонента ядрышек (Ochs et al..l985; Hernandez-Verdun. 1991). локализован в ядрышках в виде отдельных ярко флуоресцирующих зон.

15-минутное воздействие 20%-ного раствора Хенкса приводит к частичной миграции белка фибрилларина из ядрышка в кариоплазму. В условиях гипотонической среды кариоплазма клеток интенсивно светится, хотя во всех ядрах обнаруживаются области, отличающиеся гомогенной и более яркой флуоресценцией. По числу (1-3 на ядро) и размерам (2-4 мкм) они соответствуют "остаточным" ядрышкам.

Через 5-15 мин после переноса клеток в полную культураль-

ную среду белок фибрилларин обнаруживается в реконструирующихся ядрышках в виде ярко светящихся гранул. На данном этапе наблюдается также однородное слабое свечение кариоплазмы.

Через 30 мин инкубации клеток в полной среде характер локализации белка фибрилларина внутри ядрышек не отличается от таковой в контроле. В то же время, помимо ядрышек, антителами к фибрилларину окрашиваются многочисленные включения в кариоплазме. С течением времени количество фибрилларин-содержащих включений в кариоплазме постепенно падает и через 4 часа инкубации в полной среде они полностью исчезают.

Одновременное выявление белков В23 и Фибрилларина. Двойное окрашивание клеток антителами к белку В23 и антителами к белку фибрилларину на тех стадиях реконструкции ядрышек, когда кари-оплазматические включения выражены наиболее отчетливо (т.е. через 30 мин - 1 час инкубации клеток в полной среде) показало, что существуют по крайней мере два типа кариоплазматических включений: в одних содержатся оба белка (В23 и фибрилларин), в других обнаруживается только В23.

Локализация белка-Фактора инициации транскрипции, специфичного для РНК-полимеразы I. Согласно литературным данным фактор инициации транскрипции (ФИТ) РНК-полимеразы I на ультраструктурном уровне выявляется в ядрышках в ФЦ и/или в плотном фибриллярном компоненте (Rendon et al..1992; Rodrigo et al.. 1992; Rousell et al.1993; Zatsepina et al..1993). В метафазе митоза ФИТ локализован в ядрышкообразующих районах (ЯОР) хромосом (Zatsepina et al.,1993).

В интерфазных интактных клетках культуры СПЭВ ФИТ обнаруживается в ядрышках в виде многочисленных ярко флуоресцирующих гранул.

Через 15 мин инкубации клеток в 20%-ном растворе Хенкса, ФИТ по-прежнему локализуется в ядрах в виде скоплений флуоресцирующих гранул. Кроме того, в метафазных клетках ФИТ остается связанным с ЯОР хромосом. Следовательно, можно полагать, что скопления флуоресцирующих гранул, выявляемые в интерфазных ядрах в условиях гипотонии при окраске сьвороткой, содержащей антитела к ФИТ, соответствуют местам локализации рибосомных генов, т.е. ядрышкам.

В восстанавливающихся ядрышках характер локализации ФИТ

г 18 -

соответствует таковому в контроле.

Результаты иммуноцитохимических исследований распределения индивидуальных белков и Ag-6e.iiK.OB говорят о том, что белки, входящие в состав различных структурных компонентов, отличаются разной устойчивостью к действию раствора низкой ионной силы и в разной степени экстрагируются из ядрышек. Белок В23, являющийся маркером гранулярной части ядрышек (Брес^г е! а1..1984: Негпапйег-Уегйип, 1991), значительно легче мигрирует из ядрышек в кариоплазму, чем белки, входящие в состав фибриллярного компонента: Ag-бeлки, фибрилларин и ФИТ. Наибольшей устойчивостью к действию гипотонии обладает белок ФИТ, который не меняет своей локализации в ядрышках при изменении тоничности среды. Сходные результаты о различной устойчивости белков гранулярного и фибриллярного компонентов ядрышек к действию разбавленного фосфатного буфера были получены также на клетках НеЬа Гозаком с соавторами (Ногак а1.,1992).

Поведение белков - маркеров основных структурных компонентов ядрышка в условиях раствора низкой ионной силы в целом согласуется с результатами ультраструктурного анализа поведения соответствующих компонентов в процессе разрыхления ядрышка. Результаты, полученные различными методами, показывают, что именно фибриллярные центры являются наиболее устойчивыми ядрышковы-ми структурами в условиях гипотонической среды. Определенной устойчивостью обладает также плотный фибриллярный компонент. Гранулярная часть ядрышек оказывается наиболее чувствительной к обработке раствором низкой ионной силы.

Реконструкция ядрышек после прекращения действия гипотонии сопровождается восстановлением локализации ядрышковых белков характерной для интактных ядрышек.

Электронно-микроскопическое и цитохимическое изучение предъядрышек в телоФазных клетках культуры СПЭВ. При переносе клеток из гипотонического раствора в полную культуральную среду, формированию зрелых крупных ядрышек предшествует появление в нуклеоплазме многочисленных фибриллярно-гранулярных телец. В их составе обнаруживаются РНК, Ag-бeлки, белок 823 и фибрилларин. Такая последовательность событий в значительной степени напоминает нуклеологенез, происходящий в телофазе нормального митоза и сопровождающийся образованием предъядрышек (проядры-

шек) (Ochs et al.,1985; Scheer, Benavente,1990; Scheer. Weisen-berger. 1994). Принято считать, что в результате слияния предъ-ядрышек с ядрышковыми организаторами происходит реконструкция ядрышек в митотичеких клетках (Scheer et al.,1993). Этот процесс задерживается при блокировании синтеза рРНК актиномицином Д (Ochs et-al.,1983). Из литературных данных также известно, что митотические предъядрышки обнаруживают способность к сегрегации под действием актиномицина Д (Ченцов.Поляков. 1974). Из полученных нами результатов следует, что всеми перечисленными выше свойствами обладают также фибриллярно-гранулярные тельца, возникающие в ядрах клеток после прекращения действия гипотонии. Поэтому, в дальнейшем мы будем называть эти РНП-содержащие тельца проядрышкоподобными тельцами (ПЯкТ). Чтобы провести более детальное сравнение ПЯкТ и митотических предъядрышек, было предпринято изучение телофазных клеток СПЭВ.

Электронно-микроскопическое исследование показало, что в клетках СПЭВ. находящихся на стадии поздней телофазы, многочисленные предъядрышки имеют округлую форму и размеры 0.2-0.4 мкм. В их составе различаются фибриллы и гранулы. Наблюдаемая ультраструктура предъядрышек полностью соответствует описанной в литературе (Ochs et al.,1985).

Светооптическое изучение локализации Ag-белков в телофазных клетках культуры СПЭВ показало, что в ядре каждой дочерней клетки выявляется три-четыре крупных Ag-гранулы, имеющих черный цвет, и множество более светлых мелких гранул. Это наблюдение полностью согласуется с литературным данным о наличии Ag-белов в составе митотических предъядрышек (Hernandez-Verdun ,1991).

Иммунолокализация белка В23 в клетках СПЭВ, находящихся на стадии телофазы, показала, что белок В23 локализован как в восстанавливающихся ядрышках, так и в многочисленных предъяд-рыщках.

Те же особенности имеет характер распределения белка фиб-рилларина в телофазных клетках.

Однако, методом двойного окрашивания удалось обнаружить ряд отличий в динамике перераспределения данных ядрышковых белков в ходе телофазы. Белок фибрилларин появляется во вновь формирующихся ядрышках раньше, чем В23. Кроме того, белок В23 входит в состав предъядрышек с момента их возникновения, в то вре-

мя как фибрилларин появляется в большинстве из них значительно позже, когда ядрышки практически полностью сформируются. Такие же особенности в поведении данных белков наблюдались и в ходе реконструкции ядрышек после прекращения действия гипотонии.

Одновременная иммунолокализация В23 и фибрилларина на стадии. когда оба белка выявляются и в ядрышках и в предъядрышках, показала наличие по крайней мере двух популяций предъядрышек в митозе: одни из них содержат оба белка, в то время как в других обнаруживается только В23. По мере прохождения телофазы происходит уменьшение числа предъядрышек в кариоплазме и они исчезают из ядер.

Сравнительный анализ ультраструктуры, белкового состава и поведения предъядрышек в телофазе митоза с таковыми пЯкТ, позволяет заключить, что реконструкция ядрышек, наблюдаемая после разобщения их структурных компонентов в растворе низкой ионной силы, в основном повторяет процесс восстановления ядрышек, происходящий во время нормального митоза, и может быть использована в качестве модели для изучения естественного нуклеологенеза.

Исходя из современных взглядов на функциональное значение и взаимосвязь отдельных компонентов ядрышка, полученные в работе данные можно представить в виде следующей схемы реорганизации структуры ядрышка при обратимом действии гипотонического раствора (рис.2). В интактных интерфазных клетках . активно синтезирующих рРНК, ПФК. соответствующий новосинтезированной пре-рРНК, располагается на поверхности ФЦ (рис.2,а). Действие гипотонического раствора приводит к выходу и разворачиванию большей части гранул, и к пространственному разобщению ФЦ и ПФК, которые, вероятно, остаются связанными между собой посредством фибрилл ДНП (рис.2,б). Восстановление ядрышка в полной культуральной среде происходит как за счет возобновления синтеза рРНК на поверхности ФЦ, так и за счет РНП-продуктов, входивших в состав "исходного" ядрышка (рис.2,в). После прекращения гипотонического воздействия происходит полная структурно-функциональная реконструкция ядрышка (рис.2,а).

г\ -

Рис.2. Реорганизация структуры гипотонического раствора.

ядрышка при обратимом действии

А - ядрышко в интактных клетках и после полной реконструкции в условиях изотоническои среды: Б - ядрышко через 15 мин гипотонического воздействия; В - восстанавливающееся ядрышко через 5 мин после переноса клеток в полную среду; Гр - гранулы ядрышка; ПФК -плотный фибриллярный компонент; ФЦ - фибриллярные центры; ПЯкТ - проядрышкоподобные тельца; ЯО - ядерная оболочка.

ВЫВОДЫ:

1. Воздействие 20%-ного раствора Хенкса на живые клетки СПЭВ вызывает декомпактизацию материала ядрышек. Это проявляется в выходе большей части гранул из ядрышка и пространственном разобщении фибриллярных центров и плотного фибриллярного компонента.

2. Различные компоненты ядрышка обладают разной устойчивостью к действию раствора низкой ионной силы: наиболее чувствительным оказывается гранулярный компонент, более устойчивы - ФЦ и ПФК. Это может быть использовано для выделения ФЦ и ПФК в виде отдельных фракций.

3. Действие 20%-ного раствора Хенкса является структурно и функционально обратимым. После прекращения действия гипотонии ультраструктура, белковый состав и функциональная активность

- 22 -

ядрышек полностью восстанавливаются.

4. Восстановление размеров, формы ядрышек, их расположения внутри ядра, происходящее после прекращения гипотонического воздействия, свидетельствует о детерминированности этих параметров.

5. Реконструкция ядрышек после прекращения гипотонического воздействия происходит как за счет синтеза de novo, так и за счет материала "исходного" ядрышка.

6. Процесс реконструкции ядрышек сопровождается образованием в кариоплазме многочисленных РНП-содержащих включений, которые по своей ультраструктуре, белковому составу, а также поведению в ходе нуклеологенеза и под действием актиномицина Д соответствуют предьядрышкам нормального митоза.

7. Реконструкция ядрышек после прекращения гипотонической обработки в основном повторяет процесс формирования ядрышек, происходящий в телофазе митоза, и может использоваться в качестве экспериментальной модели нуклеологенеза.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Дудник О.А., Зацепина О.В., Ченцов Ю.С. Влияние растворов низкой ионной силы на структуру и функцию ядрышек в живых клетках СПЭВ. Цитология. 1993, том 35, Ns 5. стр.10-16.

Дудник 0.А., Зацепина О.В. Поведение некоторых ядрышковых белков в условиях обратимого пространственного разобщения структурных компонентов ядрышка. Цитология. 1995. том 37, №1/2. стр.125-131.

Зацепина О.В.. Дудник О.А.. Кудрявцев И.С. Динамика внутриклеточного распределения ядрышкового белка В23 в интерфазных и митотических клетках разных культур млекопитающих.Цитология (в печати).

O.A.Dudnlc. O.V.Zatsepina. I.Todorov, Yu.S.Chentsov. H.F.Trendelenburg. H.Spring. Nucleolar topology investigated by in vivo decondensation of actively transcribing nucleoli of mammalian cells.-Proc.of the 13th European Workshop on the Cell Nucleus. Hangary. 1993. p.23.

O.A.Dudnlc, O.V.Zatsepina. Artificial induction of mitotic-like prenucleolar bodies in mature interphase nuciei. Cell Biol. Int. 1994. v. 18. n.5. p.411.

O.A.Dudnlk. 0.A.Zatsepina. Artificially-induced assembly of prenucleaolar bodies in cultured interphase cells.-5th European Congress of Cell Biology. (Heidelberg, Germany. 1995).

Типография ордена "Знак Почета" издательства МГУ 119899, Москва, Ленинские горы Заказ N° -/06& . Тираж 50 экз.