Аденилатциклазы растений: характеристика и роль в реализации защитных механизмов при стрессах

Ломоватская, Лидия Арнольдовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Аденилатциклазы растений: характеристика и роль в реализации защитных механизмов при стрессах
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Аденилатциклазы растений: характеристика и роль в реализации защитных механизмов при стрессах"

На правах рукописи

Ломоватская Лидия Арнольдовна

АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ РАСТЕНИЙ: ХАРАКТЕРИСТИКА И РОЛЬ В РЕАЛИЗАЦИИ ЗАЩИТНЫХ МЕХАНИЗМОВ ПРИ СТРЕССАХ

03.00.12 - физиология и биохимия растений

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

14 ад 2озэ

Иркутск, 2009

003468986

Работа выполнена в лаборатории фитоиммунологии Учреждения Российской академии наук Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск

Научный консультант: д.б.н., профессор А. С. Романенко Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А.К. Глянько

доктор медицинских наук, профессор В.И. Кулинский доктор биологических наук. профессор Ф.Г. Каримова

Ведущее учреждение:

Институт физиологии растений им К.А. Тимирязева РАН, г. Москва

Защита состоится 3 июня 2009 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, Иркутск, а/я 317, ул. Лермонтова, 132. Факс (3952) 51-07-54; E-mail: matmod@sifibr.irk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО

РАН.

Автореферат разослан 23 апреля 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема иммунитета растений является в настоящее время одной из важнейших и достижения в этой области связаны с практическими вопросами, стоящими перед сельским хозяйством. В тесной связи с данной проблемой находится и понятие «стресс», включающее в себя механизмы первичных ответных реакций растительных организмов [Кузнецов и др., 1990; Кузнецов, 2001; Шакирова, 2003]. Известно, что у растений функционирует восемь сигнальных систем, обеспечивающих своевременную реакцию и координацию метаболизма растений на всем протяжении жизненного цикла, а также при изменении условий обитания [Тарчевский, 2001]. Среди них аденилатциклазная сигнальная система является одной из наименее исследованных; в литературе имеются лишь скудные сведения о ее функционировании у растений, как в норме, так и при стрессах.

Эффективность работы любого сигнального пути в значительной степени зависит от фермента-триггера сигнала. Для аденилатциклазной системы таким ферментом является аденилатциклаза, синтезирующая циклический аденозинмонофосфат (цАМФ). Считается, что у растений есть одна изоформа мембранной аденилатциклазы (мАЦ) [Тарчевский, 2001], а наличие «растворимой» формы (рАЦ) этого фермента до сих пор ставится под сомнение [Kamenetsky et al., 2006]. В то же время, у животных идентифицированы 9 изоформ мАЦ, а рАЦ на сегодняшний день обнаружена у многих про- и эукариот. Между тем необходимо отметить, что общие принципы работы рассматриваемой сигнальной системы у разных видов организмов в значительной степени универсальны. Это касается единого принципа организации рецепторов, встроенных в клеточные мембраны, ассоциированных с ними G белков, структуры ключевых ферментов и т. д. Исходя из этого, следует ожидать, что у растений функционирует более сложно организованный, чем представляется сегодня, аденилатциклазный сигнальный путь, включающий многие компоненты, возможно, аналогичные или похожие по структуре и функциям на соответствующие элементы этого сигналинга у животных. В этой связи разработка проблемы транедукции внутри- и межклеточных сигналов посредством аденилатциклазной системы у растений и влияние на этот процесс специфических и неспецифических стрессоров представляется весьма актуальной.

Цель работы: изучение механизмов регуляции активности аденилатциклазной сигнальной системы, а также мембраносвязапной и «растворимой» форм аденилатциклаз у растений под влиянием стрессоров различной природы, длительности и интенсивности.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Установить зависимость между вирулентностью и мукоидностыо ряда штаммов возбудителя кольцевой гнили картофеля - Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Spiecket Kotth) Skaptason et Burk (Cms) и интенсивностью

сорбции патогена на клетках двух сортов картофеля, контрастных по устойчивости к данному возбудителю.

2. Выявить рецепторы к экзополисахаридам (ЭПС) Cms иа плазмалемме клеток растений картофеля двух сортов, контрастных по устойчивости к данному патогену.

3. Определить основные кинетические параметры тотальных мАЦ и рАЦ растений картофеля (оптимум рН, Km, Vmax,) в норме и под действием кратковременного биотического стрессора (ЭПС Cms).

4. Изучить влияние абиотического и биотического стрессоров различной длительности и интенсивности на внутри- и внеклеточную концентрационную динамику цАМФ в клетках разных видов растений (арабидопсис, картофель).

5. Изучить специфичность системного ответа аденилатциклазного пути и мАЦ растений картофеля на биотический и абиотический стрессоры, а также установить сортовые особенности системного ответа этого пути растений картофеля на биотический стрессор.

6. Выявить у растений (картофель, пшеница) изоформу мАЦ, иммунородственную 6-ой изоформе мАЦ животных. Изучить влияние длительных биотического и абиотического стрессоров на активизацию синтеза этой изоформы мАЦ.

7. Изучить спектры изоформ рАЦ у разных видов растений (картофель, пшеница) в норме и под влиянием длительных биотического и абиотического стрессоров.

8. Изучить влияние биотического стрессора на изменение активности мАЦ и рАЦ во фракциях ядер и хлоропластов, выделенных из клеток растений картофеля сортов, контрастных по устойчивости к бактериальному патогену.

9. Исследовать на ультраструктурном уровне локализацию рАЦ во внутриклеточных компартментах растений картофеля. Изучить влияние биотического стрессора на перераспределение цАМФ в компартментах данных клеток.

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Вирулентность и мукоидность возбудителя в патосистеме картофель-кольцевая гниль (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus) коррелируют с интенсивностью его сорбции на поверхности растений. Количество рецепторов к экзометаболитам этого же возбудителя на плазмалемме клеток картофеля связано с сортовой устойчивостью этой культуры.

2. Компонентами аденилатциклазной системы растений разных видов являются «растворимая» АЦ, а также изоформа мАЦ, иммунородственная 6-ой изоформе мАЦ животных. Длительные специфические стрессы не приводят к интенсификации синтеза этих форм фермента.

3. При воздействии биотического стрессора па растения картофеля одним из основных регуляторных механизмов модулирования активности аденилатциклазной сигнальной системы является изменение кинетических параметров «растворимой» и мембраносвязанной форм фермента. Высокая скорость, кратковременность, а также системность активации

аденилатциклазного сигнального пути растений являются необходимым условием успешной реализации защитных механизмов при воздействии специфических и неспецифических стрессоров.

4. Как локальное, так и системное изменение уровня цАМФ у растений может выступать маркерным признаком специфической устойчивости. Научная новизна. Впервые у растений выявлена «растворимая» аденилатциклаза во многих компартментах клеток, определена ее молекулярная масса и показано, что под воздействием длительных стрессоров различной природы количество изоформ рАЦ не увеличивается. Также впервые у растений выявлена изоформа мембраносвязанной аденилатциклазы, иммунородственная б-ой изоформе аденилатциклазы животных и показано отсутствие интенсификации синтеза этой изоформы под воздействием длительных стрессоров различной природы. Показано, что ЭПС Cms осуществляют аллостсрическую и изостерическую регуляцию активности мАЦ в клетках растений обоих сортов: у устойчивого - положительную, у восприимчивого - отрицательную. Впервые определены кинетические параметры «растворимой» АЦ растений и показано, что ЭПС Cms активируют эту форму фермента у растений резистентного сорта и ннгибируют у восприимчивого сорта. Впервые показано, что модулирование активности аденилатциклазной сигнальной системы под воздействием биотического стрессора (ЭПС Cms) у растений сортов, контрастных по устойчивости к данному фактору, связано с изменением кинетических параметров мембраносвязанной и «растворимой» форм аденилатциклаз. Установлено, что под воздействием специфического стрессора активация аденилатциклазного сигнального пути связана с устойчивостью сорта к данному фактору внешней среды, тогда как при неспецифическом стрессовом воздействии реакция данной системы одинакова у двух сортов. Показано, что под воздействием биотического стрессора скорость передачи внутриклеточного сигнала от изучаемой сигнальной системы значительно выше у растений устойчивого сорта, чем у восприимчивого. Результаты исследований обобщены в схему передачи внутри- и межклеточных сигналов с помощью аденилатциклазной сигнальной системы растений при воздействии специфических и неспецифических стрессоров.

Теоретическая и нрастическая значимость. Полученные результаты вносят существенный вклад в познание механизмов внутриклеточной сигнализации у растений при воздействии стрессоров различной природы и специфичности и выявляют ряд неизвестных до настоящего времени элементов молекулярных механизмов конститутивного иммунитета растений. Совокупность проведенных исследований позволяет предложить в качестве маркерного признака специфической устойчивости локальное и системное изменение уровня цАМФ в растениях, что в дальнейшем даст возможность работать над созданием сортов с высокой устойчивостью к различным неблагоприятным факторам внешней среды.

Апробация работы: Основные результаты работы докладывались на международном Симпозиуме «Signal system of plant cell» (Москва, 2001), на международных конференциях «Физиология растений - основа биотехнологии» (Пенза, 2003), «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), Всероссийских научных конференциях «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004), «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2007), «Роль сельскохозяйственной науки в развитии АПК Приангарья» (Иркутск, 2007).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 19 работ. Струсттра и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследований, результатов и обсуждения, заключения и выводов, а также списка литературы (518 источников, в том числе 118 российских и 400 иностранных). Работа изложена на 303 страницах, содержит 64 рисунка и 12 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Пробирочные растения картофеля (Solanum tuberosum L.) сортов: Лукьяновский — восприимчивый по отношению к возбудителю кольцевой гнили картофеля, и Луговской - устойчивый, в возрасте 3-4 недели размножали черенкованием и культивировали на агаризованной среде Мурасиге-Скуга в факторостатных условиях [Бутенко и др., 1984]. Растения этих сортов получены из коллекции НИИ картофельного хозяйства (НИИКХ), п. Коренево, Московская область.

Рыхлый тканевый каллус выращивали на листовых и стеблевых эксплантах на агаризованной питательной среде Мурасиге и Скуга в течение 7-10 дней при влажности воздуха 70 % и температуре 25° С, в темноте.

Суспензионную культуру клеток картофеля получали из каллуса безвирусных растений картофеля ш vitro, используя питательную среду Мурасиге и Скуга [Murashige, Skoog, 1962], без добавления агара, при постоянном покачивании на ротационном шейкере.

Проростки пшеницы. В работе использовали два сорта пшеницы: Иркутскую озимую и яровую Тулунский 12 , выращенные при 22° С в течение 3-х дней. Культивирование бактерий. Культура Clavibacter michiganensis subsp. sepedoniciis (Spiecket Kotth) Skaptason et Burk, мукоидного, вирулентного штамма 5369 была получена из НИИКХ (пос. Коренево, Московской обл.). Штаммы CsR14 (вирулентный мукоидный), Cic31 (вирулентный немукоидный), Cs3NM (средневирулентный немукоидный), CsR5 (авирулентный мукоидный) и Cs4 (авирулентный немукоидный) были любезно предоставлены д-ром Metzler (Университет г. Турку, Финляндия). Бактериальную культуру выращивали в колбах на среде, содержащей 10 г/л диализата дрожжевого экстракта («Sigma», США), 15 г/л глюкозы («Реахим», Россия), 5 г/л СаС03 («Реахим», Россия), 20 г/л агара («НИЦФ», Россия), pH 7,0 при температуре 25° С, в темноте.

Выделение и очистка ЭПС. Выделение и очистку ЭПС Cms из культуралыюго фильтрата проводили методом колоночной ионообменной хроматографии [Strobel, 1967].

Коньюгирование ЭПС с флюорохромным красителем. 30 мг ЭПС и 1,3 мг РИТЦ (родаминизотиоцианат) ("Serva", Германия) отдельно растворяли в 2 мл 100 мМ фосфатного буфера, pH 8.8, смешивали и оставляли для конъюгации при 4°С на 15 ч. Копыогат очищали от несвязанного красителя колоночной гель-хроматографией с использованием сефадекса G-25 ("Sigma", США) и элюировали бидистиллированной водой. Фракцию, содержащую конъюгат, упаривали до сухого состояния на роторном испарителе и хранили при 4°С. Определение сорбционпой способности Cms. 1 мл бактерий с одинаковыми для всех штаммов титрами (2 х 108 клеток/мл) добавляли к 1 мл 3-х й 7-суточных суспензионных клеток картофеля (титры Ю3 и 5 х 102 клеток/мл, соответственно) двух сортов: Луговской - устойчивый, Лукьяновский -восприимчивый. Коинкубацию проводили в течение 2 и 9 час, после чего суспензию для удаления нес вязавшихся бактерий центрифугировали при 1500 g и дважды промывали средой культивирования, после чего подсчитывали в камере Горясва на микроскопе Laboval 4 ("Carl Zeiss", Германия) количество бактерий, прикрепившихся к суспензионным клеткам. По каждому варианту было проанализировано 80-100 растительных клеток.

Выделение протопластов. Для выделения протопластов использовали листья пробирочных растений двух сортов картофеля, контрастных по устойчивости к возбудителю кольцевой гнили. Отделенные от растений листья измельчали на фрагменты размерами 4-6 мм2 в среде Мурасиге - Скуга на 0,06 М K-Na фосфатном буфере, pH 5,8 и инфильтрировали методом создания обратного давления в шприце ферментативным раствором следующего состава в конечных концентрациях: 1 % мацерозим ("Merck", Германия); 1 % целлюлаза ("Sigma", США); 0,5 % гемицеллюлаза ("Sigma", США); 0,3 М сорбит; ЗмМ СаСЬ; 1 % БСА ("Реахим", Россия); 0,06 М K-Na фосфатный буфер, pH 5,8: среда Мурасиге - Скуга (1:1). Общий объем среды составлял 3 мл. С целью защиты от протеолиза белковой части рецепторов в среду выделения добавляли 1% БСА в качестве конкурентного субстрата для возможных примесей протеаз в используемых препаратах пектолитических ферментов [Diekmann et al., 1994]. Растворы с фрагментами, листьев помещали во флаконы и ставили на качалку при температуре 28°С на 3 часа. Полученную суспензию фильтровали через капрон и дважды промывали средой выделения без ферментов.

Иикубация протопластов с ЭПС. Протопласты инкубировали с избытком ЭПС Cms, коньюгированного с родаминизотиоцианатом (РИТЦ) в течение 60 мин в темноте. Затем дважды отмывали от несвязавшегося комплекса ЭПС-РИТЦ средой выделения без ферментов. Не менее 50 протопластов каждого сорта просматривали в люминесцентном микроскопе МЛ-2АУ4.2 («Ломо», Россия). Использовали пропускающий светофильтр СС-15, запирающий светофильтр ЖС-18. Контролем служили неокрашенные протопласты.

Подготовка образца для определения концентрации цАМФ

Суспензионная культура клеток картофеля. Суспензионную культуру фиксировали в жидком азоте, фильтровали и гомогенизировали в буфере выделения следующего состава: 50 мМ трис-HCl, рН 7.4, 0.1 мМ теофиллин, 1мМ дитиотреитол, 0.5 мг/мл растворимый поливинилпирролидон ("Fluka" Швеция), сорбирующий фенолы. Для дополнительного связывания фенолов (при определении содержания цАМФ) [Каримова и др., 1990] при гомогенизации использовали ионообменную смолу Dowex-50 ("Sigma", США) в весовом соотношении 1:5 (смола:растительный материал). Далее смесь фильтровали через два слоя мелкоячеистого капрона и центрифугировали 40 мин при 20000 g. Для повышения специфичности иммунной реакции в иммуноферментном анализе (ИФА), образец очищали от присутствия других циклических нуклеотидов с помощью нейтральной окиси алюминия.

Растения картофеля in vitro фиксировали в жидком азоте, затем делили на участки длиной около 4 см. Далее образцы подвергали процедурам, описанным для суспензионной культуры клеток.

Очистка осадка и супернатанта от примесей других циклических иуклеотидов. На колонку с нейтральной окисью алюминия с толщиной слоя 1 см3, уравновешенную буфером выделения, наносили 1 мл супернатанта или осадка, ресуспендированного в буфере выделения. Элюцию проводили тем же буфером и анализ спектра веществ осуществляли с помощью хроматографического оборудования ("Uvicord", Швеция) при длине волны 276 нм. Стандартами служили аденозин, 5'-АМФ, цАМФ, цГМФ, цТМФ, цЦМФ ("Sigma", США) в концентрации 100 пМ. В этом случае цАМФ элюировался раньше других соединений и обнаруживался уже во втором мл, что согласуется с литературными данными [White, Zenser, 1971]. Общий объем элюата составлял около 8 мл. Далее элюат упаривали на роторном испарителе под вакуумом, сухой остаток растворяли в 100% диметилсульфоксиде («Реахим», Россия) для удаления солей, затем центрифугировали при 20000 g. Диметилсульфоксид из осадка удаляли ацетоном («Экос-1», Россия). Пробу высушивали на воздух"е при комнатной температуре. Количество цАМФ определяли ИФА.

Иммуноферментный аналнз (ИФА)

Анализ начинали с иммобилизации антигена на поверхности планшета. С этой целью в лунки полистироловых планшетов для ИФА («Ленинградский ЗМП», Россия) вносили по 0.1 мл смеси следующего состава: 1 мл исследуемого образца + 0.08 мл 25%-ного глутарового альдегида («Sigma», США) + 1 мг/мл БСА («Sigma», США). Планшеты инкубировали 15 часов при 37°С и лунки трижды промывали раствором ФТБС (0.02 М Ка-фосфатный буфер, 0.1 М NaCl («Реахим», Россия), 0.3 % Твин-20 («Ferak», Германия), рН 7,0). Затем для предотвращения неспецифического связывания антител с твердым носителем в каждую лунку добавляли по 0.1 мл лошадиной сыворотки («Аллерген», Россия), разведенной 1:10 ФБС (ФТБС без твина) и планшеты выдерживали 1 ч при 37° С. После этого в лунки вносили по 0.1 мл

первичных кроличьих антител против цАМФ ("Sigma", США) в концентрации 60 мкг/мл, разведенных в ПБС. Материал инкубировали 2 ч при 37°С и промывали трижды ФТБС. Затем повторяли обработку образцов лошадиной сывороткой. Далее в лунки вносили по 0.1 мл меченных пероксидазой вторичных козьих антител ("Sigma", США), разведенных 1:800 в 0.1 М карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 8.3 и через 1 ч инкубации при комнатной температуре отмывали трижды ФТБС. После этого осуществляли трехразовое промывание лунок планшетов 0.1 М фосфатно-цитратным буфером, рН 5.6, для удаления детергента, создающего высокий фон неспецифического окрашивания при развитии цветной реакции на пероксидазу. Затем в каждую лунку добавляли 0.1 мл 0,16% ортофенилендиамина («Sigma», США), растворенного в том же самом фосфатно-цитратном буфере и 3 мкл 3% перекиси водорода. Окраска развивалась в течение 20 мин. Реакцию останавливали добавлением 0.1 мл/лунку 4 N серной кислоты («Реахим» Россия). Измерения интенсивности поглощения света растворами проводили на спектрофотометре С-101-46 ("BioRad", Германия) при длине волны 490 нм. Контролем служил буфер выделения без растительных образцов. Калибровочную кривую строили по цАМФ ("Sigma", США). Нижний предел определения данного метода - 10 пМоль цАМФ в пробе. Эксперименты проводили в восьми аналитических и трех биологических повторностях.

Метод дифференциального центрифугирования в градиенте плотностн для выделения фракции ядер и хлоропластов из листьев растений картофеля. Растения гомогенизировали в ступке при температуре 4°С в буфере выделения, описанном выше. Гомогенат (1,5 мл) наносили на градиент сорбита («Реахим», Россия) (0,75М, 1,5М, 2,5М и 4М по 2 мл.) и центрифугировали 30 мин при 600g на холоду. Хлоропласты собирали в 1 и 2 слоях, ядра - на границе между 3 и 4 слоями. Оценку чистоты фракции выделенных органелл осуществляли под контролем люминесцентного микроскопа МЛ-2АУ4.2 («Ломо», Россия). С этой целью ядра окрашивали DAP1 ("Sigma", США), хлоропласты обладали собственной ярко-красной флюоресценцией.

Методика подготовки образцов для определения активности рАЦ и мАЦ.

Фракции, обогащенные ядрами и хлоро пластам и, инкубировали 30 мин с 0,01% октил-В-Б-глюкопиранозидом («Amresco», США) при температуре 4°С для освобождения растворимой АЦ. Затем образцы центрифугировали при I05000g 3 часа. Полученный осадок использовали для определения активности мембранносвязанной АЦ, а супернатант - для определения активности растворимой АЦ. Реакцию начинали внесением растительного белка в количестве 100-150 мкг/г сырой массы в 500 мкл инкубационной среды: 50 мМ трис-HCI, рН 7.2, 0,1 мМ теофиллин, 1мМ дитиотреитол, 0,5 мМ АТФ ("Sigma", США), 3 мМ MgS04 («Реахим» Россия). В некоторые пробы из осадка и из супернатанта добавляли специфические эффекторы мембранносвязанной и «растворимой» форм АЦ: 3 мМ МпС12 («Реахим»

Россия) или 20 мМ NaHC03 («Реахим», Россия) - для активации рАЦ, 10 мМ NaF («Реахим» Россия) - для стимуляции мАЦ, а также 10 мкМ сурамина («Sigma», USA) - специфического ингибитора мАЦ, разобщающего G белок с рецептором. Реакцию проводили при 27°С в течение 30 мин и останавливали кипячением в течение 3 мин на водяной бане. Далее, для повышения специфичности иммунной реакции, образец дополнительно очищали от присутствия других циклических нуклеотидов с помощью нейтральной окиси алюминия («Merk», Германия). Белок в растительной пробе определяли по методу Брэдфорд.

Методика определения оптимума pll, и кинетических характеристик мАЦ и рАЦ из корней растений картофеля. Корни пробирочных растений картофеля отделяли от стебля и гомогенизировали в среде выделения и в режимах центрифугирования как указано выше. Получали две фракции: супернатант, содержащий рАЦ и осадок, содержащий мАЦ. Для определения оптимума pH проводили анализ активности мАЦ, описанный выше с некоторыми изменениями. Выделенный растительный белок (см. Подготовка образна для определения концентрации цАМФ) в количестве 100-150 мкг/г сырой массы, помещали в буферные растворы (500 мкл) с различными значениями pH (6.0; 6.7; 7.4 и 8.0), содержащие компонент, предохраняющий SH-группы белков, а также ингибиторы протеиназ и фосфодиэстеразы цАМФ и инкубировали 30 мин с 0.5 мМ АТФ при температуре 27° С. Реакцию останавливали кипячением и далее определяли концентрацию цАМФ. Для определения кинетических параметров мАЦ и рАЦ, белки из осадка и супернатанта инкубировали с различными концентрациям АТФ (0,07 мМ; 0,2 мМ; 0,4 мМ; 0,5 мМ) и 3 мМ MgS04 в каждом варианте. В отдельные варианты для мАЦ добавляли 10 мМ NaF, для рАЦ - 3 мМ МпС12, или 20 мМ NaHC03. Реакцию проводили в течение 30 мин при 27° С и останавливали кипячением. В пробах проводили определение концентрации цАМФ. В некоторые образцы вносили 10 мкМ сурамина для ингибирования мАЦ или 40 мкМ КН-7, являющегося специфическим ингибитором рАЦ животных [Zippin, 2003]. Выявление мембранных липидов во фракциях клеток после ультрацеитрнфугирования. Для подтверждения отсутствия мембранных липидов в супернатанте после ультрацентрифугирования гомогената растительных клеток (105 000g, 3 ч) проводили тонкослойную хроматографию образцов, полученных из супернатанта и из осадка (Пустовалова, 1999). Приготовление образцов для электронной микроскопии » иммунноэлектронная цитохимия для выявления цАМФ п рАЦ. Исследования проводили на корнях (цАМФ, рАЦ) и листьях (рАЦ) in vitro растений картофеля. Опытом служили растения, к среде роста которых добавляли 0,1% ЭПС Cms (15 мин), контролем - растения в обычной среде роста. Приготовление образцов проводили по методу Миронова и др. (1994) с использованием первичных антител к цАМФ («Sigma», США), рАЦ (антитела любезно предоставлены сотрудниками лаборатории Баха и Левина,

Корнельсний университет, Нью-Йорк, США) и вторичных антител, меченных золотом («Sigms», США).

Количественная оценка меток к цАМФ. Изображение участков клеток, полученных с ультратонких срезов всех анализируемых вариантов, предварительно приводили к единому масштабу с помощью программы Adobe Photoshop 7.0.1. и измеряли общую площадь, площадь каждого компартмента и длину мембран (плазмалемма, тонопласт), после чего подсчитывали в них электронноплотные частицы золота, отражающие локализацию цАМФ, используя программу SigmaScan Pro 5. Полученные величины пересчитывали на 10 мкм2 суммарной площади компартмента каждого типа, а для мембран -на 10 мкм их длины. По каждому варианту использовали 15-18 изображений.

Иммунопреципитация на сефарозе-А с прменением первичных антител. Иммунопреципитацию проводили по стандартному протоколу, предлагаемому фирмой «АВСАМ» (Великобритания). Против рАЦ использовали моноклональные антитела животных, которые были получены к N концу каталитического домена растворимой аденилатциклазы животных и обладали только одним эпитопом, содержащим 14 аминокислот (EIESVPDQRAVKVN), благодаря чему достигалась их высокая специфичность [Zippin et al., 2003], титр 1:10; титр поликлональных антител против мАЦ-6 животных составлял 1:50 ("АВСАМ", Великобритания). Первичные поликлональные антитела были получены к 121 аминокислоте N-конца молекулы мАЦ, отличающегося наибольшим консерватизмом ("Abeam", Великобритания). Электрофорез. Электрофорез белков проводили в блоках 10%-ного полиакриламидного геля в модифицированной системе Лэммли [Laemmli, 1970], используя прибор для электрофореза Mini-PROTEAN III («Bio-Rad», США), согласно инструкции производителя.

ИммупоГтотинг. Иммуноблотинг проводили по Timmons, Dunhar (1990) на приборе фирмы «Bio-Rad» (США). Титр первичных моноклональных антител к рАЦ составлял 1:1000, поликлональных к мАЦ-6 - 1:500. Использовали вторичные антитела (титр 1:1000), коньюгированные с пероксидазой («Sigma», США).

Статистическая обработка результатов. Эксперименты проводили в трех биологических повторностях. Аналитические повторности в зависимости от используемого метода составляли от трех до восьми. Полученные результаты обработаны статистически, с вычислением ошибки среднего, в некоторых случаях коэффициента корреляции и значений достоверности различий между вариантами опыта и сортами (Р).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Сорбция штаммов Cms, отличающихся по мукоидности и вирулентности, на поверхности суспензионных клеток двух сортов картофеля, контрастных но устойчивости к данному патогену. Существенная роль в процессе колонизации тканей патогеном и экспрессии или супрессии защитных реакций растений принадлежит, в частности, экзополисахаридам

(ЭПС), формирующим мукоидное окаймление бактерий [Denny, 1995; Romantschuk, 1992]. Однако имеющиеся литературные данные о роли мукоидности в проявлении патогенности (вирулентности) при бактериозах весьма малочисленны и противоречивы [Geier, Geider, 1992; Bermpohl et al., 1996]. Использование в качестве модели in vitro растений картофеля и шести различающихся по вирулентности штаммов Cms показало, что на восприимчивом сорте (Лукьяновский) эти штаммы проявили вирулентные свойства, соответствующие характеристикам, описанным в литературе, а по отношению к устойчивому сорту (Луговской) все штаммы оказались авирулентными [Ромаиенко и др., 1998; 2002]. Результаты проведенных экспериментов позволили установить, что наиболее ярко сорбция Cms проявлялась на 7-суточной культуре ткани. На клетках устойчивого copra исследуемые шесть штаммов Cms сорбировались в незначительной степени, тогда как на суспензионных клетках восприимчивого сорта довольно эффективно сорбировались пять из шести штаммов Cms (Рис. 1). Между сорбцией и вирулентностью Cms, а также между сорбцией и мукоидностью тех же штаммов наблюдалась корреляция с заметной и высокой теснотой связи, соответственно.

. Луговской

Рис.1. Интенсивность сорбции шести штаммов Cms на суспензионных клетках картофеля

По имеющимся литературным данным в клеточных стенках растений картофеля локализованы рецепторы к ЭПС Cms, причем, в таких структурах клеток растений восприимчивого сорта их присутс твует на порядок больше, чем у клеток резистентного сорта [Романенко и др., 1999]. Кроме того, рецепторы только восприимчивого сорта содержат положительно заряженные аминокислоты [Романенко и др., 1999], а в составе штаммов Cms обнаружены фосфатные и сульфатные группы, имеющие отрицательный заряд. Следует заметить, что по их содержанию все шесть штаммов значительно различались [Ломоватская, 2001]. Поэтому в паре восприимчивый сорт - Cms наблюдаемая интенсивная сорбция реализовывалась через большое количество рецепторов к ЭПС Cms и усиливалась за счет ионных взаимодействий между аминокислотами рецепторов и фосфатными группами в составе ЭПС Cms, тем более, что между сорбцией и этими группами установлена корреляция с заметной теснотой связи.

Поскольку у суспензионной культуры клеток устойчивого сорта специфических детерминант значительно меньше, а в их составе отсутствовали положительно заряженные аминокислоты, процесс сорбции был выражен | весьма незначительно. Выявление рецепторов к экзополисахаридам Cms на плазмалемме клеток-растений картофеля. Благодаря первичному контакту возбудителя с клеточными стенками растений картофеля возникает вероятность диффузии j экзополисахаридов бактерий через оболочку растительной клетки в район плазмалеммы. Это представляется вполне возможным, поскольку ЭПС Cms весьма гетерогенны по молекулярным массам - от 1 кДа до более чем 700 кДа [Рымарева, 2001; Шафикова, 2003]. Исходя из этого, логично было предположить, что на плазматической мембране клеток растений картофеля j должны присутствовать рецепторы к ЭПС Cms. Наличие таких детерминант выявляли методом люминесцентной микроскопии на протопластах, полученных из клеток мезофилла листа растений двух сортов картофеля, контрастных по устойчивости к Cms. Коинкубация протопластов с комплексом ЭПС-РИТЦ (родаминизотиоцианат) приводило к голубоватому свечению протопластов. Его интенсивность имела существенные сортовые отличия: протопласты листьев устойчивого сорта практически не флуоресцировали, тогда как протопласты, выделенные из листьев восприимчивого сорта, светились довольно интенсивно [ (Рис. 2). Важно отметить, что неоднократное отмывание протопластов средой инкубации не снижало флуоресценции.

Таким образом показано, что на плазмалемме клеток растений картофеля присутствуют рецепторы к ЭПС Cms, различающиеся по количеству у двух сортов, контрастных по устойчивости к возбудителю кольцевой гнили.

А Б В Г

Рис. 2. Сорбция ЭПС Cms на плазмалемме клеток картофеля А - сорт Луговской (резистентный), контроль, световая микроскопия, Д - флуоресцентная микроскопия, Б - сорт. Лукьяиовский (восприимчивый), контроль, световая микроскопия, Е -флуоресцентная микроскопия; В - сорт резистентный ЭПС+РИТЦ, световая микроскопия, Ж - флуоресцентная микроскопия, Г- сорт восприимчивый, ЭПС+РИТЦ, световая микроскопия, 3 - флуоресцентная микроскопия.

Поскольку ЭПС могут выступать как в роли элиситоров, так и супрессоров [Романепко и др., 1999; Шафикова, 2003], можно предположить, что у растений устойчивого сорта данные детерминанты имеют большее сродство к элиситорным компонентам ЭПС, тогда как у восприимчивого сорта - к супрессорным, что должно сказываться на работе сигнальных внутриклеточных путей, а затем и на качестве защитных реакций растений. Кроме того, большее количество рецепторов у восприимчивого сорта также может быть причиной супрессии защитных сигналов, так как известно, что в зависимости от концентрации, экзометаболиты патогена могут быть специфическими элиситорами или супрессорами [Озерецковская, 2002; Дьяков, 2008]. Определение кинетических параметров тотальных мАЦ и рАЦ из корней растений картофеля двух сортов, контрастных по устойчивости к Cms и опосредованное влняние ЭПС Cms на эти параметры. Для объективной оценки свойств изучаемых форм фермента необходимо знание оптимальных условий их функционирования и кинетических характеристик, а также характер изменений этих параметров под воздействием неблагоприятных факторов внешней среды, в частности ЭПС Cms. Объектом экспериментов служили корни пробирочных растений картофеля двух сортов, контрастных по устойчивости к Cms. В опытном варианте неотделенные от растений корни инкубировали в течение 1 мин с 0,1% ЭПС Cms. Осадок после гомогенизации и ультрацентрифугирования, обогащенный микросомальной фракцией, служил источником мембраносвязанной аденилатциклазы; в супернатанте определяли активность «растворимой» аденилатциклазы. Супернатант содержал только рАЦ, поскольку в нём отсутствовали мембранные липиды, в отличие от осадка, где были выявлены все основные липидсодержащие составляющие растительных мембран. Кроме того, применялся ингибиторный анализ, для чего в образцы микросомальной фракции добавляли сурамин, разобщающий связь G белка с рецептором. При этом происходило значительное ингибирование активности мАЦ во всех вариантах у обоих сортов. Для подавления активности рАЦ применялся ингибитор 2-(1Н-бензоимидазол-2-сулфанил)-пропионовая кислота-(5- бромо-2-гидроксибензилиден)-гидразид (КН-7), специфически блокирующий активность этого фермента в клетках животных [Stessin et al., 2006]. Однако на растениях картофеля ингибирования рАЦ не наблюдалось. Проведенные эксперименты позволили выявить оптимум рН активности мАЦ, который составил 7,4. Кинетические параметры мАЦ

Мембраносвязанная АЦ из клеток корней растений устойчивого к Cms сорта имела максимальную скорость реакции и сродство к субстрату почти в 2,5 и 2 раза выше, соответственно, чем у мАЦ из растений восприимчивого сорта. В контроле у мАЦ из растений восприимчивого сорта наблюдалось субстратное ингибирование, которое почти отсутствовало у мАЦ из устойчивого сорта. Фторид натрия повышал уровень Vmax мАЦ клеток растений обоих сортов практически в одинаковой степени, и понижал степень сродства к, субстрату, причем в большей степени у устойчивого сорта (Табл. 1; Рис. 3,4). ЭПС Cms

оказывали разнонаправленный эффект на активность изучаемого фермента у растений обоих сортов. У устойчивого сорта Vmax мАЦ возрастало почти в 3 раза, при этом Кт была почти такой же, как в контроле. У восприимчивого сорта Vmax снижалась почти в 7 раз, но Кт и сродство к субстрату не менялись, что свидетельствует о неконкурентном ингибировании активности фермента по изостерическому типу. Фторид натрия на фоне ЭПС значительно повышал максимальную скорость реакции у мАЦ из клеток растений обоих сортов, не меняя при этом Кт(Табл. 1; Рис. 3,4). Здесь необходимо отметить, что ЭПС Cms оказывали не прямое воздействие на данный фермент, а влияли опосредованно через механизм лиганд-рецепторного взаимодействия в системе in vivo, из чего следует, что в регуляции активности мАЦ принимает участие комплекс лиганд-рецептор-G белок-мАЦ.

Таблица. 1. Кинетические параметры мАЦ из растений картофеля и

влияние на них NaF и ЭПС Cms

сорт Луговскои (резистентный) сорт ЛукьяновскиЯ (восприимчивый)

Варианты опыта v„„, нМ/мг белка/ мин К„„ мМ Сродство к субстрату, мМ v„,ax нМ/мг белка/ мин Кт, мМ Сродство к субстрату, мМ

Контроль (-ЭПС) 9 0,07 14,3 3,4 0,1 8,7

Контроль + 10 мМ NaF 15,5 0,2 6,7 4,3 0,2 5,8

Опыт (+ЭПС) 24 0,06 17,5 0,5 0,1 8,7

Опыт + 10 мМ NaF 44,5 0,06 17,5 2,3 од 10

Это заставляет рассматривать процесс также и в рамках аллостерических взаимодействий, где регуляция активности фермента должна осуществляться через конформационное изменение последнего в результате его регуляции О белком.

А ТФ. ММ

ОмМ NaF

—— ->3nc

— —■ контроль (без ЭПС). ЮнМ NaF > контроль (баз ЭПС)

Рис. 3. Влияние ЭПС Cms на кинетические параметры мАЦ, сорт Луговской (устойчивый)

с. Лукьяновский

А ТФ. мМ

Рис.4. Влияние ЭПС Cms на кинетические параметры мАЦ, сорт Лукьяновский (восприимчивый)

Данные по влиянию сурамина на активность мАЦ растений картофеля и активацию мАЦ фторидом натрия, реализуемую через ГТФ-связывающий центр G белков, позволяют заключить, что мАЦ в растениях картофеля также регулируется G белками, хотя остается совершенно не ясным, какого типа G белки функционируют в данном случае у растений каждого из сортов. На основе полученных результатов можно сказать, что под влиянием

биотического стрессора активность мАЦ растений картофеля модулируется по изостерическому и аллостерическому типам. У устойчивого сорта наблюдается положительная аллостерическая регуляция, у восприимчивого -отрицательная.

Кинетические параметры рАЦ. Прежде всего обращает на себя внимание тот факт, что максимальная скорость реакции и Кт у рАЦ из корней растений обоих сортов в контроле были практически одинаковы (Рис.5,6). NaHC03 в концентрации 20 мкМ повышал Vmax рАЦ также в равной степени у обоих сортов, незначительно меняя Кт и сродство к субстрату (Табл. 2). ЭПС Cms более чем в 2 раза повышали максимальную скорость реакции у рАЦ из растений устойчивого сорта и в 2 раза снижали Кт, что приводило к возрастанию сродства к субстрату. В то же время у восприимчивого сорта Vmax снижалась почти в 4 раза, а Кш оставалась почти на том же уровне (Рис.5,б). При этом у обоих сортов наблюдалось субстратное ингибирование. Предположительно, механизмы этого явления у растений двух сортов различны, так как изменение сродства к субстрату рАЦ наблюдалось только у устойчивого сорта (Рис.5,6). Воздействие бикарбоната на фоне ЭПС оказывало практически одинаковый эффект на рАЦ из обоих сортов, а именно повышало Vmax и снижало сродство к субстрату, хотя субстратное ингибирование при этом усиливалось.

Рис. 5. Влияние ЭПС Cms на кинетические параметры рАЦ, сорт Луговской (устойчивый)

АТФ, ММ ч- Э ММ МПС1,

I . <"■*- ОПО ч- 20 мкМ N>HG03 ЭПС

ттг-тт* без ЭПС + 20 мкМ NaHCOg - *■■■■ контроль (без ЭПС)

Рис. 6. Влияние ЭПС Cms на кинетические параметры рАЦ, сорт Лукьяновский (восприимчивый) По литературным данным [Litvin et al., 2003], действие бикарбоната в клетках животных основано на конформационных изменениях молекулы рАЦ, что приводит к закрытию активного сайта и облегчению связывания второго иона металла, вследствие чего повышается Vmax и в последующем снижается субстратное ингибирование. При этом авторы использовали концентрации субстрата, превышающие таковые в наших экспериментах в 10 и более раз, а бикарбоната - на три порядка. Можно предположить, что при гораздо меньших концентрациях субстрата (0,07 - 0,5 мМ) и бикарбоната (20 мкМ) механизм действия НСОз" будет иным.

Таблица. 2. Кинетические параметры рАЦ из растений картофеля и влияние на них NaHCQ3 и ЭПС Cms__

Сорт Луговской (резистентный) Сорт Лукьяновский (воспрпичвый)

Варианты опыта Vmax, нМ/мг белка Кга, мМ Сродство к субстрату, мМ ^iii ах. нМ/мг белка Km, мМ Сродство к субстрату, мМ

Контроль (-ЭПС) 1,3 0,04 25 1,5 0,04 25

Контроль + 20 мМ NaHCO, 2,2 0,04 28,6 2,2 0,03 29,4

Опыт (+ЭПС) 2,8 0,02 55,6 0,4 0,03 29,4

Опыт + 20 мМ Nal ICO, 5,6 0,03 37 0,9 0,04 27,8

В предварительных экспериментах нами было установлено, что более высокая концентрация бикарбоната (40 мкМ) оказывала ингибирующий эффект

на активность рАЦ. Эти результаты позволяют предположить, что рАЦ растений имеет свои структурные особенности, хотя это требует дальнейшей проверки, в частности, использования очищенного препарата фермента. Пока остается неясным механизм воздействия ЭПС Cms на рАЦ растений картофеля. Так как воздействие данного неблагоприятного фактора продолжалось всего 1 мин, необходимо, чтобы агент, модулирующий активность рАЦ, за столь короткое время распространился по цитоплазме и достиг внутриклеточных компартментов - мест локализации рАЦ. Исходя из таких установок, можно предположить, что на такую роль могут претендовать ионы кальция, поскольку, во-первых, скорость их распространения в клетке очень высока [Медведев, 1998] и, во-вторых, под воздействием внешних факторов, например, элиситоров, изменение концентрации этого вторичного мессенджера в клетке носит дискретный характер за счет различного его содержания во внутриклеточных компартментах [Zimmermann et al., 1997; Lecourieux et al., 2002; Sanders et al., 2002]. Кроме того, эндогенный цАМФ является регулятором активности кальциевых каналов [Volotovski et al., 1998; Rudd, Franklin-Tong, 1999]. Также есть данные, полученные на животных, где показано, что кальций дозозависимо повышал активность рАЦ, снижая Кт и повышая сродство фермента к субстрату [Steegborn et а!., 2005]. Окончательный ответ на то, как влияют различные концентрации кальция на активность рАЦ из клеток растений картофеля, можно будет получить только в результате специальных экспериментов. Пока же наблюдаемые различия в кинетических параметрах рАЦ растений обоих сортов картофеля позволяют сделать вывод о том, что в каталитических доменах исследуемого фермента у двух сортов картофеля, несмотря на одинаковую молекулярную массу самого фермента, имеются отличия, следствием чего может стать различная регуляция активности рАЦ ионами кальция. Влишшс биотического к абиотического стрессов на внутри- и внеклеточную концентрационную динамику цАМФ в клетках разных видов растешш. К настоящему времени хорошо изучен конечный этап реализации защитно-приспособительных механизмов, например, индукция под воздействием теплового шока специфических белков [Кузнецов и др., 1987; Кузнецов, 2001; Федосеева и др., 2008]. Хотя природа сигнала, инициирующего активацию соответствующих транскрипционных факторов, остается слабоизученной, есть данные, что в этом процессе существенная роль принадлежит цАМФ. У растений его концентрация значительно меняется под воздействием различных видов стрессоров [Яворская, 1990; Cooke et al., 1994]. Исходя из этого можно предположить, что интенсивность и специфичность действующего стрессового фактора также должна оказывать дифференцированный эффект на активность аденилатциклазной сигнальной системы, а долговременная реализация ответных реакций растительных клеток может быть связана с активизацией этой системы уже в первые минуты воздействия стрессоров. Поэтому необходимо было во-первых, определить концентрационную динамику цАМФ в клетках, а также в культуральной среде на начальных этапах действия теплового шока различной интенсивности (37°С и

50°С, суспензионная культура арабидопсиса). Во-вторых, изучить концентрационную динамику цАМФ в клетках при воздействии биотического стрессового фактора (ЭПС Сшх, суспензионная культура сортов картофеля, контрастных по устойчивости к Стя).

Под воздействием мягкого теплового шока (37° С) концентрация цАМФ в суспензионных клетках арабидопсиса резко возрастала после 1 мин инкубации и значительно понижалась через 15 мин воздействия. Аналогичное явление наблюдалось и в среде роста клеток (Рис. 7). При 50° С через 1 мин выявлялся также пик внутриклеточной концентрации цАМФ, причем он превышал аналогичный показатель при 37° С почти в два раза, а через 15 мин наблюдалось его повторное значительное повышение. Еще одной интересной особенностью можно считать изменение соотношения внутри- и внеклеточного цАМФ при 50° С, а именно превышение в 1,5 и в 2 раза уровня внеклеточного цАМФ над внутриклеточным через 3 и 5 мин, соответственно (Рис. 7). Таким образом, и мягкий и жесткий тепловые стрессоры вызывают пик концентрации цАМФ уже через 1 мин воздействия. По литературным данным, при 37°С это приводит к активации систем защиты от теплового шока, в частности к индукции синтеза БТЩ [Федосеева и др., 2008]. Плавное снижение концентрации цАМФ в последующие 15 мин скорее всего свидетельствует о завершении этапа тревоги и переходу растительного организма к адаптации [Шакирова, 2001].

и цАМФ, внутриклеточный В цАМФ, среда роста

26 "С 37 °С, 37°С, 37°С, 37"С, 50"С. 50"С. 50°С, 5СГС.

1 3 5 15 1 3 5 15

Рис. 7. Влияние мягкого (37°С) и жесткого (50°С) теплового шока на изменение концентрации цАМФ в суспензионной культуре арабидопсиса

Результаты позволяют предположить, что под воздействием жесткого стресса (50°С) в суспензионных клетках арабидопсиса активация аденилатциклазной сигнальной системы индуцирует, как минимум, три программы (или стадии) изменения клеточного метаболизма. Резкое повышение уровня цАМФ через 1 мин, а затем не менее резкое его падение, говорят о возникновении реакции тревоги. Очевидно, на этом этапе могут экспрессироваться гены, ответственные за синтез специфических БТШ. Однако через 5 мин воздействия уровень цАМФ в клетке, с одной стороны, резко, в 25 раз, снижался по сравнению с 1 мин, а с другой стороны, внеклеточная концентрация превышала внутриклеточную. Вследствие этого, вероятно, происходит качественное переключение метаболических путей, что по литературным данным приводит к развитию

рограммируемой клеточной смерти (апоптоз) в суспензионных клетках забидопсиса [Федосеева и др., 2008]. Подтверждением этому служит также акт развития апоптоза у дрожжей при резком снижении уровня цАМФ в клетке 3rcitenbach et al., 2005]. Повторное повышение внугриклсточной концентрации АМФ через 15 мин жесткого стресса указывает, скорее всего, на включение ретьей программы (стадии), итогом которой, вероятно, будет некротическая ибель клеток, но это предположение нуждается в экспериментальном одтверждении. В этом случае не имеет принципиального значения, как долго продержится экстремально высокий уровень цАМФ, поскольку для индукции переключения генетических программ в клетке достаточно, вероятно, очень короткого промежутка времени. Биотический стрессор (ЭПС Cms) оказывал неодинаковое воздействие на аденилатциклазную систему суспензионных клеток картофеля двух сортов, контрастных по устойчивости к Cms. В клетках устойчивого сорта самый высокий уровень цАМФ наблюдался уже через 1 мин воздействия, и к 45 мин постепенно снижался (Рис. 8, А). При этом динамика внеклеточной концентрации цАМФ имела противоположно направленный характер, постепенно возрастая к концу эксперимента. В то же время у восприимчивого сорта накопление цАМФ происходило очень медленно и отставало по уровню от такового у устойчивого сорта и только к 45 мин наблюдалось его весьма значительное внутриклеточное возрастание (Рис. 8, Б). Концентрация цАМФ в среде роста почти на всем протяжении эксперимента оставалась на уровне внутриклеточной, и только к 45 минутам значительно возрастала, хотя и не достигала его. Замедленная аккумуляция цАМФ в клетках восприимчивого сорта позволяет говорить о задержке транедукции сигнала, возможно в результате ингибирования активности соответствующих аденилатциклаз, что было показано выше. Вполне возможно, что' это происходит по причине конкурентного связывания некоторых компонентов ЭПС Cms рецепторами клеточных оболочек картофеля. Гетерогенность состава ЭПС позволяет предположить, что супрессорные компоненты ЭПС имеют большее сродство к рецепторам клеток картофеля, но с течением времени они замещаются элиситорными составляющими ЭПС, что и отражается на постепенном повышении уровня внутриклеточного цАМФ у клеток восприимчивого сорта.

Рис. 8. Влияние ЭПС Cms на концентрацию цАМФ в суспензионных клетках картофеля и среде роста, А - сорт Луговской (устойчивый); Б - сорт : Лукьяновский (восприимчивый) Несмотря на то, что механизм восприятия сигнала при абиотическом и биотическом стрессах различен, и у суспензии арабидопсиса и у клеток устойчивого сорта реакция аденилатциклазной сигнальной системы в первую минуту воздействия практически одинакова. Вполне возможно, что это является одним из проявлений общего принципа устойчивости, независимо от специфичности действующего стрессового фактора. Очевидно, что данный принцип един для всех молекулярных систем растительных организмов: например, комплекс шапероновых белков HSC70-SGT1, найденный у арабидопсиса и табака, необходим как для регуляции гормональных ответов, так и для проявления защитных реакций при тепловом стрессе и при инфицировании вирулентными патогенами [Noël et al., 2007]. Анализ полученных данных позволяет заключить, что успешная реализация защитных ответов растений возможна только в том случае, когда активация сигнальной системы, в частности, аденилатциклазной, под воздействием любых стрессовых факторов будет кратковременной, а также строго дозированной по интенсивности.

Различия в скорости и интенсивности, а также специфичность системного ответа адснилатциклазного сигнального пути сортов картофеля, контрастных по устойчивости к возбудителю кольцевой гнили, на биотический и абиотический стрессоры. Так как уже было показано, что ЭПС Cms способны специфически взаимодействовать с рецепторами плазмалеммы клеток растений картофеля и индуцируют запуск аденилатциклазного сигналинга, представляло интерес исследовать системную активацию такого сигнального пути у растений картофеля сортов, контрастных по устойчивости к Cms, под влиянием экзометаболитов данного возбудителя.

ЦАМФ, Va К контролю

■ С. ЛуКЬЯНОВСКИЙ ЕЭ с. Луговской

О SOQ -looo 1SOO 2000 2500

% к контролю

Рис. 9. Динамика концентрации цАМФ в различных частях растений и среде роста картофеля в присутствии ЭПС Cms в среде роста. A-l мин; Б-15 мин; В-45 мин; Г- среда роста С этой целью к среде роста пробирочных растений картофеля добавляли экзополисахариды возбудителя кольцевой гнили (0,1%) и измеряли концентрацию цАМФ в различных частях растений через 1,15, 120 и 480 мин. В работе использовали два сорта: Луговской (резистентный), Лукьяновский. (восприимчивый). Исследования показали, что уже через 1 мин воздействия ЭПС в растениях резистентного сорта наиболее высокая концентрация цАМФ

наблюдалась в средней и верхней частях стебля, превышая контроль в 100 и 138 раз, соответственно (Рис. 9, А). У растений восприимчивого сорта ни в одной из частей уровень цАМФ за этот промежуток времени не достигал контроля. Через 15 мин у растений устойчивого сорта концентрация цАМФ ниже контроля была только в верхней части стебля (8-12 см от корня), в то время как у восприимчивого сорта его уровень наиболее значительно повышался только в корне (Рис. 9, Б). Через 120 мин во всех частях растения картофеля устойчивого сорта количество данного вторичного мессенджера было ниже контроля. Напротив, у растений восприимчивого сорта в большинстве отрезков уровень цАМФ значительно превышал контроль, за исключением верхушечной части, где цАМФ вообще не детектировался при пороге определения данным методом 10 пМ (Рис. 9, В). Через 480 мин во всех частях растений обоих сортов цАМФ также не выявлялся.

Активный синтез и перераспределение концентраций цАМФ по растению сопровождались значительным выходом данной сигнальной молекулы в среду роста растений. Наиболее высокий уровень цАМФ в среде роста растений устойчивого сорта - 197 % от контроля, наблюдался через 120 мин инкубации с ЭПС (Рис. 9, Г). У растений восприимчивого сорта в среду роста выводилось значительно большее количество цАМФ и максимальная концентрация его приходилась на 1 и 120 мин (Рис.9, Г).

В литературе имеются сведения о том, что динамика уровня цАМФ в растениях в норме имеет волнообразный характер [Каримова и др., 1993] и это подтверждается данными экспериментов, приведенных на Рис. 9. Представленные результаты свидетельствуют о том, что ЭПС Cms вызывают системное изменение активности аденилатциклазной сигнальной системы клеток растений картофеля. Первоначальной причиной этого, скорее всего, следует считать взаимодействие данных экзометаболитов с рецепторами плазмалеммы клеггок картофеля, что приводит к сопряжению таких рецепторов с мембраносвязанной аденилатциклазой и регулирующими ее активность G-белками. В силу предполагаемых свойств рассматриваемых рецепторов, а также сложного состава ЭПС, можно предположить, что степень активации или ингибирования данной сигнальной системы зависит от устойчивости сорта к Cms.

Однако возникает вопрос - каким образом за достаточно короткий промежуток времени происходит передача сигнала на значительное расстояние, и какова его природа, поскольку цАМФ способен мигрировать от места синтеза в клетке на расстояние меньшее, чем 1 мкм [Rich et al., 2000; Zippin et al., 2003] и на роль такого сигнала претендовать не может. Этому также препятствует высокая активность фосфодиэстеразы цАМФ и энергозависимость транспорта цАМФ за пределы клетки [Орлов, Максимов, 1999; Тарчевский, 2002]. Салициловая кислота не является мобильным сигналом, а представляет собой лишь мишень для5 его восприятия [Чиркова, 2002]. Ее антагонист, жасмоновая кислота, продуцируется растением не ранее, чем через 20 мин после воздействия элиситора [Gundlach et al, 1992]. Более вероятным претендентом на роль раннего

подвижного сигнала может быть изменение мембранного потенциала, вызванное вариацией внеклеточного pH и модуляцией активности цАМФ-зависимых ионных каналов. ЭПС Cms, через рецепторы влияя на активность мАЦ, способствуют локальному повышению в клетке уровня цАМФ, что, по-видимому, приводит к открытию цАМФ-зависимых ионных каналов, в первую очередь кальциевых [Volotovski et al., 1998; Trewavas et al., 2002]. Быстрый вход в клетку Са2+ может вызвать деполяризацию мембраны и инициировать возникновение потенциала действия (ПД) [Медведев, 1998; Гималов и др., 2004; Пятыгин, 2008], который с весьма высокой скоростью, 20-30 см/мин, распространяется по стеблю растения вверх [Тарчевский, 2001а; Felle, Zimmermann, 2007]. По литературным данным, ПД в свою очередь может активировать мАЦ [Pall, 1977; Reddy et al, 1995]. Зафиксированное в представленных экспериментах повышение уровня цАМФ в верхушке стебля растения картофеля устойчивого сорта уже через 1 мин вполне может быть объяснено именно этим. В то же время торможение сигнала в клетках растений восприимчивого сорта через 1 мин воздействия, скорее всего, связано с ингибированием ЭПС активности мАЦ. Основания для такого вывода подробно были изложены при обсуждении кинетических параметров АЦ. Одной из причин дальнейших флуктуаций в концентрации цАМФ в различных частях растений картофеля является, в частности, способность ЭПС Cms значительно закислять среду роста и, как следствие, апопласт клеток. Это должно приводить к индукции повторяющегося ПД, что может оказывать модулирующее влияние на активность мАЦ [Пятыгин, 2008]. Поскольку клетки устойчивого сорта более эффективно, чем восприимчивого, восстанавливают внеклеточный рН-гомеостаз [Романенко и др., 1998], ПД, формируемый ими, должен отличаться от такового в клетках восприимчивого сорта. Отражением этого является заметное затухание колебаний цАМФ уже через 120 мин в клетках устойчивого сорта. У восприимчивого сорта восстановление внеклеточного рН-гомеостаза более растянуто во времени при воздействии ЭПС [Романенко и др., 1998], что указывает на неоперативную работу ионных потенциалобразующих каналов и, как следствие, на замедленную системную активацию аденилатциклазного сигнального пути в клетках растений этого сорта. Полное угасание детектируемого сигнала у растений обоих сортов через 480 мин, вероятно, свидетельствует об адаптивной перестройке метаболизма клеток под воздействием биотического стрессора у растений обоих сортов.

В тесной связи с изложенным находится и вопрос специфичности защитных реакций растений. Молекулярные механизмы, определяющие этот феномен, еще до конца не выяснены. Есть данные, что на ранних этапах любых стрессовых воздействий экспрессируются прежде всего механизмы неспецифической защиты [Kreps et al., 2002; Swindell, 2006], хотя из других источников следует, что на их фоне формируются специфические защитные реакции [Seki, 2002; Xiong et al., 2002]. В основном процесс эволюции картофеля как культурного растения направлен на развитие специфической устойчивости к патогенам, являющимися биотическими стрессорами. В то же время низкая положительная

температура выступает для картофеля в роли неспецифического стрессового фактора, так как данная культура не холодостойка. Поэтому представляло интерес выяснить, какова системная реакция аденилатциклазного сигнального пути растений тех же сортов картофеля на кратковременные (1 мин) стрессы: неспецифический абиотический (4° С) и специфический биотический (ЭПС Cms). Кроме того, в рамках этой задачи необходимо было выяснить роль мембраносвязаннной аденилатциклазы в инициации системного сигнала. Для решения этого вопроса было проведено несколько вариантов экспериментов.

1. Инкубация in vitro растений картофеля двух сортов, контрастных по устойчивости к Cms, в среде роста, содержащей 0,1 % ЭПС Cms.

2. Выдерживание растений картофеля тех же сортов в среде роста, охлажденной до 4° С.

3. Предварительная инкубация растений картофеля в течение 1 ч при комнатной температуре в среде роста, содержащей 10 мкМ сурамина - ингибитора мАЦ, разобщающего связь рецептора с G белком.

4. Предварительная инкубация растений в среде с сурамином с последующей обработкой 0,1 % ЭПС Cms в течение 1 мин.

5. Повторение операции п.З, с последующим переносом растений в среду роста, охлажденную до 4° С.

По окончании экспозиции растения фиксировали жидким азотом и измеряли уровень цАМФ в верхней части стебля с листьями. Прежде всего следует отметить, что уже через 40 мин инкубации в растворе сурамина у растений наблюдалось завядание, начинающееся с верхних листьев. Этот процесс носил обратимый характер и исчезал довольно быстро после перенесения растений в стандартную среду роста. ЭПС Cms, как и в предыдущих экспериментах, вызывали отчетливую и противоположно направленную реакцию аденилатциклазной сигнальной системы (АСС) у растений обоих сортов. Как следует из таблицы 3, АСС в клетках устойчивого сорта активизировалась в 16 раз по сравнению с контролем, в то время как у восприимчивого сорта наблюдалось ингибирование этой сигнальной системы, и ее активность снизилась в 27 раз (Табл. 3).

Таблица 3. Концентрация цАМФ (нМ/ г сыр массы) в верхней части стебля и листьях растений картофеля после воздействия кратковременных стрессов и сурамина____

Варианты опыта сорт Луговской (резистентный) сорт Лукьяновский (восприимчивый) Значимость вероятности различий (Р) между сортами

Контроль 17,4±1,13 12,8±0,92 0,006

0,1% ЭПС 285,1±7,23 0,47±0,02 <0,001

4° С 29,6±1,85 23,8±1,92 0,054

10 мкМ сурамин 2,8±0,83 1,3±0,09 0,093

10 мкМ сурамин, 0,1% ЭПС 3,2±0,22 0,15±0,01 <0,001

10 мкМ сурамин, 4" С 3,3±0,17 2,3±0,12 <0,001

Напротив, кратковременный низкотемпературный стресс вызывал примерно одинаковый ответ АСС в растениях обоих сортов, а именно, возрастание уровня цАМФ в 1,7 и в 1,9 раза по сравнению с контролем у резистентного и восприимчивого сортов, соответственно (Табл. 3). Видно, что, несмотря на предварительную инкубацию с сурамином, вызывающим значительное ингибирование мАЦ, последующее добавление ЭПС в ту же среду с сурамином приводило к более интенсивному ответу АСС у растений устойчивого сорта, чем у восприимчивого. В то же время, сурамин плюс 4°С вызывали примерно одинаковое снижение активности АСС у обоих сортов: в 5.3 и 5.6 раза, соответственно (Табл. 3).Предполагаемый механизм передачи системного сигнала от АСС при биотическом стрессе уже обсуждался выше. Увядание растений в среде с сурамином подтверждает эту информацию: блокировка работы мАЦ снижает уровень цАМФ в клетке, что, вероятно, приводит к нарушению функционирования ионных каналов, и как следствие, к истечению из клетки осмотически активных ионов, таких как К+. Поскольку сурамин подавлял активность мАЦ не полностью, это все же позволило реализоваться системному сигналу. При абиотическом стрессе у обоих сортов растений картофеля, как теплолюбивой культуры, преобладает неспецифическая составляющая стрессорного ответа, реализующаяся прежде всего через изменение текучести лшгадного матрикса плазмомембраны [Кузнецов, 2001; КаБрегека, 2004; Пятыгин, 2003, 2008]. Это влечет за собой конформационные изменения в мембраносвязанных белках [Пятыгин, 2003], что, в частности, приводит к активации мАЦ в клетках корня растений картофеля. Параллельно на плазмалемме возникает потенциал действия, обусловленный изменением активности Н+-насоса и ионных каналов, причем к последним относятся как цАМФ-зависимые, так и другие каналы, неспецифически реагирующие на изменение температуры окружающей среды [Гималов и др., 2004; Пятыгин, 2003, 2007]. Можно предположить, что в последующем механизм системной активации АСС будет аналогичен таковому при биотическом стрессе. Вероятно, в силу неспсцифичсского характера низкой температуры как стрессового фактора, величина мембранного потенциала действия, возникающего при этом, должна быть практически идентичной у обоих сортов, что обеспечивает примерно одинаковую активацию мАЦ и, следовательно, АСС в клетках этих сортов.

Выявление у растений нзоформы мАЦ, иммунородственной 6-ой изоформе мАЦ животных. Влняние длительных биотического и абиотического стрессоров на активизацию синтеза этой нзоформы мАЦ у растений. В

литературе отсутствуют сведения, касающиеся изофермеитного состава мАЦ растений, хотя имеется информация, что одни и те же агенты (Мп2+, Mg2+, Са"^) могут оказывать различный, а зачастую и противоположный эффект на активность растительной мАЦ [СагпсагТе е1 а1., 1988; ЬцбЫ е1 а1.,1990]. Этот факт косвенно указывает на возможность присутствия у растений нескольких изоформ мАЦ. Поскольку под воздействием различных внешних агентов, например, элиситоров или изменения температуры у растений наблюдается

быстрое и кратковременное возрастание внутриклеточной концентрации кальция [Бияшева и др., 1993; Volotovski et al., 1998; Гималов и др., 2004], представлялось необходимым исследовать также возможность активизации синтеза этой изоформы мАЦ у растений, подвергнутых длительным стрессорам биотической и абиотической природы. Для этого использовали два сорта картофеля, контрастные по устойчивости к Cms, а также сорта озимой и яровой пшеницы. Для создания длительной биотической стрессовой нагрузки растения картофеля инкубировали 72 часа с 0,1% ЭПС Cms. Проростки яровой и озимой пшеницы подвергали длительному воздействию абиотического стрессора, а именно выдерживали 72 часа при 4°С. Выявление изоформы мАЦ, иммунородственной 6-ой изоформе мАЦ животных, проводили с помощью первичных антител к 6 изоформе мАЦ животных в осадке, полученном после ультрацентрифугирования гомогената растительной ткани. В образце, содержащем только антитела, обнаружены две белковых полосы, не совпадающие по мол. массе с экспериментальными образцами (Рис. 10).

Проведенные эксперименты позволили выявить у растений картофеля и пшеницы изоформу мАЦ, иммунородственную 6-ой изоформе мАЦ животных, которая имела мол. массу 182 кДа. Стоит сказать, что предсказанный молекулярный вес соответствующей изоформы животных составляет только 130 кДа ("Abeam", Великобритания). Возможно, это связано с чистотой исследуемой фракции: так как изучаемая форма фермента является мембранным белком, то для ее очистки необходима солюбилизация с применением дополнительных сильных детергентов. В используемых нами условиях выделения (0,01% октиглюкопиранозид в качестве детергента) скорее всего, выделяется комплекс рецептор-G белок-мАЦ. Поэтому сделать окончательное заключение о молекулярной массе по имеющимся данным пока не представляется возможным. Длительное воздействие стрессов, специфичных для каждого вида растения, не привело к интенсификации синтеза данной изоформы (Рис. 10).

Полученные результаты позволяют расширить имеющиеся представления об организации аденилатциклазной сигнальной системы растений. Так как из внешней среды к растениям поступает масса разнообразных сигналов, каждая сигнальная система должна иметь тонкие механизмы адекватной по силе и качеству передачи информации на геном. Система вторичных мессенджеров, в том числе цАМФ и Са+2, путем варьирования внутриклеточной амплитуды колебаний концентраций, позволяет успешно производить такую настройку [Медведев, Маркова, 2001; Willoughby et al, 2006; Parekh, 2008]. Для достижения оптимальной концентрации сигнальных молекул могут использоваться различные механизмы, одним из которых и являются ряд изоформ АЦ, отличающихся по чувствительности к ионам кальция. У растений в плазмалемме имеются кальциевые ионные каналы, специфически регулируемые цАМФ [Talke et al., 2003; Lemtiri-ChHeh, Berkowitz, 2004]. Кроме того, есть данные, что под воздействием некоторых неблагоприятных факторов внешней среды, например, экзометаболитов грибных патогенов, в клетках растений

наряду с цАМФ быстро повышается концентрация кальция [КигоБакл €1 а1., 1987]. Поэтому функционирование у растений изоформы мАЦ, ингибируемой физиологическими концентрациями кальция, представляется вполне логичным. Можно предположить, что экстремальные условия обитания растений (длительная засуха, засоление, деаэрация), могут привести к изменению изоферментного спектра мАЦ.

М кЦа 123-45G73

— 240

1Я2 — " - 140

Рис. 10. Иммуноблотинг белков мембранной фракции клеток растений после иммунопреципитации с поликлональными антителами к 6-ой изоформе мАЦ ЖИВОТНЫХ. 1 - пшеница озимая, 23°С, 2 — пшеница озимая, 4°С, 72 часа, 3 - пшеница яровая, 23DC; 4 - пшеница яровая, 4°С, 72 часа; 5 - картофель, с. Луговской (устойчивый); 6 - картофель, с. Луговской, -ЮПС, 72 часа; 7 — картофель, с. Лукьяновский (восприимчивый); 8 - картофель, с. Лукьяновский, +ЭПС, 72 часа; AT - антитела к 6-ой изоформе мАЦ животных. Выявление рАЦ у разных видов растений и влияние длительного биотического и абиотического стрессоров на изменение изоферментного состава рАЦ. Имеющиеся в литературе сведения о наличии рАЦ в растениях весьма противоречивы и не отличаются полнотой [Moutinho et al., 2001; Roelofs, Van Haastert, 2002]. Поскольку предполагается, что степень активности рАЦ растений связана с их устойчивостью, представляло интерес выявить не только имеющиеся в норме изоформы рАЦ, но и исследовать влияние на них длительных стрессоров различной природы.

Эксперименты показали, что в образцах растений картофеля и пшеницы как в контрольных вариантах, так и в опытных, выявилась только одна полоса преципитации с мол. массой 190 кДа (Рис. 11).

М кДа AT 1 2 3 4 5 6 7 8

— 240

190 — : ■ -■■■■ - РАЦ

— 140

Рис. II. Иммуноблотинг белков из надосадочной фракции клеток растений после иммунопреципитации с моноклональными антителами к «растворимой» аденилатциклазе растений. АТ- антитела к рАЦ животных;

I - картофель, с. Лукьяновский (восприимчивый); 2 - картофель, с. Лукьяновский, +ЭПС, 72 часа; 3 -картофель, с. Луговской (устойчивый); 4 — картофель, с. Луговской, +ЭПС, 72 часа; 5 - пшеница озимая, 23°С; 6 - пшеница озимая, 4°С, 72 часа; 7 - пшеница яровая, 23°С; 8 - пшеница яровая, 4"С, 72 часа;

По литературным данным, у животных полноразмерная рАЦ имеет молекулярную массу 187 кДа, что почти совпадает с молекулярной массой

выявленной нами рЛЦ у растений. В литературе имеются сведения, что рАЦ обладает высокой гомологией у разных видов организмов, например, малярийного плазмодия, дрозофилы, высших животных, а также человека [Барковский, Ачинович, 2003]. По растениям есть две работы, в которых найдено сходство в нуклеотидной последовательности фрагмента рАЦ из пыльцы лилий с рАЦ грибов, а также рАЦ из клеток листьев табака с рАЦ дрожжей [Ichikavva et al., 1997; Moutinho et al., 2001]. Конечно, эти сведения не позволяют проводить полную аналогию структуры рАЦ животных и растений, но дают основание предполагать, что у этой формы фермента из клеток животных и растений имеются одинаковые консервативные последовательности, позволяющие узнавать моноклональными антителами животных соответствующие эпитопы белка растений. Довольно неожиданными представляются результаты об отсутствии влияния длительных специфических стрессоров на появление других изоформ рАЦ в клетках проростков пшеницы и растениях картофеля. Вероятно, у растений регуляция активности рАЦ под воздействием длительных неблагоприятных факторов осуществляется посредством других механизмов.

Функционирование мАЦ и рАЦ в ядрах и хлоропластах клеток растений картофеля. Влияние ЭПС возбудителя кольцевой гнили на активность этих форм фермента. У растений к настоящему времени установлены еще не все элементы аденилатциклазного сигнального пути, имеющиеся у животных (не найдены, в частности ЕРАС и ACAPs-белки), однако активность аденилатциклазы выявлена методами электронной цитохимии в мембранах ядер и хлоропластов [Witters et al., 2005], хотя при этом осталось неясным, к какому типу АЦ она относилась. Кроме того, в ряде работ [Carricarte et al., 1988; Lusini et al., 1991; Ichikawa et al., 1997; Moutinho et al., 2001] биохимическими методами были выявлены тотальная мембраносвязанная и «растворимая» формы аденилатциклазы.

Совокупность таких литературных данных явилась предпосылкой для постановки цели исследования, а именно выявления различных форм АЦ («растворимой» и мембраносвязанной) в растительной клетке, в первую очередь, в органеллах - носителях генетической информации - в ядре и хлоропластах. Кроме того, учитывая важную роль АЦ в обеспечении каскадных сигнальных реакций, была поставлена еще одна цель - выявить реакцию различных форм этого фермента из клеток растений двух сортов картофеля, контрастных по устойчивости к возбудителю кольцевой гнили (Cms), на опосредованное воздействие экзополисахаридами данного возбудителя. В работе использовались in vitro растения двух сортов картофеля, контрастных по устойчивости к Cms. ЭПС Cms добавляли в среду роста растений, экспозиция составляла 1 мин. Чистота выделенных фракций ядер и хлоропластов составляла 80-85 %. Для выявления во фракциях органелл двух форм АЦ -мембраносвязанной и «растворимой» использовали специфические эффекторы соответствующих форм этого фермента: NaF для стимуляции мАЦ, а МпС12 и NaHCCh-для активации рАЦ. Измерения активности проводили при рН 7,4.

Мембраносвязанная и «растворимая» АЦ ядер клеток растений стоЛчивого сорта. Было установлено, что в контрольном варианте (без добавления ЭПС Cms в среду роста растений) активность мАЦ, выявляемая в присутствии NaF, была в 3 раза ниже, чем растворимой, определяемой с помощью МпС12 и NaHC03 . Уровни активности рАЦ под воздействием этих агентов были почти одинаковыми. После кратковременной инкубации (1 мин) корней растений картофеля с ЭПС (опыт), наблюдалось увеличение активности обеих форм АЦ со специфическими эффекторами в 4,5-7 раз, соответственно, причем наибольшая величина активации была получена в варианте с NaHCO^ (Рис.12).

Мембраносвязанная и «растворимая» АЦ хлоропластов клеток растений устойчивого сорта. В контроле (без ЭПС) уровень активности рАЦ превышал таковую мАЦ примерно в 1,3-2 раза в присутствии МпС12 и NaHC03, соответственно (Рис. 12). ЭПС Cms в различной степени стимулировали как мАЦ, так и рАЦ хлоропластов. В максимальной степени - в 17 раз -активировалась мембранная АЦ (эффектор NaF); уровень рАЦ в варианте с МпС12 был выше относительно контроля в 9 раз, а при добавлении КаНСО, - в 3,5 раза (Рис.12).

с. Луговской

■ 0,5мМ АТФ (мАЦ) а 0,5 мМ АТФ (рАЦ) О NaF a Mncu2) В NaHCO(3)

ядра-контроль

ядра-опыт

хлоропласт хлоропласт ы-контроль ы-опыт

Рис. 12. Влияние 0,1% ЭПС Cms на активность различных форм АЦ из органелл клеток растений картофеля, пМоль цАМФ/мг белка в мин, сорт Луговской (устойчивый).

Мембраносвязаншш и «растворимая» АЦ ядер клеток растений восприимчивого сорта. Как следует из полученых данных (Рис. 13), активности обеих форм АЦ между собой существенно не различались, но были значительно ниже, чем у устойчивого сорта - в 10 и 23 раза, соответственно. ЭПС ингибировали активности обеих форм данного фермента, причем м АЦ в 2 раза, рАЦ - в 1,2 раза в присутствии МпС12 и в 1,6 раза при добавлении NaHC03 (Рис. 13).

Мембраносвязаншш и «растворимая» АЦ хлоропластов клеток растений восприимчивого сорта. Активность мАЦ в контроле (без ЭПС) была значительно - в 5 раз ниже, чем у растений устойчивого сорта, в то время как уровень активности растворимой формы АЦ соответствовал аналогичному показателю у устойчивого сорта (Рис. 13). ЭПС, как и во фракции ядер, значительно ингибировали активность обеих форм фермента - мАЦ в 3,5 раза,

рАЦ в присутствии двух типов эффекторов - в 13-14 раз, соответственно (Рис.13).

120 -

с. Лукьяновский

■ 0,5мМАТО (мАЦ) Н 0.5 мМАТФ (РАЦ) Ш NaF О IVHCL(2) □ NaHCO(3)_

-JTrfTFl

—ЯттГГрд

Рис. 13. Влияние 0,1% ЭПС Cms на активность различных форм АЦ из клеток растений картофеля, пМоль цАМФ/мг белка в мин, сорт Лукьяновский (восприимчивый).

Представленные результаты позволяют выдвинуть гипотезу о механизмах внутриклеточной сигнализации растений. Ранее полагали, что синтезирующийся на плазмалемме цАМФ диффундирует далее в цитоплазме, запуская последующие каскадные реакции с участием различных протеинкиназ и факторов транскрипции, «переносящих» сигналы в ядро [Тарчевский, 2001]. Однако, опираясь на полученные результаты, где активность различных форм АЦ наблюдалась в ядре и хлоропластах уже через 1 мин после опосредованного воздействия неблагоприятного фактора, и, принимая во внимание литературные данные об ограниченной диффузии цАМФ от места синтеза [Zippin et al., 2003], сложно представить, что весь набор предполагаемых реакций может протекать за столь короткое время. Поэтому представляется более вероятным, что транедукция сигнала с помощью аденилатциклазной системы у растений может осуществляться также через микродомены, локализованные как вблизи плазмалеммы, так и во внутриклеточных органеллах. В любом случае, прежде всего сигнал от внешнего раздражителя воспринимает мАЦ плазмалеммы. Степень ее активности зависит от нескольких составляющих: от величины и характера действующего внешнего раздражителя, а также количества и качества рецепторов и соответствующих G белков [Sunahara, Taussig, 2002]. Возникает вопрос, каким образом сигнал довольно оперативно передается на внутриклеточные органеллы. Мы уже показали, что активирующим агентом для pAI I являются ионы бикарбоната. По литературным данным у животных, бикарбонат в сочетании с кальцием, оказывает мощный синергический эффект на активность растворимой АЦ, локализованной в ядрах и митохондриях [Litvin el al., 2003]. У растений показано, что благодаря соответствующим карбоангндразам, бикарбонат-ионы распространены не только в фотосинтсзирующих органах [Пронина, Семененко, 1988; Иванов и др., 2007],

) и в корнях [Wegner, Zimmermann, 2004]. Кроме того, бикарбонат-ионы жсутствуют не только в хлороплаетах, где участвуют в процессе этосиптеза, но также в митохондриях и цитоплазме. Предполагается, что они .шолняют функции стабилизации pH, особенно при воздействии стрессовых акторов [Иванов и др., 2007]. Вероятно, что и ионы кальция, как вездесущего активного вторичного мессенджера, тоже должны оказывать модулирующее ¡действие на мАЦ и рАЦ, локализованные во внутриклеточных >мпартментах растений. Такое предположение связано, с одной стороны, с шичием в клетках растений феномена «кальциевой волны», выполняющего 1гнальные функции [Медведев, 1998], и с другой, основывается на данных, ie показана тесная взаимосвязь изменения уровней цАМФ и ионов кальция эд воздействием внешних неблагоприятных факторов [Rizzuto, Pozzan, 2006]. роме того, в этом процессе, участвуют ассоциированные с аденилатциклазой злки (cyclase-associated proteins - CAPs), выполняющие роль ¡модулирующего актин агента при трансдукции внутриклеточных сигналов Iubbcrstey, Mottillo, 2002]. Мутации кДНК, кодирующих эти белки в оабидопсисе, приводили к нарушению морфологии клеток и размера листьев результате появления дефектов в элементах цитоскелета [Barrero et al., 2002]. табилизация актинового цитоскелета у дрожжей вызывала неконтролируемое овышение уровня цАМФ, приводя к развитию апоптотической гибели клеток jourlay, Ayscough, 2006]. Влияние ЭПС Cms на все формы АЦ ядер и лоропластов из клеток растений картофеля, вероятно, осуществляется через ецепторы клеточных стенок и плазмалеммы, у устойчивого сорта, возможно, к элиситорным компонентам ЭПС и, далее, через G белки. Сигнал через ряд посредников поступает к рАЦ, локализованной, в ядрах и хлороплаетах клеток картофеля. У восприимчивого к Cms сорта, напротив, происходит частичное ингибирование данных форм фермента, с участием, скорее всего, супрессорных компонентов ЭПС и соответствующих рецепторов и G-белков. Как следует из представленных экспериментальных данных, активация «растворимой» формы аденилатциклазы связана с сортовой устойчивостью растений картофеля. Вероятно, следует ожидать, что различные формы АЦ имеются также и в других внутриклеточных компартментах растений.

Все изложенное позволяет сделать заключение, что в отличие от данных зарубежных авторов, где во внутриклеточных компартментах обнаружена только рАЦ [Zippin et al., 2003], наши исследования позволили выявить в ядре и хлороплаетах клеток растений картофеля мАЦ и рАЦ. Это расширяет имеющиеся представления о составе и механизмах действия сигнальных микродоменов органелл, призванных осуществлять топкую последовательную регуляцию внутриклеточных процессов.

Влияние биотического стресса на перераспределение цАМФ в компартментах клеток картофеля. Локализация рАЦ в органеллах этих клеток. Для описания механизма трансдукции внутриклеточных сигналов существует две взаимоисключающих гипотезы, касающихся диффузии цАМФ: по одной из них цАМФ от плазмалеммы (места синтеза) двигается до ядра

[Assman, 2005], по другой цАМФ не может диффундировать от места синтеза более, чем на 1 мкм, поскольку она быстро переводится фосфодиэстеразой цАМФ в расциклизованную неактивную форму. При этом в органеллах фунционируют собственные источники цАМФ, например рАЦ в клетках животных [Zippin et al., 2003]. Поэтому, представлялось необходимым изучить локализацию цАМФ во внутриклеточных компартментах, а также исследовать влияние биотического стрессора на изменение в них количества молекул данного вторичного мессенджера. Работа была проведена на корнях растениий картофеля сортов, контрастных по устойчивости к Cms, методом электронной иммуноцитохимии. Неспецифическая реакция (обработка срезов только ВАТ или неиммунной сывороткой, затем ВАТ) отсутствовала во всех вариантах опыта. В контрольных вариантах (без обработки растений ЭПС) метки к цАМФ наблюдались во многих компартментах клеток. Однако, их распределение по органеллам клеток существенно отличалось у растений обоих сортов (Рис. 14, А,Б).

органеллы клеток картофеля

■ контроль (-ЭПС) нопыт(+ЭПС)

оргявсллы клеток картофеля

Рис. 14. Влияние ЭПС Спи (0,1%, 15 мин) на изменение количества меток к цАМФ во внутриклеточных компартментах клеток корня растений картофеля, (шт/10 мкм"), А - резистентный сорт; Б - восприимчивый сорт. Вак -вакуоль; КС - клеточная стенка; МХ - митохондрия; Пл - плазмалемма; Топ -тонопласт; Цит - цитозоль; ЭР - эндоплазматический ретикулум; Я - ядро; ЯМ -ядерная мембрана.

В клетках контрольных растений устойчивого сорта наибольшее количество ;ток к цАМФ наблюдалось на плазмалемме, затем в эндоплазматическом ггикулуме и митохондриях (Рис. 14А, 15). В аналогичном варианте у юприимчивого сорта максимум меток к цАМФ был обнаружен в [доплазматическом ретикулуме и митохондриях, а затем уже на плазмалемме ис. 14Б, 16). Инкубация растений в среде с ЭПС Стя (15 мин) приводила к ;рераспределению меток к цАМФ в органеллах клеток корня растений обоих фтов (Рис. 14А,Б; 17, 18).У устойчивого сорта на первое место вышли щоплазматический ретикулум и митохондрии, затем ядро, ядерная мембрана цитозоль. У восприимчивого сорта наиболее значительно этот показатель )зрастал в эндоплазматическом ретикулуме, затем в гораздо меньшей степени митохондриях, вакуолях и цитозоле. На первый взгляд максимум данной 1гнальной молекулы у растений обоих сортов наблюдался практически в :щих и тех же органеллах, но по количеству меток в процентах к контролю )рта весьма значительно различались (Табл.4).

В клетках устойчивого сорта количество меток к цАМФ в ядре превышало элее чем в 20 раз показатель в контроле; у восприимчивого сорта - только в 1,5 аза. У восприимчивого сорта наблюдалось существенно меньше меток к АМФ во всех компартментах, за исключением цитозоля (превышение в 12 раз ротив контроля).

аблица.4. Количество гранул золота, соответствующих локализации цАМФ в азличных компартментах клеток растений картофеля, у сортов, контрастных о устойчивости к Сиг,?, % к контролю

Сорт Компартме1ГГ

КС Пл Цит ЭР МХ Вак Тон Я ЯМ

Луговской (устойчивый) 200 50 500 560 790 660 540 2220 500

Лукьянопский (восприим'шный) 60 100 1160 240 50 290 220 150 250

Обозначения: КС - клеточная стенка; ГГл - плазмалемма; Цит - цитозоль;

ЭР - эндоплачматичсский ретикулум; МХ - митохондрия; Вак - вакуоль; Тон

тоиопласт; Я - ядро; ЯМ - ядерная мембрана.

'' V ' ■ ЭР

' и МХг * -1 р

.1:>:;/. '. *-" : -' ' ' ' : ' х".' ......"

. ' -* 2 мкм

Рис.15. Локализация цАМФ в митохондриях (МХ) (звездочки), на мембране эндоплазматического ретикулума (ЭР) (светлая стрелка), на плазмалемме (длинные стрелки), в клеточной стенке (короткие стрелки). Клетки меристемы корня растений картофеля, сорт Луговской

(резистентный) контроль.

■"■• г'А?".'"-' ■ ' ; К

г. - . ■ 1 'С —

1 ■ , - ' , V" - г . { "

, и

* " ж-/'"

I ^ . » I

* ¿ШМ

'й-

<г -

:т . ■ - м-4

."Зли»» „ ' **

Рис. 16. Локализация цАМФ в ядре (Я), ядерной мембране, цитозол? (длинные стрелки) и в клеточной стенке (короткие стрелки)- Клетки меристемы корня растений картофеля,сорт Лукьяновский (восприимчивый) контроль

е .

2 ты

Рис.17. Локализация цАМФ в вакуоли (В) (двухсторонние стрелки), на тонопласте (жирные стрелки). Клетки меристемы корня растений картофеля, сорт Луговской (устойчивый), опыт (+ЭПС)

мх

• МХ ■

4? *.„

эр

Рис.18. Локализация цАМФ в митохондриях (МХ, короткие стрелки), на мембране эндоплазматического ретикулума (ЭР, звездочки), в цитозоле (длинные стрелки), в ядре (Я, вклейка внизу, звездочки). Клетки меристемы корня растений картофеля. Сорт Лукьяновский, (восприимчивый), опыт (+ЭПС)

Таким образом, под воздействием биотического стрессора (ЭПС Cms) у растений устойчивого сорта наблюдается более высокая интенсивное:; распространения внутриклеточного сигнала через аденилатциклазны.. сигнальный путь, по сравнению с восприимчивым сортом.

Поскольку одним из источников цАМФ в клетке является рАГ, обнаруженная нами биохимическими методами в хлоропластах и ядрах клетс растений тех же сортов картофеля, необходимо было выявить локализации этой формы АЦ во всех внутриклеточных компартментах, тем более, чт~ имеющиеся литературные данные не отвечают на этот вопрос [Tu, 1979; Bhalt , Chopra, 1984; Willoughby, Cooper, 2006]. Иммунно-цитологическг._ исследования показали, что рАЦ присутствовала во многих компартмента:: клеток корня и листа растений картофеля обоих сортов. Оказалос_. неожиданным, что данная форма фермента была обнаружена в клеточной стенке и межклетнике (Рис. 19). Это позволяет высказать предположение, чг:! такая локализация рАЦ, также как ряда других ферментов, участвующих . первичных защитных ответах растений, призвана трансдуцировать самьг ранние «сигналы тревоги» растительного организма, а также осуществлял межклеточную передачу сигналов. Кроме того, частицы золота, отражающие локализацию рАЦ, были обнаружены в митохондриях, хлоропластах, вакуолям, цитозоле, а также при эндоплазматическом ретикулуме. В митохондриях метки к рАЦ выявлялись преимущественно в матриксе, тогда как в хлоропласта наблюдались как в строме, так и около гран (Рис. 20). Для сравнения, в клетка.. животных локализация рАЦ была ранее выявлена в ядре, митохондриях и н: элементах цитоскелета [Zippin et al., 2003].

Рис. 19. Локализация рАЦ в межклетнике, клеточных стенках и вакуолях (стрелки). Клетки корня растений картофеля. Сорт Луговской, устойчивый

Рис. 20. Локализация рА1Д в хлоропластах (X) и вакуоли. Клетка листовой паренхимы растения картофеля. Сорт Лукьяновский, восприимчивый

Заключение

Аденилатциклазная сигнальная система растений на сегодняшний день остается малоизученной, и пока нет полной схемы рецепции и трансдукции внутри- и межклеточных сигналов с ее участием. В работе показано, что как специфические, так и неспецифические стрессоры приводят к модуляции активности данной сигнальной системы у растений.

Весь комплекс проведенных исследований позволяет предложить схему, описывающую участие аденилатциклаз растений в передаче внутри- и межклеточных сигналов при специфических и неспецифических стрессах (Рис. 21). Независимо от вида стресса, восприятие сигнала начинается с контакта неблагоприятного фактора с клеточной стенкой, а затем и плазматической

' мембраной клетки. При биотическом стрессе (ЭПС Cms), являющемся специфическим, происходит взаимодействие рецепторов клеточных стенок и плазмалеммы с экзометаболитами данного возбудителя. Вероятно, в этом случае одним из основных механизмов регуляции активности мАЦ является I небольшое, но достаточное для индукции сигнала количество рецепторов на клеточной стенке и плазмалемме клеток растений устойчивого сорта. При этом активация аденилатциклазной сигнальной системы должна быть связана с Gs белком активатором мАЦ. Напротив, значительное количество и разнообразие рецепторов к ЭПС у клеток растений восприимчивого сорта, вероятно, обладающих сродством как к сунрессорным, так и к элиситорным компонентам ЭПС [Романенко и др., 1999а, Шафикова и др., 2003], предполагает наличие G, белка, ингибирующего активность мАЦ. Конечно,

следует учитывать, что в этой системе имеется фермент, разрушающий цАМФ фосфодиэстераза, но, поскольку в настоящей работе было показано, ч повышение или понижение активности мАЦ совпадают с изменением уровт внутриклеточного цАМФ, можно полагать, что определяющая ро. принадлежит аденилатциклазе. Кроме того, ЭПС вызывают кратковременн обратимое нарушение клеточного гомеостаза у растений картофеля, причб скорость восстановления гомеостаза имеет сортовую зависимость [Романенко др., 1996]. Это явление, вероятно, связано с изменением активности ря, ионных каналов, включая кальциевые. В связи с этим становится очевидной актуальной роль обнаруженной нами изоформы мАЦ растени иммунородственной 6-ой изоформе АЦ животных, которая ингибируеп физиологическими концентрациями кальция [Cooper et al., 1998].

При неспецифическом стрессе суть процесса, вероятно, та же самая, : исключением механизма восприятия сигнала, а дифференцирующим началом данном случае является интенсивность и длительность действующе1 неблагоприятного фактора.

Таким образом, уже на уровне плазмалеммы происходит формирован1 сигнального импульса от аденилатциклазной сигнальной систем1 стимулирующего возникновение целого ряда параллельных и цепнь внутриклеточных реакций [Kurosaki ct al., 1987; Volotovski et al., 199 Willoughby, Cooper, 2006].

В итоге, происходит модуляция активности рАЦ и мАЦ в компартментг клеток. В этом процессе немаловажное значение принадлежит и иона бикарбоната, способным в определенных концентрациях активировать рА1 Представленная цепь событий позволяет ответить на вопрос о рол аденилатциклазной сигнальной системы в дифференциации ответов растени при воздействии неспецифического стрессора, а также в сортовой устойчивое! растений под влиянием специфического стрессора и предложить использованию в селекционной работе в качестве маркера специфическс устойчивости изменение активности аденилатциклазной сигнальной систем растеннй.

Биотические и абиотические стрессоры

Рис. 2!. Участие аденилатциклазной сигнальной системы в защитных ответах растительных клеток.

РКС - рецепторы клеточных стенок; РПМ -рецепторы плазматической мембраны; G - G белок; тмАЦ - трансмембранная аденилатциклаза; рАЦ - «растворимая» аденилатциклаза, ФДЭ - фосфодиэстераза цАМФ; ПКА - протеинкиназа А; ФТ -факторы транскрипции; СС - системный ответ

Выводы

1. Вирулентность и мукоидность возбудителя в патосистеме картофель-шьцевая гниль (Cms) коррелируют с интенсивностью его сорбции на

пверхности растений. Восприятие сигналов от патогена осуществляется в том юле через рецепторы плазмалеммы клеток картофеля к экзополисахаридам : 1збудителя, имеющим количественные отличия у сортов, контрастных по устойчивости к Cms.

2. У растений сортов картофеля, контрастных по устойчивости к возбудителю : )лшевой гнили, оптимальные значения рН активности мембраиосвязанной АЦ з норме и под воздействием ЭПС Cms совпадают и составляют 7,4. Впервые сказано, что ЭПС Cms осуществляют аллостерическую и изостерическую -згуляцию активности мАЦ в клетках растений обоих сортов: у устойчивого -положительную, у восприимчивого - отрицательную.

3. Впервые определены кинетические параметры растворимой АЦ. ЭПС Cms сказывают разнонаправленный эффект на Vmax рАЦ у растений обоих сортов

картофеля: у устойчивого сорта повышают и, напротив, понижают восприимчивого сорта.

4. Одним из условий успешной реализации защитных ответов растений воздействии специфических и неспецифических стрессоров явля кратковременная и достаточная по интенсивности активация аденилатцикла: сигнальной системы растений.

5. Системная активация аденилатциклазной сигнальной системы неспецифическом стрессе у обоих сортов картофеля практически одинако! отличие от специфического стресса, где наблюдается зависимость актив; этого сигнального пути от устойчивости сорта к данному стрессору.

6. Впервые в растениях обнаружена изоформа мАЦ, иммунородственная изоформе мАЦ животных. Длительные специфические стрессы не привод интенсификации синтеза данной изоформы.

7. Впервые у растений, относящихся к разным видам (картофель, пшеш выявлена одна форма рАЦ. Длительные биотический и абиотические стре специфические для каждого вида растений, не индуцируют синтез др; изоформ этой формы фермента.

8. Впервые установлена внутриклеточная локализация рАЦ.

Показано, что под воздействием ЭПС Cms сигнал от аденилатциклаз! сигнального пути в клетках растений устойчивого сорта значите. интенсивнее и быстрее достигает ядра, чем в клетках растений восприимчи сорта.

9. Маркерным признаком специфической устойчивости может выступать локальное, так и системное изменение уровня цАМФ у растений.

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендуемых для публикации

ВАК РФ.

1. Романенко A.C., Ломоватская Л.А., Граскова И. А., Саляев Р Вирулентность, способность к сорбции возбудителя кольцевой гнили псроксидазная активность клеток сортов картофеля, различающихся устойчивости к данному патогену // ДАН, 1999, Т. 368, № 3, с.430-432.

2. Романенко A.C., Ломоватская Л.А., Граскова И.А., Саляев Р.К. Высс инфекционная нагрузка возбудителя кольцевой гнили картофеля вызывае растения-хозяина необычные симптомы заболевания // ДАН. 2000. Т. 374. 5.С. 712-714.

3. Ломоватская Л.А., Романенко A.C., Саляев Р.К. Апоптоз как защит реакция клеток растений картофеля при патогенезе кольцевой гнили // Д, 2002. Т. 382, № 6, с.847- 849.

4. Романенко A.C., Ломоватская Л. А., Граскова И.А. Некрозы как необыч] симптомы кольцевой гнили картофеля // Физиология растений. 2002. Т.49 J с.773-778.

5. Ломоватская Л. А., Романенко A.C., Криволапова Н.В. Связыва экзополисахаридов возбудителя кольцевой гнили картофеля плазмалем; клеток растения-хозяина с разной устойчивостью к данному патогену Ниологичсские мембраны. 2002. Т. 19, №2, с.179-182.

A.S. Romanenko, L. A. Lomovatskaya, T.N. Shafikova, G.B. Borovskii, N.V. ivolapova. Potato Cell Membrane Reseptors to Ring Rot Pathogen Extracellular 'lysaccharides //J. Phytopathology. 2003. 151, N1, p.1-6. Ломоватская Л.А., Романенко A.C., Криволапова H.B., Копытчук В.Н., шяев Р.К. Возможная роль эндогенного цАМФ картофеля в развитии стемного сигнала при патогенезе кольцевой гнили // ДАН. 2004. Т. 394. № 5, 715-717.

Ломоватская Л.А., Романенко А.С., Криволапова Н.В. Упрощенный метод гределения цАМФ в растениях с помощью модифицированного шуноферментного анализа // Известия РАН. Серия биол., 2005, № 6, с. 1-4.

Ломоватская Л.А., Романенко А.С., Криволапова Н.В., Копытчук В.Н., аляев Р.К. Активность трансмембранной и «растворимой» форм ^енилатциклазы в клеточных органеллах растений картофеля при иггериальном патогенезе // ДАН. 2006. № 4. Т. 409. С. 570-573. ). Ломоватская Л.А., Романенко А.С., Криволапова Н.В., Копытчук В.Н., аляев Р.К. Системная активация аденилатциклазы, лолокализованной в пазмалемме клеток картофеля при бактериальном патогенезе // ДАН. 2007. Т. 13. №3. С.420-423.

11. Ломоватская Л.А., Романенко А.С., Криволапова Н.В., Копытчук В.Н. функционирование «растворимой» и связанной с мембраной форм ценилатциклазы в органеллах растительных клеток при биотическом стрессе // иологические мембраны. 2007. Т. 24, №5. С. 363-371.

12. Ломоватская Л.А., Романенко А.С., Филинова Н.В., Копытчук В.Н., Саляев .К. Выявление «растворимой» аденилатциклазы в растениях картофеля //

ДАН. 2008. Т. 420. № 3. С. 412-414.

13. L. A. Lomovatskaya, A.S. Romanenko, N.V. Filinova. Plant adenylate cyclases (minireview) //J. Recept. Signal Transduct. Res. 2008. V. 28. is. 6. P. 531-542.

Рецензируемые журналы:

14. Romanenko A.S., Lomovatskaya L. A., Krivolapova N.V. Identification of potato cells plasma membrane receptors to ring rot pathogen extracellular polysaccharides // Academic Open Internet Journal. 2002. V.7. part 2. P.l - 6.

15. Ломоватская JI.A., Романенко A.C., Криволапова Н.В. Количественное определение цАМФ в растениях модифицированным методом иммуноферментпого анализа // Вестник Харьковского национального аграрного университета, серия биология. 2004. вып.1. С. 129-135.

16. Ломоватская Л.А., Романенко А.С., Криволапова Н.В., Копытчук В.Н.. Участие цАМФ клеток картофеля в передаче системного сигнала при патогенезе кольцевой гнили 1! Физиология и биохимия культ, раст., 2005., Т.37. №2. С. 126-131.

17. Шафикова Т.Н., Романенко А.С., Ломоватская Л.А., Криволапова Н. В., Боровский Г.Б. Взаимодействие экзополисахаридов возбудителя кольцевой гнили с рецепторами плазматической мембраны меток картофеля // Физиология и биохимия культ, раст. 2005. Т. 37. № 2. С. 166-172.

18. L. A. Lomovatskaya, A.S.Romanenko, N.V. Krivolapova, V. N. Kopytchuk.

Partisipation of potato cells cAMP in the transfer of systemic signal in ring i pathogenesis // Academic Open Internet Journal. 2005. V.l5, part 2. P.l-7.

19. Ломоватская JI.A., Романенко A.C., Криволапова H.B., Копытчук В. Влияние биотического стресса на активность различных форм аденилатцикла: в органеллах клеток растений картофеля // Журнал стрессовой физиологии биохимии. 2006. Т.2. № 2. С.7-13.

Тезисы и материалы конференций:

20. А.С.Романенко, Л.А. Ломоватская, И.А. Граскова. Вирулентное! мукоидность и способность к сорбции возбудителя кольцевой гнили картофе; //Тезисы докладов 4 съезда Общества физиологов растений России, Москва, 4 октября 1999г.

21. А.С.Романенко, Л.А. Ломоватская, И.А. Граскова. Возбудитель кольнет гнили вызывает у картофеля нехарактерные симптомы заболевания// Там же.

22. L. A. Lomovatskaya, A.S.Romanenko. Different binding of Clavibacl michiganensis sp. sepedonicus extracellular polysaccharides in the plasma membra; of cell potato cultivars with contrasting resistance to this pathogen // Internation Symposium «Signaling sistems of plant cells» Moscow. Russia 2001.

23. L. A. Lomovatskaya, A.S.Romanenko. Apoptosis as possible defense reaction potato plant cells at ring rot pathogenesis// ELSO Meetings. 2002. poster abstracts.

24. Ломоватская Л.А., A.C. Романенко, H.B. Криволапова. Влияш экзополисахаридов возбудителя кольцевой гнили картофеля на содержат цАМФ в суспензионных клетках сортов картофеля, контрастных i устойчивости к данному патогену // Тезисы докладов 5 съезда Общест] физиологов растений России, Пенза, 15-21 сентября 2003 г.С.182.

25. Ломоватская Л.А., А.С. Романенко, Н.В. Криволапова, В.Н. Копытчу Влияние экзополисахаридов возбудителя кольцевой гнили на динамику цАМ в растениях сортов картофеля, контрастных по устойчивости к даннои патогену // Материалы Всероссийской научной конференции "Стрессовь белки растений", Иркутск, 2004 г.

26. Ломоватская Л.А., Романенко А.С., Филинова Н.В., Копытчук В.] Функционирование «растворимой» и связанной с мембраной фор аденилатциклазы в органеллах растительных клеток при биотическом стрессе Тезисы докладов международной конференции «Современная физиолог! растений: от молекул до экосистем». Сыктывкар, 2007. С. 238.

27. Ломоватская Л.А., А.С. Романенко, Н.В. Криволапова, В.Н. Копытчу Эндогенный цАМФ клеток картофеля может участвовать в развит! системного сигнала при патогенезе кольцевой гнили // Материалы научн практической конференции, посвященной 50-летию Иркутского НИИСХ. «Роль сельскохозяйственной пауки в развитии АПК Приангарья», 2007, Иркутск. С. 144-147.

28. А.С. Романенко, Ломоватская Л.А., Н.В.Филинова. Различные форм аденилатциклазы растений: внутриклеточная транедукция сигнала п; биотическом и абиотическом стрессах // Материалы Всероссийскс

ференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней п,ы», Иркутск, 2007.

Ломоватская Л.А., A.C. Романенко, Н.В. Филинова В.Н. Копытчук. лемная активация аденилатциклазы, локализованной в плазмалемме клеток тофеля при бактериальном патогенезе // Там же.

Н.В. Филинова, Ломоватская Л.А., A.C. Романенко, В.Н. Копытчук Участие створимой» и трансмембранной форм аденилатциклазы органелл клеток тофеля в сигналинге при бактериальном патогенезе // Там же.

Подписано н печать 20.04.09. Формат 210x147 1/16. Бумага писчая белая. Печать RIZO .Уел печ.л.1.6. Отпечатано и типографии ИП Овсянников А.А. Тираж 100 экз. Заказ № 53

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Ломоватская, Лидия Арнольдовна

ВВЕДЕНИЕ.

Положения, выдвигаемые на защиту.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Универсальность и специфичность механизмов восприятия сигнала от абиотических стрессоров и ответные реакции растений.

1.2. Биотические стрессовые факторы.

1.2.1. Стадии фитопатогенного процесса.

1.2.2. Первичный контакт грибов и бактерий с растениями.

1.2.3. Адгезия и проникновение фитопатогенов.

1.2.4. Ионные взаимодействия.

1.2.5. Экзополисахариды ( ЭПС ) бактерий.

1.2.6.Clavibacter mishigcinensis subsp. sepedonicus.

Симптомы заболевания.

Специализация патогенна.

Факторы вирулентности.

Механизм действия ЭПС Cms.

Экстраклеточные ферменты.

1.3. Сигнальная сеть растений.

1.3.1.Рецептор ы.

1.3.1.1. Рецепторы, сопряженные с G белками (GPCR).

1.3.1.2. Рецепторы - ионные каналы.

1.3.1.3. Рецепторы, ассоциированные с ферментативной активностью.

1.3.1.4. Лектины.

1.3.2. G белки.

1.3.3. Белки, заякоривающие протеинкиназы - AKAPs

A-Kinase Anchoring Proteins).

1.3.4. Протеинкиназы и протеинфосфатазы.

1.3.5. Факторы транскрипции.

1.3.6. Сигнальные системы растений.

1.3.6.1. МАР-киназная сигнальная система.

1.3.6. 2. Липоксигеназная сигнальная система.

1.3.6. 3. Фосфатидатная сигнальная система.

1.3.6. 4. Кальциевая сигнальная система.

1.3.6. 5. НАДФН-оксидазная сигнальная система.

1.3.6. 6. Ж)-синтазная сигнальная система.

1.3.6.7. Протонная сигнальная система.

1. 3.6.8. Аденилатциклазная сигнальная система.

1.3.6.8.1. Аденилатциклазы.

1.3.6.8.1.1. Аденилатциклазы одноклеточных эукариот.

1.3.6.8.1.2. Мембраносвязанная аденилатциклаза животных и человека (АЦ).

Регуляция активности мАД животных. \ Каталитический механизм регулягцш.

О-белки.

Са и калъмодулин.

Регуляция форсколином, пирофосфатом и ингибиторами Р- сайта.

Регуляция посттрансляционной модификацией.

1.3.6.8.1.3. «Растворимая» АД животных.

Каталитическая регуляция рАЦ.

1.3.6.8.1.4. Аденилатциклазы растений.

1.3.6.8.1.4.1. Мембраносвязанная АД растений.

1.3.6.8.1.3.2. «Растворимая» АЦ растений.

Регуляция активности мАЦ и рАЦ растений факторами внешней среды

1.3.6.8.2. цАМФ - вторичный мессенджер.

1.3.6.8.3. Фосфодиэстераза.

1.3.6.8.4. цАМФ-зависимые протеинкиназы.

1.3.6.8.5. цАМФ-связывающие белки.

1.3.6.8.6. цАМФ-регулируемые ионные каналы.

1.4. Взаимодействие сигнальных систем.

1.5. Системный сигналинг.

1.5.1. Потенциал действия.

1.5.2. Системная индуцированная устойчивость.

1.6. Ионные каналы растительных клеток.

1.6.1. К+-каналы.

1.6.2. Са2+-каналы.

1.6.3.Са2+- каналы, регулируемые вторичными посредниками.

1.6.4.Са - каналы, регулируемые в белками.

1.6.5. Анионные каналы.

1.6.6. Нуклеотид-регулируемые анионные каналы.

1.6.7. Механочувствительные ионные каналы.

1.7. Специфические механизмы защитных реакций растений.

1.7.1. Гены патогенности.

1.7.2. Гены авирулентности.

1.7.3. Гены вирулентности.

1.7.4. Гены устойчивости.

1.7.4. Я-белки.

1.7.5. Гены иммунного ответа.

1.7.6. Элиситоры и супрессоры фитопатогенов.

1.7.7.Участие активных форм кислорода в защитных реакциях растений от патогенов.

1.7.8. Сверхчувствительный ответ (СЧ).

1.8. Выводы из обзора литературы, постановка цели и задач исследования.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Растительный материал.

2.1.1. Рыхлый тканевый каллус картофеля.

2.1.2. Суспензионная культура клеток картофеля.

2.1.3. Растения картофеля in vitro.

2.1.4. Получение проростков пшеницы.

2.2. Культивирование бактерий Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus(Cms)

2.3. Выделение и очистка экзополисахридов Cms.

2.4. Коньюгирование ЭПС с флюорохромным красителем.

2.5. Определение сорбционной способности Cms.

2.6. Выделение протопластов.

2.7. Инкубация протопластов с ЭПС Cms.

2.8.Подготовка образца для определения концентрации цАМФ.

2.9. Иммуноферментный анализ (ИФА).

2.10. Метод капиллярного электрофореза для идентификации цАМФ в растительном образце.

2.11. Спектроскопия ЯМР для идентификации цАМФ в растительном образце.

2.12. Метод дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сорбита для выделения фракции ядер и хлоропластов из листьев растений картофеля.

2.13. Методика подготовки образцов для определения активности растворимой и мембраносвязанной АЦ.

2.14. Методика определения оптимума pH и кинетических характеристик мАЦ и рАЦ из корней растений картофеля.

2.15. Выявление мембранных липидов во фракциях клеток после ультрацентрифугирования.

2.16. Приготовление образцов для электронной микроскопии.

2.17. Метод иммуноэлектронной цитохимии для выявления цАМФирАЦ.

2.18. Количественная оценка меток к цАМФ.

2.19. Приготовление образцов для иммунопреципитации.

2.20.Электрофорез, окраска, определение молекулярных масс АЦ.

2.21. Иммуноблотинг.

2.22. Статистическая обработка результатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Сорбция штаммов Cms на суспензионных клетках двух сортов картофеля, контрастных по устойчивости к данному патогену.

3.2. Выявление рецепторов к экзополисахаридам Cms на плазмалемме клеток растений картофеля.

3.3. Определение кинетических параметров тотальных мАЦ и рАЦ из корней растений картофеля двух сортов, контрастных по устойчивости к Cms и опосредованное влияние ЭПС Cms на эти параметры.

3.3.1. Оптимум рНмАЦ.

3.3.2.Кинетические параметры мАЦ.

3.3.3.Кинетические парсиметрырАЦ.

3.4. Влияние биотического и абиотического стрессов на внутри- и внеклеточную концентрационную динамику цАМФ в клетках разных видов растений.

3.5.Различия в скорости и интенсивности, а также специфичность системного ответа-аденилатциклазного сигнального пути сортов картофеля, контрастных по устойчивости к возбудителю кольцевой гнили на биотический и абиотический стрессоры.

3.6. Выявление у растений изоформы мАЦ, иммунородственной 6-ой изоформе мАЦ животных. Влияние длительных биотического и абиотического стрессоров на активизацию синтеза этой изоформы мАЦ у растений.

3.7. Выявление рАЦ у разных видов растений (картофель, пшеница) в норме и влияние длительного биотического и абиотического стрессоров на изменение изоферментного состава рАЦ.

3.9. Функционирование мАЦ и рАЦ в ядрах и хлоропластах клеток растений двух сортов картофеля, контрастных по устойчивости к возбудителю кольцевой гнили. Влияние ЭПС данного возбудителя на активность этих форм фермента.

3.9.1 .Мембраносвязнная и «растворимая» АЦядер клеток растений устойчивого сорта.

3.9.2.Мембраносвязанная и «растворимая» АЦхлоропластов клеток растений устойчивого сорта.

3.9.3. Мембран ос вязанная и «растворимая» АЦ ядер клеток растений восприимчивого сорта.

3.9.4. Мембраносвязанная и «растворимая» АЦхлоропластов клеток растений.

ЗЛО. Влияние биотического стресса на перераспределение цАМФ в компартментах клеток картофеля. Локализация рАЦ в органеллах клеток этих растений.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Аденилатциклазы растений: характеристика и роль в реализации защитных механизмов при стрессах"

Растения в силу неподвижного образа жизни и вариабельной среды обитания вынуждены постоянно испытывать на себе влияние множества различных стрессовых факторов. Поэтому в процессе эволюции у них выработались приспособления, позволяющие воспринимать, преобразовывать и усиливать приходящие из окружающей среды сигналы и реагировать на них, перестраивая соответственно свой обмен веществ, и создавая структурные защитные барьеры.

Изучение иммунитета растений в настоящее время является важнейшей научной проблемой, тесно связанной с практическими вопросами, стоящими перед сельским хозяйством. Прогресс в этой научной области во многом зависит от успехов в изучении субклеточных механизмов, определяющих степень устойчивости растительного организма к тем или иным неблагоприятным факторам внешней среды. В тесной связи с проблемой фитоиммунитета находится и понятие «стресс», включающее в себя механизмы первичных ответных реакций растительных организмов.

Традиционная теория стресса, разработанная Г. Селье (1972) для животных, в основе опирается только на неспецифические ответные реакции организма [Селье, 1972]. Однако, для растений не менее важное значение имеет специфическая составляющая стрессового ответа, а также соотношение неспецифической и специфической частей ответной реакции [Пятыгин, 2008]. Несмотря на некоторые отличия и дополнения, стресс у растений принято описывать также в три стадии [Шакирова, 2001; Тарчевский, 2001], соответствующие классическим фазам стресса у животных [Селье, 1972]. По литературным данным функции и назначение каждой из стадий в процессе развития стрессового ответа растительного организма оцениваются неоднозначно. Так, есть мнение, что стресс — реакция, выполняющая исключительно оперативную кратковременную защиту растения от гибели в неблагоприятных условиях, а также инициирующая мобилизацию и формирование в дальнейшем специализированной адаптации [Кузнецов, 2001]. Другие авторы считают, что растительная клетка ведет себя как биологический триггер и может осуществлять небольшие кооперативные переходы^ от одного устойчивого стационарного состояния к другому [Веселовский и др., 1993]. Например, это состояние нормы, затем защитное состояние, соответствующее стрессу, и, наконец, летальный исход, наступающий в случае ненадлежащей защиты. Следует заметить, что рассмотренные точки зрения не противоречат, а скорее, дополняют друг друга. Именно на первой стадии стрессовой реакции у растений наряду с неспецифическими, общими защитными ответами, включаются особенные, приуроченные к видовой или сортовой устойчивости, специфические защитные механизмы.

Величайшее множество имеющихся стрессовых факторов окружающей среды можно, с одной стороны, разделить по природной' принадлежности на абиотические и биотические, и с другой стороны, по способу воздействия на растения. Как правило, большинство неблагоприятных факторов, абиотической природы, например, температура (низкая и высокая); а также механическое давление оказывают, прежде всего, воздействие на липидный матрикс клеточных мембран [Пятыгин, 2004, 2008; Лось, 2001]. Это влечет за собой ряд неспецифических ответных реакций растений: повышение проницаемости и деполяризацию клеточных мембран, закисление цитоплазмы, вход ионов кальция в клетку и т. д. [Шакирова, 2001]. Однако, наряду с этим у растений наблюдается синтез шоковых белков, присущий только устойчивым к данному воздействию сортам или видам растений [Войников и др., 1984; Кузнецов, 2001]. В! то> же время биотические стрессоры в подавляющем большинстве взаимодействуют с растениями по принципу лиганд-рецептор, что подразумевает сугубо специфические взаимоотношения [Романенко и др., 1998; 1999а], но не исключает проявлений неспецифической реакции, как например синтез фитоалексинов или PR-белков [Дьяков, 2005].

Таким образом, проблема стресса у растений весьма многогранна и включает в себя обширный круг задач. Одним из важнейших слабо исследованных вопросов является расшифровка механизмов восприятия1 и передачи внутри- и межклеточных сигналов при изменении условий существования растительных организмов, особенно при действии экстремальных факторов, вызывающих у них состояние стресса.

В настоящее время известно, что у растений функционирует восемь сигнальных систем, обеспечивающих своевременную реакцию и координацию метаболизма растений- на всем протяжении жизненного цикла, а также при изменении условий обитания» [Тарчевский, 2001]. В силу многих причин изученность этих систем у растений неодинакова.

Аденилатциклазная сигнальная, система растений является* одной из наименее исследованных, хотя очевидно, что ее роль в защитных ответах в условиях абиотического и биотического стрессов весьма существенна. Однако, в литературе имеются лишь скудные сведения о функционировании этой системы у растений как в норме, так и при стрессах. Например, почти нет данных по ее участию- в< защитных реакциях растений от патогенов. В частности, отсутствуют работы* по функционированию аденилатциклазной сигнальной системы при бактериозах.

При бактериальных патогенезах возможна как элиситация защитных ответов при высокой сортовой устойчивости растений, так и их супрессия, приводящая, к восприимчивости к возбудителю. В настоящее время- хорошо изучены визуальные, симптоматические проявления этих крайних реакций фитоиммунитета, тогда как начальные этапы данных явлений, протекающие скрыто, исследованы слабо и несистемно.

В любой сигнальной системе эффективность ее работы в значительной степени зависит от фермента-триггера сигнала. Для аденилатциклазной системы^ таким ферментом является аденилатциклаза (АЦ), синтезирующая циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), который, являясь вторичным мессенджером, осуществляет преобразование и трансдукцию внеклеточного сигнала в генетический аппарат клетки, обеспечивая своевременную реакцию растительного организма на изменившиеся условия внешней среды.

Считается, что у растений есть одна изоформа мембранной аденилатциклазы (мАЦ), а наличие растворимой- формы (рАЦ) этого фермента до сих пор ставится под сомнение [Kamenetsky et al., 2006]. В то же время, у животных идентифицированы 9 изоформ мАЦ, отличающихся по чувствительности к ионам кальция и регулирующиеся различными типами G-белков [Linder, 2006]. «Растворимая» АЦ на сегодняшний день обнаружена у бактерий, грибов, простейших, животных и человека [Zippin et al., 2003]. В этом ряду отсутствуют только растения, где наличие рАЦ твердо не доказано. Между тем необходимо отметить, что общие принципы работы сигнальных систем в значительной степени универсальны. Универсальность ДНК - основного вместилища информации - определяет сходство механизмов ее обслуживания в клетках микроорганизмов, растений и животных. Это касается единого принципа структуры рецепторов, встроенных в- клеточные мембраны, ассоциированных с ними G белков, структуры стартовых ферментов сигнальных систем и ферментов, ответственных за синтез и деградацию небелковых вторичных посредников, структуры протеинкиназ, протеинфосфатаз, факторов регуляции транскрипции, РНК-полимераз, рибосом и обслуживающих их работу белков. Исходя из этого, следует ожидать, что у растений функционируют более сложно организованные, чем представляется сегодня, сигнальные системы, включающие многие компоненты, возможно, аналогичные или похожие по структуре и функциям на соответствующие элементы систем животных. Такое предположение представляется вполне оправданным, поскольку известно, что стрессовые факторы, действующие с различной интенсивностью на растения, способны оказывать дифференцированный эффект на активность различных компонентов той или иной сигнальной системы, а это может быть обеспечено только многокомпонентной и сложной структурой сигнальных систем [Кузнецов, 2001; Шакирова, 2001].

В связи с этим разработка проблемы трансдукции внутри- и межклеточных сигналов посредством аденилатциклазной сигнальной системы» у растений И' влияние на этот процесс специфических и неспецифических стрессов представляется весьма актуальной. Это позволит выявить недостающие элементы молекулярных механизмов конститутивного иммунитета растений, и в дальнейшем даст возможность работать над созданием сортов с высокой устойчивостью к различным неблагоприятным факторам внешней*среды.

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Вирулентность и мукоидность возбудителя в патосистеме картофель-кольцевая гниль {С1ау\Ъас1ег тгс/г^^опепьчх БиЬзр. 8ерес1отст) коррелируют с интенсивностью его сорбции на поверхности, растений. Количество рецепторов на плазмалемме клеток^ картофеля к экзометаболитам этого же возбудителя связано с сортовой,устойчивостью этой культуры.

2. «Растворимая»- АЦ, а также изоформа мАЦ, иммунородственная 6-ой изоформе мАЦ животных - компоненты аденилатциклазной1 сигнальной системы растений разных видов. Длительные специфические стрессы не приводят к интенсификации синтеза этих форм фермента.

3. Один из основных регуляторных механизмов модулирования активности аденилатциклазной сигнальной системы под воздействием биотического1 стресса — изменение кинетических параметров «растворимой» и мембраносвязанной форм аденилатциклазы. Высокая скорость, кратковременность, а также системность активации аденилатциклазной сигнальной системы растений являются необходимым условием для успешной реализации защитных механизмов при воздействии* специфических и неспецифических стрессоров.

4. Как локальное, так и системное изменение уровня цАМФ у растений может выступать маркерным признаком специфической устойчивости.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Ломоватская, Лидия Арнольдовна

ВЫВОДЫ

1. Вирулентность и мукоидность возбудителя в патосистеме картофель-кольцевая гниль (Cms) коррелируют с интенсивностью его сорбции на поверхности растений. Восприятие сигналов от патогена осуществляется в том числе через рецепторы плазмалеммы клеток картофеля к экзополисахаридам возбудителя, имеющим количественные отличия у сортов, контрастных по устойчивости к Cms.

2. У растений сортов картофеля, контрастных по устойчивости к возбудителю кольцевой гнили, оптимальные значения рН активности мембраносвязанной АЦ в норме и под воздействием ЭПС Cms совпадают и составляют 7,4. Впервые показано, что ЭПС Cms осуществляют аллостерическую и изостерическую регуляцию активности мАЦ в клетках растений обоих сортов: у устойчивого -положительную, у восприимчивого - отрицательную.

3. Впервые определены кинетические параметры растворимой АЦ. ЭПС Cms оказывают разнонаправленный эффект на Vmax рАЦ у растений обоих сортов картофеля: у устойчивого сорта повышают и, напротив, понижают у восприимчивого сорта.

4. Одним из условий успешной реализации защитных ответов растений при воздействии специфических и неспецифических стрессоров является кратковременная и достаточная по интенсивности активация аденилатциклазной сигнальной системы растений.

5. Системная активация аденилатциклазной сигнальной системы при неспецифическом стрессе у обоих сортов картофеля практически одинакова, в отличие от специфического стресса, где наблюдается зависимость активации этого сигнального пути от устойчивости сорта к данному стрессору.

6. Впервые в растениях обнаружена изоформа мАЦ, иммунородственная 6-ой изоформе мАЦ животных. Длительные специфические стрессы не приводят к интенсификации синтеза данной изоформы.

7. Впервые у растений, относящихся к разным видам (картофель, пшеница), выявлена одна форма рАЦ. Длительные биотический и абиотические стрессы, специфические для каждого вида растений, не индуцируют синтез других изоформ этой формы фермента.

8. Впервые установлена внутриклеточная локализация рАЦ. Показано, что под воздействием ЭПС Cms сигнал от аденилатциклазного сигнального пути в клетках растений устойчивого сорта значительно интенсивнее и быстрее достигает ядра, чем в клетках растений восприимчивого сорта.

9. Маркерным признаком специфической устойчивости может выступать как локальное, так и системное изменение уровня цАМФ у растений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По современным представлениям иммунитет растений — это система молекулярных механизмов, призванных сохранять структурную и функциональную целостность организма в меняющихся условиях внешней среды [Озерецковская, 2002; Дьяков, 2005] . Одним из главных нерешенных вопросов в этой проблеме является изучение механизмов внутриклеточной передачи сигналов на начальных этапах воздействия стрессоров различной природы.

Известно, что у растений имеется информационная молекулярная сеть, в которую входят восемь сигнальных систем [Тарчевский, 2001; Оепоис! е! а1., 2001]. На сегодняшний день новых систем трансдукции сигналов не обнаружено.

Аденилатциклазная сигнальная система является одной из составляющих этой сети клетки и участвует в формировании функциональных и структурных ответов растительного организма на внешние раздражители [ОЬтоп е! а1, 1989; Яворская, 1990; Ьотоуа1зкауа е! а1., 2008]. Следует отметить, что, несмотря на возросший общий интерес фитоиммунологов и молекулярных биологов к внутриклеточным механизмам иммунитета, аденилатциклазная сигнальная система растений до сих пор остается мало изученной, и на сегодняшний день нет полной схемы рецепции и трансдукции внутри- й межклеточных сигналов с участием этой системы растений. Поэтому целью данного исследования являлось изучение нами механизмов активации аденилатциклазной сигнальной системы, а также мембраносвязанной и растворимой форм аденилатциклаз у растений под влиянием стрессов различной природы, длительности и интенсивности.

Другой важной и также нерешенной проблемой иммунитета растений является проблема специфичности. По современным представлениям на молекулярном и структурном уровнях специфичность определяется взаимодействием соответствующих детерминант растительных клеток с определенными метаболитами патогена. Именно на этой стадии, в процессе колонизации растения патогеном, в клетку трансдуцируется сигнал «тревоги», мобилизующий защитные системы организма. Существенная роль в процессе колонизации тканей патогеном и экспрессии или супрессии защитных реакций растений принадлежит, в частности, экзополисахаридам (ЭПС), формирующим мукоидный слой бактерий [Denny, 1995; Romantschuk, 1992].

Имеющиеся литературные данные о роли мукоидности в проявлении патогенности (вирулентности) при бактериозах весьма противоречивы и малочисленны. Поэтому, в модельной системе картофель-возбудитель кольцевой гнили (Cms) нами были проведены исследования по влиянию мукоидности и вирулентности различных штаммов возбудителя кольцевой гнили, различающихся по этому показателю, на сорбционную способность данного патогена на суспензионных клетках картофеля. Была проведена оценка степени корреляции между интенсивностью сорбции и вирулентностью, сорбцией и мукоидностью исследуемых штаммов возбудителя кольцевой гнили. Для пары устойчивый сорт Луговской-Ога корреляция между этими показателями не была выявлена, тогда как для растений сорта Лукьяновский (восприимчивый) и Cms наблюдалась заметная и высокая корреляция соотвественно. На основании ранее полученных данных можно полагать, что усилению контакта рецепторов с ЭПС Cms способствуют фосфатные и сульфатные группы, присутствующие в мукоидном слое исследуемых штаммов Cms [Ломоватская, 2001]. Хотя по этому показателю штаммы существенно различались, заметная теснота связи между интенсивностью сорбции и остатками фосфорной кислоты в мукоидном слое бактерий (г = 0,65 ± 0,21) была установлена. В этой связи необходимо отметить, что рецепторы, локализованные в оболочках клеток восприимчивого сорта, имеют в своем составе, кроме полисахаридов, в большом количестве положительно заряженные аминокислоты [Романенко и др., 1999] и это также может способствовать усилению взаимодействий между детерминанатами клеточных стенок растений картофеля и метаболитами бактерий.

Контакт возбудителя кольцевой гнили с клеточными стенками растений картофеля приводит не только к рецепции сигналов непосредственно в этом компартменте, но и позволяет экзополисахаридам бактерий проникать через оболочку к плазмалемме растительной клетки. Поэтому следующая задача заключалась в выявлении на плазмалемме клеток растений рецепторов к ЭПС Cms и установлении сортовых отличий по этому показателю.

Проведенные исследования позволиливывить на плазмалемме клеток картофеля рецепторы к экзополисахаридам возбудителя кольцевой гнили картофеля. Также как и на клеточной стенке [Романенко и др., 1999], данные детерминанты имеются в очень небольшом количестве у растений устойчивого сорта, и их примерно на порядок больше у растений восприимчивого сорта. Вероятно, качественный состав рецепторов у растений устойчивого сорта имеет большее сродство к элиситорным составляющим ЭПС, тогда как у клеток восприимчивого сорта к супрессорным, что в дальнейшем сказывается на качестве поступающего в клетку сигнала «тревоги». Строго говоря, перечисленные особенности рецепторов отражают данные, полученные на суспензионных клетках и на протопластах листовых тканей картофеля. Тем не менее, сорбция> ЭПС Cms на клеточных стенках и последующее эндоцитозное поглощение этих бактериальных метаболитов корневыми клетками [Романенко, Рифель, 2002] растения-хозяина, а также эксперименты с ЭПС и сурамином, разобщающим связь рецептора с G белком (раздел 3.3.), позволяют сделать вывод о том, что рецепторы к ЭПС также присутствуют в клетках корней и, более того, обладают такими же, связанными с сортовыми различиями свойствами, характерными для других тканей картофеля.

Поскольку на плазмалемме клеток картофеля были выявлены рецепторы к ЭПС, логично было бы исследовать механизм передачи сигнала от этих метаболитов внутрь клетки. В аденилатциклазной сигнальной системе ферментом первой реакции, запускающим сигнальный каскад, является мембраносвязанная аденилатциклаза. Кроме того, по отдельным литературным данным, у растений функционирует и «растворимая» форма этого фермента, слабо ассоциированная с клеточными органеллами и элементами цитоскелета [Moutinho et al, 2001]. Поэтому было проведено исследование по выявлению оптимальных условий функционирования и кинетических характеристик обеих форм фермента в клетках корня растений картофеля, а также изменений этих показателей при опосредованном воздействии ЭПС Cms. Проведенные исследования позволили установить, что у растений двух сортов картофеля, контрастных по устойчивости к возбудителю кольцевой гнили, оптимальный уровень рН активности мАЦ составляет 7,4; каталитические параметры мАЦ и рАЦ имеют существенные сортовые различия. мАЦ из растений устойчивого сорта Луговской в норме имела более высокую Vmax, чем соответствующая форма фермента из растений восприимчивого сорта Лукьяновский. Под воздействием ЭПС Vmax мембраносвязанной АЦ у резистентного сорта повышалась более, чем в 2,5 раза при незначительном снижении Кт, а у восприичивого сорта усиливалось субстратное ингибирование, сопровождающееся значительным понижением максимальной скорости реакции. Поскольку модуляция активности данного фермента осуществлялась с участием рецепторов к ЭПС, то наряду с изостерическими взаимодействиями, регуляция кинетических параметров осуществлялась и на аллостерическом уровне. У устойчивого сорта это была положительная аллостерическая регуляция, у восприимчивого-отрицательная.

На рАЦ экзополисахариды Cms действовали иначе: на фоне субстратного ингибирования фермента из клеток обоих сортов, у рАЦ из клеток растений устойчивого сорта повышалась VmaX5 и сродство к субстрату. Напротив, у рАЦ из клеток растений восприимчивого сорта Vmax и сродство к субстрату понижались (последний показатель в незначительной степени). Возможно, это является одним из механизмов ингибирования активности рАЦ у растений данного сорта. Ионы бикарбоната повышали Vmax рАЦ клеток растений обоих сортов, у восприимчивого сорта даже на фоне ЭПС, но при этом не снимали субстратного ингибирования. Проведенный анализ кинетических параметров и оптимальных условий функционирования мАЦ и рАЦ позволяют заключить, что они у мАЦ в норме совпадают с таковым из других растительных объектов [Pacini et al., 1993; Молчан и др., 2000; Jasso-Chavez et al., 2002]. Для рАЦ растений такие данные получены нами впервые, а сравнение с аналогичными характеристиками рАЦ животных указывает на принипиальные различия, из чего можно сделать вывод, что рАЦ растений имеет структурные отличия- от аналогичного фермента животных. И касаются они, скорее всего, каталитического центра фермента. Об этом можно судить по характеру влияния бикарбоната на активность рАЦ, который, в отличие от животных, не снимал субстратного ингибирования. В пользу этого же свидетельствует и отсутствие ингибирующего эффекта на рАЦ растений высокоспецифического ингибитора рАЦ животных КН-7.

Результатом активации аденилатциклазной сигнальной системы, и в частности аденилатциклазы, является повышение в клетке уровня цАМФ, осуществляющего запуск сигнального внутриклеточного каскада, что приводит к репрограммированию генома, и включению различных защитных механизмов. К настоящему времени хорошо изучен конечный этап этого •процесса, например, индукция специфических белков под воздействием теплового шока или инфицирования [Рымарева и др., 2005; Федосеева и др., 2008]. По литературным данным, цАМФ, наряду с другими внутриклеточными вторичными мессенджерами, принимает участие в ответных реакциях растений на различные виды стресса [Яворская, 1990]. В то же время остается совершенно неизвестным, какое значение для активации аденилатциклазной сигнальной системы имеет величина и длительность действующего стрессового фактора и каким образом долговременная реализация ответных реакций растительных клеток может быть связана с этим процессом. Для выяснения этих вопросов были проведены эксперименты по влиянию различного по длительности и интенсивности теплового воздействия на аденилатциклазную сигнальную систему суспензионных клеток арабидопсиса, а также по влиянию ЭПС Cms на аналогичную систему суспензионных клеток картофеля, осуществляемого в течение различных промежутков времени. Результаты экспериментов позволяют сделать заключение, что, несмотря на различия в механизмах восприятия сигнала при абиотическом и биотическом стрессах, и в суспензионных клетках арабидопсиса и у клеток устойчивого сорта картофеля в первую минуту стрессовых воздействий наблюдалось резкое возрастание активности аденилатциклазной сигнальной системы. В дальнейшем тепловой шок различной интенсивности (37°С и 50°С) оказывал неодинаковое влияние на активность аденилатциклазной сигнальной системы арабидопсиса. При 37°С уровень цАМФ в последующие 15 минут только плавно снижался, тогда как при 50°С на 15 минуте выявлялось повторное его повышение. Эти результаты в совокупности с имеющимися литературными данными [Федосеева и др., 2008] позволяют выдвинуть предположение о том, что интенсивность и длительность' активации аденилатциклазной сигнальной системы может определять («включать») в растительных организмах различные программы, ведущие в одном случае к адаптации, а в другом к смерти, вероятнее всего через включение программы апоптоза. При воздействия ЭПС на аденилатциклазную сигнальную систему суспензионных клеток картофеля двух сортов, контрастных по устойчивости к Cms, главным также является минимальное время активации этой системы: у устойчивого сорта оно составило 1 минуту, у восприимчивого сорта значительное возрастание активности произошло только к 15 мин. Вероятно, это является одной из причин неустойчивости растений данного сорта, так как не позволяет растениям оперативно перестраивать метаболизм на защиту против патогена.

Несмотря на то, что эксперименты на суспензионных клетках выявили активацию аденилатциклазной сигнальной системы под воздействием стрессоров различной природы, вопрос специфичности защитных реакций растений остается весьма актуальным и молекулярные механизмы, определяющие этот феномен, еще до конца не выяснены. Поэтому представляло интерес изучить системную реакцию аденилатциклазной сигнальной системы растений тех же сортов картофеля на кратковременные (1 мин) стрессы: неспецифический абиотический (4°С) и специфический биотический (ЭПС Cms).

Следует заметить, что по литературным данным восприятие температурного стрессора осуществляется, прежде всего, липидным матриксом мембран клеток растений [Лось, 2001; Пятыгин, 2008]. В соответствие с этим, поскольку картофель является нехолодостойкой культурой, температурный стресс вызывал системную неспецифическую активацию АЦ-сигналинга, практически одинаковую у растений обоих сортов.

Напротив, под воздействием специфического стрессора (ЭПС Cms) восприятие сигнала осуществлялось через рецепторы, локализованные на оболочке и плазмалемме клеток корня. Это вызывало у растений устойчивого сорта системную активацию АЦ пути, выражающуюся в быстром (1 мин) и резком увеличении (в 160 раз) уровня цАМФ уже в верхней части растения и, напротив, в почти полном ингибировании данной системы у растений восприимчивого сорта.

Более детальные исследования показали, что у растений восприимчивого сорта этот показатель только через 120 минут существенно превышал уровень контроля (более чем в 6 раз). Можно полагать, что это связано с различиями в количестве и качестве рецепторов к ЭПС у двух сортов: повышенном сродстве к элиситорным компонентам ЭПС у устойчивого сорта и к супрессорным у восприимчивого сорта.

По литературным данным, первичная роль в распространении сигнального импульса принадлежит потенциалу действия (ПД) [Willoughby, Cooper, 2006 Пятыгин, 2008], возникающему при любом стрессовом воздействии, но имеющем различную интенсивность в зависимости от специфичности действующего фактора. Отсюда можно предположить, что первичным системным сигналом, возникающим в корнях под воздействием ЭПС Cms, также является потенциал действия. Это становится возможным вследствие закисления экзополисахаридами внеклеточной среды роста растений, при котором нарушается рН-гомеостаз клеток корней растений обоих сортов картофеля [Романенко и др., 1998]. Поскольку скорость восстановления рН-гомеостаза у них неодинакова, возникающий ПД должен различаться по интенсивности, что отразится на разновременной активации аденилатциклазной сигнальной системы у растений обоих сортов растений картофеля. Более того, значительное количество рецепторов к ЭПС на клеточной стенке и плазмалемме клеток растений картофеля восприимчивого сорта и их, вероятно, преимущественное сродство к супрессорным составляющим данных метаболитов, вызовут блокировку активации мАЦ. Это, по-видимому, также скажется на деятельности соответствующих потенциалобразующих ионных каналов плазмалеммы. Возможно, что постепенное замещение супрессорных компонентов ЭПС на элиситорные все же позволяет развиться системному сигналу в растениях восприимчивого сорта, но время для запуска защитных реакций окажется упущенным.

Далее представляло интерес выявить роль мАЦ в передаче системного сигнала. В ряде экспериментов мАЦ клеток корней растений картофеля была предварительно заингибирована сурамином, разобщающим связь рецептора с соответствующим G-белком. В результате уровень цАМФ даже в верхней части стебля растений картофеля как в норме, так и под воздействием стрессоров значительно снижался. Это указывает на ключевую роль мАЦ в инициировании системного сигнала, распространение которого (и опосредованная через него системная активация мАЦ), вероятно, также осуществляются через ПД.

Очевидно, что тонкая регуляция активации аденилатциклазной сигнальной системы в силу дифференцированных ответов растений на стимулы различной интенсивности и характера, должна осуществляться через множество компонентов. К сожалению, в настоящее время далеко не все составляющие данного сигнального пути у растений известны. Если за отправную точку брать аналогичную систему животных, а также известные литературные данные по влиянию кальция на активность аденилатциклазной сигнальной системы растений [Гималов и др., 2004; Kurosaki et al., 1997; Volotovski et al., 1998; Lecourieux et al., 2002], возникает необходимость выяснить существование у растений изоформы мАЦ, ингибируемой физиологическими концентрациями кальция. Такая изоформа под номером шесть функционирует в клетках животных. Поэтому были проведены эксперименты по выявлению изоформы мАЦ, иммунородственной 6-ой изоформе мАЦ животных с применением поликлональных антител к N-концу молекулы данной изоформы мАЦ животных. Исследования проводили на растениях картофеля тех же сортов и на проростках озимой и яровой пшеницы. В результате проведенных исследований было установлено, что у обоих видов растений выявлялась только одна изоформа мАЦ, иммунородственная 6-ой изоформе мАЦ животных. Ее молекулярная масса составляет 182 кДа, но есть основания предполагать, что эта величина принадлежит целому молекулярному комплексу, включающему как минимум саму аденилатциклазу и рецептор, локализованный в мембране. По литературным данным вес соответствующей изоформы АЦ животных составляет 130 кДа [Ishikawa, Homey, 1997], а белки в составе плазмомембраны клеток картофеля обоих исследуемых сортов, которые могут претендовать на роль рецепторов, имеют молекулярные массы от 50 до 15 кДа. Для уточнения параметров данной формы АЦ в дальнейшем необходима дополнительная солюбилизация и очистка исследуемого белка. Но даже имеющиеся результаты позволяют утверждать, что у растений в составе аденилатциклазной сигнальной системы фукционирует, по крайней мере, одна изоформа мАЦ и регуляция концентрации внутриклеточного цАМФ тесно связана с деятельностью кальциевой сигнальной системы.

Для более глубокого понимания механизмов влияния долговременных специфических и неспецифических стрессоров на данную сигнальную систему растения картофеля выдерживали трое суток на среде с добавлением ЭПС Cms, а на проростки пшеницы воздействовали в течение трех суток низкой температурой (10° С). Этого времени должно быть достаточно для синтеза белка de novo в изменившихся условиях. Поскольку и в норме и под воздействием стрессов у данных видов растений выявлялась только одна иммуннородственная мАЦб полоса одинаковой интенсивности, очевидно, что дополнительного синтеза белка за этот временной промежуток не происходило.

Продолжением темы явилось выявление изоформ «растворимой» формы АЦ у растений двух сортов картофеля и тех же двух сортов пшеницы в норме и под воздействием специфических длительных стрессоров. Стрессовые факторы были выбраны такие же, что и при выявлении изоформы мАЦ, иммунородственной 6-ой изоформе мАЦ животных. Исследования проводились с применением моноклональных антител, полученных к N концу каталитического домена рАЦ животных. Результаты показали, что как в норме, так и под воздействием стрессов у растений двух сортов картофеля и двух сортов пшеницы выявлялась одна изоформа рАЦ с молекулярной массой 190 кДа, которая близка к таковой рАЦ животных (187 кДа). Учитывая данные по кинетическим параметрам этой формы фермента, можно заключить, что растительная рАЦ, несмотря на некоторое сходство в аминокислотной последовательности и молекулярной массе, обладает рядом отличий в структуре от рАЦ животных.

В последние годы получила распространение теория о функционировании у животных внутриклеточных сигнальных микродоменов, включающих элементы одной, а возможно и более, сигнальных систем [Zippin et al., 2003; Kamenetsky et al., 2006]. По имеющимся в литературе данным [Zippin et al., 2003; Willoughby, Cooper, 2007], некоторые элементы аденилатциклазной сигнальной системы: рАЦ, ПКА и CREBs, были выявлены в рамках таких микродоменов в митохондиях, ядре и элементах цитоскелета клеток животных. В соответствии с этими результатами упомянутыми авторами было высказано мнение, что мАЦ функционирует только на плазмомембране и с ее помощью осуществляется более медленная, долговременная передача сигнала в ядро, тогда как рАЦ, находясь в органеллах, способствует более быстрой трансдукции сигнала. Однако у растений вопрос внутриклеточной локализации различных форм АЦ до сих пор остается открытым. В этой связи представлялось необходимым выяснить, какие формы АЦ присутствуют в органеллах - носителях генетической информации — в ядре и хлоропластах растительных клеток и как меняется их активность под действием биотического стрессора. Результаты показали, что у растений в хлоропластах и ядре функционируют обе формы АЦ: рАЦ и мАЦ. Выявленная на животных объектах характерная черта «растворимой» формы - активация ионами марганца и бикарбоната, подтвердилась в наших исследованиях на растениях. В хлоропластах эти компоненты являются активными участниками в процессах фотосинтеза: бикарбонат способствует фотосинтетическому транспорту электронов, а также необходим для эффективного включения Мп~ в структуру водоокисляющего комплекса [Климов, 1999]. Кроме того, бикарбонат необходим для поддержания оптимального уровня pH во внутриклеточной среде растений [Wegner, Zimmermann, 2004; Иванов и др., 2007]. В ходе исследований были выявлены сортовые особенности данных форм фермента: у устойчивого к Cms сорта картофеля стимулирование хлоропластной и, в особенности, ядерной рАЦ ионами марганца и бикарбоната проявлялось в гораздо большей степени, нежели у восприимчивого сорта на фоне более низкой базовой активности рАЦ в клетках этого сорта. Было также установлено, что в ядрах и хлоропластах клеток обоих сортов присутствуют мембраносвязанные формы АЦ, поскольку они специфически активировались ионами фторида, причем, как исходная, так и стимулируемая фторидом активность у восприимчивого к патогену сорта была значительно ниже в сравнении с устойчивым сортом.

Опосредованное влияние ЭПС Cms по разному сказалось на активности i обеих форм фермента у растений двух сортов: кратковременная обработка (1 мин) ЭПС Cms корней растений обоих сортов приводила к изменению активности не только «растворимой», но и мембраносвязанной форм АЦ, локализованных в ядрах и хлоропластах. Но у устойчивого сорта происходила их активация в обеих органеллах (в ядрах в большей степени повышалась активность «растворимой» формы, а в хлоропластах — мембраносвязанной), а в клетках восприимчивого сорта ЭПС значительно ингибировали их активность. Полученные результаты позволяют сделать заключение, что в первые минуты на всех этапах восприятия и передачи внутриклеточных сигналов от специфического биотического стрессора аденилатциклазы растений восприимчивого сорта подвергаются ингибированию, что сказывается в дальнейшем на эффективности защитных механизмов.

В развитие темы внутриклеточных сигнальных микродоменов представлялось необходимым изучить локализацию цАМФ относительно возможных мест его синтеза в клетке, что возможно, позволит судить о границах диффузии данного вторичного мессенджера. Кроме того, опираясь на ранее полученные данные о том, что биотический стресс оказывал модулирующее влияние на активность мАЦ и рАЦ и, соответственно, на концентрацию цАМФ, представлялось важным исследовать влияние ЭПС Cms на перераспределение цАМФ во внутриклеточных компартментах клеток картофеля.

Распределение цАМФ (клетки корня растений картофеля) по компартментам клеток существенно отличалось у растений обоих сортов: у устойчивого сорта преобладало в районе плазмалеммы, а у восприимчивого сорта - в эндоплазматическом ретикулуме.

Известно, что концентрация цАМФ в целом у растений имеет волнообразную концентрационную динамику, зависящую от условий произрастания и времени суток [Каримова и др., 1993]. Наши исследования показали, что под воздействием ЭПС внутриклеточное распределение цАМФ изменялось в зависимости от сортовой устойчивости растений картофеля к биотическому стрессору. Так, в клетках устойчивого сорта количество меток к цАМФ в ядре более чем в 20 раз превышало контроль, тогда как у восприимчивого сорта - только в 1,5 раза. Противоположная картина наблюдалась в цитозоле. Это свидетельствует о том, что у устойчивого сорта внутриклеточный сигнал передается в ядро более оперативно по сравнению с восприимчивым сортом. Подтверждением этого служат данные по влиянию ЭПС Cms на кинетические параметры мАЦ и рАЦ клеток корня растений картофеля, и на изменение уровня цАМФ в корнях растений исследуемых сортов через 15 мин воздействия биотического стрессора. Очевидно, такая динамика изменения активности аденилатциклазной сигнальной системы в органеллах косвенно свидетельствует о присутствии в них сигнальных микродоменов, одним из компонентов которых и является данная система.

Для подтвердения этого вывода исследовали локализацию рАЦ во внутриклеточных компартментах растений обоих сортов. Она была выявлена во многих компартментах клеток корня и листа растений обоих сортов растений картофеля: в клеточной стенке, межклетнике, хлоропластах, вакуолях, цитозоле, митохондриях. Особенно интересно' на наш взгляд то, что «растворимая» форма фермента была обнаружена в клеточной стенке и межклетнике. Это является дополнительным доказательством того, что данная сигнальная система участвует в передаче межклеточных сигналов. Для сравнения в клетках животных локализация рАЦ была ранее выявлена в ядре, митохондриях и на элементах цитоскелета [Zippin et al., 2003].

Независимо от вида стресса, восприятие сигнала начинается с контакта стрессора с клеточной стенкой, а затем и плазматической мембраной клетки.

При биотическом стрессе, в частности под воздействием ЭПС Cms, происходит взаимодействие рецепторов клеточных стенок и плазмалеммы с экзометаболитами данного возбудителя. Вероятно, в этом случае основным механизмом регуляции активности мАЦ является небольшое, но достаточное для индукции сигнала количество рецепторов на клеточной стенке и плазмалемме клеток растений устойчивого сорта. При этом активация аденилатциклазной сигнальной системы должна быть связана с Gs-белком -активатором АЦ. Напротив, значительное количество и разнообразие рецепторов к ЭПС у клеток растений восприимчивого сорта, вероятно, обладающих сродством, как к супрессорным, так и к элиситорным компонентам ЭПС [Романенко и др., 1999а, Шафикова и др., 2003], предполагает наличие Gi-белка, ингнбирующего активность мАЦ. Конечно, не следует забывать, что в этой системе имеется фермент, разрушающий цАМФ - фосфодиэстераза, но, поскольку в настоящей работе было показано, что повышение или понижение активности мАЦ совпадают с изменением уровней внутриклеточного цАМФ, можно полагать, что определяющая роль принадлежит аденилатциклазе. При неспецифическом стрессе суть процесса, вероятно, та же самая, за исключением механизма восприятия сигнала, а дифференцирующим началом в данном случае является интенсивность и длительность действующего неблагоприятного фактора.

На этом же этапе происходит перекрестное взаимодействие аденилатциклазного и кальциевого сигнальных путей растений. По литературным данным активность многих кальциевых ионных каналов зависит от концентрации цАМФ в клетке: может как активироваться повышенными концентрациями этого вторичного мессенджера, так и ингибироваться [Zimmerman et al., 1999; Lemtiri-Chlieh et al., 2004]. Кроме того, ЭПС вызывают кратковременное обратимое нарушение клеточного гомеостаза у растений картофеля [Романенко и др., 1996], что также связано с изменением активности ряда ионных каналов. Причем скорость восстановления гомеостаза имеет сортовую зависимость [Романенко и др.,

1996]. Кроме того, многие ионные каналы плазмалеммы реагируют на изменение температуры и осмотического даления [Zimmerman et al., 1999]. В связи с этим становится очевидной и актуальной роль изоформы мАЦ растений, иммунородственной 6-ой изоформе АЦ животных, которая ингибируется физиологическими концентрациями кальция [Cooper et al., 1998]. Таким образом, уже на уровне плазмалеммы происходит формирование сигнального импульса от аденилатциклазной сигнальной системы, действующего, скорее всего, в связке с кальциевым внутриклеточным сигналом. В результате этого происходит значительное, но кратковременное изменение уровня внуриклеточного цАМФ, стимулирующее возникновение целого ряда параллельных и цепных реакций [Kurosaki et al., 1987; Volotovski et al., 1998; Willoughby, Cooper, 2006]. В итоге, как было рассмотрено выше, происходит модуляция активности рАЦ и мАЦ во внутриклеточных компартментах. Кроме того, кальций через кальмодулинзависимое фосфорилирование на длительное время изменяет состояние других ферментов аденилатциклазной сигнальной системы, таких как, фосфодиэстераза цАМФ, Са2+-зависимая протеинкиназа и др. [Rudd, Franklin-Tong, 1999].

Для модуляции активности аденилатиклазной сигнальной системы немаловажное значение имеют также и ионы бикарбоната, способные в определенных концентрациях активировать рАЦ. По имеющимся данным бикарбонат у растений присутствует во внутриклеточном пространстве, где выполняет в числе прочих, функции поддержания внутриклеточного рН [Иванов, 2007].

Представленная цепь событий, очевидно, с опущенными некоторыми элементами, позволяет ответить на вопрос о роли аденилатциклазной сигнальной системы в дифференциации ответов растений при воздействии неспецифического стресса, а также в сортовой устойчивости растений под влиянием специфического стресса.

Все изложенное позволяет сделать вывод о том, что изменение уровня цАМФ у растений под воздействием каких-либо стрессоров может выступать маркером специфичности стресса, а также степени устойчивости к нему сорта.

Биотические и абиотические стрессоры I сс га х о к го х

I 0> ркс

Рис. 64. Участие аденплатцпклазнон сигнальной системы в защитных ответах растнтельныъх клеток.

РКС - рецепторы клеточных стенок; РПМ - рецепторы плазматической мембраны; в - в белок; тмАЦ - транс мембранная аденилатциклаза; рАЦ - растворимая аденилатциклаза; ФДЭ - фосфодиэстераза; ПКА -протешиашаза; ФТ - факторы транскрнпцип; СС - системный ответ.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Ломоватская, Лидия Арнольдовна, Иркутск

1. Аверьянов A.A., Лапикова В.П. Фунгитоксичность систем ферментативного окисления о-диоксифенолов, обусловленная радикалами кислорода// Известия АН СССР, серия биол. 1989. N5. С.776-780.

2. Альберте А., Брей Д.Ю., Льюис Р. и др. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1994. в 3 т.

3. Барковский, Е. В., Ачинович, О. В. Филогенетические взаимоотношения мембраносвязанных аденилатциклаз человека и многоклеточных беспозвоночных животных // Белорусский медицинский журнал. 2003. Т.З. С.15-18.

4. Берестовский Г.Н. Ионные каналы плазмалеммы и тонопласта // Вестник Нижегородского университета, серия биология. 2001. Т. 1. С. 11-15.

5. Берестовский Г.Н., Жерелова О.М., Катаев A.A. Ионные каналы клеток харовых водорослей // Биофизика. 1997. Т. 32. С. 1011-1027.

6. Бияшева А.Э., Молотковский Ю.Г., Мамонов Л.К. Повышение уровня свободного Са+2 в цитозоле растительных протопластов в ответ на тепловой стресс: связь с Са+2 -гомеостазом // Физиол. растений. 1993. Т.40, № 4. С. 613-626.

7. Брехман И. И. Вариационная статистика в спортивной медицине и педагогике. Москва, 1970. 109 с.

8. Булычёв A.A., Крупенина H.A. Влияние потенциала действия на фотосинтез и транспорт протонов растительной клетки. Потенциал действия импульса электрического тока // Докл. ТСХА / МСХА им. Тимирязева. Москва. 2007. Вып. 279, ч. 1. С. 213-216.

9. Ванин А.Ф. Оксид азота в биологии: итоги состояние и перспективы // Биохимия. 1998. Т.63. С.867-879.

10. Ю.Васюкова Н.И., Герасимова Н.Г., Озерецковская О.Л. Роль салициловой кислоты в болезнеустойчивости растений. (Обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. N 5. С. 557-563.

11. П.Васюкова H.И., Медведева Т.Е., Чаленко Г.И., Озерецковска О. JT. Специфическая иммуносупрессия картофеля ß-1,3 р-1,6-глюканами // ДАН СССР.1985. Т. 283. С. 502-505.

12. Васюкова Н.И., Зиновьева C.B., Удалова Ж.В., Панина Я. С., Озерецковская O.JT. Участие салициловой кислоты в системной нематодоустойчивости томатов. // ДАН. 2003.Т. 391, № 2 С. 343-345.

13. П.Васюкова Н. И., Озерецковская O.JT. Индуцированная устойчивость растений и салициловая кислота (обзор) // Прикл. биохим. микробиол. 2007. Т. 43. С. 405-411.

14. Веселов А.П. Чуманкина Е.А. Маркина И.В. Влияние экзогенного пероксида водорода на липооксидацию и ферменты антиоксидантной защиты изолированных хлоропластов гороха// Вестник Нижегородского Университета, серия биология. 2001. С. 164-167.

15. Веселовский В.А., Веселова Т.А., Чернавский Д.С. Стресс растения. Биофизический подход // Физиол. растений. 1993. Т. 40. № 4. С. 553-557.

16. Воденеев В.А., Опритов В.А., Пятыгин С.С. Обратимое изменение внеклеточного pH при генерации потенциала действия у высшего растения Cucurbita pepo II Физиол. растений. 2006.Т. 53. № 4. С. 538-545.

17. Войников В.К., Иванова Г.Г., Рудиковский A.B. Белки теплового шока растений // Физиол. растений. 1984. Т. 31. С. 970-979.

18. З.Волин М.С., Дэвидсон К.А., Камински П.М., Фейнгерш Р.П., Мохаззаб K.M. Механизмы передачи сигнала оксидант-оксид азота в сосудистой ткани//Биохимия. 1998.Т.63. С.958-965.

19. Воронин Д.А., Киселева Е.В. Функциониальная роль белков, содержащих анкириновые повторы// Цитология. 2007. Т.49, № 12. С.989-999.

20. Выскребенцева Э. И., Иванов Г. Г. Аденилатциклаза корнеплода сахарной свеклы: локализация и некоторые свойства // ДАН СССР. 1981. Т. 258, В. 6. С. 1515-1517.

21. Гималов Ф. Р., Чемерис A.B., Вахитов В.А. О восприятии растением холодового сигнала // Успехи совр. биологии. 2004. Т. 124. № 2. С. 185196.

22. Гвоздяк P.E. Полибиотрофия бактерий // Микробиол. журнал. 1981. Т.43. С. 256-262.

23. Гречкин А. Н., Тарчевский И. А. Липоксигеназная сигнальная система //Физиол. растений. 1999. Т.46. С.132-142.

24. Гусев Н.Б. Протеинкиназы: строение, классификация, свойства и биологическая роль // Соросовский образовательный журнал. 2000.Т.6. С.4-12.

25. Деркач К. В., Шпаков А. О., Кузнецова Л. А., ПлесневаС. А., Успенская 3. И., Перцева M. Н. Гормоночувствительная аденилатциклазная система инфузории Dileptus anser II Цитология. 2002. T. 44 № 11. С. 1129—1134.

26. Дмитриев А.П. Сигнальные молекулы растений // Физиол. растений. • 2003.T.50.N.3.C.465-474

27. Доман Н.Г., Феденко Е.П. Биологическая роль циклического АМФ // -Успехи биол. химии.1976.Т.17.С.63-101.

28. Дьяков Ю. Т. Генетика взаимоотношений растений-хозяев и их паразитов // Генетические основы селекции растений на иммунитет / Под ред. Дьякова Ю.Т. М.: Наука, 1973. С. 135-180.

29. Дьяков Ю.Т. Физиология и генетика грибов-паразитов и растений // Успехи совр. микробиол. 1981. Т. 16. С. 215-230.

30. Дьяков Ю. Т. Пятьдесят лет теории «ген-на-ген» // Успехи соврем, биол. -1996. T. 116.С. 293-305.

31. Дьяков Ю.Т., Багирова С.Ф. Что общего в иммунитете растений и животных? //Природа. 2000. № 11. С. 11-15.

32. Дьяков Ю.Т. На пути к общей теории иммунитета // Журнал общей биологии. 2005. Т. 66, № 6. С. 451-458.

33. ЗЗ.Зинченко В.П., Долгачева Л.П. Внутриклеточная сигнализация. Пущино. 2003. 84 с.

34. Иванов Б.Н., Игнатова Л.К., Романова А.К. Разнообразие форм и функций карбоангидразы высших наземных растений // Физиол. раст. 2007. Т. 54. №2. С. 165-185.

35. Ивашкин В.Т., Васильев В.Ю., Северин Е.С. Уровни регуляции функциональной активности органов и тканей. Л.: Наука. 1987.-272 С.

36. Игуменов В.Л., Этингоф Р.Н. Фосфодиэстераза циклических нуклеотидов из проростков пшеницы. Очистка, свойства, влияния системных фунгицидов // Биохимия. 1980.Т.45.Вып. 10. С. 1797-1802.

37. Ильинская Л.И., Озерецковская О. Л. Продукты липоксигеназного окисления жирных кислот как сигнальные молекулы в индуцировании устойчивости растений // Прикл. биохимия и микробиол. 1998. Т.34. № 5. С. 467-479.

38. Каримова Ф.Г., Леонова С.А., Гордон С.А., Фильченкова В.И. Секреция цАМФ клетками растений // Физиол. биохим. культ. растений.1993.Т.25. N.4. С.362-367.

39. Каримова, Ф.Г., Тырыкина, Е. В., Захарова, О. Ю. цАМФ-зависимое фосфорилирование белков гороха, индуцированное форсколином// Физиол. раст. 2005. Т. 52. С. 27-35.

40. Клычников О.И., Драбкин A.B., Василенко О.В. и др. Органицация рецептора фузикокцина в плазмалемме высших растений: взаимосвязь между аффинностью и молекулярной массой // Биохимия. 1998.Т.63,Вып.9.С.1269-1278.

41. Колесниченко A.B., Войников В.К. Белки изкотемпературного стресса растений // ред. Войников В.К. Иркутск. 2003. 196 с.

42. Королев Н. П., Выскребенцева Э.И. Функционирует ли система циклических нуклеотидов в высших растениях? // В кн.: Рост растений. Первичные механизмы. М.: Наука. 1978. С. 178-204.

43. Косицын A.B. Растительная карбоангидраза. // Успехи совр. биол. 1977. Т.83.С. 87- 96.

44. Кошникович В.И. Статистические методы в защите растений // Новосибирск. 2006. 262 с.

45. Кузнецов Вл. В., Кимпел Дж., Гокджиян Дж., Ки Дж. Элементы неспецифичности реакции генома растений при холодовом и тепловом стрессе // Физиол. раст. 1987. Т. 34. № 5. С. 859-867.

46. Кузнецов Вл. В. Общие системы устойчивости и трансдукция стрессорного сигнала при адаптации растений к абиотическим факторам // Вестник Нижегородского Университета, серия биология. 2001. № 1. С. 6569.

47. Кулаева О.Н. Белки теплового шока и устойчивсть растений к стрессу // Соросовский образовательный журнал. 1997. № 2. С. 5-13.

48. Кулинский В.И. Передача и трансдукция гормонального,сигнала в разные части клетки. Соросовский образовательный журнал. 1997. №8. С. 14-19.

49. Кулинский В.И., Колесниченко JI.C. Молекулярные механизмы действия гормонов. I. Рецепторы, нейромедиаторы. Системы со вторыми посредниками //Биохимия. 2005.Т.70. Вып.1.С.33-50.

50. Курганова JT.H., Веселов А.П, Гончарова Т.А., Синицына Ю.В. Перекисное окисление липидов и антиоксидантная система хлоропластов; гороха (Pisum sativum L.) при тепловом шоке //Физиология растений. 1997.Т.44, №.5. С.742-746.

51. Лазарев A.M. Кольцевая гниль. Методические указания по диагностике черной ножки и кольцевой гнили картофеля. Ленинград. 1988.

52. Ломоватская Л. А. Особенности развития инфекционного процесса на начальном и завершающем этапах патогенеза кольцевой гнили картофеля. // Автореферат дисс. . к-та биол. наук. — Иркутск. 2001. 21с.

53. Ломоватская Л. А., А. С. Романенко, Н. В. Криволапова, В. Н. Копытчук, Р.К. Саляев. Возможная роль эндогенного цАМФ картофеля в развитии системного сигнала при патогенезе кольцевой гнили // ДАН. 2004. Т. 394. №5. С. 715-717.

54. Ломоватская Л.А., A.C. Романенко, H.B. Криволапова. Упрощенный метод определения цАМФ в растениях с помощью модифицированного иммуноферментного анализа// Известия РАН. Серия биол. 2005. № 6. С.1-4.

55. Ломоватская Л.А., A.C. Романенко, Н.В. Филинова, В.Н. Копытчук, Р.К. Саляев. Выявление «растворимой» аденилатци клазы в растениях картофеля // ДАН. 2008. Т. 420. № 3. С. 412-414.

56. Лось Д.А. Восприятие сигналов биологическими мембранами: сенсорные белки и экспрессия генов //Соросовский образ, журнал. 2001. Т. 7, № 9. С. 14-22.

57. Луцик М.Д., Панасюк E.H., Луцик А.Д. Лектины. Львов: Вища шк. 1981.154 с.

58. Любимова Н.В., Салькова Е.Г. Лектин-углеводное взаимодействие во взаимоотношениях растение-патоген //Прикл. биохимия и микробиология. 1998.Т.ХХ1У.вып.5. С.134-139.

59. Медведев С. С. Электрофизиология растений // 1998. Изд-во С-Петербургского ун-та. 181с.

60. Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К., Реутов В.П. Оксид азота и NO-синтазы в организме млекопитающих при различных функциональных состояниях // Биохимия. 2000. Т.65, Вып.4. С. 485-503.

61. Мерзляк М.Н. Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки // Итоги науки и техники. Сер. Физиология растений. М. 1989 Т. 6. 167 с.

62. Метлицкий Л.В., Дьяков Ю.Т., Озерецковская O.A. Двойная индукция -новая гипотеза иммунитета растений к фитофторозу и сходным болезням // ДАН. 1973. Т.213, N.3. С. 209-212.

63. Молчан О.В., Соколовский С.Г., Волотовский И.Д. Циклическая АМФ и фитохромная регуляция его эндогенного уровня в проростках овса // Физиология растений. 2000. Т. 47, №4 С.531-537.

64. Найдун С.Н., Юрин В.М. Изменение свойств калиевых каналов плазмалеммы клеток Nitellaßexilis после воздействия гипер- и гипотермии // Ученые записки БГМУ. 2002. №4. С. 18-27.

65. Одинцова И. Н. Генетика устойчивости к фитопатогенам // Успехи современной генетики. 1994. Т.З, N 19. С. 119-132.

66. Озерецковская О. Л. Проблемы специфического фитоиммунитета // Физиол. растений. 2002 Т. 49. С. 148 -154.

67. Орлов С. Н., Максимова Н. В. Выброс клетками циклического аденозинмонофосфата: механизм и физиологическое значение // Биохимия. 1999.Т.64. Вып.2.С. 164-173.

68. Патрушев Л.И. Экспрессия генов.М.: Наука. 2000. 528 с.73 .Плотникова Л.Я. Иммунитет растений и селекция на устойчивость к болезням и вредителям // 2007. М. КолосС, 359 с.

69. Полевой B.B. Физиология целостности растительного организма // Физиология растений. 2001. Т. 48, № 1. С. 631-643.

70. Полесская О.Г. Растительная клетка и активные формы кислорода. 2007. Уч. пособие. Москва.: «КДУ», 140 с.

71. Попкова К.В. Общая фитопатология // 1989. 399 с.

72. Пронина Н. А., Семененко В. Е. Локализация связанной карбоангидразы в мембранах клеток хлореллы // Физиол. раст. 1988. Т. 35. С. 51-61.

73. Пустовалова Л.М. Практикум по биохимии. 1999. Ростов-на-Дону.: Феникс, 324 с .

74. Пятыгин С.С. Электрогенез клеток растений в условиях стресса // Успехи соврем, биол. 2003. Т. 123, № 6. С. 552-562.

75. Пятыгин С. С. Особенности сигнальной роли потенциала действия у высших растений // Успехи современ. биол. 2007. Т. 127. № 3. С. 293-298.

76. Пятыгин С.С. Стресс у растений: физиологический подход // Ж. общ. биологии. 2008. Т. 69. № 4. С. 294-298.

77. Пятыгин С.С. Распространяющиеся электрические сигналы в растениях// Цитология. 2008. Т.50, № 2. С. 154-159.

78. Ретивин В.Г., Опритов В.А., Федулина С.Б. Предадаптация тканей стебля • Cucurbita pepo к повреждающему действию низких температур, индуцированная потенциалом действия // Физиология растений. 1997. Т. 44, №4-С. 499-510.

79. Романенко A.C., Граскова И.А., Рифель A.A., Копытчук В.Н., Раченко М.А. Стабилизация корнями картофеля pH среды, смещаемого возбудителем кольцевой гнили // Физиология растений. 1996. T.43.N.5. С.707-712.

80. Романенко A.C., Рымарева A.B., Шафикова Т.Н. Компоненты оболочек клеток картофеля, обладающие сродством к токсину возбудителя кольцевой гнили // ДАН. 1998. Т.358, N.2. С.277-279.

81. Романенко A.C., Рымарева A.B., Копытчук В.Н., Екимова Е.Г., Собенин A.M. Характеристика экзополисахаридов возбудителя кольцевой гнили и афинных к ним сайтов оболочек клеток картофеля // Биохимия. 1999а. Т.64. Вып. 10.С. 1370-1376.

82. Романенко A.C., Ломоватская Л.А., Граскова И.А. Некрозы как необычные симптомы кольцевой гнили картофеля. // Физиол. раст. 2002. Т. 49, №5. С. 773-778.

83. Романенко A.C., Рифель A.A., Саляев Р.К. Эндоцитоз экзополисахаридов возбудителя кольцевой гнили картофеля клетками растения-хозяина //Доклады АН. 2002. Т. 386. №1. С. 139-141

84. Рубан Е.Л. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas // Москва. 1986. 178 е.- С.67.

85. Рымарева Е.В., Донская А.Е., Сухарева О.Н., Романенко A.C. Антибактериальная активность низкомолекулярных белков клубней картофеля.// Физиол. биохим. культ, растений. 2005. Т. 37, №. 2. С. 147151.

86. Савинов А.Б., Курганова Л.Н., Шекунов Ю. И. Интенсивность перекисного окисления липидов у Taraxacum officinale wigg. и Vicia cracca L. в биотопах с разными уровнями загрязнения почв тяжелыми металлами // Экология. 2007. № 3. С. 191-197.

87. Самуилов В.Д., Олескин A.B., Лагунова Е.М. Программируемая клеточная смерть //Биохимия. 2000.Т.65. N.8.C.1029-1046.

88. Селье Г. На уровне целого организма. М. : Наука, 1972.-122 с.

89. Семенов В.В., Каримова Ф.Г., Сабирова Л.Р., Леонова С.А. Предсинтетический период клеточного цикла. Уровень эндогенного цАМФ, интенсивность репарации мутагенеза // Цитология и генетика. 1993. N. 1 .С.28-32.

90. Судьина Е.Г., Лозовая Г.И. Основы эволюционной биохимии растений.-Киев: Наукова думкаЛ 982.360 с.

91. Тарчевский И. А. Метаболизм растений при стрессе // 2001. Казань: Фэн. -448 с.

92. Тарчевский И. А. Влияние элиситоров на ионные потоки и электрические потенциалы растений // Вестник Нижегородского Университета, серия биология. 2001а. С. 61- 64.

93. Тихонова Л. И. Ионные каналы вакуолярной мембраны высших растений //Биол. мембраны. 1998. Т. 15. С. 245-257.

94. Урманцев Ю. А., Гудсков Н. Л. Проблема специфичности и неспецифичности ответной реакции растений на повреждающее воздействие //Журн. Общ. биол. 1986. Т. 46. №3. С. 337-349.

95. Филиппов П.П. Как внешние сигналы передаются внутрь клетки // Соросовский образовательный журнал. 1998. N.3. С.28-34.

96. Феденко Е.П., Иванова М.А., Доман Н.Г. Аденилатциклаза и фитохром //ДАН. 1983. T.269.N.5. С. 1267-1268.

97. Холл М.А., Новикова Г.В., Мошков И.Е., Мур Л.А.Дж., Смит А.Р. Протеинкиназы растений в трансдукции абиотических и биотических сигналов // Физиол. раст. 2002. Т. 49, № 1. С. 123-135.

98. Чиркова Т. В. Физиологические основы устойчивости растений. СПб.:Изд-во СПб ун-та. 2002. 240 с.

99. Чумаков М.И. Участие поверхностных полисахаридов и белков бактерий семейства Rhizobiacea в адсорбции и прикреплении к поверхности растений // Микробиология. 1996. Т.65. N6. С.725-739.

100. Шакирова Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция // Изд-во «Гилем». Уфа. 2001. 159 с.

101. Шакирова Ф.М., Сахабутдинова А. Р. Сигнальная регуляция устойчивости растений к патогенам.// Успехи соврем, биологии. 2003. Т. 123. С.563-572.

102. Шафикова Т.Н. Экзополисахариды кольцевой гнили картофеля и их взаимодействие с рецепторами плазмалеммы клеток растения-хозяина: Автореферат дисс. . к-та биол. наук. Иркутск. 2003. 23с.

103. Шафикова Т.Н., Романенко A.C., Боровский Г.Б. Рецепторы плазмалеммы клеток картофеля к экзополисахаридам возбудителя кольцевой гнили // Физиология растений.2003.T.50.N.2.С.246-250.

104. Шафикова Т.Н., Эпова Е.Ю., Романенко A.C., Саляев Р.К. Обнаружение внеклеточных протеиназ у возбудителя кольцевой гнили картофеля // ДАН. 2009. Т. 425, № 2. С. 1-3.

105. Шишова М.Ф., Линдберг С., Полевой В.В. Активация ауксином транспорта Са2+ через плазмалемму растительных клеток // Физиология растений. 1999. Т. 46, № 5. С. 718-727.

106. Шпаков А.О. Структурно-функциональная организация аденилатциклаз одноклеточных эукариот // Цитология. 2007. Т. 49. № 2. С. 91-106.

107. Юрин В.М., Иванченко В.М., Галактионов С.Г. Регуляция функций мембран растительных клеток. 1977. Минск: Наука и техника. 254 с.

108. Этингоф Р.Н., Думлер И.Л. Функциональная и структурная характеристика фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов // Циклические нуклеотиды. Тез. докл. IV Всесоюзного симпозиума. Минск. 1982. С. 172.

109. Яворская В.К., Калинин Ф. Л. О функционировании цАМФ-регулирующей системы в растениях//Физиология и биохимия культ, растений. 1984.T.16.N.3. С. 217-229.

110. Яворская В.К. Физиологическая роль 3',5'-цАМФ в растительных клетках // Автореферат дисс. . д-ра биол. наук. Киев. 1990. 35

111. Янович В.И. Особенности биологии возбудителя кольцевой гнили картофеля Corinebacterium sepedonicum и меры борьбы с ней в условиях Белоруссии//Автореф.дис.канд.биол.наук. 1971. Минск. 24 с.

112. Adams S.R., Harootunian A.T., Buechler Y.J., Taylor S.S., Tsien R.Y. Fluorescence ratio imaging of cyclic AMP in single cells // Nature. 1991. V.349. P.694-697.

113. Aducci P., Marra M., Fogliano V., Fullone M.R. Fusicoccin receptors: perception and transduction of the fusicoccin signal // J. Exp. Bot. 1995.V.46, N.291.P.1463-1478.

114. Albersheim P., Anderson-Prouty A. Carbohydrates, proteins, cell surfaces and the biochemistry of pathogenesis. // Annu. Rev. Plant Physiol. 1975. V.2. P. 31-52.

115. Ali R., Ma W., Lemtiri-Chlieh F., Tsaltas D., Leng Q., von Bodman S., Berkowitz G.A. Death Don't Have No Mercy and Neither Does Calcium: Arabidopsis CYCLIC NUCLEOTIDE GATED CHANNEL2 and Innate Immunity//Plant Cell. 2007. V.19. P.1081-1095.

116. Amrhein N. Evidence against the occurrence of adenosine 3',5'-ceclic monophoshate in higher plants // Planta.l974.V.l 18.N.24. P.241-258.

117. Amrheim N. The current status of cyclic AMP in higher plants I I Annu. Rev. Plant Physiol. 1977.V.28.P. 123-132.

118. Amsterdam A., Gold R., Hosokawa K., Yoshida Y., Sasson R., Jung Y., Kotsuji F. Crosstalk among multiple signaling pathway controlling ovarian cell death // TEM.1999. V. 10. N 7. P. 255-262.

119. Antoni F.A., Smith S.M., Simpson J., Bosie R., FinkG., Paterson J.M. Calcium control of adenylyl cyclase: the calcineurin connection.// Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 1998. V. 32. P. 153-172.

120. Arazi T., Sinkar R., Kaplan B., Fromm H. A Tobacco plasma membrane calmodulin-binding transporter confers Ni2+ tolerance and Pb2+ hypersensitivity in transgenic plants // Plant J.1999.V.20.P.171-182.

121. Assman SG. Protein regulation of disease resistance during infection of rice with rice blast fungus. Sci STKE. 2005. V. 205. P. 13-21.

122. Axtell MJ, Staskawicz BJ. Initiation of RPS2-specified disease resistance in Arabidopsis is coupled to the AvrRpt2-directed elimination of RIN4.// Cell. 2003. V. 112. P. 369-77.

123. Baer D., Gudmastad N.C. In vitro cellulotic activity of the plant pathogen Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus II Can. J. Microbiol. 1995 .V.41.P.877-888.

124. Baluska F., Samaj J., Wojtaszek P., Volkman D., Menze D. Cytoskeleton-plasma membrane-cell wall continuum in plants. Emergins links revisited // Plant Physiol. 2003. V. 133. P. 482-491.

125. Barbier-Brygoo H., Ephritikhine G., Klambt D., Maurel C., Palme K., Schell J., Guern J. Perception of the auxin signal at the plasma membrane of tobacco mesophyll protoplasts // Plant J. 1991. V.l. P. 83-93.

126. Barrero R.A., Umeda M., Yamamura S., Uchimiya H. Arabidopsis CAP regulates the actin cytoskeleton necessary for plant cell elongation and division //Plant Cell. 2002. V. 14. P. 146-163.

127. Barco A., Alarcon J.M, Kandel E.R. Expression of constitutively active CREB protein facilitates the latephase of long-term potentiation by enhancing synaptic capture // Cell. 2002. V. 8, is. 108. P. 689-703.

128. Bates G.W., Goldsmith M.H.M. Rapid response of the plasma membrane potential in oat, Avena sativa, coleoptiles to auxin and other weak acids // Planta. 1983. V.159. P. 231-237.

129. Beaulieu C., Boccara M., Van Gijsegem F.Pathogenic behavior of pectinase-deficient Erwinia chysanthemi mutants on different plants // Mol.Plant -Microb.Interact. 1993. V.6, N.l. P. 197-202.

130. Beffagna N., Lutzu L. Inhibition of catalase activity as an early response of Arabidopsis thaliana cultured cells to the phytotoxin fusicoccin // J. Exp. Bot. 2007. V. 58. P.4183-4194.

131. Bent A. Plant desease resistans genes: function meets structure // Plant Cell. 1996.V.8, N.10. P.1757-1771.

132. Bermpohl A., Dreier J., Bahro R., Eichenlaub R. Exopollyssaccharide in the pathogenic interaction of Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis with tomato plants // Microbial. Res. 1996.V.151.- P.l-9.

133. Besson-Bard A., Courtois C., Gauthier A., Dahan J., Dobrowolska G., Jeandroz S., Pugin A., Wendehenne D. Nitric oxid in plants: production and cross-talk with Ca2+ signaling // Molecular Plant. 2008 V.l. N. 2. P. 218-228.

134. Bevensee M.O., Schmitt B.M., Choi I., Romero M.F., Boron W.F. An electrogenic Na-HCO~3 cotransporter (NBC) with a novel COOH-terminus, cloned from rat brain// J. Physiol. Cell Physiol. 2000. V. 278. P. 1200-1211.

135. Bindschedler L.V., Minibaeva F., Gardner S.L., Gerrich C., Davies D. R., Bolwell G.P. Early signaling events in the apoplastic oxidative burst in suspension cultured French bean cells involve cAMP and Ca ~ // New Phytologist. 2001. V. 2001. P.l-10.

136. Bhalta, S.C., Chopra, R.N. Subsellular localization of adenylate cyclase in the shoot apices of Bryum argenteum Hedvv. //Ann. Botany . 1984. V. 54. P. 195-200.

137. Blatt M.R., Thiel G. K+ channels of stomatal guard cells: bimodal control of the K+ inward-rectifier evoked by auxin. // Plant J. 1994 V. 5. P. 55-68.

138. Blatt M. R., Grabov A. Signal redundancy, gates and integration in the control of ion channels for stomatal movement. // J. Exp. Bot. 1997. V. 48. P. 529-537.

139. Blume B., Nürnberger T., Nass N., Scheel D. Receptor-Mediated Increase in Cytoplasmic Free Calcium Required for Activation of Pathogen Defense in Parsley//Plant Cell. 2000.V.12. P. 1425-1440.

140. Bohnert H., Nelson D., Jensen R.G. Adaption to Environmental Stresses // Plant Cell. 1995. Vol. 7. P. 1099-1111.

141. Boks N. P., Norde W., van der Mei Y.C., Busscher H. J.Forces involved in bacterial adhesion to hydrophilic and hydrophobic surfaces // Microbiology. 2008. V. 154. P. 3122-3133.

142. Bowler C, Neuhaus G., Yamagata H., Chua N. -H. Cyclic GMP and calcium mediate phytochrome phototransduction // Cell. 1994. V. 77. P.73-81.

143. Bolwell G.P. Cyclic AMP, the reluctant messenger in plants // TIBS. 1995.V.20. P. 492-495.

144. Braun C.J., Siedow J.N., Williams M.E., Levings C. S. D. Mutations in the maize mitochondrial T-urfl3 gene eliminate sensitivity to a fungal pathotoxin 11 Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1989. V. 86. P.4435-4439.

145. Breitenbach M., Laun P., Gimona M. The actin cytoskeleton, RAS -cAMP signaling and mitochondrial ROS in yeast apoptosis // Trends Cell Biology. 2005. V.3.P.637- 639.

146. Breton S. The cellular physiology of carbonic anhydrases // J. Pancreas, (online) 2001. V.2. P.159-164.

147. Broglie K., Gaynor J., Broglie R. Ethilene-regulated gene expression: molecular cloning of genes encodding on endochitinase from Phaseolus vulgaris // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1986. V.83. P.6820 -6824.

148. Brown E.G., Newton R.P. Occurrence of adenosine 3':5'-cyclic monophosphate in plant tissues // TIBS. 1973. V.12. N.l 1. P.2683-2685.

149. Brown E.G., AI-Najafi T., Newton R.P. Cyclic nucleotide phosphodiesterase activity in Phaseolus vulgaris //Phytochemistry.l977.V.16. N.9. P.1333-1337.

150. Brown E.G., Newton R.P., Smith C.I. A cyclic AMP binding-protein from barley seedlings // Ibid., 1980. V.19. N.ll. P.2263-2267.

151. Brownlee C. Plant K+ Transport: Not Just an Uphill Struggle. 1999.

152. Buck J., Sinclair M.L., Schapal L., Cann M. J., Levin L. R. Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammalians // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 79-84.

153. Bundschedler L.V., Minibayeva F., Gardner S.L., Gerrish C., Davies D.R., Bolwell G.P. Early signaling events in the apoplastic oxidative burst in suspension cultured Freanch bean cells involve cAMP and Ca // New Phytologist. 2001. V. 151. P. 185-194.

154. Bush D. S. Regulationof cytosolic calcium in plants // Plant Physiol. 1993. V. 103. P. 7-13.

155. Caetano Anoles G., Favelukes G. Host-simbiotic specificity expressed during early adsorption of Rhizobium meliloti to the root surface of alfaalfa // Appl.Environ. Microbiol. 1986. V. 52, N2. P.377-382.

156. Cali J.J., Zwaagstra J.C., Mons N., Cooper D.M., Krupinski J. Type VIII adenylyl cyclase. A Ca / calmodulin -stimulated enzyme expressed in discrete regions of rat brain. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 12190-12195.

157. Carricarte V.C., Bianchin G.M., Muschietti J.P. Adenilate cyclase activity in a higher plant, alfalfa (Medicago sativa) // Biochem. J. 1988. V. 249. P. 807811.

158. Catterall W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca channels // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2000. V.16. P. 521-555.

159. ChaloupkaJ.A., Bullock S.A., Iourgenko V., Levin L.R., Buck J. Autoinhibitory regulation of soluble adenylyl cyclase // Molecular Reproduction Development. 2005. V. 73. P. 361 -368.

160. Chaudrhry F., Guerin C., Witsch von M., Blanchoin L., Staiger C.J. Identification of Arabidopsis cyclase associated protein 1 as the first nucleotide exchange factor for plant actin // MBC. 2007. V. 18.is. 8. P. 3002-3014.

161. Chen J., Iyengar R. Inhibition of cloned adenylyl cyclases by mutant-activated Gi-cc and specific suppression of type 2 adenylyl cyclase inhibition by phorbol ester treatment // J. Biol. Chem. 1993.V. 268. P. 12253-12256.

162. Chinusamy V., Schumaker K., Zhu J-K. Molecular genetic perspectives on cross-talk and specificity in abiotic stress signaling in plants // J. Exp. Bot. 2004. V. 55. P. 225-236.

163. Cho M.J., Vaghy P.L., Kondo R., Lee S.H., Davis J.P., Rehl R., Heo W.D., Jonson J.D. Reciprocal regulation of mammalian nitric oxide synthase and calcineuring by plant calmodulin isoforms // Biochem. 1998. V.37. P. 1559315597.

164. Choi E-J., Xia Z., Storm D.R. Stimulation of the type 3 olfactory adenylyl cyclase by calcium and calmodulin. //Biochemistry. 1992. V. 31. P. 6492-6498.

165. Colledge M., Scott J.D. AKAPs: from structure to function //Trends Cell Biol. 1999. V. 9. P. 216-221.

166. Collmer A., Bauer D. Erwinia chrysanthemi and Pseudomonas syringae: plant pathogens trafficking in extracellular virulence proteins // Current Topics in Microbiology and Immunology. 1994. V.192, N1. P.43-69.

167. Conconi A.M., Browse J.A., Ryan C.A. Intracellular levels of free linolenic and linoleic acids increase in tomato leaves in response to wounding // Plant Physiol. 1996.V.l 11, N.3. P.797-803.

168. Cooke C.J., Smith C.J., Walton T.J., Newton R.P. Evidence that cyclic AMP is involved in the hypersensitive response of Medicago sativa to a fungal elicitor // Phytochemistry. 1994. V. 35. P. 889-894.

169. Cooper DMF, Mons N, Karpen JW. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signaling //Nature. 1995. V. 374. P. 421-424.

170. Cooper DM, Karpen JW, Fagan KA, Mons NE. Ca2+-sensitive adenylyl cyclases // Adv. Second Messenger Phosphoprotein Res. 1998. V.32. P. 23-51.

171. Cooper DMF. Compartmentalization of adenylyl cyclase and cAMP signaling//Biochem. Soc. Trans. 2005. V. 33. P. 1399-1322.

172. Courtois C., Besson A., Dahan J., Bourque S., Dobrowolska G., Pugin A.,1A

173. Wendehenne D. Nitric oxide signalling in plants: interplays with Ca and protein kinases // Mol. Plant. 2008. V. 1. N. 2. P. 218-228.

174. Cousson A. Pharmacological evidence for the implication of both cyclic GMP-dependent and independent transduction pathways within ayxin-induced stomatal opening in Commelina communis (L.) // Plant Sci. 2001. V. 161. P.249-258.

175. Creelman R.A., Mullet J.E. Jasmonic acid distribution and action in plants: regulation during development and response to biotic and abiotic stress // Proc. Natl.Acad.Sci. 1995.V.92. N. 10. P. 4114- 4119.

176. Curvetto N., Darjania L., Delmastro S. Effect of two cAMP analogues on stomatal opening in Vicia faba\ relationship with cytosolic calcium concentration // Plant Physiol. Biochem. 1994.V.32. P.365-372.

177. Dahse I., Sack H., Bernstein M., Petzold U., Muller U., Vorbrodt H. M., Adam G. Effects of (22S,23S)-Homobrassinolide and Related Compounds on

178. Membrane Potential and Transport of Egeria Leaf Cells // Plant Physiol. 1990.V. 93. P. 1268-1271.

179. Danchin A. Phylogeny of adenylyl cyclases // Adv. Second messenger Phosphoprotein Res. 1993. V. 27. P. 109-162.

180. Dazzo F., Tmchet G., Sherwood J., Hrabac E., Abe M., Pankratz S. Specific phases of root hair attachment in the Rhizobium trifolii- clover symbiosis // Appl. Environ. Microbiol. 1984.V. 48, N 6. P. 1140-1150.

181. Defer N., Best-Belpomme M., Hanoune J. Tissue specificity and physiological relevance of various isoforms of adenylyl cyclase // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. // 2000. V. 279. P. 400-416.

182. Delaney T.P, Friedrich L . Ryals J.A. Arabidopsis Signal Transduction Mutant Defective in Chemically and Biologically Induced Disease Resistance // Proc. Natl.Acad.Sci. 1995.V. 92. P. 6602-6606.

183. Delledone M., Xia Y., Dixon R.A., Lamb C. Nitric oxide function as a signal in plant disease resistance // Nature. 1998.V.394. N. 6693. P. 585-588.

184. Denarie J., Debelle F., Rosenberg C. Signaling and host range variation in nodulation // Annu. Rev. Microbiol. 1992. V. 46. P. 497-531.

185. Denny T. Involvement of bacterial polysaccharides in plant pathogenesis // Annu. Rev. Phytopathol. 1995. V.33. P. 173-197.

186. Deising H., Nicholson R., Haug M., Howard R., Mendgen K. Adhesion pad formation and the involvment of cutinase and esterases in the attachment of uredospores to the host cuticle // Plant Cell. V. 4, N6. P. 1101-1111.

187. Dessauer C.W., Scully T.T., Gilman A.G. Interactions of forskolin and ATP with the cytosolic domains of mammalian adenylyl cyclase // J. Biol. Chem.1997. V.272. P. 22272-22277.

188. Dessauer C.W., Tesmer J.J., Sprang S.R., Gilman A.G. Identification of a Gk binding site on type V adenylyl cyclase // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 25831-25839.

189. Diedhiou C.J., Golldack D. Salt-dependent regulation of chloride channel transcripts in rice // Plant Science. 2005. V.170. P. 793-800.

190. Doke N, Miura Y, Sanchez LM, Park H.J, Noritake T, Yoshioka H, Kawakita K. The oxidative burst protects plants against pathogen attack: Mechanism and role as an emergency signal for plant bio-defence // Gene. -1996.V.7., N 179. P. 45-51.

191. Dziubinska H., Trebacz K., Zawadzki T. Transmission route for action potentials and variation potentials in Helianthus annuus L. // J. Plant Physiol. 2001. V. 158. P. 1167—1172.

192. Ebel J., Cosio E. G. Elicitors of plant defense responses // Int. Rev. Cytol.1994. V.148. P.1-36.

193. Eckstein F., Romaniuk P.J., Heideman W., Storm D.R. Stereochemistry of the mammalian adenylate cyclase reaction.// J. Biol. Chem. 1981. Vol. 256. P. 9118-9120.

194. Edelhoff S., Villacres E.C., Storm D.R., Disteche C.M. Mapping of adenylyl cyclase genes type I, II, III, IV, V, and VI in mouse // Mammalian genome.1995. V. 6. P. 111-113.

195. Ehsan H., Reichheld J.P., Roef L., Witters E., Lardon F., Van Bockstaele D., VanMontagy M., Inse D., VanOnckelen H. Effect of indomethacin on the cell cycle-depend cyclic AMP fluxes in tobacco BY-2 cells // FEBS Letters. 1998.V.422. P. 165-169.

196. Ellingboe A. Genetics and physiology of primary infection by Erysiphe graminis //Phytopathology. 1972. V.62, N3. P.401-406.

197. Enyedi A.J., Talpani N., Silverman P., Raskin I. Signal molecules in systemic plant resistance to pathogens and pests // Cell. 1992.V.70, N.6. P.879-886.

198. Fairley-Grenot K., Assman S. M. Evidence for G protein regulation of inward K+ channel current in guard cell of fava bean // Plant Cell. 1991. V.3. P. 1037-1044.

199. Farmer E.E., Weber H., Vollenweider S. Fatty acid signaling in Arabidopsis // Planta. 1998. V. 206. N. 1-2. P. 167-174.

200. Federman AD, Conklin BR, Schrader KA, Reed RR, Bourne HR.Hormonal stimulation of adenylyl cyclase through Gi-protein subunits// Nature. 1992. V. 356. P.159-161.

201. Fehr T.F., Dickinson E.S., Goldman S.J., Slakey L.L. Cyclic AMP efflux is regulated by occupancy of the adenosine receptor in pig aortic smooth muscle cells // J. Biol. Chem. 1990.V.265. N. 19. P. 1097-10980.

202. Felle H. H., Zimmermann M. R., Sistemic signaling in barley through action potentials // Planta. 2007. V. 226. P. 203-214.

203. Feng, Q., Zhung Y., Li, Y., Liu, Z., Zuo, J., Fang, F. Two domains are critical for the nuclear localization of soluble adenylyl cyclase // Biochimie. 2006. V. 88. P. 319-328.

204. Flaishman M., Kolattukudy P. Timing of fungal ivasion using host's ripening hormone as a sygnal // Proc Nat. Acad. Sci.USA. 1995.V.91. P.6579-6583.

205. Flor H. The complementary genik systems in flax rusts // Adv. Genet. 1956.V. 8. P. 29-54.

206. Flor H. The inheritance of X-ray induced mutation to virulence in a uredospore culture of race 1 of Melampsora lini II Phytopathology. 1960.V. 50, N5. P.603-605.

207. Frietsch S, Wang Y.-F., Sladek C., Poulsen L. R., Romanowsky S. M., Schroeder J. I., Harper J. F. A cyclic nucleotide-gated channel is essential for polarized tip growth of pollen II Proc. Natl. Acad. Sei. 2007. V.104. P. 14531 -14536.

208. Fromm J., Spanswick R. Characteristics of action potentials in willow (Salix viminalis L.). // J. Exp. Bot. 1993. V. 44. P. 1119—1125.

209. Gabriel D., Rolf B. Working models of specific recognition in plant-microbe integration//Annu. Rev. Phytopathol. 1990.V.28. P.365-391.

210. Gao B.N., Gilman A.G. Cloning and expression of a widely distributed (typ IV) adenylyl cyclase // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991. V. 88. P. 1017810182.

211. Gaymard F., Cerutti M., Horeau C., Lemailett G., Urbach S., Ravellec M. The baculovirus/insect cell system as an alternative to Xenopus oocytes // J. Biol. Chem. 1996. V. 272. P. 22863-22870.

212. Geier G., Geider K. Die levansucrase aus virulenz faktor bei der Feuerbrandentstehung // Mitt. Biol. Budesanst.land-und Forswirt. BerlinDahlem. 1992. B. 282. S.78-81.

213. Gelli A., Higgins V.J., Blumwald E. Activation of plant plasma membrane Ca2+-permeable channels by race-specific fungal elicitors. // Plant Physiol. 1997. V. 113. P. 269-279.

214. Genin, S., B. Brito, T. P. Denny, and C. Boucher. // Control of the Ralstonia solanacearum type III secretion system (Hrp) genes by the global virulence regulator PhcA //FEBS Lett. 2005. V. 579. P. 2077-2081.

215. Genoud T., Trevino Santa Cruz M.B., J-P. Metraux. Numeric simulation of plant signaling networks // Plant Physiol. 2001. V. 126. P. 1430-1437.

216. Gerbino A., Ruder W.C., Curci S., Pozzan T., Zaccolo M., Hofer A. M. Termination of cAMP signals by Ca+2and G, via extracellular Ca +2 sensors: a link to intracellular Ca +2 oscillations // J. Cell Biol. 2007. V. 20. P. 303-312.

217. Giannattasio M., Carraty G., Tucci G.F. Presence of cyclic-AMP-binding protein in Jerusalem artichoke rhizome tissvie // FEBS Let. 1974. V.49, N.2. P.249-253.

218. Gilman A.G. A protein binding assay for adenosine 3',5'-cyclic monophosphate//Proc. Natl. Acad. Sci. 1970.V.67, N.l. P. 305-312.

219. Girardean J. Adherence bacterienne // 6'eme Reun microbiol.' INRA.Versalles. 1982. P. 9-12.

220. Goodman R., NovackyA. The hypersensitive reaction in plants to pathogens. A resistance phenomenon // USA, APS Press. 1994. p.243.

221. Gough C., Dow J., Barber C., Daniels M. Cloning of two endoglucanase genes of Xanthomonas campestris pw.campestris: analysis of the role major endoglucanase in pathogenesis // Mol. Plant Microb Interact. 1988.V.1. P.275-281.

222. Graskova I. A., Epova K. Y., Kusnetsova E.V., Kolesnichenko A.V., Voinikov V. K. Weak-associated with cell wall peroxidase during the root infection // J. Stress Physiol. Biochem. 2008. V. 8. N. 1. P.4-10.

223. Gu C., Cooper D. M. Calmodulin -binding sites on adenylyl cyclase type VIII. //J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 8012-8021.

224. Gundlach H., Müller M.J., Kutchan T.M., Zenk M.H. Jasmonic acid is a signal transducer in elicitor-induced plant cell cultures // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1992. V. 89. P. 2389-2393.

225. Hubberstey A.V., Motillo E.P. Cycase-associated proteinsö capacity for linking signal transduction and actin polimarization // FASEB J. 2002. V. 16. P.487-499.

226. Hahlbrock K., Scheel D., Logemann E., Nürnberger T., Parniske M., Reinhold S. Oligopeptide elicitor-mediated defense gene activation in cultured parsley cells // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1995. V.92. P. 4150-4157.

227. Hampton M.B., Orrenius S. Dual regulation of caspase activity by hydrogen peroxide: implications for apoptosis // FEBS Letters. 1997. V. 414, N 3. P. 552556.

228. Hanoune, J., Pouille Y., Tzavara E., Shen T., Lipskaya L., Miyamoto N., Suzuki Y., Defer N. Adenylyl cyclases: structure, regulation,and function in an enzyme superfamily//Mol. Cell. Endocrinol. 1997. V.128. P. 179-194.

229. Harada H, Nalcajima K, Sakaue K, Matsuda Y. C02 sensing at ocean surface mediated by cAMP in a marine diatom. Plant Physiol // 2006. V. 142. P. 13181328.

230. Hardie D.G.// Plant protein serine/threonine kinases: classificationand function//Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1999. V.50. P. 97-131.

231. Harr}' A., Chen Y, Magnusson R., Iyengar R., Weng G. Differential regulation of adenylyl cyclases by Gas // J. Biol. Chem. 1997. V.272. P.19017-19021.

232. Hacker B.M., Tomlinson J.E., Wayman G.A., Sultana R., Chan G., Villacres E., Disteche C., Storm D.R. Cloning, chromosomal mapping, and regulatory properties of the human type 9 adenylyl cyclase (ADCY9) // Genomics. 1998. V.50. P. 97104.

233. Hahn M. Microbial elicitors and their receptors in plants // Annu. Rev. Phytopathol. 1996. V. 34. P. 387-412.

234. Hammond-Kozack K., Jones J. Resistanse gene-dependent plant defense responses // Plant Cell. 1996. V.8, N.10. P. 1773-1791.

235. Hedrich R., Busch H., Raschke K. Ca2+ and nucleotide dependent regulation of voltage dependent anion channels in the plasma membrane of guard cells. // EMBO J. 1990. V. 9. P. 3889-3892.

236. Heidemann W, Casperson GF, Bourne HR. Adenylyl cyclase in yeast: antibodies and mutations identify a regulatory domain // J. Cell Biochem. 1990. V.42. P.229-242.

237. Hellevuo K., Berry R., Sikela J.M., Tabakoff B. Lokalization of the gene for a novel human adenylyl cyclase (ADCY7) to chromosome 16 // Hum. Genet. 1995. V. 95. P. 197-200.

238. Hill C.S., Triesman R. Transcriptional regulation by extracellular signals: mechanism and specificity // Cell. 1995.V.80. P. 199-212.

239. Hirano S., Upper C. Ecology and epidemiology of foliar bacterial plant pathogens II Annu. Rev. Phytopathol. 1983.V. 21. P. 243-269.

240. Holz G. G., Kang G., Harbeck M., Roe M.W., Chepurny O. G. Cell physiology of cAMP sensor Epac II J. Physiol. 2006. V. 1. P. 345-352.

241. Hong S.W, Jon Ji.H., Kwak J.M., Nam H.G. Identification of a reseptor-like kinase ene rapidly induced by abscisic acid, degidration, high salt, and cold treatments in Arabidopsis thaliana II Plant Physiol. 1997. V. 113. P. 1203-1212.

242. Hoshi T. Regulation of voltage dependence of the KAT1 channel by intracellular factors // J. Gen. Physiol. 1995. V. 105. P. 309-328.

243. Ishikawa I., Homey C., The adenylyl cyclases as integrators of transmembrane signal transduction // Circulation Research. 1997. V. 80. P. 297304.

244. Ichikawa T., SuzukiY., Czaja I. Identification and role of adenylyl cyclase in auxin signaling in higher plants //Nature. 1997.V. 390, N. 6661.- P. 698-701.

245. Iwami G., Kawabe J., Ebina T., Cannon P.J., Homsy C.J. Ishikawa Y. Reguation of adenylyl cyclase by proten kinase A // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 12481-12484.

246. Jahr H., Bahro R., Burger A., Ahlemeyer J., Eichenlaub R. Interaction between Clavibacter michiganensis and its host plants // Environmental Microbiology. 1999.V.l, N.2. P. 113-118.

247. Janistin B. Stimulation by manganese (Ilsuliphate of a cAMP-dependent protein kinase from Zea mays seedlings // Phytochemistry. 1988. V.27. P. 27352736.

248. Jasso-Chávez R., Vega-Segura A., El-Hafidi M, Moreno-Sanchez R., Torres-Márquez M. E. Kinetic and thermodynamic characterization of adenylyl cyclase from Euglena gracils // Archives Biochem. Biophys. 2002. V. 404, is. 1, P. 48-54.

249. Jiang J., Fan L. W., Wu W. H. 2005. Evidenes for involvement of endogenous cAMP in Arabidopsis defense responses to Verticillium toxins // Cell Research. 2005. V. 15. P. 585-592.

250. Johal G.H., Briggs S.P. Reductase activity encoded by the HM1 disease resistance gene in maize // Science. 1992. V. 258. P. 985-987.

251. Jones A.M., ,Assman S. M. Plant: the latest model system for G-protein research // EMBO Reports. 2004. V. 5. № 6. P. 572-578.

252. Kamenetsky M, Middelhaufe S, Bank E.M, Levin L.R, Buck J, Steegborn C. Molecular details of cAMP generation in mammalian cells: a tale of two systems// J. Mol Biol. 2006. V. 362. P. 623-39.

253. Karege F., Penel C., Greppin H. Rapid correlation between the leaves of spinach and the photocontrol of peroxidase activity // Plant Physiology. 1982.V.69, N.2. P.437.

254. Kasperska A. Sensor types in signal transduction pathways in plant cells responding to abotic stressors: do they depend on stress intensity? // Physiol. Plant. 2004. V.122. P. 159-168.

255. Kawai M., Aotsuka S., Uchimiya H. Isolation of a cotton CAP gene: a homologue of adenylyl cyclase-assocsed protein highly expressed during fiber elongation//Plant Cell Physiol. 2007. V.39. P. 1380-1383.

256. Kelly W. B., Esser J. E., Schroeder J. I. Effects of cytosolic calcium and limited, possible dual, effects of G protein modulators on guard cell inward potassium channels //Plant J. 1995. V. 8. P. 479-489.

257. Kinoshita T., Shimazaki K. I., Nishimura M. Phosphorilation and dephosphorilation of guard cell proteins from Vicia faba L. in respons to light and dark //Plant Physiol. 1993. V. 102. P. 917-923.

258. Knight H., Calcium signaling during abiotic stress in plants // Int. Rev. Cyt. 2000. V. 195. P. 263-325.

259. Knogge W. Fungal infection of plants // Plant Cell. 1996. V. 8, N 10. P. 1711-1722.

260. Kobe B., Deisenhofer J. The leucine-rich repeat: a versatile binding motif // Trends Biochem Sei. 1994. V. 19. P. 415-421.

261. Kohler C., Mercle T., Roby D., Neuhaus G. Developmentally regulated expression of a cyclic nucleotide-gated ion channel from Arabidopsis indicates its involvement in programmed cell death // Planta. 2001 .V. 213. P.327-332.

262. Kohorn B. D. Plasma membrane cell wall contacts.// Plant Physiol. 2000.V. 124. P. 31-38.

263. Koga B.Y., Abe M., Kitagawa Y. Alteration in gene expression during cold treatment rice plant // Plant Cell Physiol. 1991. V. 32. P. 901-906.

264. Komatsu S., Hirano H. Protein kinase activity and protein phosphorylation in rice (Oryza sativa L.) leaf// Plant Sei. 1993. V.94. P. 127-137.

265. Kreps, J. A., Y. Wu, C. Hur-Song, T. Zhu, X. Wang Transcriptomic changes for Arabidopsis in response to salt, osmotic, and cold stress // Plant Physiol. 2002. V.130. P. 2129-2141.

266. Köhler C., Merkle T., Roby D., Neuhaus G. Developmentally regulated expression of a cyclic nucleotide-gated ion channel from Arabidopsis indicates its involvement in programmed cell death // Planta. 2001. V. 213. P. 327-332.

267. Kudlacek O., Mitterauer T., Nanoff C., Hohenegger M., Tang W-J., Freissmuth M., Kleuss C. Inhibition of Adenylyl and Guanylyl Cyclase Isoforms by the Antiviral Drug Foscarnet // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 3010-3016.

268. Kurosaki F. Role of inward IC+ channel located at carrot plasma membrane in signal cross-talking of cAMP with Ca2+ cascade // FEBS Letts. 1997. V. 408. P.115-119.

269. Kurkdjian A. C. Role of the differentiation of root epidermal cells in Nod factor- (from Rhizobium meliloti) induced root hair depolarization of Medicago sativa // Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 783-790.

270. Kurosaki F. Role of inward K+ channel located at carrot plasma membrane04in signal cross-yalking of cAMP with Ca cascade // FEBS Letter. 1997. V. 408. P. 115-119.

271. Kurosaki F., Nishi A. Stimulation of calcium influx and calcium cascade by cyclic AMP in cultured carrot cells // Arch. Biochem. Biophys. 1993.V.302. P.144-151.

272. Kuznetsov VI. V., Rakitin V. Yu., Borisova N.N., Rotschupkina B.V. Why does heat shock increase salt resistance in cotton plants? // Plant Physiol. Biochem. 1993. V. 31. P. 181-188.

273. Kuznetsov VI. V., Rakitin V. Yu., Zholkevich V.N. Effects of preliminary heat-shock treatment on accumulation of osmolytes and drought resistance in cotton plants during water deficiency// Physiol. Plant. 1999. V. 107. P. 399-406.

274. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970.V. 227. P. 680 685.

275. Landschulz W.H., Johnson P.F., McKnight S.L. The leucine zipper: a hypothetical structure commn to a new class of DNA binding proteins // Science. 1988. V. 240. P. 1759-1764.

276. Lebaudy A., Very A-A., Sentenac H. K+ channel activity in plants: Genes, regulations and functions // FEBS Letter. 2007. V. 581. Is. 12. P. 2357-2366.

277. Lecourieux D., Mazars C., Pauly N., Ranjeva R., Pugin A. Analysis and effects of cytosolic free calcium increases in response ton elicitors in Nicotiana plumbaginifolia cells // Plant Cell. 2002. V. 14, N 10. P. 2627-2641.

278. Lee Y.W., Assman S.M. Arabidopsis thaliana extra-large GTP-bibding protein (AtXLGl): a new class of G-protein // Plant Mol. Biol.l999.V. 40, N.l. P. 55-64.

279. Lemtiri-Chlieh F., Berkowitz G.A. Cyclic adenosine monophosphate regulates calcium channels in the plasma membrane of Arabidopsis leaf guard and mesophyll cells // J. Biol Chem. 2004. V. 279. P. 35306-353 12.

280. Levitan I. B. Modulation of ion channels by protein phosphorylation and dephosphorylation //Annu. Rev. Physiol. 1994. V. 56. P. 193-212.

281. Leng Q., Mercier R.W., Yao W., Berkowitz G.A. Cloning and first functional characterization of plant cyclic nucleotide-gated cation channel // Plant Physiol. 1999. V. 151. P.753-761.

282. Leshem Y.Y. Membrane phospholipids catabolism and Ca activity m control of senescence // Physiol. Plant. 1987. V.69. N.3. P.551-559.

283. Levin L.R., Reed R.R. Identification of functional domains of adenylyl cyclase using in vivo chimeras // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 7573-7579.

284. Li W., Luan S., Schreiber S.L., Assman S.M. Cyclic AMP stimulates K+ channel activity in mesophyll cells of Vicia faba L. // Plant Physiology. 1994. V.106.P. 957-961.

285. Li W., Assman S. An abscisc acid-activated and calcium independent protein kinase from guard cells of fava bean // Plant Cell. 1996. V.8. P. 23592368.

286. Li W., Lee Y. -R., Assman S. M. Gurd cells possess a calcium-dependent protein kinase that phosphorylates the KAT1 potassium channel // Plant Physiol. 1998. V. 116. P.785-795.

287. Li W., Luan S., Schreiber S.L., Assman S. Evidence for protein phosphatase 1 and 2A regulation of K+ channels in two types of leaf cells // Plant Physiol. 1994. V. 106. P. 963-970

288. Ligterink W., Kroj T., zur Nieden U., Hirt H., Scheel D. Receptor-mediated activation of a MAP kinase in pathogen defense of plants // Science. 1997. V. 276. P. 2054-2057.

289. Linder J. U., Schultz J. E. The class III adenylyl cyclases: multi-purpose signalling modules // Cell Signal. 2003. V. 15. P. 1081-1089.

290. Linder JU. Class III adenylyl cyclases: molecular mechanisms of catalysis and regulation // Cell Mol. Life Sci. 2006. V.63. P. 1736-1751.

291. Litvin T.N., Kamenetsky M., Zarifyan A., Buck J., Levin L.R. Kinetic properties of "soluble" adenylyl cyclase // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P.15922-15926.

292. Liu H-T, Li B., Shang Z-L., Li X-Z., Mu R-L., Sun D-Y., Zhou R-G. Calmodulin is involved in heat shock signal transduction in wheat // Plant Physiol. 2003. V. 132. P. 1186-1195.

293. Lomovatskaya L.A., Romanenko A.S., Filinova N.V. Plant adenylate cyclases (minireview) // J. Recept. Signal Transduct. Res. 2008. V. 28. is. 6. P. 531-542.

294. Low P. S., Heinstein P. F., Chandra S., Dwyer S., Legendre L. Signal-Transduction of the Oxidative Burst // J. Cell. Biochem. 1995. V.5. P. 470-476.

295. Ludwig A.A., Saitoh H., Felix G., Freymark G., Miersch O., Wasternack C. Ethylene-mediated cross-talk between calcium-dependent protein kinase and MAPK signaling controls stress responses in plants // PNAS. 2005. V. 102, N. 30. P. 10736-10741.

296. Lupton F., Macer R. Inheritance of resistance to yellow rust (Puccinia glumarum Erikss et Henn) in seven varieties of wheat // Trans.Brit.Mycol.Soc. 1962. V.45, N 1. P.21- 45.

297. Lusini P., Trabalzini L., Franchi G.G., Bovalini L., Martelli P. Adenilate cyclase in roots of Ricinus comuis: stimulation by GTF and Mn2+// Phytochem. 1990. V. 30. P. 109-111.

298. Lustig R.D., Conklin B.R., Herzmark P., Taussig R., Bourne H.R. Type II adenylyl cyclase integrates coincident signals from Gs, G„ and Gq. // J. Biol. Chemical. 1993. V. 268. P.13900-13905.

299. Ma H. GTP-binding proteins in plants: new members of an old family // Plant Mol. Biol. 1994. V. 26. P. 1611-1636.

300. Maathuis F. J. M., Sanders D. Sodium uptake in Arabidopsis roots is regulated by cyclic nucleotides // Plant Physiol. 2001. V. 127. P.1617-1625.

301. Malbon С. C., Tao J., Wang H. AKAPs (A-kinase anchoring proteins) and molecules that compose their G-protein-coupled receptor signalling complexes //Biochem. J. 2004. V. 379. P.l-9.

302. Mackey, D., B. Holt, A. Wiig, and" J. Dangl. RIN4 Interacts with Pseudomonas syringae Type III Effector Molecules and Is Required for RPM1-Mediated Resistance in Arabidopsis // Cell. 2002. V.108. P. 743-754.

303. MacRobbie E. A. C. Signalling in guard cells and regulation of ion channel activity//J. Exp. Bot. 1997. V. 48. P. 515-528.

304. Maximyuk O.P., Lozovaya N.A., Kopanitsa M.V., Krishtal O.A. G-protein inhibition of N- and P/Qtype calcium channels // Биологические мембраны. 2002. Т. 19, № l.C. 42-48.

305. Michelmore R.W., Meyers B.C. Clusters of resistance genes in plants evolve by divergent selection and a birth-and-death process // Genome Res. 1998. V. 8. P. 1113-1130.

306. Manch Mani B., Metraux I. Salicylic acid and systemic asquired resistance to pathogen attack // Ann. Bot. 1998. V. 82. N 5. P.72-89.

307. Markus Gierth M., Maser P. Potassium transporters in plants Involvement in K+ acquisition, redistribution and homeostasis // FEBS Letters. 2007. V. 581., Is.12. P. 2348-2356.

308. Marten I., Lohse G., Hedrich R. Plant growth hormones control voltage-dependent activity of anion channels in plasma membrane of guard cells. // Nature. 1991. V. 353. P.758-762.

309. Martin T.F.J. Phosphoinositide lipids as signaling molecules: Common themes for signal transduction, cytoskeletal regulation, and membrane trafficking // Annu. Rev. Cell Biol. 1998. V.14. P. 231-264.

310. Mason M.G., Botella J.R. Isolation of a novel G-protein y-subunit from Arabidopsis thaliana and its interaction with G(3 // Biochim. Biophys. Acta. 2001. V. 1520. P. 147-153.

311. Mathieu Y., Lapous D., Thomine S., Lauriere C., Guern J. Cytoplasmic acidification as an early phophorylation-dependent response of tobacco cells to elicitors // Planta.l996.V.199. N.3. P.416-424.

312. Matthysse A. Mechanisms of bacterial adhesion to plant surfaces // Bacterial adhesion mechanisms and physiological significance. 1985. New-York and London: Plenum Press. P. 255-278.

313. Matthysse A., Holmes K., Gurlitz R. Elaboration of cellulose fibrils by Agrobacterium tumifaciens during attachment to carrot cells // J. Bacteriol. 1981.V.145. N1. P.583-595.

314. Mazmanian S., Liu C., Tzianabos A.O., Kasper D.L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system // Cell. 2005. V.122. P.107-118.

315. Meindl T., Boiler T., Felix G. The bacterial elicitors flagellinactivates its receptor in tomato cells according to the address-message concept // Plant Cell. 2000.V.12. P.1783-1794.

316. Mendgen K., Hahu M., Deising H. Morphogenesis and mechanisms of penetration by plant pathogenic fungi // Annu. Rev. Phytopatol. 1996.V. 34. P. 367-386.

317. Metraux J.-P. Systemic acquired resistence and salicylic acid: current state of knowledge //European Journal of Pathology. 2001.V.107. P. 13-18.

318. Metzler M., Laine M., De Boer S. The status of molecular biological research on the plant pathogenic genus Clavibacter // FEMS Microbiology Letters. 1997.V.150, N.l. P.l-8.

319. Mikami K., Katagiri T., Luchi S., Yamaguchi-Shinozaki K. A gene encoding phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase is induced by water stress and abscisic acid in Arabidopsis thaliana II Plant J. 1998. V. 15". P. 563-568.

320. Millner P. A. Heterotrimeric G-Proteins in Plant Cell Signaling // New Phytol. 2001. V. 151, N. l.P; 165-174.

321. Moran N., Satter RL. Interaction of the depolarization -activated potassium ion channel of Samanea saman with inorganic ions-patch clamp study // Plant Physiol. 1990. V. 94. P. 424-431.

322. Mori I.C., Muto S. Abscisic acid activates a 48-kilodation protein kinase in guard cell protoplasts // Plant Physiol. 1997. V. 113. P.833-839.

323. Morris A.J., Malbon C.C. Physiological regulation of G-protein-linked signaling//Physiol. Rev. 1999.V.79. P.1373-1430.

324. Morris K.E., Juranka P.F. Lipid Stress at Play: Mechanosensitivity of Voltage-Gated Channels // Current Topics in Membranes. 2007. V. 59. P. 297338.

325. Morsucci, R, Curvetto, N, Delmastro, S. Involvement of cytokinins and adenosine 3',5'-cyclic-monophosphate in stomatal movement in Vicia faba II Plant Physiol Biochem. 2003. V. 29. P. 537-547.

326. Moutinho A., Hussey P. J., Trevawas A.J., Malho R. Cyclic AMP act as a second messenger in pollen tube growth and reorientation // Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. V. 98. P. 10481-1048.

327. Mueller M. J., Pearce G., Orozco-Gardenas M., Ryan C.A. Signaling in the elicitation process is mediated through the octadenoid pathway leading to jasmonic acid // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.1993.V.90, N.16. P.7490-7494.

328. Muglia L.M., Schaefer M.L., Vogt S.K., Gurtner G., Imamura A., Muglia L.J. The 5'-flanking region of the mouse adenylyl cyclase type VIII gene imparts tissue-specific expression in transgenic mice // J. Neurosci.1999. V.19. P. 2051-2058.

329. Munnik T., Ligterink W., Meskiene I., Calderini O., Beyerly J., Musgrave A., Hirt H. Distinct osmo-sensing protein kinase pathways are involved in signaling moderate and severe hyper-osmotic stress // Plant J. 1999. V.20. P. 381-388.

330. Munnik T., Meijer H. J. G. Osmotic stress activates distinct lipid and MAPK signaling pathways in plants // FEBS Lett. 2001. V. 498. P. 172-178.

331. Miiller-Rober B., Ellenberg J., Provart N., Willmizer L., Busch H., Becker D.Cloning and electrophysiological analysis of KST1, an inward rectifying K+ channel expressed in potato guard cells // EMBO J. 1995. V. 14. P. 2409-2416.

332. Murata N., Los D.A. Membrane Fluidity and Temperature Perception // Plant Physiol. 1997. V. 115. P. 875-879.

333. Naoumkina M. A. , He Z., Dixon R. A. Elicitor-induced transcription factors for metabolic reprogramming of secondary metabolism in Medicago truncatula II BMC Plant Biol. 2008. V.8. № 132.

334. Neer E.G. Heterotrimeric G proteins: organizers of transmembrane signals // Cell. 1995.V.80. P.249-257.

335. Newton R.P., Gibbs N., Moyse C.D., Wiebers J., Brown E.G. Mass spectrometric identification of adenosine 3':5'-cyclic monophosphate isolated from a higher plant tissue // Phytochemistry.1980. V.19, N.10.P. 1909-1911.

336. Newton R., Roef L., Witters E., VanOnckenen H. Cyclic nucleotides in higher plants: the enduring paradox // New Phytol. 1999. V. 143.P.427-455.

337. Niles R.M., Mount M.S. Cyclic nucleotide phosphodiesterase from carrot // Phytochem.l974.V.13, N.12. P.2733-2740.

338. Ntefidou M, Iseki M, Watanabe M, Lebert M, Hader D-P. Photoactivated adenylyl cyclase controls phototaxis in the flagellate Euglena gracillis // Plant Physiol. 2003. V. 20. P.1517-152.

339. Noctor G., Foyer C. Ascorbate and Glutathione: KeepingActive Oxygen under Control // Annu. Rev. Plant Physiol. 1998. Vol. 49. P. 249-279.

340. Nürnberger T., Wirz W., Nennstiel D., Hahlbrock K., Jabs T., Zimmermann S. Signal perception and intracellular signal transduction in plant pathogen defense // J. Recept. Sign. Transd. Res. 1997. V. 17. P. 127-136.

341. Ohmori MK, Hasunuma K, Furukava K. cAMP in Anabaena cylindrica: Rapid changes in cellular levels in response to changes in extracellular environments // Plant Cell Physiol. 1989. V.30. P. 911-914.

342. Onda, T., Hashimoto, Y., Nagai, M. et al. 2001. Type-specific regulation of adenylyl cyclase: Selective pharmacological stimulation and inhibition of adenylyl cyclase isoforms // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 47785-47775.

343. Pacini B., Petrigliano A., Diffley P., Paffetn A., Brown E. G. , Martelli P., Trabalzini L, Bovalini L., Lhusini P., Newton R.P. Adenylyl cyclase activity in roots of Pisum sativum II Phytochemistry. 1993. V. 34, is. 4. P.899-902.

344. Pall M.L. Cyclic AMP and the plasma membrane potential in Neurospora crassa//L Biol. Chem. 1977. V. 252. P. 7146-7150.

345. Pandey S., Zhang W., Assmann S.M. Roles of ion channels and transporters in guard cell signal transduction // FEBS Letter. 2007. V. 581, Is. 12. P. 23372347.

346. Parlevliet J. Models explaining the specificity and durability of host resistance derived from the observation in crops // Durable Resistance Crops. 1983.V. 55. 55-57.

347. Pastori G.M., Foyer C. H. Common components, networks, and pathways of crodd-tolerance to stress. The central role of "redox" and abscisic acid-mediated controls // Plant Physiol. 2002. V.129. P. 460-468

348. Payne G., Ahl P., Moyer M. Isolation of complementary DNA clones encoding pathogenesis-related proteins P and Q, two acid chitinases from tobacco // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1990. V.87. P. 98-102.

349. Pei Z-M., Ward J.M., Harper J.F., Schroeder J.I. Novel chloride channel in Vicia faba guard cell vacuoles activated by the serine /threonine kinase, CDPK //EMBO J. 1996. V. 15. P. 6564-6574.

350. Polya G.M., Bowman J.A. Resolution and properties of two high affinity cyclic adenosine 3\5'-monophosphate-binding proteins from wheat germ // Plant Physiol. 1981. V.68, N.3. P.577-584.

351. Premont R., Matsuoka I., Mattei M.G., Pouille Y., Defer N., Hanoune J. Identification and characterization of a novel and widely-expressed isoform of adenylyl cyclase // J. Biol. Chem. 1996.V.271. P. 13900-13907.

352. Pryor A. The origin and structure of fungal disease resistance gene in plants // Trends Genet. 1987. V.3. P. 157-161.

353. Qiao J., Mei F.C., Popov V. L., Vergara L. A., Cheng X. Cell cycle-dependent subcellular localization of exchange factor directly activated by cAMP // J. Biol. Chem . 2002. V. 277. P. 26581-26586.

354. Qin W., Pappan K., Wang X. Molecular Heterogeneity of Phospholipase D (PLD). Cloning of PLDy and regulation of plant PLDy, -(3, and -a by polyphosphoinositides and calcium // J. Biol. Chem. 1997. V.272. P.28267 -28273.

355. Quinton P. M., Reddy M. M. Control of CFTR chloride conductance by ATP levels through non-hydrolytic binding // Nature. 1992. V. 360. P.79-81.

356. Reddy r., Smith D., Wayman G., Wu Z., Villacres E.C., Storm D.R. Voltage-sensitive adenylyl cyclase activity in cultured neurons // J. Biol. Chem. 1995.V.270, N.24. P.14340-14346.

357. Rich T.C., Fagan K.A., Nakata H., Schaack J. Cooper D. M. T., Karpen J.W. Cyclic nucleotide-gated channels colocalize with adenylyl cyclase in regions of restricted cAMP diffusion//J. Gen. Physiol. 2000. V. 116. P.147-161.

358. Richards H., Das S., Smith C., Pereira L., Geisbrecht A., Devitt N., Games D., van Geyschem J., Brenton A.G., Newton R. P. 2002. Cycic nucleotidate content of tobacco BY-2 cells //Phytochemistry. 2002. V. 61. P. 531-537.

359. Ritter A., Dangle J. Interference betweene two specific pathogen recognition events mediated by distinct plant disease resistance genes // Plant Cell. 1996. V.8, N 2. P.251-258.

360. Robb J., Lee B., Nazar R. Gene suppression in a tolerant tomato-vaskular pathogen interaction. // Planta. 2007. V. 226. P. 299-39.

361. Roberts D., Denny T., Schell M. Cloning of the egL gene of Pseudomonas solanacearum and analysis of its role in phytopathogenicity // J. Bacteriol. 1988.V. 170, N10.P.1445-1451.

362. Robinson K.R., Messerli M.A. Pulsating Ion Fluxes and Growth at the Pollen Tube Tip 11 Scl STKE. 2002. Vol. 2002. P. 51.

363. Rodbell M. Signal transduction: evolution of an idea // Biosci. Rep. 1995. V.15. P.33-117.

364. Rhodes J. D., Thain J. F., Wildon D. C. Evidence for physically distinct systemic signaling pathways in the wounded tomato plant // Ann. Bot. 1996. V. 84. P. 109-116.

365. Rodrigues P.L. Protein phosphase 2C (PP2C) function in higher plants // Plant Mol. Biol. 1998.V.38, N.6. P.919-927.

366. Roelofs J., Van Haastert J.M. Dedusing the origin of soluble adenylyl cyclase, a gene lost in multiple lineages // Mol. Biol. Evol. 2002. V. 19. P. 2239-2246.

367. Romanenko A.S., Lomovatskaya L.A., Shafikova T.N., Borovskii G.B., Krivolapova N.V. Potato cell membrane receptors to ring rot pathogen extracellular polysaccarides // J. Phytopathology. 2003.V.151, N.l.P.1-6.

368. Romantschuk M. Attachment of plant pathogenic bacteria to plant surfaces // Annu.Rev.Phytopathol. 1992.V. 30, N 2. P. 225-243.

369. Rosqvist R., Hakansson S., Forsberg A., Wolf-Watz J. Functional conservation of the secretion and translocation machinery for virulence proteins of Yersinicie, Calmonella and Shigellae // EMBO. 1995.1.14. P.4187- 4195.

370. Rudd J.J., Franklin-Tong V.E. Calcium signalling in plants // Cell Mol.Life Sci.l999.V.55. P.214-232.

371. Rudolph Iv., Non-spcific toxins//In: Encyclopedia of Plant Physiology.-V.4.- Physiological Plant Pathology. N.Y.: Springer Verlag. 1976. P.270-315.

372. Ruffer M., Steipe B., Zenk M.N. Evidence against specific binding of salicylic acid to plant catalase // FEBS Lett. 1995. V. 377. PI75-180.

373. Ruy S.V., Wang X. Increase in free linolenic and linoleic acids associated with phospholipase D-mediated hydrolysis of phospholipids in wounded castor bean leaves // FEBS Lett. 1998.V. 1393, N.l. P. 193-202.

374. Ryals J., Uknes S., Ward E. Systemic aquired resistance // Plant Physiol. 1994.V.104. P.l 109-1112.

375. Sacks W., Nürnberger T., Hahlbrock K., Scheel D. Molecular characterization of nucleotide sequences encoding the extracellular glycoprotein elicitor from Phytophthora megasperma II Mol. Gen. Genet. 1995. V. 246. P. 45-55.

376. Sang Y., Cui D., Wang X. Phospholipase D and phosphatidic acid-mediated generation of superoxide in Arabidopsis // Plant. Physiol. 2001. V.126, N.4. P.1449-1458.

377. Saunders M.I., Hepler P. K. Calcium ionophore A23187 stimulates cytokinin-like mitosis in Funaria II Science. 1982. Vol. 217. P. 943 945.

378. Sanders D., Pelloux J., Brownlee C., Harper J. Calcium at the crossroads of signaling//Plant Cell. 2002. V. 5. P. 401-417.

379. Schroeder, J.I., Allen, G.J., Hugouvieux, V., Kwak, J.M., Waner, D. Guard cell signal transduction. //Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2001. V. 52. P. 627-658.

380. Schouten H. A possible role in pathogenesis for the swelling of extracellular slime of Erwinia amylovora at increasing water potential // Neth.J. Plant Pathol. V. 95, N 2. P.169-174.

381. Schulz-Lessdorf B., Lohse G., HedrichR. GCAC1 recognizes the pH gradient across the plasma membrane: A pH-sensitive and ATP-dependent anion channel links guard cell membrane potential to acid and energy metabolism // Plant J. 1996. V. 10. P. 993-1004.

382. Seger R., Krebs E.G. The MAPK signaling cascade // FASEB J.1995.V. 9.-P. 726-735.

383. Seki M., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. Molecular responses to drought, salinity and frost: common and different paths for plant protection // Curr. Opin. Biotechnol. 2003. V. 14. P. 194-199.

384. Sentenac H., Bonneaud N., Minet M., Lacroute F., Salmon J.-M, Gaymard F. Cloning and expression in yeast of a plant potassium ion transport system // Science. V. 256. P. 663-665.

385. Simonds W. F. G protein regulation of adenylate cyclase// Trends plant science. 1999. V. 20. P. 66.

386. Sharaf M.A., Rooney D.W. Changes in cyclic nucleotide levels correlated with growth, division and morphology in Clamidomonas chemoctan culture // Biochem. Biophys. Res. Commun.l982.V.104, NAP. 1461.

387. Shi X, Zhu A., Burt J., Qi F., Simonson D. A Case-based Reasoning Approach to Fuzzy Soil Mapping // Soil Sci. Soc. Am. J. 2004. V. 68. P. 885894.

388. Shinski H., Neucous U-M., Rials J., Meins F. Structure of tobacco endochitinase gene:evidence that different chitinase genes can by transposition of sequences encoding a cystein-rich domain // Plant.Mol.Biol. 1990. V.14. P. 357-368.

389. Schroeder, J.I. Allen G.J., Hugouvieux V., Kwak J.M., Waner D. Guard cell signal transduction // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2001. V. 52. P. 627-658.

390. Schultze M., Kondorsi E., Ratet P., Buire M., Kondorsi A. Cell and molecular biology of Rhizobium plant interactions // Int. Rev. Cytol. 1994.1. V.156. P. 1-4.

391. Schulz-Lessdorf B., Lohce G., Hedrich R. GCAC1 recognizes the pH gradient across the plasma membrane potential to acid and energy metabolism. //Plant J. 1996. V. 10. P.993-1004.

392. Schumaker K.S., Gizinski M.J. 1,4-dihydropyridine binding sites in moss plasma membranes. Properties of receptors for a calcium channel antagonist // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 23461-23467.

393. Sheng S-H., Willmann M.R., Chen H-C., Sheen J. Calcium signaling through protein kinases. The Arabidopsis calcium-dependent protein kinase gene family// Plant Physiol. 2002. V. 129. P. 469-485.

394. Shoshani I., Laux W. H. G., Pe'rigaud C., Gosselin G., Johnson R.A. Inhibition of Adenylyl Cyclase by Acyclic Nucleoside Phosphonate Antiviral Agents // J. Biol. Chemistry. 1999. V. 274. P. 34742-34744.

395. Showalter A., Bell J.,Cramer C. Accumulation of hydroxyproline-rich glicoprotein mRNA in biologically stressed cell cultures and hypocotils // Biol.and Molecular. Biol. Plant-Phathogen Interact. NY.Springer.1986. P.235-244.

396. Shuichi Y. Cross-talk between signaling pathways in plants: Controlling degradation of transcription factors is a key for cross-talk // Protein, Nucleic Acid and Enzyme. 2004. V. 49, N. 13. P. 2131-2138.

397. Sim W-S., Kim H-R. Effect of GA3 on the cyclic AMP biosynthesis in maize seedling // Plant Cell Physiol. 1987. V. 28. P. 415-420.

398. Simonds W.F. G protein regulation of adenylate cyclase // Trends Plant Science. 1999.V.20. P. 66-73.

399. Smit G., Kijne I., Lughtenberg B. Involvement of both cellulose fibrils and Ca dependent adhesin in the attachment of Rhizobium leguminozarum to pea root haeir tips // J. Bacteriol. 1987.V. 169, N19. P. 4292-4301.

400. Smit G. Adhesins from Rhizobiaceae and their role in plant-bacterum interactions 11 Ph.D. Thsis. Leuden Univ. The Netherlands. 1994.

401. Somssich I.E., Hahlbrock K. Pathogen defence in plants a paradigm of biological complexity // Trends Plant. Sci. 1998. V. 3. P. 87- 90.

402. Spiteri A., Viratelle O.M., Raymond P., Rancillac M., Labouesse J., Prsdet A. Artefactual origins of cyclic AMP in higher plant tissues// Plant. Physiol. 1989. V. 91. P. 624-628.

403. Steegborn C, Litvin TN, Levin LR, Buck J, Wu H. Bicarbonate activation of adenylyl cyclase via promotion of catalytic active site closure and metal recruitment//Nat. Struct. Mol. Biol. 2005. V. 12. P. 32-37.

404. Stankovic B., Davies E. Both action potentials and variation potentials induce proteinase ingibitor gen expression in tomato // FEBS Letters. 1996. V. 390. P. 275-279.

405. Stessin, A.M., Zippin, J.H., Kamenetsky, M., Hess, K.C., Buck, J., and Levin, L.R. Soluble adenylyl cyclase mediates NGF-induced activation of RAP1 //J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 17253-17258.

406. Strobel G., Talmadge K., Albersheim P. Observation on the structure of the toxic glicopeptide of Corinebacterium sepedonicum II Biochem. Biophys. Acta. 1972.V.261, NAP. 356-374.

407. Sunahara R., Taussig R. Isoforms of mammalian adenylyl cyclase: multiplicities of signaling // Mol. Intervent. 2002. V.2.P. 168-184.

408. Sutherland E.W., Rail T.W., Mennon T. Adenyl cyclase: distribution, preparation and properties II J. Biol. Chem. 1962.V.247, N.2. P. 1220-1227.

409. Swindell W.R. The association among gene expression responses to nine abiotic stress treatments in Arabidopsis thaliana II Genetics. 2006. V.8.- P. 128132.

410. Takken L.W., Joosten M.H.A. Plant resistans genes: their structure, functiom and evolution // J. Plant Pathol. 2000. V. 106. P.699-713.

411. Talke 112. I.N., Blaudes D., Maathuis F. J.M., Sanders D. CNGCs: prime targets of plant cyclic nucleotide signaling // Trends Plant Science. 2003. V.8. P. 286-293.

412. Tang W-J, Gilman AG. Type-specific regulation of adenylyl cyclase by G protein subunits//Science. 1991. V. 254. P. 1500-1503.

413. Taylor J. E., McAinsh M.R. Signalling crosstalk in plants: emerging issues // J. Exp. Bot. 2004. V. 55, N. 395. P. 147-149.

414. Thatcer L.F., Anderson J.P., Singh K.B. Plant defense responses: what have we learn from Arabidopsis? // Functional Plant Biology. 2005.V.32. P. 1-19.

415. Tena G., Renaudin J.P. Cytosolic acidification but not auxin at physiological concentration is an activator of MAP kinases in tobacco cells // Plant J. 1998. V.16., N.2. P.173-182.

416. Tenhaken R., Rubel C. Salicylic acid is needed in hypersensitive cell death in soybean, but does not act as a catalase inhibitor // Plant Physiol. 1997.V.115. P. 291-298.

417. Terhune B., Hoch H. Substrate hydrophobiciti and adhesion of Uromyces urediospores and germlings // Exp. Mycol. 1993. V.17, N 2. P. 241-252.

418. Tesmer, J.J., Sunahara, R.K., Johnson, R.A., Gosselin, G., Gilman, A.G., Sprang, S.R. Two-metal-ion catalysis in adenylyl cyclase // Science. 1999. V. 285. P. 756-760.

419. Tester 113. M. Plant ion channels: whole-cell and single channel studies // New Phytol. 1990. V. 114. P. 305-340.

420. Thiel G., 114.Blatt M. R. Phosphatase antagonist ocadaic acid inhibits steady-state K+ currents in guard cells of Vicia fava II Plant J. 1994. V. 5. P. 727-733.

421. Thomine S., Guern J., Barbier-Brigoo H. Voltag-dependent anion channel of Arabidopsis hypocotyls: nucleotide regulation and pharmacological properties. //J. Membr. Biol. 1997. V. 159. P. 71-82.

422. Timmons T. M., Dunhar B. S. // Methods Enzymol. 1990. V.182. P. 679688.

423. Trebacz K., Sievers A. Action potentials evoked by light in traps of Dionaea muscipula Ellis // Plant Cell Physiol. 1998. V. 39. P. 369-372.

424. Truelsen T.A., Wyndaele R. Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate in normal and habituated Heliantus callus // Physiol. Plant. 1978.V.42, N.3. P. 324380.

425. Trusov Y, Rookes J., Tilbrook K., Chakravorty D., Mason M., Anderson D., Chen J-G., Jones A., Botella J. Heterotrimeric G Protein Subunits Provide Functional Selectivity in GB Dimer Signaling in Arabidopsis // Plant Cell. 2007. V. 19. P. 1235-1250.

426. Truelsen T.A., Wyndaele R. Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate in normal and habituated Heliantus callus // Physiol. Plant. 1978. V.42. N.3. P. 324-380.

427. Tsuruhara A., Tesuka T. Relationship between self-incompatibility and cAMP level in Lidium Longyflorum H Plant Cell Physiol. 2002.V.42. P. 12341238.

428. Tu J.C. Biochemical and histochemical investigation of diurnal variation in cAMP concentration and adenilate cyclase activity in white dutch clover // Protoplasma. 1979. V. 99. P. 139-146.

429. Ulker B., Mukhtar M. S., Somssich I.E. The WRKY70 transcription factor of Arabidopsis influences both the plant senescence and defense signaling pathways //Planta. 2007. V. 226. P. 125-137.

430. Valster A.H., Hepler P.K., Chernoff J. Plant GTP-ases: the Phos in bloom // Trends Cell Biol. 2000.V.10, N.4. P.141-146.

431. Van Alfen N., McMillan B., Dryden P. The multi-component extracellular polysaccharide of Clavibacter mishiganensis subsp. insidiosum // Phytopathology. 1987. V.77, N 5. P.495-501.

432. Vanderplank J. Host pathogen interaction in plant desease // N.Y.: Acad.Press. 1982. 207 p.

433. Van Loon L.C., Rep M., Pieterse C.M. Significance of inducible defense-related proteins in infected plants // Annu.Rev. Phytopathol. 2006. V. 44. P. 135-162.

434. Villacres E.C., Xia Z., Bookbinder L.H., Edelhoff S., Disteche C.M. Storm D.R. Cloning, chromosomal mapping and expression of human fetal brain type I adenylyl cyclase // Genomics. 1993. V. 16. P. 473-478.

435. Volotovski D., Sokolovsky S.G., Molchan O.V., Knight M.R. Second messengers mediate increases in cytosolic calcium in tobacco protoplasts // Plant Physiol. 1998. V.117. P.1023-1030.

436. Vorherr T., Knopfel L., Hofmann F., Molner S., Pfeuffer T., Carafoli E. The calmodulin binding domain of nitric oxide synthase and adenylyl cyclase // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 6081- 6088.

437. Wang X. The role of phospholipase D in signalling cascade // Plant Physiol. 1999.V.120.N.2. P.645-651.

438. Wang Q, McLoughlin RM, Cobb BA, Charrel-Dennis M, Zaleski KJ, Golenbock D, Tzianabos AO, Kasper DL. A bacterial carbohydrate links innate and adaptive responses through Toll-like receptor 2 // J. Exp. Med 2006. V. 203. P.2853-2863.

439. Wang S., Assmann S.M., Fedoroff N.V. Characterization of the Arabidopsis Heterotrimeric G Protein //J. Biol. Chem. 2008. V. 283, Is. 20. P. 13913-13922.

440. Ward J.M., Schroeder J.I. Roles of ion channels in initiation of signal transduction in higher plants//Signal transduction in plants 1997. P. 1-17.

441. Wastemack C., Parthier B. Jasmonate-signalled plant gene expression // Trends Plant Sci.l997.V.2, N.8. P.302-307.

442. Watkinson J.I., Sioson A.A., Vasquez-Robinet C., Shukla M., Kumar D. Photosyntetic acclimation is reflected in specific patterns of gene expression in drought-stressed loblolly pine // Plant Physiol. 2003. V. 133.- P. 1702-1716.

443. Wayman, G.A., Impey, S. and Storm, D.R. Ca" inhibition of type III adenylyl cyclase in vivo // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 21480-21486.

444. Wayman, G.A., Wei, J., Wong, S., and Storm, D.R. Regulation of type I adenylyl cyclase by calmodulin kinase IV in vivo // Mol. Cell. Biol. 1996. V. 16. P. 6075-6082.

445. Wegner L. H., De Boer A. H. Two inward K+ channels in the parenchyma cells of barley roots are regulated by G protein modulators through a membrane-delimited pathway // Planta. 2003. V. 203. P. 506-516.

446. Wen J-Q., Jjnj K., Imai R. Two novel mitogen-activated protein signaling components, OsMEKl and OsMAPl, are involved in a moderate low -temperature signaling pathway in rice // Plant. Physiol. 2002. V. 129. P. 18801891.

447. Wendehenne D., Pugin A., Klessing D.F., Dumer J. Nitric oxide comparative synthesis and signaking in animal and plant cells // Trends Plant Sci. 2001. V.6, N.4. P. 177-183.

448. Westra A., Slack S. Isolation and characterization of extracellular polysaccharide of Clavibacter mishiganensis subsp .sepedonicus II Phytopathology. 1992.V.82, N.12. P. 1193-1199.

449. Whisnant RE, Gilman AG, Dessauer CW. Interaction of the two cytosolic domains of mammalian adenylyl cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA // 1996. V. 93. P.6621-6625.

450. White P.J. Calcium channels in higher plant // Biochim. Biophys. Acta. 2000.V.1465, N.1/2.P.171-189.

451. White P. J., Broadley M. R. Calcium in plants II Annu. Bot. 2003. V. 92. P. 487-511.

452. Willard F, Crouch M. Nuclear and cytoskeleton translocation and localization of heterotrimeric G-proteins. // Immunology & Cell Biol. 2000. V. 78. P. 387-394.

453. Willoughby D., Cooper D.M.F. Ca2+ stimulation of adenylyl cyclase generates dynamic oscillations in cyclic AMP// J. Cell Science. 2006. V. 119. P. 826-836.

454. Wingender E., Chen X., Hehl R., KarasH., Liedich I., Matis V., Meinhardt T., Prus M., Reuter 1., Schacherer F. TRANSFAC: an integrated system for gene expression regulation //Nucl. Acid. Res. 2000.V.28, N.l. P.316-319.

455. Witters E., Quanten L., Bloemen J. Valcke R., van Onckelen H. Product identification and adenylyl cyclase activity in chloroplasts of Nicotiana tabacum II Rapid Commun. Mass Spectrometry. 2004. V. 18. P. 499-504.

456. Witters E., Valcke R, van Onckelen H. Cytoenzymological analysis of adenylyl cyclase activity and 3':5'-cAMP immunolocalization in chloroplasts ofNicotiana tabacum //New Phytol. 2005. V.168. P.709-712.

457. Wojtaszek P. Oxidative durst: an early plant response to pathogen infection //Biochem. J. 1997. V.322. -P.681-692.

458. Wong S. K., Ma C. P., Foster D. C., Chen A. Y., Garbers D. L. The Guanylyl Cyclase-A Receptor Transduces an Atrial Natriuretic Peptide/ATP Activation Signal in the Absence of Other Proteins // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 30818-30822.

459. Wu W.-H., Assmann S. M. A membrane delimited pathway of G protein regulation of the guard-cell inward K+ channel // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 6310-6314.

460. Wuttke, M. S., Buck, J., Levin, L. R. Bicarbonat-regulated soluble adenylyl cyclase // JOP. J. Pancreas. 2001. V. 2. P. 154-158.

461. Xiong L., Schumaker K.S., Zhu J.-K. Cell signaling during cold, drought, and salt stress// Plant Cell. 2002. V. 14. P. 165-183.

462. Xu M-J., Dong J-F., Zhu M-Y. Nitric oxid mediates the fungal elicitor-induced hypericin production of Hypericum perforatum cell suspension cultures through a jasmonic-acid-dependent signal pathway // Plant Physiol. 2005. V. 139. P. 991-998.

463. Jiang Xu,l,2 Hao-Dong Li, 1,2 Li-Qing Chen, 1,2 Yi Wang, 1,2 Li-Li Liu, 1,2 Liu He,l and Wei-Hua Wul, A Protein Kinase, Interacting with Two Calcineurin B-like Proteins, Regulates K+ Transporter AKT1 in Arabidopsis // Cell. 2005. V. 125. P.1347-1360.

464. Yan S.Z., Huang Z.H., Andrews R.K., Tang W.J. Conversion of forskolin-insensitive to forskolin-sensitive (mouse-type IX) adenylyl cyclase // Mol. Pharmacol. 1998.V.53. P. 182-187.

465. Yasuomi T., Koh K., Shigeyuki B., Takeshi S., Masaru S., Yasuko O., Shingo H., Tomoyo M.,Yukio T., Shigeyuki M. Victorin Triggers Programmed

466. Cell Death and the Defense Response via Interaction with a Cell Surface Mediator// Plant Cell Physiology. 2005. V. 46. P. 1787-1798.

467. Yoshimura M., Cooper D. M. Type-specific stimulation of adenylyl cyclase by protein kinase C // J. Biol.Chem. 1993. V. 268. P. 4604-4607.

468. Zaccollo M., Pozzan T. cAMP and Ca2+ interplay: a matter of oscillation patterns // Trends Neurosciences. 2003. V. 26, N. 2. P. 53-55.

469. Zhao, X., Mehrabi, R., and Xu, J. -R. 2007. MAP kinase pathways and fungal pathogenesis. //Eukaryotic Cell. 2007. V. 10. P. 1701-1714.

470. Zhang S.,Klessig D.F. Salicylic acid activates a 48-kD MAP kinase in tobacco // Plant Cell. 1997.V.9, N.5. P.809-824.

471. Zhang S., Klessing D.F. The tobacco wounding-activated mitogen activated protein kinase is encoded by SIPK // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.1998.V.95. P.7225-7230.

472. Zhu J-K. Salt and drought stress signal transduction in plants // Annu. Rev. Plant. Biol. 2002. V. 53. P. 247-273.

473. Zimmermann S, Thomine S, Guern J, Barbier-Brygoo H. An anion current at the plasma membrane of tobacco protoplasts shows ATP-dependent voltage regulation and is modulated by auxin // Plant J. 1994. V.6. P. 707-716.

474. Zimmermann S., Nürnberger T., Frachisse J.-M., Wirz W., Guern J.,2 j

475. Hedrich R. Receptor mediated activation of a plant Ca permeable on channel involved in pathogen defense // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997. V. 94. P. 2751-2755.

476. Zimmermann S., Talke I., Enhardt T., Nast G., Miiller-Rober B. Characterization of SKT1, an inward rectifying K+ channel from potato, by heterologous expression in insect cells. // Plant Physiol.1998. V. 116. P. 879890.

477. Zimmermann S., Ehrhardt T., Plesch G., Miiller-Rober. Ion channels in plant signaling // Cel. Mol. Life Sci. 1999. V. 55. P. 183-203.

478. Zippin J.H., Levin, I.R., Buck J. C02/HC03~ responsive soluble adenylyl cyclaseas a putative metabolic sensor //Trends Endocrinol. Metab. 2001. V. 12. P. 366-370.

479. Zippin J.H., Chen Y., Nahirney P., Kamenetsky M., Wuttke M.S., Fischman D.A., Levinm L.R., Buck J. Compartmentalization of bicarbonate-sensitive adenylyl cyclase in distinct signaling microdomains //The Faseb. J. 2003. V. 17. P. 82-84.

Информация о работе

Ломоватская, Лидия Арнольдовна
доктора биологических наук
Иркутск, 2009
ВАК 03.00.12

Диссертация

Аденилатциклазы растений: характеристика и роль в реализации защитных механизмов при стрессах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы