Влияние абсцизовой кислоты на функционирование кальциевой и аденилатциклазной сигнальных систем

Ягушева, Мадина Рашитовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние абсцизовой кислоты на функционирование кальциевой и аденилатциклазной сигнальных систем
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние абсцизовой кислоты на функционирование кальциевой и аденилатциклазной сигнальных систем"

РГБ од

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК 1/ ART 2003

КАЗАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И БИОФИЗИКИ КНЦ РАН

На правах рукописи

ЯГ'УШНВА Малина Рашитовна

ВЛИЯНИЕ АБСЦШОВОЙ КИСЛОТЫ НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ КАЛЬЦИЕВОЙ И АДЕНИЛАТЦНКЛАЗНОЙ СИГНАЛЬНЫХ СИСТЕМ

03.00.12-физиологня растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ - 2000

Работа выполнена в лаборатории метаболизма белков Казанского института биохимии и биофизики Казанского Научного Центра Российской Академии Наук.

Научные руководители: академик РАН, профессор НА. Тарчевский

доктор биологических наук H.H. Максютова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Г.А. Великанов

кандидат биологических наук Е.В. Асафова

Ведущая организация: Санкт-Петербургский

Государственный Университет Кафедра физиологии и биохимии растений

Защита состоится « 22 » 2000 г. в << 1L » часов на

заседании Специализированного совета К 002.16.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Казанском институте биохимии и биофизики КНЦ РАН (420503, г. Казань, а'я 30, ул. Лобачевского, 2/31).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского физико-технического института КНЦ РАН.

Автореферат разослан « » сАЛсЛ-^-У 2000 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Абсцизовая кислота (АБК) играет важную роль в регуляции роста растений и в ответной реакции на различные биогенные и абиогенные стрессоры. Существующие данные предполагают участие сигнальных систем клеток в ответе на действие АБК. В плазмалемме обнаружен белок (рецептор), характеризующийся высокой степенью сродства к АБК. АБК индуцирует репрограмирование экспрессии генов и синтеза «защитных» белков, что определяет повышение устойчивости растений к различного рода стрессорам. К возможным медиаторам осуществления ответной реакции на АБК относят Са2+, К+, If1' и циклическую АДФ-рибозу (Owen, 1988; Quatrano et al, 1994; Heimovaara-Dijkstra et al, 1996). Показано, что в механизм действия АБК включен МАР-киназный сигнальный каскад (Knetch et al., 1996).

Существенным этапом передачи сигнала по системе вторичных посредников является фосфорилирование белков, которое играет кардинальную роль в регуляции многих клеточных процессов эукариот. В настоящий момент доказана роль процессов фосфорилирования-дефосфорилирования белков в клетках прокариот и всех эукариот, включая дрожжи, животные и растения (Cohen et al,1995; Hunter, 1995; MacKintosh et al, 1990; Kauss et al, 1991; Cohen, 1992; Каримова, 1994; Тарчевский, 2000; и др.). Сведения об АБК-индуцированном фосфорилировании белков немногочисленны и получены с помощью ингибиторного анализа. Несмотря на доказательство участия Са2+ в механизмах действия АБК, измеренные изменения поглощения Са2+ при действии АБК в различных растениях были неоднозначны, а в некоторых случаях показано отсутствие действия АБК. Сведения о влиянии АБК на цАМФ-систему в растениях к началу нашего исследования отсутствовали.

Цель и задачи исследовапия. Целью нашей работы было изучение участия цАМФ- и Са2+- сигнальных систем в АБК-индуцированном ответе клеток растений. В задачи исследования входило: 1) изучить влияние АБК на содержание цАМФ в тканях растений, а также на протеинкиназную активность и фосфорилирование белков; 2) выявить вклад различных механизмов изменения и поддержания Са2+ гомеостаза в цитозоле клеток растений при действии на них АБК: Са2+-каналов (с помощью блокаторов), Ыа+/Са2+-обменника при наличии градиента Na+ между клеткой и средой.

Научная новизна работы: Впервые показано АБК-индуцированное снижение содержания цАМФ в клетках растений и интенсивности секреции цАМФ в среду; а также изменения цАМФ-зависимой протеинкиназной активности, зависящие от времени воздействия АБК. Впервые показаны АБК-индуцированные изменения профиля фосфорилированных полипептидов, которые были различными при оптимальной температуре и при гипотермии. Впервые показано беспрецедентно сильное АБК-индуцированное повышение относительного уровня фосфорилированности полипептида (ОУФП) 10 кД при гипотермии. цАМФ также повышал за 2 часа действия гипотермии in vivo ОУФП 10 кД. АБК вызывала кратковременное повышение поглощения Са2+ клетками, сменяющееся понижением или отсутствием изменения транспорта Са2+. Показано АБК-индуцированное изменение соотношения активностей Са2+-транспортирующих систем клеток растений во времени: Са2+-каналов, Ыа+/Са2+-обменника.

Практическая значимость работы: Полученные результаты вносят вклад в понимание физиолого-биохимических механизмов, лежащих в основе регуляции клеточной активности растений и могут использоваться для разработки приемов повышения устойчивости растений с помощью препаратов, содержащих АБК и соли кальция. Полученные результаты можно использовать при чтении лекций в учебном процессе.

Апробация работы: Материалы диссертации доложены на 10 конгрессе федерации европейских физиологов растений FESPP, Florence, Italy, 1996; на Российско-Германской школе молодых ученых, Пущино, 1997; на Н(Х) Съезде Русского Ботанического Общества, С.-Петербург, 1998; на Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 1998; на VI Съезде общества физиологов растений России (международная конференция), Москва, 1999; на международном конгрессе нейрохимиков ISN/ESN-Meeting, Берлин, Германия, 1999; на итоговых конференциях КИББ КНЦ РАН (1998,1999).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 113 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок, 5 таблиц. Список литературы включает 154 наименований, из них 116 иностранных.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования служили зеленые или этиолированные листья 3-7 дневных растений гороха сорта Казанский, выращенных на 1/4 среды Хогланда-Арнона1 под люминостатом (освещенность 10 клюке) или в термостате при 25°С. Побеги растений, отрезанные от корней, инкубировались в растворах с эффекторами АБК, цАМФ, Ca2* (контролем служила дистиллированная вода) при оптимальной и/или низкой температурах. Гомогенизацию листьев проводили при 4°С в среде, содержащей 50 шМ трис-буфер pH 7,5; ImM ДТТ, lmM I'MSF (ингибитор сериновых протеаз); 250 шМ сахарозы; 0,1 тМ теофилина (ингибитор ФДЭ цАМФ); 10 тМ ЭДТА, 3% поливинилпирралидона (для связывания фенольных соединений) и ингибиторы фосфатаз. Гомогенат отжимали через 2 слоя полотна и центрифугировали 3 мин при 20000g. Супернатант, содержащий растворимые белки и белки везикул цитоплазматических мембран, и осадок, содержащий ядра, митохондрии, хлоропласта (этиопласты), обрывки клеточных стенок, ресуспендированный в 300 мкл среды гомогенизации использовали для определения протеинкиназной активности и для электрофореза. Для определения трансмембранного транспорта CaJf использовали культуру одноклеточной микроводоросли Dunaliella maritima (морской галофит), полученную из коллекции Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева, любезно предоставленную нам М.Г. Владимировой. Клетки этой водоросли не имеют клеточной стенки, что позволило избежать трудностей в учете транспортируемых ионов кальция, возникающих в случае использования клеток высших растений. Для выращивания D. maritima использовали жидкую среду (Абдуллаев, Семененко, 1974). Культуру выращивали в стерильных условиях при температуре 26°С и при освещении белым светом. В опыты брали клетки в линейной фазе роста. Количество клеток в опыте -106 в 1 мл среды.

Определение цАМФ проводили в грубом экстракте листьев. Для депрогеинизации гомогенат и среду инкубации кипятили на водяной бане 6 мин и центрифугировали 5 мин. при 20000g. Для отделения 3',5'цАМФ от других нуклеотидов надосадочную жидкость наносили на колонку с нейтральной окисью алюминия (по Брокману II) (White, Zenser, 1971) и ионообменной смолой 50Wx8 (200-400меш) и элюировали 5 мл дистиллированной воды. Элюцшо цАМФ с колонки контролировали с помощью 3Н-цАМФ; выход его в наших опытах составлял 0,8-0,9.

Определение цАМФ проводили методом Gilman (1970) с использованием наборов фирмы «Amersham» (UK) или «Алга» (С.-П.). Реакцшо связывания нуклеотида проводили при 0°-4°С.

Определение протеинкиназной активности проводили по методу Kikkawa et al. (1983) с модификациями (Каримова и др., 1991). Реакционная смесь (объем 100 мкл) содержала: 50 мМ PÍPES-буфера рН 6,5; 5 мМ MgCl2; 0,1 мМ PMSF; 0,1тМ теофилина; 0,1 мМ ДТТ; 0.5 мМ АТФ; (у-32Р)-АТФ 500-800 тысяч имп/мин; 40-80 ми-белка и различные реагенты в зависимости от условий опыта. Радиоактивность просчитывали в ЖС-1 на счетчике «Delta-ЗОО» (США). Удельную активность фермента выражали в пмолях 32Р па мг белка в мин.

Фосфорилирование белков i и vivo проводили в течение 2-х часов при инкубации отделенных побегов при низкой (4°С) и оптималыюй (25°С) температурах в растворах 1мкМ АБК или 1мкМ цАМФ (контроль - диет, вода), далее растения переносили в растворы с 32Р-ортофосфорной кислотой и инкубировали 2 часа при 25°С на слабом рассеяном свету. Гомогенат листьев центрифугированием разделяли на две фракции: супернатант и осадок (20000g); затем фосфорилированные белки фракций разделяли методом электрофореза по Laemmli (1970) с последующей радиоавтографией. Гели и радиоавтографы сканировали па денситографе LKB «Швеция» или ИФО-450 (ГИ110, Казань). В опытах учитывали количество поглощенного листьями 32Р-ортофосфата из среды и включение 32Р в белки, рассчитанное на мг белка.

Поглощение Са2+ клетками водорослей определяли с помощью изотопа 45Са (33 МБк/л) с применением LaClj для отмывания клеток после опыта от внешнего Са2 (Van Breemen et.al., 1977). Запуск реакции производили добавлением к суспензии клеток водорослей изотопа 15Са и эффекторов; останавливали путем фильтрования через предварительно смоченные фильтры "Владипор" (диаметр пор 0,4 мкм) под давлением. Затем фильтры промывали холодной средой с ЬаОз (1,5мМ), высушивали, и радиоактивность просчитывали в ЖС-8. В каждом варианте был контроль (фон) на неспецифическое связывание 45Са. Количество Са2", поглощенного клетками, выражали в нмоль/мг белка. Вклад С а2-капало в определяли с использованием их блокаторов: верапамила и нифедипина. Активность Na VCa2 -обмешшка (в прямом и обращенном режимах) определяли при создании градиента Na+ заменой среды

выращивания на минимальную среду (Na+;lU>Na+ext), или гиперосмотическую среду (2М NaCl), или после нагрузки клеток 45Са перед опытом (Na'&t>Na"int). Минимальная среда содержала (в мкМ): NaCl - 125; КН2Р04 - 0,25; Са(МО)2 - 0,04; MgS04 - 0,30; Fe-ЭДТА - 0.006; Трис-НМОз- 50000; рН 7,2. Осмомолярность среды поддерживали глицерином (500мМ). Среды заменялись центрифугированием в мягких условиях (2000g - 2мин), интактность клеток после центрифугирования контролировалась микроскопически. Радиоактивность проб измеряли на жидкостном сцинтилляционном счетчике Delta-ЗОО (США). Белок определяли по методу Лоури в 'ГХУ -осадках или осадке при кипячении проб (Lowry et al., 1951). Эксперименты проводились в трех биологических повторностях от 3 до 7 раз. В таблицах и рисунках приведены средние арифметические значения и средние квадратичные ошибки.

В работе использовали (у-э2Р)-АТФ (удельная активность 1000 Кюри/ммоль) Ташкентского или С.-Петербургского ПО «Изотоп», 32Р-ортофосфорную кислоту (удельная активность 5000 Кюри/ммоль) Г10 «Изотоп», MgCI2 фирмы «ВДН» (Англия), 'PIPES, ДТТ, ЭГТА, цАМФ, ДДС-Na, акриламид и бис-акриламид, Кумасси R-250, фенилметилсульфонилфторид (PMSF) фирмы «Serva». Неорганические соли отечественные, марки «ХЧ».

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ IIIIX ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Влияние АБК на аденилатциклазную сигнальную систему клеток растений

На современном этапе исследований показаны ключевые ферменты аденилатциклазной (АЦ) сигнальной системы: синтеза цАМФ - аденилатциклазы и его деградации - фосфодиэстеразы цАМФ (ФДЭ), их локализация. Клонированный первым ген протеинкиназ растений имел сходную пуклеотидную последовательность с геном цАМФ-зависимых протеинкиназ животных. Частично очищенная протеинкиназа из петунии фосфорилировала специфический для цАМФ-зависимых протеинкиназ синтетический субстрат - кемптид LRRASLD. Ген АЦ растений клонирован, а АЦ достаточно очищена. Низкий эндогенный уровень цАМФ (0,5 пмоль/г сырого веса) в клетках растений, обнаруженный в работах некоторых авторов (Spiteri et al, 1989), послужил одной из причин для сомнений в возможности функционирования АЦ-сигнальной системы в растениях. Перспективными являются исследования содержания цАМФ, этимология и молекулярная биология АЦ, клеточная сигнализация в аденилатциклазной системе растений (Assman, 1995).

Работы отечественных исследователей В.К. Яворской (1990), С.П. Феденко (1993), Ф.Г. Каримовой (1994), И.А. Тарчевского и др. (1999) убедительно показали физиологическую роль цАМФ и некоторых компонентов АЦ системы в адаптивных реакциях растений при стрессе.

В наших экспериментах АБК за 2 часа инкубации этиолированных или зеленых побегов гороха, отделенных от корней, снижала содержание как эндогенного цАМФ в листьях, так и секретируемого в среду инкубации (табл. 1). Абсолютное суммарное количество цАМФ, определенное в листьях и в среде инкубации, достигало в некоторых опытах 11-18 нмоль/мг белка. Следует отметить частое превышение уровня секретируемого в среду инкубации количества цАМФ в сравнении с эндогенным (табл. 1). Целесообразность секреции цАМФ клетками растений обсуждались ранее (Franco, 1983; Каримова и др., 1993).

Таблица 1. Влияние АБК (2 часа инкубации) на содержание цАМФ в листьях гороха и его секрецию в среду инкубации. После инкубации листья гомогенизировались, гомогенат и среда инкубации после кипячения подвергались очистке и разведению. Содержание цАМФ в образцах определялось согласно СШпап

N опы та Возраст растений (дни) 3Н, цАМФ, нмоль/мг белка

контроль-дист.вода АБК, 1мкМ

в листьях | в среде в листьях | в среде

1 этиолиро- 3 3,26 ± 0,05 * 1,95+0,02 *

2 ванные растения 5 3,28 ± 0,02 # 1,69 ±0,12 *

3 Зеленые 5 7,72 ±0,11 3,40 ± 0,05 3,72 ± 0,02 3,31 ±0,10

4 растения 6 5,46 ±0,03 8,98 ± 0,06 3,78 ±0,03 4,89 ± 0,04

Ь 7 9,50 ± 0,09 8,98 ±0,12 * *

* - не определяли

Влияние фитогормона АБК на содержание цАМФ в листьях и его секрецию в среду в наших экспериментах совпадало по направленности с действием экзогенного Ca2" (рис. 1), что позволяет подтвердить предположение об участии кальциевой сигнальной системы в ответе растений на действие АБК, сделанное ранее (Owen, 1988; Munnik et al„ 1998).

Рис. 1. Влияние АБК на содержание цАМФ в листьях гороха и его секрецию в среду (отрезанные листья со стеблями инкубировали 2 часа в растворах). 1 - диет, вода; 2 -1 мМ Са2*; 3 - 1 мкМ АБК.

В высокой концентрации Са2" ингибирует некоторые формы АД в клетках (Taussing, Gilman, 1995), одновременно активируя ФДЭ цАМФ в комплексе с кальмодулином (Феденко, 1993), что вызывает снижение содержания цАМФ в клетках. Это может объяснить полученные нами данные (табл. 1, рис. 1).

Известно, что АБК накапливается в растениях при действии различных стрессоров, например, гипотермии. Результаты опытов с кратковременным действием (20 минут) низкой температуры (+2"С) на растения морозоустойчивой озимой пшеницы Мироновская 808 показали, что за 20 минут гипотермии содержание эндогенного цАМФ повышалось в 2,1 раза в сравнении с контролем; это согласуется с ранее полученными данными (Тарчевский и др., 1999).

Данные литературы о влиянии АБК на протеинкиназную активность противоречивы: уменьшение в клетках Lemna (Chapman et al., 1975), стимуляция в тилакоидах хлоропластов (Романко и др., 1990) и в микросомальной фракции ю корней ячменя (Селиванкина и др., 1989). В наших опытах in vitro также наблюдалась как стимуляция, так и подавление протеинкиназной активности (базальной и цАМФ-зависимой) экзогенным АБК (рис. 2). Наши результаты и данные литературы свидетельствуют о возможности непосредственного воздействия АБК на протеинкиназы in vitro.

800

^ 700 х

i 600 -ш

S 500 -с;

ю 400 -

I 300 Ц

I 200 -

оГ 100

0 -1

А Б

Рис. 2. Влияние АБК на цАМФ-зависимую протеинкиназную активность фракций гомогеиата 6-ти дневных этиолированных листьев гороха in vitro: Реакционная среда содержала: 50шМ PIPES pH 6,5; 50 mkM АТФ; 0,1 mM PMSF, 0,1 тМ DTT; 0,1 тМ теофилина; 10 mM Na2Mo04; 800 000 имп/мин у-32Р-АТФ и эффекторы. Эффекторы добавлялись в реакционную среду. А- супернатант 20000g, Б- осадок 20000g. 1 - контроль (вода); 2-1 мкМ АБК; 3 -1 мкМ цАМФ.

Инкубация побегов гороха в растворах АБК и цАМФ за 2 и 12 часов индуцировала различные изменения включения 32Р-ортофосфата в зависимости от локализации белков (растворимых и в осадочной фракции - табл. 2, опыт 1) и длительности воздействия: за 2 часа в растворимой фракции наблюдалось подавление включения 32Р в белки, за 12 часов - значительная стимуляция.

Таблица 2. Влияние АБК и цАМФ на фосфорилирование in vivo белков

этиолированных листьев Зх-дневных проростков гороха.

Включение "PH в белки, имп/мин на мкг белка

№ Время Фракция Контроль - 1 мкМ

опыта (часы) гомогената диет, вода 1 мкМ АБК цАМФ

1., 2 Супернатант 945±43 610136 *

осадок 2534±87 4010153 *

2 12 Супернатант 849121 1764131 1950134

осадок 790±25 1895129 1624145

*-не определяли

Следует отметить сходство действия экзогенной цАМФ с действием АБК как in vitro (рис. 2), так и in vivo (табл. 2), что служит одним из критериев доказательства участия отдельных компонентов сигнальной системы в механизмах действия гормона.

Следующим этапом наших исследований было определение влияния АБК на фосфорилирование полипептидов в опытах с проростками гороха (рис.3).

Рис. 3. Спектры фосфорилированых полипептидов растворимой фракции гомогената 3-х дневных этиолированных растений гороха, выращенных на 1/4 питательного раствора Хогланда-Арнона I: влияние АБК прн оптимальной температуре (Отрезанные побеги инкубировались при 25°С 2 часа в растворах 1мкМ АБК, контроль - диет, вода, затем побега переносили в растворы, содержащие 32Р-ортофосфорную кислоту (185 PBq/mol) и инкуб провались еще 2 часа при 25°С. Затем гомогенат листьев центрифугировали при 20000g 5 минут; фосфорилированные белки супернатанта разделяли с помощью электрофореза в денатурирующих условиях с ДЦС-Na. Для электрофореза использовали объемы супернатанта с выравненной радиоактивностью, что позволяет говорить об относительной фосфорилированности различных полипептидов. 1-контроль, 25°С; 2-абсцизовая кислота, 1мкМ, 25°С.

Результаты сканирования радиоавтографов фосфорилированных полипептидов приведенных на рис. 3, указывают на АБК-индуцированное повышение уровня фосфорилированности полипептидов 16, 26, 30, 44-58 кД при оптимальной температуре. В то же время, АБК снижала уровень фосфорилированности низкомолекулярных полипептидов 8,5-11 кД, 60-73 кД и полипептидов наиболее высокой молекулярной массы. Следует отметить, что наиболее высоким был уровень

фосфорилированносги полипептида 30 кД, который еще более повышался под влиянием абсцизовой кислоты. При гипотермии АБК значительно повышала включение 32Р в белки гороха; профили выравненных по радиоактивности образцов, разделенных электрофорезом с последующей радиоавтографией, представлены на рис. 4.

-1-1-1-1-1-—

67 45 25 17 12,3 kD

Рис. 4. Влияние АБК при гипотермии (4°С) на спектр фосфорилированых полипегггидов растворимой фракции гомогената 3-х дневных этиолированных растений гороха, выращенных на 1/4 питательного раствора Хогланда-Арнона I. (Отрезанные побеги инкубировались при 4°С 2 часа в растворах 1мкМ АБК, контроль - диет, вода, затем побеги переносили в растворы, содержащие 32Р-ортофосфорную кислоту (185 PBq/mol) и инкубировались еще 2 часа при 25°С. Образцы были выравнены по радиоактивности. 1-контроль,4°С; 2-абсцизовая кислота, 1мкМ, 4°С.

Совершенно неожиданным было появление высокого уровня фосфорилированносги полипептида 10 кД под действием АБК при гипотермии, тогда как уровень фосфорилированносги других полипептидов изменился незначительно (рис. 4). Это хорошо видно на радиоавтографе (рис. 6). Следует отметить различие направленности действия АБК на уровень фосфорилированносги полипептида 10 кД при оптимальной температуре (понижение - рис. 3) и при гипотермии (сильное повышение - рис. 4)

Различия в спектрах фосфорилированных белков, индуцированных АБК при 25°С (рис. 3) и при гипотермии (рис. 4) свидетельствуют об АБК-зависимом и -независимом путях низкотемпературной адаптации растений, что обсуждается в литературе (Хохлова и др., 1999; Chao et al., 1999).

Рис. 5. Влияние цАМФ при гипотермии (4°С) на спектр фосфорилированных полипептидов растворимой фракции гомогената 3-х дневных этиолированных растений гороха, выращенных на 1/4 питательного раствора Хогланда-Арнона I. (Отрезанные побега инкубировались при 4°С 2 часа в растворах 1мкМ цАМФ, контроль - диет, вода, затем побеги переносили в растворы, содержащие 32Р-ортофосфорную кислоту (185 PBq/mol) и инкубировались еще 2 часа при 25°С. Варианты выравнены по радиоактивности. 1- контроль, 4°С; 2- цАМФ, 1МкМ, 4°С.

Для выяснения механизмов индуцирования повышенного уровня фосфорилированности полипептида 10 кД абсцизовой кислотой мы изучили влияние экзогенного цАМФ на включение 32Р в полипептиды при гипотермии (рис. 5). Оказалось, что цАМФ при гипотермии также увеличил уровень фосфорилированности полипегттида 10 кД (рис. 5, 6), в еще большей степени, чем АБК. По данным литературы полипептид 10 кД может быть белковым регулятором ФДЭ цАМФ, который стимулировался АБК и Са2' (Junker, 1977). Учитывая наши результаты по одинаковой направленности (сильная стимуляция) действия АБК (рис. 4) и цАМФ

67 45 25 17 12,3 kD

(рис. 5) при гипотермии на уровень фосфорилированности полипептида 10 кД можно предположить, что действие цАМФ могло бьггь обусловлено не только цАМФ-зависимым фосфорилированием этого белка, но также и цАМФ-опосредованным повышением концентрации Са2+ в цитозоле клеток (Volotovsky ct al., 1998).

Если полипептид 10 кД является активатором ФДЭ цАМФ (по Junker, 1977), фосфорилированность которого повысилась АБК за 2 часа гипотермии в наших опытах (рис. 4), то его фосфорилирование может быть направлено на уменьшение

содержания цАМФ внутри клетки и за ее пределами (известна внеклекгочная и внутриклеточная локализация ФДЭ цАМФ в растениях (Franco, 1983). Данные об уменьшении содержания цАМФ под действием АБК за 2 часа (табл. 1, рис. 1), а также об АБК- и цАМФ-индуцированном за 2 часа гипотермии повышении

фосфорилированности полипептида 10 кД и сопоставление с ранее полученными нами данными об увеличении в 2-4 раза содержания цАМФ в листьях растений за 20 минут ,JQ гипотермии (Тарчевский и др., 1999)

свидетельствуют о временной 2 3 регуляции каскада реакций

аденилатциклазной сигнальной

системы фитогормо-ном АБК. Необходимость кратковременного повышения содержания цАМФ при гипотермии в клетках растений (Тарчевский и др., 1999) может быть

12,3—

Рис. 6. Радиоавтографы 32Р-содержащих полипегггидов 3-х дневных этиолированных проростков гороха за 2 часа действия АБК и цАМФ при низкой температуре (4°С). фосфорилирование белков in vivo (20000g). 1-контроль, 4°С; 2-1мкМ цАМФ,4°С; 3-1мкМ АБК, 4°С.

объяснена данными литературы. Согласно В.К. Яворской (1990), добавление экзогенного цАМФ повышало холодоустойчивость озимой ржи и останавливало их клетки в Gj-фазе клеточного цикла. Данные В.Г. Гриф с сотр. (1987) показывают, что холодоустойчивые растения при гипотермии останавливаются в Gi или 02-фазе клеточного цикла. Необходимость цАМФ для повышения холодостойкости показана также на дрожжах (Baroni et al., 1994): цАМФ-зависимое фосфорилирование циклин-зависимых протеинкиназ (регулирующих прохождение фаз клеточного цикла) останавливало клетки дрожжей в Gi-фазе клеточного цикла, очевидно, чтобы избежать негативное действие низкой температуры на синтетические процессы, необходимые для роста и деления клеток.

Итак, полученные нами результаты по АБК-индуцированному изменению содержания цАМФ (табл. 1, рис. 1), протеинкиназной активности (рис. 2) и спектров фосфорилированных белков in vivo (рис. 3-6) свидетельствуют о включении в механизмы действия АБК аденилатциклазной сигнальной системы и о значении временной регуляции фитогормоном каскада реакций в сети сигнальных систем .

2.2. АБК-индуцированный транспорт Са2+ в клетках Duaalieila maritima.

В предыдущей главе были представлены результаты, свидетельствующие о возможном участии аденилатциклазной сигнальной системы в качестве посредника действия АБК на растения. Имеющиеся в литературе сведения о неоднозначном изменении поглощения ионов кальция клетками под влиянием АБК заставили нас обратить внимание и на кальциевую сигнальную систему. Однако, горох - наш основной объект исследования - трудно было использовать для изучения транспорта Ca2 , так как клеточные стенки растений могли вносить большой вклад в поглощение и выход ионов кальция. В связи с этим вопросы, связанные с влиянием АБК на ионный баланс клеток растений, мы изучали с помощью другого объекта -одноклеточных зеленых микроводорослей - гелофитов Dunaliella maritima, не имеющих клеточной стенки, что позволило избежать трудностей в учете транспортируемых ионов кальция, возникающих в случае использования клеток высших растений. Применяемый нами метод позволяет определять с помощью изотопа 45Са содержание Са2+ в клетке за определенные промежутки времени, которое зависит от активности Са2+-транспортеров, переносящих Са2+ в клетки или из

нее: Са2г-каналов, Са^-ионофоров, Ыа7Са2"-об,ченника, Са2ТН+-антипортера, Са2'-АТФазы и т.д. (рис. 7).

АБК

Рис. 1. Схема регуляции Са 2+ - транспортеров АБК и цАМФ 1 - Са2-каналы 2 - Са21/Н'-антииортер; 3 - Са2'-АТФаза; 4 - \'а7Са2'-обменник в прямом режиме при градиенте Ыа +Сх1> N8 (табл. 3); 5- ФЛД - ФК (Са2+-ионофор); АЦ - аденилатциклаза, К - рецептор, g - ГТФ-связывающий белок, ПК - протеинкиназы, Р - остаток фосфорной кислоты.

Мы изучали в своей работе некоторые транспортеры Са2+, способные быстро переносить Са2+. Например, единичный Са2+-канал переносит 106 молекул Са2+ в секунду, что быстро увеличивает содержание Са2* в цитозоле (Тге\уауаБ, МаШо, 1997). Скорость переноса ионов кальция К'а*/Са2 -обменником, измеренная на везикулах плазмалеммы клеток животных, достигает 20 нмоль/мг белка в 1 сек. (Сагош, СагаГоП, 1983). В нативных клетках одноклеточных водорослей эта скорость была выше (Капшоуа е1 а!., 2000).

0,25мин 0,5мин 1мин 1,5 мин Змин 5мин 10 мин

время, мин

Рис. 8. Временная зависимость содержания Са2+ в клетках В.ттЬта в оптимальных условиях роста, где концентрация №С1 была равна 500 мМ. Возраст культуры 4 дня, плотность клеток - 0,96 млн кл/мл. К;а,с,:(>Ьта",-п(.

Изучение временной динамики содержания Са'* в клетках О.тагйта в контроле выявило колебательный характер содержания Са2+ в клетках (рис. 8). Временные колебания содержания Са2+ в клетках наблюдались при действии АБК (рис. 9), солевого стресса (рис. 10), в присутствии блокаторов (рис. 9) механизмов транспорта Са2'; амплитуда колебаний при этом изменялась. Действие блокатора потегадаалзависимых Са2* каналов - верапамила на АБК-индуцированное изменение содержания Са2' во времени показало, что индуцированное АБК поглощение Са2* клетками обусловлено транспортом по Са2* каналам (0,5-3 мин) (рис. 9), вклад которых уменьшался с АБК-индуцированным понижением поглощения Са2* (3 мин) (рис. 9), а затем отсутствовал (5-10 мин) (рис. 9).

Временная динамика действия другого блокатора Са2* каналов нифедипина в наших опытах отличалась от действия верапамила: нифедипин проявлял свое специфическое действие лишь с 5-ой минуты инкубации, ингибируя АБК-идуцированный транспорт Са2+ в клетке водорослей на 23-62% в различных экспериментах.

Транспорт Са2+ в клетках может осуществляться также Ыа+/Са2*-обменником, функциональные характеристики которого в обращенном режиме №+;п1>Ыа*е« были охарактеризованы нами ранее (Корчуганова, 1997; Капшоуа е1 а! 2000). Регуляция

фитогормоном АБК переноса ионов кальция Ыа7Са2>-обменникоы из клетки или в клетку осуществлялась согласно заданному в наших экспериментах направлению и величине градиента №7

■ контроль □ АБК, 1 мкМ Щ верапамил, 10 мкМ @ АБК+верапамил

время, мин

Рис. 9. Влияние АБК и верапамила на содержание Са2т в клетках Б.тапНша в оптимальных условиях роста. Возраст культуры 3 дня, плотность клеток 0,92 млн кл/мл. Кта+ех^У|п1.

Данные показывают (рис. 10), что повышение величины градиента Ха" при солевом стрессе (рис. 10, оп. 2) понижает содержание Са^ в клетках в сравнении с контролем (рис. 10. оп. 1), что было индуцировано увеличением выноса Са2< К'а7Са2"-обменником.

Если данные рис. 10 косвенно свидетельствуют о выносе Са2+ из клеток обменником, то приведенные в табл. 3 данные получены прямым измерением выноса Са2+ Ыа7Са21-обменником в инкубационной среде. Для этого клетки предварительно загружали "<5Са. В этих условиях Ь'а7>.-гЛга+Ш1 при направлении градиента ионов натрия внутрь клеток Ыа7Са2+-обменник в прямом режиме, характерном для обменника в сигнальных системах, осуществлял вынос Са2' из клетки, (табл. 3). Согласно данным Не&еги^оп, (ЗиаСапо (1991) АБК ингибирует активность Н -помпы (Н'-АТФазы), служащего источником энергии для Са2+/Н+-антгаюртера, поэтому вынос Са2+ из клеток Са2>/Н+-антипортером (рис.7) нами не рассматривался.

Данные табл. 3 показывают, что 65% экспортированного Са2+ за 30 сек Ыа7Са2' -обмешшком из клеток в контроле вновь поступали в клетки по Са2+ -каналам

700 600

га

5 500 ю

400

га !

0 300 -i л I с

1 200 X

100 0 <

32.

£nl

0,5

1,5

®1 □ 2

время, мин

Рис. 10. Влияние солевого стресса на содержание Са2+ в клетках D.maritima. Возраст культуры 4 дня, плотность клеток 1,18 млн кл/мл Na^^NVj,,,. (В этих условиях обменник выносит Ca2* из клеток). 1-контроль; 2-солевой стресс (добавление NaCl до 2М в среду роста).

Табл. 3. Влияние АБК, цАМФ и верапамила на выход Ca2" из клеток Dunaliella maritima за 30 сек. инкубации при градиенте Na* cxt > Na --1. Предварительно клетки нагружали 41Са (1мкКи/мл) инкубацией в минимальной среде в течение 10 мин., после отмывки клетки помещали в минимальную среду (без изотопа) + 20мМ NaCl. Возраст культуры 5 дней, число клеток 1,03 млн/мл (при заданном градиенте Na! \а7Са'~-опмснник в прямом режиме активности - должен выносить Са"+ в среду в

ТТЛ \Гя 1 \ Г* Л Л А«>1»Л11ТГП ^Г1« 1>П11ПШ>ТГ<1 IS тпгтп .itfloii/titTini^ лпптп

№ Вариант нмоль С а"/иг белка % от контроля

1 Контроль 182±10 100

2 Верапамил, ЮмкМ 301+9 165

3 АБК, 1 мкМ 351+3 192

4 АБК+верапамил *220+11 120

5 цАМФ, 1мкМ 293±16 161

6 цАМФ+верапамил 624153 343

*-разница между контролем и опытом недостоверна при Р0.о1

(табл. 3, в. 1 и 2) т.к. при их блокировании верапамилом содержание Са2' в среде инкубации увеличилось на 65% в сравнении с контролем. Из АВК-индуцированного повышения на 92 % Ыа7Са:'-обменником выхода Са2+ из клеток, 72% снова поступали в клетки по верапамил-чувствительному Са2'-'фанепортеру (табл. 3, в. 3 и

4). Экзогенный цАМФ также повышал на 61 % вынос Ca2" из клеток Na7Ca2+-обменником (табл. 3, в. 5 и 1). Блокирование Са2+-каналов верапамилом в присутствии цАМФ показало, что Са2'-каналы закачивали обратно в клетки значительную часть Ca2*, вьшос которого осуществлял обменник, чья активность повысилась циклонуклеотидом (табл. 3, в. 5 и 6). Приведенные данные являются показателем мощности Са2'-каналов и На7Са2'-обменника в клетках D. maritima. Из данных литературы (Костюк, 1986) известно, что цАМФ-зависимое фосфорилирова-ние белков Са2-транспортеров клеток животных повышает их способность транспортировать ионы кальция с помощью Са2*-каналов, Са2*-А'ГФазы и Na+/Ca2+-обменника (рис. 7). Возможно в клетках водорослей цАМФ и АБК повышали интенсивность транспорта Ca2', также индуцируя фосфорилирование белков Са2'-транспортеров.

Из результатов наших экспериментов с цАМФ и блокатором фосфоршшрован-иых Са2+ -каналов (Антипенко, 1991) - верапамилом (табл. 3, в. 5 и 6) следует весьма важный вывод о том, что в клетках растений функционируют также фосфорилированные цАМФ-зависимым способом Са2+-каналы. Найдено, что в клетках растений (Assman, 1995; Volotovsky, 1998) и животных (Авдонин, Ткачук, 1994) цАМФ может прямо, связываясь с белками Са2+-каналов, увеличивать время их открытости без фосфорилирования. Однако в клетках животных время открытости Ca24-каналов увеличивается также цАМФ-зависимым фосфорилированием их белков (Caroni, Carafoli, 1983). Наши результаты, приведенные в табл. 3 (вар. 5 и 6), косвенно свидетельствуют о возможности цАМФ-зависимого фосфорилирования белков Са2'-каналов плазмалеммы, повышая их активность. Возможно, оба способа активирования Са2+-каналов циклонуклеотидом (цАМФ) могут осуществляться и в клетках растений.

В наших опытах АБК-индуцированное за 30 сек повышение содержания Ca2' в клетках в условиях активации обменника в обращенном режиме (перенос 45Са2+ из среды в клетку) осуществлялось Ыа+/Са2+-обменником на 36-61% в разных опытах. Изучение временной динамики АБК-индуцированного транспорта Ca2" показало кратковременные колебания содержания Ca2t в клетках (рис. 9). В соответствии с полученными результатами мы полагаем, что колебательный характер содержания Са2+ в клетках обусловлен изменением соотношения активностей Ca

транспортирующих систем клеток растений. Данные литературы (Медведев, 1998) указывают, что в клетках растений наблюдаются синусоидальные и случайные колебания концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме ([Са2+]с). Например, градиент [Са2+]с в пыльцевых трубках колеблется с частотой в несколько минут (Pierson et al., 1996). Полагают, что колебания [Са2+]с обусловлены активностью Са2+-каналов. Источником колебаний могут быть также заполнение и опустошение внутриклеточных хранилищ, например, вакуолей и ЭПР (Trewavas, Malho, 1997).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выявление участия ряда сигнальных систем: кальциевой (Trewavas, Malho, 1997), МАР-киназной (Knetsch et a!, 1996), NO-синтазной (Wu et al, 1997), аденилатциклазной (Каримова и др., 1998; Тарчевский и др., 1999), липоксигеназной (Гречкин, Тарчевский, 1999) в АБК-индуцированных реакциях растений определяет необходимость дальнейших детальных исследований участия сигнальных систем в ответе клеток растений на действие стрессовых фитогормонов, в том числе АБК.

На основании полученных нами результатов мы делаем вывод об участии в механизмах действия АБК аденилатциклазной сигнальной системы, так как гормон уменьшал содержание эндогенного цАМФ в клетках растений и его секрецию при оптимальной температуре (табл. 1, рис. 1). АБК и цАМФ индуцировали повышение при гипотермии фосфорилирования полипептида 10 кД (рис. 4-6), по данным литературы - активатора ФДЭ цАМФ (Junker, 1977). Зарегистированное нами повышение протеинкиназной активности абсцизовой кислотой в присутствии экзогенного цАМФ (1мкМ) свидетельствует о возможности прямого действия этого фитогормона на цАМФ-зависимые протеинкиназы in vitro (рис. 2). In vivo действие АБК на протеинкиназную активность зависело от времени воздействия гормона (2 и 12 часов) (табл. 2). К настоящему времени найдено, что повышение концентрации ионов кальция в цитозоле клеток растений опосредовано вторичными мессенджерами ИТФз, цАДФР, цАМФ. Полученные нами результаты (табл. 3) по влиянию на транспорт Са2+ из клеток цАМФ и блокатора фосфорилированных Са2+-каналов верапамила свидетельствуют о возможности цАМФ-зависимого фосфорилирования белков Са2+-каналов и На+/Са2+-обменника.

Согласно нашим результатам, данные исследователей о неоднозначности действия АБК на поглощение Са2+ клетками растений (С1агкэоп е1 а1, 1988; БеПе, 1988; Мас11оЬЫе, 1992) объясняются АБК-инудированным изменением соотношения активностей различных Са2+-транспортеров в плазмалемме. Изучение временной зависимости действия АБК на содержание Са2+ в клетках О.тагШта выявило гормон-индуцированное кратковременное повышение содержания Са2+ в клетках, обусловленное входом Са2+ по Са2+-каналам, которое сменялось его падением, затем отсутствием изменения (рис. 9). Последнее было обусловлено активированием механизмов удаления Са2+ из клеток, в частности Ма+/Са2+-обменника, активность переноса Са2+ которым повышалась АБК на 92% (табл. 3). Регуляция АБК переноса Са2* №+/Са2+-обменником осуществлялась в разных режимах работы обменника: прямом (табл. 3) и обращенном (данные не приведены); соответственно, направление Са2+ переноса было из клетки и в клетку.

В наших экспериментах получено доказательство взаимовлияния Са2+- и цАМФ-сигнальных систем: вторичный мессенджер аденилатциклазной системы цАМФ стимулировал АБК-индуцированный транспорт Са2+ (табл. 3); Са2+ участвовал в АБК-индуцированном уменьшении содержания цАМФ (рис. 2). Обнаруженное нами действие верапамила - блокатора фосфорилированных потенциалзависимых Са2+-каналов на транспорт Са2 (табл. 3) - свидетельствует о роли цАМФ-зависимого фосфорилирования белков Са -каналов в усилении транспорта Са2+ в клетки циклонуклеотидом. Последнее свидетельствует о том, что цАМФ может не только, связываясь с белками Са2+-каналов, прямо открывать их без фосфорилирования, но и, фосфорилируя белки Са2+-каналов цАМФ-зависимым способом, увеличивать время их открытости и, соответственно, увеличивать вход Са2+ в клетки (табл. 3, рис. 7).

Итак, полученные в наших экспериментах результаты свидетельствуют об АБК-индуцированной активации аденилатциклазной и кальциевой сигнальных систем, входящих в состав сети клеточных сигнальных систем, осуществляющих регуляцию каскада приспособительных реакций клеток растений к изменившимся условиям среды обитания.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что экзогенная АБК понижала содержание цАМФ в клетках растений и его секрецию в среду, а также изменяла протеинкиназную активность в

присутствии цАМФ.

2. АБК индуцировала изменение профилей радиоактивности '2Р фосфорилированных полипептидов листьев гороха in vivo, которое было различным при оптимальной температуре и при гипотермии.

3. ")кзогенные АБК и цАМФ в условиях гипотермии резко повысили относительный уровень фосфорилированности полипептида 10 кД. По данным литературы это может бы п. белковый активатор ФДЭ цАМФ.

■1. АБК индуцировала кратковременное повышение содержания С а' в клетках D.maritima, сменяющееся ингибированием и отсутствием изменения. 5. АБК индуцировала изменение соотношения активностей Са2'-транспортирующих механизмов плазмалеммы клеток Dunaliella maritima (Са2"-каналы, Na'/Ca2'-обченник) во времени.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Каримова Ф.Г., Бунтукова Е.К., Корчуганова Е Е., Абубакирова (Ягушева) М.Р. Роль фосфорилирования белков и АТФаз в переносе Са2 и Na' в клетках водоросли Dunaliella maritima. // Цитология. 1996. Т. 38. №2. С. 207.

2. Uuntukova Е.К., Korchuganova Е Е., Abubakirova (Iagoucheva) MR., Kanmova F.G. Some aspects of transmembrane Ca2" and Na" transfer depending on N'a* gradient in algae celIs//Ann symp. «Physical-chemical basis of plant physiology» 1996. Puschino. P. 92.

3. Karimova E.G., Buntukova E.K., Korchuganova E.E., Abubakirova (Iagoucheva) MR. The Na /Ca* -exchange in Dunaliella maritima and its modulation by protein phosphorylation.// 10 FESPP Congress «From molecular mechanisms to the plant: an integrated approach», Florence, Italy. 1996. P. 194.

4. Каримова Ф.Г., Бунтукова E.K., Корчуганова E.E., Абубакирова (Ягушева) MP. Влияние экзогенного цАМФ на Na'/Ca2-обмен в клетках Dunaliella maritima.// Второй Съезд Биохим. общества РАН. 1997. Москва. С. 266-267.

5. Ьакуридзе Ц.Л., Захарова О.Ю., Каримова Ф.Г., Абубакирова (Ягушева) MP., Тарчевский И.А. «Ретиналь стимулирует фосфорилирование белков растений». П(Х)Съезд РБО. «Проблемы ботаники на рубеже XX-XXI веков» 26-29 мая 1998. С.-Петербург. С. 147.

6. Корчуганова Е Е., Каримова Ф.Г., Абубакирова (Ягушева) MP. «Влияние тяжелых

металлов на транспорт кальция в клетках растений». 11(Х)Съезд РБО. «Проблем! ботаники на рубеже XX-XXI веков» 26-29 мая 1998. С.-Петербург. С. 175.

7. Корчуганова E.H.. Абубакирова (Ягушева) М.Р.. Каримова Ф.Г. «цАМФ и Ca* участвуют в механизмах действия фитогормона АБК» Междунар конференция «Рецепция и внутри клеточная сигнализация». Пущино. 1998. С. 230-233.

8. Каримова Ф.Г., Корчуганова Е.Е., Тарчевский И.А., Абубакирова (Ягушева) M.F Na*/Ca;'-обмен в клетках растений // Докл АН. 1999. Т. 366. № 6. С. 843-845.

9. Тарчевский И.А.. Гречкин А.Н., Каримова Ф.Г.. Корчуганова Е.Е.. Максютов H.H., Мухтарова Л.Ш., Яковлева В.Г.. Фазлиев Ф.Н., Ягушева М.Р., Палих Э Хохлова J1.1I. О возможности участия циклоаденилатной и липокеш еназно] сигнальных систем в адаптации растений пшеницы к низким температурам / Сборник К1 У Грани сотрудничества. Казань. 1999. С. 299-309.

10. Ягушева М.Р., Каримова Ф.Г. «Влияние АБК на механизмы транспорта Ca" » IV Съезд ОФРР. «Физиология - наука 111 тысячелетия» М. 1999. Тез.докл. С. 185.

11. Karimova F.G.. Kortchuganova H.H., Tarchevsky I.A., lagoucheva M.K. The opposite directed Ca: and Na transmembrane transport in alga cells /'/' Protoplasma. 2000. In press.

и lagoucheva M.R., Karimova F.G.. Tarchevsky I.A. Abscisic acid-induced proteii phosphorylation and с AMP content in plant tissues.// 12lh Congress of the FESPP. 2000 Budapest, Ншшагу. In press. Ci о \)

Отпечатано e ООО «СИДДХИ-СЕКЬЮРИТИ» Казань, уп.Журналистов, 1/J6, офис 211. Тел (8432) 76-74-59 Лицензия №0130 от 1.08.98 г. Заказ jYs274 Тираж 100 экз. Формат 60x84^1 Бумага офсетная. Печать - ризозрафия.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ягушева, Мадина Рашитовна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Фитогормон - абсцизовая кислота

1.2. Аденилатциклазная сигнальная система 16 1.2.1. Аденилатциклазная система в растениях

1.3. Са -сигнальная система 21 1.3.1. Механизмы поддержания Са2+-гомеостаза в клетках

1.3.1.1. Са2+-каналы

1.3.1.2. Ыа+/Са2+-обменник

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Определение содержания цАМФ

2.3. Определение цАМФ-зависимой протеинкиназной активности

2.4. Фосфорилирование белков in vivo

2.5. Определение транспорта Са2+ в клетках водорослей

2.5.1. Поглощение Са клетками водорослей

2.5.2. Активность Na/Са -обменника

2.6. Определение содержания Na+ в клетках водорослей

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Влияние АБК на аденилатциклазную сигнальную систему

3.1.1. АБК-индуцированные изменения содержания цАМФ в клетках растений и его секреции

3.2. Влияние АБК на протеинкиназную активность и фосфорилирование белков

3.2.1. Влияние АБК на протеинкиназную активность in vitro и фосфорилирование белков in vivo

3.2.2. Влияние АБК на фосфорилирование полипептидов in vivo

3.3. Влияние АБК на кальциевую сигнальную систему

3.3.1. АБК-индуцированный транспорт Са2+ в клетках, вклад Са2+-каналов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние абсцизовой кислоты на функционирование кальциевой и аденилатциклазной сигнальных систем"

Актуальность проблемы. Абсцизовая кислота (АБК) играет важную роль в регуляции роста растений и ответной реакции на различные биогенные и абиогенные стрессоры. АБК индуцирует репрограмирование экспрессии генов и синтеза «защитных» белков, что определяет повышение устойчивости растений к различного рода стрессорам. Существующие данные предполагают участие сигнальных систем клеток в ответе на действие АБК. В плазмалемме обнаружен белок (рецептор), характеризующийся высокой степенью сродства к АБК. К возможным медиаторам осуществления ответной реакции на АБК относят Са2+, К+, Н+ и циклическую АДФ-рибозу (Owen, 1988; Quatrano et al, 1994; Heimovaara-Dijkstra et al, 1994). Показано, что в механизм действия АБК включен МАР-киназный сигнальный каскад (Knetch et al., 1996).

Существенным этапом передачи сигнала по системе вторичных посредников является фосфорилирование белков, которое играет кардинальную роль в регуляции многих клеточных процессов эукариот. В настоящий момент доказана роль процессов фосфорилирования-дефосфорилирования белков в клетках прокариот и всех эукариот, включая дрожжи, животные и растения (MacKintosh et al, 1990; Kauss et al, 1991; Cohen, 1992; Cohen et al,1995; Hunter, 1995; Каримова, 1994; Тарчевский, 2000; и др.). Сведения об АБК-индуцированном фосфорилировании белков немногочисленны и получены с помощью ингибиторного анализа. Несмотря на доказательство участия Са2+ в механизмах действия АБК, измеренные изменения поглощения Са2+ при действии АБК в различных растениях были неоднозначны, а в некоторых случаях показано отсутствие действия АБК. Сведения о влиянии АБК на цАМФ-систему в растениях к началу нашего исследования отсутствовали.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы было выяснение участия цАМФ- и Са2+- сигнальных систем в АБК-индуцированном ответе клеток растений. В задачи исследования входило: 1) определить влияние АБК на содержание цАМФ в тканях растений, а также на протеинкиназную активность и фосфорилирование белков; 2) выявить вклад различных механизмов изменения и поддержания Са гомеостаза в цитозоле клеток

9-4растении при действии на них

АБК: Са -каналов (с помощью блокаторов), Ма+/Са2+-обменника при наличии градиента Na+ между клеткой и средой.

Научная новизна работы: Впервые показано АБК-индуцированное снижение содержания цАМФ в клетках растений и интенсивности секреции цАМФ в среду; а также изменения цАМФ-зависимой протеинкиназной активности, зависящие от времени воздействия АБК. Впервые показаны АБК-индуцированные изменения профиля фосфорилированных полипептидов, которые были различными при оптимальной температуре и при гипотермии. Впервые показано беспрецедентно сильное АБК-индуцированное повышение относительного уровня фосфорилированности полипептида (ОУФП) 10 кД при гипотермии. цАМФ также повышал за 2 часа действия гипотермии in vivo ОУФП 10 кД. АБК вызывала кратковременное повышение поглощения Са клетками, сменяющееся понижением или отсутствием изменения транспорта Са . Показано АБК-индуцированное изменение соотношения активностей Са2+-транспортирующих систем клеток растений во времени: Са2+-каналов, Ка+/Са2+-обменника.

Апробация работы: Материалы диссертации доложены на 10 конгрессе федерации европейских физиологов растений FESPP, Florence, Italy, 1996; на Российско-Германской школе молодых ученых, Пущино, 1997; на П(Х) Съезде Русского Ботанического Общества, С.-Петербург, 1998; на Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 1998; на VI Съезде общества физиологов растений России (международная конференция), Москва, 1999; на международном конгрессе нейрохимиков ISN/ESN-Meeting, Берлин, Германия, 1999; на итоговых конференциях КИББ КНЦ РАН (1998, 1999). 7

Благодарности, Приношу свою благодарность коллегам, работавшим со мной в группе: Мухаметчиной Н.У., Ванюшиной С.А., Крутиковой Т.И., Гайнутдиновой А.Х. Глубокую признательность выражаю за плодотворное обсуждение полученных данных и неоценимую дружескую поддержку Каримовой Ф.Г., Гордону JI.X.; за помощь в освоении компьютерных программ и дружескую помощь Колесникову О.В. Особую благодарность выражаю моим научным руководителям И.А. Тарчевскому и H.H. Максютовой за всестороннюю поддержку, терпение и веру в успех нашей работы. Благодарна своей семье за поддержку и понимание.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Ягушева, Мадина Рашитовна

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что экзогенная АБК понижала содержание цАМФ в клетках растений и его секрецию в среду, а также изменяла протеинкиназную активность в присутствии цАМФ.

2. АБК индуцировала изменение профилей радиоактивности 32Р -фосфорилированных полипептидов листьев гороха in vivo, которое было различным при оптимальной температуре и при гипотермии.

3. Экзогенные АБК и цАМФ в условиях гипотермии резко повысили относительный уровень фосфорилированности полипептида 10 кД. По данным литературы это может быть белковый активатор ФДЭ цАМФ.

4. АБК индуцировала кратковременное повышение содержания Са2+ в клетках D.maritima, сменяющееся ингибированием и отсутствием изменения.

5. АБК индуцировала изменение соотношения активностей Са2+-транспортирующих механизмов плазмалеммы клеток Dunaliella maritima (Са2+-каналы, Nа7Са2+-обменник) во времени.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выявление участия ряда сигнальных систем: кальциевой (Trewavas, Malho, 1997), МАР-киназной (Knetsch et al, 1996), NO-синтазной (Wu et al, 1997), аденилатциклазной (Каримова и др., 1998; Тарчевский и др., 1999), липоксигеназной (Гречкин, Тарчевский, 1999) в АБК-индуцированных реакциях растений определяет необходимость дальнейших детальных исследований участия сигнальных систем в ответе клеток растений на действие стрессовых фитогормонов, в том числе АБК.

На основании полученных нами результатов мы делаем вывод об участии в механизмах действия АБК аденилатциклазной сигнальной системы, так как гормон уменьшал содержание эндогенного цАМФ в клетках растений и его секрецию при оптимальной температуре (табл. 1, 2; рис. 7). АБК и цАМФ индуцировали повышение при гипотермии фосфорилирования полипептида 10 кД (рис. 11-13), по данным литературы - активатора ФДЭ цАМФ (Junker, 1977). Зарегистированное нами повышение протеинкиназной активности абсцизовой кислотой в присутствии экзогенного цАМФ (1мкМ) свидетельствует о возможности прямого действия этого фитогормона на цАМФ-зависимые протеинкиназы in vitro (рис. 8). In vivo действие АБК на протеинкиназную активность зависело от времени воздействия гормона (2 и 12 часов) (табл. 3, 4). К настоящему времени найдено, что повышение концентрации ионов кальция в цитозоле клеток растений опосредовано вторичными мессенджерами ИТФ3, цАДФР, цАМФ. Полученные нами результаты (табл. 5) по влиянию на транспорт Са2+ из клеток цАМФ и блокатора фосфорилированных Са2+-каналов верапамила свидетельствуют о возможности цАМФ-зависимого фосфорилирования белков Са2+-каналов и Ыа+/Са2+-обменника.

Согласно нашим результатам, данные исследователей о неоднозначности л | действия АБК на поглощение Ca клетками растений (Clarkson et al, 1988;

Felle, 1988; MacRobbie, 1992) объясняются АБК-индуцированным изменением

•ji соотношения активностей различных Ca -транспортеров в плазмалемме. Изучение временной зависимости действия АБК на содержание Са2+ в клетках D.maritima выявило гормон-индуцированное кратковременное повышение содержания Са2+ в клетках, обусловленное входом Са2+ по Са2+-каналам, которое сменялось его падением, затем отсутствием изменения (рис. 16). Последнее было обусловлено активированием механизмов удаления Са2+ из клеток, в частности На+/Са2+-обменника, активность переноса Са2+ которым повышалась АБК на 92% (табл. 5). Регуляция АБК переноса Са2+ Na7Ca2+-обменником осуществлялась в разных режимах работы обменника: прямом (табл. 5) и обращенном (данные не приведены); соответственно, направление

Ca переноса было из клетки и в клетку.

В наших экспериментах получено доказательство взаимовлияния Са2+- и цАМФ-сигнальных систем: вторичный мессенджер аденилатциклазной системы цАМФ стимулировал АБК-индуцированный транспорт Са2+ (табл. 5); Са2+ участвовал в АБК-индуцированном уменьшении содержания цАМФ (рис. 8). Обнаруженное нами действие верапамила - блокатора фосфорилированных потенциалзависимых Са2+-каналов на транспорт Са2 (табл. 5) - свидетельствует о роли цАМФ-зависимого фосфорилирования белков Са2+-каналов в усилении транспорта Са2+ в клетки циклонуклеотидом. Последнее свидетельствует о том, что цАМФ может не только, связываясь с белками Са2+-каналов, прямо открывать их без фосфорилирования, но и, фосфорилируя белки Са2+-каналов дАМФ-зависимым способом, увеличивать время их открытости и, соответственно, увеличивать вход Са2+ в клетки (табл. 5, рис. 18).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ягушева, Мадина Рашитовна, Казань

1. Абдулаев A.A., Семененко В.Е. Интенсивная культура Dunaliella salina Teod. и некоторые ее физиологические характеристики. // Физиол. раст. 1974. Т. 21. N6. С. 1145-1153.

2. Авдонин П.В., Ткачук В. А. Рецепторы и внутриклеточный кальций. М.:Наука. 1994.

3. Антипенко А.Е. Вторичные посредники в клетках сердца и тладких мышц сосудов. //Биохимия. 1991. Т.56, N4. С.589.

4. Бабаков A.B., Абрамычева Н.Ю.ОТР-связывающие белки в плазматических мембранах высших растений. //Биол Мембраны. 1989. Т. 6. № 3. С. 262-266.

5. Балнокин Ю.В. Ионный гомеостаз у галотолерантных водорослей. Автореф.дисс. докт.биол. наук. М.: ИФР им.К.А.Тимирязева. 1995. С. 51.

6. Берридж М.Д. Молекулярные основы внутриклеточной коммуникации. // В мире науки. 1985, № 12. С.98-109.

7. Гордон JI.X. Дыхание и водносолевой обмен растительных тканей. // Наука. 1976. С. 119.

8. Гречкин А.Н., Тарчевский И.А. Липоксигеназная сигнальная система. // Физиол. раст. 1999. Т.46, № 1. С.132-142.

9. Гриф В.Г., Александров Т.В., Валович Е.М. Действие низких температур на хроматин интерфазного ядра клеток корневой меристемы у Tritium. // Цитология. 1987. Т. 29. №. 3. С.295-302.

10. Ю.Жерелова О.М., Гршценко В.М. Регуляция потенциалзависимых кальциевых каналов плазмалеммы клеток харовой водоросли. // Внутриклеточная сигнализация. М.: Наука. 1988. С. 71-76.

11. И.Каримова Ф.Г. цАМФ-мессенджерная система клеток растений и ее роль в регуляции транспорта воды и Са2+: Автореф. . дис. д.б.н. С.-Пет.: ВНИИ растениеводства им.Вавилова. 1994. С. 39.

12. Каримова Ф.Г., Бунтукова Е.К., Клочкова Е.Е. Поглощение Са2+ клетками ратений. //Цитология. 1991. Т. 33. N. 11. С. 180-183.

13. З.Каримова Ф.Г., Бунтукова Е.К., Тарчевская О.И. "Са2+-парадокс" в растительных тканях. //Физиол. раст. 1989. Т. 36. N. 6. С. 1178-1183.

14. Каримова Ф.Г., Леонова С.А., Гордон Л.Х., Фильченкова В.И. Секреция цАМФ клетками растений. // Физиол. и Биохим. Культ. Раст. 1993. Т. 25. N. 4. С. 362-367.

15. Каримова Ф.Г., Тарчевский И.А., Мурсалимова Н.У., Гречкин А.Н. Влияние продукта липоксигеназного метаболизма- 12-гидроскидодеценовой кислоты на фосфорилирование белков растений. // Физиол. Раст. 1999. Т. 46. N. 1. С. 148-152.

16. Корчуганова Е.Е., Каримова Ф.Г., Бунтукова Е.К. Противоположно направленный трансмембранный перенос Са2+ и Na+ в клетках Dunaliella maritima. //Цитология. 1997. Т. 39. N. 6. С. 409-419.

17. Костюк П.Г. Кальций и клеточная возбудимость. М.: Наука. 1986. С. 256.

18. Левицкий Д.О. Кальций и биологические мембраны М.: Высшая школа. 1990. С. 8-17.

19. Медведев С.С. Физиологические основы полярности растений. Труды: СПб.: о-ва естествоиспытателей: СПб.: Кольна. 1996. С. 159.

20. Медведев С.С. Электрофизиология растений. Изд-во С.-П. Универститета. 1998.

21. Меерсон Ф.З. Общий механизм адаптации и роль в нем стресс-реакции, основные стадии процесса адаптации: физиология адаптивных процессов. М. Наука. 1986. С. 77-123.

22. Новикова Г.В. Гормональная регуляция фосфорилирования ядерных белков : Автореф. дис. . канд. биол.наук М.: ИФР. 1989. 42 С.

23. Палладина Т.А. Транспортные Н+-АТФазы несопрягающих мембран. // Успехи совр. биологии. 1983. Т. 96. N. 3. С. 394-408.

24. Петров-Спиридонов А.Е., Ионева Ж.З. Ионный обмен у растений в условиях хлоридного засоления. // Известия Тимирязев, с.-х. акад. 1987. 2. С. 86-95.

25. Полевой В.В. Физиология растений. //Москва «Высшая школа» 1989.

26. Романко Е.Г., Селиванкина С.Ю., Воскресенская Н.П. Действие фитогормонов in vitro на активность протеинкиназ, связанных с мембранами тилакоидов. //Докл. АН СССР. 1990. Т. 313. N. 4. С. 1021-1023.

27. Селиванкина С.Ю., Муромцева Д.Г., Новикова Г.В., Кулаева О.Н. Регуляция фузикокцином и РНК-полимеразой-I. //Докл. ВАСХНИЛ. 1989. N. 3. С. 2-4.

28. Таланова В.П., Титов А.Ф., Боева Н.П. Изменение уровня эндогенной абсцизовой кислоты в листьях растений под влиянием холодовой и тепловой закалки. // Физиология Растений. 1991. Т. 38. С. 991-997.

29. Тарчевская О.И. Влияние фитогормонов на содержание цАМФ и цАМФ-зависимое фосфорилирование белков в тканях растений: Автореф. дис. .канд. биол. наук Минск. Институт Экспериментальной Ботаники. 1989. С. 17.

30. Тарчевский И. А. Элиситор-индуцируемые сигнальные системы и их взаимодействие. // Физиол. Раст. 2000. Т. 47. С. 321-331.

31. Тихая Н.И., Селиванкина С.Ю., Новикова Г.В. Действие фитогормонов на протеинкиназную активность плазматических мембран корней клеток ячменя. // Физиол. Раст. 1989. Т. 35. N. 5. С. 1003-1011.

32. Феденко Е.П. Фоторегуляция ферментов обмена цАМФ у фототрофных организмов: Автореф. дис. канд. биол. наук. Институт Биохимии им. Баха. Москва. 1993.

33. Феденко Е.П., Иванова М.А., Доман Н.Г. Аденилатциклаза и фитохром. // Докл. АН СССР. 1983. Т. 269. N. 5. С. 1267-1268.

34. Федоров Н.А., Радуловацкий М.Г., Чехович Г.Е. Циклические нуклеотиды и их аналоги в медицине. // М. Медицина. 1990. С. 192.

35. Черницкий М.Ю., Паничкин JI.A., Купленский О.Ю. Роль Са2+ вформировании биоэлектрической реакции листьев огурца. // Физиол. Раст. 1993. Т. 40. N. 2. С. 246-249.

36. Яворская В.К. Физиологическая роль циклического 3', 5'-аденозинмонофосфа-та в растительных клетках: Автореф. дис. докт. биол. наук. Киев. 1990.С. 35.

37. Alexandre L., Lassalles J.P., Kado R.T. Opening of Ca2+channels in isolated red beet root vacuole membrane by inositol 1,4,5-trisphoshate. // Nature. V. 1990. N. 343. P. 567-570.

38. Allan A.C., Fricker M.D., Ward J.L., Beale M.H., Trewavas A.J. Two transduction pathways mediate rapid effects of abscisic acid in Commelina guard cells. //Plant Cell. 1994. V. 6. P. 1319-1328.

39. Anderson M.D., Prasad T.K., Martin B.A., Stewart C.D. Differential gene expression in chilling acclimated maize seedling and evidence for the involvement of ABA in chilling tolerance. //Plant Physiol. 1994. V. 105. P. 331-339.

40. Ashton A.R., Polya G.M. Adenosine 3'5'-cyclic monophosphate in higher plants. Isolation and characterization of 3'5'-cAMP from Kalanchoe and Agave. // Biochem. J. 1977. V. 165. N. 1. P. 27-32.

41. Askman P., Abromeit M., Sarnighausen E., Dorffling K. Formation of polypeptides related to frost tolerance in responce to cold hardering and abscisic acid treatment in winter wheat. // Physiol. Plantarum. 1990. V. 79. P. 105.

42. Assman S.M. Cyclic AMP as a second messenger in higher plants. // Plant Physiol. 1995. V. 108. P. 885-889.

43. Baker P.F., Blaustein M.P. Sodium dependent uptake of calcium by crab nerve. // Biochim. Biophis. Acta. 1968. V. 150. P. 167-170.

44. Baker P.F., Hodgkin A.L., Ridgway E.B. Depolarization and calcium entry in squid giant axons. //J.Physiol. (Gr.Brit). 1971. V. 218. P. 709-755.

45. Baroni M.D., Monti P., Alberghina L. Repression of growth-regulated G1 cyclin expression by cyclic AMP in budding yeast. //Nature. 1994. V. 371. P. 339-345.

46. Barry W.H., Smith T. W. Mechanism of transmembrane calcium movement in cultured chick embryo ventricular cells. // J. Physiol. (Lond). 1982. V. 325. P. 243-260.

47. Behl R., Harting W. Transport and compartmentation of abscisic acid in roots of Hordeum distichou unde osmotic stress. //1, Exp. Bot. 1984. V. 35. N. 159. P. 1433-1440.

48. Bental M., Degani H., Avron M. 23Na NMR studies of the intracellular sodium ion concentration in the halotolerant alga Dunaliella salina. // Plant Physiol. 1988. V. 87. P. 813-817.

49. Bolwell G.P. Cyclic AMP, the reguctant messenger in plants. // TIBS. 1995. 20. December. P. 492-493.

50. Brosnan J.M., Sanders D. Inositol triphosphate-mediated Ca2+ release in beet microsomes is inhibited by heparin. // FEBS Lett. 1990. V. 260. P. 70-72.

51. Caroni P., Carafoli E. The regulation of the Na+/Ca2+-exchange of heart sarcolemma. //Europe. J. Biochem. 1983. V. 132. P. 451-460.

52. Carvajal M., Cooke D.T., Clarkson D.T. Responses of wheat plants to nutrient deprivation may involve the regulation of water channel function. // Planta. 1996. V. 1999. P. 372-381.

53. Chapman K.S.R., Trewavas A., Van Loon L.C. Regulation of the phosphorylation of cromatin-associated proteins in Lemna and Hordenium. // Plant Physiol. 1975. V. 55. P. 293-296.

54. Chen H.H., Li P.H., Brennen M.L. Involvement of abscisic acid in potato cold acclimation. //Plant.Physiol. 1983. V. 71. P.362-365.

55. Clapham D.E. Calcium signaling. // Cell. 1995. V. 80. P. 259-268.

56. Clarkson D.T., Brownlee C., Ayling S.M. // J. Cell Sci. 1988. V. 91. P.71-80.

57. Cohen G.B., Ren R., Baltimore D. Modular binding domains in signal transduction proteins. //Cell. 1995. V. 80. P. 237-248.

58. Cohen P. Signal interaction at the level of proteinkinases, proteinphosphatases and their substrates. // Trends. Biochem. Sci. 1992. V. 12. P. 408-413.

59. Cosgrove D.J., Hendrich R. Stretch activated chloride, potassium, and calcium channels coexisting in plasma membranes of guard cells of Vicia faba L. // Planta.1986. P. 143-153.

60. Cramer G.R., LauchliA., Polito V.S. Displacement of Ca2+by Na+from the plasmalemma of root cells. A primary response to salt stress. // Plant. Physiol. 1985. V. 79. l.P. 207-211.

61. Creelman R.A., Tierney M.L., Mullet J.E. Jasmonic acid/methyl jasmonate accumulate in wounded soybean hypocotyls and modulate wound gene expression. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V.89, № 11. P.4938-4941.

62. Daie J., Campell W.F. Responce of tomato plants to stessfull temperatures. // Plant.Physiol. 1981. V. 61. P. 26-29.

63. Dallaire S.M., Houde Y., Gagne H.S. et al. ABA and low temperature induced freezing tolerance via distinct regulation pathways in wheat. // Plant Cell Physiol. 1994. V. 35. P. 1-4.

64. De Silva D.L.R., Hetherington A.M., Mansfield T.A. Synergism between calcium ions and abscisic acid in preventing stomatal opening. // New Phytol. 1985. V. 100. P. 473-482.

65. DiPolo R., Beauge L. In squid axons ATP modeulates Na+/Ca2+-exchange by a Ca2+rdependent phosphorylation. // Biochim. Biophis. Acta: Biomembranes.1987. V. 897 (M 146). 3. P. 347-354.

66. Du Pont F.M., Bush D.S., Windle J.J., Jones R.L. Calcium and proton transport in membrane vesicules from barley roots. // Plant Physiol. 1990. V.94. P. 179-188.

67. Evans D.E., Briars S.A., Williams L.E. Active calcium transport by plant cell membranes. //J. Exp. Bot. 1991. V. 42. P. 285-303.

68. Fehr T.F., Dickinson E.S., Goldman S.J., Slakey L.L. Cyclic AMP efflux is regulated by occupancy of the adenosine receptor in pig aortic smooth muscle cells. //J. Biol. Chem. 1990. V. 265. N. 19. P. 10974-10980.

69. Felle H. Auxin causes oscillations of cytosolic free calcium and pH in Zea mays coleoptiles. //Planta. 1988. V. 174. P. 495-499.

70. Franco D.A. Cyclic AMP in photosintetic organisms: recent development. // Avd. Cyclic. Nucleotide Res. 1983. V. 15. P. 97-117.

71. Gilman A.G. A protein binding assay for adenosine -3', 5'-cyclic monophosphate. //Proc. Nat. Acad. Sci. 1970. V.67. P.305-312.

72. Gilman A.G. G-protein: transdusers of receptor generated signals. // Ann.Rev. Biochem. 1987. V. 56. P. 615-645.

73. Gilroy S. Signal transduction in barley aleurone protoplasts is calcium dependent and independent. // The Plant Cell. 1996. V. 8. P. 2193-2209.

74. Gilroy S., Read N.D., Trewavas A.J. Elevation of citoplasmic calcium by caged calcium or caged inositol trisphosphater initiates stomatal closure. // Nature. 1990. V. 346. P. 769-771.

75. Gilroy S., Jones R. Perception of gibberellin and abscisic acid at the external face of the plasma membrane barley (hordeum vulgare 1.) aleurone protoplasts. // Plant Physiol. 1994. V. 104. P. 1185-1192.

76. Gilroy S., Jones R.L. Gibberelic acid and abscisic acid coordinately regulate cytoploasmic calcium and secretory activity in barley aleurone protoplasts. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1992. V. 89. P. 3591-3595.

77. Greengard P., Rudolph S.A., Sturtevaut Y.M. Enthalpy of hydrolysis of the 3'bound of adenozine-3', 5' -monophosphate and guanosine-3',5'-monophosphate. //J. Biol. Chem. 1969. P. 18-25.

78. Harting W., Kaiser W.M., Burska C. Release of abscisic acid from leaf strips under osmotic stress. //Z. Pflansen. Phytol. 1983. V. 2. P. 131-138.

79. Heimovaara-Dijkstra S., Hiestek J.C., Wang M. Counteractive effects of ABA and GA3 on extracellular pH and malate in barley aleurone. // Plant Physiol. 1994. V. 106. P. 194-195.

80. Hepler P.K., Wayne R.O. Calcium and plant development. // Ann. Rev. Plant. Physiol. 1985. V. 36. Palo Alto, Calif. P. 397-439.

81. Hetherington A.M., Quatarano R.S. Mechanism of action of abscisic acid at the cellular level. //New Phytol. 1991. V. 119. P. 9-32.

82. Hocking T.J., Claplan J., Cattel K.J. Abscisic acid binding to subcellular fractions from leaves of vicia faba. //Planta. 1978. V. 138. N. 2. P. 303-307.

83. HolappaL.D., Walker-Simmons M.K. The wheat abscisic acid-responsive proteinkinase mRNA, PKABA1, is up-regulated by dehydration, cold, temperature, and osmotic stress. //Plant Physiol. 1995. V. 108. P. 1203-1210.

84. Hong S.W., Jon J.H., Kwak J.M., Nam H.G. Identification of a receptor-like proteinkinase gene rapidly induced by abscisic acid, dehydration, high salt, andcold treatments in Arabidopsis thaliana. // Plant Physiol. 1997. V. 113. P. 12031212.

85. Hunter T. Proteinkinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling. // Cell. 1995. V. 80. P. 225-236.

86. Ingram J., Battels D. The molecular basis of dehydration tolerance in plants. // Annu. Rev. Plant.Physiol. Plant Mol. Biol. 1996. V. 47. P. 377-403.

87. Janowiak F., Dorffling K. Chilling of maize seedlings: changes in water status and abscisic acid content in ten types differing in chilling tolerance. // Plant Physiol. 1996. V. 147. P. 582-588.

88. Johannes E., Brosnan J.M., Sanders D. Parallel pathways for intracellular Ca2+ release from the vacuole of higher plants. // Plant J. 1992. V. 2. P. 97-102.

89. Johnson KD., Chrispeels M.J. Tonoplast-bound protein kinase phosphorylates tonoplast intrinsic protein. //Plant Physiol. 1992. V. 100. P. 1787-1795.

90. Jundt H., Porzig H., Reuter H., Stucki J.W. The effect of substances releasing intracellular calcium ions on sodium-dependent calcium efflux from guinea pig auricles. //J. Physiol. (Lond). 1975. V. 246. P. 229-253.

91. Junker S. Verbeek-Wyndaele R., Truelsen T. A., Characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterase activity in sunflower callus. // Physiol. Plant. 1977. V. 39. P.45-50.

92. Kang E.S., Gates R.E., Chiang T.M., Kang A.H. Ectoprotein kinase activity of the isolated rat adipocytes. //Biochem. Biophys. Res. Comm. 1979. V. 86. P. 769774.

93. Karimova F.G., Kortchuganova E.E., Tarchevsky I.A., Iagoucheva M.R. The opposite by directed Ca2+ and Na+ transmembrane transport in alga cells. // Protoplasma. 2000. In press.

94. Kauss H. Some aspects of calcium-dependent regulation in plant metabolism. // Ann. Rev. Plant Physiol. 1987. V. 38. P. 47-72.

95. Kauss H., Jeblik V. Indused Ca2+ uptake and callose synthesis in suspension-cultured cells of catharanthus roseus are decreased by the protein phosphatase in hibitor okadaic acide. //Physiol. Plantarum. 1991. V. 81. N. 3. P. 309-312.

96. Kawabe K., Kodaki T., Katayama K. Identification of lipid Inhibitor of MammalianPhospholipaseD. //J. Biochem. 1998. V. 123. P. 870-875.

97. Kikkawa U., Minakuchi R., Takoi Y., Nishizuka Y. Calcium activated phospholipid dependent protein kinase (Protein kinase C) from rat brain. // Methods Enzymology. 1983. V. 99. P. 288-289.

98. Knetsch M.Z.W., Wang M., Snaaz-Jagalska B.E., Heimovaara-Dijkstra. Abscisic acid induces mitogen-activated protein kinase activation in Barley aleurone protoplasts. // The Plant Cell. 1996. V. 8. P. 1061-1067.

99. Knight C.D.,Sehgal A., Kamaljit A., Wallace J.C., Cove D.J., Coates D., Quatrano R.S., Bahadur S., Stockley P.G., Cuming A. Molecular responses toabscisic acid and stress are conserved between Moss and Cereals. I I Plant Cell. 1993. V. 7. P. 499-506.

100. La Rosa P.C., Handa A.K., Hasegawa P.M., Bressan R.A. Abscisic acid accelerates adaptation of cultured tobacco cells to salt. // Plant Physiol. 1985. V. 79. P. 138-142.

101. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the nead of bacteriophag T4. //Nature. 1970. V. 227. N. 5259. P. 680-685.

102. Lang V., Heino P., Palva E.T. Low temperature accimilation and treatment with exogenous abscisic acid induse common polipeptides in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. // Theor Appl. Genet. 1989. V. 77. P. 729-734.

103. Leckie C.P., Mc Ainsh M.R., Allen G.J., Sanders D., Hetherington A.M. Abscisic acid-induced stomatam closure mediated by cyclic ADP-ribose. // Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 1998. V. 95. P. 15837-15842.

104. Lee Y., Choi Y.B., Suh S., Lee J., Assmann S.M., Joe C.O., Kelleher J.F., Crain R.C. Abscisic acid-induced phosphoinositide turnover in guard cell protoplasts of Vicia Faba. //Plant Physiol. 1996. V. 110. P. 987-996.

105. Leung J., Bouvier-Durand M., Morris P.Ch., Guerrier D., Chefdor F., Giraudat J. Arabidopsis ABA response gene AJBI1: features of a calcium-modulated protein phosphatase. //Science. 1994. V. 264. P. 1448-1452.

106. Leung J., Merlot S., Giraudat J. The Arabidopsis abscisic acid insensitiver (ABI 2) and ABI 1 genes encode homologous protein phosphatases 2C involved in abscisic acid signal transduction. // Plant Cell. 1997. V. 9. in press.

107. Lowry C.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. N. 1. P. 265-275.

108. Maathnis F.J.M., Sanders D. Plant membrane transport. // Curr. Opin. Cell Biol. 1992. V. 4. P. 661-669.

109. Mac Robbie E.A.C. Calcium and ABA-induced stomatal closure. // Proc. R. Soc. London. 1992. Ser. B. V. 338. P. 5-18.

110. Mac Robbie E.A.C. Calcium influx at the plasmalemma of isolated guard cells of Commelina communis. Effects of abscisic acid. //Planta. 1989. V. 178. P. 231241.

111. MacKintosh S.G., Sitt C.M. Sucrose-phosphate sysnphase in dephosphorylated by protein phosphatases 2A in spinach leaves. Evidence from the effects of okadaic acid and microcyctin. // FEBS Lett. 1990. V. 270. P. 198-202.

112. Matoh T., Ohta D., Takahaski E. Effect of sodium application on growth of Amaranthus tricolor L. //Plant Cell Physiol. 1986. V. 27. N. 2. P. 187-192.

113. Melan M.A., Dong X., Endara M.E., Davis K.P., Ausubel F.M., Peterman T.K. An arabidopsis thaliana lopixygenase gene can be induced by pathogens, abscisic acid, and methyl jasmonate. //Plant Physiol. 1993.V. 101. P. 441-450.

114. Miller A.S., Vogg G., Sanders D. Cytosolic calcium homeostasis in fungi: roles of plasma membrane transport and intracellular sequestration of calcium. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V.87. P. 9348-9352.

115. Minorsky P.V. An heuzistic hypotheses of chilling injuri in plants: a role for calcium as the primary physiological trundsduces of injuri. // Plant Cell Envirop. 1985. V. 8. N. 2. P. 75-94.

116. Munnik T., Irvine R.F., Musgrave A. Phospholipid signaling in plants. // Biochimica et Biophysica Actal389. 1998. P. 222-272.

117. Munnik T., Steven A.A., Vrige T., Musgrave A. G-protein activation stimulates phospholipase D signaling in plants. // The Plant Cell. 1995. V. 7. P. 2197-2210.

118. Neuhaus G., Bowler C., Kern R., Chua N.-H. Calcium/Calmodulin-dependent and -independent phytochrome signal transduction pathways. // Cell. 1993. V. 73. P. 937-952.

119. Owen J.H. Role of abscisic acid in Ca2+ second messenger system. // Physiol. Plant. 1988. V. 72. P.637-641.

120. Pantoja O., Gelly A., Blumwald E. Voltage dependent calcium channels in plant vacuoles. //Science. 1992. V. 255. P. 1567-1570.

121. Pei Z.-M., Kuchitsu K., Ward J.M., Schwarz M., Schroeder J.I. Differential abscisic acid regulation of guard cell slow anion channels in Arabidopsis wildtype and abil and abi2 mutants. // Plant Cell. 1997. V. 9. P. 409-423.

122. Pick V., Ben-Amotz A., Kami L., Seebergts C.J. Partial characterization of K+ and Ca2+ uptake systems in the halotolerant alga Dunaliella salina. // Plant Physiol. 1986. V. 81. P. 875-881.

123. Pierson E.S., Miller D.D., Callaham D.A., Van Aken J., Hackett G., Hepler P.K. Tip localised calcium entry fluctuates during pollen tube growth. // Dev. Biol. 1996. V. 174. P. 160-173.

124. Ping Z., Yabe I., Muto S. Identification of K+, CI" and Ca2+ channels in the vacuolar membrane of tobacco cell suspension cultures. // Protoplasma. 1992. V. 171. P. 7-18.

125. Quatrano R.S., Battels D., Ho T.-H.D., Pages M. Meeting report. New Insights into ABA-MediatedProcesses. //Plant Cell. 1997. april. P. 470-475.

126. Ralph R.K., Mc Combl P.J.A., Tenner G., Wojcic S.J. Evidence for the modification of proteine phosphorylation by citokinines. // Biochem. J. 1972. V. 130. P. 901-911.

127. Rasmussen H. Calcium as intracellular messenger in hormone action. Regulation phosphate and mineral. // Metabolism. N.-Y., London. 1982. P. 473491.

128. Rasmussen H., Barret P.Q. Calcium messenger system: an integrated view. // Physiol. Rev. 1984. V. 64. N 3. P. 938-984.

129. Reuter H., Seitg N. The dependence of calcium efflux from cardiac muscle on temperature and external ion composition. // J. Physiol. (Lond) 1968. V. 195. P. 451-470.

130. Ritche S., Gilroy S. Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 2697-2702.

131. Schmidt C., Schelle I., Liao Y., Schroeder J.I. Strong regulation of slow anion chanels and abscisic acid signaling in guard cells by phosphorylation and dephosphorylationevents. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 95359539.

132. Segaloff D.L., Ascoli M. Internalisation of peptide hormobes and hormone receptors. //Hormones and their actions. Amsterdam, A.O.: Elsevier, 1988. Pt. 1. P. 133-149.

133. Sing N.K., La Rosa P.C., Handa A.K., Hasegawa P.M. Hormonal regulation of protein synthesis associated with salt tolerance in plant cells. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1987. V. 84. P. 739-743.

134. Spiteri A., Viratelle O.M., Raymond P., Rancillac M., Labouesse J., Pradet A. Artefactual origins of cyclic AMP in higher plant tissues. // Plant Physiol. 1989. Y. 91. P. 624-628.

135. Sutherland E.W., Rail T.W., Mennon T. Adenyl cyclase distribution, preparation and properties. //J. Biol.Chem. 1962. V. 247. P. 1220-1227.

136. Taussing R., Gilman A.G. Mammalian Membrane Bound Adenylyl Cyclases. // The J. BioLChem. 1995. V. 270. P. 1-4.

137. Tazawa M., Kishimoto U., Kikuyama M. Potassium, sodium and chloride in the protoplasm of characeae.//Plant Cell Physiol. 1974. V. 15. N. l.P. 103-110.

138. Trewavas A.J., Malho R. Signal Perception and Transduction: the origin of the phenotype. // The Plant Cell. 1997. V. 9. P. 1181-1195.

139. Ueda T. Na+-Ca2+ exchange activity in rabbit Cymphocyte plasma membranes. //Biochim. Biophys. Acta. 1983. V. 734. P. 342-346.

140. Van Breemen C., Hwang O., Siegel B. Excitation-contraction coupling in smooth muscle. Elsevier: North-Holland Biomed. Press. 1977. P. 243-252.

141. Volotovsky I.D., Sokolovsky S.G., Molchan O.V., Knight M.R. Second messengers mediate increases in cytosolic calcium in tobacco protoplasts. // Plant Physiol. 1988. V. 117. P. 1023-1030.

142. Wakabayashi S., GoshimaK. Kinetic studies on sodium-dependent calcium uptake by myocardial cells and neuroblastoma cells in culture. // Biochim. Biophys. Acta. 1981. V. 642. P. 158-172.

143. White A.A., Zenser T.V. Separation of cyclic 3'5'-nucleoside monophosphates from other nucleotides on aluminium oxide columns. // Anal. Biochem. 1971. V. 41. N. 41. P. 372-396.112

144. Williamson R.E., Ashley C.C. Free Ca2+ and cytoplasmic streaning in the alga Chara.//Nature. 1982. V. 296. N58. P. 647-651.

145. Wu Y., Kuzma J., Marechal E„ Graeff R., Lee H.G., Foster R., Chua N.-H. Abcisic Acid Signaling Trough Cyclic ADF-Ribose In Plants. // Science. 1997. V. 278. P. 2126-2130.

Информация о работе

Ягушева, Мадина Рашитовна
кандидата биологических наук
Казань, 2000
ВАК 03.00.12

Диссертация

Влияние абсцизовой кислоты на функционирование кальциевой и аденилатциклазной сигнальных систем - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы