Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ ДНК-репаративных возможностей лимфоцитов человека при изменении ионных параметров среды и воздействиях, инициирующих состояние готовности клеток к адаптивному ответу

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ ДНК-репаративных возможностей лимфоцитов человека при изменении ионных параметров среды и воздействиях, инициирующих состояние готовности клеток к адаптивному ответу"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи УДК 675.224.42/46:677.2

ПОСПЕХОВА Наталья Ивановна

АНАЛИЗ ДНК- РЕПАРАТИВНЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ 7ШЮЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ПРИ. ИЗМЕНЕНИИ ИОННЫХ ПАРАМЕТРОВ СРЕДЫ Ч ВОЗДЕЙСТВИЯХ, ИНИЦИИРУЮЩИХ СОСТОЯНИЕ ГОТОВНОСТИ КЛЕТОК К АДАПТИВНОМУ ОТВЕТУ

(03.00.15 - генетика)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Института генетики человека Медико-генетического ' научного Центра РАМН

Научный руководитель - доктор биологически« наук.

профессор Д.М.Спитковский

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор Ю.А.Ревазова

доктор биологических наук, профессор А.С.Саенко

Ведущее учреждение - Институт общей генетики

им. Н.И.Вавилова РАН

„. г,

Защита диссертации состоится " гч- /у ¿/У 199Б г. в /у чао. иин. на заседании Специализированного учёного совета (Д.001.16.01) Медико-генетического научного Центра РАМН по адре-оу:. 115478 Москва, ул. Москворечье, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра. Автореферат разослан и "_ 1095 г.

Учёный секретарь Специализированного совета

доктор биологических наук, профессор Л.Ф.Курило

Актуальность проблемы. В последнее время выясняется, что верность переходов индуцированных генетически опасными агентами (режпений ДНК в фиксированные генные или хромосомные мутации в мительной степени зависит от параметров среды, в которой функ-иируют клетки (Galloway etal.,1987; Kubotaetal., 1989; tt et al., 1991). Несмотря на принципиальную важность указано феномена, его механизмы остаются невыясненными. Вместе с I, известно, что стабильность генома клеток в значительной сте-и обусловлена системой ДНК-репарации клеток. Поэтому можно дположить, что в период адаптации к изменённым параметрам сре-клетки переходят в новый функциональный режим, при котором кены их ДНК-репаративнае возможности, что и приводит в конеч-итоге к повышенному уровню мутагенеза. Если высказанное пред-ожение справедливо, то можно ожидать, что снижение ДНК-репара-ных возможностей клеток будет происходить и в период перехода эвый функциональный режим, вызванный не только средовыми фак-ами, но и другими воздействиями, в частности, физическими. , известно, что в период подготовки клеток к включению прог-«ы адаптивного ответа (Wolff et al., 1988), инициированный ма-1 дозами ионизирующей радиации при определённой комбинации дои её скорости (Спитковский, 1995). происходят существенные йразования параметров ядер клеток, т.е. изменения их функциэ-.ного состояния.

Настоящее исследование посвящено выяснению ДНК-репаративньк южностей лимфоцитов (и их отдельных субпопуляций) периферией крови человека в период их перехода в новый функциональный м, вызванный изменениями ионных параметров среды или воздейс-ы рентгеновского излучения, инициирующего состояние готовнос-леток к адаптивному ответу. Актуальность решения этой пробле-пределяется тем, что доказательство снижения ДНК-репаративных ожностей клеток (или их определённых субпопуляций) в период даптации к изменённым факторам окружающей среды позволило бы полагать новый механизм усиления мутагенеза при совместном твии нейтральных и опасных в генетическом плане агентов. Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования аось: выяснение влияния изменений ионной силы среды и ионизи-эго , излучения в условиях инициации последующего адаптивного га - факторов, изменяющих физиологический статус клеток (лим-

фоцитов периферической крови человека). - на ДНК-репаративные возможности (внеплановый синтез ДНК) клеток при воздействии УФ-облучения; выяснение возможных отличий при указанных условиях и воздействиях во внеплановом синтезе ДНК между отдельными субпопуляциями лимфоцитов и клетками пациентов с генетическими дефектами в системе УФ-индуцированной репарации (пигментная ксеродер-иа). В связи с поставленной целью конкретные задачи исследования ваключались в следующем:

1. Выяснить зависимость УФ-индуцированного знепланового синтеза ДНК от ионной силы среды в лимфоцитах периферической крови человека. \

2. Получить, охарактеризовать отдельные субпопуляции лимфоцитов и выяснить зависимость УФ-индуцированного в них внепланового синтеза ДНК от ионной силы среды.

3. Выяснить зависимость УФ-индуцированного внепланового синтеза ДНК от ионной силы среды в лимфоцитах больных пигментной ксеродермой.

Изучить влияние ионизирующей радиации в режиме, инициирующем последующий адаптивный ответ лимфоцитов, на УФ-индуцированный внеплановый синтез ДНК в этих клетках.

Положения, выносимые на защиту.

. 1. Зависимость УФ-индуцированной репаративной активности лимфоцитов человека от ионной силы среды выражена в виде параболы о максимумом при физиологической ионной силе.

2. Различия по обогащённости активированными Т-лимфоцитами, уровню спонтанного включения 3Н-тимидина, размерам ядер клеток, количеству ядрышек на клетку, активности УФ-индуцированного ре-паративного синтеза ДНК и степени деградации ДНК разных 'фракций' лимфоцитов, выделенных в градиенте рН и плотности V фракции БСА.

■ 3. Пониженная степень модификации репаративной активности лимфоцитов 3-й фракции здоровых доноров и больных ХР при уменьшении ионной силы среды.

4. Нелинейность зависимостей "доза-эффект" при действии, рентгеновского излучения в диапазоне доз, инициирующих состояние готовности клеток к адаптивному ответу, и последовательного воздействия ионизирующего и неионизирующего излучений.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые показано, что как средовые, так и физические факторы, из-

меняющие режим фушщионирования клеток, . приводят к снижении УФ-индуцированного внепланового синтеза ДНК. Этот феномен лежит в основе механизма резкого повышения выхода генетических повреждений при изменении ионной силы среды обитания Клеток. Впервые показано, что среди лимфоцитов человека имеется субпопуляция» отличающаяся от остальных зависимостью УФ-индуцированного синтеза ДНК от ионной силы среды, близкой к таковой для клеток больных о генетическими дефектами по системе УФ-репарации.

Изученная зависимость УФ-индуцированной репарации ДНК от ионной силы среды в клетках больных пигментной ксеродермой позволяет существенно увеличить возможности диагностики названной патологии и заболеваний с предполагаемым нарушением УФ-индуцированной репарации ДНК.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на

1 Всесоюзном симпозиуме "Молекулярно-клеточные механизмы хронического действия ионизирующих излучений на биологические системы" (1990), на Российском научном симпозиуме "Экологические факторы и кроветворение" (1992), на 1 Радиобиологическом съезде (1993), на

2 Международной конференции "Радиобиологические последствия аварий на атомных станциях" (1994), на 1 Российском съезде медицинских генетиков (1994), на 1 съезде ВОГиС (1994), на 2 Мели/народном симпозиуме "Механизмы действия сверхмалых доз" (1995), на научном семинаре Института-генетики человека МГНЦ РАШ (1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы м методы, результаты исследования, обсуждение результатов исследования, выводы и список литературы. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, содержит 18 иллюстраций и 8 таблиц. Список ли- ,-• гературы включает 167 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе .использовали нестимулированные лимфоциты человека, вделенные в системе фиколд-верографин по стандартной методике [Вйуиш, 1968) из крови 74 здоровых доноров и 6 больных пигментной ссеродермой (ХР). Клинические проявления заболевания соответство-

вали у 1 больного описанию "классической формы" ХР (Михельсон, 1979), которая по классификации Кливера (Cleaver & Кгаетег, 1989) относится к группам комплементации С, Е или F; у 1 - синдрому де Санктиса-Каччионе (группы комплементации А, В или D), у .1 -ХР-варианту (XP-V).

Приготовление сред с различными значениями ионной силы. Смеси дистиллированной воды, 10-кратного раствора Хенкса без фенолового красного в разных пропорциях и сыворотки крови крупного рогатого скота доводили добавлением 0,1 н НС1 и трис-HCl до значения рН 7,4. Затем по 2,96 мл этих растворов добавляли к клеточным суспензиям (объёмом 2 мл) для создания в инкубационных средах необходимой кратности ионной силы. Конечная концентрация сыворотки составляла 9.7Z. В некоторых опытах в среду с О.Бм« вводили ионы Na+, К+, Са2+ до их конечной концентрации, характерной для-раствора Хенкса с физиологической ионной силой.

Фракционирование лимфоцитов в ступенчатом градиенте альбумина. Применяли методику, предложенную August и др. (1970). Исполь-вовали бычий сывороточный альбумин (БСА) фракции V, рН 5,2 (United States biochemical corp.). Готовили исходный 35% раствор БСА в 0,165 М растворе трис-HCl. Различные концентрации альбумина получали при разведении исходного раствора фосфатным буфером: 0,15 М NaCl, 0,01 М NaH2P04, рН 7,1. В стеклянную пробирку последовательно наслаивали ступени градиента (объёмом 1 мл), начиная с ЗБХ-го раствора; концентрация альбумина в верхнем слое градиента

- 1QX. Интервал между концентрациями БСА соседних слоев - 2Х. Сверху наслаивали суспензию лимфоцитов в 17Х-ном растворе БСА объёмом 1,5 мл (100-200"10е клеток). Градиент с нанесёнными клетками инкубировали 15 минут при 4°С, затем центрифугировали при 900g 45 минут при температуре Ю°С. Фракции лимфоцитов последовательно собирали с границ раздела фаз. Фракцию клеток, собранную с границы между 17Х-ным и 19Х-ным слоями БСА. обозначили как фрак-цио N 1; клетки, находящиеся между 19Х-ным и 21Х-ным слоями БСА -как фракцию N 2 и т.д.

Облучение лимфоцитов. Использовали безазотную ртутную лампу низкого давления BLF-12 (Венгрия) сАтах-253,7 нм. Мощность дозы

- 2 Д*/м2-сек. Лимфоциты помещали в пластиковые чашки Петри (40 мм) и облучали в растворе Хенкса без фенолового красного при тол-шине слоя 1,6 мм в дозе 20 Дд/м2.

- б -

Для рентгеновского облучения клеток использовали импульсную рентгеновскую установку АРИНА-2 (Россия). Облучение проводили при мощностях дозы 0,026, 0,076 и 0,228 сГр/с, а при получении лозовой зависимости - 0,228 СГр/с. Часть клеток после рентгеновского облучения инкубировали 1,5 часа при 37°С и подвергали УФ-облучению в дозе 20 Дж/м2.

Включение 3Н-тимидина и оценка внепланового синтеза ДНК. Клетки инкубировали в растворе Хенкса, содержащем 10"3 М гидрок-симочевины, 3,7-Ю4 Бк/мл 3Н-тимидина (уд. акт. 962 ГБк/мМ, "Amersham") и 102 сыворотки крови КРС в течение 3 часов при 37°С. Включение радионуклида останавливали введением холодного тимиди-на. Клетки переносили на фильтры GF/A ("Whatman"), фиксировали холодной смесью этанол-ледяная уксусная кислота, промывали 15 объёмами 2,5%-ной трихлоруксусной кислоты, тремя объёмами этанола и высушивали. Радиоактивность препарата считали в толуольном сцинтияляторе, . содержащем 4% ППО и 0,2Х ПОПОП на счётчике Mark III (США). Гидролиз клеток проводили в 5%-ном растворе НСЮ4 1 час при 95°С. Радиоактивность (cipm) каждого препарата измеряли в течение 10 минут в толуольном сцинтилляторе, содержащем 332 тритона Х-100. Активность репаративного синтеза характеризовали индексом репарации (ИР), который представляет собой разность между включениями "^-тимидина в опытные (о) и контрольные (к) клетки, отнесённую к величине включения в контрольные клетки: iP - (dpmo - dpm,{)/clpr)K. Коэффициент самопоглсщения (КС) в-частиц ^Н-тимидина определяли по соотношению радиоактивностей гидроли-гованного (dprna) и негидролизованного (dpmi) препаратов: КС -ipn>2/dpmi. При получении дозовых зависимостей проводили по пять экспериментов на лимфоцитах каждого донора.

Метод микрозлектрофореза ДНК индивидуальных клеток (метод |ейтральных ДНК-комет). Интактные и облучённые в дозе 3 сГр клетей смешивали с расплавленной легкоплавкой агарозой (0,5Х агароза ) фосфатном буфере, рН 7,4). Слайд на предметном стекле лизирова-01 12-15 ч при 50°С в растворе, содержащем 1,6 М NaCl, 0,01 М 'рис-HCl рН 8,0, 22-ный лаурилсаркозинат Na, 0,4 М ЦЦТАИаг. Затем лайды промывали в воде и инкубировали 2 ч в буферном растворе, »держащем 25 мМ ЗДТАНаг, 25 id! Трис-HCl, рН 8,0. Проводили 1лектрофорез при постоянном напряжении 4 В/см в течение 20 мин [ри 10-12°С и окрашивали препарат зтидиеы бромида (1 мкг/мл).

Анализ ДНК-комет проводили по 2 показателям: полная длина кометы (Ь) и момент хвоста кометы (ш) - произведение длины хвоста кометы на долю материала в нём. Содержание ДНК в комете определяли по интенсивности флюоресценции.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Зависимость включения 3Н-тимидина в контрольные и УФ-облучённые лимфоциты. Установлено, что включение в контрольные клетки достаточно слабо зависит от ионной силы среды во всём исследованном диапазоне. В тоже время наблюдается существенная зависимость этого параметра от ионной силы среды с максимумом, близким к физиологическому значению ионной силы (ц®). На основании этих данных рассчитали зависимость от ионной силы среднего значения параметра К - (А - В)/(С - 0) для всех исследованных 11-и здоровых, доноров (рис.1), где А и В - величины радиоактивности соответственно для УФ-облучённых и контрольных клеток при различных значениях ионной силы, С и Б - то же при ц®. Как видно из приведённого рисунка, изменение ионной силы среды выше и ниже физиологического значения вызывает существенное уменьшение УФ-индуцированного. внепланового синтеза (ВС) ДНК. Данная зависимость К - Иц) для лимфоцитов вдоровых доноров удовлетворительно описывается параболой у - - 1,21х2 + 2,76х - 0,55. Приведённые выше результаты могут быть обусловлены не только интегральным изменением ионной силы, но и изменениями концентрации определённого иона в среде. Для выяснения этого вопроса нами были поставлены следующие эксперименты. В разбавленную в 2 раза среду (О.Би®) вводили некоторые ионы (Иа+, К+, Са2+) до их конечной концентрации, характерней для' раствора Хенкса. Как следует иа полученных данных, качество иона в данном случае не имеет принципиального авачения. Эти результаты указывают на решающий вклад в исследованный феномен абсолютного вначения ионной силы. Следствием изменений ионных параметров среды могут быть структурные преобразования хроматинового комплекса в ядрах кяеток, что, как известно, может препятствовать процессу репарации ДНК. Поэтому провели изучение изменений 'некоторых структурных характеристик ядер лимфоцитов здоровых доноров в зависимости от ионной силы среды.

Размеры ядер лимфоцитов. Показано, что с уменьшением значе-

0.5 1 1.5 г

Рис. 1. ЭавйсййЬсяь штепсивности внепланового синтеза ДНК

ЛЙМфоЦИТОЕ здоровых доноров от ионной силы среды. По оси абсцисс - кратность ионной силы среды её физиологическому значению (и«); по оси ординат - величина К - отношение среднего значения показателя репарации (А - В) для всех доноров данной группы к величине показателя репарации (С - 0) при физиологической ионной силе. Стрелками указаны значения К при введении в среду с О.бц® соответствующих ионов.

ния ионной силы раамер ядер увеличивается как для необлучённых, так и для УФ-облучённых клеток. Вместе с тем, при всех трёх исследованных значениях,ио{ШЫХ сил среды (О.Бдф; ц®; 1,25ц®) диаметр ядер УФ-облучённых клеток меньше, чем контрольных (р < 0,05). Параллельно оценивали величину самопоглощенил в-частиц от инкорпорированного 3Н-тимидина, отражающую степень конденсации хроматина. Прослеживается определённая, тенденция уменьшения КС (т.е. уменьшения степени конденсации) с уменьшением ионной силы среды.

Таким образом, при УФ-облучении параболическая зависимость включения 3Н-тимвдина от ионной силы среды также не связана с исследуемыми параметрами" ядер, поскольку последние изменяются разнонаправленно при значениях ц больше и меньше м<ь- Итак, выясненная нами зависимость внепланового синтеза ДНК, в той степени, в которой этот параметр отражает ДНК-репаративные возможности лимфоцитов, объясняет механизм увеличенного выхода геномных повреждений при варьировании ионной силы среды.

Полученные данные отражают интегральный вид зависимости между изучаемыми параметрами. Однако известно, что популяции клеток „достаточно гетерогенны. Поэтому нельзя исключить, что для некоторых субпопуляций эти зависимости могут существенно отличаться.

Выделение и исследование лимфоцитов разных субпопуляций. После фракционирования лимфоцитов в градиенте БСА количественные ■распределения клеток для разных доноров обнаруживают значительное сходство. В большинстве опытов максимальное количество лимфоцитов находится в 5-й фракции. Мы (также как и другие авторы) получали незначительное количество клеток в самых верхних слоях градиента БСА. Лимфоциты именно этих фракций по многим параметрам существенно отличаются от клеток других фракций.

1. Анализ размеров ядер лимфоцитов разных фракций градиента БСА. В табл. 1 приведены средн"е значения диаметра (Б) лимфоцитов разных фракций градиента. Видно, что клетки верхних фракций градиента отличаются большим диаметром ядер, и наблюдается тенденция к уменьшению (хотя и не монотонно) среднего размера ядер лимфоцитов вдоль' градиента БСА. Мы условно разделили лимфоциты по размерам их ядер на три группы: большие (>8,1 мкм; "6"), средние (6-8,1 мкм; "ср") и малые (< 6 мкм; "м") клетки.

Таблица 1. Относительное содержание лимфоцитов разных размеров во фракциях.

опыт 1 ОПЫТ 2

N |

&Р.1 0 м. ср. б. 0 м. ср. б.

мкм X X X мкм X X X

1 | 9,20 41 59 7,30 10 71 19

2 1 8,51 - 53 47 7,52 9 67 24

3 I 7,83 - 70 30 6,91 20 67 13

4 I 7,50 2 72 26 6,50 38 56 6

5 I 7,32 5 74 21 6,93 3 91 6

6 I 7,50 3 79 18 6,32 39 57 4

7 I 5,80 74 24 2 6,30 36 62 2

8 I 6,75 12 80 8 5,74 71 29 -

9 I 6,96 7 82 11

опыт 3

О

мкм

м.

г

ср. б. X 7.

7,73 8,31

6 60 34 4 50 46

7.00 19 65 16

6,49 24 74 2

5,84 71 28 1

6,10 47 52 1

5,62 74 26 -

5.38 84 15 1

Приведенные данные указывают на то, что основная масса1 круп>-ных лимфоцитов находится в верхних слоях градиента. Было установлено, что между величиной спонтанного включения метки и размером* ядер существует определённая взаимосвязь. Верхние фракции грали*-ента, характеризующиеся обогащённостыо клетками большого размера1,, отличаются повышенным уровнем спонтанного включения ^-тимидина1,-а нижние - меньшими значениями обоих параметров.

2. Исследование репаративного потенциала клеток разных фракций БСА. В табл. 2 приведены данные, из которых видно, что лимфоциты разных фракций существенно отличаются по своему репаративно-му потенциалу, причём, клетки верхних фракций характеризуются пониженным значением индуцированного ВС ДНК по сравнению с клетками Других фракций. В некоторых случаях отмечается снижение ИР для клеток нижних фракций градиента, что требует дополнительных исследований. Значение ИР для контрольных, нефракционированных лимфоцитов существенно превышает значение этого показателя для клеток верхних фракций градиента.

Таблица 2. Значение индекса репарации для лимфоцитов разных фракций после воздействия УФ-иэлучения в дозе 20 Дж/ы2.

опыт 1 1 опыт 2 |

1 N 1

(Зрспк с1рг1о ИР | йрпь йрть ИР 1 1

1 г 940 936 0 |

1 з 141 281 0.99| 291 968 2.33)

1 4 92 145 0.58| 147 747 4,081

1 & 47 151 2.211 134 950 6.09|

1 6 65 344 5.25| 154 772 4,01|

1 7 111 366 2.301 332 1568 3,721

! 8 63 306 3,86) 470 1741 2,70|

|9 53 322 5,081 1 |

1 к 77 242 2.14| 164 872 4,32| 1

I опыт 3 |

| <1ргпк с!рто ИР 1

I 346 754 1-, 18 1

1 188 830 3,41 |

I 125 753 5,05 |

I 99 688 5,98 1

I 13? | 902 5,58 I

I 103 821 6,97 |

опыт 4,

ёрш« с1{япо ИР |

1370 3095 1,26|

823 2962 2,60|

583 3036 4.2Ц

411 <8 со 6.60|

515 3235 5.28|

637 2937 3.611

423 3128 б,39|

N ~ воиер фракции; <1рпь - вклкыевие эН-пшидива в веоблучёв-. вые клетки; (Зрпъ - вклкневие 3И-ташдша в облучённые клети; ИР - индекс репарации; К - показатели вефракционированных клеток.

Чтобы получить дополнительную информацию о репаративном статусе клеток разных фракций лимфоцитов здоровых доноров, изучали их репаративную активность после переведения в среду с пониженной ионной силой. Результаты этих экспериментов представлены в табл. 3. Как следует из таблицы, клетки 3-й фракции отличаются наимень-' вей степенью модификации репаративной активности при понижении ионной силы среды.

Таблица 3. Изменение ДНК-репаративной активности, индуцированной У2>-облучением, во фракционированных лимфоцитах после инкубации в средах с разным значением ионной силы.

1 0,Б|хф • | 0,75ц«, Мф 1

1 N 1

1 с1ртк сЗрШо ИР М | с1ртк с1рто ИР М ¿ртк с^ргпо ИР М| 1

1 1 300 1 517 0,72 1|

1 г 346 754 1,18 1|

1 з 268 772 1,88 0,6б| 188 830 3,41 1|

1 4 214 627 1,93 0,48( 228 841 2,69 0,61 125 753 5,05 1|

1 5 223 538 1,41 0,35| 227 701 2,09 0,44 99 688 5,98 1|

16 1 229 676 1,95-0,451 137 902 5,58 1| 1

1 1 к 219 542 1,47 0,31| 230 638 1,77 0,35 103 1 821 6,97 1| 1

М - индекс репарации, нормированный на его значение при и® и отражающий степень модификации репаративних процессов при изменении ионной силы среды.'

Таким образом, фракция 3 существенно отличается от остальных по крайней мере по трём параметрам: 1) индексу репарации и степени его изменения при понижении ионной силы среды, 2) размерам лимфоцитов, 3) спонтанному включению в лимфоциты этих фракций ^-тимидина на фоне подавления репликативного синтеза ДНК. Это позволило нам предполагать повышенный уровень деградации ДНК этих клеток.

3. Изучение повреждения ДНК лимфоцитов разных фракций. Для индукции повреждений ДНК применяли дозу рентгеновского облучения 3 сГр в режиме инициации последующего адаптивного ответа' клеток. Этот раздел работы был выполнен совместно с ведущим научным сотрудником Института химической физики РАН В.А.Троновым. Облучённые и интактные .клетки фиксировали в щелочной агарозе, подвергали электрофорезу, окрашивали этидием бромида и анализировали под микроскопом. Нуклеоид лизированной клетки вытягивается и с разрушенным ядром формирурт образование, напоминающее комету с хвое-

той. Подученные нуклеоиды индивидуальных клеток характеризовали с помощью величин длины (Ю и момента хвоста (ш) ДНК-комет. Считается, что длина хвоста кометы связана с количеством индуцированных однотяжевызх разрывов ДНК. Уровни значимости попарного сходства гистограмм комет интактных и облучённых лимфоцитов, установленные на основе критерия Хг, говорят о том, что указанные клетки 3 ей фракции градиента БСА отличаются друг от друга с вероятностью р>0,99, для других фракций такие отличия отсутствуют. Анализ, проведённый с помощью метода непараметрической статистики (Колмогорова-Смирнова) также свидетельствует о достоверном отличии гистограмм облучённых и интактных клеток той же 3-ей фракции, что не наблюдается для лимфоцитов других фракций. Таким образом, можно заключить, что наиболее радиочувствительными лимфоцитами человека являются клетки третьей фракции альбумина. Этот эффект может быть связан со сниженным индексом репарации ДНК, характерным для этой фракции. Также следует заметить, что клетки данной фракции- достаточно гетерогенны. Повышенный уровень повреждения ДНК имеет место только в 11-152. клеток. Такое значение получено при использовании параметра йР, являющегося разницей двух сравниваемых частотных гистгограмм. Кроме того, возможно, что часть клеток этой фракции находится в активированном состоянии. Мы установили, что 3-я фракция обогащена лимфоцитами, содержащими 2 и более ядрышка. Число таких клеток также составляет 13Х.

Итак, мы установили, что для клеток 3 фракции характерна редуцированная способность к ответу на изменение ионной силы среды. Если этот феномен действительно однозначно определяется ДНК-репа-ративными возможностями клеток, то он в полной мере должен проявляться не только для специальных клеток, но и для всей их популя-' ции в том случае, если клетки генетически дефектны по системе репарации.

Исследование клеток больных пигментной ксеродермой. Классическим примером наследственной патологии, обусловленной генетическими дефектами в системе УФ-индуцированной репарации ДНК, является пигментная ксеродерма (ХР). Было показано, что для лимфоцитов больных ХР величина К не зависит от вариации ц. На рис. 2 представлена информация о всех исследованных случаях ХР и 15 здоровых донорах, для клеток которых проанализированы ИР при физиологической ионной силе и 0,5^. Из рисунка следует, что зависи-

б

Рнс. 2. Зависимость изменения индекса репарации при уменьшении ионной силы как функции индекса репарации при физиологической ионной силе, а) для лимфоцитов здоровых доноров (о) и Сольных ХР (другие символы), б) для лимфоцитов разных фракций (номер фракции указан цифрой) и нефрагсционированных клеток (К). По оси абсцисс - индекс репарации при ц®; по оси ординат -значение 1п (ИРц® - ИРо.бУф)2-

моста изменений ИР при двух значениях ионной силы как функции ИР при 11ф принципиально различается для ХР и нормы. Существенно, что больной ХР, который по используемым параметрам находится в зоне группы здоровых лиц, относится по проявлению клинических признаков к комплементационной группе ХР-вариант (ХР-У), характерна-"О-щейся уровнем индуцированного внепланового синтеза ДНК близким к нормальному. Для клеток одного из исследованных здоровых доноров характерны признаки нарушенной системы ДНК-репарации. Для сравнения в таких же координатах представлены данные для разных фракций лимфоцитов здоровых доноров. Мы хотели бы отметить, что сравнение этих двух рисунков позволяет выявить общие качественные закономерности в зависимостях ИР для ХР и 3-й фракции лимфоцитов здоровых доноров.

Исследование репаративной активности лимфоцитов после воздействия рентгеновского излучения в диапазоне доз, инициирующих состояние готовности к адаптивному ответу клеток. Итак, мы рассмотрели. вопрос об УФ-индуцированном внеплановом синтезе ДНК при изменениях в клетках за счёт физиологических (ионная сила среды) и генетических факторов (ХР). Представляет интерес проанализировать ИР при физиологических изменениях в клетке, представляющих собой реализацию зволюционно закреплённой программы - адаптивного ответа. Известно, что для реализации последнего необходим переход клеток в состояние готовности, который инициировался в нашей работе малыми дозами рентгеновского облучения.

На рис. • 3(а) представлена зависимость изменений ИР при воздействии доз рентгеновского облучения. Как видно из рисунка, при дозе 2-3 сГр наблюдается максимальный эффект. При этом, при дозе 10 сГр по исследованному параметру клетки близки к контрольным. Отсюда мы можем прийти к заключению, что при воздействии в дозе 10 сГр и в другом случае - 3 сГр клетки находятся в разных состояниях. Поэтому предстояло решить вопрос о УФ-индуцированном внеплановом синтезе ДНК в этих клетках. Для этой цеди пбсле воздействия каждой дозы клетки через 90 мин облучали УФ (20 Дж/м2). На рис. 3(6) представлена зависимость УФ-индуцированного синтеза ДНК после предоблучения лимфоцитов рентгеновским излучением. Как видно на этом рисунке, максимальному значению ИР после рентгеновского облучения соответствует минимум при последующем УФ-индуцированном включении ^Н-тимидина. При 10 сГр рентгеновского облучения

Рис. 3. Относительное ивыенение ИР при воздействии доз рентгеновского излучения и последующего УФ-облучения, а) кривые дозовых зависимостей для лимфоцитов разных доноров после воздействия рентгеновского излучения; б) то же для лимфоцитов доноров 1 и 2, облучённых последовательно рентгеновским и УФ-излучением (20 Дк/ы2).

По оси абсцисс - доза рентгеноского облучения, сГр; по оси ординат - индекс репарации, нормированный на его значение при дозе 10 сГр.

после которого ИР близок к контрольному значению, УФ-облучение также индуцирует внеплановый синтез ДНК, который мало отличается от такового в контрольных, т.е. необлучённых предварительно рентгеновскими лучами клеток.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Как следует из полученных результатов; индуцированный УФ-излучением внеплановый синтез ДНК является параболической функцией ионной силы среды. Вершина параболы соответствует физиологической ионной силе. Каковы же механизмы, обусловливающие эту зависимость? Некоторые исследователи полагают, что наблюдаемое при изменении ионной силы среды увеличение выхода мутаций обусловлено изменением в этих случаях осмолярнооти среды, что и приводит в конечном итоге к нарушению функционирования клеток. Однако с увеличением ионной силы от 0,5|1ф до 1,Б}1ф осмотическое давление в клетках, равно как и размер ядер, изменяются монотонно, е то время как внеплановый синтез (ВС) ДНК имеет максимальное значение при ц®. Не зависит ВС ДНК и от качества ионов в среде. Таким образом, обсуждаемый феномен не является функцией активности ион-зависимых нуклеаз. Нам известна только одна зависимость параметров субстрата ядер клеток, имеющая параболический характер. Однако для неб в противоположность зависимости ВС ДНК от ионной силы среды при имеет место минимум. Мы имеем в виду зависимость растворимости хроматина от ионной силы среды. При растворимость увеличивается эа счёт усиления заряда на ДНК благодаря уменьшению концентрации низкомолекулярных противоионов. При

растворимость увеличивается из-за диссоциации части белков хроматина, что приводит к увеличению зарядов на ДНК. Эти процессы неизбежно должны вызвать изменения степенк конденсации хроматина. В то же время, как показано в наших экспериментах, значимых различий между коэффициентами самопоглощения в УФ-облучённых клетках при равных значениях ц среды.не обнаружено. Вместе с тем, сам метод анализа самопоглощения позволяет сделать заключение об интегральной степени конденсации хроматина в его структурах по размеру не менее десятых долей микрона, т.е., по крайней мере, не менее величины супердоменов. Из сказанного следует, что изменения степени конденсации иерархических структур хроматина, т.е. его де-

конденсация при и |1>м®, могут происходить на нуклеосомном, нукдеомернсм и/иди петельном уровнях организации хроматина. Указанные динамические вариации в структурной организации хроматина должны, в свою очередь, приводить к нарушению процесса связывания ферментов репаративного комплекса с ДНК; это и вызывает изменения ВС ДНК, следствием которых является, по-видимому, повышенный уро-■вень мутагенеза. Более подробно вероятный механизм нарушения процесса связывания ферментов репарации с ДНК при изменении н рассмотрены в диссертации.

Поскольку при изменении (1 наблюдаемая наш выживаемость клеток практически не изменяется, следует полагать, что при этом происходит изменение физиологического статуса клеток. Установленные нами изменения клеточных параметров и ВС ДНК являются следствием фундаментального механизма ответа клеток на воздействия внешних факторов. Феноменологически эта реакция заключается в переходе клеток в состояние, названное нами "оперативным покоем" -т.е. состояние готовности выполнения новой конкретной функции. В случае воздействия генетически опасных агентов - это состояние быстрого включения ДНК-репаративных систем клетки в ответ на последующие потенциально неблагоприятные для клеток факторы. Таким образом, состояние "оперативного покоя" есть состояние потенциальной последующей защитной реакции клеток. В то же время, есть основания полагать, что период перехода клеток в это состояние является наиболее уязвимым с точки зрения генетической опасности.

Если при изменении конной силы среды можно только предполагать переход клеток в состояние оперативного покоя, то в настоящее время известно такое состояние и период, необходимый для пе-. рехода в него. Мы имеем в виду состояние инициации последующего адаптивного ответа. Как известно, после инициирующего события необходимо 4-6 часов для того, чтобы клетка стала способной дать адаптивный ответ, инициируемый уже ДНК-повреждающими воздействиями. В этот переходный период в клетках синтезируется ряд белков, существенно изменяется организация клеточного ядра. Именно поэтому мы полагали полезным проанализировать УФ-индуцированный ВС ДНК в период перехода югеток, т.е. до 4-х часов после инициирующего события, в состояние готовности к адаптивному ответу. В результате (рис. За) было показано,, что на кривой зависимости индекса репарации (ИР) от дозы предоблучения выделяются максимум при 2-3

сГр и минимум при 10 сГр. Как следует из полученных нами и другими исследователями данных, доза.2-3 сГр инициирует изменение размеров ядер лимфоцитов и структурные перестройки хроматина (Спит-ковский и др., 1994). Для такой временной перестройки структуры ядра, возможно, необходима эндогенная инициация дополнительного количества одиночных разрывов ДНК, индукция которых в данном случае является физиологической реакцией клеток, т.е. повышение ИР при 2-3 сГр отражает физиологические перестройки в ядре клетки. Таким образом, мы получили возможность оценки УФ-индуцированного ВС ДНК в клетках, находящихся в режиме перехода в состояние оперативного покоя. Как следует из рис. 36. максимальным значениям ИР при рентгеновском облучении соответствует минимум в случае последовательного действия рентгеновского и УФ облучений. И только в случае рентгеновского облучения в дозе 10 сГр, т.е. в доае, когда этот тип излучения минимально по сравнению с контролем изменяет ИР, совместное облучение также не приводит к изменению ИР по сравнению с контрольным УФ-облучением.

Важен вопрос о тог., все ли субпопуляции общей популяции клеток равноценны в указанном плане. На примере влияния ионной силы среды на лимфоциты выделенных нами субпопуляций дан отрицательный ответ на этот вопрос. Из проанализированных фракций лимфоцитов 3-я фракция отличается сниженным ИР при физиологической ионной силе и существенно меньшей способностью к изменению ИР при уменьшении и- Последнее обстоятельство, вероятно, указывает на меньшую способность клеток этой фракции к индуцированному изменению их физиологического состояния, т.е. к переходу в состояние "оперативного покоя". Лимфоциты этой фракции характеризуются большими размерами клеток, высоким уровнем спонтанного включения ^-тиыи-дина, отличаются от остальных фракций большим количеством ядрышек в них и повышенной степенью деградации ДНК, по крайней мере, в ■ 11-16 X клеток этой фракции. Сама 3-я фракция составляет примерно IX от общей популяции лимфоцитов. Установлено, что в 3-й фракции увеличено количество Т-клеток. (С04+) в активированной форме (С025+). Существенно также отметить, что по.характеру некоторых перечисленных параметров лимфоциты 3-й фракции сходны с клетками пациентов с генетическими дефектами по УФ-репарации (ХР). Это обстоятельство позволяет предположить, что если при ХР невозможность реализации ДНК-репарации обусловлена генетически, то в лим-

фоцитах 3-й фракции - фенотипическа. По всем описанным характеристикам клетки (или часть клеток) 3-й фракции лимфоцитов человека могут быть кандидатами на постулированные клетки "эволюционного резерва" (Спитковский, 1992).

Последнее, что ш хотели бы обсудить, это вопрос о диагностической ценности определения ИР, в частности при ХР. Из анализа •литературы о ХР следует, что система ДНК-репарации контролируется рядом генов. Дефекты в каждом из них приводят к снижению КР, однако, в разном количественном выражении. С другой сторонц, как показано в нашей работе, снижение ИР может быть обусловлено и не генетическими причинами, например, знешнесредовыми и другими факторами. Учёт этого обстоятельства позволяет (рис. 2) чётко дифференцировать различия между ИР, которые обусловлены фенотйпячески-ми и генетическими причинами. Так, из этого рисунка следует - индивидуумов с близкими ИР по модификации этого параметра при изменении ионной силы среды можно отнести к группе здоровых доноров или пациентов с генетическими дефектами в системе ДНК-репарации. Один из обследованных доноров попадает по этому параметру в группу больных или группу риска. К сожалению, дальнейшая судьба этого донора нам неизвестна. Таким образом, предлагаемый тест (рис. 2) позволяет существенно повысить диагностическую ценность определения ИР.

Итак, на основании выполненного исследования мы можем заключить, что изменения физиологического состояния клеток, вызванные как внепяесредовыми, так и физическими факторами, в ряде случаев представляют собой переход клеток в состояние оперативного покоя. 3 интервал времени, необходимый для этого, функциональные ресурсы «детки направлены на осуществление данного перехода. В этот пери-ад другие функции, в частности репарация ДНК, осуществляются не в золной мере, что приводит к существенному повышению выхода генетических нарушений.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что зависимость внепланового УФ-индуцирован-юго синтеза ДНК от ионной силы среды выражена в виде параболы : вершиной при физиологической ионной силе.

2. В градиенте БСА по плотности и рН выделены 8 фракций лимфоцитов человека. Третья фракция, обогащённая активированными Т-лимфоцитами, характеризуется повышенным спонтанным включением 3Н-тимидина, большим размером ядер клеток, пониженным УФ-индуцированным внеплановым синтезом ДНК, отличается от остальных фракций по количеству ядрышек на клетку и резко повышенной деградацией ДНК.. индуцированной рентгеновским облучением в дозе 3 сГр.

3. Выяснено, что 3-я фракция лимфоцитов характеризуется существенно меньшей по сравнению с другими фракциями и нефрак- • ционировашшми лимфоцитами зависимостью УФ-индуцированного внепланового синтеза ДНК от ионной силы среды,.которая близка к таковой для лимфоцитов больных с генетическими дефектами в системе УФ-репарации (пигментная ксеродерма).

4. Показано, что при воздействии ионизирующей радиации на лимфоциты человека зависимость включения 3Н-тнмидина от дозы имеет максимум при режимах облучения, инициирующих последующий адаптивный ответ. При дальнейшем увеличении дозы наблюдается минимум включения 3Н-тимидина в клетки.

Б. Выяснено, что зависимость УФ-индуцированного внепланового синтеза ДНК в лимфоцитах от дозы предварительного облучения ионизирующей радиацией в режиме инициации последующего адаптивного ответа характеризуется следующим: при дозах, вызывающих, максимальное включение 3Н-тимидина, наблюдается наибольшее снижение УФ-индуцированного внепланового синтеза ДНК; повышение дозы ионизирующей радиации, снижающей включение 3Н-тимидина в клетки, не приводит к изменению по сравнению с контролем УФ-индуцированного внепланового синтеза ДНК.

6. Полученные данные позволяют заключить, что в процессе перестройки режима функционирования' клеток, вызванного изменением парау->тров среды или воздействием физических факторов существенно снижаются ДНК-репаративные возможностей клеток, что, по-видимому, является основной причиной известного в этих случаях значительного повышения выхода генетических нарушений.

7. Показано, что анализ изменения индекса УФ-индуцированной ДНК-репарации как функции ионной сиш среды ыоает оказаться полезным для повызения диагностической значимости аналиаа индекса репарации при заболеваниях, предположительно связанных с нарушением ДНК-реперативных систем. -

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ Ш ТВДЕ ДИССЕРТАЦИЙ

1. Ермаков A.B., Горин А.И., Поспелова Н.й., Спитковский Д. И. Связан ли индуцируемый машин дозами иопизирушей радиации адвптиввый ответ о канекеншши параметров внутриклеточной среды? // Tea. дока. 1 Всгсшв. сиып. "Молекулярно-клеточные механизмы хронического действия ионизирующих излучений на биологические системы". - Пущино, 1990. - С. 44.

2. Spitkovsky D.M., ErmakovA.V.. Gorin A. I., Pospekhova N. I., Prokhorov A.Yu. DNA repair In normal and UVC-repair mutant cells are the functions of ionic strength // Ргос. VI Ii Internat. Cong- Human Genetics: Abstracts. - Washington. 1991. - P. 461.

3. Спитковский Д.Ы., Ермаков A.B., Горин А.И.. Поспелова H.H., Прохоров А.Ю. Зависимость репарации ДНК, индуцированной генетически опасными воздействиями, от ионной силы среды, в которой находятся клетки // Цитология. - 1092. - Т. 34, N 7. - С. 76-85.

4. Поспелова Н.И., Ермаков A.B., Горин А.И., Спитковский Д.М. Индуцированная облучением репарация ДНК в лимфоцитах периферической крови человека зависит от параметров среды обитания этих клеток // Тез. докл. Рос. науч. сиып. "Экологические факторы и кроветворение". - Москва, 1992. - С. 87-88.

5. Спитковский Д.М., Ермаков A.B., Горин А.И., Поспехова Н.И., Прохоров А.Ю. Влияние окружающей среды на репарацию повреждений ДНК лимфоцитов человека // Вестн. Рос. АМН. - 1993. - N 4. - С. 25-29.

6. Ермаков A.B., Поспехова Н.И., Сорокина Т.А.. Горин А.И., Спитковский Д.М. Индуцированный УО-облучением внеплановый синтез ДНК различных фракций лимфоцитов человека // Тез. докл. I Радио-биол. съезда. - Пущино, 1993. - С. 348-349.

7. Спитковский Д.М., Горин А.И., Ермаков A.B., Поспехова Н.И., Талызина Т.А. О связи между изменеиями параметров среды и

индукцией повреждений генетического субстрата клеток /7 Теоретические и прикладные проблемы медицинской генетики, - Москва,

1993. - вып. 1. - С, 61-71.

8. Спитковский Д.М., Ермаков А.В., Горин А.И., Поспелова Н.И., Сорокина Т.А., Талызина Т.А. Особенности внепланового синтеза ДНК и изменений, структурных параметров ядер лимфоцитов человека после действия рентгеновского излучения в малых дозах и в сочетании о УФ-облучением // Радиационная 'биология. Радиоэкология. - 1994. - Т. 34, ВЬШ. 1. - С. 23-31.

9. Spitkovsky D.M.. Gorin A.I.. Ermakov A.V., Zaitzev S.V., Pisarev V.M., Pospekhova N. I., Sorokina T.A., Talyzina T.A., Tro-nov V.A. Peculiarities of Initiation of genetic damage m human cells at low dose irradiation // 2 Intern. Conf. "Radiobiological consequences of nuclear accidents: Abstracts. Part 2. - Masсон,

1994. - P.262.

10. Спитковский Д.М.,. Горин А.И., Ермаков A.B., .Поспехова Н.И., Музаффарова Т.А., Тронов В.А. Индуцируются ли генетические повреждения программируемой реакцией клеток? // Тез. докл. 1 Рос. съезда мед. генетиков. - Москва, 1994. - С. 53.

11. Спитковский Д.М., Горин А.И., Ермаков А.В., Писарев В.М., Поспехова Н.И., Сорокина Т.А., Тронов В.А. Имеется ли субпопуляция клеток, программируемо отвечающих на малые дозы генетически опасных агентов аутоиндукцией повреждений ДНК? // Тез. докл. I съезда ВОГиС. - Генетика. - 1994. - Т. 30, прилок. - С. 150.

12. Pospekhova N. I., Gorin A.I., Ermakov A.V., Talyzina T.A., Spitkovsky D.M. Effeot of cellular memory: preirradiation by X-rays alters unscheduled DNA synthesis after UVrlnsult // Joint meeting of Europ. Soc. Radiat. Biol, and Hypertherm. Oncol.: Abstracts. - Amsterdam, 1994.- P. 310.

13. Поспехова Н.И., Ермаков А.В., Музаффарова T.A., Спитковский Д.М. О возможных причинах индивидуальной чувствительности к. действию ионизирующих излучений в диапазоне малых доз, индуцирующих адаптивный ответ // Тез. докл. 2 Междунар. симп. "Механизмы действия сверхмалых доз". - Москва, 1995. - С. 59-60.

/

_Участок множительной тохиики ОНЦ РАМН_

Подл, к печати 12..Т-.95 Заказ О?" "Тираж 100 экз.