Влияние 24-эпибрассинолида на фосфорилирование белков растений

Федина, Евгения Олеговна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние 24-эпибрассинолида на фосфорилирование белков растений
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние 24-эпибрассинолида на фосфорилирование белков растений"

На правах рукописи

ФЕДИНА ЕВГЕНИЯ ОЛЕГОВНА

ВЛИЯНИЕ 24-ЭПИБРАССИНОЛИДА НА ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ РАСТЕНИЙ

03.00.12 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2006

Работа выполнена в лаборатории сигнальных систем Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор

Каримова Ф.Г. (КИББ КНЦ РАН, г. Казань)

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор

Максютова H.H. (КИББ КНЦ РАН, г. Казань)

- доктор биологических наук, профессор Шакирова Ф.М.

(Институт биохимии и генетики УНЦ РАН г. Уфа)

Ведущая организация - Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН (г. Москва)

Защита состоится-^? ¿is.yf 2006 года в часов на заседании диссертационного совета К 002. 005. 01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Казанском институте биохимии и биофизики КазНЦ РАН по адресу 420111 Казань ул. Лобачевского 2/31, а/я - 30.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Казанского научного центра РАН.

Автореферат разослан Oi-t-öZJj 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А.Б. Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фитогормон 24-эпибрассинолид (ЭПБ) - один из наиболее активных представителей брассиностероидов, структурно сходных со стероидными гормонами животных - вызывает широкий спектр ответов клетки, включая рост растений, прорастание семян, активность фотосинтеза, фиксацию азота, повышение устойчивости к холоду, патогенам, солевому стрессу (Khripach et al., 2000; Шакирова, 2001). Большая часть современных исследований направлена на выяснение молекулярных механизмов действия сигнала ЭПБ: выявлены рецепторы на плазматических мембранах, их трансфосфорилирование по Ser/Thr (Nam and Li, 2002). Обнаружена киназа, фосфорилируюшая ядерные белки (Не et al., 2000), а также факторы регуляции транскрипции, участвующие в брассиностероид-регулируемой экспрессии генов (Yin et al., 2005; Li and Deng, 2005). В то же время, практически не изучена роль конкретных сигнальных систем в реакции растений на брассиностероиды. Сигнальные системы клеток - это каскады биохимических реакций, принимающих участие в распознавании и рецепции внеклеточных сигналов, их трансформации, усилении и передаче в геном. В результате этих процессов происходит изменение программы экспрессии генов, и, как следствие, адаптация растений к изменившимся условиям существования.

Известно, что фосфорилирование белков является обязательным этапом функционирования всех сигнальных систем. Активность до 30 % белков эукариот регулируется фосфорилированием/дефосфорилированием (Cohen, 2004), в основном, по остаткам серина, треонина, тирозина и гистйдина. Тирозиновое фосфорилирование белков составляет относительно небольшую долю от общего фосфорилирования, но принимает участие в регуляции целого ряда процессов метаболизма у растений (Luán et al., 2001). Фосфорилирование белков по тирозину играет ключевую роль и в осуществлении контроля над процессами пролиферации и дифференцировки клеток (Hunter, 1995; Mustelin and Hunter, 2002). В литературе информация о влиянии брассиностероидов на тирозиновый тип фосфорилирования белков растений отсутствует. В связи с этим, изучение механизмов действия брассиностероидов на фосфорилирование/дефосфорилирование белков растений является актуальным.

Цель и задачи исследования. Цель проводимых исследований заключалась в выявлении сигнальных систем и идентификации фосфорилированиых белков листьев гороха, участвующих в сигналинге брассиностероидов.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1, Выявление влияния 24-эпибрассинолида на общее фосфорилирование белков.

2. Исследование влияния эпибрассинолида на тирозиновое фосфорилирование белков и вклада протеинкиназ и протеинфосфатаз в уровень их фосфорилированности.

3. Идентификация некоторых выявленных белков, тирозиновое фосфорилирование которых регулируется 24-эпибрассинолидом.

4. Определение возможности участия липоксигеназной и супероксидсинтазной сигнальных систем в эпибрассинолид-индуцированном фосфорилировании белков.

Научная новизна работы. Впервые выявлена регуляция 24-эпибрассинолидом уровня фосфорилирования белков по тирозину, что было вызвано действием 24-эпибрассинолида на активность тирозиновых протеинкиназ и протеинфосфатаз. Впервые показано влияние эпибрассинолида на липоксигеназную и супероксидсингазную сигнальные системы, о чем свидетельствует повышение содержания оксилипинов, а также эндогенной Н202. Впервые методом МАЬОЬТОР МБ идентифицированы белки цикла Кальвина, тирозиновое фосфорилирование которых регулируется эпибрассинолидом.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные о влиянии эпибрассинолида на фосфорилирование белков растений, в частности на тирозиновое фосфорилирование ряда белков цикла Кальвина, помогут приблизиться к пониманию механизма повышения брассиностероидами фотосинтетической активности растений и, в связи с этим, повышения их урожайности. Результаты работы могут быть использованы при подготовке и чтении курсов лекций на кафедрах биохимии и физиологии растений в университетах и сельскохозяйственных ВУЗах.

Связь работы с научным» программами и собственный вклад автора в исследования. Работа в 2001-2006 гг. проводилась в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме «Взаимодействие сигнальных систем клеток растений». Исследования автора являлись частью работ, проводимых по грантам РФФИ 04-04-49348, 04-04-49350, а также по гранту ведущей научной школы. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на 6"й международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пушино, 2002); 13'" международном конгрессе РЕЭРР (Греция, 2002); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005); 1(1Х) международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006); II международном симпозиуме «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006), а также на итоговых конференциях Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ (2004 - 2006).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, в том числе 4 статьи, две из которых опубликованы в центральных российских научных журналах.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность акад. И.А. Тарчевскому за советы при обсуждении результатов экспериментов; д.б.н., профессору Ф.Г. Каримовой за всестороннюю помощь и поддержку; чл.-корр. HAH Беларуси, д.х.н. В А. Хрипачу за любезное предоставление 24-эпибрассинолида; к.б.н. И.Р. Чечеткину за помощь в проведении экспериментов, связанных с ВЭЖХ-разделением оксигенированных производных линолевой кислоты; д.х.н. Серебряковой М.В. за проведение идентификации белков с помощью метода MALDI-TOF масс-спекгрометрии.

Структура и объем работы. Диссертация состоит го введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, заключения, основных выводов работы, списка литературы. Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста, содержит 37 рисунков и 3 таблицы. Список литературы включает 213 наименований.

1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Эксперименты in situ проводили на листьях и корнях 9-дневных растений гороха Pisum sativum, которые были выращены при оптимальных условиях (освещенность 10000 Люкс, 25'С, с фотопериодом 10 часов), на V* среды Хогланда-Арнона 1. На рис. 1 представлена схема опытов по изучению общего и тирозинового фосфорилирования белков.

Для определения общего фосфорилирования белков in situ побеги гороха прединкубировали в среде Хогланда-Арнона 1 с добавлением Э2Р-ортофосфорной кислоты (10 МБк) в течение 4 часов при 25°С. Затем проростки инкубировали в растворе ЭПБ (0.1 мкМ), 4-бромфенилацилбромида (БФБ) (10 мкМ) и ЭПБ+БФБ, которые были добавлены в среду роста без изотопа. БФБ - ингибитор фосфолипазы Л2 (ФЛА2) -ключевого фермента липоксигеназного сигнального каскада. Гомогенизацию листьев проводили в соотношении 1:2 со средой гомогенизации, содержащей 50 мМ трис-НС1 буфер pH 7.5, 1 мМ ДТТ, 1 мМ ПМСФ (ингибитор сериновых протеаз), 250 мМ сахарозы, 1 мМ теофиллин (ингибитор фосфодиэстеразы цАМФ), 1 мМ ЭДТА (ингибитор металлопротеаз), 3% поливинилпирролидон (для связывания фенольных соединений) и 10 мМ Na2W04 (ингибитор протеинфосфатаз). Гомогенагг центрифугировали 5 мин при 5°С и 14000g.

Часть супернатанта использовали для определения включения 32Р-ортофосфата в белки. Для этого 20 мкл супернатанта каждого образца наносили на фильтры "Whatman ЗММ", которые промывали 4 раза 5-10% трихлоруксусной кислотой, содержащей растворы ингибиторов протеинфосфатаз Na2W04, КН2Р04, Na^C^, в концентрации 10 мМ, затем — ацетоном и высушивали.

Центрифугирование

Включение 32Р„ в . белки на фильтрах Whatman 3 ММ

Супернатант

Одномерный электрофорез

Выделение белка

Двумерный электрофорез

МАЦЛ-ТОР МБ выявленных белков

Вестерн-блотинг с использованием

моноклональных антител к фосфотирозиновым белкам РУ20

Радиоавтография

Хемилюминесценция

Обработка данных

Рис. 1 Схема опытов по изучению фосфорилирования белков листьев гороха

Радиоактивность на фильтрах просчитывали в сцинтилляте ЖС-8 на счетчике "Дельта-300" (США). Удельную радиоактивность выражали в тыс. имп./мин на мг белка. Другую часть супернатанта разделяли методом одномерного электрофореза в 620% градиенте полиакриламидного геля по Laemmli (1970) с последующей экспозицией гелей на рентгеновской пленке ПО «Тасма» (Казань, Россия). Гели окрашивали серебром.

Количество белка в пробах определяли по методу Бредфорда.

Для определения тирозииового фосфорилироваиия белков проростки гороха, выращенные на среде Хогладда-Арнона 1, отделяли от корней и помещали в растворы ЭПБ (0.1 мкМ) или других эффекторов. Супернатант гомогенатов листьев использовали как для приготовления образца для одномерного электрофореза, так и для осаждения белка для двумерного электрофореза. Приготовление образца для одномерного электрофореза проводили согласно методике Laemmli (1970). Белки для двумерного электрофореза осаждали холодным 80% ацетоном. 100 мкг белка растворяли в изоэлектрофокусирующем буфере (8 М мочевина, 2 М тиомочевина, 2% ХАПС, 0,2% амфолита рН 3-10,3 мМ ДТТ и 20 мМ Трис).

Белки разделяли с помощью одномерного или двумерного электрофореза. После электрофореза проводили Вестерн-блотинг - перенос разделенных белков из геля на мембрану. После проведения Вестерн-блотинга мембрану помещали на 1 ч в 1% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) для предотвращения неспецифического связывания антител с мембраной. Отмывку мембраны от излишков БСА проводили 10 мМ раствором солевого Трис-HCl буфера рН 7.5, содержащим 100 мМ NaCl и 0,1 % Твин-20. Затем мембраны инкубировали 1 ч при комнатной температуре с антителами к фосфотирозиновым белкам PY20 («Amersham», UK), конъюгированными с перокскдазой хрена в разведении 1:1000 в солевом Трис-HCl буфере, содержащем 0,1 % Твин-20. Для визуализации тирозииового фосфорилироваиия белков блоты инкубировали в хемилюминесцентном реагенте («Amersham», UK.), а белки мембран окрашивали 0,1 % Кумасси R-250, затем отмывали 50 % этанолом.

Обработка данных. Для вычисления удельного фосфорилирования белков сканированное изображение пленок, гелей и мембран одномерного электрофореза переводили в числовые значения оптической плотности с помощью программы Image Master ID (Англия), а двумерного электрофореза - с помощью программы Flicker (http://open2dprot.sourceforge.net/Flicker) (США). Удельное общее и удельное тирозиновое фосфорилирование выражали как отношение оптической плотности фосфорилированного белка (хемилюминесценции или радиоавтографии), идентифицированного на радиоавтографической пленке, к оптической плотности того же самого белка, идентифицированного на мембране или геле, окрашенных Кумасси R-250. Величину удельного общего или тирозииового фосфорилирования оценивали в относительных единицах (отн. ед.).

Для идентификации белков кусочки (1x1 мм) пятен белков, разделенных методом двумерного электрофореза, дважды промывали для удаления красителя Кумасси R-250 путем инкубации в 150 мкл 100 мМ NH4HCO3 в 40 % ацетонитриле в течение 20 мин при 5б°С. После промывки кусочки геля дегидратировали в 150 мкл ацетонитрила. Ацетонитрил удаляли, а кусочки геля высушивали (в открытой пробирке на воздухе). Трипсинолиз белка проводили в растворе модифицированного трипсина, растворенного в 50 мМ NH4HCO3, с концентрацией трипсина 15 мкг/мл. Гидролиз проводили в течение 2 ч при 56°С, затем к раствору добавляли 5 мкл 0,5 % трифторуксусной кислоты, растворенной в 10 % растворе ацетонитрила, и тщательно перемешивачи. Надгелевый раствор использовали для получения MALDI-TOF масс-спектров. Для подготовки образцов для времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной ионизацией (MALDI-TOF MS) на мишени смешивали по 0,5 мкл раствора образца и раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (6 мМ в 20 % ацетонитриле, содержащем 0,5 % трифторуксусной кислоты), полученную смесь высушивали на воздухе. Масс-спектры регистрировали на MALDI-TOF масс-спектрометре BRUKER Ultraflex («Брукер», Германия), оснащенном УФ лазером (337 нм). Масс-спектры получены в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона; точность измеренных масс после проведения внутренней калибровки (по молекулярным массам пептидов-продуктов автолиза трипсина) составляла 0,005 % (=50ррт). Для идентификации белков по масс' 'спектрометрическим пептидным картам использовали поисковую программу Mascot (www.matrixscience.com). Поиск проводили в базе данных NCBI.nr (http://ncbi.nlm.nih.gov) с ограничением по таксону Viridiplantae (зеленые растения) с указанной точностью и с учетом возможного окисления метионинов кислородом воздуха, возможной модификации цистеинов акриламидом и неполного прохождения протеолитического гидролиза. При указанных ограничениях, критерием достоверности поиска является значение больше 65 единиц. Характеризующая величина достоверности определяется исходя из уникальности регистрируемого набора масс для белка из базы данных, количества предполагаемых пептидов и полноты перекрывания последовательности фрагментов белка.

Определение содержания Н;Ог в корнях проводили методом FOX1 (Wolff, 1994), основанном на окислении Fe2+ перекисью водорода, сопрождающимся реакцией Fe3+ с - ксиленбловым оранжевым (о-крезолсульфонфталеин 3', 3"-бис[метилимино] | : диуТссусная кислота, натриевая соль). Отсеченные корни гороха инкубировали в растворе ЭПБ (0,1 мкМ)'в течение 20 мин, затем гомогенизировали в холодном ацетоне. Гомогенат центрифугировали при 12000g 15 мин. Для определения содержания Н2О2 '' супернатант смешивали в соотношении 1:1 с реагентом (500 цМ железо (II) аммоний сульфат гексагидрат, 50 мМ ксиленоловый оранжевый, 200 мМ сорбитол, 50 мМ H2SO4) ' и выдерживали Г час в темноте для полного окрашивания раствора. Продукт реакции измеряли спектрофотометрически при 560 нм.

Определение содержания оксигенированных производных линолеата. Для суждения о содержании оксигенированных производных линолевой кислоты был применен методический подход, основыванный на появлении двух сопряженных связей и максимума поглощения при 232 нм в ранних продуктах липоксигеназных реакций. Определение оксигенированных производных линолеата проводили согласно схеме, указанной на рис.2.

Гомогенизация листьев

Центрифугирование

Супернатант

Инкубация 10 мин с линолевой кислотой (1 мМ)

Экстрагирование продуктов реакции смесью этоксиэтанол:гексан (1:1)

/ \

Спектрофотометрия при ВЭЖХ 232 нм

Рис. 2 Схема опытов определения содержания оксигенированных производных линолеата в листьях гороха

После инкубации (20 мин) побегов гороха в растворах ЭПБ (0,1 мкМ), БФБ (10 мкМ) и ЭПБ+БФБ листья гомогенизировали со средой гомогенизации (1:2) и центрифугировали 5 мин при 5°С и 14000,?. Супернатанты гомогенатов листьев являлись ферментным препаратом для определения липоксигеназной активности.

Субстратом реакции служила линолевая кислота (1мМ), растворенная в 0,1М фосфатном буфере рН 6.5. Через 10 мин фермент-субстратную реакцию останавливали

добавлением ледяной уксусной кислоты. Затем проводили экстрагирование продуктов липоксигеназный реакций из водного раствора фермент-субстратной смеси путем добавления смеси этоксиэтанола и гексана (1:1). Верхнюю фазу отбирали и содержание гидроперекисей линолевой кислоты оценивали спектрофотометрически при 232 нм.

Индивидуальные продукты липоксигеназного окисления определяли методом ВЭЖХ на колонке с нормальной фазой при изократических условиях с использованием системы растворителей гексан:изопропанол:уксусная кислота- 98,5:1,4:0,1 (по объему). Скорость потока элюента составляла 0,4 мл/мин.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Влияние 24-эпибрассинолида на общее фосфорилирование растворимых

белков листьев гороха

Наши эксперименты по исследованию динамики действия 24-эпибрассинолида ш

• 22 situ на общее фосфорилирование белков листьев гороха с использованием Р-

ортофосфата показали, что ЭПБ вызывал усиление фосфорилирования белков при всех

исследовавшихся экспозициях по сравнению с контролем (рис. 3). Нужно заметить, что

фосфорилирование белков в контроле слабо изменялось во времени.

Время, мин

10 20 30

Рис. 3 Временная зависимость общего фосфорилирования in situ растворимых белков листьев 9-дневных проростков гороха под действием 24- эпибрассинолида: □ - Контроль, | - ЭПБ (0.1 мкМ)

Приведенные на рис. 3 данные являются интегральным показателем изменения уровня фосфорилированности всего спектра полипептидов, в котором уровень фосфорилированности индивидуальных белков может изменяться по-разному под влиянием эпибрассинолида.

Для выявления возможного участия липоксигеназного сигнального каскада в эпибрассинолид-индуцированном изменении фосфорилировании белков был использован 4-бромфенилацилбромид (БФБ), являющийся ингибитором ФЛА2 — начального фермента липоксигеназной сигнальной системы. При оценке значений удельного общего фосфорилирования полипептидов, полученных с помощью одномерного электрофореза и последующей радиоавтографией, было выявлено, что фитогормон увеличивал, а ингибитор фосфолипазы А2 снижал фосфорилирование полипептидов 22 и 24 кДа по сравнению с контролем (рис. 4).

кДа

Рис. 4 Влияние 24-эпибрассинолида и БФБ (20 мин) на удельное общее фосфорилирование растворимых полипептидов 9-дневных листьев проростков гороха: □ - контроль, | - ЭПБ (0.1 мкМ), Щ-БФБ (10 мкМ)

Полученные данные свидетельствуют о способности эпибрассинолида влиять на активность ферментов фосфорилирования/ дефосфорилирования белков: протеинкиназ и протеинфосфатаз, от соотношения активности которых зависит наблюдаемый нами уровень фосфорилирования. Увеличение уровня фосфорилирования полипептидов 22 и 24 кДа под воздействием эпибрассинолида свидетельствует о ключевой роли фитогормона в регуляции активности этих белков.

Изменение уровня радиоактивности этих же белков под воздействием ингибитора ФЛА2 свидетельствует о влиянии компонентов липоксигеназной сигнальной системы, в том числе ФЛА2, на уровень их фосфорилирования, а, следовательно, и на регуляцию их активности.

2.2. Влияние 24-эпибрассинолида на тирозиновое фосфорилирование растворимых

белков листьев гороха

Для выявления тирозинового фоефорилирования белков листьев гороха были использованы моноклональные антитела к белкам, фосфорилирующимся по тирозину. Проведенные нами исследования с использованием этих антител подтвердили наличие в растительных клетках тирозинового фоефорилирования (рис. 5), что может свидетельствовать о наличии активных тирозиновых протеинкиназ. Антитела к фосфотирозиновым белкам проявили заметную кросс-реактивность с 7 растворимыми полипептидами: 15, 19, 22,26, 31, 36 и 47 кДа.

Нужно отметить, что белок 24 кДа, общее фосфорилирование которого регулировалось эпибрассинолидом, не фосфорилировался по тирозину. Так как изменения в уровнях фоефорилирования белков определяются активностями ферментов противоположно направленного действия — протеинкиназ и протеинфосфатаз, то в специальном опыте сопоставлялось 20-минутное действие эпибрассинолида и универсального ингибитора тирозиновых протеинфосфатаз ортованадата на тирозиновое фосфорилирование белков у срезанных побегов гороха.

Рис. 5 Тирозиновое фосфорилирование растворимых полипептидов листьев 9-дневных проростков гороха, разделенных методом одномерного электрофореза: 1 — маркерные белки, 2 - белки листьев, окрашенные Кумасси 11-250, 3 - белки листьев, фосфорилированные по тирозину

Оказалось, что ЭПБ вызывал повышение уровня удельного тирозинового фоефорилирования у всех полипептидов; ортованадат проявлял в большинстве случаев ту же тенденцию, за исключением полипептидов с молекулярной массой 22 и 47 кДа, у которых уровень удельного тирозинового фоефорилирования снижался (рис. 6).

Рис. 6 Влияние ЭПБ и ортованадата (20 мин) на удельное тирозиновое

фосфорилирование полипептидов листьев гороха:---- контроль, И - ЭПБ (0.1 мкМ),

¡Э - ортованадат (0,1 мМ), Ц - ЭПБ + ортованадат

Разная направленность изменений в уровне тирозинового фосфорилирования полипептидов 22 и 47 кДа, с одной стороны, и остальных полипептидов, с другой, в вариантах ортованадат и ЭПБ+ортованадат может объясняться сложением действия эффекторов, влияющих на фосфорилирование полипептидов с одинаковой молекулярной массой, тем более что некоторые полипептиды могут представлять группы полипептидов с одинаковой молекулярной массой и с разными р/. Однако, если два эффектора действуют сходным образом на один и тот же из двух ферментов противоположного действия (или тирозиновые протеинкиназы, или тирозиновые протеинфосфатазы), то их влияние должно быть, как правило, аддитивным. Если же эффекторы действуют на разные ферменты, то в эксперименте мы можем наблюдать разнообразные варианты ответов, что можно увидеть на рис. 6 в вариантах совместного действия эффекторов.

Для выявления более детального влияния ЭПБ на фосфорилирование белков был использован двумерный электрофорез. Данные, представленные на рис. 1,а показывают, что в листьях контрольного варианта растений по тирозину фосфорилировались полипептиды с теми же молекулярными массами, что и при одномерном электрофорезе.

Мм, кДа 66453629242014-

66453629242014-

■ 12

f/^ni

5 2

8910

3 4

' 2.

--*-

10 3 рН

24-эпибрассинолида in

Рис. 7 Влияние 24-эпибрассинолида in situ (20 мин) на тирозиновое фосфорилирование полипептидов 9-дневных проростков гороха Белки, фосфорилированные по тирозину: а - контроль, б — ЭПБ (0.1 мкМ). Белки, окрашенные Кумасси R-250: в — контроль, г — ЭПБ

250

| g" 200

I 5 §

й 03 о

£ 5 о

ям

й о- н

S о о

J г» ^ <L> 2

100 -■ ---I

50 -

6 7 8 9 10 11 12 13

№ пятна на 2В-электрофорезе

Рис. 8 Влияние 24-эпибрассинолида и ингибитора ФЛА2 — БФБ на удельное тирозиновое фосфорилирование полипептидов листьев 9-дневных проростков гороха: ---контроль, ■ - ЭПБ (0.1 мкМ), - БФБ (10 мкМ), Щ - ЭПБ + БФБ

Оказалось, что некоторые из них представляют собой индивидуальные белки, но некоторые — группы белков с одинаковой молекулярной массой и с различными р/. Расчет удельного тирозинового фосфорилирования белков, разделенных с помощью двумерного электрофореза, показал, что 24-эпибрассинолид повышает уровни тирозинового фосфорилирования большинства полипептидов, особенно у полипептидов № 1, 8, 9 и 11, но снижает фосфорилирование полипептида №13 (рис. 8).

Ингибитор ФЛАг - БФБ вызывает значительное подавление тирозинового фосфорилирования всех выявленных белков (рис. 8-9). При совместном действии ингибитора и фитогормона уровень удельного тирозинового фосфорилирования большинства полипептидов соизмерим с контрольным. Исключение составляют белки № 1, 9, 11 и 13 - фосфорилирование белков № 1 и 11 - ниже контрольного (но выше уровня фосфорилирования под влиянием БФБ), белка № 9 - выше, а белка № 13 — ниже как контрольного уровня, так и под влиянием БФБ (рис. 8 и 10). Увеличение тирозинового фосфорилирования большинства выявленных белков при добавлении эпибрассинолида на фоне ингибитора липоксигеназной сигнальной системы (по сравнению с ингибитором) позволяет говорить об участии липоксигеназной сигнальной системы в эпибрассинолид-индуцированном тирозиновом фосфорилировании белков.

St: * " ч» Л"

- * * 5 5

3629-

й=

14-

3 4 4-Х 34 1 2

6645362924- j

13 • - tf я , .

»«•»до 11 - '

2014-

L: ■ 34 ■■.' ) .а

Рн

3 10 3 10

Рис. 9 Влияние ингибитора ФЛА2 - БФБ in situ (20 мин) на тирозиновое фосфорилирование полипептидов 9-дневных проростков гороха. Белки, фосфорилированные по тирозину: а - контроль, 6 - БФБ (10 мкМ). Белки, окрашенные Кумасси R-250: в - контроль, г - БФБ

2014-

36- ^ д

24- - - 5 s

3 4

♦

L A 3 4 1¿

6645362924- 5

13 12 ■',. 13

~»*28910 , >1 10

•mnÁmm,:

1 2

3 4

3 10 рн 3 10

Рис. 10 Влияние 24-эпибрассинолида и ингибитора ФЛЛ2 - БФБ т зйы (20 мин) на тирозиновое фосфорилирование полипептидов 9-дневных проростков гороха. Белки, фосфорилированные по тирозину: а - контроль, б - ЭПБ + БФБ. Белки, окрашенные Кумасси 11-250: в - контроль, г — ЭПБ + БФБ

23. Идентификация белков листьев гороха, тирозиновое фосфорилирование которых изменяется под влиянием эпибрассинолида

8 полипептидов, отличавшихся наибольшим содержанием в геле (рис. 7 № 1-2, 67, 9-10, 12 и 13), после разделения с помощью двумерного электрофореза были вырезаны из геля и подвержены трипсинолизу. Трипсинолитические фрагменты белков были идентифицированы с помощью матричной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS). Идентифицированные белки оказались белками-ферментами фотосинтетической ассимиляции С02 цикла Кальвина — малыми (белок № 1-2) и большими субъединицами РУБИСКО (белок № 6-7 и 12), хлоропластными предшественниками фруктозо-1,6-бисфосфат альдолаз 1 и 2 (белок № 9-10). Также был идентифицирован хлоропластный предшественник а-субъединицы РУБИСКО-связывающего белка (белок № 13).

Сведений о фосфорилировании ферментов цикла Кальвина относительно мало. С помощью изотопа 32РН было обнаружено фосфорилирование больших и малых субъединиц РУБИСКО, что способствует повышению фиксации С02 (Foyer, 1985); затем показано, что большие субъединицы РУБИСКО фосфорилируются по серину и

треонину (Guitton and Mache, 1987). Позднее было найдено, что малая субъединица может фосфорилироваться по треонину и тирозину; дефосфорилирование приводило к диссоциации малых и больших субъединиц и к падению активности РУБИСКО. Однако, тирозиновое фосфорилирование было обнаружено лишь у одного (Cicer arietinum) из двух исследованных в этом эксперименте видов растений (Aggarwal et al., 1993). Других данных о тирозиновом фосфорилировании белков РУБИСКО не существует. Также отсутствуют данные о тирозиновом фосфорилировании фруктозо-1,6-бисфосфат альдолазы. Обнаруженное нами тирозиновое фосфорилирование белков Pisum sativum L. позволяет дополнить существующие представления о типах фосфорилирования белков-ферментов темновой стадии фотосинтеза.

Обнаруженная ранее возможность фосфорилирования еще одного ключевого фермента цикла Кальвина - глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (Guitton and Mache, 1987), а также зависящее от тирозинового фосфорилирования существование больших агрегатов белков, представляющих собой комплексы ферментов, подобных РУБИСКО и объединяемых шэлеронами (типа РУБИСКО -связывающего белка), позволяет сделать вывод, что фосфорилилирование/дефосфорилирование белков, участвующих в функционировании цикла Кальвина, является одним из важнейших механизмов его регуляции, например, с помощью фитогормонов. Приведенные нами данные по изменению уровня тирозинового фосфорилирования ферментов цикла Кальвина под влиянием 24-эпибрассинолида могут внести ощутимый вклад в понимание фактов, обнаруженных другими исследователями, брассиностероид-индуцированного повышения интенсивности фотосинтеза (Mussig et al., 2000), активности РУБИСКО (Yu et al., 2004) и содержания растворимых углеводов в тканях растений (Braun and Wild, 1984; Прусакова и др., 2000).

2.4. Влияние 24-эпибрассинолида на содержание перекиси водорода в клетках

корней гороха

Одним из способов регуляции тирозинового фосфорилирования может быть изменение редокс-статуса клеток. Н2О2, окисляя SH-группы ферментов, активирует тирозиновые протеинкиназы и ингибирует тирозиновые протеинфосфатазы,, что ведет к усилению тирозинового фосфорилирования белков в клетках (Luán, 2002). В связи с этим были проведены эксперименты по определению влияния 24-эпибрассинолида на содержание эндогенной перекиси водорода в клетках корней гороха. .Измерение содержания эндогенной перекиси водорода обычно проводится, при 560 нм и перекрывается с диапазоном светопоглощения хлорофиллов, что затрудняет определение содержания эндогенной Н202 в листьях. По этой причине в эксперименте использовали корни гороха. Данные рис. 11 указывают, что 24-эпибрассинолид увеличивает образование перекиси водорода по сравнению с контролем.

16,0

S 12,0

Рис. 11 Влияние эпибрассинолида (0.1 мкМ) in situ за 20 мин инкубации 9-дневных корней гороха на содержание эндогенной Н20;>

| 4,о:

0,0

Контроль ЭПБ

В наших экспериментах образование перекиси водорода в клетках в микромолярной концентрации соответствует диапазону концентраций, принимающих участие в сигнальных системах растений, что, вероятно, указывает на участие супероксидсинтазной сигнальной системы в сигналинге 24-эпибрассинолида. Наши результаты о повышении эпибрассинолидом содержания Н2О2 в клетках согласуются с другими нашими данными - повышением тирдаинового фосфорилирования белков растений (рис. 7-8). Таким образом, 24-эпибрассинолид может активировать сигнальные системы, в которых ферменты генерируют Н202 (например, липоксигеназную сигнальную систему) и, в результате, регулируют содержание фосфотирозиновых белков; по всей вероятности, превалирующую роль при этом играет снижение активности тирозиновых протеинфосфатаз.

2.5. Влияние эпибрассинолида на содержание оксигенированных производных лннолевой кислоты в листьях гороха

Чтобы получить доказательство прямого влияния эпибрассинолида на компоненты липоксигеназной сигнальной системы, спекгрофотометрически определяли суммарное содержание продуктов липоксигеназного окисления линолеата, а также разделяли полученные продукты гидроперекисей линолевой кислоты с помощью ВЭЖХ. Необходимо отметить, что действие фитогормона и ингибитора ФЛА2 осуществлялось на отделенных побегах. Супернатант гомогената являлся источником липоксигеназ. Поскольку образование и последующие превращения гидроперокси- и гидрокси-производных полиненасыщенных жирных кислот в клетках происходят очень быстро, то нам за 20 мин действия in situ фитогормона и ингибитора не удавалось обнаружить изменения эндогенных продуктов раннего липоксигеназного окисления. В связи с этим в качестве субстрата липоксигеназ, которые содержались в гомогенате

листьев, использовали in vitro экзогенную линолевую кислоту. Данные рис. 12 указывают, что эпибрассинолид вызывает увеличение образования гидроперекисей линолевой кислоты по сравнению с контролем. БФБ (ингибитор ФЛА2) снижает образование гидроперекисей полиеновой кислоты. Одновременное влияние ЭПБ и ингибитора вызывало снятие ингибирующего эффекта БФБ.

и s

"а §

8,0

6,0

4,0

2,0

0,0

Контроль ЭПБ

БФБ ЭПБ+БФБ

Рис. 12 Влияние 24-эпибрассинолида (0.1 мкМ) и БФБ (10 мкМ) in situ за 20 мин инкубации 9-дневных проростков гороха на содержание оксигенированных производных линолевой кислоты

Таблица 1 Влияние 24-эпибрассинолида и БФБ на содержание оксигенированных производных линолевой кислоты (ОПЛК): 1-3 - оксо-октадекадиеновые кислоты, 4 -гидрокси-октадекадиеновая кислота, 5 - (92, 11£)-13-гидроперокси-9,11-октадекадиеновая кислота, 6 - (9Е, 11£)-13-гидроперокси-9,11-октадекадиеновая кислота, 7 - (10£, 122)-9-гидроперокси-10,12-октадекадиеновая кислота) + (10Е, 12£)-9-гидроперокси-10,12-октадекадиеновая кислота

Варианты Номера пиков

1 2 3 4 5 6 7

Содержание индивидуальных ОПЛК, пмоль/мг белка в мин

Контроль 117±5 116±3 58±5 643±5 3275125 292±5 1345115

ЭПБ 157+5 235±7 157±9 1176±15 "3449±20 470±5 219519

БФБ 20717 "124±11 124±11 950±9 190217 207±5 620±5

ЭПБ+БФБ 78±3 38±3 *38±7 1320±9 "3382±25 *310±7 1696117

* - разница с контролем недостоверна

При разделении полученных продуктов гидроперекисей линолевой кислоты с помощью ВЭЖХ (на нормальной фазе) было обнаружено, что основными

оксилипинами, обладавшими избирательным поглощением света при 232 нм, были (10£, 12Z)-9-nuponepoKCH-10,12-октадекадиеновая кислота) + (10£, 12Е)-9- гидроперокси-10,12-окгадекадиеновая кислота (9-ГПОД), (9 Z, 11£)-13-гидроперокси-9,11-октадекадиеновая кислота (13-ГПОД) и гидрокси-октадекадиеновая кислота. Из данных таблицы 1 можно заключить, что при ингибировании ФЛА2 в растениях происходит снижение образования как 9-ГПОД (№7), так и 13-ГПОД (№5). Эпибрассинолид увеличивал содержание гидрокси-октадекадиеновой кислоты (№4) и 9-ГПОД (№7), тогда как содержание 13-ГПОД не изменилось (№5).

Полученные данные могут свидетельствовать в пользу того, что эффект гормона может осуществляться на уровне изменений изоферментного состава липоксигеназ, а именно на уровне липоксигеназ^' катализирующих образование 9-ГПОД. Снижение содержания основных оксилипинов 9-ГПО$1 и 13-ГПОД под влиянием ингибитора фосфолипазы А2 в данных экспериментах нельзя объяснить его непосредственным влиянием на активность фосфолипазы, поскольку эндогенная линолевая кислота в концентрации 1 мМ является избыточной и не позволяет говорить о том, что ингибитор, блокируя фосфолипазу А2, создает дефицит субстратов для липоксигеназ. Одним из объяснений эффекта ингибитора может являться его прямое влияние на активность липоксигеназ. Существуют данные литературы о том, что для ферментативной активности липоксигеназ являются важными гистидиновые остатки (Steczko et al., 1992; Kim, 2000). Они находятся в участке связывания молекулы фермента с субстратом. Показано, что БФБ может нековалентно связываться с остатками гистидина и снижать активность ферментов (Roberts et al., 1977). Однако, не исключено, что при воздействии in situ за 20 мин ингибитор фосфолипазы может затормаживать липоксигеназный сигнальный каскад путем ограничения в субстратах при ингибировании фосфолипазы А2, а последующее добавление in vitro экзогенного субстрата не способно повлиять на уже заданную реактивность липоксигеназ.

Исходя из полученных данных этих экспериментов можно заключить, что 24-эпибрассинолид вовлечен в регуляцию ранних этапов липоксигеназного окисления и может осуществлять ее на уровне липоксигеназ, катализирующих образование 9-ГПОД ненасыщенных жирных кислот.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Приспособление растений к различным стрессорам на клеточном уровне осуществляется с помощью сигнальных систем, которые распознают, преобразуют, умножают внешние сигналы и передают генетическому аппарату клеток. В результате происходит перепрограммирование считывания информации с генов и синтеза белков (начинают синтезироваться белки, обеспечивающие адаптацию и повышение иммунитета растений). Многими исследователями было показано, что существенную роль в адаптации растений к биотическим и абиотическим неблагоприятным факторам

играют фитогормоны. Принципиально новыми явились результаты наших исследований по влиянию на фосфорилирование белков одного из представителей брассиностероидов — 24-эпибрассинолида. Оказалось, что 24-эпибрассинолид вызывает изменения в общем и тирозиновом фосфорилировании белков. Результаты экспериментов с использованием современных методов протеомики: двумерного электрофореза и иммуноблотинга с применением антител к фосфотирозиновым белкам, а также матричной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии (МА1Л31-ТОР М5) показали, что 24-эпибрассинолид вызывает повышение уровня тирозинового фосфорилирования некоторых ферментов цикла Кальвина - малых и больших субъединиц РУБИСКО, РУБИСКО-связываюшего белка и фруктозо-1,6-бисфосфат альдолазы. Это может внести дополнительный вклад в понимание фактов, установленных другими исследователями, повышения интенсивности фотосинтеза и активности РУБИСКО под влиянием брассиностероидов.

Впервые нами получены экспериментальные данные, указывающие на то, что в регуляции тирозинового фосфорилирования белков РУБИСКО может принимать участие липоксигеназный сигнальный каскад. Об этом свидетельствует снижение уровня тирозинового фосфорилирования белков при воздействии на растения ингибитора фосфолипазы А2 (БФБ) - стартового фермента липоксигеназной сигнальной системы. Специально проведенные нами исследования впервые позволили обнаружить, что ЭПБ усиливает превращение экзогенного линолеата в оксилипины, то есть может оказывать стимулирующее воздействие на активность липоксигеназ, а значит, на липоксигеназный сигнальный каскад. Нами также показано, что под влиянием 24-эпибрассинолида в тканях подвергнутых исследованию растений повышается содержание перекиси водорода - одного из важнейших интермедиатов супероксидсинтазной сигнальной системы.

Эти результаты свидетельствуют, что в формировании ответной реакции растений на действие брассиностероидов задействованы, по крайней мере, две сигнальные системы - липоксигеназная и супероксидсинтазная. Более глубокий анализ причинно-временных зависимостей между выявленными нами изменениями уровня тирозинового фосфорилирования белков и функционированием липоксигеназной и супероксидсинтазной сигнальными системами остается задачей будущих исследований. Необходимо иметь в виду, что полученные нами данные не дали представления о фосфорилировании белков-интермедиатов сигнальных систем. Содержание таких белков в листьях невелико, и в связи с этим определение их фосфорилирования осложняется. Обнаруженные же нами изменения в уровнях фосфорилирования белков касаются участников такого важного энергетического метаболического процесса, как фотосинтез. Очевидно, что эти изменения являются следствием активации сигнальных систем клеток растений (рис. 13).

Эпибрассинолид

Рецептор

Липоксигеназная сигнальная система

I '

Супероксидсинтазная Другие сигнальные сигнальная система системы

1 I

Тирозиновые протеинкиназы, тирозиновые протеинфосфатазы

. Изменение уровня тирозинового фосфорилирования ферментов цикла

Кальвина

.. V ■ 1

Изменение интенсивности фотосинтеза

Рис. 13 Схема влияния 24-эпибрассинолида на тирозиновое фосфорилирование растворимых белков гороха через регуляцию сигнальных систем клеток

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано влияние 24-эпибрассинолида на общее и тирозиновое фосфорилирование растворимых белков растений.

2. С помощью метода MALDI-TOF масс-спектрометрии идентифицированы белки цикла Кальвина (большие и малые субъединицы РУБИСКО, предшественник а-субъединицы РУБИСКО-связывающего белка), а также хлоропластный предшественник фруктозо-1,6-бисфосфат альдолазы тирозиновое фосфорилирование которых регулируется эпибрассинолидом. Тирозиновое фосфорилирование белков цикла Кальвина показано впервые.

3. Впервые показано влияние липоксигеназного сигнального каскада в эпибрассинолид-индуцированном изменении тирозинового фосфорилирования растворимых белков.

4. Впервые выявлено влияние эпибрассинолида на липоксигеназный сигнальный каскад, что проявилось в изменении содержания оксилипинов, образующихся из линолевой кислоты. Эффект эпибрассинолида регулируется на уровне липоксигеназ, катализирующих образование 9-гидроперикисей ненасыщенных жирных кислот.

5. Найдено, что эпибрассинолид повышает содержание перекиси водорода в клетках растений, что указывает на активацию им супероксидсинтазной сигнальной системы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Федина, Е.О. Влияние 24-эпибрассинолида на фосфорилирование белков и содержание Са2+ в клетках растений / Е.О. Федина, Ф.Г. Каримова, О.В. Шидыч // 6-ая Пущинская школа молодых ученых: Сб. тезисов. - Пущино, 2002. - Т. 3 - С. 339.

2. Изменения фосфорилирования белков и содержания CaJ+ в клетках растений под влиянием 24-эпибрассинолида / Е.О. Федина, Ф.Г. Каримова, О.В. Шидыч, В.А. Хрипач // III съезд Биохимического общества: Сб. тезисов. - СПб, 2002. - С. 465.

3. Fedina, Е.О. Brassinolide-induced changes in plant protein phosphorylation and transmembrane Ca2+ transport / E.O. Fedina, F.G. Karimova, O.V. Shydich // 13th Congress of FESPP: Ann. abstr. - Heraklion, 2002. - P. 215.

4. Fedina, E.O. Time-dependent 24-epibrassinolide-induced changes in plant protein phosphorylation and transmembrane Ca2+ transport I E. Fedina, F. Karimova, O. Shydich // European Workshop on Environmental Stress and Sustainable Agriculture: Ann. abstr. -Varna, 2002,- P. 14.

5. Lipoxygenase signaling system in brassinolide-induced plant protein phosphoiylation / F. Fedina, F. Karimova, I. Tarchevsky, V. Khripach // BRAIN International Symposium: Ann. abstr. - Tsukuba, 2002. - P. 13.

6. Са2+-зависимость действия брассиностероидов на фосфорилирование растворимых белков листьев гороха / Е.О. Федина, Ф.Г. Каримова, А.И. Тарчевский, В. А. Хрипач И Рецепция и внутриклеточная сигнализация. - Пущино, 2003. - С. 309 311.

7. Fedina, Е.О. Lipoxygenase signaling system in brassinolide-induced plant cell response / E.O. Fedina, F.G.Karimova, V.A. Khripach. // International conference of young scientists: Ann. abstr. - Kiev, 2003. - P. 58.

8. Липоксигеназная сигнальная система в брассинолид-индуцированном ответе растительных клеток / Е.О. Федина, Ф.Г. Каримова, И.Р. Чечеткин, И.А. Тарчевский // Физиология растений - основа фитобиотехнологии. - Пенза, 2003. - С. 489.

9. Вклад липоксигеназного метаболизма в брассиностероидный сигнальный путь / Е.О. Федина, Ф.Г. Каримова, И.Р. Чечеткин и др. // Докл. РАН. - 2004. - Т. 395. - № 2.-С. 266-269.

10. The "Switching on" of lipoxygenase signaling system by brassinosteroid (24-epibrassinolide) in pea leaves / E.O. Fedina, I .A. Tarchevsky, I.R. Chechetkin, F.G. Karimova // The 14th FESPB Congress: Ann. abstr. - Cracow, 2004. - P. 26.

11. Каримова, Ф.Г. Регуляция эпибрассинолидом тирозинового фосфорилирования белков растений / Ф.Г. Каримова, Е.О. Федина, И.А. Тарчевский // Рецепция и внутриклеточная сигнализация. - Пущино, 2005. — С. 359 — 362.

12. Федина, Е.О. Влияние брассинолида на тирозиновое фосфорилирование белков листьев гороха / Е.О. Федина, Ф.Г. Каримова, И.А. Тарчевский // Биохимия. -2006. - Т. 71.-№ 4. - С. 525-532.

Печать - офсетная. Тираж 100 экз. Заказ № К-95. Типография ООО «Реплика». 420111, г. Казань, ул. М. Джалиля, 19, тел. (843) 292-46-10.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Федина, Евгения Олеговна

Оглавление.

Список использованных сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Фитогормоны брассиностероиды.

1.1.1. Структура и функции брассиностероидов.

1.1.2. Молекулярные механизмы действия брассиностероидов в клетках растений.

1.2. Фосфорилирование/дефосфорилирование белков растений.

1.2.1. Участие фосфорилирования белков растений в регуляции метаболизма азота и углерода.

1.2.2. Участие фосфорилирования белков растений в регуляции ферментов энергетического метаболизма.

1.2.3. Участие фосфорилирования белков растений в рефляции активности структурных белков.

1.2.4. Участие фосфорилирования белков растений в регуляции клеточного цикла.

1.2.5. Участие фосфорилирования белков в регуляции сигнальных систем клеток растений.

1.2.6. Участие фосфорилирования белков в регуляции фотосинтеза.

1.2.7. Участие фосфорилирования белков в регуляции других процессов клеток растений.

1.3. Тирозиновое фосфорилирование белков растений.

1.3.1. Тирозиновые протеинкиназы и протеинфосфатазы растений.

1.3.2. Роль тирозинового фосфорилирования белков в регуляции функционирования клеток растений.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Определение общего фосфорилирования белков листьев гороха in situ.

2.3. Определение тирозинового фосфорилирования растворимых белков листьев гороха методом Вестерн-блотинга с использованием моноклональных антител PY20 к фосфотирозиновым белкам.

2.3.1. Приготовление образцов.

2.3.2. Метод полусухого блотирования (Вестерн-блотинг).

2.3.3. Иммунодетекция тирозинового фосфорилирования белков.

2.3.4. Детектирование хемилюминесценции.

2.4. Одномерный электрофорез по методу Laemmli.

2.5. Двумерный электрофорез.

2.6. Анализ данных, полученных с помощью методов одномерного и двумерного электрофореза.

2.7. Идентификация белков методом MALDI-TOF MS.

2.7.1. Трипсинолиз белкового образца.

2.7.2. Регистрация масс-спектров.

2.7.3. Идентификация белков.

2.8. Определение содержания перекиси водорода в клетках корней гороха.

2.9. Определение содержания оксигенированных производных линолевой кислоты in vitro в листьях гороха.

2.10. Определение количества белка в растворе по методу Бредфорда.

2.11. Химические реактивы и материалы.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Влияние эпибрассинолида на общее фосфорилирование растворимых белков листьев гороха.

3.1.1. Временная зависимость действия эпибрассинолида на общее фосфорилирование белков in situ.

3.1.2. Участие липоксигеназной сигнальной системы в эпибрассинолид-индуцированном общем фосфорилировании белков.

3.2. Влияние эпибрассинолида на тирозиновое фосфорилирование растворимых белков листьев гороха.

3.2.1. Изучение специфичности связывания антител PY с растворимыми фосфотирозиновыми белками гороха.

3.2.2. Временная зависимость влияния эпибрассинолида in situ на тирозиновое фосфорилирование растворимых белков листьев.

3.2.3. Влияние эпибрассинолида и ингибиторов тирозиновых фосфатаз (ортованадата натрия и оксида фениларсена) in situ на тирозиновое фосфорилирование белков листьев гороха.

3.2.4. Участие липоксигеназной сигнальной системы в эпибрассинолид-индуцированном тирозиновом фосфорилировании белков листьев гороха.

3.3. Идентификация белков листьев гороха, тирозиновое фосфорилирование которых изменялось под влиянием эпибрассинолида.

3.4. Влияние эпибрассинолида на содержание перекиси водорода в клетках корней гороха.

3.5. Влияние эпибрассинолида на содержание оксигенированных производных линолевой кислоты в листьях гороха.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние 24-эпибрассинолида на фосфорилирование белков растений"

Актуальность проблемы. Фитогормон 24-эпибрассинолид (ЭПБ) - один из наиболее активных представителей брассиностероидов, структурно сходных со стероидными гормонами животных - вызывает широкий спектр ответов клетки, включая рост растений, прорастание семян, активность фотосинтеза, фиксацию азота, повышение устойчивости к холоду, патогенам, солевому стрессу (Khripach et al., 2000; Шакирова, 2001). Большая часть современных исследований направлена на выяснение молекулярных механизмов действия сигнала ЭПБ: выявлены рецепторы на плазматических мембранах, их трансфосфорилирование по Ser/Thr (Nam and Li, 2002). Обнаружена киназа, фосфорилирующая ядерные белки (Не et al., 2000), а также факторы регуляции транскрипции, участвующие в брассиностероид-регулируемой экспрессии генов (Yin et al., 2005; Li and Deng, 2005). В то же время, практически не изучена роль конкретных сигнальных систем в реакции растений на брассиностероиды. Сигнальные системы клеток - это каскады биохимических реакций, принимающих участие в распознавании и рецепции внеклеточных сигналов, их трансформации, усилении и передаче в геном. В результате этих процессов происходит изменение программы экспрессии генов, и, как следствие, адаптация растений к изменившимся условиям существования.

Известно, что фосфорилирование белков является обязательным этапом функционирования всех сигнальных систем. Активность до 30 % белков эукариот регулируется фосфорилированием/дефосфорилированием (Cohen, 2004), в основном, по остаткам серина, треонина, тирозина и гистидина. Тирозиновое фосфорилирование белков составляет относительно небольшую долю от общего фосфорилирования, но принимает участие в рефляции целого ряда процессов метаболизма у растений (Luán et al., 2001). Фосфорилирование белков по тирозину играет ключевую роль и в осуществлении контроля над процессами пролиферации и дифференцировки клеток (Hunter, 1995; Mustelin and Hunter, 2002). В литературе информация о влиянии брассиностероидов на тирозиновый тип фосфорилирования белков растений отсутствует. В связи с этим, изучение механизмов действия брассиностероидов на фосфорилирование/дефосфорилирование белков растений является актуальным.

Цель и задачи исследования. Цель проводимых исследований заключалась в выявлении сигнальных систем и идентификации фосфорилированных белков листьев гороха, участвующих в сигналинге брассиностероидов.

В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1. Выявление влияния 24-эпибрассинолида на общее фосфорилирование белков.

4. Определение возможности участия липоксш еназной и супероксидсинтазной сигнальных систем в эпибрассинолид-индуцированном фосфорилировании белков.

Научная новизна работы. Впервые выявлена регуляция 24-эпибрассинолидом уровня фосфорилирования белков по тирозину, что было вызвано действием 24-эпибрассинолида на активность тирозиновых протеинкиназ и протеинфосфатаз. Впервые показано влияние эпибрассинолида на липоксигеназную и супероксидсинтазную сигнальные системы, о чем свидетельствует повышение содержания оксилипинов, а также эндогенной Н2О2. Впервые методом МАЬОЬТОР М8 идентифицированы белки цикла Кальвина, тирозиновое фосфорилирование которых регулируется эпибрассинолидом.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа в 2001-2006 гг. проводилась в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме «Взаимодействие сигнальных систем клеток растений». Исследования автора являлись частью работ, проводимых по фантам РФФИ 04-04-49348, 04-04-49350, а также по гранту ведущей научной школы. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на 6"и международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002); 13"м международном конгрессе РЕ8РР (Греция, 2002); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005); 1(1Х) международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006); II международном симпозиуме «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006), а также на итоговых конференциях Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ (2004 - 2006).

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Федина, Евгения Олеговна

ВЫВОДЫ

2. С помощью метода МАЬБ1-ТОР масс-спектрометрии идентифицированы белки цикла Кальвина (большие и малые субъединицы РУБИСКО, предшественник а-субъединицы РУБИСКО-связывающего белка), а также хлоропластный предшественник фруктозо-1,6-бисфосфат альдолазы тирозиновое фосфорилирование которых регулируется эпибрассинолидом. Тирозиновое фосфорилирование белков цикла Кальвина показано впервые.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Растения постоянно находятся в условиях влияния различных биотических и абиотических стрессоров: инфицирования патогенами, воздействия высоких и низких температур, засухи и других неблагоприятных факторов среды. Приспособление растений к различным стрессорам на клеточном уровне осуществляется с помощью сигнальных систем, которые распознают, преобразуют, умножают внешние сигналы и передают генетическому аппарату клеток. В результате происходит перепрограммирование считывания информации с генов и синтеза белков (начинают синтезироваться белки, обеспечивающие адаптацию и иммунитет растений). Многими исследователями было показано, что существенную роль в адаптации растений к биотическим и абиотическим неблагоприятным факторам играют фитогормоны.

Принципиально новыми явились результаты наших исследований по влиянию на фосфорилирование белков одного из представителей брассиностероидов - 24-эпибрассинолида. Оказалось, что 24-эпибрассинолид вызывает изменения в общем и тирозиновом фосфорилировании белков. Результаты экспериментов с использованием современных методов протеомики: двумерного электрофореза и иммуноблотинга с применением антител к фосфотирозиновым белкам, а также матричной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии (МАЬОЬТОР МБ) показали, что 24-эпибрассинолид вызывает повышение уровня тирозинового фосфорилирования некоторых ферментов цикла Кальвина - малых и больших субъединиц РУБИСКО, РУБИСКО-связывающего белка и фруктозо-1,6-бисфосфат альдолазы. Это может внести дополнительный вклад в понимание фактов, установленных другими исследователями, повышения интенсивности фотосинтеза и активности РУБИСКО под влиянием брассиностероидов.

Впервые нами получены экспериментальные данные, указывающие на то, что в регуляции тирозинового фосфорилирования белков РУБИСКО может принимать участие липоксигеназный сигнальный каскад. Об этом свидетельствует снижение уровня тирозинового фосфорилирования белков при воздействии на растения ингибитора фосфолипазы Аг (БФБ) - стартового фермента липоксигеназной сигнальной системы. Специально проведенные нами исследования впервые позволили обнаружить, что ЭПБ усиливает превращение экзогенного линолеата в оксилипины, то есть может оказывать стимулирующее воздействие на активность липоксигеназ, а значит, на липоксигеназный сигнальный каскад. Нами также показано, что под влиянием 24-эпибрассинолида в тканях подвергнутых исследованию растений повышается содержание перекиси водорода - одного из важнейших интермедиатов супероксидсинтазной сигнальной системы.

Липоксигеназная сигнальная система I

Эпибрассинолид 1

Рецептор

Супероксидсинтазная сигнальная система I

Другие сигнальные системы I

Тирозиновые протеинкиназы, тирозиновые протеинфосфатазы I

Изменение уровня тирозинового фосфорилирования ферментов цикла

Кальвина I

Изменение интенсивности фотосинтеза

Рис. 37 Схема влияния эпибрассинолида на тирозиновое фосфорилирование растворимых белков гороха через регуляцию сигнальных систем клеток.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федина, Евгения Олеговна, Казань

1. Васюкова, Н.И. Влияние брассиностероидов на фитофтороз картофеля / Н.И.Васюкова // Брассиностероиды биорациональные, экологически безопасные регуляторы роста и продуктивности растений. - Минск, 1993. - С. 20.

2. Каримова, Ф.Г. цАМФ-мессенджерная система клеток растений и ее роль в регуляции транспорта воды и Ca : Автореф. дис. .док. биол. наук: 03.00.12 / Ф.Г. Каримова; СПб. ВНИИ растениеводства им. Вавилова. -СПб., 1994.-39 с.

3. Каримова, Ф.Г. "Кальциевый парадокс" в растительных тканях / Ф.Г. Каримова, Е.К. Бунтукова, О.И. Тарчевская // Физиология растений. -1989.-№36. -С. 1178-1183.

4. Влияние фитогормонов на содержание цАМФ в растениях / Ф.Г. Каримова, О.И. Тарчевская, СЛ. Леонова, С.Н. Жуков // Физиол и Биохим. Культур, растений 1990. -Т. 22 -Ks 6 - С 532-537.

5. Каримова, Ф.Г. цАМФ-зависимое фосфорилирование белков гороха, индуцированное форсколином / Ф.Г. Каримова, Е.В. Тырыкина, О.Ю. Захарова // Физиология растений 2005. - № 52. - С. 27-35.

6. Форсколин-индуцируемое фосфорилирование полипептидов гороха /Ф.Г. Каримова, Е.В. Тырыкина, И.А. Тарчевский, О.Ю. Захарова //Докл. РАН. -2003. -№ 39. -С. 550-552.

7. Кораблева, Н.П. Биохимические аспекты гормональной регуляции покоя и иммунитета растений / Кораблева Н.П., Платонова Т.А. // Прикл. биохим. имикробиол. 1995. -№ 31. - С. 103-114.

8. Крутецкая, З.И. Механизмы внутриклеточной сигнализации / З.И. Крутецкая, O.E. Лебедев, Л.С. Курилова. СПб.: СПб ун-т, 2003. - 245 с.

9. Брассиностероиды в регуляции синтеза белка в листьях пшеницы / О.Н. Кулаева, Э.А. Бурханова, А.Б. Федина и др. //Докл. АН СССР. 1989. -№ 305. - С. 1277-1279.

10. Прусакова, Л.Д. Роль брассиностероидов в росте, устойчивости и продуктивности растений / Л.Д. Прусакова, С.И. Чижова // Агрохимия. -1996.-No 11.-С. 137-150.

11. Влияние эпибрассинолида и экоста на засухоустойчивость и продуктивность яровой пшеницы / Л.Д. Прусакова, С.И. Чижова, Л.Ф. Агеева и др. //Агрохимия. 2000. -№ 3.-С. 50-54.

12. Рубин, А.Б. Регуляция первичных процессов фотосинтеза / А.Б. Рубин, Т.Е. Кренделева // Успехи Биол. Химии 2003. -№43 -С. 255-266

13. Тарчевский, И.А. Метаболизм растений при стрессе /И.А. Тарчевский. -Казань: Фэн, 2001. 448 с.

14. Хрипач, В.А. Перспектива практического применения брассиностероидов нового класса фитогормонов / В.А. Хрипач, В.М. Жабинский, Ф.А. Лахвич//С.-х. Биология. -1995. - № 1. - С. 1-3.

15. Шакирова, Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция / Ф.М. Шакирова. Уфа: Гилем, 2001.-160 с.

16. Ягушева, М.Р. Влияние абсцизовой кислоты на функционирование кальциевой и аденилатциклазной сигнальных систем: Автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.00.12 /М.Р. Ягушева; Казанский ин-т биохим. и биофиз. КазНЦ РАН. Казань, 2000. - 24с.

17. Abe, Н. Japan advances in brassinosteroids and prospects for its agriculture application/H. Abe//Japan Pesticide Inform 1989. - Vol. 55. - P. 10.

18. Aggarwal, K.K. Phosphorylation of RUBISCO in Cicer arietinum: non-phosphoprotein nature of RUBISCO in Nicotiana tabacum / K.K. Aggarwal, D. Saluja, R.C. Sachar//Phytochemistry. 1993. - Vol. 34. -P. 329-335.

19. Ali, N. Cloning and biochemical characterization of a plant protein kinase that phosphorylates serine, threonine and tyrosine / N. Ali, U. Halfner, N.H. Cltua // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269 - P. 31626-31629.

20. Cameleon calcium indicator reports cytoplasmatic calcium dynamics in Arabidopsis guard cells / G.J. Allen, J.M. Kwak, J.M. Chu et al. // Plant J. -1999. Vol. 19. -P. 735-747.

21. Altmann, T. A tale of dwarfs and drugs brassinosteroids to the rescue / T. Altmann // Trends in Genetics. 1998. - Vol. 14. - P. 490-495.

22. Altmann, T. Molecular physiology of brassinosteroids revealed by the analysis of mutants / T. Altmann //Planta. 1999. - Vol. 208. - P. 1-11.

23. Andrews, T.J. Photorespiration still unavoidable? / T.J. Andrews, G.H. Lorimer //FEBSLett. 1978. - Vol. 90. - P. 1 -9.

24. Profilin tyrosine phosphorylation in poly-L-proline-binding regions inhibits binding to phosphoinositide 3-kinase in Phaseolus vulgaris / R. Aparicio-Fabre, G. Guillen, G. Estrada et al. //Plant J. 2006 - Vol. 47. - P. 491 -500.

25. Appleby, J.L. Signal transduction via the multi-step phosphorelay not necessarily a road less traveled / J.L. Appleby, J.S. Parkinson, R.B. Bourret // Cell 1996. - Vol 86. -P. 845-848.

26. Evidence suggesting protein tyrosine phosphorylation in plants depends on the developmental conditions / E. Barizza, F.L. Schiavo, M. Terzi, F. Filippini // FEBS Lett 1999. - Vol. 447 - P. 191-194.

27. Baskin, T.I. Inhibitors of protein kinases and phosphatases alter root morphology and disorganize cortical microtubules / T.I. Baskin, J.E. Wilson //Plant Physiol 1997 - Vol. 113. - P. 493 -502.

28. State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinases STN7 / S. Bellajiore, F. Barneche, C. Peltier, J. Rochaix // Nature. -2002. Vol. 433. -P. 892 -895.

29. Estradiol binding to cell surface raises cytosolic free calcium in T cells / W.P.M Benten, M. Lieberherr, G. Gunter, F. Wunderlich // FEBS Lett. 1998. - Vol. 422.-P. 349-353

30. Bishop, G.J. Brassinosteroids and plant steroid hormone signaling / G.J. Bishop, C. Koncz //Plant Cell. -2002 Vol 14 -P. 97-110

31. Photosystem II core phosphorylation and photosynthetic acclimation require two different protein kinases / V. Bonardi, P. Pesaresi, T. Becker et al. // Nature. -2005. Vol. 437. -P.l 179 -1182.

32. Bl-type cyclin-dependent kinases are essential for the formation of stomatal complexes in Arabidopsis thaliana / V. Boudolf, R. Barroco, A. Engler Jde et al. //Plant Cell. 2004a. - Vol. 16. - P. 945 -955.

33. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford//Anal Biochem 1976. - Vol 72.-P. 248-254.

34. Braun, P. The influence of brassinosteroid on growth and parameters of photosynthesis of wheat and mustard deficit / P. Braun, A. Wild // J. Plant Physiol 1984. - Vol. 116.-P. 189-285.

35. BRL1 and BRL3 are novel brassinosteroid receptor that function in vascular differentiation in Arabidopsis / A. Caño-Delgado, Y. Yin, C. Yu et al. // Development.-2004. Vol. 131.-P. 5341 -5351.

36. DNA replication licensing affects cell proliferation or endoreplication in a cell type-specific manner//M.M. Castellano, M.B. Boniotty, M.B. Caro et at. //Plant Cell -2004. Vol. 16.-P. 2380-2393

37. Cltampigny, M.-L. Nitrate activation of cytosolic protein kinases diverts photosynthesis carbon from sucrose to amino acid biosynthesis / M.-L. Cltampigny, C. Foyer//Plant Physiol. 1992. - Vol. 100. -P. 7-12.

38. Arabidopsis ethylene-response gene ETR1: similarity of product to two-component regulators / C. Chang, S.F. Kwok, A.B. Bleecker, E. Meyerowitz // Science. 1993. - Vol. 262. - P. 539 -544.

39. Cheng, H.F. Purification and characterization of a phosphotyrosyl protein phosphatase from wheat seedlings / H.F. Cheng, M. Thao // Biochem Biophys. Acta. 1989. - Vol 988. - P. 271 -276.

40. Cohen, J.D. Investigations on the mechanism of the brassinosteroid response / J.D. Cohen, W.J. Meudt//Plant Physiol. 1983. - Vol. 72 - P. 691-694.

41. Hormonal control of the cell cycle / J. C. del Pozo, M.A. Lopez-Matas, E. Ramirez-Parra, C. Gutierrez //Physiol. Plant -2005. Vol. 123 -P 173-183.

42. Demirevska-Kepova, K. Barley leaf Rubhco, Rubisco binging protein and Rubisco activase and their protein/protein interactions / K. Demirevska-Kepova, L. Simova-Stoilova, S. Kjurkchiev // Bulg. J. Plant Physiol. 1999. - Vol. 25. -P. 31 -44.

43. Depege, N. Role of chloroplast protein kinase Stt7 in LHCII phosphorylation and state transition in Chlamydomonas / N. Depege, S. Bellafiore, J.D. Rochaix // Science. 2003. - Vol. 299 - P. 1572 -1575.

44. MsERKl: A mitogen-activated protein kinase from a flowering plant/ B. Duerr, M. Gawienowski, T. Ropp, T. Jacobs//Plant Cell 1993 - Vol 5 -P 87-96.

45. Phosphorylation controls timing of Cdc6p destruction: a biochemical analysis / S. Elsasser, Y. Chi, P. Yang, J.L. Campbell//Mol. Biol. Cell Res. 1999. - Vol. 10. -P. 3263-3277.

46. Feng, G.S. Containing phosphotyrosine phosphatase as a target of protein-tyrosine kinases / G.S. Feng, C.C. Hui, T. Pawson // Science. 1993. - Vol. 253. -P 1607-1611.

47. A plant oncogene as a phosphatase / F. Filippini, V. Rossi, 0. Marin et al. // Nature 1996 - Vol. 379.-P. 499-500.

48. The plant cell cycle in context /M.R. Fowler, S. Eyre, N.W. Scott et al. //Mol. Biotechnol. 1998. - Vol. 10. - P. 123 -153.

49. Foyer, C.H. Phosphorylation of a stromal enzyme protein in maize (Zea mays) mesophyll chloroplasts / C.H. Foyer // Biochem. J. 1984. - Vol. 222. - P. 247 -253.

50. Foyer, C.H. Stromal protein phosphorylation in spinach (Spinacia oleracea) chloroplast/C.H. Foyer//Biochem J. 1985. - Vol. 231.-P. 97-103.

51. Friedrichsen, D. Steroid signaling in plants- from the cell surface to the nucleus / D. Friedrichsen, J. Chory //Bioassays -2001. Vol. 23. -P. 1028-1036.

52. Identification of the linker-SH2 domain of STAT as the origin of the SH2 domain using two-dimensional structural alignment / Q. Gao, J. Hua, R. Kimura et al. // Mol Cell Proteom -2004. Vol 3.-P 704-714.

53. Garceau, N. Y. Alternative initiation of translation and time-specific phosphorylation yield multiple forms of the essential clock protein FREQUENCY / N.Y. Garceau, Y. Liu, J.J. Loros, J.C. Dunlap // Cell. 1997. - Vol. 89. - P. 469-476

54. Tyrosine phosphorylation inhibits the interaction of 14-3-3 proteins with the plasma membrane If-ATPase / S. Giacometti, L. Camoni, C. Albumi et al. // Plant Biol. 2004. - Vol. 6. - P. 422 -431.

55. Graciet, E. Emergence of new regulatory mechanisms in the Benson-Calvin pathway via protein-protein interactions' a glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase / CP 12 / phosphoribulokinase complex / E. Graciet, S. Lebreton,

56. B. Gontero //J. Exp. Bot. 2004. - Vol. 55. - P. 1245 -1254.

57. Gribskov, M. Challenges in data management for functional genomics / M. Gribskov//0M1CS -2003. Vol. 7. -P. 3-6

58. Brassinolide, a plant growth promoting steroid isolated from brassica napus pollen / M.D. Grove, G.F. Spencer, W.K. Rohwedder et al. // Nature. 1979. -Vol. 281.-P. 216-217.

59. Guitton, C. Phosphorylation in vitro of the large subunit of the ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase and of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase /

60. C. Guitton, R. Mache//Eur. J. Biochem. 1987. - Vol. 166.-P. 249-254.

61. Identification of a dual-specificity protein phosphatase that inactivates MAP kinase from Arabidopsis / R. Gupta, Y. Huang, J.J. Kieber, S. Luan //Plant J. -1998.-Vol. 16.-P. 581-590.

62. Hakansson, G. Histidine and tyrosine phosphorylation in pea mitochondria: evidence for protein phosphorylation in respiratory redox signaling / G. Hakansson, J.F. Allen//FEBSLett. 1995. - Vol. 372. -P. 238-242.

63. Hammer, M.F. Purification of a protein phosphatase from chloroplast stroma capable of dephosphorylating the light-harvesting complex II / M.F. Hammer, J. Markwell, G. Sarath // Plant Physiol. 1997. - Vol 113.-P. 227-233.

64. Hatch, M.D. C4 photosynthesis: a unique blend of modified biochemistry, anatomy and ultrastructure / M.D. Hatch // Biochem Biophys. Acta. 1987. -Vol. 895. -P. 81-106.

65. Perception of brassinosteroids by the extracellular domain of the receptor kinase BRI1 /Z. He, Z.Y. Wang, J. Li et al. //Science. 2000. - Vol. 288. - P. 2360 -2363.

66. BZR1 is a transcriptional repressor with dual roles in brassinosteroid homeostasis and growth response / J.X. He, J.M. Gendron, Y. Sun et al. //Science. 2005. -Vol. 307.-P. 1634-1638.

67. Heberle-Bors, E. Cyclin-dependent protein kinases, mitogen-activated protein kinases and the plant cell cycle / E. Heberle-Bors // Curr. Sci 2001. - Vol. 80 -P. 225-232.

68. Hirayama, T. Novel protein kinase of Arabidopsis thaliana (APK1) that phosphorylates tyrosine, serine and threonine / T. Hirayama, A. Oka //Plant Mol. Biol. 1992 - Vol. 20. -P. 653 -662.

69. Houtz, R.L. The life of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase -posttranslational facts and mysteries / R.L. Houtz, A. R. Portis // Arch. Biochem. Biophys. -2003. Vol 414 -P. 150-158

70. Hu, Y. Promotive effect of brassinosteroids on cell division involves a distinct CycD3-induction pathway in Arabidopsis / Y. Hu, F. Bao, J. Li//Plant J. 2000 -Vol. 24.-P. 693 -701.

71. Ein4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor family in Arabidopsis / J. Hua, H. Sakai, S. Nourizadeh et al. // Plant Cell. 1998. - Vol 10 - P. 1321-1332.

72. ATMPK4, an Arabidopsis homolog of mitogen-activated protein kinases, is activated in vitro by AtMEKl through threonine phosphorylation / Y. Huang, H. Li, R. Gupta et al. //Plant Physiol. 2000 - Vol. 122. -P 1301 -1310.

73. Protein tyrosine phosphorylation during phytohormone-stimulated cell proliferation in Arabidopsis hypocotyls / H.-J. Huang, Y.-M. Lin, D.-D. Huang et al. //Plant Cell Physiol 2003. - Vol 44 - P. 770 -775.

74. Huber, J.A. Protein phosphorylation as a mechanism for regulation of spinach leaf sucrosephosphate synthase activity / J.A. Huber, S.C. Huber, T.H. Nielsen // Arch. Bichem. Biophys 1989. - Vol. 270. -P. 681-690.

75. Reversible light/dark modulation of spinach leaf nitrate reductase activity involves protein phosphorylation /S.C. Huber, J.L. Huber, W.H. Campbell, M.G. Redinbaugh//Arch. Biochem. Biophys 1992. - Vol. 296. -P. 58-65.

76. Exploring the role of protein phosphorylation in plants: from signaling to metabolism in leaf cells / S.C. Huber, M.-H. Oh, S.C. Hardin, S.D. Clouse // Plant J. 2006. - (in print).

77. Huber, S. Protein phosphorylation as a possible trigger for degradation of enzymes // S. Huber, G. Tang, S. Hardin // Curr. Top Plant Biochem. 2002. -Vol. 21.-P. 1415.

78. Hunter, T. Protein kinases and phosphatases: the yin and yang of protein phosphorylation and signaling / T. Hunter // Cell. 1995. - Vol. 80. - P. 225 -236.

79. Protein-tyrosine kinases and phosphatases in cell signaling / T. Hunter, A. Bilwes, M. Broome et al. //FASEBJ. 1996. - Vol. 10 - P. 1300.

80. Ikekawa, N. Brassinosteroids a new plant growth substance / N. Ikekawa // Farumashia. 1990. - Vol. 26 - P. 548.

81. Identification of CREI as a cytokinin receptor from Arabidopsis / T. Inoue, M. Higuchi, Y. Hashimoto etal. //Nature.-2001. Vol 409. -P. 1060-1063.

82. Islas-Flores, I. Protein phosphorylation during coconut zygotic embryo development / I. Islas-Flores, C. Oropeza, T. Hernandez-Sotomayor // Plant Physiol. -1998. Vol. 118 -P. 257-263.

83. Jiao, J.A. Light/dark regulation of maize leaf phosphoenolpyruvate carboxylase by in vivo phosphorylation / J.A. Jiao, R. Chollet // Arch Biochem. Biophys. -1988. Vol. 261.-P. 409-417.

84. John, P.C.L. Cytokinin stimulation of cell division: essential signal trasduction is via Cdc25phosphatase /P.C.L. John //J. Exp. Bot. 1998. - Vol. 49 (suppl.). -P. 91.

85. Crystallographic binding studies on the allosteric inhibitor glucose-6-phosphate to T state glycogen phosphorylase B / L.N. Johnson, P. Snape, J.L. Martin et al. //J. Mol. Biol. -1993. Vol. 232. - P. 253 -267.

86. Johnson, K. D. Tonoplast-bound protein kinase phosphorylates tonoplast intrinsic protein / K.D. Johnson, M.J. Chrispeels // Plant physiol 1992. - Vol. 100.-P. 1787-1795

87. Kaiser, W.M. Low C02 prevents nitrate reduction in leaves / W.M. Kaiser, J. Forster//Plant Physiol. 1989. - Vol. 91.-P. 970-974.

88. Kalinich, J.F. Relationship of nucleic metabolism to brassinolide-induced responses in beans / J.F. Kalinich, N.B. Mandava, J.A. Todhunter //J. Plant Physiol. -1985. Vol. 120. -P. 207-221.

89. Tyrosine phosphorylation in plant bending / K. Kameyama, Y. Kishi, M. Yoshimura et al. //Nature. 2000. - Vol 407. - P. 37.

90. Light and brassinosteroid signals are integrated via a dark-induced small G protein in etiolated seedling growth/ J.G. Kang, J. Yun, D.H. Kim et al. //Cell. -2001. Vol. 105 -P. 625 -636.

91. Katsumi, M. Interaction of a brass inosteroid with IAA and GAj in the elongation of cucumber hypocotyl sections / M. Katsumi// Plant Cell Physiol. 1985. - Vol. 26.-P. 615 -625.

92. Khripach, V. Twenty years of brassinosteroids • steroidal plant hormones warrant better crops for the XXI century / V. Khripach, V. Zhabinskii, A. de Groot // Annals Bot. 2000 - Vol 86 - P. 441 -447.

93. Kim, K.-J. Chemical modification of 5-lipoxygenase from Korean red potato / K.J. Kim//J. Biochem. Mol Biol -2000 Vol. 33.-P. 172-178.

94. A lipoxygenase from leaves of tomato (Lycopersicon esculentum Mill) is induced in response to plant pathogenic pseudomonads / E. Koch, B.M. Meier, H.-G. Eiben, A. Slusarenko //Plant Phisyol. 1992. - Vol. 99. - P. 571 -576.

95. Kohler, B. Protein phosphorylation activates the guard cell Ca2* channel and is a prerequisite for gating by abscisic acid / B. Kohler, M. Blatt // Plant J. 2002. -Vol. 32 - P. 185-194.

96. A small CDC25 dual-specificity tyrosine-phosphatase iwform in Arabidopsis thaliana /1. Landrieu, M. da Costa, L. de Veylder et al. // Proc Natl Acad Sei. USA -2004. Vol 101. -P. 13380-13385

97. Zeatin is indispensable for the G-M transition in tobacco BY-2 cells // F. Laureys, W. Dewitte, E. Witters et al. //FEBS Lett. 1998. - Vol 426. - P. 29 -32.

98. Li, J. A putative leucine-rich repeat receptor kinase involved in brassinosteroid signal transduction/J. Li, J. Chory // Cell. 1997. - Vol. 90. -P. 929-938.

99. Li, J. Regulation of brassinosteroid signaling by a GSK3/SHAGGY-like kinase / J. Li, K.H. Nam //Science. -2002. Vol. 295.-P. 1299-1301.

100. Li, L. It runs in the family, regulation of brassinosteroid signaling by the BZR1-BES1 class of transcription factors / L. Li, X. W. Deng // Trends Plant Sei 2005. - Vol. 10 - P. 266-268

101. Identification of brassinosteroid-related genes by meam of transcript co-response analyses/ J. Lisso, D. Steinhauser, Т. Altmann et al //Nucl. Acids Res 2005. -Vol. 33.-P. 2685-2696.

102. AFP is a novel negative regulator of ABA signaling that promotes ABI5 protein degradation /L. Lopez-Molina, S. Mongrand, N. Kinoshita, N.H. Chua // Genes Dev. -2003. Vol. 17.-P. 410-418.

103. Luan, S. Tyrosine phosphatases in higher plants / S. Luan, J. Ting, R. Gupta // New Phytol. 2001. - Vol. 151. - P. 155 -164.

104. Luan, S. Tyrosine phosphorylation in plant cell signaling/ S. Luan / Proc Natl. Acad. Sci. USA -2002. Vol. 99.-P. 11567-11569.

105. MacKintosh, C. Identification of a protein that inhibits phosphorylated form of nitrate reductase from spinach (Spinacia oleracea) leaves / C. MacKintosh, P. Douglas, C. Lillo II Plant Physiol. 1995. - Vol. 107.-P. 451 -457.

106. MacRae, T.H. Tubulin post-translational modifications. Enzymes and their mechanisms of action / T.H. MacRae II Eur. J. Biochem. 1997. - Vol. 244. - P. 265-278

107. MacRobbie, E.A.C. Evidence for a role for protein tyrosine phosphatase in the control of ion release from the guard cell vacuole in stomatal closure / E.A.C. MacRobbie II Proc. Natl Acad Sci USA.-2002. Vol 99. - P. 11963-11968.

108. Mandava, N.B. Plant growth promoting brassinosteroids / N.B. Mandava // Annu Rev. Plant Physiol Plant Mol Biol. 1988. - Vol 39. - P. 23 -52

109. Marshall, C.J. / C.J. Marshall // Curr. Opin. Cell Biol. 1996. - Vol. 8 - P 197-204.

110. May, T. 14-3-3 proteins from a guidance complex with chloroplast precursorproteins in plants / T. May, J. Soil II Plant Cell. 2000. - Vol. 12. - P. 53 -63. 128 Brassins , a new family of plant hormones from rape pollen / J. W. Mitchell, N.B.

111. Mockaitis, K. Auxin induces mitogenic activated protein kinase (MAPK) activation in roots of Arabidopsis seedlings / K. Mockaitis, S.H. Howell // Plant J. 2000. - Vol. 24. - P. 785 -796

112. Phosphorylation-dependent interactions between enzymes of plant metabolism and 14-3-3 proteins / G. Moorhead, P. Douglas, V. Cotelle et al. //Plant J. 1999. -Vol. 18 -P. 1-12.

113. Mu, J.H. Characterization of a pollen-expressed receptor-like kinase gene of Petunia inflata and the activity of its encoded kinase / J.H. Mu, H.S. Lee, T.H. Kao //Plant Cell. 1994. - Vol. 6. - P. 709 -721.

114. Musaccho, A. Structure and function of the SH3 domain / A. Musaccho, M. Wilmanns, M. Saraste //Prog Biophys. Mol. Biol 1994. - Vol 61. - P. 283 -297.

115. Interaction of 14-3-3 with signaling proteins is mediated by the recognition of phosphoserine/A.J. Muslin, J.W. Tanner, P.M. Allen, A.S. Shaw//Cell. 1996. -Vol. 84.-P. 889-897.

116. Mustelin, T. Meeting at mitosis: cell cycle-specific regulation of c-Src by RPTPa / T. Mustelin, T. Hunter //Sci STKE 2002. - Vol 115. - P. pe 3.

117. Nam, K.H. BR11/BAK1, a receptor kinase pair mediating brassinosteroid signaling/K.H. Nam, J. Li //Cell. 2002. - Vol. 110. - P. 203 -212.

118. BAS1: A gene regulating brassinosteroid levels and light responsiveness in Arabidopsis / M.M Neff, S.M. Nguyen, E.J. Malancharuvil et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1999. Vol. 96.-P. 15316-15323.

119. Newton, R.J. Abscisic acid effects on fronds and roots of Lemna minor L. / R.J. Newton //Am. J. Bot. 1997. - Vol. 64. - P. 45 -49.

120. A plasma membrane-bound putative endo-1,4-beta-D-glucanase is required for normal assembly and cell elongation in Arabidopsis / F. Nicol, I. His, A. Jauneau et al. //EMBO J. 1998 - Vol 17 - P. 5563 -5576

121. Purification of the phosphorylated night form and depho iphorylated day form of phosphoenolpyruvate carboxylase from Bryophyllum fedtschenkoi / G.A. Nimmo, H.G. Nimmo, I.D. Hamilton et al. //Biochem. J. 1986 - Vol. 239. - P. 213 -220.

122. Signal transduction in lemon seedlings in the hypersensitive response against Alternaria alternata• participation of calmodulin, G-protein and protein kinases / X. Ortega, R. Polanco, P. Castaneda, L.M. Perez//Biol Res. 2002. - Vol. 35 -P. 373 -383.

123. Osmond, C.B. U.S. Crassulacean acid metabolism. / C.B. Osmond, J. Holtum // Biochemistry of plants: a comprehensive treatise, photosynthesis. -N.-Y., 1981. -Vol. 8.-P. 283-328.

124. Manipulation of Rubisco: the amount, activity, function and regulation / M.A. Parry, P.J. Andralojc, R.A. Mitchell et al. //J. Exp. Bot. 2003. - Vol. 54. - P. 1321 -1333.

125. Pawson, T. Protein modules and signaling networks / T. Pawson // Nature. -1995.-Vol. 373.-P. 573-580.

126. Pawson, T. SH2 domains interaction modules and cellular wiring / T. Pawson, G.D. Gish, P. Nash // Trends Cell Biol. 2001. - Vol. 11.-P. 504 -511.

127. Pawson, T. Synthetic modular systems reverse engineering of signal transduction / T. Pawson, R. Linding //FEBS Lett. - 2005 - Vol 579. - P. 1808 -1814.

128. Pawson, T. Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains/T. Pawson, P. Nash //Science. 2003. - Vol. 300. - P. 445 -452.

129. Poly a, G.M. Purification and characterization of two wheat-embryo protein phosphatases / G.M. Poly a, M. Haritou // Biochem J. 1988. - Vol. 251. - P. 357-363.

130. Phytochromes: photosensory perceptionand signal transduction / P.H. Quail, M.T. Boylan, B.M. Parks et al. //Science. 1995. - Vol. 268 - P. 675 -680.

131. DNA replication in plants: characterization of a cdc6 homologue from Arabidopsis thaliana / G.B.A. Ramos, J. de Almeida Engler, P.C.G. Ferreira, A.S. Hemerly //J. Exp. Bot. 2001. - Vol. 52. - P 2239-2240

132. Regulation of leaf mitochondrial pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation / D.D. Randall, J.A. Miernyk, N.R. David et al. // Protein phosphorylation in plants. Oxford Press, 1996. - P. 87-103.

133. Chemical modification of the histidine residue in phospholipase A2 (Naja naja naja) / M.F. Roberts, R.A. Deems, T.C. Mincey, E.A. Dennis // J. Biol. Chem. -1977. Vol 252. -P. 2405-2411

134. Roberts, S.K. Plasma membrane anion channels in higher plants and their putative functions in roots/S.K. Roberts//New Phytologist. 2006 - Vol. 169. -P 647-666

135. Developmental responses to drought and abscisic acid in sunflower roots. 2. Mitotic activity // J.M. Robertson, E.C. Yeung, DM. Reid, K.T. Hubick//J. Exp. Bot. -1990. Vol 41.-P. 339-350.

136. Rudrabhatla, P. Developmentally regulated dual-specificity kinase that is induced by abiotic stresses / P. Rudrabhatla, R. Rajasekharan //Plant Physiol 2002. -Vol. 130.-P. 380-390

137. Rudrabhatla, P. Genome-wide analysis and experimentation of plant serine / threonine / tyrosine-specific protein kinases / P. Rudrabhatla, M.M. Reddy, R. Rajasekharan //Plant Mol. Biol. 2006. - Vol. 60. - P. 293 -319.

138. Sakurai, A. The current status of physiology and biochemistry of brassinosteroids /A. Sakurai, S. Fujioka//J. Plant Growth Reg. 1993. - Vol. 13. -P. 147-159.

139. Sasse, J.M. Recent progress in brassinosteroid research / J.M. Sasse // Physiol. Plant. 1997. - Vol. 100.-P. 696 -701.

140. Alternative splicing modulation by LAMMER kinase impinges on developmental and transcriptome expression / S. Savaldi-Goldstein, D. Aviv, 0. Davydov, R. Fluhr//Plant Cell. 2003. - Vol. 15. - P. 926-938.

141. Two-component signaling elements and histidyl-aspartyl phosphorelays / G.E. Scltaller, D.E. Mathews, M. Gribskov, J.C. Walker // Arabidopsis book San Diego, 2002. -P. -9.

142. Regulation of starch accumulation by granule-associated plant 14-3-3 proteins / P.S. Sehnke, H.-J. Chung, K. Wu, R.J. Ferl // Proc. Natl Acad. Sci. USA -2001. Vol. 98. -P 765-770.

143. PK12 a plant dual-specificity protein kinase of the LAMMER family is regulated by the hormone ethylene / G. Sessa, V. Raz, S. Savaldi, R. Fluhr // Plant Cell. -1996 Vol. 8. - P. 2223 -2234.

144. Changes in protein tyrosine phosphorylation during mannose and senescence induced cell death in rice / Y.-W. Shin, W.-C. Chou, Y.-M. Lin et al. // Plant Growth Regul. -2004. Vol. 42 -P. 271 -282

145. Protein phosphatase inhibitors block root hair development and alter cell shape in Arabidopsis roots/R.D. Smith, J.E. Wilson, J.C. Walker, T.I. Baskin //Planta. -1994.-Vol. 194.-P. 516-524.

146. Snyders, S. TAKs, thylakoid membrane protein kinases associated with energy transduction / S. Snyders, B.D. Kohorn //J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274 - P. 9137-9140.

147. Snyders, S. Disruption of thylakoid-associated kinase 1 leads to alteration of light harvesting in Arabidopsis / S. Snyders, B.D. Kohorn // J. Biol. Chem. 2001. -Vol 276.-P. 32169-32176

148. Sommer, D. A possible tyrosine phosphorylation of phytochrome / D. Sommer, T.A. Wells, P.-S. Song //FEBS Lett. 1996. - Vol. 393.-P. 161 -166.

149. A family of cylin D homologs from plants differentially controlled by growth regulators and containing the conserved retinoblastoma protein interaction motif/

150. R. Soni, J.P. Carmichael, Z.H. Shah, J A. Murray//Plant Cell 1995. - Vol 7 -P. 85-103.

151. NQKl/NtMEKlis a MAPKK that acts in the NPK1 MAPKKK-mediated MAPK cascade and is required for plant cytokinesis / T. Soyano, R. Nishihama, K. Morikiyo et al. //GenesDev. 2003. - Vol. 17.-P. 1055-1067.

152. Conserved histidine residues in soybean lipoxygenase: functional consequences of their replacement / J. Steczko, G.P. Donoho, J.C. Clemens et al. //Biochemistry. 1992. - Vol. 31. - P. 4053 -4057.

153. Streusand, V.J. Rubisco activase mediates ATP-dependent activation of ribulose bisphosphate carboxylase / V.J. Streusand, A.R. Portis //Plant Physiol. 1987. -Vol. 85. -P. 152-154.

154. Su, W. Identification in vitro of a post-translation regulatory site in the hinge 1 region of Arabidopsis nitrate reductase / W. Su, S. Huber, N.M. Crawford // Plant Cell 1996 - Vol 8 - P. 519-527.

155. PTEN modulates cell cycle progression and cell survival by regulating phosphatidylinositol 3,4,5,-trisphosphate and Afct / protein kinase B signaling pathway/H. Sun, R. Lesche, D. Li et al. //Proc. Natl. Acad Sci USA. 1999. -Vol. 96.-P. 6199-6204.

156. Sun, H. The coordinated action of protein tyrosine phosphatases and kinases in cell signaling / H. Sun, N.K. Tonks//Trends Biochem. Sci. 1994 - Vol. 19 -P. 480-485.

157. Suzuki, K. Transient activation and tyrosine phosphorylation of a protein kinase in tobacco cells treated with a fungal elicitor/K. Suzuki, H. Shinshi// Plant Cell 1995. - Vol 7. - P. 639 -647.

158. Differential effect of jasmonic acid and abscisic acid on cell cycle progression in tobacco BY-2 cells / A. Swiatek, M. Lanjou, D. Van Bockstaele et al. // Plant Physiol. 2002. - Vol. 128. - P. 201 -211.

159. Takatsuto, S. Chemical, biological and practical aspects of brassinosteroids / S. Takatsuto, F. Futatsuya//Yukagaku. 1990. - Vol 39.-P. 227.

160. Influence of (9Z)-12-hydroxy-9-dodeceonic acid and methyl jasmonate on plant protein phosphorylation /1.A. Tarchevsky, F.G. Karimova, A.N. Grechkin, N.U. Moukhametchina // Biochem. Society Transactions. 2000. - Vol. 28. - P 870871.

161. Protein phosphorylation in amyloplast regulates starch branching enzyme activity and protein-protein interactions/I.J. Tetlow, R. Wait, Z. Lu et al. //Plant Cell -2004.-Vol 16.-P. 694-708

162. Toroser, D. Protein phosphorylation as a mechanism for osmotic-stress activation of sucrise-phosphate synthase in spinach leaves /D. Toroser, S.C. Huber //FEBS Lett 1997. - Vol. 114.-P. 947-955.

163. Torruella, M. Evidence of the activity of tyrosine kinase (s) and of the presence of phosphotyrosine proteins in pea plantlets / M. Torruella, L.M. Casano, R.H. VallejosHJ. Biol Chem 1986 - Vol 261.-P. 6651-6653.

164. Tovar-Mendez, A. Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity in plant cells /A. Tovar-Mendez, J.A. Miernyk, D.D. Randall //Eur. J. Biochem -2003. Vol. 270 - P. 1043-1049.

165. Phosphorylation of plant proteins and the identification ofprotein-tyrosine kinase activity in maize seedlings /J. Trojanek, P. Ek, J. Scoble et al. // Eur. J. Biochem -1996. Vol. 235 - P. 338 -344.

166. Characterization of dual specificity protein kinase from maize seedlings / J.B. Trojanek, M.M. Klimecka, A. Fraser et al. //Acta Biochim. Polonica. 2004. -Vol. 51.-P. 635-647.

167. Novel family of sensor histidine kinase genes in Arabidopsis thaliana / C. Ueguchi, H. Koizumi, T. Suzuki, T. Mizuno //Plant Cell Physiol. 2001. - Vol 42 - P. 231 -235.

168. Van Quy, L. Effect of light and NO{ on wheat leaf phosphoenolpyruvate carboxylase activity. Evidence for covalent modulation of the C3 enzyme. / L. Van Quy, C. Foyer, M.L. Champigny //Plant Physiol. 1991. - Vol. 97. - P. 1476 -1482.

169. Genome-wide analysis of core cell cycle genes in Arabidopsis / K. Vandepoele, J. Raes, L. de Veylder et al. //Plant Cell. 2002. - Vol. 14. - P. 903 -916.

170. Mass spectrometric resolution of reversible protein phosphorylation in photosynthetic membranes of Arabidopsis thaliana /A. V. Verner, A. Harms, M.R. Sussman, R.D. Vierstra//J. Biol. Chem -2001. Vol. 276.-P. 6959-6966

171. Waegemann, K. Phosphorylation of the transit sequence of chloroplast precursor proteins/K. Waegemann, J. Soil//J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271.-P 65456554.

172. Genome-wide analysis of the cyclin family in Arabidopsis and comparative phylogenetic analysis of plant cyclin-like proteins / G. Wang, H. Kong, Y. Sun et al.//Plant Physiol.-2004. Vol. 135. -P. 1084-1099.

173. ICK1, a cyclin-dependent protein kinase inhibitor from Arabidopsis thaliana interact with both Cdc2a and CycD3, and its expression is induced by abscisic acid/H. Wang, Q. Qi, P. Schorr et al. //Plant J. 1998 - Vol. 15. - P. 501 -510.

174. Westermann, S. Post-translation modification regulate microtubule function / S. Westermann, K. Weber // Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2003. - Vol. 4. - P. 938 -947.

175. Regulated phosphorylation of 40S ribosomal protein S6 in root tips of maize / A.J. Williams, J. Werner-Fraczek, I.-F. Chang, J. Bailey-Serres //Plant Physiol. -2003 Vol 132 -P. 2086-2097.

176. Wolff, S.P Ferrous ion oxidation in presence of ferric ion indicator xylenol orange for measurement of hydroperoxides / S.P. Wolff // Methods Enzymol. -1994 Vol 223.-P 182-189

177. Wu, K. The Arabidopsis 14-3-3 multigene family / K. Wu, M.F. Rooney, R.J. Ferl //Plant Physiol. 1997. - Vol. 114. -P. 1421 -1431.

178. Molecular characterization of a tyrosine-specific protein phosphatase encoded by a stress-responsive gene in Arabidopsis /Q. Xu, H.H. Fu, R. Gupta, S. Luan // Plant Cell. 1998. - Vol. 10. - P. 849 -857.

179. Isolation and characterization of GmSTYI, a novel gene encoding a dual-specificity protein kinase in soybean (Glycine max L) /Z.-S. Xu, Y.-Z. Ma, X.-G. Cheng etal. //J. Integr. Plant Biol. 2006 - Vol. 48 -P. 857-866.

180. The structural basis for 14-3-3. Phosphopeptide binding specificity / M.B. Yaffe, K. Rittinger, S. Volinia et al. //Cell 1997 - Vol 91. - P. 961-971.

181. Yang, G. Involvement of calcium-dependent protein kinase in rice (Oryza sativa L ) lamina inclination caused by brassinolide / G. Yang, S. Komatsu // Plant Cell Physiol. -2000 Vol. 41.-P. 1243 -1250.

182. Yemets, A. Does tubulin phosphorylation correlate with cell death in plant cells? / A. Yemets, Ya. Sheremet, Ya. B. Blume // BMC Plant Biol. 2005. - Vol. 5 (Suppll).-S. 36.

183. A new class of transcription factors mediates brassinosteroid-regulated gene expression in Arabidopsis / Y. Yin, D. Vafeados, Y. Tao et al. // Cell. 2005. -Vol. 120. -P. 249-259.

184. Yopp, J.H. Brassinolide, a growth promoting steroidal lactone. I. Activity in selected auxin bioassays / J.H. Yopp, N.B. Mandava, J.M. Sasse//Physiol. Plant -1981 Vol 53 - P. 445-497.

185. An Arabidopsis cell cycle-dependent kinase-related gene, CDC2b, plays a role in regulating seedling growth in darkness / T. Yoshizumi, N. Nagata, H. Shimada, M. Matsui//Plant Cell. 1999. - Vol. 11.-P. 1883 -1896.

186. A role for brassinosteroids in the regulation of photosynthesis in Cucumis sativus / J.Q. Yu, L.F. Huang, W.H. Hu et al //J. Exp. Bot. 2004. - Vol. 55. - P. 1135 -1143.

187. Zhang, K. Cytokinin controls the cell cycle at mitosis by stimulating the tyrosine dephosphorylation and activation of p34cdc2-like HI histone kinase / K. Zhang, D.S. Letham, P.C. John//Planta. 1996 - Vol. 200. -P. 2-12.

188. Zurek, DM. Molecular cloning and characterization of a brassinosteroid-regulated gene from elongating soybean epicotyls / DM. Zurek, S.D. Clouse // Plant Physiol. 1994. - Vol. 104. - P. 161 -170.

Информация о работе

Федина, Евгения Олеговна
кандидата биологических наук
Казань, 2006
ВАК 03.00.12

Диссертация

Влияние 24-эпибрассинолида на фосфорилирование белков растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы