Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ca/Mg-зависимая эндонуклеаза как компонент ферментативных систем функционирования генома. Свойства, специфичность и возможная биологическая роль

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ca/Mg-зависимая эндонуклеаза как компонент ферментативных систем функционирования генома. Свойства, специфичность и возможная биологическая роль"

АКАДЕМИЯ '¡едщкских НАУК СССР ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ

¿/ 'Л На правах рукописи

и« £ Т Г* •*}

ХОДАРЕВ Николай Николаевич

УДК 577.152:591.813.С

Ca/Mg -ЗАВИСИМАЯ ЭНДОНУКЛЕАЗА КАК КОМПОНЕНТ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ СИСТЕМ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ГЕНОМА. СВОЙСТВА, СПЕЦШЧНОСТЬ И ВОЗМОЖНАЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ.

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биолопкчаских наук

Mocicna

1989

Робота выполнена в Научно-исслэ^овательском институте медицинской энэииологии АМН СССР

Официальные оппоненты: академик АМН СССР, доктор биологических наук И.П.Ашмарин доктор медицинских наук К.А.Коровников доктор биологических наук С.С.Шишкин

Ведущая организация: Институт химической физики АН СССР

Защита состоится "_" _ 1989 г. в

_ часов на заседании специализированного совета

Д 001.02.01 при Институте питания АМН СССР по адресу: Москва, 109240, Устьинский проезд, 2/14.

С диссертацией.можно ознакомиться в библиотеке института.'

Автореферат разослан "_" _ 1989 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

И.И.Князев

¡'•-¡-■'■П ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

:ертгци.Дктуальность исследования. Эндонуклеазы, в частности ДНК-эндонуклеаэы, являются ферментами, расщепляющими фосфодиэфирные связи в молекулах ДНК. Наличие этих ферментов показано во всех таксонах эукариот, а также у прокариот ( Linn, 1981; Laskowsky, 1982). Показано также, что у эукариот значительная часть этих ферментов локализована в клеточных ядрах ( Sierakowska, Bhugar, 1977 ). Однако, функциональная роль большинства эндонуклеаз у эукариот остается неизученной. Если ранее предполагалось, что основная роль нуклеаз, в частности эндодезоксирибонуклеаз, состоит в катаболизме нуклеиновых кислот, то к настоящему времени данные, полученные в основном на прокариотах, показывают, что эндодезокси-рибонуклеазы - ферменты, участвующие в функционировании генома, в первую очередь - репарации и рекомбинации ДНК (Татарская, 1976;

Votrin е.а. , 1987).

Исследования в этом направлении приобретают особую актуальность в связи с формированием в последнее десятилетие представлений о нестабильности генома, о его динамической организации (Хе-син, 1984). Отдельные примеры, исследованные в последние годы, указывают на участие эндонуклеаз эукариот в процессах динамической организации генома, в частности - различных типах транспозиций ( Colleaux е.а., 1986; Kostriken е.а., 1983 ), интеграции ретровирусов ( Panganiban, Temin, 1984 ), реаранжировке иммуно-глобулиновых генов ( Desiderio, Baltimore, 1984; Норе е.а., 1986 ).

На участие эндонуклеаз в процессах функционирования генома и определяемых ими изменениях функционального состояния клеток в норме и патологии указывают также данные об изменениях некоторых из этих ферментов в процессах онтогенеза ( Rao, Нао, 1982 ), диф-ференцировки С McMahon е.а., 1985 ), злокачественной трансформации клеток ( Econooidou-Karaoglou е.а., 1988 ).

Вместе с тем, систематические исследования большинства известных эндонуклеаз эукариот отсутствуют, что не позволяет судить о биологической роли этих ферментов. В значительной степени это связано с отсутствием на сегодняшний день единых методических подходов к изучению свойств и функций этих ферментов у эукариот.

Одним из методологических вопросов, связанных с решенном вопроса о причастности эндонуклеаз к функционированию генома, яплл-

етея их внутриклеточная локализация. В этом отношении, в первую очередь, представляют интерес эндонуклеазы, локализованные в клеточных ядрах. Кроме того, представляется необходимым учитывать, что эндонуклеазы клеточных ядер в основной функционируют в составе хроматина, в связи с чей важным аспектом изучения этих ферментов является исследование специфики их взаимодействия с хроматином и распределения в нем.

Существенный интерес среди известных эндонуклеаз клеточных ядер представляет Са/Ы^-зависимая эндонуклеаза. Это связано с повсеместной распространенностью данного фермента ( вгегакона-ка, БЬиваг, 1977), а также с тем, что он является основной эндонукле-азой клеточных ядер, определяющей ыекнуклеосомную фрагментацию хроматина ( Вигеоипе, Не*1вЬ, 1978 ). Кроме того, в последние годы получены данные, позволяющие предполагать ключевую роль Са/

-зависимой эндонуклеазы в процессах деградации хроматина при интерфазной гибели клеток, в частности лимфоцитов, при радиационном поражении организма (Уманский, 1982).

Шесте с тем, систематические исследования свойств фермента, его соотношений с другими эндонуклеазаыи клеточных ядер, особенностей взаимодействия с хроматином и ДНК, а так&е изменений в норме и патологии отсутствуют. Это до сих пор не позволяет создать основы для оценки биологической роли Са/Ыс^-завнсимой эндонуклеазы, ее участия в функционировании генома и, тем салош, затрудняет рациональную трактовку данных по изменениям фермента и возможностей его использования как маркера функциональных изменений клеток в норца и патологии.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение участия Са/Ц^.-зависимой эндонуклеазы в специфическом эн-донуклеолизе ДНК и хроматина как основы для выявления биологической роли фермента, а также установления взаимосвязей меаду активностью и свойствами фермента и изменениями функционального состояния клеток в норма и патологии.

Исходя из изложенного, конкретные экспериментальные задачи исследования состояли в следующем:

I. Разработка и изучение качественных и количественных параметров СаУИ^-зависимого эндонуклеолиза ДНК в изолированных клеточных ядрах; разработка методических подходов к применению Са/Мс^-зависигю-го эндонуклеолиза в изолированных клеточных ядрах для выявления и

сравнительного определения Са/М^-зависимой эндонухлеазы, а также изучения специфики участков хроматина, подвергаемых преимущественному расщеплению ферментом.

2. Разработка технологии получения высокоочищенных и стабильных препаратов Са/М^-зависимой эндонуклеазы; характеристика физико-химических свойств фермента и его механизма действия.

3. Изучение специфичности действия очищенных препаратов фермента на различные субстратные ДНК и ДНП; исследование возможностей и разработка условий тестирования сайт-специфичной фрагментации ДНК Са/М^-зависимой эндонуклеазой; характеристика факторов, определяющих специфичность фрагментации ДНК.

4. Изучение представленности Са/М^-зависимой» эндонуклеазы сравнительно с другими эндонуюшазами клеточных ядер, разработка иммуно-химических подходов и применение гибридомной технологии для решения данного вопроса.

5. Изучение свойств и активности фермента при изменении функционального состояния клеток в норме и патологии, в частности лимфоцитов при иммунном ответе и Хроническом лимфолейкозе; сравнительное исследование активности фермента в различных лиыфоидных органах и определение возможностей использования фермента как маркера лим-фопролиферативных заболеваний, в частности хронического лимфолей-коза.

Научная новизна и практическая ценность работы. При анализе распада хроматина под действием эндогенной Са/Н^-зависимой эндонуклеазы выявлен этап первичного эндонуклеолиза, состоящий в расщеплении особочувствительных к действию фермента участков хроматина, содержащих 5-7/6 тотальной ДНК. Анализ продуктов, выщепляемых на этале начального эндонуклеолиза, показал, что они содержат нукле-осош с длиной повтора ДНК, большей среднего на 10-15 н.п., а также последовательности ДНК, суперметилируемые in vitro и обогащенные быстрометящейся РНК (в 5-7 раз по сравнению, с тотальным хроматином). Использование условий первичного эндонуклеолиза позволяет выделять крупноразмерные фрагменты хроматина, содержащие ЦНК размером в 20-40 т.н.п., что может соответствовать отдельным доменам хроматина.

Разработаны методы компьютерного анализа денситограмм и математического моделирования эндонуклеолиза хроматина, применение которых выявило неслучайный распад хроматина под действием Са/М^-

зависимой эндонуклеазы. Данный подход может найти применение в анализе пострадиационного распада хроматина в интерфазно гибнущих клетках, а также при анализе взаимодействия с хроматином других эндогенных и экзогенных нуклеаз.

Разработана методика получения высокоочищенных и стабильных препаратов Са/Ы^-эависимой эндонуклеазы из клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека, проведена характеристика свойств фермента. Впервые выявлено существование высокомолекулярной формы Са/М^-за-висимой эндонуклеазы (57 кД). Обнаружена зависимость механизма фрагментации ДНК от содержания дивалентных катионов, а также этапа гидролиза.

Впервые показано, что Са/Мд-зависиыая эндонуклеаза вносит первый двухцепочечный разрыв в молекулу ДНК сайт-специфически; специфичность определяется нуклеотидньш составом и последовательностью участков ДНК, а также конформацией ДНК.

Выявлено, что Са/Ы^-зависимая эндонуклеаза расщепляет J к-кластер иммуноглобулиновых генов в участках инициации V -з -рекомбинации, что указывает на участие данного фермента в рекомбинации ДНК у эукариот.

лредложен методический подход, основанный на технологии гибрид им и направленный на выяснение вопроса о гетерогенности ондо-нуклеаз клеточных ядер и представленности отдельных ферментов. С помочью специально разработанного высокочувствительного метода детекции антител, продуцируемых независимо полученными гибридомами к эндоДНКазаы клеточных ядер, показано, что высокомолекулярная (57 кД) форма Са/М^-зависиыой эндонуклеазы является наиболее представленной эндонуклеазой клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека.

Показаны существенные различия активности Са/Ы^-эависимой эндонуклеазы, чувствительности к ионам Са^+ и интенсивности фрагментации хроматина в различных лимфоидных органах и популяциях лимфоцитов. Показано, что В-лимфоциты характеризуются большей активностью фермента, чем Т-лимфоциты, в особенности это различие выражено в периферической крови.

Показано, что активность Са/М^-зависимой эндонуклеазы клеточных ядер лимфоцитов тимуса и селезенки мыаей резко изменяется в процессе первичного иммунного ответа; изменения носят фазный, периодический характер, являются органоспецифическиыи и хорошо кор-

релируют с фазным характером пролиферативной и антителопродуциру-ющей активности лимфоцитов в ходе иммунного ответа. Результаты указывают на возможность рассмотрения активности Са/М^-зависииой эндонуклеазы как одного из ферментативных маркеров иммунных процессов, а также на ее участие в изменениях функционирования генома лимфоцитов при иммунизации.

Проведены исследования фермента лимфоцитов периферической крови при хроническом лиыфолейкозе у человека и крупного рогатого скота. Установлено, что активность Са/Мо-зависимой эндонуклеазы снижается при хроническом лиыфолейкозе (ХЛЛ) в 8-10 раз по сравнению с нормой как у человека, так и у крупного рогатого скота (КРС), причем в эксперименте на КРС показано, что изменения активности фермента предваряют формирование гематологических и клинических признаков заболевания.

Результаты показывают, что активность Са/М^-зависимой эндонуклеазы клеточных ядер лимфоцитов может быть чувствительным маркером развития лиыфопролиферативных заболеваний. Кроме того, исследование здоровых животных, контактирующих с больными, выявляет идентичные изменения активности и указывает на' практическую значимость горизонтального (контактного) пути передачи ХЛЛ у КРС (Нах-мансон, 1987).

Показано, что при изменениях функционального состояния лимфоцитов изменения активности Са/М^-зависимой эндонуклеазы сопряжены с изменением степени компактизации хроматина. Сравнение различных нуклеаз показало, что очищенные препараты Са/М^-зависимой эндонуклеазы являются более чувствительным ферментативным зондом на изменение структуры хроматина при ХЛЛ, чем обычно применяемые микрококковая нуклеаза и ДНКаза I.

При исследовании механизмов снижения активности фермента обнаружены белковые факторы, ингибируицие Са/Ц^зависимую эндонукле-азу и появляющиеся в клеточных ядрах при ХЛЛ; факторы являются специфичными к данной нуклеазе, а также проявляют видо- и ткане-специфичность. Результаты выявляют существенность функций Са/М^-эависимой эндонуклеазы в нарушениях дифференцировки лимфоцитов при развитии ХЛЛ.

Разработана гипотеза полифункциональной роли Са/М^-зависимой эндонуклеазы, определяемой ее фиксацией в хроматине, факторами микроокружения, спецификой участков хроматина, с которыми взаи-

подействует фермент, а также различной ролью одноцепочечных и сайт-специфических двухцепочечных надрезов, производимых ферментом. Гипотеза позволяет объяснить механизмы активации фермента при интерфазной гибели лимфоцитов, его ингибирование при хроническом лиыфолейкозе и определяет ряд экспериментальных подходов к дальнейшему исследованию свойств и функций Са/М^-зависимой эндо-нуклеазы, а.также других эндонуклеаз, связанных с хроматином.

По результатам работы получены три положительных решения на авторские заявки; разработаны 3 методических рекомендации, утвержденные к публикации Ученым советом ВАСХНИЛ; ыоноклональные антитела к Са/М^-зависимой эндонуклеазе включены в каталоги внешнеторговой фирмы "Биокард".

Апробация работы. Материалы диссертации апробированы на двух научных конференциях НШМЭ АМН СССР (1986, 1987), научной конференции ИМР АМН СССР (1987), научной конференции ИМГ АМН СССР (1981 заседании Московской секции Всесоюзного биохимического общества (1987).

Материалы работы докладывались на 1У и У Всесоюзных биохимических съездах (Ленинград, 1979; Киев, 1986), 1У Всесоюзной конференции по программе "Ген" (Москва, 1981), УП и IX Всесоюзных симпозиумах "Структура и функции клеточного ядра" (Харьков, 1980; Черноголовка, 1987), У Всесоюзном симпозиуме по медицинской эн-зимологии (Махачкала, 1986), Всесоюзной конференции по применению ферментов в биохимических анализах (Паланга, 1984), Всесоюзной конференции по биохимии сельскохозяйственных животных (Ташкент, 1986), Московской конференции молодых ученых "Современные проблемы биохимии и физико-химической биологии" (Москва, 1983), Всесоюзной конференции "Культивирование клеток человека и животных" (Лущино, 1985), Всесоюзной конференции "Биофизика рака" (Черноголовка, 1987), Всесоюзной конференции по математическому моделированию и применению ЭВМ в медицине (Москва, 1984), Всесоюзной конференции по современным методам профилактики и оздоровительным мероприятиям по лейкозу крупного рогатого скота (Тарту, 1987), 14 съезде 1ЕБ0 (Москва, 1984), 14 Международном биохимическом кон грессе (Прага, 1988).

Апробация диссертационной работы проведена на научной конференции Института питания АМН СССР 6 июня 1988 г.

.¡у&ликании. По материалам диссертации опубликовано 27 рабо"-

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, бзора литературы (главы I и П), описания методов исследования глава Ш), результатов (главы 1У-У1), обсуждения (глава УП), об-[его заключения, выводов, списка литературы и одного приложения. >бъем диссертации стр., включая 64 рисунка и II таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Са/М^-зависимый эндонуклеолиз ДНК в изолированных клеточных ядрах как методический подход к определению Са/М^-зависимой эндонуклеазы и изучению некоторых особенностей ее взаимодействия с хроматином.

1.1. Условия и параметры эндонуклеолиза ДНК в изолированных клеточных ядрах.

Инкубация изолированных клеточных ядер в средах с дивалент-мми катионами при нейтральных или слабощелочных рН приводит к южнуклеосомной фрагментации хроматина (Не*1эЬ, Вигбоупе, 1973 )« 'лубина которой возрастает со временем инкубации. Одновременно [арастает количество кислоторастворимых продуктов распада ДИК в шкубационных пробах.

Таким образом, в изолированных клеточных ядрах проявляется (ндонуклеазная активность, расщепляющая ДЦК хроматина. Уровень »той активности определяется дивалентными катионами, присутству-)щими в инкубационных средах (таблица I). Макс (шальное активиру-ицее влияние оказывает совместное присутствие Са^+ и Оно

фоявляется как в приросте кислоторастворимой ДНК (см.таблицу I), :ак и в углублении межнуклеосомной фрагментации хроматина. Качест-¡енно сходные результаты получены наыи на всех исследованных объ-жтах - печени и мозге крыс и лимфоцитах различных органсв и тка-гей - селезенке мышей, человека и крупного рогатого скота, тимусе 1ышей, миндалинах человека, а также лимфоцитах периферической кро-ж человека и крупного рогатого скота. Следовательно, во' всех ис-¡ледованных объектах эндонуклеолиз ДНК в изолированных клеточных щрах является Са/М^-зависимым. Это указывает на то, что основным ферментом, осуществляющим межнуклеосомную фрагментацию ДНК в изо-шрованных клеточных ядрах, является Са/М^-зависимая эндонуклоазз.

Может ли синергический эффект Са + и отражать сугшация

Таблица I. Зависимость активности эндонуклеолиза ДНК в изолированных клеточных ядрах печени крыс от ионного состава сред.

Ионный состав сред Кислоторастворимая ДНК (AggQ на пробу - контроль)

CaCf2 I мМ 0.530 + 0.01

3 мМ 0.070 ± 0.083

4 мЫ 0.375 ± 0.05

«9С12 6 мМ 0.685 + 0.025

14 мМ 0.610 ± 0.020

ю мм uftz + i мм сасг2 1>070 0>030

О о

активности нескольких различных нуклеаз.- Са +-зависимой и

зависимой? На рис.1-А представлены результаты ингибирования интенсивности Са/М^-зависимого эндонуклеолиза в изолированных ядрах лимфоцитов селезенки и тимуса, инкубируемых в средах с ЭГТА,

селективно связывающей кальций; результаты сравнены с действием ЭГТА на очищенный препарат Са/М^-зависимой эндонуклеазы клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека.

Как видно, в тимусе с помощью ЭГТА можно получить 100$ инги-бирование эндонуклеолиза; только недостаточно для активации эндонуклеазы. В селезенке кривая выходит на плато при ЗС$ от исходной активности, однако чистый фермент из селезенки так же сохраняет 3056 активности при тех же концентрациях ЭГТА. Это показывает, что Са + и оказывают истинный синергический эффект на эндонуклеолиз, не связанный с суммацией нескольких нуклеаз^ьсх активностей, а интенсивность эндонуклеолиза в присутствии Са и Mj + определяется активацией Са/Ы^-зависимой эндонуклеазы.

<>го не исключает возможности фрагментации ДНК хроматина другими нуклеазами клеточных ядер, активируемых только ионами Mj * ( Machrey, Вопяег, 1981 ), но вклад этих ферментов в наблюдаемый в изолированных ядрах эндонуклеолиз в используемых условиях, по-видкмому, незначителен. На это же указывают иммунохимические

Активность, % к исходному уровню

Концентрация ЭГТА (мМ)

Рис Л Ннгибировчние ЭГТА активности очищенных препаратов Са/М^-зявисимсй эндонуклеазы селезенки человека (А) и Са/Мд-завискмого эндонуклеолиза ДНК (Б) в изолированных ядрах селезенки (I) и тимуса мылей (2).

доказательства максимальной представленности Са/Мч-зависимой эндонуклеазы по сравнен.® с другими эндонуклеазами клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека (см. ниже).

Поскольку Са/М^-зависимая эндонуклеаза является основной эн-донуклеазой, определяющей фрагментацию ДНК в клеточных ядрах в присутствии Са + и М^ интенсивность Са/М^-зависимого эндонуклеоли-за может быть мерой активности данного фермента. Основное ограничение состоит в том, что интенсивность данного процесса может зависеть не только от активности фермента, но и от состояния (степени компактизации) хроматина.

При различных способах определения -активности фермента в лимфоцитах тимуса и селезенки мыши наши результаты показали, что корреляция между количеством кислоторастворимой ДНК, образуемой при действии эндогенной Са/М^-зависимой эндонуклеазы и экзогенной ДНК-азой I, выражена слабее, чем между расщеплением эндогенной ДНК ферментом инкубируемых ядер и экзогенной Х-ДНК экстрагированным ферментом (коэффициент корреляции составил - 0.3009 и 0.5200 соответственно). Это подтверждает, что интенсивность Са/М^-зави-симого эндонуклеолиза пропорциональна активности Са/Мо-зависимой эндонуклеазы. Сходные данные приводятся в литературе ( Татешс^о, 1984; МсИаЬоп, 198Д, 1985 ).

Использование Са/Мд-зависимого эндонуклеолиза как показателя активности Са/М^-зависимой эндонуклеазы при электрофоретическом исследовании продуктов распада ДНК и количественной обработке данных фореза является высокочувствительным методом определения активности этого фермента, применимым к образцам, содержащим 5-10 мкг ядерной ДНК и малоактивный фермент. Применение этого подхода позволило нам выявить Са/Мс^-зависимую эндонуклеазу в лимфоцитах периферической крови человека и крупного рогатого скота и исследовать изменения активности этого фермента при хроническом лимфолейкозе (см.ниже).

1.2. Характеристика начального эндонуклеолиза хроматина.

Дальнейшее исследование Са/М^-зависимого эндонуклеолиза хроматина в изолированных клеточных ядрах выявило, что скорость этого процесса может изменяться со временем инкубации ядер. На рис.2-А представлена кинетика распада ДНК инкубируемых клеточных ядер печени крыс под действием эндогенной Са/М^-зависимой эндонуклеазы.

Представленные графики показывают динамику кислоторастворимой ДНК (к/р ДНК) и фрагментов хроматина, солюбилизируемцх в 0.5 мМ Ыа2ЭДТА ( 2-ДНК). Графики носят отчетливо выраженный двухфазный характер. Перелом соответствует времени инкубации от 5 до 10 мин, причем это справедливо, как в отношении общей солюбилизи-ровалной, так и кислоторастворимой ДНК. Экстраполируя зависимость "медленной" фазы гидролиза к нулевому уровню, можно определить исходную долю хроматина, с наибольшей скоростью подвергаемого со-любилизации или превращению в к/р ДНК. Для солюбилизируемого хроматина эта доля составляет 6.8%, для кислоторастворимой ДНК -4.3$.

Для оценки количества полимерной ДНК в солюбилизированном хроматине из общего количества ДНК в этой фракции вычитали количество к/р ДНК. Для оценки способности нуклеазы к вьпцеплению высокополимерных фрагментов ДНК при образовании одного и того же количества кислоторастворимых продуктов мы относили эти количества к кислоторастворимой ДНК. Соответствующие графики приведены на рис.2-Б для Са/Мд-зависимой эндонуклеазы (СМЭ) и микрококковой нуклеазы (м.н.). Как видно из рисунка, доля полимерной ДНК для СЮ проходит точку максимума при количестве к/р ДНК, равном 3-4$ от тотальной. Электрофоретическое исследование показало, что она содержит в основном крупноразмерные фрагменты ДНК от 20 до 40 т.н.п., а также моносомы и их олигомеры. Снижение доли полимерной ДНК при глубине гидролиза более 4% от тотальной сопровождается понижением относительного содержания крупноразмерных фрагментов и накоплением мононуклеосом, что свидетельствует о деградации фрагментов, выщепленных из хроматина на начальных стадиях гидролиза.

Из изложенного видно, что существуют определенные параметры, позволяющие выделить этап начального эндонуклеолиза хроматина Са/ ¡^-зависимой эндонуклеазой.

Начальный эндонуклеолиз - это первый этап фрагментации хроматина Са/М^-зависимой эндонуклеазой, состоящий в расщеплении особо-чувствительных к этому ферменту участков и характеризующийся максимальной скоростью накопления"солюбилизированной полимерной и кислоторастворимой ДНК; начальный эндонуклеолиз длится 5-10 минут и заканчивается, когда содержание кислоторастворимой ДНК составляет А-&% от тотальной.

Время инкубации (мин)

Рис.2 Распад ДНК хроматина (А) и накопление солюби лизируемой ДНК (Б) в ходе Са/М^-зависимого эндснукле-олиза хроматина в изолированных клеточных ядрах печени крыс (Объяснения см. в тексте).

Доля полимерной ДНК в солюбилизированной фракции

16 -

5 10 15

к/р-ДНК ( % )

Скорее всего, существование объективно выделяемого этапа начального эндонуклеолиза хроматина связано с существованием в хроматине определенных участков, обладающих повышенной чувствительностью к действию Са/М^-зависимой эндонуклеазы и, возможно, на которых происходит преимущественная фиксация фермента в интактном хроматине. Это объясняет повышенную скорость их выщепления из хроматина и распада до к/р ДНК в начале гидролиза. Доля этих участков, как следует из изложенного, составляет 4-7% от тотальной ДНК хроматина. Когда вся или большая часть соответствующих участков выщеллена из хроматина, скорость распада остального хроматина замедлена.

Анализ продуктов, выщепляемых из хроматина печени крыс на этапе начального эндонуклеолиза, показал, что они содержат моно-нуклеосомы на 10-15 н.п. крупнее среднего размера нуклеосом в исследуемых образцах хроматина. Аналогичные результаты получены на лимфоцитах периферической крови человека. На рис.3 показано распределение размеров моносом и дисом в образцах фрагментированного эндогенной Са/М^-зависимой эндонуклеазой хроматина лимфоцитов периферической крови 31 здоровых доноров. Как видно, распределение размеров "чистых" моносом в исследованной выборке отлично от такового для "моносом в дисомах". В "чистых" моносомах больше доля крупноразмерных моносом ( > 200 н.п. - они составляют 22.6% против Q.7% для дисом). С наибольшей частотой встречаются моносомы размером от 188 до 204 н.п., в то время как в дисомах наибольшая частота встречаемости соответствует моносомам размером от 186 до 188 н.п. Таким образом, мы с большой достоверностью можем сделать вывод, что при действии Са/М^-зависимой эндонуклеазы на хроматин вылепляются моносомы, содержащие ДНК большего размера, чем моно-нуклеосомы, входящие в состав динуклеосом. Этот вывод показывает, что эти фрагменты могут не быть связанными отношениями типа лред-шественник-продукт и происходить из различных участков хроматина, подвергающихся альтернативным путям распада.

К таким же выводам приводит исследование распада метилируемых in vitro участков хроматина под действием Са/Мд-зависимой эндонуклеазы. Нами была исследована динамика уровней метилирования мони-сом н динуклеосом в процессе расщепления хроматина печени крыс Са/'М^-зависимой эндинуклеазой. Ферментативное метилирование in vitro осуществляли, инкубируя ядра с ДНК, меченой in vitro *

Число случаев

5 4 3 2

4 3

2

I

148 164 180 196 212 228 Размер (н.п.)

148 164 180 196 212 228 Размер (н.п.)

Рис.3 Распределение размеров моносом (А) и "моносом в ди-сомах" (Б) в гидролизатах хроматина лимфоцитов периферической крови 31 здорового донора эндогенной Са/М^-зависимой эндонухлеазой. Абсцисса - размер мономера (нуклеотидные пары); ордината - число наблюдений.

тимидином, и с [^-CHg] -S -аденозилмэтионином. Реакцию блокировали введением избытка ¿-аденозилгомоцистеина.

Било показано, что к моменту введения ингибитора уровень метилирования дисом превышает уровень метилирования моносом. При дальнейшей инкубации избыточно метилированные дисомы исчезают, но возрастает уровень метилирования мононуклеосом. К 60-й минуте инкубации уровни метилирования мононуклеосом также снижаются. Отмеченные данные позволяли предположить, что внутри классов дисом и моносом существует гетерогенность по таким признакам, как степень метилирования in vitro и чувствительность к эндогенной нуклеазе. Геторогенность популяций моно- и динуклеосом по уровням метилирования подтверждается также работами Caiafa е.а.,1986. При этом, уровень метилирования in vitro ДНК фракций, выщеп-ляемых из хроматина Са/М^-зависимой эндонуклеазой на этапе начального эндонуклеолиза, превышал средний уровень в 4.6 раза; они были также обогащены быстрометящейся FHK (в 5-7 раз) и внерепли-кативно синтезируемой ДНК.

В целом, результаты свидетельствовали о специфике участков первичного эндонуклеолиза хроматина Са/М^-зависимой эндонуклеазой, они также согласовались с данными о повышенной чувствительности к этому ферменту функционально активных участков хроматина ( Vanderbilt е.а., 1982; Чихиржина и соавт., 1987; Stewart е.а., 1986 ).

1.3. Математическое моделирование Са/М^-зависимого эндонуклеолиза хроматина.

Данные факты ставят вопрос о распределении участков хроматина, преимущественно расщепляемых Са/М^г-зависимой эндонуклеазой. Для его решения мы разработали математическую модель распада хроматина, основанную на предположении о равновероятном характере расщепления каждой межнуклеосомной связи. Модель позволяла рассчитывать выход мононуклеосом и их олигомеров при распаде протяженных равномерно упакованных фрагментов хроматина. Для ее сравнения с экспериментальными данными была разработана программа, проводящая разложение денситограмм на гауссоиды с целью достоверного определения мононуклеосом и их- олигомеров в гидролизатах хроматина.

На рис.4 представлено сравнение экспериментальных данных, полученных при фрагментации ДНК в изолированных клеточных ядрах пе-

Доля ди- и тринуклеосом

0.3 -

0.2

3

0.1

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Доля моносом

Рис.4 Содержание moho-, ди- и тринуклеосом в гидролизатах хроматина. Сплошная линия - модель; пунктир - Са/М^-зависимый эндонуклеолиз ядер печени крыс. 2, 3 -ди- и тринуклеосомы соответственно.

чени крыс, с данными модели. Выход ди-и тринуклеосом представлен как функция выхода мононуклеосом. Как видно, экспериментальные данные существенно отличаются от модели и показывают, что удельное отношение низкомолекулярных фрагментов (в данном случае, моносом) к высокомолекулярным (например, ди- и тринуклеосомам) при распаде "реального" хроматина больше, чем предсказывается моделью. Такие же Данные получены для клеточных ядер лимфоцитов периферической крови крупного рогатого скота. Следует отметить, что данные для экзогенной микрококковой нуклеазы были неидентичны, но близки к результатам, предсказываемым стохастической моделью. Таким образом, эти результаты показывают, что распределение участков хроматина, расщепляемых Са/Ы^-зависимой эндонуклеазой, отличается от случайного: присутствуют участки, содержащие больше "нук-':еаз0ч>'вст1,ительных" сайтов, чем в хроматине в среднем. Следует отметить, что это хорошо согласуется с вьиеотмечсннцми ре-

зультатами и данными литературы. С применением аналогичных подходов недавно показано, что такими же закономерностями характеризуется пострадиационный распад хроматина в тимоцитах крыс (Рябчен-ко и соавт., 1988; Солдатенков и соавт., 1988). Мы предполагаем, что данная специфика связана не только со структурной организацией хроматина, но и определенным распределением фермента в хроматине, сохраняемом некоторое время при инкубации клеточных ядер (на этапе начального эндонуклеолиза). Проводимые нами в настоящее время совместно с лабораторией молекулярной и клеточной радиобиологии ИМР АМН СССР работы по иммунохимическому исследованию локализации фермента в хроматине выявляют его неравномерную локализацию в ядре, что подтверждает данную точку зрения.

Таким образом, Са/Мд-зависимый эндонуклеолиз в изолированных клеточных ядрах является удобным методическим подходом, как для выявления и определения Са/М^-зависимой эндонуклеазы, так и для изучения особенностей ее взаимодействия с хроматином. По некоторым параметрам этот процесс может быть также адекватной моделью пострадиационного распада хроматина в интерфазно гибнущих лимфоцитах, что представляет существенный практический интерес.

П. Получение очищенных препаратов Са/Мд-зависимой эндонуклеазы клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека. Свойства, специфичность и соотношение с другими эндонуклеазами клеточных ядер.

ПЛ. Получение и характеристика свойств препаратов высокоочищенной Са/М^зависимой эндонуклеазы.

Для исследования энзимологических свойств Са/М^-зависимой эндонуклеазы и особенностей ее взаимодействия с ДНК и хроматином в модельных системах in vitro нами была разработана методика получения высокоочищенных и стабильных препаратов фермента клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека. Использован операционный материал, полученный при операциях по поводу цирроза печени.

Фермент из клеточных ядер экстрагировали 0.3 Н КС£-0.075% тритон Х-100; в этих условиях экстрагируется более 80% общей эндонук-леазной активности ядер без снижения удельной активности экстрактов. Повышение концентрации КС2 вело к снижению удельной активности без существенного увеличения выхода (Соколова, 1988).

Экстракт фракционировали н-изопропанолоы (0.5-0.6 объемами) и подвергали хроматографии на КМ-сефадексе (С-25), ДЕАЕ-целлюлозе (ДЕ-52), голубой сефарозе и денатурированной ДНК-целлюлозе*.

Степень очистки фермента достигала 1860 раз, что превышает значения, описанные в литературе ( 1аЬ1<1в е.а., 1974-. Иасалига е.а., 1981; в^ЗДИпв е.а., 1984 ). Препарат был стабилен при хранении (50% глицерин, -20°С).

Электрофорез в гелях ПААГ-ДСН выявлял два полипептида - 54 и 57 кД; нуклеазная активность во фракциях геля была представлена одним пиком, совпадающим с полипептидом 57 нД. Следует отметить, что размер полученного фермента превышает значения, приводимые в литературе и позволяет говорить об обнаружении высокомолекулярной формы Са/Ы^-зависимой эндонуклеазы. Обращал внимание широкий спект катионозависимости фермента, в частности активность в присутствии только Са^+, или Мп2+ была выражена в значительной степени,

хотя более низкая, чем при совместном присутствии Са2+ и Следует также отметить ингибирующее влияние п-ХМБ, указывающее на существенность Б Н-групп для активности фермента; отмечено .также некоторое ингибирующее влияние АТФ, сходные данные приведены в литературе ( Яасатига е.а., 1981; ЕовепЪе^ е.а., 1987 ).

Для определения одно- или двухударного характера расщепления ДНК препараты субстратной А.-ДНК на разных этапах расщепления Са/Мс^-зависимой эндонуклеазой разделяли в гелях нативной и щелочной агарозы в присутствии молекулярно-весовых маркеров. Определение среднечисленных размеров полученных распределений позволяло рассчитать количество одно- и двухцепочечных разрезов в молекулах ДНК. Установлено, что на начальных этапах расщепления скорость нанесения одкоцепочечных разрезов превышает скорость нанесения двухцепочечных; затем скорость нанесения двухцепочечных разрезов возрастает и превышает таковую для одноцепочечных. Это происходит при количестве одноцепочечных разрезов I на 4-6 т.н.п., то есть при такой низкой плотности разрезов, когда образование двухцепо-чечного разреза не может быть следствием случайного совпадения двух одноцепочечных разрезов. Следовательно, образование одно- и двухцепочечных разрезов являются независимыми событиями, и фермент обладает смешанным - одно- и двухударным механизмом действия на ДНК. Наши эксперименты показали, что количестго одно- :: двухцепс-чеч::'о: надрезов зависит также от концентрации и соотношения дива-лентных катионов: максимальное количество двухцепочечных надрезов регистрируется при оптимальных концентрациях и Са^+ (10 ыМ и I ыМ соответственно); изменение концентраций в большую или мень-сую сторону от оптимума приводит к возрастанию количества одноце-

Есо

рВН 322

Рис.5 Карта участков расщепления ДНК рВИ 322 Са/М<7-зависимой эндонуклеазой клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека.

т- позиции участков рас щепления Са/М^-зависимой эндонуклеазы.

почечных надрезов.

При исследовании специфичности фермента были выявлены предпочтительные позиции внесения первого двухцепочечного разреза в молекулу ДНК; соответствующие позиции на ДНК рВВ 322 представлены на рис.5. Отмеченные участки были обогащены по вС-парам; 8 из II картированных участков содержали последовательности типа ОвИвй. Наличие соответствующих участков отмечалось на суперспиральных и линейных молекулах плазмидной ДНК; при релаксации суперспиральных ДНК ДНК-топоизомеразой I печени крыс или печени теленка специфичность исчезала. Это говорит о значении топологического состояния ДНК для специфичности взаимодействия с ней Са/М^-зависимой эндонуклеазы. Анализ литературы показал, что последовательности типа ССЫОС присутствуют в участках предполагаемого внесения двух-цепочечнцх разрезов в 5'-районах «I-сегментов иммуноглобулиновых генов при инициации V - .1-рекомбинации ( Бакапо е.а., 19В1 ). В этой связи представлял интерес анализ специфичности раслеплеиил Д к~кластера иммуноглобулиновых генов мыши Са/М^-зависимой эндонуклеазой. Результаты приведены на рис.5 и сопоставлены с данными литературы по выявлению в экстрактах лимфоидных тканей нутсле-аэных активностей, специфически расцепляющих иммуноглобулином« гены в участках иннциаши рекомбинации.

j { I I I Hope e.a., 1986

|| | | DMgoetaro.e.a., 1985

||| | | Kataoka e.e., 1984

I

u I. ULI

Doaiderio, Baitisora,1984

Са/Мо-зависимая ^ ♦ Ц»__'И Ми >_ эндонуклеаза

^ ^ «V

Рис.6 Схеыа расщепления -кластера иммуноглобулиновых генов мши нуклеазами, специфичными к 1^-генам и Са/М^,-зависиыой эндонуклеазой. Заштрихованные ^ сегменты - ¿-гены; стрелки - участки гидролиза.

Результаты показывают, что Са/М^-зависимая эндонуклеаза расщепляет J к-кластер иммуноглобулиновых генов в 5*-районах J -сегментов, вблизи от консервативных нано- и гептамера; так же, как в РВЕ 322 4 из 7 картированных сайтов содержат последовательность GGNGG. Сайты для Са/М^-зависимой эндонуклеазы аналогичны сайтам для нуклеазных активностей, относительно которых считается, что они принимают участие в инициации рекомбинации иммуноглобулиновых генов (Sakaao е.а., 1901$ Deeiderio, Baltimore, 1984 ).

Таким образом, из данных результатов и их сопоставления с литературой можно сделать два вывода: на основе существующих моделей рекомбинации и инициирующей роли двухцепочечных разрывов ( Shoetak, 1983; Hartl, Lipp, 1987 ), а также специфичности Са/Ы^-зависиыой эндонуклеазы, этот фермент может принимать участие в инициации рекомбинации, кроме того, описанные в литературе нук-леазные активности лимфоцитов, специфически расщепляющие имыуно-глобулиновые гены в участках инициации V -J -рекомбинации, обусловлены именно Са/М^-зависиыой эндонуклеазой.

П.2. Са/М^.-зависимая эндонуклеаза - основная эндонуклеаза клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека.

Представлял интерес вопрос о соотношении Са/М^-зависимой эндонуклеазы с другими эндонуклеазами клеточных ядер, связанный с проблемой гетерогенности ДНКаз клеточных ядер ( Laabert е.а., 1981, 1983 )• Для его решения нами была использована технология гибридом.

При иммунизации мышей нефракционированным экстрактом клеточных ядер, содержащим различные эндонуклеазы, возможно получение гибридом, продуцирующих антитела к различным ферментам. Количество независимо полученных гибридом, продуцирующих антитела, не дающие перекрестных реакций, будет отражать количество отдельных эндонуклеаз. Большинство известных препаратов эндонуклеаэ клеточных ядер получены с помощью экстракции солями NaC£ или КС? в концентрации 0.3-0.6 М ( Huis-Garrillo е.а., 1987 ; Винтер и со-авт., 1987). Нами также получены данные, что 80-90% общей эндо-нуклеазной активности клеточных ядер элюируется 0.3 М КС?-0.075% тритон Х-100 (см.выше). Эти экстракты были использованы для иммунизации животных. Для детекции, скриннинга и выявления гибридом, продуцирующих антитела к любой нейтральной эндонуклеазе, был необходим чувствительный и эффективный метод детекции соответствующих антител. Такой метод был нами разработан как вариант твердофазного ИФА. Продуцируемые гибридомами антитела связывались на протеине А, сорбированном на пластике, после чего в лунки добавляли ферменты или нефракционированные экстракты. После сорбции антигенов на антителах лунки промывали, и в пробы в качестве субстрата добавляли суперспиральную ДНК pBR 322 в соответствующих инкубационных буферах. После проведения реакции ДНК разделяли в горизонтальных гелях 1.2$ агарозы для отделения суперспиральной, линейной и открытой кольцевой форм плазмиды. В каждом геле формировали 2-3 ряда колодцев, что позволяло одновременно анализировать 40-50 проб.

В пробах, содержащих ферментативную активность, снижалось количество суперспиральной ДНК и возрастало количество открытой кольцевой и линейной ДНК. Количественный рассчет активности проводили по приросту линейной ДНК (продукту внесения первого двух-цепочечного разрыва в молекулу суперспиральной ДНК).

Всего в опытах было использовано 15 клеточных линий гибридом,

Число наблюдений

5 I- -

4 .

3 -2 .

I -

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 Са2+

Рис.7 Распределение отношений активности в присутствии к активности в присутствии Са2+ эндонуклеаз, связываемых антителами исследуемых гибридом. Абсцисса - отношение активности в присутствии к активности в присутствии Са2+.

из них 8 независимо полученных первичных культур и 7 - их дериваты и моноклоны. Как оказалось, все полученные линии гибридом и их дериваты продуцируют антитела, связывающие в экстрактах клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека эндоДНКазы, проявляющие максимальную активность при рН 8.0-8.5 и совместном присутствии 10 мМ I мМ Са2+. Активность в присутствии только Мо2+ для разных линий варьировала от 17 до 40% от максимума, активность в присутствии Са2+ от 4 до 80%, Следовательно, все эндоДНКазы, фиксируемые полученными антителами, являются Са/М^-зависимыми. На рис.7 представлено распределение отношений активности в 10 мМ Мд + к активности в I Са2+ для ферментов, связываемых исследованными антитолами. Как видно, полученная гистограмма является унимодальной, чго м?кет указывать на единство белковой молекулы, к которой выра-с-зп таятся антитела разными культурами. Следует, правда, ответить,

что 20% культур вырабатывали антитела, при фиксации на которых активность фермента в присутствии больше, чем в присутствии Са^+, что отличается от свойств биохимически очищенного препарата. Возможно, эти культуры соответствуют определенной изоформе фермента, которая представлена в лимфоцитах селезенки в меньшей степени, чем основная форма.

При изучении связывания очищенной Са/М^-зависимой эндонукле-азы с антителами, продуцируемыми полученными линиями, оказалось, что связывание происходит практически во всех случаях (исключение составляет один из дериватов линии Т^). Следовательно, действительно, антитела полученных гибридом направлены к антигенным детерминантам одной и той же эндоДНКазы, а именно - Са/М^-зависимой эндонуклеазы клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека.

Учитывая сформулированные в начале настоящего раздела предпосылки, эти результаты показывают, что в экстрактах клеточных ядер лимфоцитов человека основной (наиболее представленной) эндо-нуклеазой является Са/М^-зависимая эндонуклеаза. Возможно, что этот фермент представлен двумя белковыми формами, одна из которых образуется при процессинге исходной высокомолекулярной формы. Биохимически эта возможность показана для печени крыс (Бубнов,1988). Происхождение высокомолекулярных форм показано также для К.сгаааа ( Ргавег е.а., 1986 ).

Ш. Изменения Са/М^-зав1?симо'й эндонуклеазы клеточных ядер лимфоцитов при иммунном ответе и лимфопроли-феративных заболеваниях.

Одной из задач настоящей работы являлось изучение взаимосвязи активности Са/М^-зависимой эндонуклеазы с изменениями функционального статуса клеток в норме и патологии. Выявление подобных взаимосвязей и установление закономерностей позволяет представить возможную роль фермента в клетке, разработать адекватные модели для исследования его функций, а также выявить новые аспекты патогенеза. Кроме того, этот подход позволяет создать основы для разработки новых энзимологических тестов. Исходя из этого, в исследованиях Са/М^.-эависимой эндонуклеазы клеточных ядер лимфоцитов мы в качестве одной из задач ставили изучение активности этого фермента в ходе иммунного ответа, а также при лимфопролифератив-ных заболеваниях, в первую очередь - при хроническом лимфолейкозо.

Ш.1. Динамика активности Са/М^-зависимой эндонуклеазы в процессе первичного иммунного ответа.

Используя Са/М^-зависимый эндонуклеолиз в изолированных клеточных ядрах (см.раздел I), мы сравнивали активность Са/М^-зави-симой эндонуклеазы в лимфоцитах различных органов и тканей, а также в популяциях В- и Т-лимфоцитов.

Для сравнения результатов, полученных при исследовании человека, мыши и крупного рогатого скота активность фермента в клеточных ядрах спленоцитов принимали за 10056. При этом активность Са/М^-зависимой эндонуклеазы в лимфоцитах миндалин человека составила 45 + 8 (%) от активности в спленоцитах; активность в тимусе мышей и крупного рогатого скота - 35.6 ± 9.1 ($), а активность в лимфоцитах периферической крови всех исследованных объектов не превышала 2-3 % от активности фермента в спленоцитах.

Как видно, максимальной активностью обладают лимфоциты селезенки, минимальной - лимфоциты периферической крови; различия достигают 30-50 раз. При сравнении активности в В- и Т-лимфоцитах периферической крови, селезенки и миндалин оказалось, что активность фермента во всех случаях выше в В-лимфоцитах. В селезенке и миндалинах эти различия составили 10-3055, в то время как в периферической крови они носили качественный характер - в Т-лимфоцитах активность практически не выявлялась.

Таким образом, в лимфоцитах периферической крови Са/М^-зави-симая эндонуклеаза может быть ферментативным маркером В-клеток.

Сравнение активности Са/М^-зависимой эндонуклеазы в лимфоцитах различных органов и популяций показывало, что она высока в органах в повышенным содержанием В-лимфоцитов и активных в отношении антителогенеза.

Полученные результаты указывали на целесообразность исследования активности фермента в ходе иммунного ответа.

В опытах использовали мышей линии СВА; иммунизацию проводили эритроцитами барана (ЭБ). Активность фермента определяли в экстрактах клеточных ядер по распаду суперспиральной ДНК рВЯ 322. В ходе иммунного ответа на фоне возрастания титра антител к ЭБ от-

Время после иммунизации (сутки) Рис.8 Динамика активности Са/М^-зависимой эндонуклеазы клеточных ядер лимфоцитов селезенки и тимуса в ходе иммунного ответа.

мечены выраженные 'изменения активности Са/М^-зависимой эндонуклеазы клеточных ядер как спленоцитов, так и тимоцитов (рис.8). Как видно, выраженные изменения активности Са/М^-зависимой эндонуклеп-зы в клеточных ядрах селезенки и тимуса отмечаются уже через 12 иг-сов после иммунизации. При этом в селезенке в течение 1-х суток як тивность фермента снижается, а в тимусе, наоборот, возрастает, т.^. отмечается реципрокное изменение активности Са/М^-зависимой эндонуклеазы клеточных ядер спленоцитов и тимоцитов.

Как отмечалось, упшмунизированных животных активность клеточных ядер лимфоцитов селезенки выше таковой для тимуса в 2-4 раза. После иммунизации выявляются два четко выраженных периода инверсии активности, то есть превышения активности Са/М^-зависимой эндонуклеазы клеточных ядер тимуса над таковой селезенки в 2-3 раза. Эти периоды соответствуют первым и шестым суткам после иммуниэаши.

Таким образом, иммунизация животных тимус-эависимнм алтиг^ч" -

(ЭБ) приводит к выраженным изменениям активности фермента клеточных ядер лимфоцитов селезенки и тимуса. Эти изменения начинаются в раннюю (индуктивную),фазу иммунного ответа и характеризуются определенной периодичностью (фазностыо). Очевидно, что выявленные изменения активности Са/Мс^-зависиыой эндонуклеазы клеточных ядер характеризуют изменения функциональных свойств и структуры популяций лимфоцитов селезенки и тимуса. В этом отношении они хорошо коррелируют с известными биохимическими и цитологическими данными о фазном характере пролиферативной:и антителопродуцирующей активности лимфоцитов в ходе иммунного ответа (Труфакин, 1983). Возможно, что активность эндоДНКаз клеточных ядер лимфоцитов целесообразно рассматривать как один из ферментативных маркеров иммунных процессов.

Учитывая отличия в активности фермента в Т- и В-лимфоцитах, а также рециркуляцию этих клеток, представлял интерес вопрос, в какой степени детектируемые изменения затрагивают популяции этих клеток? Кроме того, происходят ли в используемых условиях изменения компактизации хроматина? Для ответа на эти вопросы мы исследовали лимфоциты селезенки иммунизированных мышей в течение 48 часов после иммунизации, разделяя их на популяции Т- и В-лимфоцитов на колонках с найлоновым волокном. Результаты представлены на рис.9.

Как видно, иммунизация мышей ЭБ приводит к изменению структуры популяции лимфоцитов селезенки (рис.9-А). В течение первых суток происходит накопление Т-лимфоцитов. В течение первых 12 часов после иммунизации активность В-лимфоцитов практически не изменяется по сравнению с контролем (рис.9-Б). Напротив, в Т-лимфоцитах в течение первых 12 часов активность.снижается почти в 2 раза. Затем в В-лимфоцитах активность начинает'возрастать, а в Т-лимфоцитах -возвращается к исходному уровню. Вследствие этого суммарная активность нефракционированных лимфоцитов снижается в первые 12 часов, что, как видно, связано со снижением активности в Т-лимфоцитах (сравни с рис.8).

Таким образом, отмечается опережающая реакция Са/М^-зависимой эндонуклеазы Т-лимфоцитов по сравнению с В-лимфоцитами. Возможно, это связано с характером вводимого антигена, мобилизующего в первую очередь Т-лимфоциты.

Как видно на рис.9-В, доступность хроматина Т- и В-лимфоцитов к ДНКазе I различна. В Т-лимфоцитах она снижена по сравнению с В-лимфоцитами. После иммунизации доступность хроматина в Т-лимфоцитах

Время после иммунизации (час)

Рис.9 Содержание В- и Т-лимфоцитов (А), активность фермента В- и Т-лимфоцитов (Б) и доступность хроматина В- и Т-лимфоцитов к ДНКазе I (В) в селезенке иммунизировпшшх мышей.

несколько снижалась, а в B-лимфоцитах существенно повышалась к 12 часам после иммунизации. Это отражает существенную декомлактизацию хроматина B-лимфоцитов на ранних этапах иммунного ответа. Многочисленные литературные данные позволяют утверждать, что это является отражением возрастающей функциональной активности хроматина в клетках, стимулированных к делению и дифференцировке, в частности в активированных лимфоцитах (Барбашов, 1983; Kaplan е.а., 1%7 ) Можно думать, что существуют механизмы сопряжения активности ДНК-эндонуклеаз хроматина и конформации хроматина ( Levy е.а., 1981 ).

В целом, описанные опыты показывают, что процесс иммуногенеза приводит к выраженным, специфическим и закономерным изменениям активности Са/М^-зависимой эндонуклеаэы клеточных ядер лимфоцитов. Как нам кажется, это указывает на существенность данного фермента для функционирования лимфоцитов, а также определяет значимость его дальнейших исследований в плане биохимических основ активации лимфоцитов, в частности роли ДНК-ферментов в этом процессе.

Ш.2. Активность Са/Мс^-зависимой эндонуклеазы при хроническом лимфолейкозе и эндогенные ингибиторы фермента.

Полученные результаты ставили вопрос об изменениях активности Ga/Mij-зависимой эндонуклеазы при патологии, затрагивающей функции иммунной системы и связанной с нарушениями жизненного цикла лимфоцитов. Существенную значимость в этом отношении представляет хронический лимфолейкоз (ХЛЛ).

На основе подходов, изложенных в разделе I, нами была обнаружена активность Са/М^-зависимой эндонуклеазы в ядрах лимфоцитов пе-: пферической крови человека и крупного рогатого скота (КРС). Нами •■lino установлено, что у человека при хроническом лимфолейкозе актив-■ть Са/М^-зависимого эндонуклеолиза снижается в 8 раз по сравне->i« с нормой (Ходарев и соавт., 1983). Снижение определялось актив-"гью фермента В-, но не Т-лимфоцитов.. Активность не изменялась и сердечно-сосудистых заболеваниях и хронических заболеваниях же--чно-кишечного тракта.

Для дальнейших исследований был выбран крупный рогптыП скот, химически это предоставляло возможность работать с большим коли-гвом материала по сравнению с человеком; кроме того, для КРС гю-■ '¡ча четкая корреляция между развитием заболевания и инфицировани-•'■.ir;,'Thhx я прусом лейкоза крупного рогатого скота (EJiKPC), что по-

зволило проводить эксперименты в динамике.

Результаты исследования произвольной выборки здоровых животных и животных, больных спонтанным ХЛЛ, представлены в таблице 3.

Таблица 3. Активность Са/М^-зависимого эндонуклеолиза в клеточных ядрах здоровых и больных ХлЛ животных.

Исследованная Активность Са/Ма-зависи-

группа мого эндонуклеолиза (М +а)

Здоровые животные 87.8 + 6.9

( 5)_

Больные ХЛЛ 6.6+1.9

( п. 9)

Наблюдаемые значения статистически достоверны (р < 0.01), что позволяет говорить о достоверном снижении активности Са/Мд-зависи-мого эндонуклеолиза при ХЛЛ по сравнению со здоровыми животными.

К моменту наблюдений диагноз ХЛЛ был поставлен данным животным на основе совокупности клинических, гематологических и серологических данных. При этом активность эндонуклеолиза у телят, больных инфекционным вирусным ринограхеитом и парагриппом-3, не изменялась.

В случае, если снижение Са/М^-зависимого эндонуклеолиза хроматина действительно связано с развитием хронического лимфолейкоэа, можно ожидать, что инфицирование животных ВЛКРС приведет к таким же изменениям Са/М^-зависимого эндонуклеолиза, как и при спонтанном ХЛЛ. С этой целью проводили исследование эндонуклеолиза в динамике у шести телят 5-6 месячного возраста, зараженных лейкокон-центратом от коровы, больной спонтанным ХЛЛ. Полученные результаты представлены на рис.10. Как видно из рисунка, к 21 дню после инфицирования происходит резкий (в 3-4 раза) подъем активности Са/Независимого эндонуклеолиза. Непосредственно данному подъему предшествует появление антител к вирусным антигенам (РИД +; на рисунке отмечено стрелкой). К 28 дню происходит снижение активности до уровней, характерных для спонтанного ХЛЛ (нижняя заштрихованная зона), которое носило стойкий необратимый характер.

Таким обратом, основной вывод из данных опытов - о дейстпит^ль-

Активность Са/Ма-зависимого эндонуклеолиэа ДНК РИД (+)

300

>/11 НОРМА

хХКХ хм

200

100

7 14 21 28 60 120 150 180

Период исследования (сутки)

Рио.Ю Активность Са/М^-зависимого эндонуклеолиэа ДНК

клеточных ядер лимфоцитов крови крупного рогатого скота в разные сроки экспериментального инфицирования телят ВЛ КРС.

ной связи изменений Са/Мс^-зависимого эндонуклеолиза с инфицированием животных ВЛКРС и формированием вслед за этим лейкозной патологии. Кроме того, обращает внимание период подъема активности данного процесса, происходящий в узком временном интервале и совпадающий по времени с появлением антител к вирусным антигенам. Это интересно сопоставить с периодами подъема активности Са/Мд-зависимой эндонуклеазы в процессе формирования иммунного ответа, описанными в предыдущим разделе.

Особый интерес представили результаты наблюдений за здоровыми животными, контактировавшими с больными ХЛЛ - они демонстрировали такую же динамику активности Са/М^-зависимого эндонуклеолиза, как и зараженные животные. При убое 5 из 6-ти животных этой группы со стойким снижением активности Са/Мс^-зависимого эндонуклеолиза был поставлен патанатомический диагноз хронического лимфолейкоза. Таким образом, полученные результаты указывают на возможность передачи ХЛЛ контактным путем.

Одновременно было исследовано состояние структуры (степени компактизации) хроматина. Результаты показали, что хроматин при хроническом лимфолейкозе находится в существенно более компактизи-рованном состоянии по сравнению с нормой, что согласуется с электронно-микроскопическими данными (Прусов и соавт., 1983).

Таким образом, активность Са/М^-зависимого эндонуклеолиза в изолированных ядрах лимфоцитов периферической крови может быть рекомендована в качестве теста для диагностики хронического лимфолейкоза.

При исследовании активности фермента в экстрактах клеточных ядер при ХЛЛ было установлено, что она снижена по сравнению с нормой в 4-5 раз, что согласуется с данными по Са/М^-зависимому эндо-нуклеолизу в изолированных ядрах. Было также установлено, что добавление "лейкозных" экстрактов к экстрактам ядер здоровых животных вызывает ингибирование их активности, степень которого зависела от количества добавленного лейкозного экстракта.

С помощью иммунохимических методов было показано, что количество Са/М^-зависимой эндонуклеазы не изменяется при ХЛЛ (Волгина и соавт., 1988). Результаты указывали на появление ингибиторов фермента при ХЛЛ. Для их идентификации экстракты клеточных ядер лимфоцитов периферической крови животных, больных ХЛЛ, фракционировали сульфатом аммония и разделяли на колонках Моьо 2 (система

РР1С, Фармация-ЛКБ, Швеция). Фракция, обладающая ингибиторной активностью злюировалась 0.25-0.3 М ЫаС£; степень очистки составляла 100 раз.

Фракционирование препаратов ингибитора в гелях 12.5$ ПААГ-ДСН в сочетании с обработкой препаратов протеиназой К показало, что ингибиторная активность связана с полипептидами 60 и 67 кД.

Для определения специфичности ингибитора исследовали его действие на препараты Са/М^-эависимой эндонуклеазы различных лимфоид-ных органов, а также другие нуклеаэы. Было показано, что ингибитор, полученный из лимфоцитов периферической крови КРС при ХЛЛ, обладает специфичностью к Са/Мд-зависимой эндонуклеазе лимфоидных органов; другие нуклеазы (ДНКаза I, ДНКаза П, микрококковая нуклеаза) им не ингибируются или ингибируются в меньшей степени.

Таким образом, при хроническом лимфолейкозе у челозека и КРС снижается активность Са/Мд-зависимой эндонуклеазы клеточных ядер лимфоцитов периферической крови. Это связано с появлением специфических белковых ингибиторов. Одновременно отмечается повышение уровня компактизации хроматина. Данные наблюдения представляют интерес в плане разработки новых чувствительных тестов на ХЛЛ и другие лимфопролиферативные заболевания, а также обнаруживают новые аспекты патогенеза этих заболеваний.

В заключение необходимо отметить, что совокупность наших экспериментальных данных и их сравнение с данными литературы позволяют предложить гипотезу о полифункциональной роли Са/М^-зависимой эндонуклеазы в геноме эукариот. В основе этой гипотезы лежат два допущения:

1. Существование фермента в хроматине в составе специфического структурно-регуляторного комплекса;

2. Различные функциональные значения одно- и двухцепочечных надрезов, а также их влияние на структуру хроматина.

В общем виде гипотеза представлена на рис.11. Мы предполагаем, что в непосредственном контакте с Са/М^-зависимой эндонуклеазой могут находится различные белки, в том числе, оказывающие на фермент ингибирующие и активирующие воздействия (вторая возможность показана в литературе - см. ^озМИага е.«., 1982 ); соответствующие факторы на схеме обозначены как I и А. Возможно, что в состав такого комплекса могут входить также факторы, обеспечивающие фиксацию фермента в определенных участках хроматина (на схеме - Р).

КОМНАКТИЗАЦИЯ СТРУКТУРЫ ХРОМАТИНА

I

]§в> И

H

щ \

Рис.11 Схема функционирования Са/Ы^-за эндонуклеазы в хроматине.

Нарушения в структуре комплекса, в соотношении в нем активи-лощих и ингибирукщих компонентов, а также переход фермента в сво-идную (нефиксированную на хроматине) форму могут лежать в основе «екоторых патологических процессов. В частности, нарушения интакт-ной структуры комплекса и переход фермента в свободную форму могут лежать в основе инициации межнуклеосомной фрагментации хроматина in vivo при интерфазной гибели лимфоцитов, механизмы которой активно обсуждаются в литературе (Романцев и соавт., 1984).

Преобладание в комплёксе ингибирующих компонентов может объяснить снижение общей активности фермента при хроническом лимфолей-козе (см.выше). При нормальном функционировании фермента его роль будет определяться участком хроматина, в котором произошла активация фермента, видом нанесенного разрыва - одно- или двухцепочечно-го, а также влиянием нанесенных разрывов на конформацию соответствующего домена хроматина. В частности, одноцепочечные разрывы могут выступать в роли регуляторов локальной конформации хроматина, приводя к снятию торзионных напряжений в топологически отграниченных доменах хроматина. В этом отношении, возможно, Са/М^-зависимая эн-донуклеаза может выступать в качестве одного из факторов регуляции структуры хроматина. С другой стороны, учитывая наши данные по гиперчувствительности суперметилируеыых участков ДНК хроматина к Са/М^-зависимой эндонуклеазе и возможной ассоциации фермента с соответствующими участками, можно предполагать, что одноцепочечные разрывы, наносимые ферментомг могут быть связаны с регуляцией уровня метилирования ДНК. Репаративный характер деметилирования ДНК был предположен нами в 1981 году (Ходарев, Вотрин, 1981) и подтверждается работами последних 2-3 лет ( Rasin е.а., 1986 ).

Следует отметить, что само соотношение между одно- и двухце-почечными разрезами зависит от условий микроокружения фермента (см. выше).

На основании наших экспериментальных данных можно утверждать, что двухцепочечные разрезы, вводимые ферментом в ДНК, являются сайт-специфическими, причем они могут иметь значение для инициации ре-комбинационных процессов. В этом отношении интересно отметить работы последних лет, которые показывают, что в лимфоцитах транслокации онкогенов происходят в основном в локусы иммуноглобулиновых генов ( Klein, 1983» Sueuki, 1984 ). Предложенные модели транслокации основаны на их инициации двухцепочечными надрезами, а анализ струк-

туры локусов I^-генов, в которые происходят транслокации, показывает, что они сходны с участками, расщепляемыми Са/Мд-зависимой эндонуклеазой ( Hartl, Lipp, 198? ). Таким образом, одной из весьма вероятных функций Са/Мд-зависимой эндонуклеазы является инициация рекомбинационных процессов.

ВЫВОДЫ

1. Проведенное исследование качественных и количественных параметров Са/М§-зависимого эндонуклеолиза Хроматина в изолированных клеточных ядрах позволяет использовать его как методический подход н выявлению и определению Са/М^-зависимой эндонуклеазы, а также характеристики ее взаимодействия с хроматином. Данный подход позволил выявить фермент в клеточных ядрах лимфоцитов периферической крови людей и крупного рогатого скота и провести исследование его активности при хроническом лимфолейкозе. Обнаружен этап первичного эндонуклеолиза хроматина, характеризующий начальные этапы расщепления хроматина эндогенной Са/М^-зависимой эндонуклеазой, выявляющий элементы структурной специфики данных участков и позволяющий,

в сочетании с использованием методов компьютерного анализа денсито-грамм и моделирования эндонуклеолиза, предполагать неслучайное распределение фермента в хроматине и его фиксацию в соответствующих участках.

2. Разработана схема получения и очистки Са/Мс^-зависимой эндонуклеазы из клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека, позволяющая получать высокостабильные препараты, очищенные до 2000 раз. Впервые выявлена высокомолекулярная форма Са/М^-зависимой эндонуклеазы

(57 кД); показано, что фермент фрагментирует ДНК по эндонуклеазно-му типу, расщепляет фосфодиэфирные связи в З'-положении, предпочитает двухцепочечную ДНК и обладает смешанным механизмом гидролиза ДНК - одно- и двухударным.

3. Обнаружена зависимость механизма фрагментации ДНК Са/Мд.-зависи-мой эндонуклеазой от содержания дивалентных катионов и этапа гидролиза; показана смена преимущественно двухударного на преимущественно одноударный механизм фрагментации при достижении средней плотности одноцепочечных разрывов 1:4000 - 1:6000 нуклеотидньгх пар.

У. Впервые обнаружена способность Са/Мдг-зависимой эндонуклеазы к сайт-специфическому введению первого двухцепочечного разрыва н молекулы ДНК;специфичность участков гидролиза зависит, как от нуклео-тидного состава и последовательности ДНК, так и от топологического

состояния ДНК. Установлено, что Са/М^г-эависиыая эндонуклеаза расщепляет -кластер иммуноглобулиновых генов мши в 5'-участках J -сегментов, около консервативных нано- и гептамера, то есть в участках инициации 7 - Л -рекомбинации. Эти результаты в сочетании с данными литературы позволяют предполагать, что Са/Ы^-зависи-мая эндонуклеаза участвует в процессах рекомбинации ДНК.

5. Разработан высокочувствительный метод детекции антител к эндо-нуклеазам клеточных ядер; его применение позволило отобрать гибри-домы, продуцирующие антитела к Са/М^-зависимой эндонуклеазе. На этой основе предложен принципиально новый подход к исследованию гетерогенности эндонуклеаз клеточных ядер, предполагающий использование наборов независимых линий гибридом, продуцирующих антитела к любой возможной эндонуклеазе клеточных ядер; применение этого подхода в сочетании с биохимическими данными показало, что Са/М^-зависимая эндонуклеаза является наиболее представленной эндонукле-азой клеточных ядер.

6. Обнаружены выраженные органоспецифические вариации активности Са/М^-зависимой эндонуклеазы в различных лимфоидных органах; максимальная активность фермента отмечается в селезенке, минимальная -в лимфоцитах периферической крови, различия активности составляют 50 раз. Выявлены фазные изменения активности фермента в ходе иммунного ответа, обнаружен реципрокный характер динамики активности в тимусе и селезенке в индуктивной фазе иммунного ответа. Обнаружена декомпактизация хроматина В-лимфоцитов, параллельная возрастанию активности Са/М^-эависимой эндонуклеазы.

7. Выявлено выраженное снижение активности Са/М^-зависимой эндонуклеазы клеточных ядер лимфоцитов периферической крови при хроническом лшфэлейкозе у человека и крупного рогатого скота; эксперименты на крупном рогатом скоте показали, что изменения активности фермента происходят в течение 2-3 недель после инфицирования животных вирусом лейкоза крупного рогатого скота и опережают какие-либо гематологические и клинические признаки заболевания. Снижение активности фермента связано с появлением специфических белковых ингибиторов; одновременно выявляется повышенная комлактизация хроматина. Полученные результаты позволяют рассматривать Са/М^-зависимую эндо-нуклеазу и определяемый ею Са/М^-зависимый эндонуклеолиэ в изолированных клеточных ядрах как маркер хронического лимфолейкоэа.

0. На основе собственных экспериментальных результатов и анализа

литературных данных предложена гипотеза о полифункциональной роли Са/М^-зависиной эндонуклеазы в геноме эукариот. В основе гипотезы лежит представление о различном функциональном значении одно- и двухцепочечных разрезов в ДНК хроматина, а также о присутствии Са/М<^-зависимой эндонуклеазы в составе надмолекулярного структур-но-регуляторного комплекса, включающего ингибирующие и активирующие фермент белковые факторы, а также факторы, обеспечивающие фиксацию фермента в специфических участках хроматина. Гипотеза предполагает полифункциональный характер фермента, определяемый спецификой участка хроматина, содержащего структурно-регуляторннй комплекс, влиянием на фермент факторов микроокружения, регулирующих общую активность и соотношение одно- и двухцепочечных разрезов, а также возможностью нарушения интактной структуры комплекса и переходом фермента в свободную форму. Гипотеза позволяет объяснить инициацию межнуклеосонной фрагментации хроматина при интер^азной гибели лимфоцитев, снижение активности фермента при хроническом лим-фолейкозе и влияния Са/Мс^-зависимой эндонуклеазы на локальную кон-формацию хроматина.

. Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Ходарев H.H., Баснакьян А.Г., Вотрин И.И., Дебов С.С. Обнаружение эндонуклеазной активности и некоторые особенности аутоли-за хроматина в изолированных ядрах мозга // Биохимия.- 1979,-Т.44, № 4.- С.622-628.

2. Вотрин И.И., Соколов H.H., Баснакьян А.Г., Ходарев H.H., Фиц-нер А.Б. Характеристика действия различных нуклеаз на хроматин

и получение транскрипционноактивного хроматина // В кн.: 1У Всесоюзный биохимический съезд. Тезисы научных сообщений.- Ленинград, 1979.- Т.2.- C.3I3.

3. Ходарев H.H., Вотрин И.И., Дебов С.С. Об ингибировании аутоли-за хроматина о процессе выделения и инкубации клеточных ядер печени крыс // Вопросы мед. химии.- 1981.- № 4.- С.538-544.

4. Ходарев H.H., Вотрин И.И., Соколов H.H., Баснакьян А.Г. Метилирование ДНК хроматина и его расщепление в изолированных клеточных ядрах печени крыс // Биохимия.- 1979.- Т.44, № 6.- С.Ю5в-1067.

5. Вотрин И.И., Ходарев H.H., Баснакьян А.Г., Фицнер А.Б., Александрова С.С. Исследование направленной фрагментации ДНК хромат

некоторыми эндонуклеазаШЦ Йх выделение и свойства //Вестник АМН СССР.- 1981.- #2.- С.59-64.

6. Ходарев H.H., Вотрин И.И. Функциональная гетерогенность фракций хроматина, получаемых лимитированным гидролизом эндогенной Са/М^-зависимой эндонуклеазой ядер печени крыс // Билл, экспе-рим. биол. и мед.- 1982.- № II,- С.37-39.

7. Ходарев H.H., Соколова И.А.j Вотрин И.И. О количественном определении ДНК в гелях // Бголл; йкспериы. биол. и мед.- 1982.-

№ 12.- С.40-42.

8. Ходарев H.H., Соколова WiA.j ЙоНолов A.A., Берман Я.З., Вотрин И.И. Компьютерный анализ данных по фрагментации хроматина эндо-нуклеазами // Бюлл. дксУгерим; биол. и мед.- 1983.- № I.- C.II7-119.

9. Вотрин И.И.j Ходарев H.H. ( Баснакьйн А.Г. Эндонуклеазы как инструмент исследования структурно-функциональной организации хроматина // Вестйик АМН СССР.- 1983.- № 3.- С.88-95.

10. Ходарев H.H., Иванова Т.Н., Вотрин И.И. Обнаружение Са/Мс^-зави-симой эндонуклеазы в клеточных ядрах лимфоцитов периферической крови человека и ингибирование Са/М^-зависимого эндонуклеолиза хроматина при хроническом лимфолейкозе // Доклады АН СССР.-1983.- т.268.- C.I000-I003.

11. Ходарев H.H., Довгая И.А., Александрова С.С., Харитонов A.A. Некоторые свойства Са/М^-зависимой эндонуклеазы клеточных ядер и ее взаимодействие с хроматином // В кн.: "Современные проблемы биохимии и физико-химической биологии". Материалы Московской конференции молодых ученых.- 1984.- T.I.- С.129-132.

12. Казимирская В.В., Волгин A.D.j Ходарев H.H., Вотрин И.И. Гибри-домы, продуцирующие моноклональные антитела к эндо-ДНК-азам клеточных ядер лимфоцитов человека // В кн.: "Культивирование клеток животных и человека". Тезисы научных сообщений.- Пущино, 1985.- С.85-86.

13. Коромыслов Г.Ф., Газдаров А.К., Чупырина И.В., Ходарев H.H., Вотрин И.И. Эндонуклеазы и ДНК-метилазы изолированных клеточных ядер лимфоцитов периферической крови крупного рогатого скота в норме и при хроническом лимфолейкозе // В кн.: У Всесоюзный биохимический съезд. Тезисы научных сообщений,- Киев, 1986.- Т.З.-C.3I2.

14. Ходарев H.H., Коромислов Г.Ф., Газдаров А.К., Чупырина И.В., Александрова С.С., Соколова H.A., Казимирскал В.В., Вотрин И.И. Изменения активности Са/М^-зависимой эндонуклеазы клеточных ядер лимфоцитов периферической крови при гемобластоэах крупного рогатого скота.// В кн.: Всесоюзный симпозиум по биохимии селье-, ко-хоэяйственных животных. Тезисы научных сообщений.- Ташкент, 1986.- С. 43.

15. Вотрин И.И., Ходарев H.H., Баснакьян А.Г. Эндонуклеазно-топо-изомеразный комплекс клеточных ядер в стратегии исследований ДНК-ферментов // В кн.: 5-й Всесоюзный симпозиум по медицинской энзимологии. Тезисы научных сообщений.- Махачкала, 1986,- С.9-1<\

16. Votrin I.I., Baanakyan A.G. , Khodarev N.N. Endodeoxyribonuclen вея: Hole in Cell and Application in Biology and Medicine

// Harwood Academic Publisher Gmb H, Switzerland. Phyoicoche-nical Aspects of Medicine Reviews, od. by Y.M. Lopukhin.-198?.- V.1.- P.332-426.

17. Ходарев H.H., Соколова И.А..Александрова С.С., Волгина В.В., Вотрин И.И. Получение Са/М^-зависимой эндонуклеазы как основного компонента нуклеазного комплекса хроматина лимфоцитов //Балл, эксперим. биол. и мед.- 1987.- № 3.- С.312-314.

18. Ходарев H.H., Волгина В.В., Корогодин Д.В., Вотрин И.И. Метод выявления антител, продуцируемых гнбридомами к эндо-ДНК-азам клеточных ядер // Бюлл. эксперим. биол. и мед.- 1987,- № 6.-С.762-763.

19. Ходарев H.H., Соколова И.А., Александрова С.С., Чупырнна И.В., Вотрин И.И. Са/Мд-зависимая эндонуклеаза как зонд для выявления изменений структуры хроматина при хроническом лиыфолейкозе //Молек. генетика, микробиол., вирусол,- 1987.- í,r» 9.- С.24-27.

20. Ходарев H.H., Волгина В.В., Александрова С.С., Вотрин И.И. Динамика активности эндо-ДНК-аз клеточных ядер лимфоцитов селезенки и тимуса мышей в процессе иммунного отпета // Бюлл. эксперим. биол. и мед.- 1987.- ÍÍ 12.- С.713-717.

21. Соколова H.A., Ходарев H.H., Александрова С.С., Вотрин 11.1!. Эн-эимологическая характеристика Са/М^-зависимой эндонуклеазы клеточных ядер лимфоцитов человека // В кн.: IX Bceconrtuuü симпозиум "Структура и функции клеточного ядра".- Черноголовка, 1У".'. С.184.

22. Александрова С.С. , Ходарев H.H., Вотрин i!. И. Выявление w, •

белковых факторов, ингибирующих Ca/Mij-зависимую эндонуклеазу при хроническом лимфолейкозе // В кн.: Всесоюзное рабочее совещание "Биофизика рака". Тезисы научных сообщений.- Черноголовка, 1987.-C.5I.

23. Соколова И.А., Ходарев H.H., Александрова С.С., Вотрин И.И. Выделение и исследование Са/М^-зависимой эндонуклеазы клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека // Биохимия.- 1988.- Т.53,

№ 7.- C.II63-II73.

24. Чупырина И.В., Газдаров А.К., Коромыслов Г.Ф., Ходарев H.H., Вотрин И.И. Ферменты метилирования ДНК и состояние хроматина лимфоцитов крови при лейкозе крупного рогатого скота // В кн.: Современные методы профилактики и оздоровительные мероприятия по лейкозу крупного рогатого скота. Тезисы научных сообщений.- Тарту, 1987.- С.64-65.

25. Ходарев H.H., Морозов A.C., Соколова И.А., Александрова С.С., Вотрин И.И. Специфика фрагментации ДНК рВВ 322 Са/М^-зависимой эндонуклеазой клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека //Моле к. генетика, микробиол., вирусол.- 1988.- № 9.- С.26-32.

26. Волгина В.В., Ходарев H.H., Волгин A.D., Вотрин И.И., ПевницкиЙ Л.А. Применение моноклональных антител в сравнительных исследованиях Са/М^-зависимой эндонуклеазы // Бюлл. эксперим. биол. и мед.- 1988.- № 4.- С.419-421.

27. Khodarev U.N. , Bokolova I.A., Aleksandrova S.S., Morosov АЛ., Volgina V.V., Deev S.U., ürakov D.T. , Polyanovsky 0.1., Votrin I.I. Ca/Mg-dependent endonucleaee - aite-epecific endonucleaee of human lymphocytee and ite role in genone instability // 14-tli International Congress of Biochemistry, Prague.-1988.-V.5.-P.IJ.5

Аотор благодарит сотрудников НШ1Э АМН СССР С.С.Александрову, И.А.Соколову, В.В.Волгину и А.Ю.Морозова, участвовавших в настоящей работе. Некоторые разделы исследования выполнены совместно с А.Ю.Волгиным (AMГ АМН СССР), Д.В .Корогодиным (НИИ иммунологии МЗ СССР), И.В.Чупыриной (ВИЭВ ВАСХНИЛ), С.М.Деевым и Д.Ю.Ураковым (ИЖ АН СССР), И.Чука (Университет им.Земмельвейса, ВНР). _

Цели исследования, конкретные задачи и методические подходы к их решению определялись автором диссертации.