Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вторичные медиаторы и регуляция конденсации Са2+ в цитоплазме растительной клетки

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Вторичные медиаторы и регуляция конденсации Са2+ в цитоплазме растительной клетки"

РГБ Oft

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ 9 \ llE.ll Ш38 ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ

УДК 577.344

МОЛЧАН Ольга Викторовна

ВТОРИЧНЫЕ МЕДИАТОРЫ И РЕГУЛЯЦИЯ

КОНЦЕНТР АЦИИ Ca2f В ЦИТОПЛАЗМЕ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ

03.00.02-биофшика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск-1998

Работа выполнена в Институте фотобиологии HAH Беларуси

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор

академик HAH Беларуси, Волотовский И.Д.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Крицкий М.С. доктор биологических наук, профессор Фрадкин Л.И.

Оппонирующая организация:

Белорусский государственный университет

Защита состоится «23- агкаЬс'с _1998 года в ¿О часов на заседании совета по защите диссертаций (ДО 1.3 7.01) в Институте фотобиологии HAH Беларуси по адресу: 220072 Минск, ул. Академическая,

Телефон ученого секретаря -284-23-57

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фотобиологии НАН Беларуси

27.

Автореферат разослан "¿0" 1998 года

Ученый секретарь совета по защите диссертаций, кандидат биологических наук

Л.Ф. Кабашникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации

Исследование процессов трансформации внешних сигналов физической или химической природы в биологический эффект в клетке (сигнальной трансдукции) является актуальной задачей современной биофизики. Хорошо известно, что в ряде сигнальных путей, идентифицированных в клетках животных, роль медиаторов играют циклические мононуклеотиды (цГМФ, цАМФ), продукты метаболизма фосфолипидов, ионы кальция и другие соединения.

До недавнего времени о процессах трансдукции в растениях было известно гораздо меньше по сравнению с животными. Только за последнее десятилетие наметился значительный прогресс в понимании механизмов трансформации сигналов в растительных клетках. Так, было показано, что Са2+ и система фосфоинозитидов участвуют в различных процессах внутриклеточной сигнализации также и в растениях. Однако получены только косвенные доказательства сигнальной роли циклических мононуклеотидов в растительной клетке, базирующиеся на её функциональных ответах. Поэтому на фоне явного прогресса в исследованиях процессов трансдукции в растительной клетке, многое остается еще неясным.

К началу выполнения работы не было никаких данных о взаимосвязи различных сигнальных путей трансдукции в растительной клетке с участием ионов кальция и циклических мононуклеотидов. Более того, оставался открытым вопрос о присутствии и физиологической роли в растениях циклических мононуклеотидов и, в первую очередь, цАМФ, а также функционировании системы его метаболизма.

Таким образом, представлялось важным исследовать взаимодействие между различными сигнальными системами, в частности, системами Са2+, цАМФ и цГМФ. Кроме того, необходимо было попытаться установить и возможное участие в процессах трансдукции системы цАМФ - давно и хорошо охарактеризованной в клетках животных и совершенно не исследованной в растительной клетке.

Связь работы с научными программами.

Диссертационная работа выполнялась в рамках Государственной программы фундаментальных исследований по теме «Исследования промежуточных стадий процессов трансдукции световых сигналов в клетке» № 1996294 (1996-1998 гг.) и гранта Белорусского Республиканского Фонда Фундаментальных Исследований "Роль вторичных медиаторов в регуляции концентрации Са2+, как узлового звена в трансдукции фитогормонального и светового сигналов в растительной клетке" № Б97-293 (1998 г.).

Цель н задачи исследования.

Целью данной работы было исследовать взаимодействие систем циклических мононуклеотидов (цАМФ и цГМФ) и Са2+ в процессах трансформации внешних сигналов в растительной клетке и разрешить вопрос о существовании

в растениях системы метаболизма цАМФ. Поставленная цель включала решение следующих задач:

- Исследовать влияние цикломононуклеотидов на [Са2+]иит в протопластах трансгенного табака Nicotiana plumbaginifolia, экслрессирующего экворин (Са2+-чувствительный фотобелок).

- Изучить влияние цАМФ и цГМФ на регулируемое фитохромом накопление ионов кальция протопластами овса Avena sativa.

- Оценить эндогенную концентрацию цАМФ в тканях растений (овса и табака) и его возможное участие в трансдукции внешних сигналов.

- Изучить основные характеристики аденилатциклазы - фермента, катализирующего синтез цАМФ.

Объект и предмет исследования

В качестве основного объекта использовались изолированные протопласты трансгенного табака Nicotiana plumbaginifolia и овса Avena sativa, а также изолированные фракции растительных клеток и экстракты растительной ткани. Предметом данной работы было изучение взаимодействия систем циклических мононуклеотидов (цАМФ и цГМФ) и Са2+ в процессах трансформации внешних сигналов в растительной клетке и исследование системы метаболизма цАМФ в растениях.

Гипотеза

Высказано предположение, что в растительной клетке функционирует система цАМФ, и одним из этапов трансдукции ряда внешних сигналов является взаимодействие сигнальных систем цикломононуклеотидов и Са2+.

Методология и методы проведенного исследовании

Использовались радиоизотопные, радиоиммунологический и хемшпо-минесцентный методы.

Научная новизиа полученных результатов

Получены новые данные о влиянии дибутирильных и 8-бром аналогов цАМФ и цГМФ на [Са2+]аит в протопластах трансгенного табака, как в Са2+-дефицитной среде, так и в присутствии этого иона во внешней среде. Впервые показано влияние модуляторов циклазных систем, изобутилметилксантина (IBMX), форсколина, 2',5'-дидеоксиаденозина (ДДОА), запринаста на [Са2+]цвт растительной клетки. На основании полученных данных сделан вывод о том, что рост [Са2+]цит под влиянием цикломононуклеотидов обусловлен выходом иона из внутриклеточных кальциевых депо и сопряжен с физиологическими процессами. Установлено, что Са2+-каналы являются транспортными системами, чувствительными к действию циклических мононуклеотидов.

Установлено, что растительная клетка характеризуется вполне реальным содержанием цАМФ, который может участвовать в процессах внутриклеточной сигнализации в качестве вторичного посредника. Обнаружено влияние облучения красным и дальним красным светом на эндогенную концентрацию цАМФ в растениях, а также взаимозаменяемость влияния красного света и циклических мононуклеотидов на накопление Са2+ протопластами овса.

Полученные данные также позволяют сделать вывод о наличии в клетках проростков овса мембран-связанной формы аденилатциклазы. Активность фермента, определяемая при оптимальных условиях, составляет в среднем 2-4 пмоль / мг белка / мин., и активация осуществляется с участием ГТФ-связывающих белков.

Практическая значимость полученных результатов

Полученные в ходе выполнения работы данные значительно расширяют существующие представления о процессах трансдукции ряда внешних сигналов в растительной клетке и могут быть использованы в курсах лекций по биофизике, фотобиологии, биохимии и физиологии растений. Внедрение метода хемилюминесцентного мониторинга уровня внутриклеточного кальция в дальнейшем позволит тестировать степень влияния различных факторов антропогенной природы, например, химических соединений, активно используемых в сельском хозяйстве (фунгициды, инсектициды, гербициды и т.д.) на растительный организм. Кроме того, изучение молекулярных механизмов трансдукции ряда сигналов, например, биологически активных соединений, фитогормонов и света в растительной клетке является важным для оптимизации процессов роста и развития растений в искусственных условиях.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Мембран-проницаемые аналоги циклических мононуклеотидов и некоторые модуляторы активности циклазных систем вызывают рост цитоплаз-матической концентрации кальция в протопластах трансгенного табака.

2. Установлена взаимозаменяемость действия цАМФ, цГМФ и красного света на фитохром-зависимое накопление Са2+ протопластами овса.

3. Эндогенный уровень цАМФ в зеленых растениях является физиологически значимым и изменяется под влиянием красного и дальнего красного света. Определены основные характеристики аденилатциклазы в клетках овса.

Личный вклад соискателя

Экспериментальный материал получен автором самостоятельно. Выбор методов исследований, условий экспериментов, интерпретация результатов и анализ полученных данных проведены при решающем участии автора.

Апробация результатов диссертации

Основные результаты работы были представлены на I Всероссийской конференции фотобиологов (Пущино, 28-30 мая 1996 г.), II Съезде белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 25-27 июня 1997 г.), Школе-семинаре молодых ученых Федерации Европейских Биохимических Обществ "Использование одиночных клеток в изучении сигнальной трансдукции" (Лейден-Амстердам, Нидерланды, 3-10 мая 1997г.), XIII Швейцарской конференции по методологии исследования рецепторов (Морчах, Швейцария, 3-7 мая 1998), III Съезде белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 21-23 октября, 1998)

Опубликованность результатов

По теме диссертации опубликовано 3 статьи в научных журналах и б тезисов докладов. Общее количество опубликованных страниц -21.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, 5-ти глав, включающих обзор литературы; материалы, объекты и методы исследования; результаты исследования и их обсуждение; анализ и обобщение результатов исследования и заключение. Список цитируемой литературы включает 241 источник. Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 2В рисунков и 1 таблицу.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Объектом исследования служили протопласты, выделенные из 5-дневных этиолированных и зеленых проростков овса (Avena sativa, Буг), 56-дневных листьев табака Samsim и трансгенного табака Nicotiana plumbaginifolia, экспрессирующих Са2+-чувствительный цитоплазматический белок экворин, а также субклеточные фракции и экстракты растительной ткани.

Для выделения протопластов кусочки листьев инкубировали в смеси целлюлолитических ферментов, содержащей 2 % целлюяазы "Onozuka R.-10", 0,2 % пектомацерина, 400 мМ D-маннита, 100 мМ глицина, 5 мМ СаСЬ, рН 5,6. После инкубации протопласты отмывали от энзиматической среды и центрифугировали в ступенчатом градиенте сахарозы при 200 g в течение 3 минут. Полученная суспензия протопластов далее разводилась до концентрации 2,5'105 клеток/мл.

Для реконструкции зкворина в клетке суспензия протопластов, выделенных из листьев трансгенного табака, инкубировалась в среде, содержащей целентеразин в концентрации 2 мкМ в течение 3 часов в темноте при комнатной температуре.

Различные субклеточные фракции получали методом дифференциального центрифугирования [Youshida et al., 1983]. Все операции проводились при температуре 0-4°С.

Хемилюминесцентные измерения проводили на хемилюминометре, собранном в Институте фотобиологии НАНБ. Каждое измерение заканчивалось внесением смеси 100 мМ СаСЬ/0,1 % Тритон Х-100 (объём/объём). Изменения [Са2+]11их рассчитывались по методу Кобболда и Ринка [Cobbold, Rink, 1987] с некоторыми изменениями [Knight et al., 1996].

Накопление Са2+ протопластами измерялось в среде, содержащей СаС12 (5 мкКи 45Са27мл) в требуемой концентрации при 22 С.

Активность аденилатциклазы определяли в среде, содержащей 30 мМ HEPES-KOH, рН 7,5, 5 мМ MgCI2, 2мМ изобутилметилксантина (IBMX), 20 мМ креатинфосфата, 80 МЕ/мл креатинфосфокиназы, 0,5 мМ цАМФ, 0,75 мМ АТФ (30 мкКи/мл [32Р-а]АТФ). Реакцию запускали внесением мембранного препарата в реакционную среду. Количество образовавшегося [32Р]-цАМФ определяли по методу Коуниса и Монгонгу [Counis, Mongongu, 1978].

Определение эндогенного уровня цАМФ в экстрактах растительных тканей проводили с помощью набора для радиоиммунологического определения количества цАМФ.

Основные результаты и их обсуждение

Влияние циклических мононуклеотидов н модуляторов циклазных систем на [Са2+]цит протопластов трансгенного табака МсоНапа р1шпЬа<г>'1м/оИа.

Многочисленные литературные данные свидетельствуют, что изменение [Са2+]цит является промежуточным событием в цепи трансдукции ряда фото- и фитогормональных сигналов в растительной клетке. Вариабельность кинетических, временных и пространственных характеристик Са2+-ответов указывает на существование сложной системы переработки первичной информации, функционирующей с вероятным участием в качестве посредников кроме Са2+ и других соединений. Не могут ли в их роли выступать, например, цАМФ и цГМФ, медиаторы многих сигналов в клетках животных?

Для ответа на этот вопрос была проведена серия экспериментов по изучению влияния циклических мононуклеотидов на [Са2+]щ,т в трансгенных растениях, экспрессирующих Са2+-чувствительный фотобелок экворин. Использовались мембран-проницаемые ДБ-аналоги цАМФ и цГМФ. В результате экспериментов было установлено, что оба эффектора оказывают влияние на [Са2+]цит в физиологическом диапазоне концентраций от 10'7 до 10"4 М (рис. 1 а, б).

На основании данных, представленных на рисунке 1, можно сделать вывод о том, что рост [Са2+]цит обусловлен выходом иона из внутриклеточных кальциевых депо. Кривые, (см. рис. 1), показывают, что ДБ-цАМФ и ДБ-цГМФ вызывают рост [Са2+]вдТ до 480 нМ и 700 нМ. [Са2+]цит при этом возрастала в 3,2 и 6,3 раза, соответственно, по сравнению с контрольным уровнем цитоплазматического кальция в нестимулированной клетке. Существующие кинетические отличия Са2+-ответов клетки на цАМФ и цГМФ свидетельствуют о том, что рост [Са2+]циТ вызван выходом иона в цитоплазму из разных внутриклеточных депо и, следовательно, о различных внутриклеточных пулах кальция, участвующего в трансдукции сигналов в растительной клетке и контролируемых циклическими мононуклеотидами.

Кроме дибутирильных аналогов циклических мононуклеотидов хеми-люминесцентный ответ экворина индуцировался и другими мембран-проницаемыми аналогами: 8-бромо-цГМФ и 8-бромо-цАМФ. Эти соединения вызывали Са2+-зависимые хемилюминесцентные ответы, сходные по амплитуде и кинетике с эффектами дибутирильных производных циклических мононуклеотидов. Данный факт свидетельствует о том, что при добавлении дибутирильных и бромированных аналогов цАМФ и цГМФ в суспензию клеток Са2+ -ответ обусловлен действием нуклеотидной части молекулы эффектора.

Внутриклеточная локализация «мишеней», с которыми взаимодействуют ДБ- и 8-бромо- аналоги циклических мононуклеотидов подтверждается также и тем, что непроникающие через мембрану цАМФ и цГМФ не оказывали никакого влияния на [Са2"]^.

ДБ-цГМФ 10 мкМ

10 сек

ДБ-цАМФ ЮмкМ

800 § 600

¡400 ■гц 200

В

ДБ-цГМФ ДБ-цАМФ

Рис. 1. Влияние ДБ-цГМФ (А) и ДБ-цАМФ (Б) на Са2+-зависимук> хемилю-минесценцию экворина в протопластах листьев трансгенного табака

ШсоНапа рЫтЪа^Ы^Иа в Са2+-дефицитной среде. В -интегральное увеличение концентрации Са2+ в цитоплазме.

Итак, рост [Са2+]цит происходит за счет выброса иона из внутриклеточных депо. На какие именно системы транспорта Са2+ внутри клетки оказывают влияние циклические мононуклеотиды, пока неясно. Можно только утверждать, что, по крайней мере, Са2+-каналы являются транспортными системами, чувствительными к действию циклических мононуклеотидов. Действительно, верапамил, неспецифический блокатор Са2+-каналов Ь-типа, ингибировал эффекты ДБ- и 8-бромо- аналогов цАМФ и цГМФ. В случае ДБ-аналогов цГМФ и цАМФ степень ингибирования составила 53% и 85%, соответственно. Оказалось, что максимальный эффект верапамила проявляется при концентрации ЮмкМ.

Нельзя также исключить и возможность входа Са2+ в цитоплазму из внешней среды под влиянием этих же мононуклеотидов. Было изучено влия-

ние ДБ-цАМФ и ДБ-цГМФ на Са -зависимую хемилюминесценцию протопластов трансгенного табака в Са2+-содержащей (1 мМ СаСЬ) среде. СаС12 добавлялся в суспензию протопластов табака перед внесением циклических мо-нонуклеотидов. Как видно на рисунке 2, добавление в среду инкубации ДБ-аналогов цАМФ (А) и цГМФ (В) вызывало увеличение [Са2<~]цйт до 800 и 700

мкМ, соответственно, достигающее максимума через 20-30 секунд.

X люм

10 сек

ДБ-цГМФ 1мМ СаС1г 10 мкМ

1 мМ Саа2 """'<М / 1 '/

ДБ-цАМФ |/ 10 мкМ /

•й 800

н

600

1—1 400

+

ГЦ

а 200

О

В

ДБ-цГМФ ДБ-цАМФ СаС12

Рис. 2. Влияние ДБ-цГМФ (А), ДБ-цАМФ (Б) на Са2+-зависимуго хемилюминес-ценцию экворина в протопластах, выделенных из листьев трансгенного табака МсоИста plumbaginifolia в Са2+-содержащей среде. В -интегральное увеличение концентрации Са2+ в цитоплазме клетки.

В последнем случае эффект, по крайней мере ДБ-цАМФ, адресован Са2+-каналам плазматической мембраны. Об этом свидетельствуют опыты с Сс12+, блокирующим каналы снаружи, поскольку этот ион, в противоположность ве-рапамилу, не проникает в клетку. Эффект ДБ-цГМФ, однако, Сс12+ не блокировал, что свидетельствует о разных механизмах действия ДБ-цАМФ и ДБ-цГМФ на плазматическую мембрану.

Таким образом, мембран-проницаемые аналоги циклических мононук-леотидов индуцируют рост [Са2+]цит и в Са2+-содержащей среде. При этом источником Са2+ является и внеклеточное пространство, гак как после проникно-

вения в клетку циклических мононуклеотидов возрастает проницаемость плазматической мембраны для ионов Са2+. В Са2+-содержащей среде регистрируется более высокий рост [Са2*]цит, чем в Са2+-дефицитной среде (см. рис. 1 и 2)-

Логическим продолжением предыдущих исследований явилось использование ингибиторов и активаторов метаболизма циклических мононуклеотидов как модуляторов Са2+-зависимого хемилюминесцентного ответа клеток трансгенного табака.

С этой целью использовались следующие легко преодолевающие мембранный барьер биологически активные соединения: форсколин - активатор практически всех типов аденилатциклаз; 1ВМХ - неселективный ингибитор фосфодиэстераз; запринаст - селективный ингибитор цГМФ-зависимой фос-фодиэстеразы; 2'5'-дидеоксиаденозин (ДЦОА) - ингибитор аденилатциклаз.

Данные, представленные на рисунке 3 иллюстрируют влияние вышеперечисленных эффекторов на содержание Са2+ в цитоплазме клеток трансгенного табака. Под влиянием 1ВМХ, запринаста и форсколина индуцируется Са2+-зависимая хемилюминееценция, что, по всей видимости, связано с переходным увеличением концентрации циклических мононуклеотидов в клетке при активации анаболической или подавлении катаболической ветвей их метаболизма. Как следствие этого, наблюдается рост [Са2+]11ИТ, достигающий значений 500, 300, 490 нМ, соответственно (см. рис. 3 А, Б, В).

I люм

10 сек

В

1ВМХ ж

т/Ч

форсколин 20 мкМ

\

ч

запринаст 100 мкМ

2'5'-дидсокскаденозии

1Т\.

Мш

200 мкМ 20 мкМ

форсколин

г

'д 500 § 400

Г-? зов +

<ч я

у

200

л

д

Рис. 3. Влияние модуляторов циклазных систем на Са2+-зависимую хемилто-минесценцию эквори-на в протопластах листьев трансгенного табака ШсоИапа

plumbagmifolia в Са2+-дефицитной среде (А, Б, В, Г). Д - интегральное увеличение концентрации Са2+ в цитоплазме протопластов после добавления эффекторов.

Как видно из рисунка, наиболее ярко выраженный эффект наблюдался в случае форсколина и 1ВМХ, вероятно вследствие меньшей специфичности этих эффекторов к какому-то определённому типу ферментов. В то же время, ДЦОА, внесённый в суспензию протопластов перед добавлением форсколина,

В

на 65 % снимает опосредуемый форсколином рост [Ca2f]OTr, изменяя и амплитуду, и характер регистрируемой хемилюминесценции по сравнению с ответом, наблюдаемым после активации одним форсколином.

Можно предположить поэтому, что вызываемый мембран-проницаемыми аналогами циклических мононуклеотидов рост [Са2*]1ШТ происходит вследствие двух причин: выброса иона из внутриклеточных депо и входа Са2+ в клетку извне. Проникновение в клетку модуляторов активности ферментов циклазных систем сопровождается увеличением в ней концентрации цАМФ и цГМФ и, как следствие, увеличением концентрации Са2+ в цитоплазме за счет выхода иона не только из внутриклеточных депо, но также и его входа из внешней среды. Последний вывод подтверждается тем, что форско-лин, IBMX и запринаст, индуцировали Са2+-зависимую хемилюминесценцию экворина в протопластах N. plumbaginifolia и в Са2+-содержащей среде. При этом нужно отметить, что Са2+-ответ был по порядку величины близок к ДБ-цАМФ/ГМФ-индуцированным ответам.

Итак, внутриклеточный Са2+ является медиатором сигнальных процессов в клетке, ассоциированных, в частности, с цАМФ/цГМФ-зависимыми процессами трансдукции разнообразных внешних сигналов. Каким же образом растения дифференцируют внешние сигналы и трансформируют увеличение [Са^цщ- в конкретный ответ клетки при действии конкретного стимула? Точного ответа на этот вопрос до сих пор нет.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что специфичность возникающего Са2+-сигнала определяется, по-видимому, пространственной локализацией компартмента, которому, в конечном счёте, адресуется Са2+-индуцирующий стимул. При этом Са2+ находится на пересечении путей трансдукции сигналов в клетке, между которыми происходит постоянный обмен информацией.

Исследование участия ДБ-цАМФ и ДБ-цГМФ в реализации фито-хромной регуляции накопления Са2+ протопластами.

Как и в ряде других внутриклеточных процессов, в ходе фототрансдук-ции, опосредуемой фитохромом, одним из ключевых моментов является увеличение цитоплазматической концентрации кальция. Данное увеличение может быть следствием мобилизации Са2+ из внутриклеточных кальциевых депо [Shacklock et al., 1994]. Имеются данные, указывающие, что фитохром стимулирует также накопление Са2+ протопластами через активацию систем транспорта Са2+, что также сопровождается ростом концентрации иона в цитоплазме [Bossen et al., 1991; Соколовский и др., 1992].

Учитывая вышесказанное, была предпринята попытка изучения роли цАМФ и цГМФ, как возможных вторичных медиаторов в регуляции контролируемого фитохромом транспорта Са2+ через плазматическую мембрану этиолированных протопластов овса. Для оценки влияния цГМФ и цАМФ на накопление ионов кальция протопластами использовались их дибутирильные аналоги. На рис. 4 видно, что накопление кальция протопластами стимулируется при внесении цикломононуклеотидов в среду инкубации. Зависимость

эффекта от концентрации добавки носит доза-зависимый характер. Эффект стимуляции более выражен в случае ДБ-цАМФ.

и я

Я

дб-цАМФ

Рис. 4. Влияние циклических мононуклео-

тидов на накопление Са21" этиолированными овса

0 W! 10" 10J

^[циклоиононуклеотиды), М

протопластами Avena sativa.

Наблюдаемая стимуляция накопления может реализовываться при прямом действии циклических мононуклеотидов на компоненты Са2+-транспортирующих систем, как это имеет место в животных системах. Так, например, в плазматической мембране наружного сегмента палочек сетчатки катионный канал содержит в своем составе центры высоко сродства к цГМФ, связываясь с которыми цГМФ открывает каналы [Fesenko et al., 19853. Сходная ситуация имеет место в обонятельных мембранах, проницаемость катионных каналов которых модулируется цАМФ [Gold, Nakamura, 1989]. Нельзя также исключить и возможность активации протеинкиназ циклическими мононук-леотидами.

Какова же связь между стимуляцией накопления Са2+ циклическими мо-нонуклеотидами и фитохромом? Можно представить себе ситуацию, при которой фитохром и циклические мононуклеотиды стимулируют накопление Са2+ автономно с использованием своего индивидуального пути трансдукции или, наоборот, находятся в одной и той же цепи трансдукции. Данные проведенных далее экспериментов, возможно, помогут ответить на этот вопрос.

Как и в экспериментах, выполненных ранее в нашей лаборатории [Соколовский и др., 1991], красный свет (рис. 5) стимулировал накопление, а дальний красный свет, использованный сразу же после красного, «снимал» стимулирующий эффект. Оказалось, что красный свет и циклические мононуклеотиды в своем влиянии на накопление Са2+ взаимозаменяемы (см. рис. 5).

В соответствии с приведенными на рисунке 5 данными находятся результаты опытов Нейхауса с соавторами [Neuhaus et al., 1994], согласно которым микроиньекции цГМФ в клетки фитохром-дефицитного мутанта томата

вызывали аналогично красному свету генетический эффект. цАМФ в опытах указанных авторов генетические эффекты не имитировал.

СПт

ЧШ-К К7ДК

Контроль

дб-цАМФ дб-дПУМ»

Рис. 5. Влияние К/ДК света, ДБ-цАМФ и ДБ-цГМФ (10~5 М) на накопление Са2+ этиолированными протопластами овса Avena sativa. Т - этиолированные проростки, К - облученные красным светом (660 нм), К/ДК - облученные последовательно красным и дальним красным светом (730 нм).

+

Итак, циклические мононуклеотиды, цАМФ и цГМФ, индуцируют в растительной клетке эффекты, затрагивающие систему кальциевого гомеостаза, проявляющиеся в росте цитоплазматической концентрации иона и модуляции кальциевой проницаемости плазматической мембраны растительной клетки. Особый интерес, как эффектор, представляет цАМФ, биологическому действию которого на растительные системы в литературе посвящено большое количество публикаций. Однако в некоторых из них высказывается сомнение, что цАМФ содержится в растениях в концентрациях, достаточных для проявления биологического действия [Assmann, 1995J. Для получения ответа на вопрос об участии цАМФ в фитохромной трансдукции следует осуществить прямые измерения концентрации циклического мононуклеотида в растительной ткани в условиях её облучения красным светом. И в следующем разделе будут приведены данные об эндогенном содержании цАМФ в тканях растений, полученные с использованием радиоиммунологического метода.

Содержание цАМФ в тканях растений.

Эндогенный уровень цАМФ в тканях листьев трансгенного табака Nicotiana plumbaginifolia, табака дикого типа Samsun и овса Avena sativa составил 25-30 пмоль цАМФ/г сырой ткани. Следует, однако, отметить, что, например, в тканях мозга, где реализуется основная функция цАМФ, как медиатора в процессах передачи гормонального сигнала, содержание цАМФ, на два порядка более высокое. Поэтому вполне естественным представляется вопрос,

достаточны ли такие низкие концентрации цАМФ для реализации его медиа-торной роли в растении. Для получения ответа на этот вопрос было изучено влияние света на содержание цАМФ в растительном материале.

Оказалось, что содержание цАМФ в ткани этиолированных (содержащих фитохром) и зеленых (без фитохрома) растений сильно различается, а К-свет вызывает в растениях падение уровня эндогенного цАМФ. Эксперименты с адаптированными в течение 24 часов к темноте растениями (содержащими фитохром), в которых также исследовалось влияние красного и дальнего красного света показали, что освещение проростков красным светом приводит к падению эндогенной концентрации цАМФ, а освещение дальним красным светом снимает эффект красного, возвращая концентрацию цАМФ на уровень, близкий к контрольному (рис. 6)

Из этих данных следует, что баланс синтеза и распада цАМФ в растении определяется а) завершенностью морфогенетических процессов - в зеленых растениях концентрация цАМФ выше, чем в этиолированных; б) фитохромной системой - К-свет вызывает уменьшение концентрации циклического моно-нуклеотида в этиолированных и адаптированных к темноте растениях.

Рис. 6. Содержание цАМФ в гомогенате ткани зеленых (1) и адаптированных к темноте в течение 24 часов (2-5) проростков овса Avena sativa и влияние на него теофиллина (3), тео-филлина и К-облучения (4), теофиллина и К/ДК-облучения (5).

Падение [цАМФ] под влиянием красного света в ткани растений позволяет также сделать вывод о том, что стимуляция К-светом и цАМФ накопления Са2+ протопластами овса обусловлена активацией различных систем. В качестве одного из объяснений падения под влиянием Р6>формы фитохрома эндогенного уровня цАМФ и активации этим циклическим мононуклеотидом накопления Са2+ протопластами овса можно выдвинуть предположение о существовании негативного контроля Рй-формой ряда генетических эффектов через цАМФ в противоположность позитивному контролю активности генетического аппарата Рйг-формой с участием цГМФ.

40

зо -

©

S <

и

20

10

СИЗ 1 2

3

4

ГГТТТТП 5

Подводя итог обсуждению данных, представленных в настоящем разделе, можно сделать вывод о том, что растительная клетка характеризуется вполне реальным содержанием цАМФ, который может участвовать в процессах внутриклеточной сигнализации в качестве вторичного посредника. Поскольку стационарный уровень содержания циклического аденозинмонофос-фата в клетке определяется балансом процессов его синтеза и разрушения, катализируемых соответственно аденилатциклазой и фосфодиэстеразой, в следующем разделе будут представлены результаты определения активности аде-нилатциклазы.

Активность аденилатциклазы в проростках овса Avena sativa

Существование цАМФ в тканях растений позволяет предположить функционирование в растительной клетке системы метаболизма цАМФ, включающей два её основных фермента - аденилатциклазу и фосфодиэстеразу цАМФ. Активность фосфодиэстеразы в растительной ткани детально исследовалась в работах Феденко и др. [1991]. Поэтому в данной диссертации было предпринято исследование активности аденилатциклазы с использованием в качестве субстрата радиоактивного [32Р]-аАТФ.

В таблице суммированы данные по измерению аденилатциклазной активности в различных субклеточных фракциях, полученных из 5-дневных зеленых проростков овса: в грубом гомогенате, осадке 1500 g, содержащем ядра, целые клетки и обломки клеточной стенки, грубой митохондриальной, грубой мембранной и цитозольной фракциях.

Таблица

Активность аденилатциклазы (пмоль / мг белка / мин) в различных субклеточных фракциях, полученных из проростков овса Avena sativa

ФРАКЦИЯ Без 0,1 мМ 0.1 мМ ГТФ

добавок ГТФ 10 мМ NaF

Грубый гомогенат 0 1,34+ 0,08 2,02 + 0,48

Осадок 1500g 0 1,03+0,09 1,35 ±0,27

Грубая митохондриалъпая 0 1,73+0,09 2,78 +0,32

Цитозоль 0 0,73±0,12 1,01+0,13

Микросомалъпая 0 1,91+0,23 6,63 ± 0,26

Активность аденилатциклазы регистрировалась только в зеленых проростках. В этиолированных проростках уровень содержания цАМФ был ниже предела определения. Следовательно, возможно, что фермент активен только в морфологически зрелой растительной ткани.

Кроме того, без ГТФ активность фермента не регистрировалась ни в одной из вышеуказанных фракций. Добавление в образцы ЫаР, соединения, которое является модулятором активности аденилатциклазы в животных тканях посредством активации О-белка, приводило к увеличению аденилатцик-лазной активности. Данные факты свидетельствуют о том, что для активации растительной аденилатциклазы, как и фермента животных систем, необходима её связь с ГТФ-связывающим белком. Из этого следует также, что исследуемая аденилатциклаза является мембран-связанным ферментом. В присутствии ГТФ ферментативная активность обнаруживалась в грубой митохондриалыюй и грубой микросомальной фракциях, причем в грубой микросомальной фракции она была наибольшей и составляла 1,91 пмоль цАМФ/мг белка/ мин. При отсутствии в образцах ингибитора фосфодиэстеразы, например ГОМХ, зарегистрировать в них ферментативную активность не удавалось.

Активность фермента, определяемая при оптимальных условиях, составляет в среднем 2-4 пмоль/мг белка /мин, что хорошо согласуется с уже известными данными по изучению аденилатциклазы в высших растениях [Аэзтапп, 1995]. Специфический активатор фермента форсколин также существенно увеличивает активность аденилатциклазы.

Как следует из приведённых результатов, возможно, в клетках овса содержится аденилатциклаза в мембран-связанной форме. В связи с этим была предпринята попытка определить основные характеристики фермента. На рисунке 7 представлена зависимость аденилатциклазной активности от времени в грубой микросомальной фракции в присутствии ГТФ и фторида натрия. Видно, что в обоих вариантах эксперимента максимальные значения количества образовавшегося цАМФ были зарегистрированы к 10-ой минуте (см. рис. 7). Вместе с тем, в присутствии только ГТФ в последующие 10 минут наблюдается падение количества цАМФ в пробе, что может объясняться разрушением цикломононуклеотида вследствие действия фосфодиэстераз.

На рис. 8 изображена зависимость активности аденилатциклазы от концентрации АТФ в среде. Активность фермента проявляет свое максимальное значение при концентрации АТФ в среде, равной 0,75 мМ. При более высоких концентрациях АТФ наблюдается падение активности, обусловленное, возможно, субстратным ингибированием. Эффект субстратного ингибирования проявляется в присутствии как ГТФ, так и Ыа]7

Влияние температуры инкубации на активность аденилатциклазы исследовалось в диапазоне температур от 10 до 40°С. Оказалось, что оптимальная температура для функционирования аденилатциклазы равна 20-25°С. Следует отметить, что именно такой диапазон температур является характерным для роста и развития проростков овса.

Исследование рН-зависимости активности аденилатциклазы показало оптимальное значение рН равное 7,5, как в случае активированных фторидом натрия образцов, так и без. Активность аденилатциклазы не зависела от кон, центрации ионизированного Са2+ в среде.

время, мин

Рис. 7. Кинетика образования цАМФ в микросомальной фракции, выделенной из проростков овса Avena sativa. 1 - в стандартной среде, 2 - в среде, содержащей 10 мМ NaF.

Рис. 8. Зависимость активности аденилатциклазы от концентрации АТФ в грубой микросомальной фракции, выделенной из проростков овса Avena sativa. 1 - в стандартной среде, 2 - в присутствии 10 MMNaF

[АТФ],мМ

Итак, в растительной клетке представлена система анаболизма циклического АМФ, благодаря чему в ней синтезируются количества цикломоноцук-леотида, сравнимые по величине с аналогичными показателями для животных клеток. Это предполагает принципиальную возможность использования цАМФ в роли медиатора внутриклеточных процессов в высших растениях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Мембран-проницаемые аналоги циклических мононуклеотидов цАМФ и цГМФ, потенциальных медиаторов трансдукции физических и химических сигналов в растительной клетке, вызывают переходное увеличение ци-топлазматической концентрации ионов кальция в клетках трансгенного табака, экспрессирующего кальций-чувствительный фотобелок экворин [3, 6, 7, 8].

2. Модуляторы метаболизма циклических мононуклеотидов, активирующие анаболическую (форсколин) и подавляющие катаболическую (изобу-тилметилксантин, запринаст) ветви метаболизма, также индуцируют в цитоплазме клеток трансгенного табака переходное увеличение [Са +]ш1т. Эффект форсколина блокируется, если предварительно в среду добавляется ингибитор аденилатциклазы 2',5'-дидеоксиаденозин [3, 6, 7, 8].

3. Анализ экспериментальных данных, полученных с использованием трансгенного табака, экспрессирующего экворин, позволяет сделать вывод о тесном взаимодействии в растительной клетке различных сигнальных цепей трансдукции (кроссток) и локализации Са2+, как участника многих цепочек, на их пересечении [3, 6, 7, 8].

4. Циклические мононуклеотиды цАМФ и цГМФ проявляют стимулирующее влияние на накопление Са2+ протопластами, выделенными из этиолированных проростков овса, сходное со стимулирующим действием красного (1=660 нм) света, адресованного фоторегуляторному рецептору растений фи-тохрому [1,4, 5].

5. Показано, что в клетках овса и табака содержится 25-30 пмоль цАМФ/грамм ткани, что согласуется с предполагаемым участием цАМФ в процессах трансдукции физических и химических сигналов в растительной клетке. К-свет приводит к падению концентрации цАМФ в клетке, что свидетельствует об отсутствии сопряжения между стимулирующими эффектами фитохрома и цАМФ на накопление Са2+ этиолированными протопластами овса. Обнаружено также, что содержание цАМФ в зеленых растениях значительно превышает содержание цикломононуклеотида в этиолированных растениях

М-

6. Установлено, что активность растительной аденилатциклазы в микро-сомальной фракции составляет 1,91 пмоль/мг белка/мин. Измеренные ферментативные характеристики растительной аденилатциклазы близки к аналогичным параметрам аденилатциклаз тканей животных [2,4, 7].

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Соколовский С.Г., Яцевич (Молчан О.В.), Волотовский И.Д. Об участии универсальных мессенджеров в реализации фитохромной регуляции накопления Са2+ протопластами // Физиология растений.- 1996,- Т. 43, № 6,- С. 883886.

2. Яцевич (Молчан О.В.), Соколовский С.Г., Волотовский И.Д. Аденилатцик-лазная активность в зеленых листьях овса // Известия АНБ,- 1996.- № 3,- С. 3537.

3. Volotovski I.D., Sokolovsky S.G, Molchan O.V., Knight M.R. Second messengers mediate increases in cytosolic calcium in tobacco protoplasts // Plant Physiology.- 1998,-Vol. 117,-P. 1023-1030.

4. Молчан O.B., Соколовский С.Г., Волотовский И.Д. Взаимосвязь циклазных систем и фитохром-регулируемого транспорта Са2+ в растительной клетке // Тез. Докл. I Всероссийской конференции фотобиологов, Пущияо, 28-30 мая 1996 г. / Российская академия наук,- Пущино, 1996.- С. 34-35.

5. Молчан О.В., Соколовский С.Г. Роль универсальных вторичных медиаторов в фитохром-контролируемом накоплении Са2+ протопластами овса И Тез. Докл. II-го Респ. Съезда БОФБ, Минск, 25-27 июня 1996 г. / Белгосуниверси-тет,- Минск, 1996,- С. 62.

6. Molchan O.V., Sokolovsky S.G., Volotovsky I.D., Knight M.R. [Ca2+]cyt js regulated by cyclic mononucleotides system in transgenic tobacco protoplasts // Single Cell Techniques in Signal Transduction Research: Abstract Book of FEBS Advanced Course, Leiden-Amsterdam, The Netherlands, May 3-10, 1997,- Leiden, 1997,- P. 191.

7. Molchan O.V., Sokolovsky S.G., Volotovsky I.D., Knight M.R. Adenylate cyclase activity, endogenous level of the cAMP and regulation of [Ca2+]cyt by cyclic mononucleotides system in transgenic tobacco // Cellular Signal Recognition and Transduction: Abstract Book of III Internatioal Colloquium, Berlin, Germany, October 7-11, 1997,- Berlin, 1997,- P. P23.

8. Molchan O.V., Sokolovsky S.G., Volotovsky I.D., Knight M.R. Second messengers mediate increases in cytosolic calcium in protoplasts of aequorin-containing transgenic tobacco // Methodology in Receptor Research: Abstract Book of 8th Swiss Workshop, Morchach, Switzerland, May 3-7, 1998,- Morchach, 1998.-P. 21,

9. Молчан O.B., Соколовский С.Г. Участие системы метаболизма цАМФ в трансдукции фитохромного сигнала в клетках овса Ave па sativa // Тез. Докл. Ш-го Респ. Съезда БОФБ, Минск, 21-23 октября 1998 г. / Ин-т фотобиологии НАН Беларуси,- Минск, 1998,- С. 63.

РЭЗЮМЕ

Молчан Вольга Виктарауна Другасныя медыятары 1 рэгуляцыя [Са2+] у цытаплазме раслшнай клетю

Ключавыя словы: фггахром, юны кальцыя, трансгенны тытунь, экварын, цАМФ, цГМФ, мадулятары метабал1зма цыкшчных монануклеатыдау.

Мэта работы - даследванне узаемадзеяння цыкшчных монануклеатыдау (цАМФ, цГМФ) и Са2+ у працэсах трансдукцьп знешшх игналау 1 вымярэнне асноуных характарыстык анабашчнай галшы метабал1зма цАМФ у раслшнай клетцы з дапамогай трансгеннага тытуню, зкспрэаруючага экварын. Паказана, што мембран-прашкальныя аналап цАМФ 1 цГМФ, а таксама мадулятары ¡х метабал1зма выклщаюць рост [Са2+]ДЬ1Т, абумоулены выхадам ¡она з унутрыкле-тачных дэпо щ уваходам юна са знешняга асяроддзя у цытаплазму, што паказ-вае на шчыльнае узаемадзеянне у раслшнай клетцы розных ланцугоу трансдукцьп (красток) и лакал1зацыю Са2+ на ¡х перакрыжаванш.

ВыяуленЫ фотакантроль колькасщ цАМФ у рас л ¿не 1 уплыванне цык-л1чных монануклеатыдау на ф1тахром-залежнае накапленне Са2+ пратапла-стамк 1дэнтыфкавана мембрана-злучаная форма адэншатцыклазы у раслше 1 вымераны яе характарыстык!.

Вынш работы могуць быць выкарыставаны для распрацоую прыемау аптым1зацьй працэсау роста 1 развщця раслш.

РЕЗЮМЕ

Молчан Ольга Викторовна

Вторичные медиаторы и регуляция концентрации Са2+ в цитоплазме растительной клетки

Ключевые слова: фитохром, ионы кальция, трансгенный табак, экворин, цАМФ, цГМФ, модуляторы метаболизма циклических мононуклеотидов.

Цель работы - исследование взаимодействия циклических мононуклеотидов (цАМФ, цГМФ) и Са2+ в процессах трансдукции внешних сигналов с помощью трансгенного табака, экспрессирующего экворин, кальций-чувствительный белок, и измерение основных характеристик анаболической ветви метаболизма цАМФ в растительной клетке. Показано, что мембран-проницаемые аналоги цАМФ и цГМФ, а также модуляторы их метаболизма вызывают рост [Са2+]цкг, обусловленный выходом иона из внутриклеточных депо или входом иона из внешнего пространства в цитоплазму, что указывает на тесное взаимодействие в растительной клетке различных цепей трансдукции (кроссток) и локализацию Са2+ на их пересечении.

Обнаружен фотоконтроль содержания цАМФ в растении и влияние циклических мононуклеотидов на фитохром-зависимое накопление Са2+ протопластами. Идентифицирована мембран-связанная форма аденилатциклазы в растении и измерены ее характеристики.

Результаты работы могут быть использованы для разработки приемов оптимизации процессов роста и развития растений.

Summary Molchan Olga V. Secondary messengers and regulation of [Ca2+]cy, in plant cell

Key words: phytochrome, calcium ions, transgenic tobacco, aequorin, cAMP, cGMP, modulators of metabolism of cyclic mononycleotides.

The aim of the work is a study of interaction of cyclic mononucleotides (cAMP and cGMP) and Ca2+ in transduction processes of outer signals and the measurement of the principal parameters of anabolic part of cAMP metabolism. The object - tobacco and oat plants. Using transgenic tobacco expressing Ca2+-sensitive protein aequorin the membrane permeable analogs of cAMP and cGMP and modulators of their metabolism were shown to result in an increase in [Ca ]Cyt as caused by Ca2+ release from the intercellular stores and by Ca2+ translocation from outer space to cytoplasm that indicates the interaction among the transduction signaling chains (crosstalk) in plant cell and Ca2+ localisation on their crossing point.

The photocontrol of cAMP content in plant and the influence of cAMP and cGMP on phytochrome-dependent Ca2+ uptake in oat protoplast were found. The membrane-bound form of plant adenylate cyclase was shown. Their catalytic parameters were measured.

The results of this work can be used in the creation of techniques for optimisation of the processes of plant growth and development.

(

Молчан Ольга Викторовна

ВТОРИЧНЫЕ МЕДИАТОРЫ И РЕГУЛЯЦИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ С а2 В ЦИТОПЛАЗМЕ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ

Специальность 03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано к печати 10.11.1998. Формат 60 х 84 1/16. Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,1. Усл. кр.-отг. 1,2. Уч.-изд. л. 1,2. Тираж 100 экз. Заказ № 158.

Отпечатано на ризографе АНК "ИТМО им. А.В.Лыкова" НАНБ 2200072, Минск, П.Бровки,15. ЛП № 117 от 29 декабря 1997 г.