Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

цАМФ-мессенджерная система клеток растений и ее роль в регуляции транспорта воды и Са2+

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "цАМФ-мессенджерная система клеток растений и ее роль в регуляции транспорта воды и Са2+"

госсийЬ1ая М\демия сельскохозяйственных наук

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧ НО-ИССЛЕДО ВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ PACTEНИЕВОДСТВА имени Н.И.ВАВИЛОВА

На правах рукописи КАРИМОВА Фатима Габдуппазяновна

УДК 577.175.1:581.13

цАМФ-МЕССЕНДЖЕРНАЯ СИСТЕМА КЛЕТОК РАСТЕНИЙ И ЕЕ ЮЛЬ В РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСПОРТА ВОДЫ И Са2+

03.00.12 - физиология растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ - 1994

Работа выполнена в 1978-1993 г. г. в отделе энергетики и адаптации растений Института биологии Казанского Научного Центра РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

B. И. Кефели;

доктор биологических наук, профессор О.О.Лялин;

доктор биологических наук, профессор

C. С. Медведев.

Ведущее учреждение: Казанский государственный университет.

Защита состоится "¿З 1994 года в часов

на заседании Специализированного совета Л 020.18.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства имени Н. И. Вавилова по адресу: 190000, Санкт-Петербург, Центр, Большая Морская ул., 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства им. Н. И. Вавилова.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

О^а&му*/^ э. д Гончарова

ОБОСНОВАНИЕ ПРОБЛЕМЫ И ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. .Одной из важнейших проблем современной биологии является изучение регуляции клеточной активности, находящейся под контролем значительного числа гормонов и физиологически активных соединений, действующих с поверхности клетки. Наиболее универсальны и достаточно строго очерчены две клеточные сигнальные системы, осуществляющие эффективную передачу и усиление внешних сигналов и реализующие их действие на молекулярном уровне. Первая из них - аденилатциклазная, она связана с изменением уровня цАМФ (Sutherland et al.,1962; Ткачук, 1983; Северин, Кочеткова, 1985;). Вторая система,Са^+-полифосфоинозитольная, в которой участвуют инозитолтрисфосфат (ИФд),Са^+ и диацилглицерол СДАЙ CRasmussen, 1985, Радченко, 1991). Основные данные о способах и путях сопряжения внешних стимулов с внутриклеточными структурами, реализующими конечный физиологический ответ, получены при изучении клеток животного происхождения CKrebs, 1972; Cohen, 1992).

К началу наших исследований продолжительное время велась дискуссия о возможности функционирования аденилатциклазной системы в клетках растений CAmrhein, 1974; Королев, Выскребенцева, 1978; Franco,1983; Яворская, Калинин, 1984; Newton, Brown, 1986; Доман, Феденко, 1986).Наряду с имеющимися в литературе данными о повышении уровня эндогенного цАМФ под действием фитогормонов, о непосредственном измерении активности аденилатциклазы и стимуляции ее активности фитогормонами.об имитации экзогенным цАМФ действия различных фитогормонов на рост,активность ферментов и различные физиологические процессы, имелся целый ряд публикаций об отсутствии влияния фитогормонов на активность аденилатциклазы, о незначительном содержании цАМФ или даже отсутствии его в растениях. Кроме того, очищенный цАМФ-связывающий белок растений не проявлял протеинкиназной активности. Все это служило основанием тому, чтобы подвергнуть сомнению само существование системы цАМФ и ее роль в регуляции клеточной активности растений CAmrhein, 1977; Letham, 1978). Полагали, что в растениях цАМФ может играть роль, подобную обнаруживаемой в прокариотах, где цАМФ оказывал свое действие на транскрипцию в комплексе с рецептором -цАМФ-связывающим белком,который специфически связывался с ДНК С Яворская .Калинин, 1984; Newton, Brown, 1986). Функционирование цАМФ-

зависимых протеинкиназ у прокариот .отрицалось CPastan, Adhya, 1976), однако, в последующем было доказано (Saier et al., 1990).

Отрицательные результаты, полученные при исследовании цАМФ-мессенджерной системы в растениях, очевидно, не случайны. В растениях обнаружены соединения, мешающие определению содержания цАМФ СJohnson et al.,1981; Nikaido et al.,1987).Отмечается необходимость обеспечения нативности клеточных структур при определении цАМФ в растениях CGadeyne et al., 1990; Roef et al.,1990), что важно и при определении активности аденилатциклазы. Опреде- . лению активности цАМФ-зависимых протеинкиназ в грубых экстрактах растений может мешать наличие их ингибиторов CWalsh et al.,1971) и других протеинкиназ - известно,что в тканях животных активность только небольшой части протеинкиназ зависит от цАМФ CLangan, 1973).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение возможности и особенностей функционирования системы цАМФ в клетках высших растений,а также :роли цАМФ-зависимого фосфорили-рования белков растений в регуляции их важнейших физиологических функций:транспорте Са^+ и воды. В задачи исследования входило:

- проверить надежность применяемого в изучении животных объектов простого и доступного метода анализа цАМФ по Gilman С1970) для тканей растений и определить содержание этого циклонуклеотида в клетках и его секрецию в зависимости от различных физиологических условий; .

- выявить активность ключевых ферментов системы цАМФ: аденилатциклазы и цАМФ-зависимых протеинкиназ в растениях;

- изучить особенности функционирования цАМФ-зависимых протеинкиназ и цАМФ-зависимого фосфорилирования белков растений;

- выявить роль фосфопротеинфосфатаз в регуляции уровня фосфори-лированности белков растений;

- изучить влияние цАМФ на транспорт ионов кальция (Са2+) в клетках растений, так как наряду с цАМФ важнейшим вторичным посредником регуляции метаболизма живых клеток являются ионы кальция. В связи с этим чрезвычайно важна регуляция их концентрации в компартментах клетки различными мембранными транспортными механизмами;

- изучить механизмы регуляции транспорта воды в растениях вторичными мессенджерами: цАМФ и Са^+, т.к. важнейшим условием обеспечения оптимального функционирования живых клеток является сохранение их оводненности,что обеспечивается метаболическое

- 5 -

регуляцией транспорта воды.

Основные исследования выполнены на этиолированных проростках гороха, зеленых листьях и корнях гороха и бобов, выращенных в лабораторных условиях.

Научная новизна работы. Подтверждена надежность применения простого метода определения цАМФ по Gilman С1970) в экстрактах тканей растений, очищенных с помощью ионообменных смол и окиси алюминия. Диапазон содержания цАМФ в тканях растений соответствовал уровню циклонуклеотида в тканях животных. Стресс Сотрезание ткани от целого растения, удаление клеточной стенки) вызывал резкое увеличение содержания цАМФ в клетках и егс секрецию в среду. Секреция цАМФ клетками растений зависела от присутствия гормонов и Сай+ в среде.

Показана роль Са^+ в действии гормонов на активность адени-латциклазы в тканях гороха.

Впервые показано, что цАМФ-зависимые протеинкиназы в тканях растений могут быть активированы в разной степени уже в процессе приготовления гомогената и выделения белков,что может быть одной из причин трудностей в определении активности ферментов. Продемонстрирована регуляция цАМФ-зависимой протеинкиназной активности в тканях растений различными агентами,влияющими на конформа-цию биополимеров.

Впервые показано усиление цАМФ-зависимого фосфорилирования белков растений при ингибировании Са^-зависимых фосфопротеинфос-фатаз, что согласуется с гипотезой Ingebritsen, Cohen С1983) о каскадной регуляции фосфорилирования - дефосфорилирования белков. Ингибиторы фосфатаз увеличивали содержание фосфата в белках этиолированных листьев гороха; при этом изменялась степень чАМФ- и Са^+-зависимого фосфорилирования белков.

Впервые показано,что цАМФ in vivo сильнее всего фосфорили-ровал полипептиды мол. массы 11,13,18,27,39 и 120 кДа. Полипептиды мол.массы 11,13 и 27 кДа фосфорилировались цАМФ как in vivo, так и in vitro.^

Впервые установлено, что 1 мМ цАМФ имитировал эффект ИУК in vivo в этиолированных проростках гороха на повышение фосфорилирования полипептида мол. массы 25 кДа; 1 мкМ цАМФ имитировал действие кинетина и АБК на повышение фосфорилирования аолипепти-да мол. массы 37 к Да.

Впервые выявлена резкая стимуляция экзогенным цАМФ фосфорилирования полипептидаСов) мол. массы 9-10 кДа при +4°С за 2 часа

- е -

инкубации проростков гороха, что может иметь значение в приспособительных реакциях растений на низкотемпературный стресс. Фи-тогормон АБК в условиях низкотемпературного стресса С+4°С) повышал уровень фосфорилирования большого числа полипептидоз, в том числе полипептидаСов) мол. массы 9-10 кДа.

Получены данные о регуляции экзогенным цАМФ и фитогормоном ЛУК транспорта в клетки растений. Данные о снятии эффекта ИУК и АТФ нифедипином,блскатором фосфорилированкых Са^+-каналов, позволяют сделать вывод о том, что фитогормон ИУК регулирует транспорт Са^+ в клетках растений через системы вторичных мессенджеров.

Экзогенные цАМФ и регулировали транспорт воды в клетках растений. Показано участие цАМФ- и Са2+- зависимых протеинкиназ в транспорте воды и необходимость цАМФ- и Са2+-зависимого фосфорилирования белков для удержания воды в клетках растений.

Практическая значимость работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание физиолого - биохимических механизмов, лежащих I основе регуляции клеточной активности растений.

Выявленная роль цАМФ, Са2+,активируемого ими фосфорилирования белков и связанных-с этим процессов транспорта воды и ионов является базой для создания более эффективных биотехнологических приемов выращивания растений из каллусов и культуры клеток,повышения устойчивости сельскохозяйственных культур к низким температурам и другим видам стрессоров.

Полученные результаты использовались в учебном процессе при чтении лекций на кафедрах физиологии и биохимии Казанского гос. университета, а также на кафедре промышленной биотехнологии Казанского технологического университета. На защиту выносятся следующие положения:

1. В клетках растений функционирует цАМФ-мессенджерная система регуляции метаболизма. Это положение обосновывается фактами нахождения активности аденилатциклазы и цАМФ-зависимых протеинкиназ и фосфопротеинфосфатаз в клетках высших растений и ее частях, а также обнаружением цАМФ-зависимого фосфорилирования белков в тканях растений при действии различных факторов.

2. В механизмы действия фитогорконов включена цАМФ- мессенджэр-ная система; она тесно связана с Са2+-полифосфоинозигольной мессенджерной системой.

3. В приспособительных реакциях растений на действие стресс-факторов принимает участие цАМФ-зависимое фосфорилирование бел-

ков, которое включено в механизмы действия фатогормона АБК. 4. цАМФ- мессенджерная систэма придашает участие в регуляции физиологических функций клеток растений - транспорте воды и Са2*

Апробация работы. ¡Материалы диссертации доложены на Всесоюзном симпозиуме "Водный режим растений в связи с разными экологическими условиями" СКазань, 1976), на Международных конференциях "Бода и ионы е биологических системах" (Румыния, Бухарест, 1980, 1934, 1987), "Вода и зоднкэ растворы в биологических системах" (Югославия, Блед, 1981), иа 7 и 8 Всесоюзных симпозиумах походному режиму растений СКиев, 1S31; Ташкент, 1384), на II Всесоюзной конференции "Биосинтез целлюлозы" СКазань, 1085), на У Всесоюзном биохимическим съезде СКззе&,1985), на 17 съезде Федерации Европейских биохимических обществ (Зап. Берл:га, 19S5), на 14-м Международном Конгрессе бксхишжсв СЧССР, Прага, 19S8), на Q—d Конгрессе Федерации Европейских обществ физиологов растений СЮгославия, Сплит, 1888), на Всесоюзной конференция "Регуляторы роста и развития вастеняй (Клев, 1S88), на X объединенной ск;шозиу?.'.е биохимических обществ СССР-ГДР СТашке&т,1889), на Всесоюзном совещании "Ионный транспорт и регуляция функций клетки" С Ленинград, 1990), на II съезде ВОФР СМинск, 1990), на стятсзкумэ стран СНГ "Пути передачи внеклеточного сигнала" СЗвенигород, 1993), на 3-м съезде ВО'Р СС.-Петербург, 1S93), ка семинарах и итоговых научных конференциях КНЦ РАН СКазань, 1976-1993). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 44 работы. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 318 страницах машинописного текста Свключая иллюстрации и список литературы) и состоит из введения, трех глав, заключения и выводов. В работе представлены: 51 таблица, 59 рисунков, 4 фотографии. Список литературы включает 529 наименований,из них 348 на иностранных языках

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основные исследования выполнены на корнях и зеленых листьях гороха и бобов,зеленых проростках пшеницы, этиолированных проростках гороха, кояеоптелях кукурузы,выращенных в лабораторных условиях на 1/4 среды Хогланда-Арнона под люминостатом Сили в темноте) и культуре одноклеточной водоросли Chlasydoraonas "roin-chardtii CW-15.

Анализ содержания цАМФ в тканях растений и его секреции в

среду проводился с применением метода изотопного разведения с использованием цАМФ-связывасщего белка фирмы "AmershanfíАнглия) или "Алга" С С.-Петербург) согласно Gilman С1970). Гомогенаты тканей, инкубационные среды перед определением очищались с помощью колоночной : хроматографии с применением ионообменной смолы Дауэкс 50Wx8 или 1x8 С200-400 меш) в форме катионита и высушенной AlgOg, нейтральной по Брокману II. Воздействие физиологически активных соединений проводилось при инкубации целых проростков, отрезанных стеблей или корней растений, клеток водорослей (или изолированных протопластов) за различные промежутки времени.

Активность аденилатциклазы определяли в гомогенатах из тканей растений двумя методами: с помощью а ^Р-АТФ (White, Zenser, 1971) и с помощью цАМФ-связывающего белка (Авдонин,Ткачук,1978).

Протеинкиназная активность определялась во фракциях гомоге-ната (супернатант и осадок 20 ООО g после 3-минутного центрифугирования) согласно Kikkawa et al. (1983) в модификации Алахова и др.(198G) в присутствии различных эффекторов.Удельную активность ферментов выражали в пмолях ^Р ка мг белка в минуту. Белок определяли по Лоури в осадках ТХУ. После определения активности фермента часть реакционной смеси использовали для электрофореза согласно Laemmli (1970) в ПААГ с 0,1% ДДС-На с линейным градиентом 6-16% акриламида.Радиоавтографию получали при экспозиции геля 14 дней при -20°С, гели и радиоавтографы сканировали на денситог-рафе LKB'2202 ("LKB", Швеция).

Фосфорилирование белков in vivo проводилось за 2 часа инкубации на слабом рассеянном свету отделенных стеблей с листьями

ор

или целых проростков в растворах с Р-ортофосфорной кислоты и

эффекторов.Затем ткани быстро гомогенизировались,учитывалось поя?

глощение Рн проростками и фосфорилирование белков. Разделение фосфорилированных белков проводили методом электрофореза по Laemmli (1970) с последующей ргдиоавтографией.

Для изучения поглощения Са^+ использовали изотоп ^Са и культуру одноклеточной водоросли Chlamydomonas г. CW-15 "(штамм без клеточной стенки) из коллекции ИФР им. Тимирязева, которая любезно была предоставлена нам М.Г.Владимировой (Владимирова, Маркелова,1980). Радиоактивность просчитывали на счетчике "Дель-та-300" (США).

Транспорт воды изучали рефрактометрическим методом (Гусев, 1964) с модификациями.

Опыты проводились в 3-х биологических повторностях от 3 до

Э раз. Экспериментальные данные обрабатывали статистически. Критерий достоверности определяли при уровне значимости Р <0,01 доверительного интервала. В диссертации приводятся значения биологических повториостей и 'средние ошибки.

В работе использовали наборы для определения цАМФ фирмы "Amersham" (Англия), "Алга" СС.-Петербург); для определения про-теинкиназной активности использовали у-^Р-АТФ (удельная активность 1000 Кори • ммоль-1) фирмы "Amersham" и ПО "йзотоп" (Ташкент); для фосфорилирования белков in vivo использовали ^Р-ортофосфорную кислоту (удельная активность 5000 Кюри-ммоль~Ъ ПО "йзотоп". MgCl2 "ВДН" (Англия), PIPES, ДТТ, ЭГТА, цАМФ, SUS, ак-риламид и бис-акриламид, Кумасси R-250, PMSF, белковый ингибитор цАМФ-зависимых протеинкиназ СБЮ фирмы "Serva", с удельной активностью 3 пмоль/мг белка в мин. БИ - также фирмы "Алга" (С.-Петербург), вазопрессин "Calbiochem", тритон Х-100 "Terак",соли воль-фрамата, молибдата, ванадата отечественные, хч; CaClg.NaCl, KCl, CaíNO^g - хч, перекристаллизованные.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

' АКТИВНОСТЬ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ Изучению активности аденилатциклазы в тканях растений посвящено много работ (Brovm,Newton, 1986), в том числе - и отечественных исследователей (Поляков и др.,1977; Выскребенцева,Иванов, 1981; Феденко и др.,1983;Иванов,1986; Иванов,Выскребенцева,1986). Были опубликованы работы, в которых активность аденилатциклазы не выявлялась (Yunghans, Marre, 1977; Hinterman. Parish, 1979).

Наши опыты показали,что значения удельной активности аденилат-циклазы (от 14 до 60 пмоль Р цАМФ/мг белка в мин.) были сопоставимы. с таковыми, полученными на животных тканях. Величины активности фермента в корнях и листьях гороха были одного порядка, известные активаторы аденилатциклазы ГТФ и NaF увеличивали активность фермента в тканях бобов и гороха (Karimova, Avdonin, 1986). Чтобы убедиться в подлинности определяемого цАМФ, образовавшегося за 10 мин. опыта в результате активации аденилатциклазы, проводили его гидролиз экзогенной ФДЗ цАМФ из сетчатки глаза быка. (Эта часть работы проводилась в лаборатории В.Ткачук совместно с П.Авдониным из Кардиоцентра РАЮ. Снижение содержания цАМФ в 20 раз за 30 мин. гидролиза ФДЭ цАМФ убедительно доказало подлинность определяемого цАМФ. Предварительно нами показано,что

соединений, мешающих определению фосфодиэстеразной активности в гомогенате корней гороха не было; активность ФДЭ составляла 2 мкМ/мг белка в минуту.

Изученные нами фитогормон ИУК С10"^ М) и пептидный гормо животного ^происхождения вазопрессин, регулятор водно-солевог баланса клеток животных. С 2- 10~® М), изменяли активност аденилатциклазы в гомогенатах корней 5-11-дневных растений бобо в зависимости от условий выращивания растений. Активность адени латциклазы под действием гормона вазопрессина увеличивалась гомогенатах растений, выращенных на среде с и К+; в гомоге натах же растений, выращенных на водопроводной воде, уменьшалас Эти данные согласуются с данными литературы о том, что ионны состав среды определяет внутриклеточный уровень цАМФ и увеличе ние активности аденилатциклазы под действием ГК в 3 раза и - ИУ. в 2 раза CGianattasio, Macchia,1973;Janistyn,1972) и также иллю стрируют взаимодействие двух систем вторичных мессенджеров: Ca2 и цАМФ.

СОДЕРЖАНИЕ цАМФ'

Несмотря на положительное разрешение вопроса о наличии цАМ в растениях (Bressan et al.,1976, 1980; Ashton.Polya, 1977,1978 Newton et al., 1980; Johnson et al, 1981; Janistyn, 1981; Van Oncelen et al.,1982; Franco,1983; Brown, Newton, 1986; Яворская 1990), все еще появляются работы, в которых авторы считают обна ружение цАМФ в растениях артефактом CSpiteri et al. , 1989). В связи с этим нами проведена проверка надежности применения доступного метода Gilman С1970) для определения цАМФ в экстрактах из растений, используя приемы очистки экстрактов, предложенные ранее Bressan et al.С1976), Ashton, Polya С1977). Проведенные нами опыты показали, что при соблюдении условий,необходимых для определения цАМФ в экстрактах из любых тканей - 6\ страя фиксация тканей; депротеинизация; разведение гомогенат; перед определением; очистка от мешающих соединений; устранение гидролиза цАМФ фосфодиэстеразой С Brown et al. ,1976) - нет никак] противопоказаний применять метод Gilman С1970) для определение содержания цАМФ в тканях растений (Каримова и др. ,1990).

Значимость системы цАМФ в регуляции метаболизма клеток растений продемонстрирована нами в опытах с набухающими семенами скерды кровельной при прохождении фаз клеточного цикла (Семенов Каримова и др.,1993); с протопластами, изолированными из листье]

-

обов и культивируемыми в стерильных условиях (Losovaya et al., 987; Тарчевская, 1989); с проростками гороха и культурой одно-леточной водоросли Chlamydomonas г. CW-15 при действии фитогор-юнов и экзогенных Са2+' СКаримова я др., 1990, 1993).

СЕКРЕЦИЯ цАМФ

В регуляция концентрации цАМФ в жввых клетках важная роль фянадлежит секреции цАМФ в окружающую среду CMakman, Sutherland, ,965).Это явление характерно для клеток всех ступеней эволюции -гг прокариот до высших эукариот. Физиологическое значение секреции цАМФ неясно (Fehr et al.,1990). Наши опыта показали,что эна-штельное количество цАМФ секретировалось отсеченными корнями пвеницы в инкубационную среду (рис. 1А-2), прячем максимум секреции цАМФ совпадал по времени с максимальным содержанием оАМФ, образованного в отсеченных корнях Срис.1Б-1). Об увеличении со-хержаняя и секреция цАМФ клетками колеоптилей кукурузы и корней jodoB при их инкубация с фитогормоном ИУК я животным гормоном -аазопрессином свидетельствует данные ряс. 2. Полученные вами даяние по различному действию экзогенного Са^+ на эффекты ИУК [рис. 2Б) и вазопрессина Срис. 2А) могут свидетельствовать о некоторых различиях в механизмах действия фитогормонов и регуляторов пептидного происхождения.

цАМФ-ЗАВИСИМАЯ ПРОТЕИНКИНАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ РАСТЕНИИ

Результаты наших исследований in vivo пбказали.что экзогенный цАМФ стимулирует фосфорилирование большого числа полипептидов низкой мол. массы Срис. ЗА), однако увеличение концентрации экзогенного цАМФ до 1 мМ уменьшало количество полипептидов, фосфорилирование которых стимулировалось цАМФ и резко увеличивало количество полипептидов средних и высокомолекулярных масс,фосфорилирование которых ингибировалось цАМФ Срис. ЗБ).

Согласно гипотезе Greengard С1978) эффекты, вызываемые цАМФ внутри живой клетки,опосредованы цАМФ-зависимыми протеинкиназами.

Определению активности цАМФ-зависимых протеинкиназ в грубых экстрактах мешает присутствие других цАМФ-независимых протеинкиназ. Мы использовали высокоспецифичный белковый ингибитор цАМФ-зависимых протеинкиназ фирм "Sigma" CUSA) и "Алга"СС.-Петербург) для выявления цАМФ-зависимой протеинкиназной активности; впервые

2.5

2.0

1.5

сз §

ЧЭ

5: \

л §

i

4,0

5Г

^ 3.0

5.0

2.0

1.0

г

2 3 4 5 6

12 3 4 5 5 Время, час.

Рис. I. Динамика содержания цАМФв корнях пшеницы по мере их инкубации в растворе хлористого кальция, Ю~4М0 А.: I—в отрезанных корнях; 2-в ин,-куб, среде; Б: 1-сумма содержания в отрезанных корнях + секретированного в среду; 2-в интактаых корнях

контроль вазопрессин Вазопрессин 2,Ч-Ю~ЬМ +Са2/1тМ

к -э с § 2'5'

СО

а •©

и

Я

2,0-

Й 1,5..

о

I

о

аз

1.0-

1

Контроль ИУК, 1мМ ИУК+Са.1мМ

Рис*. 2.Влияние гормонов на содержание - и секрецию - ■ цАМФ: А - корнями 8-дневных бобов; Б - отрезками 4-дневных колеоптилей кукурузы

лю : 67 «Г- ¿5 в* Мол.м.кВа

Рис. 3. Денситограммы радиоавтографов Р-фосфорилированных ¿л г£и-о ■ белков листьев гороха (супернатант 20 000«), .полученных при электрофорезе в градиенте 6-16% ПААГ с 0,1% А: а - контроль (вода), £ - I мкМ цАМФ; Б: а •- контроль (вода), £ - I мМ цАМФ

этот ингибитор был выделен и охарактеризован в лаборатории Krebs CWalsh et al., 1971). Подавление фосфорилирования белков этим ингибитором свидетельствует о наличии цАМФ-зависимых протеинки-

Таблица 1

Влияние белкового ингибитора цАМФ-зависимых протеинкиназ СБГО на цАМФ-зависимую протеинкиназную активность фракций гомогената Ссупернатант 20 ООО д) этиолированных листьев гороха.

N п/п Возраст растений Сдни) пмоль/мг белка мин.

Базальная цАМФ, 10"8 М цАМФ + Ш,5 мкг

1 5 102-2 204-26 85±17

2 10 161-14 242-9 132-^6

3 14 92-5 122-2 46-4

наз, величина активности которых может быть выражена величиной подавления фосфорилирования ингибитором. Действительно, в наших

Таблица 2

Действие белкового ингибитора цАМФ-зависимых протеинкиназ СБГО на базальное фосфорилирование белков фракций гомогената этиолированных листьев гороха

N п/п Возраст растений Сдни) Фракции гомогената 32р> имп/мин.

Базальное БИ, 5 мкг У.

1 2 7 10 Супернатант, 20 000 g и I* 1833-21 1788-5 1528-10 514-3 83 28

5 4 Осадок, 3374-3 1809±11 53

20 000 g

6 10 • 1 и 2339-16 1516^7 64

опытах в случае, когда наблюдалась стимуляция экзогенным цАМФ базальной протеинкиназной активности, она снималась белковым ин-

гибитором (табл. 1), что однозначно свидетельствует о функционировании цАМФ-зависимых протеинкиназ в растениях. Данные свидетельствуют, что белковый ингибитор подавлял значительную часть ба-зальной протеинкиназной активности в растительных экстрактахСтабл. 1 и 2).Это означает, что протеинкиназы были активированы еще до опыта. Активирование цАМФ-зависимых протеинкиназ до их определения может быть вызвано отделением тканей от целого растения, т.к. это является мощным стресс-фактором СГордон, 1992; Пахомова 1992), который, активируя аденилатциклазу, может повысить содержание эндогенного цАМФ. Действительно, наши опыты показали резкое увеличение содержания эндогенного цАМФ в отделенных корнях „пшеницы, бобов, £ороха и. колеоптилях кукурузы и его секрецию в среду инкубации Срис. 1), СКаримова и др., 1993).

Таким образом, одной из причин неудач в определении активности цАМФ-зависимых протеинкиназ в растениях может быть активирование ферментов эндогенным цАМФ еще до опыта. Такое предположение сделали в 1986 г. Newton и Brown. Полученные нами данные однозначно доказывают наличие активности цАМФ-зависимых протеинкиназ в гомогенатах растений (Каримова и др., 19S3).

Причиной того,что экзогенный цАМФ может не всегда оказывать стимулирующий эффект на протеинкиназную активность грубых экстрактов из тканей растений или очищенных белков, обладающих проте инкиназной активностью, может быть еще и в особенностях цАМФ-зависимых протеинкиназ, в их высокой специфичности (Cohen, 1978) При отсутствии цАМФ-зависимого фосфорилирования белков животного происхождения модифицировали их конформацию различным способами,что приводило к появлению фосфорилирования белков цАМФ зависимым способом; таким образом было продемонстрировано значен доступности мест фосфорилирования для цАМФ-зависимых протеинкина (Bylund, Krebs,1975; Дзгоев, Иванова,1990). Подобные опыты, проведенные наш с белками грубой фракции ядер,изолированных из корней гороха,показали, что обработка полученной фракции ядер 0,01 раствором детергента додецилсульфата натрия уменьшила величину цАМФ-зависимого фосфорилирования с 45% до нуля, а тритона Х-10С повысила эту величину с 33 до 39% (Каримова и др. , 1993). Эти опыты свидетельствуют о значении конформации белков-субстратов фосфорилирования, т.е. доступности мест фосфорилирования для цАМФ-зависимых протеинкиназ, а также об универсальности механизмов регуляции активности цАМФ-зависимых протеинкиназ в живо-

- 17 -

тных и растительных клетках.

Нами впервые показана стимуляция цАМФ-зависимой протеинки-назной активности в гомогенатах листьев гороха в присутствии больших концентраций ЭГТА - до 5 мМ Срис. 46),СКаримова и др.,1989). Эффект ЭГТА на цАМФ-зависимую протеинкиназную активность гомоге-ната листьев гороха может быть обьяснен каскадной регуляцией цАМФ-зависимого фосфорилирования белков, предложенной Ingebrit-sen, Cohen С1983) на основании анализа данных, полученных на клетках животных: ингибируя Са2+-зависимые протеинфосфатазы.ЭГТА может усиливать цАМФ-зависимое фосфорилирование белков. В то же время ЭГТА, хелатируя Са2+, может уменьшить вклад Са2+-зависимых протеинкиназ в базальную активность, этим могут быть объяснены данные по влиянию ЭГТА на базальную протеинкиназную активность (рис. 4а).

В присутствии 5 мМ ЭГТА мы определили для цАМФ-зависимой протеинкиназной активности оптимум pH,равный 6,5, - температуры -30°С, - концентрации цАМФ -10"8-10"1оМ; Кд для АТФ - И мкМ.Добавление экзогенного субстрата гистона HI в 3 раза увеличивало активность; аналоги цАМФ - 5'АМФ и 2'3'АМФ не влияли на ферментативную активность; теофилин - ингибитор фосфодиэстеразы 3'5'цАМФ увеличивал активность фермента при концентрациях цАМФ в пробе 1 мкМ и ниже СКаримова и др., 1991).

Протеинкиназная активность, стимулируемая цАМФ, найдена нами в клеточных стенках, ядрах, митохондриях,плазматических мембранах,что соответствует данным, полученным на тканях животных.In víyo цАМФ сильнее всего фосфорилировал белки мол. массой 11,13, 18, 27, 39, 120 кДа (рис. 3). Белки мол.массы 11, 13 и 27 кДа фосфорилировались цАМФ как in vivo, так и in Yitro.

Таким образом,наши опыты показали,что основные принципы регуляции активности цАМФ-зависимых протеинкиназ в клетках растений те же, что и в животных клетках. Наши результаты позволяют сделать однозначный вывод о функционировании цАМФ-зависимых протеинкиназ в клетках растений. Это согласуется с существующими немногими данными в литературе о стимуляции экзогенным цАМФ протеинкиназной активности частично очищенных белков растений (Kato et al.,1983; Janistyn, 1986, 1988; Яворская, 1990), а также данными о фосфорилировании экзогенной цАМФ-зависимой протеинкиназой животного происхождения белков растений СMarme et al,1983).

О-

[ЭГТД.мН]

Рис. 4. Зависимость базальной (а) и цАМФ-зависимой (б) активности протеинкиназ гомогената 5-дневных зеленых листьев гороха (супернатант 20 ОООд) ■ от концентрации ЭГТА

- 19 -

Ф0СФ0ПР0ТЕИНФАТАЗЫ, РОЛЬ ИНГИБИТОРОВ ФОСФАТАЗ В ФОСФОРИЛИРОВАНИИ БЕЛКОВ РАСТЕНИИ

Уровень фосфорилиро^аннооти белков определяется скоростью двух процессов: интенсивностью их фосфорилирования, осуществляемого протеинкинаэами, и дефосфорилирования, катализируемого фосфспро-теинфосфатазами. Наши данные по увеличению фосфорилированности белков листьев гороха в 2-3 раза в присутствии различных ингибиторов фосфатаз CHaF, KgHPO^ Na^PgOy, Na2Vr04, NagMoO^, ЭГТА) подтверждают это положение.

Данные электрофореза и радиоавтографии фосфорилированных белков в- присутствии ингибиторов фосфатаз молибдата и ЭГТА свидетельствуют о функционирования в листьях гороха двух типов про-теинфосфатаз: Са2+-зависимых и Са^+-независимых Срис. 5), что согласуется с данными о наличии Са^-зависимых протеинфосфатаз в проростках гороха CHetherington, Trewavas, 1982).

При анализе причин изменения уровня фосфорилированности белков в зависимости от условий проведения опытов необходимо учитывать, что протеинкиназная и протеинфосфатазная реакции -особого типа. Если в абсолютном большинстве других биохимических реакций эффекторы не изменяют достаточно жесткую структуру субстратов реакции, и изменение интенсивности реакции однозначно определяется изменением активности фермента, то в случае 'фосфорили-рования-дефосфорилироваяия белков оказываются чувствительными к эффекторам (Сас+,цАМФ,~) и субстрат-белок Счто изменяет его атакуемость ферментом), и фермент (что изменяет его активность). Это делает значительно более гибкими, более регулируемыми, чем для большинства других случаев, реакции с участием белков в качестве субстратов. Это также позволяет понять,почему реакции фо-сфорилирования-дефосфорилирования белков лежат в основе регуля-торных цепей метаболизма клеток.

ВЛИЯНИЕ ФИТОГОРМОНОВ И НИЗКОЙ ПОЛОЖИТЕЛЬНОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ НА.цАМФ-ЗАВИСИМОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ РАСТЕНИИ

Исследование молекулярных механизмов действия фитогормонов на метаболизм растительной клетки - одна из актуальных проблем физиологии растений С Кефели,1974,1990;Кулаева,1982;Полевой,1982).

На растениях действие различных фитогормонов на фосфорили-рование белков изучается с достаточно давних пор (Ralph et al.,

■

базальное сЙМФ НоОгц~еЯМР+МоО%'сЯМР+МоОц+ЭГГД

12 3 4 5

рис. 5. Радиоактивность полипептидов фракции 1-3, изменяющихся под действием цАМФ; молибдата, ЭГТА (в 55 от базальной радиоактивности)

1972; Chapman et al., 1975). Влияние фитогормонов на протеинки-назную активность интенсивно изучается в лаборатории О.Н.Кунаевой. Действие фитогормонов 6-БАП, АБК, ПУК in vitro на активность протеинкиназ, связанных с мембранами тилакоидов, изучено Романко с сотр. (1990). Показано влияние бгБАП и АБК нафосфори-рилирование белков трансляционного комплекса в изолированных семядолях тыквы. Установлен тип протеинкиназы С кальмодулинзависи-мый), фосфорилирувдий EF1. Прямая активация хинетином протеинки-назной активности белка хроматина и выделенной из него РНК-поли-меразы I была показана в работах СеливанкиноЯ с сотр. (1987, 1988). Новикова (1989) установила, что выделенная и очищенная РНК-полимераза I из хроматина листьев ячменя обладала протеинки-назной активностью. Ассоциированная с РНК-полимеразой I протеин-киназа активировалась in Yitro цитокининами -(зеатином, 6-БАП,ки-нетином).

В лаборатории В.В.Полевого показано,что ИУК эа 10 мин; увеличивала включение ^Р в белки колеоптилей кукурузы на 50%, а за 40 ыин. разницы не было. Не отмечено влияние ИУК in vivo и in vitro на активность протеинкиназ (Танкелюн и др., 1992). В отлв-чне от этих данных ¡¡¡ривастава с соавт. (Srivastava et al., 1975) показали, что ИУК и цАМФ стимулировали протеинкиназы семян нута в первые 6 часов прорастания.

Все больше появляется работ, где сопоставляются механизмы действия гормонов животных и растений и на основе экспериментальных данных обосновывается включение систем вторичных мессенд-жеров в механизмы действия фитогормонов CTrewavas, 1983; Evans, Hasenstein, 1985; Owen, 1988; Zbell, Wailer-Back, 1988).

В наших опытах в оптимальных условиях низкая концентрация цАМФ (1 мкЮ воспроизводила эффект фитогормонов на суммарное фос-форилирование белков листьев гороха, высокая (1 мЮ концентрация цАМФ почти не оказывала эффекта С рис. 6). Однако данные электрофореза и радиоавтографии свидетельствовали, что 1 мМ цАМФ увеличивал фосфорилирование одних полипептидов,в то же время уменьшая фосфорилирование других, имитируя эффект ИУК на повышение фосфо-рилирования полипептида мол. массы 25 кДа. 1 мкМ цАМФ имитировал резкое повышение кинетином и АБК фосфорилирования полипептида фракции супернатанта 20 000 g мол.массы 37 кДа. ИУК увеличивала фосфорилирование 3-х полипептидов - 17,5; 18; 25; ГК - 17,5; 18; 37 кДа, т.е наблюдалось различие в спектре полипептидов, фосфо-

зпо

сх

* т

1 \

(ПО

1 •ч

контроль вода

ИУИ, Ю'еМ

ииншии 10~5М

ГН, Ю'?М

цДМФ 10-ЬМ

7,

цЙМФ 10'3М

Рис.. б.

32г

Влияние фитогормонов и цАМФ ¿л и-Иго на включение ' Р 8 белки фракций гомогената 7-дневных этиолированных листьев гороха (целые проростки инкубировались в растворах 2 часа при + 25°с) (• | - супернатант 20 ООО ^ осадок 20 ОСЮ#

14) IV)

- zs-

рилирование которых повышалось при действии разных фитогормонов. Эти данные говорят о специфичности действия фитогормонов.

Прямое влияние фитогормонов С in Yitro) на протеинкиназную активность фракций гомогената этиолированных листьев гороха нами изучалось на примере ИУК и кинетика. Полученные данные показывают, что под действием ИУК наблюдалось стимулирование активности протеинкиназ с оптимумом з области концентраций М. Это совпадает с данными, полученными ранее для цАМФ-зависимой активности (Каримова и сотр. ,1989). Подобные картины по концентрационной зависимости с оптимумом 10~®-10~® М были получены нами для кинетика. Однако в некоторых наших опытах кинетин in vitro подавлял протеинкиназную активность, как базальную, так и цАМФ-эависимую. Неоднозначность действия фитогормонов на фосфорилиро-вание белков и протеинкиназную активность в растениях как in vivo, так и in vitro отмечалась в литературе (Ralph et al, 1972; Chapman et al, 1975). Видимо, эти данные говорят о том, что'фя-тогормоны не прямо регулируют активность протеинкиназ, а опосре-ванно, через цепь событий.

Исходя из наших данных,можно полагать, что фитогормоны.так же, как и гормоны животного происхождения, контролируют активность как протеинкиназ, так и протеинфосфатаз.Однако представления о механизмах регуляции процессов фосфорилирования-дефосфорилирова-пия белкоз в растениях еще далеки от их понимания.

Данные об изменении протеинкчназной активности и фосфорили-рованил белков под влиянием фитогормонов позволяют предполагать включение в механизм их действия цАМФ- и Са2+-мессенджерных систем. Возможно, что фитогорионы на первых этапах своего действия связываются на плазмалеше с рецепторами,вызывая каскадное усиление сигнала через системы вторичных посредников. Не исключено, что фятогормоны (как и пептидны® гормоны животных),проникая в клетку з виде гормон-рецепторных комплексов,непосредственно влияют на внутриклеточные процессы. Фятогсрмояы близки по способности проникать через плазмалемму стероидным гормонам животных. На клетках животных показано, что стероидные гормоны зстрадиол и эстриол изменяют содержание циклических куклеотидов цАМФ и цГМФ в клетках животных (Flandroy, Galand, 1978), Они также регулируют активность цАМФ-завхсимых протеинкиназ. Грингард (Green-gar d, 1978) полагает, что один из белкоз, синтезированных под влиянием стероидных гормонов, оказывает влияние на фосфорилиро-

вание регуляторной субъединицы цАМФ-зависимой протеинкиназы II Сбелок мол. массы 54 кДа). Это - пример сопряжения действия двух типов (пептидных и стероидных) гормонов животного происхождения. Известно, что некоторые животные гормоны реализуют свое действие через две системы вторичных посредников: Са^+- и цАМФ. Примером может служить регулятор водно-солевого баланса,пептидный гормон вазопрессин, который в начале действия вызывает увеличение содержания цАМФ, а через 20 секунд - активирование Са^+-мессенджерной системы (Наточин и др., 1991). 0 том, что в растениях фитогормоны также могут'реализовать свое действие через обе (Са^+- и цАМФ-) мессенджерные системы, могут свидетельствовать наши опыты, показывающие стимулирующую роль экзогенного Са^ в увеличении содержания цАМФ под действием ИУК в клетках Chlamy-domonas r.CW-15 С Каримова и др.,1990).

Рассматривая возможные механизмы действия известных 5 классов фитогормонов,Гверн CGuern, 1987) полагает необходимым продемонстрировать ключевые положения действия гормонов через системы вторичных посредников:модуляцию фитогормонами концентрации внутриклеточного уровня вторичных мессенджеров, наличие G-регулятор-ных белков, фосфорилирования белков. Изменение уровня цАМФ под действием фитогормонов показано в многочисленных работах (Королев, Выскребенцева, 1978; Newton, Brown, 1986; Яворская, 1990; Каримова и др., 1990); все больше данных об изменении фитогормонами концентрации свободных Са^+ (Felle, 1988; Owen, 1988; Saunders and Hepler, 1982) и фосфорилирования белков, о чем мы; уже упоминали. Быстрое фосфорилирование эндогенных липидов под действием ИУК показано в суспензионной культуре моркови (Zbell, Walter-Back, 1988). Наличие G-белков, их свойства в растениях показано работами Бабакова и Абрамычевой (1989), Билуши и Бабакова (1992). Приведенные данные свидетельствуют о соответствии критериев действия фитогормонов через системы вторичных мессенджеров.

ВЛИЯНИЕ НИЗКОЙ ПОЛОЖИТЕЛЬНОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ НА цАМФ-ЗАВИ-СИМОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЖОВ РАСТЕНИИ

Влиянию низких температур на метаболические процессы в клетках растений посвящены многочисленные публикации. Одной из-основных реакций растений на низкие температуры является увеличение в них содержания гормона АБК; наблюдается увели-

тение з составе мембран количества ненасыщенных ирных "всяслот. Это обусловливает снижение температуры фазового

перехода тЙШидов из

жидко-кристаллического .состояния в твердое, что сохраняет высокую проницаемость мембран, необходимую для быстрого транспорта воды и ионов из клетки СХохлова, 1985). В клетках высших растений ухе через 30 минут воздействия низкой температуры регистрируется уменьшение интенсивности синтеза большинства белков СТитов и др., 1992); затем происходит образование совершенно новых стрессовых белхов, спектры котсркх различаются у растений разных видов СВойников, 1985; Титов, 1589; Кузнецов, 1992). Непосредственное изменение содержания цАйФ, активности ФДЭ цАМФ и стимулирующее действие экзогенной цАМФ на активность РНК-полиме-разы II в проростках ржи при действии низкой температуры показали в своих работах Яворская С1990) и Драговоз С1991). Об участии цАМФ в регуляции синтеза зерновок пшеницы в норме и при засухе свидетельствует работа Максютовой с сотр. С1989). Приведенные данные свидетельствуют об участии цАМФ в ответных реакциях растений на стресс-факторы. Об этом же косвенно могут свидетельствовать единичные работы по изменению фосфорилироваяня белков растений при низкой температуре СМ!погзку, 1985).

Нама выявлена роль цАМФ в фосфорилировании белков листьев гороха при действии низкой положительной температур« С+4°С) на целые проростки в течение 2-х часов: данные электрофореза и ра-диоаЕтографии показали резкое повышение фосфорилироваяня низко-молекулярного(ых) полипептидаСов) мол. кассы 9-10 кДа: в 11 раз - во фракции супернатанта; в 15 раз - осадка. Кроме того, наблюдалось изменение степени фосфорилирования других полипептидов средних мол.масс. Воспроизведение действия цАМФ на фосфорилиро-вание полипептидаСов) мол. массы 9-10 кДа фитогормсном АБК при низкой температуре указывает на участие этого события в приспособительных реакциях растений к пониженной температуре Спри оптимальной температуре АБК не изменяла фосфорилнроваиие этогоСих) полипептидаСов) (Каримова, Жуков, 1991). Роль АБК в воспроизведении действия цАМФ более наглядно выявилась' в наших опытах с разной длительностью воздействия низкой температуры на проростки Сот 2 до 12 часов).Если при двухчасовой инкубация проростков гороха при низкой температуре действие цАМФ воспроизводило действие АБК на суммарное фосфорилированне белков только осадка, то при +4°С за 12 часов инкубации АБК резко усиливала фосфорилиро-

вание белков обеих фракций. Различия в степени изменения действия цАМФ и АБК на фосфорилирование белков фракций гомогената при низкой температуре за различные времена инкубации свидетельствуют об острой необходимости цАМФ уже в первые часы действия низкотемпературного стресса, особенно для фосфорилирования белков осадочной фракции; при длительной же экспозиции растений запас цАМФ мог быть исчерпан, сама же АБК могла вызвать долговременную стимуляцию фосфорилирования белков Скак цАМФ-,так и Са -зависимую). При длительной Сдо 12 часов) инкубации растений при 25°С АБК почти в 3 раза повышала фосфорилирование белков осадка, не изменяя фосфорилирование белков фракции супернатанта, т.е. воспроизводила эффект цАМФ при +4°С. Эти данные позволяют предполагать возможность включения в механизмы действия фитогормона АБК цАМФ-мессенджерную систему. О включении системы цАМФ в механизмы действия фитогормонов свидетельствуют также наши данные по изменению содержания цАМФ и цАМФ-зависимого фосфорилирования белков при действии фитогормонов и цАМФ на целые растения, их ткани и изолированные протопласты СКаримова и др., 1990), а также по воспроизведению действия фитогормона АБК цАМФ на фосфорилирование белков гороха за два часа инкубации проростков гороха при низкой положительной температуре +4°С. Итак, нами впервые показано изменение цАМФ-зависимого фосфорилирования белков гороха при 2-часовом действии низкой температуры на проростки гороха; отмечено резкое повышение фосфорилирования низкомолекулярно-гоСых) полипептидаСов) мол. массы 9-10 кДа экзогенным цАМФ и АБК за два часа инкубации проростков гороха при +4°С, что может иметь важное значение в приспособительных реакциях растений к низким температурам.

РОЛЬ цАМФ В ТРАНСПОРТЕ Са2+ ЧЕРЕЗ МЕМбРАНЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК На животных клетках' показано, что цАМФ-мессенджерная' система функционирует в тесной взаимосвязи с другой - Са^+-фосфоино-зитольной мессенджерной системой, роль которой в растениях обще-признана (Каг^еуа, ВоисМ, 1987 ; 0*еп, 1988). Роль вторичного посредника регуляции метаболизма Са2+ выполняет за счет изменения своей концентрации в различных компартментах клетки. Поэтому весьма актуально изучить механизмы, поддерживающие определенную концентрацию Са^+ в компартментах клетки. Полагают, что

»сновная масса Са2+ поступает в цитозоль через Са2+-каналы в шазматических мембранах СОрлов, 1987;- Авдонин, 1993). Публикации >б особенностях функционирования Са2+ -каналов в мембранах растительных клеток появились, в основном, в середине 80-х годов ;Ве11Ьу, 1984; Апбге^аизказ е1 а1., 1985; Магте, 1986; Жерелова I др., 1985, 1987; БШпа, Tazawa, 19&Г; '0кагак1 е1 а1., 1987; Медведев, 1990, 1991). Выявив, что состояние потенциалзависимых За2+-каналов в клетках Ш1е11орБ15 о^иБе зависит от наличия <д2+ и АТФ, Жерелова с сотр. С1985.1987) полагают, что эти канаты контролируются цАМФ-системой.

Роль цАМФ в регуляции транспорта Са2+ рассмотрена нами на примере одноклеточной водоросли СМатус1отопа5 г. СУ-15, мутанте, гашенном клеточной стенки, что позволяет избежать влияния связывания ионов полимерами клеточной стенки. Это дало нам возмож-аость получить достоверные результаты, позволяющие судить о механизмах транспорта Са через плазматические мембраны клеток растений.

Экзогенный цАМФ изменял поглощение Са2+ клетками водорослей в зависимости от плотности клеток в культуре Срис. 7). цАМФ в концентрации 10"® до 10~6 М ингибировал поступление Са2+ в клетки, где плотность клеток в 1 мл была оптимальной - 106. При увеличении плотности клеток в культуре выше 10® в мл, цАМФ вызывал стимуляцию поглощения Са2+ клетками в диапазоне концентраций от 10~12 до Ю-7 Н. Ткачук, Авдонин и др.С1988) нашли, что увеличение внутриклеточной концентрации цАМФ блокирует рецепторопе-рируемые Са2+-каналы. Небезынтересны в связи с этим данные Конева с сотр. (1976) об увеличении выхода нуклеотидов из дрожжей при росте их плотности в культуре.Различное влияние цАМФ на поглощение Са2+ клетками водорослей, вероятно,объясняется наличием двух типов Са2+-каналов в их плазматических мембранах.

Об участии фосфорилирования белков Са2+-зависимых каналов в регуляции поступления Са2+ в клетки по Са2+-каналам можно судить по результатам наших опытов с блокатором Са2+-каналов нифедипи-ном, который блокирует белки каналов только в их фосфорилирован-ном виде СДмитренко,1981): нифедипин уменьшал поступление Са2+ в клетки водорослей на 36% по сравнению с контролем. Увеличение входа Са2+ в клетки в присутствии АТФ на 27% и снятие эффекта АТФ нифедепином также свидетельствует об участии фосфорилирования белков в поступлении Са2+ в клетки растений Стабл. 3).

1

«а

I

«о 5:

10

0.8

«о

§ 0,6

i +

<\1 -

<5 0,5

нонтрол,

10

■12

iо

-т

(О

-8

{О'6

[цАМФ,М]

1

1 0,45

<ъ * Ч 0,35

1

SJ Л CV 0,25

<3

[*АМФ,М]

Рис. 7. Зависимость поглощения клетками

Chl'amydomonas rexnhardtii GW—15 от концентрации цАМФ в среде.

а - 30 мкМ CaCIg в среде, 2.0А5 >10^ клеток в I мл; 6-50 мкМ СаС12 в среде, 1,002-Ю6 клеток в I мл

—29—

Эксперименты показали, что фитогормон ИУК увеличивал база-ьное С в 2,5 раза) и индуцированное увеличением внешней концен-рации Са2+ до 10~* М Сна 29%) поступление Са2+ в клетки водо-ослей. Эффект ИУК снимался нифедипином. Это позволяет предпола-

Таблица 3

лияние АТФ на поступление Са2+ в клетки водоросли СМатуйогаопаз е1пЬагс1Ш СТ-15Сконцентрация Са2+ в основной среде - 1,45 мЮ

Поглощение Са2+, нмоль на 1 кг белка за 1 мин.

Вариант опыта ---

в контроле в присутствии

нифедипина, 10~7 М

Основная среда* 13,3 + 0,1 8.6 + 1.8

+0,1 мМ АТФ 16,7 + 0,1 12,5 + 1,3

+0,2 мМ Na+ 11,7 + 0,9 11,2 + 1,3

+0,2 мМ Na+ + 0,1 мМ АТФ 13,6 + 2,3 10,0 + 0,1

■ать, что влияние ИУК на активность Са2+-каналов обусловлено кзменением фосфорилирования их белков. Это может быть Са2+ или 1АМФ-зависимое фосфорилирование; в пользу этого свидетельствуют :анные о том,что экзогенный цАМФ также оказывал эффект на поглощение Са2+ клетками водорослей в зависимости от его концентрации и количества клеток СКаримова и др., 1992), а также данные эб увеличении концентрации свободных ионов кальция в цитозоле ¡слеток водоросли при действии ИУК в работе Felle С1988).

РОЛЬ цАМФ и Са2+ В РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСПОРТА ВОДЫ В КЛЕТКАХ РАСТЕНИИ Физиолого-биохимические процессы в живой клетке протекают в водной среде, поэтому крайне важно поддерживать определенное содержание воды в них. Это достигается постоянным обменом воды между живыми клетками и их окружением. Величина водообмена зависит от степени проницаемости плазматических мембран и величины диффузии в цитозоле. Полагают, что транспорт воды через мембрану определяется свойствами липидного бислоя (изменением упаковки, ориентации, структуры и подвижности липидов), а также белковых

гидрофильных каналов в мембранах (Mild, Lovtrup,1985; Скобелева, 1990). На значение величины диффузии воды в цитоплазме в транспорте воды через мембраны клеток растений указывают работы A.M. Алексеева (1948, 1966). Многочисленными исследованиями доказана зависимость транспорта воды через мембраны живых клеток от их метаболизма (Гусев, 1974; Жолкевич, 1978; Можаева, Пилыцикова, 1979; Гринева, 1980; Удовенко, Гончарова, 1982; Гордон, 1984; Шматько и др., 1989; Лялин, Лукоянова, 1993). Однако механизмы метаболической регуляции транспорта воды через мембраны изучены далеко не полностью и составляют предмет исследования на сегодня.

. В результате проведенных нами исследований установлена зависимость водообмена клеток листьев растений от изменения состава и содержания в них липидов (Панкратова,Каримова,1984). При снижении общего количества липидов в листьях озимой ржи в поливном варианте на 15%, что сопровождалось увеличением содержания гли-колипида моногалактоэилдиацилглицерина. содержащего ненасыщенные жирные кислоты - линолевую и 'линоленовую, наблюдалось значительное увеличение водообмена листьев: 3-кратное увеличение интенсивности транспирации листьев, уменьшение их сосущей силы, увеличение водопроницаемости мембран,характеризуемой параметрами ЯМР-спектроскопии: Дд^ и Tj (увеличение Дд^ и укорочение Tj), В этих условиях наблюдалось также снижение содержания фосфо-липидов. На сегодня имеются данные о регуляторной роли мембранных фосфолипидов в передаче внешнего сигнала внутрь клетки через Са2+,фосфоинозитольную систему с помощью вторичных мессенджеров: Са2+, ДАТ и цГМФ, которые связаны с цАМФ-мессенджерной системой.

В зависимости от концентрации цАМФ, рН инкубационного раствора и наличия ионов в среде выращивания растений, экзогенный цАМФ в наших опытах увеличивал или уменьшал выход воды из корней бобов (Каримова, Гусев, 1980). Зависимость действия на водообмен корней бобов регулятора водно-солевого баланса клеток животных, пептидного гормона вазопрессина наблюдалась нами от ионного состава среды выращивания растений (Каримова и др., 1978). Эффект цАМФ и вазопрессина на водоотдачу корней бобов в нейтральной среде снимался добавлением 1 мМ Са2+. Наши опыты показали, что цАМФ воспроизводил действие вазопрессина на водопроницаемость клеток корней бобов.

Роль Са2+ в транспорте воды показана нами в опытах с исключением Са2+ из питательных сред выращивания растений. Са2+-де-

фицитные корни бобов отличались по сравнение с контрольным вариантом резко увеличенной водоотдачей (Каримова, 1985), которая еще более увеличивалась при 30-минутной инкубации их с экзогенными Са2+ С в контроле экзогенные Са2+ уменьшали выход воды из корней). Повышенная водоотдача корней сопровождалась значительной потерей белка и увеличением потери К+ и Ма+. Было установлено, что причиной наблюдаемого эффекта "кальциевого парадокса" явилась замена Са2+ на Иа+ в среде выращивания в соответствии с ионной силой, т.к. выращивание растений на 5 мМ растворе СаС^ или на дистиллированной воде,или при замене Са2+на К+ в среде Хогланда-Арнона не вызывала такого эффекта (Каримова и др., 1989).

Данные по действию вазопрессина, а также экзогенных цАМФ, Са2+ и АТФ, которые воспроизводили эффекты вазопрессина на выход воды из клеток корней бобов,выращенных в присутствии и при исключении Са2+ из питательных сред, объясняются нами участием цАМФ- и Са2+-мессенджерных систем в регуляции транспорта воды. Одновременное с транспортом воды изменение активности цАМФ- и Са2+-зависимых протеинкиназ доказывают участие цАМФ- и Са^+-мес-сенджерных систем в регуляции транспорта воды в клетках растений (Каримова и др. , 1993). Нами впервые показано, что в корнях бобов, выращенных на 1/4 среды Хогланда-Арнона со всеми катионами, наблюдалась базальная протеинкиназная активность, которая стимулировалась в 4 раза экзогенным цАМФ (белковый ингибитор цАМФ-за-висимых протеинкиназ снимал эту стимуляцию, что однозначно доказывает стимуляцию именно цАМФ-зависимых протеинкиназ).Экзогенные Са^+ стимулировали базальную протеинкиназную активность в 2,5 раза. При исключении Са^+ из среды выращивания бобов наблюдалась колоссальная потеря воды корнями, в то же время цАМФ-зависимая протеинкиназная активность, определяемая в гомогенате корней Са^+-дефицитных растений, отсутствовала. На основании этих данных мы пришли к заключению,что для удержания воды в клетках растений необходимо функционирование цАМФ-зависимого фосфорилирования белков мембран,которое возможно в присутствии необходимого количества кальция.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами данные свидетельствуют о функционировании системы цАМФ в растениях и значимости ее в механизмах действия гормонов,в регуляции адаптации растений к низким температурам, а

также важнейших физиологических функций растений, таких, кг транспорт воды и Са2+. На рис. 8 представлена схема, обобщают; наши представления о функционировании цАМФ-мессенджерной систе) в клетках растений.

. Установленное нами влияние концентрации Са2+ на цАМФ-зав! симую протеинкиназную активность в гомогенатах растений свидет< льствует о тесной взаимосвязи в функционировании двух основш систем вторичных мессенджеров в растениях. Подавление активное ти цАМФ-зависимых протеинкиназ их высокоспецифичным белковым и: гибитором животного происхождения свидетельствует об универсал: ности механизмов регуляции цАМФ-мессенджерной системы в клетк< животных и растительных организмов. Присутствие агентов, могу| изменить конформацию белков, влекло изменение величины цАМФ-з; висимого фосфорилирования белков в наших опытах, что может бы объяснено изменением степени доступности мест фосфорилирован! для протеинкиназ, в том числе и цАМФ-зависимых. Наши данные по; воляют констатировать, что всеобщий механизм регуляции фермент; тивных реакций - изменение конформации биополимеров - являет« основой регуляции реакций фосфорилирования-дефосфорилирован: белков растений, в том' числе, и катализируемых цАМФ-зависимы: протеинкиназами. Следует еще раз подчеркнуть особенности реакц: фосфорилирования-дефосфорилирования белков, в которых интенси; ность процесса зависит не только от свойств самих ферментов, и от особенностей белков-субстратов, определяющихся действ» различных эффекторов. Они объясняют, почему эти реакции лежат основе регуляторных цепей метаболизма клеток.

ВЫВОДЫ

1. Доказано функционирование основных звеньев системы цАМФ в тк нях различных растений:образование и деградация,секреция цАМ протеинкиназная и фосфопротеинфосфатазная активности, а такж значимость системы цАМФ в важнейших физиологических процесса растений: транспорте Са2+ и воды.

2. Содержание цАМФ в тканях растений зависело от условий роста растений, фазы клеточного цикла, содержания гормонов и Са2+ Секреция цАМФ клетками растений в инкубационную среду имела колебательный характер и регулировалась гормонами и Са2+.

3. Выявлено, что экзогенный цАМФ в определенных условиях Св пр сутотвии в реакционной среде или среде выделения ЭГТА, МоО^

теофилин 5'ЯМФ^

фоесродиэегпараза

+вел он

(активный) * - .

клеточный ответ

Рис. 8. Схема передачи экстраклеточного сигнала в клетки растений через цАМФ-мессендяерную систему

-г34 -

ТО^ ) стимулировал базальную протеинкиназную активность в экстрактах из тканей растений Св отдельных случаях в 2-4 раза) , а также изменял величину их цАМФ-зависимой протеинкиназ-ной активности.

4. Количество фосфорилированных полипептидов в экстрактах из растений и степень активации или ингибирования их фосфорили-рования зависела от концентрации экзогенного цАМФ.

5. Впервые установлено, что специфический белковый ингибитор цАМФ-зависимых протеинкиназ подавлял базальную протеинкиназнув активность в экстрактах из тканей растений на 15-70% I различных условиях, что указывает на существование цАМФ-зав! симых протеинкиназ и активирование их эндогенным цАМФ 1 процессе приготовления гомогенатов или очистки белков. Такая возможность подтверждена данными по резкому увеличение содержания цАМФ в отсеченных тканях растений и секреции ими цАМФ I среду инкубации,которая регулировалась гормонами и Са2+ при отсечении тканей от целого растения. Активация цАМФ-зависимьп протеинкиназ перед определением может быть одной из причин неудач в определении активности ферментов в растениях.

6. Фосф->рилирование белков растений определяется соотношение» активностей протеинкиназ и протеинфосфатаз.Выявлены Са2+-сти-мулируемое, Са2+-ингибируемое и Са -независимое фосфорилиро-вание белков растений, определяемое соотношением активностей Са2+-зависимых и Са2+-независимых протеинкиназ и протеинфосфатаз.

7. 0 включении системы цАМФ в механизмы действия фитогормоноз свидетельствуют данные по изменению содержания цАМФ и цАМФ-зависимого фосфорилирования белков при действии фитогормоков и цАМФ на целые растения, ткани и изолированные протопласты,г также по воспроизведению с помощью цАМФ действия фитогормона АБК на фосфорилирование белков гороха за два часа инкубации проростков гороха при низкой положительной температуре +4°С. Установлена определяющая роль ионов кальция при действии гормонов на активность аденилатциклазы и цАМФ-завксимых протеинкиназ. Впервые показано резкое повышение фосфорилирования ни-зксмолекуляркогоСых) полипептидаСов) мол. массы Э-10 кДа экзогенным цАМФ и АБК за два часа инкубации проростков гороха при +4°С, что может иметь важное значение в приспособительны) реакциях растений к низким температурам.

-.35;. Экзогенный цАМФ и фитогормон ИУК контролировали транспорт Са2+ в клетках растений. Предложена схема действия фитогормо-на ИУК на транспорт,Са2+ через плазматические мембраны клеток растений, основанная на данных, полученных с применением бло-катора фосфорилированных потенциалзависимых Ca -каналов ни-федипина.

|. Транспорт воды в растениях связан с функционированием систем вторичных посредников регуляции метаболизма.Для удержания зоды клетками растений в стрессовый условиях необходимо цАМФ-зависимое фосфорилирование белков, определяющееся концентрацией Са2+

Основные положения диссертации опубликованы в 44 научных работах.

1. Каримова Ф. Г. О водообмене листьев мхов//Фйзиол. раст. -1971. -Т. 18,N 1. -С. 211-213.

2. Каримова Ф. Г., Маркова Н. А., Гусев Н. А. Изменение выхода годы из растительных клеток под действием некоторых факторов// &ИЗИ0Я. раст. -1978. Т-.25, вып. 2. -С. 328-333.

3. Каримова Ф. Г. Клеточная стенка растений и водообмен// Казань,1979,14 с.,бйблиогр.51 назв./Деп. 2 авг. 1979 г.,N 287879 Деп. в ВИНИТИ.

4. Каримова Ф.Г., Гусев H.A. , Кузмичева Н.В. Роль клеточной оболочки в водообмене растительных клеток//Физиол. и биохим. культ, раст. -1980. -12, N 3. -С. 285-290.

2. Каримова Ф. Г., Маркова Н. А., Гусев Н. А. Изменение выхо:.а воды из растительных клеток под действием некоторых факторов// Физиол. раст. -1978. -Т. 25, вып. 2. -С. 328-333.

3. Каримова Ф. Г. Клеточная стенка растений и водообмен//Ка-зань, 1979, 14 с., библиогр. 51 назв./Деп. 2 авг. 1979., N 28787,9. Деп. в ВИНИТИ.

4. Каримова Ф. Г., Гусев Н. А., Кузмичева Н. В. Роль клеточной оболочки в водообмене растительных клеток//Физисл. и биохим. культ, раст. -1980. -12, N 3. -С. 285-290.

5. Каримова Ф. Г. , Гусев Н.А. Влияние циклического аденозин-

3',5'-монофосфата СцАМФЗ на водообмен растительных клеток//Физиол. раст. -1980. -27, N 4. -С. 766-772.

6. Velikanov G. А., Karimova F.G. Study of permeability of yeast cells membranes for water by pulsed NMR Сmethod)//Abstracts of International Conference on Water and Ions in biological

- 36 -

systems, Bucharest, Romania, June 25-27, 1980. -P. 169.

7. Karimova F. G. , Gusev N. A., Velikanov G. A. Water and ions transport in plants and cyclic adenosine-3',5'-monophosphate СсAMP) system//Abstracts of International Conference on Water an Ions in biological systems, Bucharest, Romania, June 25-27, 1980 ' 8. Каримова Ф.Г. К вопросу о некоторых механизмах транспорта воды в растительных клетках//В кн. "Вопросы водообмена и состояния воды в растениях". Казань, 1981. -С. 135-143.

9. Каримова Ф. Г., Крутикова Т. И., Шишманцева 0. В. Са2+-акти-вируемая аденозинтрифосфатаза корней бобов и возможность ее учас тия в транспорте воды//В кн. "Вопросы водообмена и состояния воды в растениях". Казань, 1981. -С. 144-149.

10. Каримова Ф. Г. , Муравьева А, С. Влияние вазопрессина на ды хания корней бобов//Водообмен и физиол. процессы раст., Казан

1981. -С. 56-59.

И. Karimova F.G., Gusev N. A. Some mechanisms of water trans port in plant tissues Cparticipation of cAMP-system)//Abstract International Conference "Water and Water Solutions in biologica systems", Bled,Jungoslavia, 1981.

12. Каримова Ф. Г., Шишманцева O.B. , Чернышева Л. М. Поглощени и отдача воды, растительной клеткой под действием вазопрессина/ Некотор. характеристики мембран и водообмен клеток раст., Казань

1982. -С. 45-51.

13. Гусев Н. А. , Каримова Ф. Г. Водообмен и засухоустойчивость растений//В кн.: "Развитие теоретич. и эксперим. комплексных исследований в борьбе с засухой". Ставрополь, 1982. -С. 78-89.

14. Каримова Ф. Г. , Крутикова Т. И. Светозависимый транспорт воды и ионов в корнях бобов//Регуляция вод. обмена раст. Материалы 7 Всес. симпоз., Киев, Сент., 1981. Киев, 1984.-С. 103-106

15. Karimova F.G. , Gusev N. А. , Buntukova Е. К. The role of Са2+ in water transport of plant tissues //Abstracts 3d Interna tional Conference on water and ions in biological systems. Bucha rest, Romania, October 2-6, 1984. -P. 208.

16. Панкратова С. И. .Каримова Ф. Г. Влияние полива на водообме и липидный состав листьев озимой ржи//Деп. 31.07.1984,за N 553784. Москьа,

17. Каримова Ф.Г. К вопросу о роли Са2+ в транспорте воды растительных тканей//Физиол.и биохим.культ, раст. -1985, -17,N 6. -С. 544-549.

18. Karimova F.G., Avdonin P.V. On physiological role of eye

- - 37 -

ic AMP-system in plant tissues//In Biol. Chem. Hoppe-Seyler, . 357, Suppl. 1986. P.201. 17th meeting Berlin CWesO.

19. Losovaya V, V. , Gorshkova T. A. ; Karimova F. G. , Raimanov I. ., Tarchevskaya 0.1, and Khusainov M. B. Some metabolic peculia-ities of isolated protoplasts//In : 'Trogress in Plant Protopast Research", Proceedings of-the 7th Intern. Protoplast Sympo-ium, Wageniugen. the Netherlands, Decern. 6-11, 1987. Ed. Puite .1 et al. • Kluwer Academ. Publishers. -P. 149-150.

20. Каримова Ф. Г., Бунтукова E.К. Са2+-активируемая АТФаза и ранспорт Са2+ в растительных клетках//"Пробл. соврем. 6коп.: р. 18 Науч. конф. мол. ученых биол. фак. МГУ, Москва,20-24 апр. , 987. 4.2" СДеп. в ВИНИТИ. 14.09.87, N 6653-В87).

21. Karimova F.G., Buntukova Е.К. , Tarchevskaya 0.1. "Са2+-aradox" in plant tissue//Abstracts 4th Inter. Confer, on Water nd Ions in biological systems. Bugharest, Romania, may 24-28, 987. -P. 182.

22. Karimova F. G., Tarchevskaya 0.1., Buntukova E.K. Investi-¡ation of regulation mechanisms of cytosole Ca2+-concentration n plant cells: Na/Ca-exchanger, Ca2+-channels and Ca2+-ATPase// abstracts 6th Congress FESPP, 4-10 September, 1988, Split-Yugos-avia, 6.17.

23. Tarchevsky I. A. , Karimova F.G. The regulation of the pro-.einkinase activity in pea Leaves by phytohormonas//Abstracts ,4th Inter. Congr. Biochem. , July 10-15, 1988, v. v,FR: 719.-P. 223.

24. Karimova F.G., Tarchevskaya 0.1. Is there Na/Ca-exchanger in plant cell membranes?//Abstracts 14th Inter. Congr. Biochem, July 10-15, 1988, V.2, TU:072. P. 83. Praga. ,1988. -P. 178.

25. Бунтукова "E. К., Каримова Ф. Г. Ca -активируемая АТФаза сорней гороха//В сб.: Н+-АТФазы и реактивность растительной клетей. Казань, 1989. -С. 106-115.

26. Каримова Ф. Г., Жуков С. Н., Леонова С. А., Тарчевская 0. И. ¿АМФ-зависимое фосфорилирование белков листьев гороха//Механизмы регуляции клеточ. активности : 10 Обьед. симп. биохим. о-в СССР-ГДР, Ташкент, 18-22 сент. , 1989: Тез. докл. М. ,1989. -С. 35.

27. Каримова Ф. Г., Тарчевская О.И. Роль ионов кальция в регуляции цАМФ-зависимой протеинкиназы фитогормонами/'/Регуляторы роста и развития раст. •. Матер. 2 Всес. конф. по регуляторам роста и развития раст. , Киев, 25-27 мая, 1988. Киев, 1989. -С. 233.

28. Каримова Ф.Г., Бунтукова Е.К., Тарчевская 0.И. "Кальциевый парадокс" в растительных тк&няк/УФкзяоп. раст. -1989. -Т. 36,

вып. 6. -С. 1178-1183.

29. Каримова Ф. Г. , Тарчевская 0. И. , Леонова С. А. Регуляция протеинкиназ фитогормонами/vB кн.: "Регуляторы роста и развита; растений". "Наукова думка", Киев, 1989. -С. 161-174.

30. Каримова Ф.Г., Тарчевская 0.И. Регуляция концентрации Са2+ в цитозоле растительных клеток//Физиол. и биохимия культ, раст. -1990. -22. N 2. -С. 107-118.

31. Каримова Ф. Г. , Тарчевская 0. И., Леонова С. А., Жуков С. Н. Влияние фитогормонов на содержание цАМФ в растениях//Физиол. i биохим. культ, раст. -1990, -Т. 22, N 6. -С. 532-537.

32. Каримова Ф.Г., Бунтукова Е. К. Влияние градиента натрия ; активность Са2+-АТФазы//Матер. 6 научн. конф. мол. ученых Казан ин-та биол. Казан, фил. АН СССР, Казань, 5-8 апр., 1988. Казань -1990. -С. 95-97.

33. Каримова Ф. Г., Бунтукова Е.К., Крутикова Т. И. Водйый ре жим орошаемых культур и его оптимизация/vB сб.: "Регуляция адап тивных реакций растений", Казань. Изд-во КГУ. -1990. -С.107-113.

34. Каримова Ф.Г., Жуков С.Н. Влияние цАМФ на фосфорилирова ние белков листьев гороха при низкой положительной температуре Докл. АН СССР. -1991, -316, N 5. -С. 1277-1279.

35. Каримова Ф. Г. , Бунтукова Е. К.Клочкова Е. Е. Поглощение Са2+ клетками растений//Цитология. -1991, -T.33.N И. -С.180-18

36. Каримова Ф. Г., Тарчевская 0. И., Леонова С. А. , Жуков С. Н Некоторые характеристики цАМФ'-зависимой.лротеинкиназной активно ти и цАМФ-зависимого фосфорилирования белков листьев гороха Физиол. раст. -1991, -38, N5. -С. 923-929.

37. Бунтукова Е.К/, Каримова Ф.Г. Роль Са2+-АТФазы в поддер жании Са2+ гомеостаза растительных клетоК//Сб. научн. тр. "Ионны транспорт.и усвоение элементов минерального'питания растениями" Киев, "Наук, думка", 1991. С. 11-14'.

38. Каримова Ф. Г. , Тарчевская .0. И. , Бунтукова Е. К. , Леонова С. А. Na/Ca-обменник"в растительных клетках//Сб. научн. тр. "Ионнь; транспорт и усвоение элементов минерального питания растениями" Киев, "Наук, думка", 1991. -С. 18-22. • „ ' ■

39. Каримова Ф. Г. , Бунтукова Е:К. АТФ-зависимый транспорт С в везикулы плазматических мембран // Физиол. и биохим. культ, раст. -1992. -Т. 24, N 4. - С. 388-391.

40. Семёнов В. В. , Каримова Ф. Г. , Сабирова Л. Р. , Леонова С. / Предсинтетический период клеточного цикла: Уровень эндогенногс цАМФ, интенсивность репарации мутагенеза//Цитология и генетика.

993. -Т. 27, N5. -С. 28-32.

41. Каримова Ф. Г. , Леонова С. А. , Гордон Л. X. ,Фильченкова В. И. креция цАМФ клетками растений//Физиол. бйохим. культ, раст. 993. -Т. 25, N 4. С. 362-367.

42. Каримова Ф. Г. , Бунтукова Е.К. , Леонова С. А. , Крутикова И. Регуляция транспорта воды в растениях, участие фосфорилиро-1ния белков //Водообмен и устойчивость растений. Казань, Изд-ео 'У. -1993. -С. 121-129

43. Каримова Ф.Г. .Бунтукова Е.К. .Тарчевская О.И. ,Алимова Л. А. Роль фосфатаз в регуляции фосфорилирования-дефосфорилирования

¡лков растений. Деп. в ВИНИТИ. 12.01.93. N 43-В93.

44. Каримова Ф. Г., Бунтукова ЕЛ,Алимова Л. А; Мурсалимова Н. У, Ш-зависимые протеинкиназы растений. Деп.в ВИНИТИ. 12.01.93. 46-В93.

По теме диссертации опубликованы 14 тезисов всесоюзных конвенций и съездов.

и

Сдано в набор 10.01.94 г. Подписано в печать 12.01.94 г. Форм.бум. 60 х 84 Г/Г6. Печ.л.2. Тираж Г00. Заказ 13.

Лаборатория оперативной полиграфии КГУ 420008 Казань, Ленина, 4/5