Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Са/Mg-зависимая эндонуклеаза клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека: выделение и исследование свойств

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Са/Mg-зависимая эндонуклеаза клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека: выделение и исследование свойств"

<1 <} С'1.

, л £ б й]

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

СОКОЛОВА Ирина Анатольевна

УДК; 577.123:591.813.611.41

Са/Мд-ЗАВИСИМАЯ ЭНДОНУКЛЕАЗА КЛЕТОЧНЫХ ЯДЕР ЛИМФОЦИТОВ СЕЛЕЗЕНКИ ЧЕЛОВЕКА: ВЬЩЕЛЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ

03.00.04; — биохимия.,

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1988

Работа выполнена в НИИ медицинской энзимологш АМН СССР.

Научный руководитель:

член-корреспондент АМН СССР, доктор биологически? наук профессор И. И. Вотрин.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Г. А. Галегов.

кандидат биологических наук Ю. Ю. Венгеров.

Ведущая организация:

Всесоюзный онкологический научный центр АМН СССР

Защита состоится « » 1988 г. е

часов на заседании специализированного советг К 074.08.01 Всесоюзного ордена Ленина и ордена Трудовогс Красного Знамени гематологического научного центра М2 СССР (125167, Москва, Новозыковский проезд, д. 4а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного гематологического научного центра МЗ СССР.

Автореферат разослан « 1988 года,

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

В. Д. Реуи

ОБЩАЯ ХАРАКТЕР/СТККА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Механизмы функционирования генома эу-кариот являатся одним из основных направлений исследований в современной биохимии и молекулярной биологии. Стремительное развитие методов генной инженерии позволило накопить огромнуп информацию о нуклеотидных последовательностях и структурах эукариотическо:'! ДНК, сглзгнннх с функционированием генома. Однако, относительно ферментов, осуществляющих функционирование эукариотического генома, данные носят.фрагментарной характер. Одной из накмение изученных в функциональном отноиении групп эукариотических ДНК-Ферментов являются ДНК-эндонуклеазы (эндо-ДНКазы), значительная часть которых локализована в клеточных ядрах. Показано участие некоторых из них в процессах репарации; обсуждается участке этих ферментов в процессах рекомбинации и репликации ДНК. Изменение активности и свойств эндо-ДЖаз наблюдаются в ходе онтогенеза, иммунного ответа, малигнизации, интерфазной гибели клеток, в частности, после радиационного поражения.

Среди эндо-ДНКаэ клеточных ядер можно выделить группу ферментов, обладающих сходными свойствами и, возможно, представляющими собой один и тот же фермент или его изоформы - так называемых Са/ М^-зависимих эмдонуклеаэ. Впервые наличие в клеточных ядрах Са/М^-зависимой эмдонуклеазной активности, осуществляющей межнуклеосом-нуп фрагментацию ДНК хроматина, баю показано в 1973 году Неи1еь и Бигроупв . В дальнейлем присутствие в клеточных ядрах Са/М^-эа-висимой эндонуклеадноЯ активности было достоверно показано для самых различных тканей эукариот. Широкое распространение этого {лр-мента в природе, по всей вероятности, указиэаят на его сущестпениуг) роль в метаболизме ДНК и предполагает участие в наиболее в^тп'^о. генетических процессах.

Г- {62.9 1

Очевидно, исследование участия СаЛ^-эависимой эндонуклеазы в генетических и биологических процессах требует получения фермента в высокоочищенном виде, изучения его физико-химических свойств, механизма действия и специфичности. Особый интерес представляет фермент из тканей человека, в частности лимфоидных тканей, что определяется как возможными медицинскими приложениями подобных разработок, так и возможным участием эндо-ДНКаз, в частности Са/!'^-зависимых, з процессах рекомбинации ДНК, активно протекающих в лимфоидных тканях. В связи с этим в качестве объекта настоящего исследования использовались клеточные ядра лшфэцитов селезенки человека.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получение высокоочищенных и стабильных препаратов Са/М^-зависимой эндонуклеазы из клеточных* тдер лимфоцитов человека, изучение её свойств и специфичности взаимодействия с ДНК и хроматином. Конкретные задачи исследования состояли в следующем:

1. Разработка технологии получения высокоочищенных препаратов Са/М^-зависимой эндонуклеазы из клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека.

2. Характеристика физико-химических свойств фермента.

3. Изучение механизма действия фермента и'его специфичности.

4. Характеристика возможностей использования Са/М^-зависимой эндонуклеазы в качестве зонда для исследования структуры' хроматина в норме и патологии.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проведенных исследований разработана оригинальная схема выделения Са/!' -ависимой эндонуклеазы из клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека и получены препараты фермента, обладающие высокой степенью очистки (около 2000 раз) и стабильные при хранении более 2-х

лет без существенной потери активности. Детальная характеристика 2

свойств фермента показала, что фермент отличается от описанных в литературе препаратов Са/М^-зависижх эндонуклеаз молекулярной кассой, имеющей в 2 раза больший размер, способностью изменять механизм гидролиза ДНК в зависимости от глубины гидролиза и условий реакции. Полученный фермент обладает способность» к специфическому расщепления суперспиральной ДНК рВЙ 322, причем специфика расцепления определяется топологическим состоянием ДЧК. Используя СоА'у-зависимуя эндонуклеазу в качестве зонда, выявлено увеличение степени компаятизации хроматина лиифоцктов периферической кропи крупного рогатого скота при тграническом лимфолейкозе "о сравнен!® с нормой. Показана йглъшая чувствительность Са/М^-зависимоЯ ькдону-клеазы к ".т^уктурной организации хроматина нормальных и опухолевых ^•г&к по сравнении с обычно применяемыми коммерческими препаратами микрококкопой нуклепзы и Д!1Каэы I. Разработан комплекс методов анализа зндонуклеслиза хроматина. Пскэзак неслучайная характер взаимодействия Са/М^-зависимой зндонуклеазп с хроматином нормальных лимфоцитов прри^рическоя крови крупного рогатого снотз; при хроническом лим|юлеЯкозэ изменяется механизм взаимодействия Са/Мр-за-висимой п!!донуклеазн с хроматином лимфоцитов периферической крови.

;:олученнне результаты могут быть использованы в комплексе мер ло рамной диагностике хронического лимфолейкоза у ».апотннх и человека, а также в разработках мер задитц и коррекции от последствий радиационного поражения организма. Метод компьютерного анализа он-дснуклеолизп хрематнчз внедрен в институте медицинской радиологии А.'й! СССР.

Алссбауия габотц состоялась 22 апреля 1983 г. на научней конференции Н/Г/ медицинской эмг/молегии АЛУ. СССР и на засед?.:■•.■/.•/. у-.-х-лабораторной научно?. конференции ВГгЦ !£3 СССР от 31 и».я Iг.

Материалы диссертанта догл% дь'яу.а, на Зсйс.г.лной

2-4&Э ■ 5

по. катеуатдаескоыу моделированию и применении ЭВМ в медицине (Москва, 1984), 5-м Всесоюзном симпозиуме ло медицинской энзимологии С'ехачкала, 1986), IX Всесоюзном симпозиуме "Структура л функции клеточного ядра" (Черноголовка, 1967), научной конференции молодых ученых НИ'/МЭ АМН СССР (1987 г.), 14 Международном биохимическом конгрессе (Прага, 1:88).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов собственных исследований, обсуждения и выводов. Количество страниц 160, рисунков 39, таблиц 6. Список цитируемой литературы включает 207 источников.

Хроыатографические стадии очистки фермента проводились при участии С.С.Александровой. Получение клеточных ядер лимфоцитов периферической крови крупного рогатого скота проводилось И.В.Чупы-риной.

СОДЕИКАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалом исследования,служила селезенка человека - операци-оьный материал, полученный-при,сплензктомии по поводу цирроза печени. Лимфоциты к клеточные ядра из них выделяли по разработанной нами методике (см. "Результаты"). Ядерные нуклеазы экстрагировали 1 помощью буфера, содержащего 0.3 М КС1, 10 мМ трис-НС1, рН 7.6, 0.07555 Тритон Х-1С0.

Белки ядерного экстракта фракционировали н-изопропанолом и подвергали хроматографии на колонках с КМ-сефадексом, ДЕАЕ-целлю-лэзой ДЕ-5?., Голубой сефарозой, ДНК-пеллюлозой (денатурированной).

ДНК-эндонуклеазную активность определяли, инкубируя препараты с различными субстратными ДНК и определяя степень расщепления ДНК с помощью электрофореза в блоках агароэы. При схриннинге актив-

и

сти в ходе фракционирования экстрактов клеточных ялер и коло-чной хроматографии использовали ДНК X -^iara. D этом случае офиль активности вычисляли, измеряя степень миграции субстратной К и продуктов ее расщепления в гелях.

Расщепление плазмидной ДНК Са/М^.-зависимой эндонуклсазой оводили в инкубационном буфере, содержащем 10 мМ трис-HCl, рН 2, 10 :/.'■! ЩС1? , I vU С«С12 , 0.5 мМ EGTA, 10 кй 2-ме'ркаптозта-

На пробу объемом 50 мкл добавляли от 26 до 55 единиц фермсн-(2-5 мкл) и от 5 до 10 мкг суперспиральной плазмидной ДНК рва I. Реакция останавливали, прогревая пробы 10 мин при 65°С, за* проби депротеинизировали и ДНК осаждали спиртом. Промытые и :уаенныо осадки ДНК растворяли в 10 мИ тряс- HCi, ph' 7.6 и домяли 1/10 объема IO-кратных концентратов буферов для рестриктьз: юокосолевого* для В«ш HI и "среднесолевого" для Eco Н1 и BlndlU [ниатис, 1985). К пробам добавлйлй соответствующие рестриктазы, :ичества которых подбирались тйкйм обрезом, чтобы за 60 мин ин-ации спи полностью расщепили 5-10 мкг плазмидной ДНК. Eco Н1 iaa Н1 били полутени из НПО "Еиолар"*Hind Ш пройэводстпа gaa", США. Реакция останавливали добавлением ЭДТА и перемеще-№ проб на лед.

Для количественного определения удельной 'активности фермент.? сследуемых образиэх использовали суперслиральнуп ДНК рВЯ 322. гд/нуцу активности принимали количество фермента, сбралуЕ'цес кг линейной рЗП 322 за I час кнк^ации при 37°0 в инкуба-(нсм буфере. Количество суперспиральной Д?гК рассчитывали с уче-эффе:гта енстения флуоресценции - коэффициент 1.5.

Электрофорез белков проводили в гелях 12.5$ ПААГ-ДСН по г ( bbtaxlj>Л'У70 ) с послчдугкцеЯ окраской серебром по у.^^/.гя, :?яноЯ 8 (Осте с мал, 1954). КснЕгентрмзгс белка олред-г-тгл/ пс

£29 ' Г

методу ( Sednark, 1977).

Основные результаты исследования Разработка технологии получения внсокоошпценных препаратов

Са/М^-зави^икой эндонуклеазы. Исходным этапом работц являлось получение лимфоцитов и клеточных ядер из них. Однако, больсоЯ объем образца и препаративная направленность опытов делали невозможным использование общепринятых кетодих выделения лимфоцитов и клеточных ядер из них, так как это приводило к резкому увеличению объемов получаемых суспензий, расходу дорогостоящих реактивов, удлинению времени процедур, низкому выходу продукта. Разработанная нами методика ступенчатой про ыывки клеточных ядер в растворах сахарозы повышающейся плотности позволяла сравнительно быстро и эффективно получать препараты кле точных ядер, пригодные для дальнейшего выделения фермента (рисЛ) Детальное исследование окстракции нуклеаз из ядер лимфоцито! солями хлорида калия (от 0 до I М) в присутствии Тритона Х-ЮО п< казало (риг.2), что общая активность образцов экстрактов возрастала параллельно с увеличением концентрации хлорида калия- в экстрагирующем буфере. Однако, максимальной удельной активностью об ладали образцы экстрактов,полученных в присутствии 0.1, 0.2 и 0. "Л KCl . Чтобы сократить потери общей активности, но сохранить в сокую удельную активность эндонуклеаэ в экстракте, для всех даль неПаих исследований мы использовали буферы, содержащие KCl в к неиной концентрации 0.3 М.

Для предобогашения ядерный экстракт фракционировали н-raonj панолом, который в соотношении 0.6 объзма изопропанола на I объс экстракта осаждал всю нуклеазную активность и давал обогащение i активности до 10 раз.

Первый этап хроматографической очистки состоял в пропускан]

С

ГСЕЛЕЗЕНКА

_______Г'БУФЕРлА

•'СУСПЕНЗИЯ КЛЕТОК

' II

ч5000, р, 30»кия -Н/О*" ' }} ________; БУФЕР>В

-----------ГШЖЕН4Т

I БОЛЕЕ 9055' ЛШ$ОПИ- и

; ТОВ. ЕСТЬ ОСТАТКИ I

СТРОМЫ »Т

~ '5000; £.<30чют

;,н/о—1Ц-—-———'—ГБУ4ЕРС

---------- ГОМОГЕНАТ

ЯЛ РА. ЕСТЬ НЕРАЗ- |

50 ООО р, 30-мин

Н/0 "" ________Г БУФЕР С

ГОМОГЕНАТ

1.11Ф111111 [

ЦЕНТРИвУТИРОВАНИЕ В СТУПЕНЧАТОМ ГРАДИЕНТЕ 2.0 М САХАРОЗЫ 70 ООО о, 3 ч

I

■ ОЧИЩЕННЫЕ ЯДРА }

" ХРАНЕНИЕ ПРИ -20°С

Рис Л Схема1 выделения-клеточных ядер лимфоцитов селезенки (•человека.

БУ5ЕР А: 0.9^ «мл,. ,\0Л% Я.-цитрат,' 10 Ш трис-нсг , рН 7.6. ШЕР В: 0.?.5< М оахаровд. с*Схг , 50 мМ трис- НС1, рН 8.5, 0.4* нонидвт Р-40.

БУ1ЕР С: состав тог же,-что к БУ4£Р В, «о,' 1*0: М сахароза.

3-1629

Концентрация KCl (Ii)

Рис.2 Исследованиэ степени экстракции ядерных нуклеаз при использовании различных концентраций KCl .

1 - удельная активность эндснуклеаз в экстракте;

2 - общая эндонуклеазн&я активность экстракта;

3 - содержание белка в экстракте.

8

[^акционированного изопропанолом экстракта через колонку с КМ-се-[ядексом (С-25) и сборе несорбированных на ней фракций, в которых I содержалась нуклеазная активность. Далее этот материал подвергался хроматографии на ДБАЕ-целлплозе. Такой подход определялся •ем, что если фракционировании:! изопропанолом экстракт подавали гепосредственно на колонку с ДЕАЕ-целлвлозой, не пропуская предва-»ительно через КМ-се<[>адекс, то происходила инактивация фермент.!, (следствие этого мы решили применить в качестве первого этапа хро-1атографии "батарею" колонок.Выход колонки с КК-сефэдексом соеди-[или с входом колонки с ДЕ-целлюлозой (того ке сечения и глубины 1аг.олнения). Фракционированный изопропанолом экстракт наносили на М-сефадекс, затем вели промывку системы стартовым буфером. После хоядения с ДЕ-целлплозы всего несорбировавшегося материала (под онтролем проточного CS-метра) колонки разъединяли и пропускали ерез ДЕ-целлюлоэу градиент В«С1 от 0 до 0.5 М. Активность сходи-а в зоне 0.2 М HaCl (рис.З-А).

На последующем этапе очистки применялась аффинная хромато-рафия на голубой сефярозе. Ферментативная активность разделялась а 2 компонента: первый не взаимодействовал с сорбентом, второй -орбировалсл и элюироеался при последующей промывке градиентом сои (рис.З-Б). Фракции, сорбированные на колонке, собирали и нано-или на колонку с ДНК-целлюлозой, приготовленной по методу Albert«, Г971 . Профиль глюоти представлен на рис.З-В. Два пер;ых пика ак-ивности соответствовали Мр-завлеимой нуклеазноЯ активности, тре-иЯ пих - матерный - злюируемый концентрацией Я*С1 0.7-0.8 Ii, го-гзетствовал Са/Л^-зависимоЯ зндонуклеазе. Эту фракция собирали и кализовали з течение ночи против бу*»*ра 10 тркс- 2Cit pH 7.С, . 15 U 5»С1, 50J глтгеран я хранили при -20°С.

Не рис.4 предетазлена сбаал схема разрзйст«кнего »«тодя полу-

,.■-... - .. '■'. 9

СЕЛЕЗЁНКА

I • ■

. ВЫДЕЛЕНИЕ ЯДЕР В ПРИСУТСТВИИ

НОНИДЕТА Р-40 (

ЭКСТРАКЦИЯ 0.3 Ы KCl + 0.075* ТРИТОН X-IOO

I

ИЗОПРОПАНОЛ 0.6 ОБЪЕМА'

• I

КЫ-СЕФАДЕКС - ПРОСВД,

ДЕАЕ-ЦЕЛЛ&ОЗА ЭЛЩИЯ ГРАДИЕНТОМ я«С1 ДО . Oi 5, l|i

I .

ГОЛУБАЯ СЕФАРОЗА ЭЛЩИЯ ГРАДИЕНТОМ И«С1 ДО 0.5 II

I

ДНК-ЦЕЛЛШОЭА /ДЕНАТУРИРОВАННАЯ/ ВЛЮЦИЯ ГРАДИЕНТОМ Н.С1 ДО Г.О M

■ I

ДИАЛИЗ ПРОТИВ 5С# ГЛИЦЕРИНА

Рис.4

Схема получения высокоочищенных препаратов Ca/Mji-эависимой эндонуклеаэы из . клеточных ядер лимфоцитов человека.

H

Таблица I. Очистка Са/Ыф-эависимой эндонуклеазы.

Стадия очистки Удельная активность Степень Выход

(ед.акт./мг белка) очистки (%)

Экстракт 49 I 100

Иэопропанол 215 4.2 74

ДР-целлплоза 15 0.1-0.3 46

Голубая сефароза 8950 182.7 5.7

ДНК-целлплоз а 91333 1863 8.6

чения высокоочищенного препарата Са/М^-зависимоП эндонухлеазы из клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека. В таблице I приведены количественные данные по степени очист^ фермента.

Физико-химические свойства и специфичность фермента.

Для характеристики белкового спектра полученного препарата фермента ш проводили его электрофорез в ПААГ-ДСН с последугщей окраской серебром. Результаты показали, что препарат представлен мажорным полипептидом с молекулярным весом 57 кД и минорным - 54 хД. (рис.5-А). Определение нухлеазной активности по фракциям геля показало, что ферментативная актиьность мигрирует единым пиком и совпадает с детектируемыми белковыми'полосами. Других нуклеазньк активностей и белковых полос в геле не выявлялось (рис.5-Б).

Основные сгойства фермента подробно исследованы и представлены в таблице 2.

Д*я кручения механизма действия фермента мы исследовали кинетику кагслзения одно- и двухцеясчечмых гадреэсв, возникающих в ДНК V > зрот^сге икну?алии с ферментом. Дзя этого продукта фрагментапяи

А

57 *Д

^ ^54 кД

+

Активность ( % )

100

80

60

40

20

15 20 25 30

Расстояние от старта (усл.ед.)

5

Рис.5 Схема электрофореза препарата Са/^-зависимой эндо-нуклеазы в ПААГ-ДСН.

А- белковый спектр препарата после серебрения геля; В- распределение нуклеазной активности в геле.

30

Таблица 2. Свойства Са/Мр-заеисимой эндонуклеагы клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека.

Исследуемый параметр

Полученные результаты

Ыо*екул1фНйй0Ввс . НаШме губъодШйчнбй

ОптИм^м1 '¿М

Температурный оптимум

КатионОэависимость (дивалентн1л катионы)

Катионозайийймость (одновалентные катионы)

Предпочтительный субстрат Тип атаки ДНК Механизм фрагментации ДНК Влияние п-ХМБ

57 - 54 *Д Одна полипептидлая цепь

8.2 - 8.3

37°С

(С«24«. Kg2*) > ttixz*> C«2V «e2V U

Ингибируется HeCl и KOI в концен от 0.15 до 0.2 М.

дц-ДНК > оц-ДНК

Эндс^/клеазиый

Смешанный - одно- и двухударь

Ингибирует на 90?

•ДНК А-чфага на каждом этапе гидролиза разделяли в нативной и щ< лочной агарозе. В нативных условиях определяли.количество двух! почечных надрезов, нанесенных на ДНК, 'в щелочных - количество с негтпочечнмх надрезов, нанесенных, на ДНК. Результаты показали, скорости накопления одно- и двухцепочечных надрезов в процессе кубации не совпадают (рис.6). На начальных этапах скорость наи< сенкя -одноцепгчачных надрезов»существенно превыпает скорость ж несения двухцепечездоде надрезов.' Однако, на определенном этапе рсти.ча' происходит-'резкое возрастание скорости накопления Двухш 'асл^чнмг надрезов я, наэбгрот, существенное енгаение 'скорости 1 ленки еднасепочечнмс надрезав. Недельные расчеты показывают, «г дг.1 пгкм^гйя перлст двухпеаочечиых кадгеэов 8 результате едуч«

^ • - , С . - ,

Скорость нанесения надрезов (усл.ед.)

30 -

20 '

10 -

I . <_I_I_■_|-1

5 10 15 20 25 30

Время инкубации (мин)

4(0.6 Зависимость скорости нанесения одноцепочечных (I) и (вухцепочечных надрезов (2) от времени инкубации ДНК с Са/М^-1йвисимой эндонуклеаэой.

ного совпадения одноцепочечных нужна достаточно высокая плотность нанесения одноцепочечных надрезов, она достигается при гидролизе 5-7% всех <1ДЭ связей в молекуле ДНК. Однако, наши экспериментальные данные показывают, что появление двухцепочечных надрезов происходит при расщеплении ферментом лишь 0.03^ от всех ФДЭ-связей в ДНК. При этом плотность нанесения одноцепочечных надрезов составляет I на 4-6 тысяч н.п. При такой плотности одноцепочечных надрезов вероятность случайного появления двухцепочечного надреза очень низка. Эти опыты позволяли думать о неслучайности появления перги./ двухцеп очечных надрезов в ДНК.

-Т

/о

Ьсо H1

Baa H1

Рис.7 Карта участков

расцепления ДНК pBR 322

Са/М^-зав'исииоп эндонуклеазой

клеточки* ядер лимфоцитов

селезенки человека.

- позиции участков расцепления Са/Ы^-зависи-мой эндонуклеазы.

Для исследования отого явления мы использовали расщепление суперспиральной кольцевой ДНК' рЕЯ 322 Са/М^-зСкисимой эндонуклз-сзоп до линейной формы. Далее полученный препарат линеГлой ДНК об-peiCTî.'EtjiK рестриктазоЯ, имеющей один сай.т узнавания на рВЕ J22 (например Eco R1 , Baa Н1 или Hind Ш ). После гидролиза линейной ДНК рестриктазой мы получили дискретный спектр фрагментов, длины которых равны расстояния от места нанесения двухцепочечного надреза Сл/Уо-зйвискмоП эндонуклеазой до сайта соответствующей рест-риктг.оы. Используя несколько однгсайтовых репгркктлз ни хартирова-г.к г.счпг-.ки этих i-.рогозеs на ДНК рБй.322 (рис.7).

Та*нм о б р гитом, результаты этих опытов показали, что фермент . оп;>г.1фг.1?схн г.по-тляет суяерсзиральнуг ДНКрВД 322 , внося первые дг.ухцепечечкыс ? определенные участки ДНК.

H.wi: пгорегено влияни? топологического состотаия ДНК на сп£:!**-!£гу с феруенгсы. Для. этого vu использовали

злаксацию мономерной суперспираРьной ДНК рВН 322 ДНК-топоизоме-130Й I печени крыс. Полностью релаксироэанную ДНК расцепляли Са/

>-зависимой ондонуклеазой, что приводило к образованию линейной >

Ж, а затем расщепляли рестриктазой Eco R1 или Вы» Н1 , как и в

*

:ходных опытах. Характерные фрагменты при использовании в качест-! субстрата кольцевой релаксированной ДНК не выявлялись. Отсюда I могли сделать вывод, что специфика расцепления суперспиральных И CaAîÇ-зависимой эндонухлеазой определяется топологическим сос- . »янием ДНК.

Применение препаратов Са/М^-зависимой эндонуклеазн для исследования структурно-функциональной организации хроматина. Задачей данной работы являлось исследование специфичности вза-юдействил фермента не только с чистой ДНК, но и с ДНК в составе юматина, при этом представляло интерес качестзенное и количеет-нное сравнение его действия на хроматин нормальных"и лейхозных мфоцитов, а также сравнение с действием обычно применяемых ком- . рческих препаратов микрококковой нуклеазы и ДНКазы I. Используя к .очищенные препараты Са/М^-зависимой эндонуклеазн, так и коммер-ские препараты микрококковой нуклеазы и ДНКазы I, мы показали,

0 развитие хронического лимфолейкоза сопровождается конформаци-ными перестройками хроматина лимфоцитов периферической крови' круп-го рогатого скота, приводящими к увеличению степени его компак-задии, к увеличению его "нуклеазорезистентности". Качественная энка электрофореграмм показала, что различия в расщеплении "нор-пьного" и "лейкозного" хроматина более выражены при использовании Л^-эависимой эндонуклеазы, чем микрококковой нуклеазы и ДНКазыЬ

С целью разработки подходов к количественной оценке дейст-

1 н/клеаз на хроматин мы провели специальную работу по количест-таому определению продуктов эндонуклеолиза хроматина в геле. Под-

Дсуу* мононуклеосом

Рис.й Динамика накопления д::нуклессои в зависимое.*:t от содерян ния мононуклеосом. (I) - модель стохастического распада хроматина; (2) - действие микрококковой нуглеазы на хро-катин нормальных лимфоцитов; (3) - действие Са/М^-завиа мой экдонуклеазы на хроматин нормальных лимфоцитов.

гчгти скорости расЕТленич рисоксполим-.-рной хроматина пока; бг-пт, чти при испсльясмиии ондонухлеазч лейке;

гпсз«п.'.лстся р 7 раз м»*леннее по ер.»рмения с норкады-Д-.-- '.'во^ иуклеазы эти различия менее »мражгни.

Н?мк ivs. рялгаботак кс-мпьстернРГ" анализа денситогр:

ггл\г>!;-грять rzr.mec.t?«vü гродуггев растоплен»« хро:. " ук.г^азгл';! к сраанигать грy.vнтал дачные С мэделъс гп.т.ад* хр:; пгд нуклеал. Очевцл

'лг: 7 пг дхг-- гу?гд о спгцифкчлсхсн или несг.ец'/.

fS

ическом характере взаимодействуя нуклеаз с хроматином, а на отой снове о возможных механизмах изменений при патологии.

Экспериментальные данные показали, что взаимодействие очищен-ой Са/Мп-зависимой эндонуклеазы с хроматином носит неслучайный ярактор, п отличие от .микрококковой нуклеазы, для которой этот роцесс близок к случайному (рис.8). Эти данные согласуются с ра-ее полученными результатами о неслучайном характере расщепления роматина в условиях активации эндогенного фермента в клеточных драх пе«ени крыс (Ходарев Н.Н., 1983), а также с результатами на-тоящей работы в отношении специфичности взаимодействия Са/М^-зави-имой эндонуклеазы с суперспиральной ДНК рВН 322.

Таким образом, показано неслучайное, специфическое взаимодей-твие очищенной Са/Мд-эависимой эндонуклеазы как с чистой ДНК, так с ДНК в составе хроматина.

ВЫВОДЫ

. Разработан простой и эффективный метод получения клеточных ядер имфоцитов селезенки человека, основанный на ступенчатом фракцио-ировании клеточной суспензии растворами сахарозы возрастающей лотности, обеспечивающий выход материала около I мг по ДНК на I г кани.

. Из лимфоидной ткани человека получены внсокоочищенные препараты а/М^-зявисимой эндонуклеазы, свободные от экзонуклеаз, фосфатаз протеаз.

. Представлена детальная характеристика свойств Са/М^-зависимой ндонуклеазы: молекулярная масса фермента 57 кД, оптимум рН 8.2, емпературный оптимум 37°С. Фермент обладает широким спектром ка-ионозависимости: в максимальной степени активируется при совмест-ом присутствии Са и М^, одновалентные катионы ( Н«" и к" ) при

изиологических концентрациях ингибируют фермент практически пол-

&

НОСТЫО. ti , .. ,

4. Получены данные о субстратной специфичности, .фермента:

.-' а) предпочтительным субстратом является двухцепочечная ДНК;

б) фосфодиэфирная связь расиепляется в З'-псложении;

в) механизм гидролиза ДНК изменяется в зависимости от глубины рас щепления и условий реакции с двухударного на одноударный.

5. Обнаружено, что Са/М^-зависимвл эндонухлеаза обладает способностью к специфическому гидролизу ДНК,. при этом специфичность гидролиза определяется не только первичной- последовательностью, но и вторичной и третичной конформациям^ Д.ЧК, Установлено, что фермент теряет специфичность гидролиза при использовании молекул плазмид-ной ДНК, рслпксированных ДНК-тспсизомеразой I.

6. Разработан оригинальный способ количественного определения в гелях продуктов расщепления ДНК хроматина. Показан неслучайный'характер взаимодействия Са/М^-зависимой зндонуклеазы с хроматином лимфоцитов периферической крови крупного рогатОго скота.

7. УстянОвлено, что Са/!^-зависимая эндонуклеаза являотся более чувствительным ферментативным зондом при исследовании структурно-функ'лиональной организации хроматина d норме и при хроническом лиыфст.еЯкэзе, чем обычно используемые микрскокковая нуклеаза и ДНКдза I. Выпилено увеличение степени ксмпактизации хроматина лим-ф.-цит^п периферической крори крупного рогатого скота при хроничес-кси лкм^слеГ.кээе.

СП НТК СГТУ^ЛИКГРаКН^Т Г.7Р!"* ЛПССвРТЯ!Ч!Л. /

I. V, свойства СяЛ'Ъ-заю^-.-.моГ. зндонуклеазы клеточ-,

пл- .«".^ср -•км^сыктс'в селезенки человека /Секглояа И. А.Александрова С.С., Хгдкгер H.H., Встрда Y..)'. //5 Всес-сзный симпозиум по ые-¿¡сгкнскЯ* эи'имг-лоп'а. 29 сентября - I ewafrs, 1986: Тез;докл.-

2Ü . ;