Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активность Са2+/Mg2+-зависимых эндонуклеаз в эндометрии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Активность Са2+/Mg2+-зависимых эндонуклеаз в эндометрии"

На правах рукописи

гтъ од

I " ¿.„-'¡Л Л

Колобова Елена Александровна

АКТИВНОСТЬ Са2+/М§2+-ЗАВИСИМЫХ ЭНДОНУКЛЕАЗ В ЭНДОМЕТРИИ.

03.00.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2000

Работа выполнена в Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН

Научный руководитель: член-корреспондент РАМН,

профессор, доктор медицинских наук Г.Т. Сухих

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор A.A. Терентьев

доктор медицинских наук, профессор В.М. Девичинский

Ведущая организация:

Московская Медицинская Академия им. И.М. Сеченова.

Защита диссертации состоится 17 апреля 2000 г. в_час.

на заседании Диссертационного Совета К08.414.05

при Российском Государственном Медицинском Университете

(117513 Москва, ул. Островитянова 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ. Автореферат разослан "_"_2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, Кандидат медицинских наук, доцент

Т.Н. Клушина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Апоптоз представляет собой нормальный физиологический процесс гибели, направленный на удаление генетически дефектных клеток, а также на поддержание постоянства численности и обеспечение правильного соотношения клеток различных типов. Апоптоз является защитным механизмом от нерегулируемого клеточного деления.

Баланс процессов пролиферации и гибели клеток имеет особое значение в поддержании гомеостаза в активно пролиферирующих тканях. Нарушение апоптоза является важным звеном в патогенезе многих так называемых пролиферативных заболеваний. Показано, что опухолевые процессы в различных тканях сопровождаются не только увеличением скорости пролиферации клеток, но и снижением их способности к апоптозу. Наиболее изученными заболеваниями, при которых происходит ингибирование апоптоза, являются лейкозы и лимфомы, развитие которых сопряжено с изменением экспрессии регуляторов апоптоза, в частности, с гиперэкспрессией ингибитора апоптоза Bci-2 [Cleary et al, 1986; Korsmeyer et al., 1992].

В то же время, данные литературы о нарушениях процесса апоггтоза и его роли в патогенезе пролиферативных заболеваний эндометрия очень противоречивы. Выбор эндометрия в качестве объекта исследования обусловлен тем, что в течение менструального цикла в этой ткани происходят последовательные процессы пролиферации, дифференциации и элиминации клеток, в связи с чем эндометрий представляет собой хорошую модель для изучения процессов клеточной пролиферации и гибели. По данным литературы, апоптоз играет ключевую роль в опосредованном гормонами циклическом отторжении клеток функционального слоя эндометрия [Gompel et al., 1994]. Несбалансированность гормональной стимуляции эндометрия в течение менструального цикла приводит к нарушению баланса пролиферации и гибели клеток и гиперпластическим изменениям эндометрия. Гиперпластические процессы в эндометрии в ряде случаев являются предвестником неопластической трансформации клеток и развития аденокарциномы. Частота перехода гиперплазии в рак колеблется от 2 до 30% [Савельева и Серов, 1980; Бохман, 1989; Макаров и соавт., 1993]. В этой связи необходим поиск маркеров, позволяющих оценить изменения, которые происходят при переходе от нормальной пролиферации, контролируемой конкурентным процессом клеточной гибели, к неконтролируемой пролиферации, приводящей к гиперплазии и неоплазии эндометрия.

Одним из главных критериев апоптоза является расщепление ДНК на олигонуклеосомные фрагменты, которые выявляются при электрофорезе в виде дискретных полос [Wyllie et al., 1984; Cohen et al., 1993]. Межнуклеосомная фрагментация ДНК осуществляется, главным образом,

Ca2+/Mg2t-3aBiicHMbiMH эндонуклеазами (СМЭ), ■ локализованными в клеточном ядре [Ribeiro and Carson, 1993; Khodarev and Ashwell, 1996; Pandey et al., 1997]. Изменение активности Ca2+/Mg2 '-зависимых эндонуклеаз отмечено при некоторых патологических процессах [Kyprianov et al., 1988; McConkey et al., 1996]. В частности, наблюдаемое при лимфопролиферативных заболеваниях значительное снижение активности ядерных Са2+/М§2+-зависимых эндонуклеаз, считается признаком нарушения апоптоза [Соколова и соавт., 1988; Ткачева и соавт., 1990].

Цель работы:

Исследование активности ядерных Ca2+/Mg24 -зависимых эндонуклеаз при физиологических и патологических состояниях эндометрия, сопровождающихся изменением баланса пролиферации и гибели клеток.

Задачи исследования:

1. Разработать метод определения активности Ca2'/Mg2+-3aBncnMLix эндонуклеаз в эндометрии.

2. Исследовать зависимость активности СМЭ в эндометрии от фазы менструального цикла.

3. Определить активность Ca2+/Mg2+ -зависимых эндонуклеаз в тканях эндометрия с разной степенью выраженности гиперпластических и неопластических процессов.

4. Оценить уровень активности СМЭ в мононуклеарных клетках периферической крови в зависимости от состояния эндометрия.

Научная новизна работы:

Впервые показано, что гиперплазия ткани эндометрия сопровождается уменьшением активности СМЭ в измененных участках ткани, но не в клетках периферической крови. Активность СМЭ в ткани эндометрия при его гиперпластических и иеопластических изменениях снижается в ряду: неизмененный эндометрий - гиперпластический эндометрий - аденокарцннома эндометрия. Выявлена зависимость между уровнем активности СМЭ и степенью дифференцированности аденокарцином эндометрия. Активность Са2+/М§2"-зависимых эндонуклеаз снижается по мере уменьшения степени дифференцировки аденокарцином,

Практическая значимость работы:

Проведена адаптация метода оценки активности Ca2+/Mg2+-зависимых эндонуклеаз для исследования эндометрия. Предложен новый способ расчета эндоиуклеазной активности. Показано, что снижение активности СМЭ зависит от степени выраженности патологического процесса в эндометрии. Снижение активности Ca2+/Mg2+ -зависимых

эндонуклеаз, по-видимому, может быть использовано в качестве маркера нарушений процесса апоптоза, приводящих к изменению баланса клеточной пролиферации и гибели в ткани эндометрия. Предложенный метод измерения уровня активности СМЭ позволяет выявить нарушения механизмов регуляции апоптоза в эндометрии и оценить степень риска их малигнизации.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработан метод определения активности СМЭ в эндометрии.

2. Активность СМЭ в эндометрии не зависит от фазы менструального цикла.

3. Снижение активности СМЭ в эндометрии коррелирует со степенью выраженности гиперпластических и неопластических процессов.

4. Уменьшение активности СМЭ в трансформированных тканях эндометрия не сопровождается изменением активности нуклеаз в клетках периферической крови.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 6-ом международном конгрессе гинекологов-эндокринологов в Швейцарии (Гран-Монтана, 1998); на 13-ом конгрессе Европейской ассоциации акушеров и гинекологов в Израиле (Иерусалим, 1998); на 7-ом международном конгрессе репродуктивной иммунологии в Индии (Ныо Дели, 1998); на 4-ом международном симпозиуме "Механизмы локального иммунитета" в Хорватии (Опатия, 1998).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 99 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 14 рисунков. Список литературы включает 150 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Характеристика клинического материала.

Материалом исследования являлись ткани эндометрия и мононуклеарные клетки периферической крови человека. Результаты гистологического исследования соскобов эндометрия представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Результаты гистологического исследования соскобоа эндометрия.

№ Состояние эндометрия Количество исследованных образцов

1. Неизмененный эндометрий: 15

1.а. - стадии пролиферации 6

1.6. - стадии секреции 9

2. Железисто-фиброзные полипы эндометрия 13

3. Гиперплазия эндометрия: 43

З.а. - железисто-кистозная 28

3.6. - аденоматозная 15

4. Аденокарцинома эндометрия: 17

4.а. - низкодифференцированная 6

4.6. - умереннодифференцированная 5

4.в. - высокоднфференцированная 6

Методы исследования.

1. Определение активности ядерных СМЭ.

Клеточные ядра выделяли методом градиентного центрифугирования. Для определения активности Ca2VMg2'-зависимых эндонуклеаз очищенные ядра инкубировали в буфере, содержащем 1мМ СаС12 и 10 мМ MgCl2. Степень фрагментации ДНК под действием ядерных Ca2+/Mgz+-3aBncHMbix эндонуклеаз определяли по результатам электрофореза ДНК в 1%-ном агарозном геле. Для этого окрашенные бромистым этидием гели анализировали с использованием системы Gel Doc 1000 и программы Molecular Analyst (Bio Rad, США).

2. Выявление клеток с фрагментированной ДНК in situ.

Количество клеток с фрагментированной ДНК в ткани эндометрия

определяли методом TUNEL (TdT-mediated dUTP-biotin nick end-labeling). Принцип метода основан на присоединении меченных биотином олигонуклеотидов к образующимся в результате действия нуклеаз свободным З'-концам ДНК. Визуализацию специфической биотиновой метки проводили после ее взаимодействия со стрептавидином, конъюгированиьш с пероксидазой хрена. В качестве субстрата пероксидазы хрена использовали диаминобензидин (ДАБ).

Для гистологического исследования ткани эндометрия один из серийных срезов окрашивали гематоксилином и эозином.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Метод определения активности С a2 *7Mg2+-з а в и с имых эндонуклеаз, как критерия способности клеток к программированной клеточной гибели, был предложен в лаборатории проф. Вотрина И.И. Авторами было установлено, что уровень активности Ca2+/Mg2+-3aBHCHMbix эндонуклеаз существенно снижается при некоторых процессах, сопровождающихся патологическим увеличением количества клеток, в частности, при лимфопролиферативных заболеваниях [Соколова и соавт., 1988; Ткачева и соавт., 1990]. В этой связи нами была поставлена задача исследовать активность С a2+/Mg2+- за вис i ш ы х эндонуклеаз при пролиферативных заболеваниях эндометрия человека.

Модификация метода определения активности Ca2f/Mg2+-зависимых эдонуклеаз.

Исследование было выполнено с использованием методического подхода, разработанного в лаборатории проф. Вотрина [Соколова и соавт., 198S; Ткачева и соавт., 1990] и основанного на измерении активности ядерных СМЭ при добавлении ионов Са2+ и Mg к очищенным клеточным ядрам. Активность СМЭ определяли после электрофоретического разделения фрагментов ДНК в агарозном геле. Нами была разработана модификация этого метода для определения активности СМЭ в ткани эндометрия, а также предложен способ количественной обработки результатов с использованием системы Gel Doc 1000 и программы Molecular Analyst (Bio Rad, США).

Были подобраны условия гомогенизации ткани и выделения клеточных ядер методом градиентного центрифугирования; проведена стандартизация количества анализируемых тканей; определено количество клеточных ядер, достаточное для анализа ДНК методом электрофоретического разделения; подобраны оптимальные условия инкубации очищенных клеточных ядер с ионами Са2+ и Mg2+; определены условия и сроки хранения тканей, не приводящие к изменению ферментативной активности.

Активность СМЭ пропорциональна числу разрывов в ДНК, или количеству фрагментов, образующихся из исследуемого количества ДНК. Наибольшая активность фермента приводит к преобладанию на электрофореграмме минимальных продуктов интернуклеосомной деградации ДНК, от мономеров (180-200 п.н.) до тетрамеров. Поэтому в формулу расчета активности фермента было предложено вводить коэффициенты, обратно пропорциональные молекулярной массе фрагментов ДНК и отражающие их относительный вклад в величину эндонуклеазной активности (ЭА).

Для определения эндонуклеазной активности окрашенный бромистым этидием гель сканировали с использованием системы Gel Doc 1000 и

программы Molecular Analyst. На электрофореграмме выделяли три области, включающие фрагменты анализируемой ДНК, в среднем различающиеся по длине в 4 раза (200-800 п.н., 800-3200 п.н., 3200-12800 п.н.) (Рис. 1). Этим областям были присвоены коэффициенты 16, 4, и 1, соответственно. Каждый образец был проанализирован на наличие эндонуклеазной активности, не зависящей от присутствия ионов Са2+ и Mg2\ Для этого аликвоту очищенных клеточных ядер разделяли на две равные части, одну из которых инкубировали в буфере, содержащем ионы Са2+ и Mg , а другую (отрицательный контроль) - в буфере, не содержащем ионов (до начала инкубации в буфер вносили ЭДТА).

1 2 3 4 5

Y4 Х4

т т

YI N

_ к

5а

-1 -1

Рис. 1. Определение активности Ca2+/Mg2+ -зависимых эндонуклеаз. Электрофореграмма ДНК, выделенной из изолированных клеточных ядер. Дорожка 1 -ДНК не нанесена, дорожка 2 - интактная ДНК (без добавления Cai+ и Mg2'*'); дорожки 3 и 4 - ДНК, выделенная го ядер, инкубированных в буфере с 1 мМ Са*\ ЮмМ Mg2+ в течение 90 мин. и в течение 50 мин., соответственно; дорожка 4 - X Hind Ш. (Объяснения в тексте).

Для оценки степени деградации ДНК из суммарной интенсивности свечения заданной области электрофореграммы (на дорожке с ДНК, выделенной из ядер, прединкубированных в буфере с ионами Са2+ и Mg2r) вычитали суммарную интенсивность фонового свечения равной по площади области на дорожке с ДНК, выделенной из ядер, прединкубированных в буфере, не содержащем ионов (отрицательный контроль). Расчет ЭА проводили по формуле:

ЭА= [ 16(X3-Y3)+4(X2-Y2)+-(X1-VI )J/(X4-Y4) относительных единиц (отн. ед.), где XI, Х2 и ХЗ - суммарная интенсивность свечения трех областей электрофореграммы исследуемого образца (3200-12800 пар нуклеотидов, 80-3200 п.н., 200-800 п.н., соответственно); Yl, Y2 и Y3 - суммарная интенсивность свечения соответствующих им областей с интактной ДНК;

Х4 - суммарная интенсивность свечения ДНК во всем образце и Y4 -суммарная интенсивность фонового свечения (Рис. 1).

Оценка активности эндоиуклеаз в неизмененном эндометрии в различные фазы менструального цикла.

Количество клеток с деградированной ДНК и уровень активности Ca27Mg2+-3aBHcmrax эндонуклеаз определяли в неизмененном эндометрии в различные фазы менструального цикла (менструальная стадия, 1й-4й день менструального цикла; стадия пролиферации, 5Й-15Й день; стадии ранней и средней секреции, 16Й-25Й день; стадия поздней секреции, 25Й-28Й день).

При исследовании интенсивности апоптоза в эндометрии in situ было показано, что в слизистой матки стадии пролиферации присутствовали единичные клетки с фрагментированной ДНК, интенсивность окраски варьировала от слабой до умеренной. На стадиях ранней и средней секреции картина окрашивания существенно не изменялась.

В эндометрии поздней стадии секреции были выявлены протяженные участки фокально расположенных вокруг желез стромальных клеток с фрагментированной ДНК. В некоторых участках ткани эндометрия поздней стадии секреции был окрашен весь фокально расположенный вокруг желез слой стромальных клеток, Значительно реже продемонстрировано окрашивание ядер клеток, принадлежащих к функциональному эпителиальному слою. Иногда окрашенные эпителиоциты находились не в слое других эпителиальных клеток, а в просвете железы. В целом в эндометрии поздней стадии секреции было окрашено от 0.5% до 40% ядер расположенных перигландулярно стром&тьных клеток (в среднем на одном срезе 20%). Окрашивание было преимущественно интенсивным.

Таким образом, при развитии инволюционных процессов в эндометрии наблюдается значительное увеличение как количества окрашиваемых клеток, так и интенсивности окрашивания. Тот факт, что в некоторых участках эндометрия стадии поздней секреции были окрашены практически все перигландулярные стромальные клетки, подстилающие железы, позволяет предположить, что железистые клетки отторгаются без запуска в них программы клеточной гибели, посредством изоляции целого слоя железистых клеток от стромы эндометрия слоем мертвых клеток. Отсутствие специфического окрашивания в железистых клетках свидетельствует в пользу того, что отторжение и элиминация этих клеток может происходить без осуществления в них деградации ДНК.

В неизмененной менструальной слизистой количество окрашенных клеточных ядер значительно снижалось (0.5% окрашенных клеток - в железах и 1% клеток - в строме), интенсивность окрашивания варьировала от умеренной до сильной. Наряду с этим значительно возрастало число кластеров окрашенных апоптотических телец, точно оценить количество и локализацию которых не представлялось возможным в связи с их малыми

размерами и гетерогенностью. Представляется интересным, что, несмотря на дальнейшее развитие инволюционных процессов в менструальном эндометрии, количество окрашенных клеток в ткани менструального эндометрия сильно сокращается по сравнению с поздней стадией секреции. По-видимому, это связано с интенсивным процессом отторжения, деградации и элиминации апоптотических клеток.

В связи с тем, что по данным литературы [Hopwood and Levison, 1976; Gompel et al., 1994] и по полученным нами in situ данным интенсивность апоггготического процесса в эндометрии меняется в течение менструального цикла, была проведена оценка зависимости величины активности СМЭ от фазы цикла, установленной при гистологическом анализе. В большинстве образцов неизмененного эндометрия добавление ионов Са2+ и Mg2+ к клеточным ядрам приводило к образованию олигонуклеосомных фрагментов ДНК (Рис. 2, дорожки 1, 2).

123 456 789 10

Рис. 2. Уровень эндонуклеазной активности в клетках эндометрия человека (электрофореграмма ДНК в 1%-ном агарозном геле)

Дорожки 1, 2, 3 - неизмененный эндометрий; А, 5,6- гиперплазия эндометрия; 7, 8, 9 - аденокарцинома эндометрия; дорожка 10 - стандарт молекулярных масс ДНК - X Нт<1Ш. Дорожки 1, 4, 7 дорожки 2, 5, 8 - ДНК, выделенная из ядер, прединкубированных в буфере с 1мМ Са2+, ЮмМ в течение 90 мин. и в течение 50 мин., соответственно; дорожки 3,6,9 - интактная ДНК (без добавления Са2+ и Мд2+).

Активность фермента(ов) в ткани неизмененного эндометрия составила 1.09±0.12 отн. ед. (п=15). Различия между величинами активности в различные фазы цикла были недостоверны, ЭА составила 1.03+0.16 отн. ед. в эндометрии стадии пролиферации (дни 4-16, п=6) и 1.17±0.19 отн. ед. в эндометрии поздней стадии секреции (дни 25-28, п=9). (Рис, 3).

В стадия пролиферации !

стадия поздней!) секреции

Рис. 3. Уровень активности СМЭ в ткани неизмененного эндометрия стадии пролиферации (п=б) и стадии поздней секреции (п=9).

Таким образом, несмотря на значительные отличия количества клеток с деградированной ДНК в различные фазы менструального цикла (от 0.05% в эндометрии стадии пролиферации до 20% в эндометрии поздней стадии секреции), нами не обнаружено зависимости величины эндонуклеазной активности в ткани эндометрия от фазы менструального цикла. Вероятно, уровень ЭА в ткани не соответствует количеству находящихся на данный момент в состоянии апоптоза клеток, а характеризует потенциальную способность клеток эндометрия активировать суицидную программу в ответ на физиологические стимулы, что и происходит в течение менструального цикла. По-видимому, в клетках неизмененного эндометрия заложен потенциально высокий уровень эндонуклеазной активости, реализуемый в большей или меньшей степени в зависимости от интенсивности апоптоза на данной стадии цикла.

Отсутствие изменений активности СМЭ в течение менструального цикла позволяет в дальнейшем анализировать данный параметр в ткании эндометрия независимо от фазы цикла.

Оценка активности эндонуклеаз при различных гиперпластических и неопластических состояниях эндометрия.

Гиперпластические процессы эндометрия, по-видимому, могут быть связаны как с увеличением пролиферации, так и с неспособностью клеток запускать программу гибели. Гиперпластические процессы эндометрия в ряде случаев являются предвестником аденокарциномы. В этой связи была поставлена задача исследовать количество апоптотических клеток и уровень активности Са^/М^-зависимых эндонуклеаз в ткани эндометрия с выраженными в различной степени гиперпластическими и неопластическими процессами.

При исследовании количества клеток с фрагментированной ДНК ш situ было показано, что интенсивность апоптоза в ткани железисто-фиброзных полипов эндометрия (п=3) и в неизмененном эндометрии соответствующей стадий менструального цикла практически не различается. В образцах гиперпластического эндометрия (п=3) было окрашено около 0.3% клеток желез и не более 0.05% клеток стромы. Окрашенные клетки были обнаружены приблизительно в 15% гиперплазированных желез, причем некоторые железы содержали до 5 окрашенных эпителиальных клеток. Интенсивность окрашивания варьировала от слабой до умеренной.

В образцах аденокарциномы эндометрия (п=3) обнаруживались единичные окрашенные по методу TUNEL железистые клетки (приблизительно 0.05%) и стромальные (приблизительно 0.01%), а также скопления апоптотических телец с умеренной интенсивностью окраски.

На основании полученных in situ данных можно сделать заключение об интенсивности процесса апоптоза в неизмененном, гиперпластическом и неопластическом эндометрии. Если в неизмененном эндометрии в различные фазы менструального цикла количество окрашенных апоптотических клеток варьировало от 0.05% в ткани эндометрия стадии пролиферации до 20% в ткани эндометрия поздней стадии секреции, то при гиперпластических и неопластических изменениях в эндометрии количество апоптотических клеток изменяется в более узких пределах (от 0.05 до 0.3%). Так, например, количество окрашенных клеток в неизмененном эндометрии стадии пролиферации и в тканях аденокарциномы практически не различается. Из представленных данных следует, что количество апоптотических клеток с фрагментированной ДНК при гиперпластических и неопластических изменениях эндометрия, по-видимому, не является специфическим критерием оценки рассматриваемых патологий.

Результаты определения активности Са2+/Г^2+-зависимых эндонуклеаз при различных гиперпластических и неопластических изменениях эндометрия представлены на рисунке 4.

Незначительное снижение активности СМЭ по сравнению с нормой имело место в ткани железисто-фиброзных полипов эндометрия (0.90+0.10 отн. ед.) (п=13), хотя отличие величин эндонуклеазной активности в ткани неизмененного эндометрия и в ткани железисто-фиброзных полипов эндометрия не было достоверным.

При гиперпластических изменениях эндометрия наблюдалось существенное снижение активности СМЭ (0.4110.04 отн. ед.) (п=43) по сравнению с активностью фермента(ов) в неизмененном эндометрии (Рис. 4).

Рис. 4. Уровень активности Са2<ТМв2*-зависимых эндонуклеаз (отн. ед.) в неизмененном эндометрии (п= 15), в железисто-фиброзных полипах эндометрия (п=13), в гиперпластическом (п=43), и неопластическом эндометрии (п=17).

В образцах аденокарциномы эндометрия активность СМЭ была минимальна (0.20±0.05 отн. ед.) (п=17). Различия в эндонуклеазной активности были достоверными между всеми четырьмя группами («неизмененный эндометрий», «полипы эндометрия», «гиперплазия эндометрия», «аденокарцинома эндометрия») при их попарном сравнении (р<0.05), за исключением пары «полипы эндометрия: неизмененный эндометрий» (Рис. 4).

Полученные данные относительно активности СМЭ в патологически измененном эндометрии, по всей видимости, свидетельствуют о нарушении молекулярных механизмов реализации апоптоза уже при наличии гиперпластических изменений. Снижение уровня активности Ca27Mg2+-зависимых эндонуклеаз может приводить к выживанию клеток с измененным генетическим аппаратом, которые в норме удаляются путем апоптоза. Это, в свою очередь, ведет к быстрому накоплению дефектных клеток в результате неконтролируемой пролиферации.

Минимальная активность СМЭ, выявленная при аденокарциноме эндометрия, может свидетельствовать об устойчивости раковых клеток к программированной гибели, что согласуется с представлением о том, что клетки большинства опухолей обладают пониженной способностью запускать механизмы собственной клеточной гибели [Bellamy et al., 1995].

Из представленных данных следует, что, хотя количество апоптотических клеток в гиперпластическом и неопластическом эндометрии не уменылаетя по сравнению с неизмененным эндометрием

стадии пролиферации, уровень активности СМЭ в ткани гиперпластического эндометрия значительно снижается по сравнению с нормальной тканью. Это может свидетельствовать о нарушении потенциальной способности клеток к самоуничтожению при воздействии физиологических стимулов, запускающих апоптоз. Наблюдаемое при патологических процессах в эндометрии снижение активности СМЭ, по-видимому, свидетельствует именно о нарушении процесса апоптоза, а не о снижении его интенсивности, которая в норме варьирует в широких пределах.

По современным представлениям, роль железистой и железисто-кистозной гиперплазии (ЖКГ) в патогенезе опухолей является спорной, тогда как атипическая гиперплазия эндометрия (АГЭ) рассматривается как предраковое состояние [Кигтап е! а1., 1985]. В этой связи при анализе эндонуклеазной активности выборка образцов гиперпластического эндометрия была разделена на две подгруппы - с железистыми и железисто-кистозными и с аденоматозными гиперпластическими изменениями.

Величина активности СМЭ при железистой и железисто-кистозной гиперплазии эндометрия составила 0.45+0.06 отн. ед. (п=28), а при аденоматозной - 0.32+0.06 отн. ед. (п=15), однако обнаруженное отличие не было достоверным.

На рисунке 5 представлены данные изменения активности СМЭ в зависимости от степени дифференцированное™ аденокарциномы эндометрия.

0,6

I

£3 ВЫСОКО-

дифференцировашда □ умеренно-

дифференцированная щ низко-дифференцированная

Рис. 5. Уровень активности Са 7Mg Зависимых эндонуклеаз в образцах аденокарциномы эндометрия в зависимости от гистологической дифференцированное™ опухоли.

Величина активности СМЭ составила: 0.39±0.10 отн. ед. (п=6) при высоко-дифференцированной, 0.12±0.05 отн. ед. (п=5) при умеренно-дифференцированной и 0.09±0.0б отн. ед. (п=6) при низко-дифференцированной аденокарциноме (различия были достоверны при попарном сравнении выборок, за исключением выборок умереннодиф-ференцированная: низкодифференцированная аденокарцинома).

Тенденция к снижению активности Саг7М§2+-зависимых эндонуклеаз по мере уменьшения гистологической дифференцированности аденокарцином, вероятно, свидетельствует о взаимосвязи активности СМЭ с прогрессией опухоли.

Частота встречаемости образцов с различным уровнем активности Ca2+/Mg2+-зaвиcимыx эндонуклеаз в зависимости от патологического процесса в эндометрии представлена в таблице 2.

Таблица 2.

Частота встречаемости образцов с различным уровнем активности СМЭ в зависимости от патологического процесса в эндометрии._

Активность СМЭ (отн. ед.) Патология эндометрия

Норма <п=15) Полипы (п-13) ЖКГ (п=28) АГЭ (п=15) Аденокарцинома (п=17)

Высокая (ЭА>0.8) И (73.4%) 9 (69%) 3 (10.7%) - -

Средняя (0.4<ЭА<0.8) 4 (26.6%) 3 (23%) 14 (50%) 5 (33.3%) 2 (11.8%)

Низкая (0.1<ЭА<0.4) • 1 (8%) 7 (25%) 8 (53.4%) 9 (52.9%)

Практически отсутствует (ЭА<0.1) 4 (14.3%) 2 (13.3%) 6 (35.3%)

Для характристики образцов эндометрия были введены условные понятия «низкой» (от 0.1 до 0.4 отн. ед.), «средней» (от 0.4 до 0.8 отн. ед.) и «высокой» (более 0.8 отн. ед.) эндонуклеазной активности. Высокая эндонуклеазная активность определялась в И из 15 (73.4%) образцов неизмененного эндометрия, в 9 из 13 (69%) образцов железисто-фиброзных полипов эндометрия и лишь в 3 из 43 (7%) образцов гиперпластического эндометрия. Низкая эндонуклеазная активность не обнаружена ни в одном образце неизмененного эндометрия, тогда как в образцах аденокарциномы эндометрия ЭА преимущественно была низкой (9 из 17 образцов, 52.9%) или практически отсутствовала (6 из 17 образцов, 35.3%). Если среднюю активность Ca2+/Mg +-зависимых эндонуклеаз детектировали при всех исследованных состояниях эндометрия, а именно в 4 из 15 (26.6%) образцов неизмененного эндометрия, в 3 из 13 (23%) полипов эндометрия, в 14 из 28

(50%) железисто-кистозной гиперплазии, в 5 из 15 (33.3%) аденоматозной гиперплазии эндометрия и только в 2 из 17 (11.8%) случаях аденокарциномы, то высокая активность фермента отсутствовала в гиперпластическом эндометрии и при аденокарциномах, а низкая - в неизмененном эндометрии. Таким образом, доля образцов эндометрия с низкой активностью СМЭ увеличивается с усилением патологических процессов в нем. Следует отметить, что распределение образцов эндометрия по активности СМЭ в группах неизмененного эндометрия и полипов эндометрия очень сходно, тогда как распределение образцов в зависимости от уровня активности СМЭ в группе аденокарциномы эндометрия существенно отлетается от всех остальных групп (Таблица 2). При аденокарциноме эндометрия в большинстве образцов ткани (52.9%) была детектирована низкая активность Ca2+/Mg +-зависимых эндонуклеаз, примерно в трети (35.3%) образцов аденокарциномы активность СМЭ была настолько низкой, что не выявлялась с помощью электрофоретического метода, тогда как высокая активность фермента не была выявлена ни при одном случае аденокарциномы. В образцах гиперпластического эндометрия был детектирован весь диапазон активности СМЭ, однако высокий уровень активности был характерен лишь для 10.7% случаев, причем все образцы гиперпластического эндометрия с высокой активностью СМЭ были железисто-кистознымми. Ткани аденоматозной гиперплазии характеризуются в целом более низким средним значением активности СМЭ и большим количеством образцов с низкой активностью СМЭ по сравнению с тканями железисто-кистозной гиперплазии. (Таблица 2).

Оценка активности СМЭ в мопонуклеарных клетках периферической крови.

Была поставлена задача проанализировать уровень активности СМЭ в мононуклеарных клетках периферической крови в зависимости от состояния эндометрия. Такая постановка задачи была связана с поиском неинвазивного метода исследования. Результаты определения уровня активности СМЭ в периферической крови пациенток с неизмененным, гиперпластическим и неопластическим эндометрием представлены на рисунке 6.

2,5 -г

Ннорма ;

Ипалипы |

□гиперплазия | Ш аденокарцинома |

Рис. 6. Уровень активности Са2'/М§2* -зависимых эндонуклеаз (отн. ед.) в мононуклеарных клетках периферической крови пациенток с неизмененным эндометрием (п=15), полипами эндометрия (п=13), гиперплазией эндометрия (п=43) и аденокарциномой эндометрия.

Величина активности Са2+/М|2+-зависимых эндонуклеаз в мононуклеарных клетках периферической крови при отсутствии патологических процессов в эндометрии составила 1.20Ю.19 отн. ед. (п=15), при полипах эндометрия - 1.22+0.19 отн. ед. (п=13), при гиперплазии эндометрия - 1.610.35 отн. ед. (п=43), при аденокарциноме - 1.08+0.22 отн. ед. (п=17). Различия величин активности фермента в клетках крови при исследованных патологиях эндометрия не были достоверны. По полученным нами данным, взаимосвязь между величиной активности -зависимых эндонуклеаз в периферической крови и патологическими процессами, протекающими на локальном уровне в эндометрии, не обнаружена. Вероятно, снижение активности эндонуклеаз при изменении баланса процессов клеточной пролиферации и гибели наблюдается только 'в тех тканях, в которых происходит нарушение координации этих процессов. Действительно, снижение активности Са2+/Мя2+-зависимых эндонуклеаз в периферической крови характерно для лимфопролиферативных заболеваний [Соколова и соавт., 1988; Ткачева и соавт., 1990]. Таким образом, эндонуклеазная активность, по-видимому, может являться маркером процесса программированной клеточной гибели только на локальном уровне.

ОБСУЖДЕНИЕ

На основании полученных нами данных относительно количества клеток с деградированной ДНК и активности СМЭ при различных патологических состояниях эндометрия, а также данных литературы, можно провести сравнительный анализ информативности различных биохимических маркеров апоптоза для оценки способности клеток эндометрия к программированной гибели.

Гиперэкспрессия наиболее изученного ингибитора апоптоза Вс1-2 может служить надежным маркером блокирования запрограммированной клеточной гибели. В первую очередь это связано с тем, что Вс1-2 продуцируется клетками нормального эндометрия с интенсивностью, контролируемой гормонами - регуляторами менструального цикла, а также с существованием Вс1-2-независимого пути регуляции апоптоза [Chan et al., 1995; Hale et al., 1996].

Детекция мутаций или гиперэкспрессии р53 также не может служить надежным прогностическим фактором развития неопластической трансформации, поскольку не показана его роль в гиперпластических процессах [Kohler et al., 1993; Eissa et al., 1997].

Наиболее распространенным критерием процесса апоптоза является интенсивность межнуклеосомного расщепления ДНК, которую оценивают либо in situ методом TUNEL, либо электрофоретически, после экстракции ДНК из исследуемого образца. Из представленных данных следует, что детекция клеток с фрагментированной ДНК методом TUNEL практически не позволяет различить интенсивность апоптоза в образцах нормального эндометрия стадии пролиферации и аденокарциномы эндометрия. В то же время, характер окрашивания клеток в нормальном эндометрии на различных стадиях менструального цикла значительно варьирует, что делает невозможным использование образцов нормального эндометрия в качестве контроля. Отсутствие контроля, в свою очередь, затрудняет оценку риска развития рака у пациентов с диагнозом «гиперплазия эндометрия». Таким образом, определение количества клеток с деградированной ДНК in situ, вероятно, не имеет прогностической значимости при оценке патологических состояний эндометрия.

Уровень активности Ca27Mg2+-3aBnciiMbix эндонуклеаз, напротив, не зависит от фазы менструального цикла, в то время как при гиперпластических и неопластических изменениях эндометрия происходит достоверное снижение активности СМЭ. В этой связи, измерение активности Са2+/М§2+-зависимых эндонуклеаз, по-видимому, является наиболее информативным подходом к оценке потенциальной способности клеток эндометрия активировать программу клеточной гибели.

Своевременное выявление снижения активности данного маркера нарушения процесса программированной клеточной гибели позволяет еще

на предраковой стадии заболевания принять своевременные терапевтические меры, направленные на предотвращение развития малигнизации.

В целом исследование взаимосвязи процессов, вовлеченных в апоптоз, пролиферацию и дифференцировку клеток, идентификация морфологических и биохимических маркеров апоптоза способствуют более глубокому пониманию механизмов патогенеза многих патологий, связанных с нарушением этих процессов.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод определения активности ядерных Са2+/Мц2+-зависимых эндонуклеаз в эндометрии.

2. В ткани эндометрия не выявлено зависимости активности Ca2+/Mg2+-зaвиcимыx эндонуклеаз от стадии менструального цикла.

3. Гиперплазия эндометрия сопровождается снижением активности Са2+/'М£21 -зависимых эндонуклеаз. Уровень активности Са2+/К^2+-зависимых эндонуклеаз в эндометрии уменьшается в ряду: неизмененный эндометрий - гиперпластический эндометрий -аденокарцинома эндометрия.

4. Активность Са2+/К^2+-зависимых эндонуклеаз снижается по мере уменьшения степени дифференцировки аденокарцином.

5. Уровень активности -зависимых эндонуклеаз в периферической крови, по-видимому, не коррелирует с выраженностью гиперпластических процессов в эндометрии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Колобова Е.А., Жданов А.В., Варламов Д.А., Демеентьева М.М., Чернуха Г.Е., Файзуллин Л.З., Табакман Ю.Ю., Иванова А.Е., Сухих Г.Т. (1999) Потенциальный уровень активности Ca2+/Mg2+- зависимои эндонуклеазы при гиперпластических процессах и раке эндометрия. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 127, 683-687.

2. Колобова Е.А., Жданов А.В., Варламов Д.А., Файзуллин JI.3., Гречко Г.К., Блидченко Ю.А., Дементьева М.М., Наумкина Н.К., Сухих Г.Т. (1998) Оценка активности Са27Мс2+-зависимой эндонуклеазы в эмбриональных тканях человека. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. Приложение 1,126, 138-140.

3. Dementieva М.М., Smetnic V.P., Tchernucha G.E., Kolobova E.A., Varlamov D.A., Zhdanov A.V., Sdvizhkov A.M., Tabakman JuJu., Ivanov A.E., Serov V.N., Sukhikh G.T. Apoptosis: Ca/Mg-dependent endonuclease activity in human endometrium. 13-th congress of the European association of gyanecologists and obstetricians (EAGO). Israel. May 10-14,1998.

4. Kolobova E.A., Zdanov A.V., Varlamov D.A., Grechko G.K., Blidchenko Y.A., Sukhikh G.T. The Ca^/Mg^-dcpendent endonuclease activity in human fetal tissues. Fourth international meeting "Mechanisms in local immunity". Croatia, 1998, W 5-8.

5. Kolobova E.A., Varlamov D.A., Zhdanov A.V., Faizullin L.Z., Dementieva M.M., Tchernucha G.E., Sukhikh G.T. The quantitation of Ca2+/Mg2+ -dependent endonuclease activity in T-lymphocytic leukemia cell line, endometrial hyperplasia and neoplasia. 13-th congress of the European association of gyanecologists and obstetricians (EAGO). Israel. May 10-14, 1998.

6. Dementieva M.M., Smetnic V.P., Tchernucha G.E., Kolobova E.A., Serov V.N., Sukhikh G.T. (1998) Apoptosis in human endometrial hyperplasia. 6-th World Congress of Gynecological Endocrinology, Vol.12, Supplement number 2, 40.

7. Kolobova E.A., Dementieva M.M., Smetnic V.P., Tchernucha G.E., Serov V.N., Sukhikh G.T. (1998) Ca2+/Mg2+-dependent endonuclease activity in human endometrial hyperplasia and adenocarcinoma. 6-th World Congress of Gynecological Endocrinology, Vol.12, Supplement number 2, 27.

8. Sukhikh G.T., Dementieva M.M., Kolobova E.A., Zhdanov A.V., Varlamov D.A., Tchernucha G.E., Faizullin L.Z. (1998) The nuclear Ca++/Mg++-dependent endonuclease activity as a prognostic factor in human endometrium. American Journal of Reproductive Immunology 40,270.

Список сокращений:

СМЭ - Ca2+/Mg2+-3aBHcHMbie эндонуклеазы

ЭА - эндонуклеазная активность

TUNEL - TdT-mediated dUTP-biotin nick end-labeling

Отпечатано в отделе оперативной печати Геологического ф-та МГУ

Типом. 1 О-----