Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция активности нервно-мышечных синапсов мыши внутриклеточным депонированным кальцием, мобилизуемым кофеином и рианодином

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сурова, Наталья Владимировна, Москва

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

Сурова Наталья Владимировна

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ НЕРВНО-МЫШЕЧНЫХ СИНАПСОВ МЫШИ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫМ ДЕПОНИРОВАННЫМ КАЛЬЦИЕМ, МОБИЛИЗУЕМЫМ

КОФЕИНОМ И РИАНОДИНОМ

03.00.13 - физиология человека и животных

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н., в.н.с. О.П.Балезина

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ОГЛАВЛЕНИЕ............................................................................................................................................................2

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................................................................5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................................................................9

I. Роль ионов Са2+ в активности нейронов и синапсов..........................................................9

1.1. Системы поддержания постоянного уровня [Са2+]внутр. в покое..............10

1.2. Способы повышения [Са2 ]вн}тр в нейронах и нервных терминалях.... 11

а) Са2+ -каналы наружной мембраны......................................................................................11

б) Са2+ -связывающие белки и внутриклеточные мембраны..............................12

в) Инверсия Ыа /Са -транспортера..........................................................................................12

г) Внутриклеточные депо кальция.....................................................12

И. Характеристика внутриклеточных цистерн эндоплазматического

ретикулума (ЭР)........................................................................................13

II. 1. Микроструктура и назначение цистерн ЭР в различных типах

клеток................................................................................................................................................................13

II.2 Функции цистерн ЭР, не связанные с метаболизмом Са ................................13

2+

Н.З. Функции цистерн ЭР как депо и источников внутриклеточного Са .. 13

а) Са2+-депо в мышечных клетках............................................................................................13

б) Са2+-депо в нейронах......................................................................................................................14

А,

в) Са -депо в нервных терминалях синапсов................................................................16

III. Типы кальциевых депо и внутриклеточных Са2+-каналов................................................16

III. 1. Разновидности Са -депо эндоплазматического ретикулума............................16

а) Рианодиновые рецепторы..................................................................................17

IV. Характеристика рианодиновых рецепторов (РиР) Са -депо..........................................17

IV. 1. Молекулярная структура РиР..........................................................................................................18

Р/.2. Взаимодействие РиР с другими белками..............................................................................19

IV. 3. Эндогенные регуляторы РиР (стимуляторы и блокаторы)..................................19

IV.4. Экзогенные регуляторы РиР (стимуляторы и блокаторы)....................................19

а) Характеристика кофеина как стимулятора активности РиР........................20

б) Характеристика рианодина как модулятора активности РиР....................22

V. Роль Са2+

-депо в функционировании нейронов..........................................................................23

VI. Роль кальция и кальциевых депо в секреции медиатора....................................................25

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ................................................ 35

I. Объект исследования..................................................................... 35

II. Методика получения изолированного нервно-мышечного препарата двубрюшной шейной мышцы мыши.................................................. 36

III. Электрофизиологические методы...................................................... 38

IV. Методы обработки и статистического анализа результатов..................... 42

V. Используемые в работе вещества...................................................... 43

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.......................................................... 45

I. Действие кофеина и рианодина на вызванную активность нервно-мышечных синапсов мыши.............................................................. 45

1.1. Одиночные вызванные потенциалы концевой пластинки на фоне действия кофеина и рианодина.................................................... 45

1.2. Изменение рисунка ритмической активности нервно-мышечных синапсов мыши под действием кофеина......................................... 57

II. Увеличение частоты миниатюрных потенциалов концевой пластинки мыши

под действием агентов, высвобождающих Ca2 из кальциевых депо........... 74

II. 1. Влияние кофеина на частоту миниатюрных потенциалов концевой

пластинки..............................................................................74

II.2. Влияние рианодина на частоту миниатюрных потенциалов концевой пластинки..............................................................................83

III. Действие кофеина на амплитудно-временные характеристики спонтанных миниатюрных потенциалов и токов концевой пластинки мыши................ 87

III. 1. Дозозависимое воздействие кофеина на амплитуду и временной ход

миниатюрных потенциалов мыши.............................................. 87

III.2. Анализ постсинаптических эффектов кофеина на примере холинергических миниатюрных токов концевой пластинки мыши...... 90

IV. Изменение распределения амплитуд миниатюрных потенциалов концевой пластинки на фоне действия кофеина.................................................. 98

IV. 1. Дозозависимость эффекта кофеина............................................. 98

IV.2. Изменение дисперсии амплитуд миниатюрных потенциалов

концевой пластинки в бескальциевом растворе на фоне кофеина

при разных температурах.........................................................112

IV. 3. Анализ эффектов кофеина на фоне блокады выброса кальция из

кальциевых депо терминали 10 мкМ рианодином........................... 115

1У.4. Подавление везамиколом прироста дисперсии амплитуд миниатюрных

потенциалов концевой пластинки на фоне кофеина......................... 116

V. Изменение распределения амплитуд миниатюрных потенциалов концевой

пластинки мыши на фоне действия рианодина..............,..,....,..............125

V.!. Дозозависимость эффектов рианодина,......................................... 125

У.2. Зависимость эффектов рианодина от присутствия кальция в наружной

среде.................................................................................... 128

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................ 132

ВЫВОДЫ...................................................................................... 136

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................138

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. В современной физиологии расширяются исследования внутриклеточных цистерн эндоплазматического ретикулума (ЭР), называемых кальциевыми депо, способных не только запасать, но и высвобождать Са2+ в цитоплазму клетки (Berridge, 1993; 1995а,Ь, 1997; Miller, 1991; Kasai et al., 1994; Kasai, 1999). Известна роль таких цистерн ЭР в функционировании мышечных клеток (Melzer et al., 1995), однако их участие в работе нейронов и синаптических терминалей только начинает изучаться (Kuba, 1994; Henzi, MacDermott, 1992; Pozzan et al., 1994; Cohen et al., 1997). У разных типов нейронов и терминален с помощью

Ca -красителей обнаружены Ca -депо, выброс Ca из которых осуществляется по специальным Са2+-активируемым Са2+-каналам, получившим название рианодиновых рецепторов (Coronado et al., 1994; Hernandez-Cruz, 1995). Открывание этих каналов может регулироваться, наряду с Ca 5 двумя растительными алкалоидами - рианодином и кофеином. Использование кофеина и рианодина для мобилизации Са2+ из Са2+-депо позволило обнаружить существенный вклад внутриклеточного депонированного Са2+ в регуляцию возбудимости, ритмической активности и постсинаптической пластичности нейронов (Brorson et al,, 1991; Капо et al., 1995; Simpson et al., 1995; Cohen et al, 1997).

У синапсов процесс вызванной секреции медиатора, как известно, обусловлен повышением уровня ионизированного кальция в аксоплазме за счет его поступления из наружной среды (Katz, Miledi, 1965; 1968). Вместе с тем, в последние годы показана возможность выброса Са2+ из Са2+-депо терминалей у многих центральных и периферических синапсов (Blaustein, 1978a,b; Cunnan, Smith, 1997), однако, роль этой системы в регуляции процессов секреции медиатора остается во многом не ясной. В частности, у нервно-мышечных синапсов скелетных мышц при действии кофеина (Wilson, 1973; Onodera, 1973; Roed, 1982) или рианодина (Nishimura et al., 1990), облегчающих выброс Ca из Са2+-депо нервных терминалей, наблюдается увеличение частоты спонтанной и уровня вызванной секреции квантов медиатора. Систематический анализ этого явления не проводился. В связи с этим, в данной работе предпринято специальное

изучение пресинаптических эффектов кофеина и рианодина, нацеленное на получение новой информации о роли внутриклеточного депонированного Са2+, выбрасываемого из кофеин- и рианодин-чувствительных Са2-депо в регуляции активности нервно-мышечных синапсов мыши.

Цели и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в изучении роли системы внутриклеточного депонирования и высвобождения ионов Са2+ в регуляции спонтанной и вызванной активности нервно-мышечных синапсов мыши. В связи с поставленной целью, в работе решались следующие конкретные задачи:

1. Исследовать характер вызванной активности синапсов на фоне действия двух модуляторов работы Са -депо - кофеина и рианодина, потенциирующих либо тормозащих мобилизацию депонированного Са2+ в терминалях.

2. Сопоставить действие кофеина и рианодина как миметиков выброса Са2+ из Са2+-депо на частоту и характер спонтанной секреции квантов медиатора.

3. Исследовать среднюю величину квантов медиатора и распределение их размеров на фоне действия кофеина и рианодина.

4. Рассмотреть характер секреции «гигантских» квантов медиатора на фоне действия рианодина и кофеина как модуляторов активности Са2 -депо нервных терминалей.

Положения, выносимые на защиту:

1. В нервных терминалях моторных синапсов внутриклеточный депонированный Са2 , мобилизуемый действием кофеина и рианодина, участвует в регуляции разных типов квантовой секреции ацетилхолина: усиливает Са2+-зависимый вызванный выброс медиатора в ответ на нервный импульс, увеличивает частоту спонтанного высвобождения отдельных квантов медиатора.

2. Специфическая роль депонированного Са , мобилизуемого кофеином и рианодином, заключается в усилении спонтанной секреции особого пула крупных по размеру - т.н. «гигантских» - квантов медиатора, способных поддерживать передачу и возбуждение мышечного волокна без участия наружного кальция.

Новизна полученных результатов.

В работе получен ряд новых фактов, касающихся вклада депонированного Са2+ в регуляцию процессов секреции медиатора у синапсов. Впервые установлено, что при действии кофеина и рианодина, имеющих разный механизм и кинетику мобилизации Са2+ из Са2+-депо, наблюдается качественно сходный эффект -

дозозависимое усиление спонтанной и вызванной квантовой секреции медиатора,

2+ 2+

тогда как блок выброса Са из Са -депо (с помощью 10 мкМ рианодина) приводит к значительному снижению уровня вызванной секреции медиатора. Впервые показано, что в условиях ритмической активности синапса усиленная мобилизация внутриклеточного Са кофеином может приводить к ограничению количества медиатора, выбрасываемого на каждый ритмический стимул, на всем протяжении залпа.

Впервые выявлена специфическая роль депонированного

Са2+ в регуляции

определенных режимов спонтанной секреции квантов медиатора. На фоне кофеина или рианодина значительно возрастает особый вид спонтанной секреции в виде так называемых «гигантских» квантов медиатора, в 2-10 раз превышающих размеры стандартного кванта медиатора.

Новыми являются также данные о том, что в бескальциевой среде потенциирующие эффекты кофеина и рианодина на частоту и размеры спонтанно секретируемых квантов медиатора становится более выраженными. Это позволяет думать, что при ограниченном поступлении наружного Са2 в терминаль мобилизация внутриклеточного депонированного Са2+ может играть роль резервного физиологического механизма регуляции секреции квантов и поддержания синаптической активности.

Научно-практическая ценность. Полученные в работе данные расширяют современные представления о роли кофеин- и рианодин-чувствительных Са2 -депо в активности нервных терминалей на примере периферических синапсов млекопитающих. В работе получены новые важные доказательства способности таких Са2+-депо и мобилизуемого из них

Са2+

участвовать в регулировании всех режимов секреции медиатора: спонтанного, вызванного и ритмического. Это позволяет взглянуть на внутриклеточные Са -

депо и депонированный Са2+ как на новый механизм и точку приложения медикаментозных средств, направленных на лечение нарушений синаптической передачи. Проведенное в работе сопоставление эффектов кофеина и рианодина как двух разных по механизмам действия модуляторов мобилизации депонированного могут оказаться полезными при разработке фармакологических аналогов этих препаратов, способных, избирательно воздействуя на рианодиновые рецепторы нервных терминалей, усиливать или модулировать синаптическую передачу.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ I. Роль ионов Ca в активности нейронов и синапсов.

Нормальное функционирование клетки во многом определяется ионным составом ее внутренней и наружной среды (Berne, Levy, 1990; Албертс и др., 1994). Среди ионов, регулирующих жизнедеятельность клеток, кальцию принадлежит

л,

особое место. Ca является самьм представительным из всех катионов у позвоночных (20-30 г/кг веса тела). Большая часть кальция в организме запасена в костной ткани, но практически все остальные клетки организма также запасают кальций в достаточно высоких количествах (в общей сумме - 2-10 мМ на клетку); при этом клеточный кальций находится на 90-95% в связанном или депонированном состоянии (Berne, Levy, 1990).

Впервые внимание нейрофизиологов к ионам кальция было привлечено в связи с открытием в 70-ые годы "кальциевых" потенциалов действия (ПД) у нейронов, сердечных и других возбудимых клеток. Стало очевидным, что, наряду с ионами Na , ионы

Са2+, входя в клетку при возбуждении по специальным кальциевым каналам, могут играть ведущую роль в деполяризации мембраны и генерации ПД в соме нейронов (Kostyuk et al., 1974; Костюк, Крышталь, 1981), в их коротких отростках - дендритах (Pockberger, 1991; Konnerth et al,, 1992; Schiller et al., 1997), a также в нервных терминалях аксонов (Katz, Miledi, 1965; 1968). Однако уже в конце 70-х - начале 80-х годов стало очевидным, что роль ионов Ca2 как катионов, деполяризующих мембрану при генерации ПД, не является единственной и, по-видимому, главной ролью этих катионов у возбудимых клеток.

В последние 10 лет в практику физиологических экспериментов широко вошли новые методы флуоресцентного мшфоскопического отслеживания так называемого кальциевого сигнала - то есть колебаний уровня внутриклеточного кальция. Благодаря компьютерному мониторингу кальциевого сигнала, удалось воссоздать картину пространственно-временных колебаний уровня кальция в цитоплазме клетки (Tsien, 1980; 1981; Neher, Zucker, 1993). Изучение широкого круга эукариотических клеток (ооциты лягушки, железистые и секреторные клетки млекопитающих, мышечные клетки, центральные и периферические нейроны и их

отростки) показало, что ионы Са2+ играют роль универсальных внутриклеточных посредников как у невозбудимых клеток (Berridge, 1993; 1995; 1997), так и у электровозбудимых клеток (Kuba, 1994; Brorson et at, 1991), В частности, у нейронов такие процессы, как дифференцировка и экспрессия генов, программируемая клеточная смерть нейронов, прорастание и спрутинг аксонов, синаптическая пластичность, нейрональная память, секреция медиатора и многие другие прямо зависят от регионального или генерализованого повышения уровня Са2+ внутри нервной клетки (Албертс и др., 1994; Brorson et.ai., 1991; Berridge, 1993; 1995; 1997; Simpson et al., 1995; Mironov, Hermann, 1996). Очевидно, что кальций как универсальный внутриклеточный посредник должен иметь возможность строго дифференцированно менять свою концентрацию и во времени, и в пространстве клетки. Для решения этой непростой задачи в клетке существует многоуровневая система депонирования и регионального высвобождения Ca2 в цитоплазму.

1.1. Системы поддержания постоянного уровня fCa^L»^ в покое.

У нейронов и других клеток уровень свободного ионизированого Са2+ в цитоплазме очень низок и составляет порядка 1СГ8-1(Г7 М (Kuba, Nishi, 1976; Ashley, 1989; Костюк, 1986). Основная часть внутриклеточного кальция находится в связанном или депонированном виде (Шеперд, 1987; Албертс и др., 1994).

В нейронах существует четыре основных системы, поддерживающих постоянно низкий уровень ионизированного Ca2 в цитоплазме: а) Са2 -АТФ-азы, встроенные в мембраны цистерн эндоплазматического ретикулума (ЭР), а также в наружную мембрану, выкачивающие Са2+ из цитоплазмы либо в наружную среду, либо - в полость цистерн ЭР (Deamer, Baskin, 1969; Herbette et al, 1985; Stewart, Maclennan, 1974; Litton et al., 1992; Pozzan et al., 1994); б) выведение Ca2+ за счет системы сопряженного Na /Са -транспорта (Allen, Baker, 1985; DiPolo, Beauge, 1986; 1987; 1990; Furman, Raiiamimoff, 1990; Taglialatela et al., 1990; Wier, 1990); в) связывание

Ca2+ Ca2+ -связывающими белками цитоплазмы (Means et al., 1982; Seto-Oshima et al., 1984; Heizmann, Hunziker, 1990; Persechini et al., 1989); г) аккумуляция Ca митохондриями (Авдонин, Ткачук, 1994; Pozzan et al., 1994).

Существование всех вышеназванных четырех систем забуферивания Ca в цитоплазме детально описано не только у нейронов, но и у нервных окончаний нейросекреторных клеток гипофиза, а также у нервных терминалей многих центральных и периферических нейронов (Brorson et al., 1991; Horrigan, Bookman, 1994; Stuenkel, 1