Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

О функционировании Na+/Ca2+ - обменника в клетках растений

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "О функционировании Na+/Ca2+ - обменника в клетках растений"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК КАЗАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ КНЦ РАН

КОРЧУГАНОВА Екатерина Евгеньевна

О ФУНКЦИОНИРОВАНИИ Ма+/Са2+ - ОБМЕННИКА В КЛЕТКАХ РАСТЕНИЙ

03.00.12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

УДК 581.1:632.122.1

КАЗАНЬ - 1996

Работа выполнена в Казанском институте биологии КНЦ РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Каримова Ф.Г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Зялалов A.A.

кандидат биологических наук Пахомова В.М.

Ведущая организация: Казанская государственная

сельскохозяйственная академия

Защита состоится " июня 1996г. в " час.

н

на заседании специализированного Совета К 002.16.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Казанском институте биологии КНЦ РАН по адресу: 420503, Казань, а/я 30.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского института биологии КНЦ РАН.

Автореферат разослан "2-Ь

и

1996г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук

Б.Л.Лосева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из мощнейших механизмов удаления основного количества свободных ионов кальция (Са2+) из клеток животных после возбуждения является Ыа+/Са2+-обменник (Schatzmann, 1985). На+/Са2+-обменник представляет собой белок- переносчик, обменивающий кальций на натрий. Мощность этого переносчика очень велика, однако он имеет невысокое сродство к Са2+. На+/Са2+-обменник, не обладая собственным механизмом энергообеспечения, частично использует энергию концентрационного градиента Na+, однако основная часть энергии поставляется за счет трансмембранной разности потенциалов, существующей на плазматической мембране клеток. Na+/Ca2+-обмен является электрогенной системой: один ион кальция обменивается на- три иона натрия (Schatzrnann, 1995). Ряд исследователей установили, что Ыа+/Са2+-обменник может обеспечивать как выброс Са2+ в межклеточное пространство, так и его поглощение в зависимости от соотношения градиентов Na+ и Са2+. Клетки аккумулируют Са2+, когда через мембрану создается направленный наружу градиент ионов натрия. Причем, поглощение Са2+ зависит от величины трансмембранного градиента Na+, то есть увеличение внутриклеточной концентрации Na+ заметно стимулирует поглощение Са2+, в то время, как увеличение внеклеточной концентрации Na+ сильно его ингибирует (Ueda, 1983; Cheon, Reeves, 1988).

Данные о функционировании На+/Са2+-обменника в мембранах растительных югеток в имеющейся на сегодня литературе отсутствуют. Показано,, однако, что градиент Na+ на плазмалемме растительных клеток может быть очень высоким (Tazawa et al., 1974). Можно полагать, что у растений-галофитов для защиты цитоплазмы от засоления может служить Na+/H+-антипорт (Балнокин, 1995), Na+-ATd>asa (Shonoetal., 1995), Na+/K+-AT<3E>aaa плазмалеммы (Гордон, 1976; Палладина, 1983). В то же время, высокое содержание Na+ в клетках галофитов (Bental et al., 1988; Балнокин, 1995), очевидно, предусматривает механизм регуляции внутриклеточной концентрации Ыа+, не сопряженный с большой затратой энергии АТФ. Имеющиеся в литературе данные о зависимости транспорта Са2+ и его содержания в клетках растений от наличия в питательной среде Na+ (Cramer et

al., 1985; Maton et al., 1986; Петрог-Спиридонов, Ионева, 1987 не исключают возможности функционирования Na+/Ca2+ -обменника мембранах растительных клеток. Каримовой с сотр. (1989) был пока ван противоположно направленный транспорт Са+ и Na+ в клетка корней бобов, выращенных на среде без Са2+, при его замене на Na+ Авторами было зарегистрировано влияние экзогенного АТФ на обме Са2+ и Na+ в корнях бобов (Каримова и др., 1989; 1991). Активаци Na+/Ca2+-обмена посредством АТФ была показана еще в 1974 г. DiPo 1о и Beauge на нервных клетках. Их дальнейшие исследования свиде тельствовали об активации Ма+/Са2+-обмена Са2+- кальмодулинзави симым фосфорилированием переносчика (Dipolo, Beauge, 1987). Сага foli (1984) было показано, что полностью активированный с помощь Са2+-зависимого фосфорилирования №+/Са2+-переносчик сарколемм имеет значительно большее сродство к Са2+, чем нефосфорилирован ный.

Таким образом, исходя из данных литературы о зависимост транспорта Са2+ в клетках растений от содержания Na+ во внешне среде и концепции об универсальности молекулярных механизмов ре гуляции клеточной активности (Тарчевский, 1993), можно предполо жить функционирование Ма+/Са2+-обменника в клетках растений. Не обходимость осуществления глубоких исследований в этой облает очевидна,' также потому, что Са2+ является вторичным посреднико регуляции метаболизма (Rasmussen, 1982, 1984).

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы- изучит противоположно направленный трансыембранный перенос Na+ и Са2+ клетках водорослей и механизмы его регуляции, соответствующи критериям активности Иа+/Са2+-обменной системы.

При проведении исследований были поставлены следующие задач

1. Выявить взаимосвязь потоков Са2+ и Na+ в клетках водорос лей: установить влияние величины и направления трансмембранног градиента На+ на величину и направление транспорта Са2+ и Na+ клетках галотолерантных водорослей.

2. Исследовать влияние состава среды инкубирования клето водорослей на противоположно направленный трансмембранный перено Са2+ и Na+.

3. Выявить возможный вклад в потоки Са2+ и Na+ через плазма лемму клеток галофитов Са2+-каналов, протонтранспортирующих сис

тем, Ма+/К+-АТФазы.

4. Изучить возможность регуляции Na+/Ca2+-обмена посредством цАМФ и А ТФ.

5. Сравнить основные характеристики противоположно направленного транспорта Са2+ и Na+ в клетках водорослей различной толерантности к засолению.

Научная новизна. В результате выполненных исследований впервые бы* показан противоположно направленный транспорт Са2+ и Na+ в условиях лрансмембранного градиента Na+, направленного из клетки во внешнюю среду, для зеленых одноклеточных водорослей различной степени толерантности к засолению.

Была показана зависимость направления и величины обмена Са2+ на Na+ от направления и величины трансмембранного градиента Na+, определены соотношения величин транспортируемых Са2+ и Na+ в различных экспериментальных условиях, произведены расчеты скоростей переноса этих ионов за различные промежутки времени для экстремального и морского галофита, вычислены Км(Са2+). Обнаружено влияние ионного состава среды на транспорт Са2+, Na+, К+, Н+ в клетках D.maritima. Двухвалентные катионы (Ва2+, Мп2+) ингиби-ровали противоположно направленный транспорт Са2+ и Na+. В подобранных нами экспериментальных условиях блокаторы Са2+-каналов и ингибиторы Н+-АТФазы не оказывали значительного влияния на пере-■нос Са2+ и Na+. Ингибитор На+/К+-АТФазы оубаин частично подавлял еыход Na+ из клеток D.maritima. Показана регуляция противонаправленного трансмембранного переноса Са2+ и Na+ посредством Са2+-завис-имого фосфорилирования. Полученные нами данные укладываются в рамки критериев функционирования в плазматичэских мембранах водорослей На+/Са2+-обменника( свойства которого изучены на клетках животных.

I тактическая значимость. Представленная работа приводит весомые доказательства в пользу функционирования в плазмалемме клеток растений NaVCa2+-обменника, который в клетках животных является мощнейшей системой удаления Са2+ иа цитозоля. Результаты исследования не только расширяют мания относительно регуляции Са?л- гомеостаза растительных клеток, но и предполагают возможный вклад Na+/Caz+-o6MeHoü системы в механизмы адаптации галотоле-рантных растений к условиям повышенной засоленности.

Полученные результаты могут быть рекомендованы для включения в лекционные курсы по физиологии и биохимии растений.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на IX Конгрессе FESPP (Прага,1994), 11 Республиканской конференции "Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан" (Казань, 1995), на Ежегодном симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений" (Пущино, 1996), на отчетных конференциях Института биологии КНД РАН (1995, 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, 1 находится в печати.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов. Работа изложена на/^ страницах машинописного текста, содержит*^ рисунков,таблиц, список цитируемой литературы включает /¿^наименований, из них - на иностранных языках.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили культуры одноклеточных микроводорослей разной толерантности к засолению: Chlamydomonas rein-hardtii CW-15 (пресноводная водоросль), Dunaliella maritima (морской галофит), Dunaliella salina (экстремальный галофит) из коллекции Института физиологии растений им. Тимирязева К.А., любезно предоставленные нам Ы.Г.Владимировой. Клетки этих водорослей не имеют клеточной стенки, что позволяет избежать трудностей в учете транспортируемых ионов кальция.

Галотолерантные водоросли рода Dunaliella способны развиваться в высококонцентрированных солевых растворах (0,5-4 NaCL), накапливая внутри клетки значительные количества Na+ (Bental et al., 1988). Это свойство делает водоросли рода Dunaliellé удобным объектом для исследования влияния градиента ионов натрия на транспорт ионов кальция через плазмалемму. Балнокин (1995) указывает на то, что при отсутствии в клетках галотолерантны> ыикроводоросдей крупной центральной вакуоли основная нагрузка i ионном гомеостатировании цитоплазмы ложится на плазмалемму.

Культуры выращивались в стерильных условиях при температур«

26°С и при освещении белыми флюоресцентными лампами 10 тыс. люкс. В опыты брались клетки в линейной фазе роста. Количество клеток в опыте - 10б в 1 мл среды.

Для выращивания водорослей Ch.reinhardti i CW-15 использовали среду Владимировой, Маркеловой (1980): NH4CI 4,67 шМ, MgS04 0,83 mM, Mgcla 0,52 mM, Сайг 0,45 гпМ (количество CaClg в вариантах варьировалось), трис-НС1 13,56 гпМ, pH среды 6,9, а для Dunaliella - среды Абдуллаева, Семененко (1974); для клеток D.maritima: 500 mM NaCl, 5 mM КН2РО4, 0,75 mM Ca(N03)2, 6 mM MgS04, 0,125 шМ Fe-ЭДТА, микроэлементы, трис-HCL 50 mM, pH среды 7,2; для клеток D.salina: 2000 mM NaCL, 25 шМ КШэ, 1,5 rnM КН2РО4, 0,42 шМ MgSÜ4, 12 mM NaHC03, 11,6 мкМ железо-аммонийные квасцы, pH среды 7,5.

Для создания направленного из клетки во внешнюю среду трансмембранного градиента ионов натрия клетки D.maritima и D.salina помещались в минимальную среду, содержащую соли в микромолярних концентрациях, где молярность поддерживалась глицеролом. Исследования Bental et.al.(1988) показали, что замещение Na* во внешней среде глицеролом не влияет на уровень внутриклеточных Na+. Минимальная среда для D.maritima содержала: 0,125 ШМ NaCL, 0,25 мкМ КН2РО4, 0,04 мкМ Ca(N0)2, 0,30 мкМ MgS04, 0,006 мкМ Fe-ЭДТА, 50тлМ трис-НШз (pH 7,2); для D.salina: 0,1 mM NaCL, 20 мкМ MgS04, 1мкМ KNO3, 0,075 мкМ К2НРО4, 0,6 нМ железо-аммонийные квасцы, трис-HCL (pH 7,5). Клетки Ch.reinhardtii CW-15 нагружались Na+ инкубированием в течение 45 мин. с моненсином (5 мкМ) и NaCl (50 mM). Среды заменялись центрифугированием в мягких условиях (2000g в течение 2-4 мин.), интактность клеток после центрифугирования контролировалась микроскопически. Опыт начинали о момента замены среды выращивания на среду без Na+;

: :оглощение Са2+ клетками водорослей определяли о помощью изотопа 45Са2+ (0.67 мкКи/мл) с применением LaCl3 для отмывания клеток после опыта от внешнего Са2+ (Van Breemen et al.,1977). Реакцию начинали помещением клеток в инкубационные среды о 45Са (Naint> Naext) и проводили при комнатной температуре; останавливали фильтрованием через предварительно омоченные фильтры "Влади-пор" (диаметр пор 0.4 мкм) под давлением. Затем фильтры промывались холодной средой с LaCl? Ji.5тМ) и-высушивались, их радиоак-

тивность определялась в сцинтилляторе (ЖС-8). Количество поглощенных Са2+ клетками водорослей выражали в нМ на мг белка в минуту. Белок определяли по ижгу е1 а1. (1951). В каждом варианте был контроль на неспецифическое связывание 45Са2+.

Эндогенное количество Ыа+ в клетках Еодорослей определяли после сжигания их в смеси кислот (азотной и хлорной) на пламенном фотометре ШМ-4 А (ГДР). О выходе (или входе) Ма+ из клеток судили по анализу внеклеточных растворов до-и после опыта на пламенном фотометре ПФМ-4 А. Количество транспортированных рассчитывали е нМ на мг белка в минуту.

Протеинкиназную активность определяли по методу К1ккаиа с сотр. (1983) с модификациями (Каримова и др.,1991). Реакционная среда объемом 100 мкл содержала: 50 мМ Р1РЕЗ-буфер рН 6,5; 5 МгСЛг; 1 мМ ДТТ; О.5 мМ АТФ; Сг-Э2РЗ-АТФ (500 - 800 тыс. имп. мин.-1); 50 мкг белка. Радиактивность просчитывали в толуольноы сцинтилляторе (ЖС-1). Удельную протеинкиназную активность выражали в нмоль 32Р/мг белка в мин. Проводился контроль на неспецифическое связывание ?2Р на фильтрах.

Са2+-АТФазная активность определялась по количеству неорганического фосфора, отщепляемого от АТФ при его гидролизе в течение 15 мин. при 34°С (Скулачев, .1960). Реакционная среда объемом 1 мл содержала: 50 мМ трис-НС1 рН 7,5; 1 мМ СаС12; 1,5 мМ АТФ; 50 мкМ МеС1г; 50 мкг белка. Са2+-АТФазная активность выражалась в мкМ неорганического фосфора на мг белка за мин. В каждом варианте был контроль на неферментативный распад АТФ.

Эксперименты проводились в трёх биологических повторностях от 3 до 7 раз. В таблицах и рисунках приведены средние арифметические значения и средние квадратичные ошибки.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЗДЕНИЕ

3.1. Противоположно направленный трансмембранный перенос

Саг+ и Ыа+ в клетках водорослей различной толерантности и

гасолению.

Одним из критериев функционирования Иа+/Са2+-обменника является соотношение транспортируемых ионов кальция к натрию. Не клетках животных показано, что один ион кальция обменивается не

Рис. 1. Временная зависимость противоположно направленного транспорта Caz+ (А) и Na"1" (В) в клетках D.maritima в минимальной среде инкубации при Na^Naext:

по оси абсцисс - время, шш.;

по оси ординат - А - поглощение Са2+, нМ/мг белка;

Б - выход Na+, нМ/мг белка.

Рис. 2. Временна1? зависимость противоположно направленного транспорта Са2+ (А) и Na+ (Б) в клетках D.salina в минимальной среде инкубации при Nain>Naext:

по оси абсцисс - время, мин.;

по оси ординат - А - поглощение Са2+, нМ/мг белка;

Б - выход Na+, нМ/мг белка.

3-4 иона натрия (Schatzmann, 1985). В наших экспериментах соотношение транспортируемых Са2+: Na+, равное 1:3, было зафиксировано для D.maritima при инкубировании клеток водоросли в минимальной среде в течение 15 сек.(рис.1). Соотношение 1Са2+: 4Na+ было получено для D.salina и D.maritima за 30 сек. инкубации (рис.1,2). Из графиков (рис.1, 2) видно, что максимальная величина обмена Са2+ на Na+ клетками обоих видов водорослей достигалась за 3 мин. инкубации, однако соотношение Са2+: Na+ было равно 1:2. Согласно предположению Caroni и Carafoli (1981), основная нагрузка в начальный момент после возбуждения клетки падает на систему Ма+/Са2+-обмена, а затем, после уменьшения концентрации Са2+ в цитозоле до 1 мкМ и ниже, включается Са2+-АТФаза и другие механизмы транспорта Са2+> Видимо, именно по причине высокой степени мобильности Na+/Ca2+-обменной системы, в наших экспериментах соотношение транспортируемых ионов, характерное для NaVca^-oöMeH-ника, наблюдалось в первые 30 сек. после помещения клеток водорослей в безнатриевую минимальную среду.

Наши исследования показали зависимость характера противоположно направленного трансмембранного переноса Са2+ и Na+ в клетках D.maritima при Na"*"ínt>Na+ext от концентрации ионов, присутствующих в инкубационной среде. В среде инкубации, содержащей ионь в физиологических концентрациях,' поглощение Са2+ клетками водоросли и выход из них Na+ снижались с начального момента измерения, а соотношение транспортируемых Са2+: Na+ было равно 1:2. Полученные нами результаты объясняются, вероятно, влиянием на обме* Са2+ на Na+ механизмов переноса присутствующих в инкубационное среде ионов: К+/№+-АТФазы (Гордон, 1976), На+/Н+- (Баднокин, 1995), Са2+/Н+-обмена (Felle, 1988), №*-АТФазы (Балнокин, 1995; Shono et al., 1995) и т.д.

Учитывая возможное влияние ионного состава среды инкубацш на измеряемый транспорт Са2+ и Na+, дальнейшие эксперименты проводились с использованием минимальной инкубационной, среды, содержащей микромолярные' концентрации Na+, К+, Caz+, Mg2+, где осмотич-ность поддерживалась глицеролом.

Важнейшей характеристикой Na+/Ca2+-обменника является зависимость его активности от величины трансмембранного градиента Na' Такая зависимость в наших экспериментах in vivo прослеживалaci

при использовании водорослей различной толерантности к NaCL: экстремального галофита D.salina (Na+jnt=82 мМ) и морского галофита D.maritima (Na+int=r',.3 мМ). Очевидно, более высокое содержание Na+ и, соответственно, более высокий градиент Na+ у D.salina в наших опытах определили на порядок большую величину транспорта Са2+ и Na+ через плазматические мембраны клеток этой водоросли (рис.2) по сравнению с D.maritima (рис.1). Это согласуется с данными W^kabayashi, Qoshima (1981), где увеличение поглощения Са2+ при больше"' загрузке клеток Na+ было обнаружено при функционировании Ма+/Са*-+-обменника в мембранах клеток миокарда. Таким образом, результаты опытов, представленные на рис.1, 2, подтверждают зависимость величины обмена Na+ на Са2+ в клетках галотолерантных водорослей от величины градиента Na+, что является основной характеристикой белка- переносчика, осуществляющего Na+/Ca2+-обмен.

Зависимость противоположно направленного переноса Са2+ и Na1" в клетках D.maritima и D.salina при Na+int>Na+ext от концентрации NaCl во внешней среде представлена на рис.3,4; максимальные величины поглощения Са2+ (рис.ЗА, 4А) и выхода Na+ (рис.ЗБ, 4Б) наблюдались при минимальной концентрации Na+ в среде инкубации. При увеличении концентрации NaCl в инкубационной среде уровень противоположно направленного переноса Са2+ и Na+ в клетках галофитов снижался. Внесение NaCL в среду инкубации ведет к снижению трансмембранного градиента Na+, направленного из клетки, следовательно, результаты, представленные на рис.3,4, свидетельствуют о зависимости противоположно направленного переноса Са2+ и Na+ в клетках галотолерантных водорослей от величины трансмембранного градиента Na+. Однако, Schellenberg, Swanson ('.982) наблюдали ин-гибирующий эффект внешних Na+ на активность №+/Са2+-обменника в нативных мембранах из мозга крыс и реконструированных везикулах, содера лцих Ыа+/Саг+-обменник, при том же направлении градиента Na+, что и в наших опытах. В клетках миокарда сердца было показано, что внеклеточные Na+ конкурентно ингибировали поглощение Са2+ (Wakabayashi, Goshima, 1981). Таким образом, полученная нами зависимость противоположно направленного переноса Са2+ и Na+ в клетках D.maritima и D.salina при Na+int>Na+öxt от концентрации NaCl во внешней среде (рис.3,4) лишь косвенно доказывает зависимость активности На+/Сп2+-обмена в клетках галофитов от величины

Рис. 3. Зависимость скорости трансмембранного переноса Ca2i" (А) Na+ (Б) в клетках D. maritima от концентрации NaCl в минимальн среде инкубации. Время эксперимента - 30 сек. По оси абсцисс - концентрация NaCl, мМ; по оси ординат - А - поглощение Са2+, нМ/мг белка;

Б - выход Na1', нМ/мг белка.

Рис. 4. Зависимость скорости трансмембранного переноса Са2+ (А) Na+ (Б) в клетках D.salina от концентрации NaCl в минималь* среде инкубации. Время эксперимента - 60 сек. По оси абсцисо - концентрация NaCl, мМ; по оси ординат -А - поглощение Са2+, нМ/мг белка;

Б - выход Na+, нМ/мг белка.

трансмембранного градиента Na+.

Зависимость направления и величины обмена Са2+ на Na+ от направления и величины трансмембранного градиента Na+,■ была зафиксирована нами также в клетках пресноводной водоросли Chlamydo-monas reinhardtii CW-15 (данные не приводятся).

Важнейшей характеристикой Ыа+"/Са2+-обменника является величина Кщ для переноса ионов. Schatzmann (1985) предполагает, что Km(Na+) в аксоне кальмара одинакова для сайтов на внешней и внутренней мембранной поверхности (порядка 10-100 мМ), тогда как Кщ(Са2+) на внутренней поверхности - порядка мкМ, а на наружной поверхности - мМ. Для нерва краба Кт(Са2+) была равна 2 мМ в присутствии 2,5 мМ Na+ во внешней среде (Baker and Blaustein, 1968). В наших экспериментах с увеличением концентрации Ca24" в минимальной среде инкубации количество поглощенных ионов кальция клетками D.salina и D.maritima возрастало. В опытах с использованием Dunaliella maritima при NaeXt=0,125 мМ Km(Ca2'1') была равна 0,4 мМ (рис.5), что укладывается в значения, указанные для Ма+/Са2+-об-менника (Schatzmann, 1985).

В опытах Schellenberg, Swanson (1982) и Wakabayashi, Goshima (1981, 1982) при исследовании кинетики На+/Са2+-обмена была получена величина Км для Са2+, равная 27 мкМ. Такого же порядка величина Км(Са2+) была получена нами для экстремального галофита D.salIna - 33 мкМ (данные не приводятся).. Полученная величина Кы указывает на более эффективный механизм Ыа+/Са2+-обмена в клетках экстремального галофита, по сравнению с морским галофитом (рис.5).

Поскольку нами изучался обращенный Na+/Ca2+-обмен (Naj-зависимое поглощение Са2+ клеткой) (DiPolo, Beauge, 1987), необходимо было выявить возможный вклад в трансмембранный перенос Na+ и Са2+ транспортных механизмов, которые функционируют в том же направлении. Блокаторы Са2+-каналов нифедипин и верапамил не оказывали ингибирующего действия на обмен Са2+ на Na+ в клетках D.maritima, что свидетельствует об отсутствии вклада Ca2"1"-каналов в определяемые потоки Са2+(табл.1).

Таблица 1

Влияние блокаторов Са2+-каналов на противоположно направленный транспорт Са2+ и Na+ в клетках D.maritima

вариант поглощение Са2+ выход Na+

нМ'мг белка"1• мин-1 нМ'мг белка-1• мин"1

Контроль 60 ± 2 180 ± 1

нифедипин, 10~б М *69 ±4 "181 ± 2

верапамил, 5"10-4М "70 ± 2 "195 ± 5

* - разница с контролем недостоверна при Р<0,01

Ингибиторы Н+-АТФазы диэтилстилбестрол (ДЭС), дициклогексил-карбодиимид (ДЦКД) и протонофор карбонилцианид-м-хлорфенилгидра-вон (СССР) не изменяли достоверно поглощение Са2+ и выход Na+ из клеток Dunaliella maritima при инкубировании их в минимальной среде (Nain>Naext) (табл.2), что указывает на отсутствие вклада протон-транспортирующих систем в трансмембранный перенос Са2+ и Na+ в данных условиях.

Таблица 2

Влияние ингибиторов Н+-АТФазы и протонофоров на скорость переноса Са2+ и Na+ в клетках D.maritima при инкубации клеток в'течение 30 сек. в минимальной среде (Nain>NaaXt) .

вариант поглощение Са2+ нМ-мг белка-1• мин"1 выход Na+ нМ-мг белка"1, мин"1

Контроль ДЦКД (5 Ю-5 М) ДЭС (5 Ю-5 М) СССР (5 10~б М) 43 ± 3 *50 ± 7 "53 + 5 *64 ± 8 . 166 ± 5 * 160 ±. 6 * 150 ± 3' 14 180 ± 8 ,;

* - разница с контролем' Недостоверна при Р<0,01

Известно, что двухвалентные катионы и Ы+ ингибируют Ма+/Саг+-обмен в клетках животных (ЬикасБ et а!., 1986; А1склп et

al., 1987, Hermoni et al., 1987). В наших экспериментах о использованием минимальной инкубационной среды литий в концентрациях 0,1-10 мМ сникал как поглощение Са2+ клетками D.maritima, так и выход из них Na+ (данные не приводятся), что согласуется с данными Hermoni с сотр. (1987). В'а2+, Mg2* и Мп2+ в двух концентрациях - 1мМ и 10 мМ снижали величину обмена Са2+ на Na* в клетках D.maritima (данные не приводятся). При концентрации двухвалентных катионов в среде инкубации 1 мМ эффективность ингибирующего действия снижалась в ряду Ва2+, Mg2"*", Мп2+. При увеличении концентрации катионов во внешней среде до 10 мМ наблюдался иной порядок эффективности ингибирования транспорта • Са2+ и Na+: Ba2+>Mn2+>Mg2+. Порядок эффективности ингибирования транспорта Са2+ и Na+ двухвалентными катионами в наших опытах, зависящий от их концентрации в инкубационной среде, был сопоставим с результатами Schellenberg, Swanson (1982), полученными при сравнении свойств Na+-зависимого поглощения Са2+ в реконструированных везикулах плазмалеммы из мозга крысы со свойствами обменного переносчика в нативной мембране; в их опытах по эффективности ингибирования поглощения Са2+ двухвалентные катионы располагались в ряд: в нативной мембране - Sr2+>Ba2+>Mn2+>Mg2+ и в реконструированных везикулах - Sr2+>Ba2+>Mg5+«>Ari2+. Предполагается, что двухвалентные катионы конкурируют с Са2+ за связывание на А-сайте (дива-лентном) обменника.

2+ +

3.2. Регуляция трансмембранного переноса Ca и Na

в клетках Dunaliella maritima фосфорилированиеы белков.

Фосфорилирование - важнейший механизм регуляции транспорта Са2+ через клеточные мембраны, включая Са2+- каналы и Ca2"1"- насос (Са2+-ЛТФаза) (Caroni.Carafoli, 1981). Получены'доказательства, что №+/Са2+-обменный механизм может быть объектом регуляции внутриклеточными Са2+ и АТФ (DiPolo, Beäuge, 1985, 1986). Фосфорилирование белка- переносчика, осуществляй! го Na+/Ca2+-обмен, увеличивало скорость обмена в несколько раз (Caroni, Carafoli, 1982).

Для тестирования фосфорилированйя обменника обычно использу-

го -

-Qt -02

Q2 ctf Об се 1.0

Рис. 5. Зависимость поглощения Са2+ метками D.maritima от концентрации Ca2"1" в минимальной среде инкубации: по оси абсцисс - концентрация Са2+,мМ по оси ординат - поглощение Са2+, нМ/мг белка1мин:

1 - в прямых координатах

2 - в координатах Лангмюра

Рис. : 6. Влияние экзогенного АТФ на трансмембранный перенос Са2+ (А) и Na+ (Б) в клетках D.maritima в минимальной среде инкубации. Время эксперимента - 30 сек.

По оси абсцисс - концентрация АТФ, М; _г по оси ординат - А - поглощение Са2+, нМ/мг белка; fyv-iO Б - выход Na+, нМ/мг белка.

Рис. 7. Зависимость поглощения Са2+ клетками D.maritima от концентрации Са2+ в минимальной среде инкубации (I), В присутствии 10 мкМ АТФ (2). По оси абсцисс -- концентрация Са2+, t.;M.

ют АТФ и аналог АТФ - Гт-БЗАТФ, который служит субстратом для ки-наз, но не для АТФаз (Gratecos and Fischer, 1960; Cassidy et al., 1979). Внесение в реакционную среду Сг-БШФ или АТФ производится при неизменной концентрации Са2+ и Mg2+. В наших экспериментах использовался АТФ.

Рис.6 представляет концентрационную зависимость действия АТФ на противоположно направленный транспорт Са2+ и Na+ в клетках D. maritima. Оптимальная концентрация АТФ, стимулирующая обмен Na+ на Са2+ клетками водоросли при Naint>Naext» была равна 5'10_5М, где поглощение Са2+ клетками и выход из них Na+ увеличивались в 2 раза по сравнению с контрольным вариантом. В контрольном варианте отношение транспортированных Са2+ к Na+ было 1 : 4,5; экзогенный АТФ не изменял его в интервале концентраций от 10~6 до 10"4 М, лишь при высокой концентрации АТФ, равной 10мМ, соотношение Са2+ к Na+ повышалось до 1:8,

DiPolo, Beauge (1987) показали, что АТФ стимулировал Na+/Ca2+-обмен в аксонах каракатицы посредством изменения афин-ности обменника по отношению к Na* и Са2+.Нами проведен эксперимент, где детектировалось поглощение Са2+ клетками D. maritima в присутствии 10 мкМ АТФ в зависимости от концентрации Са2+ во внешней среде (рис.7). Значение Км(Са2+), вычисленное в координатах Лангмюра (S/V к S), было равно для контрольного варианта 0,45 мМ; АТФ уменьшил его до 0,30. мМ. Таким образом, экзогенный АТФ в нашем эксперименте повысил сродство обменника по отношению к Са2+, что согласуется с данными DiPolo, Beäuge (1987). Вышеуказанные авторы показали, что активация Na+/Ca2+-o6Mcнника посредством АТФ требовала присутствия Са2+ и была высокоспецифичной, так как ни Na+/K+-Hacoc, ни Са2+-насос, ни Na+j/Mg2+-обмен, ни Na+/K+/Cl~-KOTpaHcnopT при этом не изменялись. Эти результаты, по мнению авторов, доказывают, что эффекты,£ТФ на Па+/Са2+-обменник опосредованы Са2+-кальмодулинзависимой протеинкиназной системой, ответственной за фосфорилирование обменника. ,

Для выяснения вклада Са2+ и, возможно» па2+- кальмодулинза-висимого фосфорилирования - дефосфорилирования обменника мы использовали высокоспецифичный хелатор Са2+ - ЭТТА. Результаты наших экспериментов показали, что АТФ-индуцированная стимуляция переноса Са2+ в клетках D. maritima полностью снималась и даже

уменьшалпь по сравнению о контролем АТФ в присутствии 5 мМ ЭГТА (табл.3). Изменения переноса Na+ в этом опыте, возможно, объясняются активацией АТФ Na+ j/Na+0-обменного компонента Ма+/Са2+-обменника, что наблюдали в своих опытах DiPolo, Beaugo (1986). Данные, представленные в табл.3 доказывают Са2+- зависимость активации Na+/Ca?+-обмена посредством АТФ и свидетельствуют о Са2+- зависимом фосфорилировании обменника.

Таблица 3

Влияние АТФ и ЭГТА на Na+/Ca2?-обмен в клетках D.marltima в минимальной среде инкубации при Na+int > Na+ext- Время инкубации- 30 сек.

Вариант нмоль • мг белка-1 • мин"1 Са2+: Na+

поглощение Са2+ выход Na+

ЭГТА, 5 мМ 31 ±1 132 ± 1 1 : 4

АТФ, 50 мкМ 51 ± 2 129 ± 2 1 : 3

АТОн-ЗГТА 25 ± 1 118 ±2 1 : 4

В связи с данными Hanai с сотр. (1986), предполагающими рол! цАШ> в регуляции Ма+/Са2+-обменника в клетках животных, мы исследовали влияние экзогенного цАМФ на Na+/Ca2+-обмен в клетках D. maritima при Na+int > Na+ext (табл.4). Результаты эксперименте] свидетельствуют об активации На+/Са2+-обмена в клетках водоросл! экзогенным цАМФ. Отношение Ca2+:Na+ в контроле было равно 1:4, Высокоспецифичный белковый ингибитор цАМФ-зависимых протеинкина (Walsh et al., 1971), выделенный из скелетных мышц кролика, сни мал стимулирующий Na+/Ca2+-обмен эффект цАМФ, при этом отношени Ca2+:Na+ оставалось 1:4 (таб;.4). Эффект белкового ингибитор свидетельствует о роли liAMD-зависимого фосфорилирования в наблю даемом нами обмене Na+ на Са2+ в клетках D. maritima, что согла суется с данными Hanai с сотр. (1986).

Однако, полученные нами результаты по действию верапамила блокатора фосфорилированных потенциалзависимых 0д';+- каналов (Ан

типенко, 1991) на противоположно направленный трансмембранный перенос Na+ и Са2+ в клетках водоросли (табл.4) не позволяют сделать однозначный вывод о цАШ- зависимом фосфорилировании Ма+/Са2+-обменника в наших опытах. Дело в том, что мы наблюдаем обращенный Na+ i nt/Caz+Gx t-обмен, где направление трансмембранного переноса Са2+ На+/Са2+-обменником совпадает с направлением движения Са2+ по Са2+-каналам, фосфорилирование которых, uAW>-зависимое в том числе (Каримова, 1994), увеличивает время их открытого состояния, стимулируя вход Са2+ в клетку (Caroni, Carafoli, 1982). Нивелирующий эффект верапамила на стимулированный посредством цАМФ перенос Са2+ (табл.4, оп.2,5) можно объяснить блокированием Са2+-каналов, фосфорилированных цАМФ-зависимым способом (о чем свидетельствует эффект белкового ингибитора цАШ>-зависимых протеинкиназ). Активация переноса Na+ экзогенным цАМФ в нашем опыте может быть обусловлена фосфорилированием K+/Na+- АТФазы, которая осуществляет перенос Na+ через плазматическую мембрану в том же направлении, что и Ма+/Са2+-обменник в наших экспериментах. Для проверки этого предположения нами был использован специфичный ингибитор K+/Na+~ АТФазы - оубалн. Результаты опыта (табл.4) показали вклад K+/Na+- АТФазы в перенос Na+ через плазматическую мембрану D. maritima в контрольном варианте (сравнить опыты 1 и 6, табл.4), с учетом чего отношение транспортируемых Ca2+/Na+ в контроле будет равно 1:3, что характерно для ^/Са^-обменника. Сравнение данных опыта 2, 7 табл.4 свидетельствует о том, что стимуляция циклонуклеотидом выхода Na+ из клеток могла быть обусловлена активностью K+/Na+- АТФазы (Гордон, 1976) или Na+-насосом, присутствие которого показано на плазма-лемме клеток растений (Shono et al., 1995).

Таким образом, действие цАМФ на трансмембранный перенос Са2+ и Na+ в клетках D. maritima в наших экспериментах не было связано с фосфорилированием На+/Са2+-обменника цАМФ-зависимым способом, но обусловлено эффектами цАМФ на Са2+-каналы и KVNa"1"- АТФазу (возможно, это было фосфорилирование белков каналов и АТФазы).

Таблица 4

Влияние цАМФ на Na+/Ca2+-обмен в клетках D. maritima в минимальной среде инкубации при Nain>Naext- Время инкубации-30 сек.

Вариант нмоль • мг белка-1 • мин-1 Са2+: Na+

поглощение Са2+ выход Na+

1. контроль 42 ± 2 170 ± 2 1 4

2. цАМФ, 1мкМ 54 ± 1 204 + 1 1 4

3. ЦАМФ + БИ, 5 мкг 41+1 160 + 1 1 4

4. верапамил, 0,5 мМ 44 ± 1 159 + 2 1 4

5. цАМФ + верапамил 37 ± 1 "186 + 5 1 5

6. оубаин, 1 мМ 42 + 1 114 ± 2 1 3

7. оубаин + цАМФ 48 ± 1 . 110 ± 1 1 2

"-разница с контролем недостоверна при Р<0,01

Чтобы выявить роль фосфорилирования обменника и сопутствующих транспортных систем (K+/Na+- АТФазы, Na+-Hacoca, Са2+-каналов) в их активности, мы определили протеинкиназную активность и Са2+-АТФазную активность в клетках D. maritima, помещенных в разные среды (табл.5). Данные табл.5 (опыт 1,2) показывают, что замена среды выращивания на минимальную среду (где Na+int>Na+ext» соотношение Са2+:На+ - 1:3 и 1:4 и где отсутствовал вклад Са2+-каналов и Н+-АТФаз в определяемый перенос Са2+ и Na+, то есть зафиксирован NaVca2"1"-обмен, по свойствам схожий с обменником плазматических мембран животных) индуцировала резкую стимуляцию протеинкиназной активности в клетках: она была выше по сравнению с контрольным вариантом; АТФазная активность при этом практически не изменялась (табл.5, опыт 2). Данные опыта 2 доказывают, что АТФ служил субстратом преимущественно для фосфорилирования. В опыте 3 экзаменовались клетки в среде, где присутствовали катионы в физиологической концентрации; протеинкиназная активность здесь была ниже на 32%, чем у клеток в основной среде (опыт 1), а изменение АТФазной активности было направлено противоположно измене-

нию протеинкиназной активности (табл. 5, опыт 3). Последние данные указывают, что АТФ в этом опыте служил в основном в качестве субстрата АТФаз. .

Таблица 5

Протеинкиназная и Саг+-АТФазная активность клеток D.maritima в зависимости от состава инкубационной среды.

Среда инкубации Направление градиента Na+ Удельная протеинкиназная активность нМ/мг бел.-мин"1 Сай+-АТФазная активность мкМ Р„/мг белка" • мин-1

1.Основная среда роста при наличии всех катионов Na+axt>Na+int 5,36 ± 0,34 1,20 ± 0,24

2.Минимальная среда Na+int>Na+ÖXt 13,51 ± 0,90 *1,56 ± 0,12

3.Среда со всеми катионами, без Иа+ Na+int>Na+0xt 3,66 ± 0,48. 3,77 ± 0,37

"-разница с контролем недостоверна при Р<0,01

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Показано, что концентрация свободного (ионизированного) кальция в цитоплазме клеток животных и растений -0,01 -0,1 мкм, во внеклеточной среде концентрация Са2+ достигает 1,5-2,5 мМ (Левицкий, 1990). Именно благодаря чрезвычайно низкой концентрации кальция в цитоплазме и существованию высоких градиентов Са2+ на клеточных мембранах, этот ион играет ключевую роль в жизнедеятельности практически всех животных и растительных организмов (Rasmussen, 1982). Способность клеток поддерживать низкую концентрацию Са2+ в цитозоле и реагировать на стимулы изменением уровня цитозольного кальция осуществляется благодаря объединенной деятельности механизмов, транспортирующих Са2+ через клеточные мембраны. Поскольку длительное возрастание концентрации цитозольного Са2+ опасно для клетки (Rasmussen, 1982), весьма ваглыми являются механизмы, осуществляющие удаление Са2+ из цитозоля. в клетках животных такими механизмами являются Са2+-АТФазы, Na+/Ca2+- обменник и Са2+-связывающие белки цитозоля (Carafoli, 1987). В растительных клетках показано функционирование Са2+-свя-зывающих белков цитозоля, Са2+- АТФазы (Lukas et al., 1984; Tipton, 1987). Сведения о функционировании Ыа+/Са2+-обменника в мембранах растительных клеток отсутствуют. Однако, существуют данные о зависимости транспорта Са2+ и его содержания в клетках растений от наличия в питательной среде Na+ (Cramer et al., 1985; Maton et al., 1986; Петров-Спиридонов, Ионева, 1987; Каримова с сотр., 1989), которые не исключают возможности функционирования Na+/Ca2+- обменника в мембранах растительных клеток. Хотя почти во ъсех справочниках по питательным растворам для растений Na+ не включен в качестве обязательного элемента, в вакуоли содержание Na+ может приближаться к К+ и. даже превышать его (Воробьев, 1980). Полученные нами данные являются весомым доказательством в пользу функционирования в плазмалемме клеток растений Na+/Ca2+-обменника, который в клетках животных является мощнейшей системой удаления Са2+ из цитозоля, не требующей больших затрат энергии АТФ. Поскольку в почвенном растворе и в воде для орошения всегда содержится Na+, функционирование в плазмалемме растительных клеток Na+/Ca2+-обменника является вполне обоснованным. Ре-

зультаты нашего исследования не только расширяют знания относительно регуляции Са2+- гомеостаза растительных клеток, но и предполагают возможный вклад На+/Са2+-обменой системы в механизмы адаптации галотолерантных растений к условиям повышенной засоленности.

ВЫВОДЫ

1. Впервые был зафиксирован противоположно направленный перенос Са2+ и Na+ в условиях трансмембранного градиента Na+ для зеленых одноклеточных водорослей различной степени толерантности к засолению.

2. Впервые была показана зависимость величины противонаправленного переноса Са2+ и Na+ от величины трансмембранного градиента Na+, что является весомым доказательством функционирования в плазмалемме галотолерантных водорослей NaVCa2"1"- обменной системы.

3. В клетках D.maritima и D.salina были зафиксированы соотношения транспортируемых Na+:Ca2+, характерные для Na+/Ca2+- обменной системы клеток животных (1:3, 1:4).

4. Было обнаружено влияние концентрации ионов среды инкубации клеток D.maritima на транспорт Na*, Са2+, К+, Н+.

5. Катионы (Li+, Ва2+, Mg2-*", Мп2*)- ингибиторы NaVCa2*-об-менника клеток животных подавляли противоположно направленный транспорт Са2+ и Na* в клетках D. maritima.

6. Впервые показано активирование На+/Са2+-обмена в клетках D.maritima посредством Са2+- зависимого фосфорилирования.

7. Впервые в условиях функционирования NaVCa2+-o6MeHHHKa зарегистрирована высокая зктопротеинкиназная активность.

8. Полученные результаты свидетельствуют: о функционировании Ма+/Са2+-обменника в клетках водорослей. • .:

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Каримова Ф.Г., Бунтукова. Е. К., Клочкова Е.Е; Поглощение Са2+ клетками растений// Цитология. 1991. т.аЗ. N11. С.180-184.

2, Karimova F.G., Buntukpva E.K.Klochköva Е.Е. Dependence of Ca2+- uptake on gradient of Na+ in Dunaliella salina// Abstracts of 9th Congress of FESPP, Prague. 1994, v.36. (Suppl.) to

Biología .ilantarum.

3. Тарчевский И.А., Каримова Ф.Г., Бунтукова Е.К., Закиро ваЛ.А., Мурсалимова Н.У., Корчуганова Е.Е. Влияние соединени тяжелых металлов на регуляторные функции клеток//Теаисы докл. 1 Республ. конф. "Актуальные экологические проблемы Республики Та тарстан". Казань. 1995. С.85.

4. Каримова О.Г., Бунтукова Е.К., Корчуганова Е.Е., Абубаки рова М.Р. Участие фосфорилировании.белков и АТФаз в противоположи но направленном переносе Са2+ и Na+ в клетках Dunaliella mariti ша//Цигология. 1995. N12.

5. Корчуганова Е.Е., Каримова Ф.Г., Бунтукова Е.К. Завися мость транспорта Са2+ от градиента Na+ в клетках Еодорослей pas личной толерантности-к засолению//Цитология. 1995. N12.

6.Бунтукова Е.К., Корчуганова Е.Е., Каримова Ф.Г. Регулящ трансмембранного переноса Са2+ и Na* в клетках Dunaliella mariti ma неорганическими катионаш//Цитология. 1995. N12.

7. Buntukova Е.К., Korchuganova Е.Е., Abubakirova М. R., Кг rimova F.G. Same aspects of transmembrane Caz+ and Na+ transfc depending on Na+ gradient in algae celIs//Annual. symp. "Physi cal-chemical basis of plant physiology". 1996. Puschino. C.92.

8. Корчуганова E.E., Каримова Ф.Г., Бунтукова Е.К. Противс полажио направленный трансмембранный перенос Са2+ и Na+ в клетк; Dmaliella таг^1та//Цитология., в печати.

Подписано к. лвчадя 22.05.96г. Форкат 60х90Дб

Бумага шатая ■ . Печать офсетная

Усл.пв*.л& 1.00. Тщша 100. Заказ109'-

Офсетная лаборатория КГСХА К Маркса,65 Казанская государстванная свльскохозяйствэаная

. академия.