Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль внутриклеточных Ca2+-буферов в регуляции секреции медиатора
ВАК РФ 03.03.01, Физиология
Автореферат диссертации по теме "Роль внутриклеточных Ca2+-буферов в регуляции секреции медиатора"
00500775Ь
СКИТЕВА ОЛЬГА ИГОРЕВНА
РОЛЬ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ Са2+-БУФЕРОВ В РЕГУЛЯЦИИ СЕКРЕЦИИ МЕДИАТОРА
03.03.01 - Физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2012
2 5 ЯН5 20:2
005007756
Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (зав. кафедрой -профессор А.А. Каменский).
НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:
Ольга Петровна доктор биологических наук, профессор кафедры
Балезина физиологии человека и животных биологического
факультета МГУ имени М.В. Ломоносова
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник кафедры высшей нервной деятельности биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова
кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории физиологии сенсорных систем Учреждения Российской Академии Наук Института Высшей Нервной Деятельности и Нейрофизиологии РАН
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:
Университет Дружбы Народов им. Патриса Лумумбы
Защита диссертации состоится 20 февраля 2012 года в 15.30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 при биологическом факультете Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова по адресу: Ленинские горы, д.1, строение 12, Москва, ГСП-1,119991, ауд. М-1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.
Автореферат разослан 19 января 2012 года
Аркадий Саулович Пивоваров
Наталья Юрьевна Герасименко
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук
^ЛЧ/"'" Б.А. Умарова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы.
Роль кальция как регулятора синаптической передачи в химических синапсах находится в центре внимания современной физиологии (Neher, 2008; Kyoung et al., 2011). Кальций может одновременно поступать в терминаль из разных вне- и внутриклеточных источников во время активности синапса. Параметры возникающих при этом внутриклеточных Са2+-сигналов (т.н. Са2+-доменои) находятся под контролем специальных молекул - Са2+-буферов (Schneggenburger, Neher, 2005; Nigli, Shirokova, 2007).
В нервных терминалях описаны эндогенные Са2+-связывающие белки, различающиеся Са2+-емкостью, афинностыо,' скоростью связывания и высвобождения ионов кальция (Schwaller, 2010). Их роль заключается в пространственно-временном разграничении Са2+-доменов, обеспечении их избирательного действия на множество мишеней. В первую очередь это касается прицельного воздействия различных Са2+-доменов на Са2+-сенсоры экзоцитоза везикул, Са2+-зависимые канальные и ферментные системы, вовлеченные в регуляцию секреции медиатора (Urbano et al., 2001; Rozov et al.,2001; Blatow et al., 2003; D'Angclo ct al., 2005; Muller et al., 2007; Eggermann et al., 2012). Реальный спектр функциональных возможностей Са2+-буферов как регуляторов Са2+-сипшюв и секреции медиатора остается малоизученным. В связи с этим, в последние годы широко используется нагрузка терминалей синапсов экзогенными Са2+-буферами. Наиболее известны ВАРТА (бис-(о-аминофснокси)этан-М,Ы,К|>К'-тетра-ацетиловая кислота) и EGTA (этиленгликоль бис-(бета-аминоэтиловый эфир)-Ы,М,М',]\['-тетраацетиловой кислоты), представляющие собой органические полианионные молекулы, имитирующие работу эндогенных быстрых и медленных Са2+-связывающих буферных белков (Tsien, 1980; Bortolozzi et al., 2008). Оба буфера, имея одинаковую емкость и высокое сродство к кальцию, различаются по скорости связывания кальция. Так, ВАРТА, т.н. «быстрый» Са2+-буфер, обладает в 100 раз более быстрой, чем EGTA, кинетикой связывания кальция (Rozov et al., 2001). Соответственно, ВАРТА преимущественно редуцирует быстрые локальные подъемы уровня Са2+, т.н. «Са2+-нанодомены», влиящие наэкзоцитоз везикул, расположенных в десятках нанометров от источника Са2+. EGTA же, как более медленный буфер, эффективен в редукции «Са2+-микродоменов», действующих на везикулы с больших расстояний - порядка долей микрона (Neher, 1998; Augustine et al., 2003). В последние годы, в исследованиях центральных синапсов ВАРТА и EGTA успешно используются как инструмент для выяснения зависимости механизмов выброса медиатора от Са2+-сигналов разного типа и генеза (Blatow et al., 2003; Felmy et al., 2003; Scott, 2007).
Такого рода исследования на нервно-мышечных синапсах мыши до сих пор малочисленны и противоречивы (Kijima, Tanabe, 1988; Robitaille et al„ 1993; Зефиров, Мухамедьяров, 2004). Остается не ясным, какой тип Са2+-сигналов формируется и регулирует секрецию АХ при входе Са2+ по Са2+-каналам P/Q-типа, L-типа, каналам рианодиновых рецепторов (РиР), а также в какой мере Са2+-буферы способны модифицировать эти Са2+-сигналы и вносить тем самым свой вклад в регуляцию секреции медиатора. Изучению этих актуальных вопросов и была посвящена данная работа. _
Цель и задачи работы.
Целью работы было исследовать способность быстрого и медленного экзогенных Са2+-буферов (ВАРТА и EGTA, соответственно) избирательно модифицировать процесс секреции АХ в нервно-мышечных синапсах мыши при вовлечении в работу различных пресииаптических Са2+-входов. В связи с поставленной целью, в работе решались следующие конкретные задачи:
1) Охарактеризовать дозо-зависимость действия быстрого и медленного Са2+-буферов ВАРТА и EGTA (1-100 мкМ) на параметры вызванного выброса АХ, регистрируемого в виде потенциалов концевой пластинки (ПКП)) при одиночной и ритмической активности синапсов и входе кальция в терминали по потенциал-зависимым Са2+-каналам P/Q-типа;
2) Исследовать способность ВАРТА и EGTA влиять на изменения квантового состава (КС) ПКП, вызываемые входом кальция по пресинаптическим потенциал-зависимым Са2+- каналам L-типа, расторможенным с помощью S(-) BAY К 8466;
3) Сопоставить способность ВАРТА и EGTA избирательно модифицировать изменения КС ПКП, вызываемые усилением выброса кальция из Са2+-депо терминален под действием активаторов рианодиновых рецепторов (РиР) - кофеина и рианодина;
4) Исследовать феномен увеличения амплитуды миниатюрных потенциалов концевой пластинки (МПКП) под действием кофеина и рианодина, понять роль ВАРТА, EGTA и определенных Са2+-зависимых ферментов в этом процессе.
Положения, выносимые на защиту.
1) В исследованном диапазоне концентраций (10-100 мкМ) EGTA более эффективно, чем ВАРТА, подавляет акты одиночных выбросов медиатора. ВАРТА проявляет аналогичную активность только при сниженном уровне кальция в наружной среде.
2) ВАРТА избирательно и дозо-зависимо предотвращает начальное облегчение передачи в ритмических залпах ПКП с частотой 20-50 Гц, а также - возрастание облегчения при выбросе депонированного кальция под действием кофеина.
3) Возрастание амплитуды МПКП под действием рианодина и кофеина сопряжено с Са2+-зависимым увеличением размера кванта медиатора, происходит с участием CaMKII и избирательно редуцируется с помощью EGTA, но не ВАРТА.
Научная новизна полученных результатов
Установлен ранее не известный факт, что EGTA избирательно и эффективно подавляет акты одиночного вызванного выброса медиатора АХ. Впервые показано, что Са2+-зависимый процесс начального облегчения при ритмической работе синапсов избирательно чувствителен к действию быстрого буфера ВАРТА. Выявлена ранее не известная способность EGTA разобщать сопряжение между входящим по L-типу Са2+-каналов кальцием и активацией РиР, приводящей к выбросу депонированного кальция и усилению секреции медиатора. Именно это сопряжение - основная причина потенцирования передачи при активации Са2+-каналов L-типа. Впервые получены данные о способности агонистов РиР (кофеина и рианодина) вызывать Са2+-зависимое увеличение размера кванта АХ, сопряженное с активацией CaMKII. Впервые показана способность EGTA, но не ВАРТА, полностью предотвращать этот Са2+-зависимый прирост размера кванта АХ.
Научно-практическая значимость работы
Анализ пресинаптических эффектов ВЛРТА и EGTA позволил получить научно значимую информацию о характере Са2+-сигналов, формируемых при работе разных Са2+-входов в терминали, и специфическом участии этих Са2+-сигналов в регуляции разных режимов секреции АХ. Показан индивидуальный вклад в вызванную секрецию квантов АХ разных типов Са2+-доменов - узколокальных Са2+-нанодоменов (редуцируемых только с помощью ВАРТА), более диффузных Са2+-макродоменов (редуцируемых с помощью EGTA) и тонического подъема уровня Са2+ (равноэффективно редуцируемого с помощью ВАРТА и EGTA).
Научный интерес представляет впервые обнаруженный факт регуляции размера кванта медиатора кальцием, выбрасываемым из Са2+-депо, с участием Са зависимого фермента СаМКП.
Полученные данные могут быть использованы и в прикладном аспекте, например, при разработке путей фармакологической коррекции синаптической передачи в моторных синапсах с помощью специфических кальциевых буферных систем, или их ингибиторов.
Апробация диссертации
Результаты исследования были представлены на международной молодежной конференции «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), Всероссийской (XVI) молодежной научной конференции «Молодежь и наука на Севере» (Сыктывкар, 2008), конференции с международным участием «Механизмы нервных и нейроэндокринных регуляций», посвященной памяти Т.М. Турпаева (Москва, 2009), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009), ежегодном съезде Британского Физиологического Общества «Физиология 2009» (Дублин, Ирландия, 2009). XXI съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010), 7-ом Форуме Федерации Европейских Нейронаук (FENS) (Амстердам, Нидерланды, 2010), 8-ом Всемирном конгрессе Международной Организации Изучения Мозга (IBRO) (Флоренция, Италия, 2011).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в их числе 4 статьи, из них 2 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 162 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, характеристик материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы; иллюстрирована 97 рисунками. Список литературы включает 206 источников, из них 11 отечественных.
ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для исследования спонтанной и вызванной синаптической активности в нервно-мышечных синапсах мыши были выбраны моторные синапсы диафрагмальной мышцы мыши (т. diaphragma). Данная мышца иннервируется аксонами диафрагмального нерва (п. phrenicus). В работе использовали беспородных мышей массой 20-30 г.
Внутриклеточная регистрация спонтанных и вызванных потенциалов концевой пластинки. Для предотвращения мышечных сокращений в ответ на стимуляцию нерва проводили процедуру рассечения мышечных волокон (Barstad, Lilleheil, 1968). Полученный таким образом «рассеченный» препарат помещали в физиологический раствор Лайли для теплокровных: (мМ): NaCl -135.0, КС! - 4.0, СаС12 - 2.0, MgCl2 -1.0, NaH2P04 - 1.0, NaHC03 - 16.0, глюкоза^- 11.0. Раствор аэрировали карбогеном (95%02/5%С02), рН раствора доводили до 7,2-7.4.
Для нагрузки терминалей В APTA и EGTA использовали мембрано-проницаемые ацетометокси-производные буферов (-AM) (Tsien, 1980). Нагрузку проводили по стандартному протоколу, используемому для насыщения клеток АМ-буферами (Zhao et al., 1997; Urbano, Uchitel, 1999). Проводили 2-х часовую инкубацию препарата в бескальциевом растворе Лайли (Са2+ 0 мМ; Mg2+ 3 мМ), содержащем ВАРТА-АМ или EGTA-AM (1-100 мкМ). Далее проводили 15-минутную отмывку препарата в бескальциевом растворе Лайли, потом заменяли его на нормокальциевый раствор (Са2+ 2 мМ; Mg2+1 мМ), а через 15-20 минут начинали регистрацию.
В работе использовали стандартную микроэлектродную технику, применяемую для регистрации трансмембранных потенциалов. Внутриклеточно регистрировали потенциалы концевой пластинки (ПКП) при раздражении нерва одиночными стимулами с частотой 0,3 Гц и короткими (50 ПКП) ритмическими сериями с частотой 20 Гц. Расчитывали квантовый состав (КС) ПКП, используя прямой метод -А(ПКП)ср/А(МПКП)ср, также оценивали среднюю амплитуду и временные параметры ПКП и МПКП. В случае ритмической активности оценивали начальное облегчение - отношение амплитуды второго ПКП в залпе к амплитуде первого (ПКП2/ПКП1), а также уровень фазы плато - средняя амплитуда последних 20 ПКП в залпе в % от амплитуды ПКП].
Статистическая обработка экспериментальных данных
Сравнение выборок производили по непараметрическому критерию Манна-Уитни, а также по критерию Стьюдента (t-тест) Использовали уровень значимости отличий между двумя выборками, равный 0,05. Все данные представлены как средние значения ± стандартные ошибки среднего, п - объем выборки (количество исследованных синапсов).
Использованные в работе вещества: ВАРТА-АМ (Biomol), EGTA-AM (AnaSpec, Calbiochem); S(-)-BAY К 8644 (Sigma-AIdrich); рианодин (Biomol); кофеин (Sigma-Aldrich); KN-93 (Calbiochem); везамикол (Sigma-Aldrich); кальмидазол (R24571) (SERVA), бафшюмицин Al (Sigma-Aldrich).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Влияние ВАРТА-АМ я EGTA-AM на параметры одиночной вызванной
секреции АХ.
В моторных синапсах мыши основной вклад в Саг+-сигналы, запускающие вызванную секрецию АХ, делает вход Са2+ по P/Q-типу Са2+-каналов (Uchitel et al., 1992). Поэтому в первой серии работы мы исследовали, в какой мере Са2+-доме»ы, создаваемые входом кальция по P/Q-типу Са2+-каналов, подвержены редукции со стороны экзогенных Са2+-буферов, и как это отражается на уровне вызванной секреции АХ.
1.1. Эффекты ВАРТА-АМ. Мы установили, что средняя амплитуда одиночных ПКП нервно-мышечных синапсов составляет 20,0±0,6 мВ, а средний КС ПКП -20,6±0,3 (п=65). Предварительная инкубация нервных терминален в растворе, содержащем ВАРТА-АМ в концентрациях 10-100 мкМ, не вызвала достоверных изменений параметров ПКП: при нагрузке 10 мкМ ВАРТА-АМ амплитуда и КС ПКП составили, соответственно, 99,2±4,5% и 103,1±6,1% от контроля (р>0,05; п=18), при 50 мкМ ВАРТА-АМ - 103,5±1,59% и 107,3±4,5% от контроля (р>0,05; n=37), а при 100 мкМ - 102,4±4,4% и 102,9±4,2% от контроля (р>0,05; п=24).
В следующей серии мы снизили наружную концентрацию Са2+ в перфузирующем растворе в 2 раза (с пропорциональным повышением уровня ионов магния до 2 мМ). Двукратное уменьшение [Ca2+]out вызывало трехкратное снижение средней амплитуды и КС ПКП, соответственно, до 30,2±2% и 35,4±3,2% по сравнению с контролем (р<0,001; п=15). В этих условиях предварительная инкубация препарата в растворе 50 мкМ ВАРТА-АМ вызывала достоверное снижение средней амплитуды ПКП до 75,3±4,7% (р<0,05; п=30), а КС- до 81,3±5,1% (р<0,05; п=30) относительно значений средней амплитуды и КС одиночных ПКП, полученных при снижении концентрации кальция в 2 раза в перфузирующем растворе.
Тот факт, что ВАРТА оказалась способной редуцировать КС ПКП только при двукратном снижении наружной концентрации калция позволяет предполагать, что в нормокальциевом растворе использованные нами концентрации быстрого буфера оказались недостаточными, чтобы эффективно редуцировать подъем кальция в одиночных Са2+-нанодоменах и, тем самым, редуцировать экзоцитоз близлежащих одиночных везикул. Действительно, известны примеры, когда для такой редукции используют диапазон в десятки миллимолей концентраций ВАРТА (Rozov et al., 2001). Неспособность ВАРТА-АМ редуцировать КС ПКП в зрелых синапсах диафрагмы мыши в нормокальциевом растворе наблюдали при аналогичных условиях и концентрациях буфера и другие авторы (Urbano, Uchitel, 1999; Rosato-Siri et al., 2002). Вместе с тем, в моторных синапсах лягушки (Robitalie, Charlton, 1992; Зефиров, 2004), незрелых моторных синапсах мыши (Rosato-Siri et al., 2002) ВАРТА оказывает редуцирующий эффект на КС ПКП (в дозах 100 мкМ), но там присутствуют другие типы Са +-каналов (N-тип и др.), ниже плотность Са2+-каналов, другая относительная расположенность их с везикулами и - низкая вероятность выброса медиатора. Считается, что в этих условиях везикулярный экзоцитоз осуществляется за счет локальных Са2+-нанодоменов, формируемых вокруг устья отдельных, разбросанных с низкой плотностью Са +-каналов, в момент их случайного открытия вблизи готовых к экзоцитозу везикул. В случае же зрелых
терминалей мыши показан другой характер группирования Ca +-каналов P/Q-типа в активных зонах, когда одна везикула окружена несколькими (до 10) каналами, находящимися на разных расстояниях (от десятка до сотен нм) от везикулы (Stanley, 1997). Возникает возможность взаимодействия (перекрытия) Са2+-доменов и создания более крупного Са2+-макродомеиа с высокой концентрацией кальция внутри, обеспечивающей высокую вероятность выброса везикулы, непосредственно готовой к экзоцитозу.
1.2. Эффекты EGTA-AM. В данной серии экспериментов использовали тот же диапазон концентраций экзогенного буфера, что и в случае ВАРТА-АМ, т.е. 10, 50 и 100 мкМ. Оказалось, что в концентрации 10 мкМ EGTA-AM не вызывал достоверных изменений одиночных ПКП: средняя амплитуда ПКП составила 101,8±5,9%, а КС -110,4±7,3% от контроля (р>0,05; п=22). В отличие от ВАРТА-АМ, EGTA-AM в концентрации 50 мкМ вызывал снижение исследуемых параметров ПКП. Так, под действием медленного кальциевого буфера средняя амплитуда одиночных ПКП уменьшалась на 10,9±20%, а КС ПКП - на 15,9±2,3% относительно контроля (р<0,001; п=25). Увеличение концентрации EGTA-AM до 100 мкМ привело к еще большему подавлению секреции медиатора: амплитуда ПКП в этих условиях составила 57,5±5,3% а КС - 79,2±4,9% от контрольных значений (р<0,001; п=12). Тот факт, что в наших экспериментах EGTA-AM в низких дозах (50-100 мкМ) оказывает редуцирующее действие на КС одиночных ПКП, позволяет предполагать, что здесь в экзоцитозе каждой отдельной везикулы может принимать участие группа разноудаленных от везикулы одновременно открывающихся Са2+-каналов. Это отличает моторные синапсы мыши от таковых у лягушки, где КС ПКП не чувствителен к медленному буферу EGTA (Gilmanov et al., 2008; Mukhamedyarov et al., 2009). Но в моторных нервных терминалях лягушки имеет место другой (N-тип) Са2+-каналов, более низкая их плотность, а также более низкая вероятность выброса АХ. По данным литературы в других быстрых синапсах, например, в calyx of Held именно медленный буфер EGTA способен снижать выброс медиатора (Chen, Regehr, 1999; Borst, Sakmann, 1996; Borst, Sakmann, 1999; Meinrenken et al., 2002). Было высказано предположение, что такое действие EGTA отражает возможность участия нескольких перекрывающихся и разноудаленных от везикулы Са2+-доменов в запуске ее экзоцитоза (Borst, Sakmann, 1996; Meinrenken et al., 2002; Wang, Fedchyshyn, 2005; Oheim et al., 2006; Wu et al., 2009). Редукция такого Ca2+-макродомена может эффективно осуществляться именно медленным буфером типа EGTA. В моторных терминалях мыши Са2+-каналы распределены с высокой плотностью так, что до 10 каналов, по-разному отстоящих от локированных везикул, могут принимать одновременное участие в запуске экзоцитоза везикулы (Stanley, 1997; Ruiz et at., 2011). В работе, выполненной на нервно-мышечных синапсах мыши, также показано, что именно EGTA-AM (30 мкМ) способен редуцировать КС одиночных ПКП (Ruiz et al., 2011).
2. Влияние ВАРТА-АМ и EGTA-AM на параметры вызванной секреции АХ в условиях ритмической стимуляции.
Влияние Са2+-буферов на вызванный выброс медиатора в условиях залповой ритмической активности синапсов исследовали путем регистрации серии из 50 ПКП в ответ на высокочастотное электрическое раздражение диафрагмального нерва. Видно, что в начале залпа из 50 ПКП имеет место кратковременное облегчение передачи, выражающееся в увеличении амплитуды ПКПг-ПКПз по сравнению с ПКП1. После этого, по ходу залпа наблюдается кратковременный спад амплитуды ПКП (депрессия передачи) и, наконец, выравнивание амплитуды Г1КП на стабильном, но сниженном по сравнению с ПКП! уровне - фаза «плато» залпа (Рис. 1Б). Проведенные нами ранее эксперименты, а также литературные данные, свидетельствуют, что изменения амплитуды ПКП по ходу залпа коррелируют и однозначно отражают изменения КС ПКП (Балезина, Букия, 2005; Ruiz et al., 2011).
/и мс Номер пкп
Рис. 1. Оригинальная запись ПКП при частоте стимуляции нерва 20 Гц (А). Изменение амплитуд ПКП е ходе ритмической стимуляции с частотой 20 Гц (Б),
2.1. Эффекты ВАРТА-АМ. Влияние ВАРТА-АМ исследовали в двух аспектах: во-первых, в зависимости от частоты ритмического разряда ПКП, и, во-вторых, в зависимости от концентрации ВАРТА-АМ при определенной (оптимальной) частоте разряда ПКП.
Частото-зависимые эффекты ВАРТА-АМ. Изменения амплитуды ПКП по ходу залпа в присутствии 50 мкМ ВАРТА-АМ исследовали при раздражении нерва с частотой с 20, 50 и 100 Гц. При работе синапсов с частотой 20 Гц нагрузка терминалей ВАРТА-АМ вызывала снижение отношения ПКП2/ПКП1 от 1,07±0,01 в контроле до 0,99±0,01 на фоне ВАРТА-АМ (т.е. 93,3±1,3% от контроля, р<0,001; п=24), а также - снижение уровня ПКП на фазе плато от 82,7±1% в контрольном залпе до 78,7±1,4% относительно ПКП1 (94,9±1,7% от контроля, р<0,05; п=24) (Рис, 2).
При частоте разряда 50 Гц ВАРТА-АМ также вызывала значительное подавление начального облегчения в залпе, так что отношение ПКП2/ПКП1 составило 1,03±0,01, то есть снизилось до 93,2±1,3% от контроля (р<0,05; п=25) (Рис. 2А). Наблюдалось также снижение амплитуды ПКП на фазе плато залпе до 78,2±3,3% от ПКП! (91,5±3,9% по сравнению с контрольным уровнем плато, р<0,05; п=25) (Рис. 2Б).
Контроль □ ВЛГТА-АМ50 мкМ
Контроль О ВАРТА-АМ 50 мкМ
Частота, Гц
Частота, Гц
Рис. 2. Изменение начального облегчения (А) и уровня плато (Б) при частотах стимуляции 20, 50 и 100 Гц в контроле и при действии 50мкМБАРТА-АМ (#-р<0,001; *-р<0,05)
В условиях стимуляции нерва с частотой 100 Гц на фоне предварительной инкубации с ВАРТА-АМ отношение ПКПз/ПКП, составило 97,6±1,67% от контроля (р>0,05, п=19), а уровень плато - 95,3±4,43% от контрольного (р>0,05, п=19) (Рис. 2). Таким образом, увеличение частоты залповых разрядов синапсов ведет к ослаблению редуцирующего действия ВАРТА-АМ (50 мкМ) на залповую активность. Известно, что по мере повышения частоты разряда, в нервную терминаль за единицу времени поступает большее количество кальция, входящего по потенциал-зависимым Саг+-каналам Р/р-типа. Если в покое базальный уровень ионизированного несвязанного кальция в терминали составляет 10" М, то в результате кратковременных высокочастотных разрядов (ПД) он может повышаться в 10-50 раз (Магка й а1., 2000; Ишг й; а1. 2011). По-видимому, такой подъем базального уровня кальция может приводить к постепенному насыщению Са" -буфера, а, следовательно, и к снижению эффективности связывания им ионов кальция (Angelson, ВЛг, 2001). Дозо-зависимые эффекты ВАРТА-АМ.
В следующей серии мы сопоставляли, как проявляется тормозное влияние ВАРТА-АМ на рисунок залповой активности в зависимости от ее концентрации в терминали. Для этого синапсы нагружали ВАРТА-АМ в концентрациях 1, 10, 50 и 100 мкМ. Для тестирования дозозависимых изменений залповой активности под действием ВАРТА-АМ была выбрана частота залпов в 20 Гц, при которой наиболее выражены все характерные изменения рис. 3. Огибающие рисунка залпа ПКП при стимуляции амплитуды ПКП по ходу залпа и нерва с частотой 20 Гц в контроле, на фоне инкубации которая наиболее близка к препарата с ВАРТА-АМ в концентрации 1,10, 50 и 100 частоте залповых разрядов мкМ .(*-р<0,05 по сравнению с контролем) мотонейронов млекопитающих (Ьее е1 а1,, 2009). Мы установили, что ВАРТА-АМ в концентрациях 1, 10, 50 и 100 мкМ дозо-зависимо снижает развитие начального
"".......... Контроль
—СЬ-ВАРТА-АМ 1 мкМ —»-»ВАРТА-АМ« мкМ —О— ВАГТА-АМ50 ихМ ——ВАРТА-АМ 100 мкМ
¡¡ЯЩа-8'
10 20 30
Номер ШШ
облегчения (отношение амплитуд ПКП2/ПКП|). ПКП2/ПКП1 снижается от 1,07±0,01 в контроле (п=49) до ],02±0,015 в присутствии 1 мкМ ВАРТА-АМ (п=22) - снижение составило 95,2±1,4% от контроля, р<0,01). При загрузке ВАРТА-АМ в концентрации 10 мкМ этот буфер снижает начальное облегчение до 1,0±0,02, то есть до 94,7±1,3% от контроля, р<0,01; п=21) (Рис. 3).
Более высокие концентрации буфера (50 и 100 мкМ) не только предотвращали развитие начального облегчения, но и вызывали усиление начальной депрессии передачи, т.е. достоверное снижение амплитуды второго и следующих ПКП в залпе ниже амплитуды ПКП1 по сравнению с контролем: при 50 мкМ ВАРТА отношение ГТКП2/ПКП1 упало до 0,99±0,01, что составляет 93,3±1,6% от контроля (р<0,001; п=24). Увеличение концентрации буфера до 100 мкМ вызвало дальнейшее достоверное усиление депрессии в залпе ПКП - до 0,98±0,02, то есть снижение до 91,9±1,7% от значения в контроле (р<0,001; п=25) (Рис. 3).
Мы установили, что наряду с подавлением начального облегчения и усилением начальной депрессии в залпе, ВАРТА-АМ в высоких концентрациях (50 и 100 мкМ) вызывает также снижение уровня плато ПКП в залпах до 78,7±1,4% относительно первого ПКП, (94,9±1,7% от контроля (р<0,05; п=24) и 72,4±1,7% (87,3±2,0% от контроля (р<0,001; п=25)), соответственно. ВАРТА-АМ в низких концентрациях не оказывала достоверного влияния на этот параметр. При нагрузке 1 мкМ ВАРТА-АМ среднее значение уровня плато составило 97,87±3,8% от контроля (р>0,05; п=23), а при нагрузке 10 мкМ ВАРТА-АМ - 97,3±2,2% (р>0,05; п=21) (Рис. 3). Таким образом, в нашей работе впервые установлено дозозависимое тормозное действие «быстрого» Са2+-буфера ВАРТА-АМ как на начальное облегчение передачи в коротком залпе ПКП, так и на уровень фазы плато в залпе.
2.2. Эффекты ЕвТА-АМ.
На следующем этапе работы проводили сравнение эффектов ВАРТА-АМ и ЕвТА-АМ. При частоте залповых разрядов синапсов 20 Гц ЕйТА-АМ не повлияла на процессы начального облегчения (отношение ПКП2/ПКП1 - 1,05±0,01, что составило 98,5±1,3% от контрольного значения ( р>0,05, п=21)), тогда как уровень плато снизился до 82,4±1,9% относительного первого ПКП (94,4±2,2% по сравнению с контролем (р<0,05; п=20)) (Рис. 4).
Таким образом, в нашей работе впервые описаны эффекты двух разных по кинетике связывания Са2+-буферов на рисунок изменений вызванной секреции по ходу залпа - на начальное облегчение передачи, последующую кратковременную депрессию и стабилизацию ПКП на сниженном по сравнению с ПКП] уровне - фазу плато. Вызванный выброс АХ по ходу ритмического залпа во время начального облегчения оказался чувствительным только к быстрому буферу ВАРТА-АМ,
О 10 20 30 40 50
Номер ПКП
Рис. 4. Огибающие рисунка залпа ПКП при стимуляции нерва с частотой 20 Гц в контроле, на фоне инкубации препарата с ЕСТЛ-АМ и ВАРТА-АМ в концентрации 50 мкМ (* - р<0,05; # -р<0,001).
причем в концентрациях, не действующих на акты одиночных вызванных выбросов медиатора. Созвучные эффекты в отношении процесса облегчения передачи со стороны быстрого и медленного экзогенных буферов были получены и на нервно-мышечном препарате лягушки (Kijima, Tanabe, 1988; Mukhamedyarov et al., 2009) и мыши (Rosato-Siri et al., 2002).B синапсах гиппокампальных нейронов также показано, что именно быстрый буфер ВАРТА, а не EGTA, способен нивелировать начальное облегчение передачи при сдвоенных стимулах (Emptage et al., 2001).
Считается, что облегчение передачи - следствие сохранения т.н. «остаточного» кальция после спада Са2+-транзиента, создаваемого входом Са2+ при одиночном ПД. Приход следующего ПД и формирующийся следующий Са2+-транзиент суммируется с остаточным Са2+, что и может увеличивать вероятность Ca +-зависимого выброса квантов медиатора (Zucker, Regehr, 2002). Однако было показано, что наряду с «остаточным» Са2+ в процесс облегчения вносит вклад и Ca24", выбрасываемый из Са2+-депо (Балезина, 2000; Балезина, Букия 2005; Гайдуков и др., 2009). Поскольку оказалось, что только ВАРТА подавляет облегчение передачи в залпе, можно предполагать, что источник депонированного Са2+, участвующий в облегчении, находятся вблизи от локированных везикул. Действительно, по данньм литературы расположение цистерн эндоплазматического ретикулума возможно на расстоянии порядка 40-100 нм от локированных везикул (Narita et al., 2002; Verkhratsky, 2005).
В отличие от избирательного действия В APT A-AM на фазу начального облегчения в залпе, оба буфера одинаково эффективно снижали уровень ПКП по всему остальному ходу залпа, включая фазу «плато». Известно, что уровень фазы плато в залпе ПКП определяется балансом как минимум двух Са2+-зависимых процессов - экзоцитоза везикул и их пополнения из резервного пула или путем быстрой рециклизации (Zucker, Regher 2002; Neher, Sakaba, 2008; Ruiz et al., 2011). Предполагается, что в этих процессах могут принимать участие как кальций из состава Са2+-нанодоменов, образуемых вокруг P/Q-типа Са2+-каналов, так и, в значительной степени, глобальный и устойчивый подъем кальция, наблюдаемый в терминали на фазе плато при залповой активности (David, Barret, 2000; Neher, Sakaba, 2008; Ruiz et al., 2011).
Известно, что в случае глобального и тонического, а не локального и кратковременного подъема Са2+ в клетке, изменение уровня Са2+, а также зависимых от него секреторных процессов, в равной степени может нивелироваться достаточно высокими концентрациями быстрых и медленных буферов, имеющих сравни тельно одинаковую емкость (Angelson, Betz, 2001; Dargan, Parker, 2003). Тот факт, что в наших исследованиях оба буфера одинаково подавляли КС ПКП по всему ходу залпа, (за исключением фазы начального облегчения), может означать, что в данном случае Са2+-зависимые процессы, определяющие рекрутирование везикул в активную зону и уровень фазы плато в залпе, определяются тоническим, генерализованным подъемом уровня Са2+-в терминали.
Таким образом, мы установили, что характер воздействий быстрого и медленного экзогенных Са2+-буферов на секрецию АХ существенно различается в зависимости от того, в каком режиме, одиночном или ритмическом, работает синапс.
Судя по обнаруженным различиям, можно предположить участие следующих типов Са2+-сигналов в регуляции квантового выброса медиатора (Рис. 5): 1. ионы Са2+ из перекрывающихся Са2+-доменов вокруг Са2+-каналов P/Q-типа (при одиночной и залповой активности)
2. ионы Са2+ из Са2+-доменов, формируемых выбросом депонированного Са2+ через РиР вблизи мест докинга везикул (в период облегчения передачи в залпе)
3. глобальный подъем уровня Са2+ в терминали (на фазе плато залпа ПКП).
Рис. 5. Схема участия кальциевых доменов и подъема уровня базального кальция в регуляции вызванной секреции квантов АХ, построенная на основании эффектов ВАРТА-АМ и EGTA-АМ. Показан Са2*-паподомсп, редуцируемый ВАРТА, Са**-макродомен, редуцируемый EGTA, а также подъем базального кальция, равноэффектиено редуцируемый ВАРТА и EGTA на фазе плато ритмического выброса медиатора.
Наряду с P/Q-типом Са21-каналов, в нервных терминалях мыши недавно обнаружен пул медленных потенциал-зависимых Са2+ -каналов L-типа. В чем особенность создаваемых их работой Са2+-сигналов, в какой мере они подвержены действию Са2+-буферов, и как это отражается на секреции медиатора, было исследовано в следующих экспериментов.
3. Влияние ВАРТА-АМ и EGTA-AM на секрецию АХ в условиях активации пресннаптических Са2+-каналов L-типа
Усиление активности потенциал-зависимых Са2+-каналов L-типа проводили путем воздействия на нервные терминали селективным активатором Са"+-каналов L-типа S(-) BAY К 8644 (ImkM), который облегчает активацию и пролонгирует открытое состояние этого типа кальциевых каналов (Lipscombe et al., 2004). Применение такой процедуры обусловлено тем, что в обычных условиях в интактных моторных терминалях мыши пул имеющихся Са2+-каналов L-типа находится в «замаскированном» состоянии, при котором он не оказывает воздействия на секрецию АХ (Urbano, Uchitel, 1999; Гайдуков и др., 2009). Вместе с тем, облегчение активации L-типа Са2+-каналов, в том числе с помощью S(-) BAY К 8644, приводит к тому, что вход Са2+ по каналам L-типа в терминали сопровождается облегчением вызванного выброса АХ (Atchison, 1989; Arenson, Gill 1996; Flink, Atchison, 2003; Гайдуков и др., 2009).
3.1. Влияние SM BAY К 8644 и кальциевых буферов на параметры вызванной секпепни АХ в условиях одиночной стимуляции.
Аппликация 1 мкМ S(-) BAY К 8644 на нервно-мышечный препарат вызывала увеличение средней амплитуды ПКГ1 на 21,1±3,6% (р<0,01; п=20) и КС ПКП на 24,1±7,5% (р<0,05; п=17) по сравнению с контролем (Рис. 6). Это совпадает с данными других авторов об облегчающем действии S(-) BAY К 8644 на вызванный
выброс медиатора в нервно-мышечных синапсах мыши (Flink, Atchison, 2003; Гайдуков и др., 2009). Эффекты ВАРТА-АМ.
При аппликации S(-) BAY К 8644 на фоне нагрузки терминалей ВАРТА-АМ средняя амплитуда ПКП составила 116,34*4,2% (р<0,001; п=16), что достоверно не отличается от средней амплитуды ПКП на фоне действия одного S(-) BAY К 8644 (р>0,05). Сходные данные были получены и в отношении КС ПКП в этих условиях, его значение составило Рис.6, Изменение квантового состава одиночных 125,6±9,2% от контроля (р<0,001; ПКП на фоне предварительной инкубации с ВАРТА-п=16) что не отличается от ш (50 мкМ) " EGTA-AM (SO мкМ) и при потенцирующего эффекта —ации S(-) BAY К 8644 (1 мкМ). (#-р<0,001;
собственно S(-) BAY К 8644 в р ' '
отношении КС ПКП в отсутствие буфера (Рис. 6). Таким образом, быстрый буфер оказался не способным предовратить потенцирование вызванного выброса АХ, индуцируемое S(-) BAY К 8644 как активатором L-типа Са2+-каналов.
Эффекты EGTA-AM. На фоне предварительной инкубации препарата в растворе, содержащем 50 мкМ EGT A-AM, средняя амплитуда ПКП при аппликации S(-) BAY К 8644 составила 81,2±2,6% (р<0,001; п=16), а КС ПКП - 83,4±5,9% от контрольных значений этих параметров (р<0,05; n=15). EGTA-AM не только предотвращает увеличение КС ПКП, вызваемое действием S(-) BAY К 8644, но и снижает значение этого параметра, причем в той же степени, что и при действии EGTA-AM в отсутствие S(-) BAY К 8644 в перфузирующем растворе (Рис. 6). Таким образом, только медленный буфер EGTA-AM оказался способным не только редуцировать прирост КС ПКП, вызываемый активацией L-типа Са2+-каналов с помощью S(-) BAY К 8644, но и снизить его до уровня ниже контрольного аналогично тому, как это наблюдалось при действии EGTA-AM на синапсы в отсутствие S(-) BAY К 8644. По-видимому, в этом случае медленный буфер способен ограничивать латеральную диффузию Са2+ из домепов, создаваемых входом Са2+ по L-типу Са2+ каналов до такого уровня, при котором они становятся неэффективными для облегчения Са2+-зависмого выброса АХ. Согласно расчетам, такие Са2+-домены и Са2+-каналы L-типа, находятся на достаточном удалении от мест экзоцитоза - порядка 150 им (Parekh, 2008). Кроме того, емкости и концентрации EGTA-AM (50 мкМ), по-видимому, оказывается достаточной, чтобы сохранить способность забуферивать и ограничивать диффузию Са2+ из перекрывающихся Са2+-доменов вокруг кластеров Са2+-каналов P/Q-типа, совместно участвующих в запуске экзоцитоза, аналогично тому, как это наблюдалось в предыдущей серии экспериментов.
В Контроль В ВАРТА-АМ О BAPTA-A№BAYK8644 140
120 ¡J 100
в80
и 60
И 40 20
О BAYK8644 ВЕСГА-АМ
В KCTA-AM+BAYK8644
#
3.2. Влияние Si-) BAY К 8644 и кальциевых буферов на параметры вызванной секреции АХ в условиях ритмической стимуляции.
В данной серии экспериментов исследовалось взаимодействие эффектов S(-) BAY К 8644 и Са -буферов в условиях ритмического выброса медиатора. Для этого проводили регистрацию вызванных ПКП при высокочастотной стимуляции нерва (20 Гц), аппликацию S(-) BAY К 8644, а также воздействие на терминали Са24 буферов.
Аппликация S(-) BAY К 8644 в концентрации 1 мкМ вызывала увеличение первого ПКП в залпе (ПКПО на 10,7±2,6% относительно контроля (р<0,01; п=17). Соотношение ПКП2/ПКП1 не изменилось относительно
контроля, его значение составило 100,5±1% от контроля (р>0,05; п=17), однако увеличилась амплитуда максимального ПКП в залпе на 3,4±1,2% от контроля (р<0,05; п=17). Кроме того, наблюдалось пролонгирование начального облегчения (Рис. 7).
На фоне активации каналов L-типа наблюдали также достоверный подъем уровня фазы плато в залпе на 7% по сравнению с контрольным (р<0,05; п=17) (Рис. 7). Таким образом, нами впервые показано стойкое облегчение вызванного выброса медиатора при активации Са ^-каналов L-типа в помощью S(-) BAY К 8644 (1 мкМ) в условиях не только одиночной, но и ритмической активности синапса. Отметим, что обнаруженные облегчающие эффекты S(-) BAY К 8644 совпадают по своему характеру с аналогичными изменениями рисунка залпа ПКП при растормаживании Са2+-каналов L-типа другим путем - с помощью блокаторов Са2+-активируемых К+ -каналов ВК-типа, описанных в данных синапсах (Гайдуков и др., 2009).
Эффекты ВАРТА-АМ. В условиях предварительной нагрузки препарата быстрым буфером ВАРТА-АМ (50 мкМ) и последующей аппликации S(-) BAY К 8644 амплитуда ШТ^ в залпах составила 109,4±3,4% от контрольного значения (р<0,05; п=23), т.е. не изменилась по отношению к действию самого S(-) BAY К 8644 (р>0,05). Соотношение ПКП2/ПКП1 достоверно снизилось до 1,05 относително ПКП] (99,7±1% от контроля; р>0,05; п=23). При этом амплитуда максимального пика ПКП в залпе в этих условиях снизилась до значений, характерных для контрольных залпов (101,2±0,9%; р>0,05; п=23). Предварительная нагрузка ВАРТА-АМ оказалась не способной предотвратить прирост уровня амплитуды ПКП на фазе плато, который составил как и на фоне действия самого S(-) BAY К 8644, 96,5±2,9% от ПКП, (109,5±3,3% от контроля; р<0,05; п=23) (Рис. 7).
Итак, при растормаживании L-типа Са2+-каналов и потенцировании начального облегчения в залпе ПКП, ВАРТА-АМ оказалась способной лишь отчасти снижать начальное облегчения до контрольного уровня, но не полностью его редуцировать, как это наблюдалось при «молчащих» Са +-каналах L-типа. Это может означать, что в присутствии ВАРТА-АМ редуцируется вклад тех же самых близко расположенных
Номер пки
Рис. 7. Огибающие рисунка залпа ПКП при стимуляции нерва с частотой 20 Гц в контроле, на фоне инкубации препарата с EGTA-AM и ВАРТА-АМ (50 мкМ), BAY К 8644 (1 мкМ), а такнее при совместной аппликации BAY К S644 с EGTA-AM и ВАРТА-АМ (*-р<0,0S)
источников Са2+, которые обеспечивали облегчение в контроле. Однако подключаются и новые источники входящего Са2+ (и, видимо, Са2+-сенсоры, поддерживающие облегчение), возможно, более удаленные и связанные с диффузией кальция от Са2+-каналов L-тииа.
Эффекты EGTA-AM. Нагрузка терминалей медленным буфером EGT A-AM в концентрации 50 мкМ иным образом повлияла на действие S(-) BAY К 8644. В присутствии EGTA амплитуда ПКП1 оказалась подавленной ниже контрольного значения и составила 88,7±2% от контроля (р<0,001; п=30), что сопоставимо с действием самого EGTA-AM (см. выше) (р>0,05). В этих условиях соотношение ПКП2/11К1[| также не изменилось по сравнению с контролем (100,6±0,8% от контроля, р>0,05; п=30). Амплитуда максимального пика в залпе при совместной аппликации EGTA-AM и S(-) BAY К 8644 составила 104±1,5% от контроля (р<0,05; п=30), а уровень фазы плато - 110,2±2,2% (р<0,001; п=30), что достоверно не отличается от значения этого параметра на фоне S(-) BAY К 8644 в отсутствие буфера (р>0,05) (Рис. 7). Таким образом, не только ВАРТА-АМ, но и EGTA-AM в присутствии S(-) BAY К 8644 потерял способность подавлять уровень плато ПКП в залпах до значений ниже контрольных. Можно предположить, что несмотря на присутствие Са2+-буферов, на фоне растормаживания Са2+-каналов L-типа и создания вокруг них Са2+-доменов, вовлекаются дополнительные Са2+-зависимые процессы, препятствующие снижению уровня плато под действием буферов. Согласно данным литературы, это может быть либо замедление инактивации L-типа Са2+-каналов (Tuckwell, 2011), либо дополнительная стимуляция процессов рециклизации везикул под действием ферментов, активируемых входом Са2+по L-Типу Са2+- каналов (Parekh, 2008).
Подводя итог анализу эффектов буферов на ритмическую активность, важно отметить, что вызываемый S(-)BAY К 8644 прирост КС ПКП по всему ходу залпа (за исключением прироста начального облегчения) подвергся редукции только с помощью медленного буфера EGTA-AM. Вход Са2+ по L-типу медленных Са2+-каналов непосредственно может, хотя и с некоторой задержкой, вносить вклад в Са2+-сигналы, запускающие и поддерживающие секрецию АХ, тем самым вызывая повышенный выброс медиатора (Flink, Atchison, 2003). Однако недавно установлено, что вход Са2+ по L-типу Саг+-каналов вызывает выброс депонированного Са2+ через РиР, и именно этот источник Са1+ оказывает облегчающее влияние на выброс АХ. Было показано, что блокада РиР рианодином (2 мкМ) полностью нивелирует облегчающие эффекты Са2+-тока L-типа на секрецию медиатора, симметрично сдвигая рисунок залповой активности на более сниженный уровень по всему ходу залпа, включая фазу плато (Гайдуков и др., 2009).
Примечательно, что характер редуцирующего действия EGTA-AM на залповую активность, оказался практически совпадающим с характером редуцирующего действия рианодина (блокатора РиР) на аналогичное облегчение залповой активности, вызываемое S(-) BAY К 8644. Поэтому мы предположили, что подавляющее ритмическую активность действие EGTA-AM может заключаться в разобщении сопряженной работы двух типов Са2+-сигналов - от L-типа Са2+-каналов и РиР, EGTA, редуцируя Са2+-домены создаваемые входом Са2+ по L-типу Са2+-каналов, предотвращает активацию РиР и выброс депонированного Са2+ через РиР, который в этом случае играет ведущую роль в потенцировании секреции АХ, тогда как Са2+-домены, создаваемые входом Ca2" по L-типу, служат лишь для запуска
выброса депонированного кальция (Рис. 8). Несмотря на выдвинутое нами предположение, что механизмом редуцирующего действия ЕСТА-АМ в данной серии была редукция Са2+-домеиов, создаваемых входом Са2+ по Ь-типу Са каналов, служащих лишь для активации РиР, нельзя полностью исключить, что действие ЕвТА-АМ могло быть направлено и непосредственно на редукцию кальциевых сигналов, образуемых Са2+-зависимым выбросом депонированного кальция. Поэтому в следующей серии была исследована способность Са -буферов редуцировать секрецию АХ на фоне прямой активации выброса депонированного кальция с помощью агонистов РиР.
Р/О-тип Са2+-каналов Ь тип Са2+- каналов
Рис. 8. Схема участия в секреции АХ Са2*-сигналов, создаваемых входом кальция по Ь-типу Са2+ каналов, построенная на основании эффектов ВАРТА-АМ и ЕСТА-АМ. Показана способность ЕОТА разобщать сопряжение между входом Са2*-тока Ь-типа и активацией РиР, сопровождающаяся блокированием выброса депонированного Со1*.
4. Влияние ВАРТА-АМ и ЕСТА-АМ на секрецию АХ в условиях активации
пресинаптичсских РиР
В нервных терминалях моторных синапсов мыши описаны цистерны гладкого эндоплазматического ретикулума, содержащие рианодиновые рецепторы, активация которых вызывает выброс депонированного Са2+ и облегчение передачи при определенных условиях работы синапсов (ЪПзЫтига й а!., 1990; Ыагка, 1998; Балезина, Букия, 2007). Мы исследовали пресинаптические эффекты агониста РиР кофеина (2,5 мМ), а также модификацию этих эффектов при нагрузке терминален Са2+-буферами.
4.1. Влияние кофеина кальциевых буферов на параметры вызванной секреции АХ в условиях одиночной стимуляции.
На фоне кофеина усиливалась вызванная секреция АХ: средняя амплитуда одиночных ПКП возрастала на 26,7±4% от контроля (р<0,001; п=20). В этих условиях достоверно увеличивался и КС ПКП на 12.9±4% (р<0.01; п=22) (Рис. 9). Мы установили, что увеличение средней амплитуды ПКП не было пропорционально увеличению КС ПКП. т.к. аппликация кофеина вызывала увеличение амплитуды МПКП на 38,9±6,6% от контроля. Обнаруженная нами способность кофеина облегчать одиночные акты вызванной секреции, приводя к увеличению КС ПКП на 13%, совпадает с данными литературы в отношении нервно-мышечных синапсов теплокровных (МвЫтига е! а1., 1990; ЗЬи^г & а1., 1999), гиппокампальных синапсов (ЗЫгтги et а!., 2008). Показано, что аппликация кофеина в используемом
Я Контроль
В BGTA-AM 120 ■ 100 ■
£■ 80 •
g 60 ■ V
И 4020-
О Кофеин Q ВАРТА-АМ
8 ВАРТА-АНЫСофеин 0 ЕСТА-АМЯСофеин **
Г
диапазоне концентраций резко увеличивает сродство РиР к ионам Са + (Porta et al,,
2011). Это приводит к возрастанию вероятности выброса депонированного Са2+
через активированные кофейном РиР. В результате, можно предполагать, что на
фоне действия кофеина в работающих терминалях оказывается повышенной (по
сравнению с контролем) внутриклеточная концентрация кальция за счет
подключения выхода Са2+ из Са2+-депо (Narita et al., 2000; Shimuzu et al., 2008). Это,
в свою очередь, приводит к усилению выброса медиатора, выражающемуся в
увеличении КС ПКП. В связи с этим, важно было проверить, каким образом
нагрузка терминалей Са2+-буферами скажется на этот облегчающий синаптическую
передачу эффект кофеина.
Эффекты ВАРТА-АМ.
На фоне предварительной нагрузки
препарата быстрым буфером ВАРТА-
АМ (50 мкМ) кофеин (2,5 мМ) вызвал
прирост средней амплитуды ПКП
до114,8±4,1% от контроля (р<0,01;
п=21), что достоверно ниже значения
амплитуды ПКП при аппликации
кофеина в отсутствие буфера (р<0,05).
Нагрузка ВАРТА-АМ в концентрации
50 мкМ полностью предотвращала
увеличение КС ПКП под действием „ „
, г. Рис. 9. Изменение квантового состава одиночных
кофеина. Значение этого параметра в /ш/ ш фот предварительной инку6ати с
данной ситуации составило ВАРТА-АМ (50 мкМ) и EGTA-AM (50 мкМ) и при 101,4±4,9% от контроля (р>0,05; аппликации кофеина (2,5 mM)(U - р<0,001; ** -п=21) (Рис. 9). Различия в значениях р<0,01)
средней амплитуды и КС ПКП объясняются отсутствием эффекта ВАРТА-АМ на среднюю амплитуду МПКП (138,6±7,2% от контроля; р<0,001; п=24). Эффекты EGTA-AM. Медленный Са2+-буфер EGTA-AM в концентрации 50 мкМ предотвращал увеличение средней амплитуды ПКП, вызваемое действием кофеина (107,9±б% от контроля, р>0,05; п=13), а также - прирост КС ПКП (100,4±3,7% от контроля, р>0,05; п=21) (Рис. 9).
Таким образом, оказалось, что в нервно-мышечном синапсе мыши быстрый и медленный Са2+-буферы в равной степени способны предотвращать развитие эффектов кофеина в отношении увеличения КС ПКП. По данным литературы, в случае, когда и быстрый, и медленный Са2+-буферы способны оказывать одинаковое воздействие на Са2г-зависимое изменение секреции квантов медиатора, это обусловлено не фазным, а тоническим подъемом уровня внутриклеточного Са2+ (Angelson, Bete, 2001).
По-видимому, в случае продолжительного действия кофеина на нервную терминаль, выброс депонированного кальция приводит именно к такому тоническому (генерализованному) подъему уровня цитоплазматического кальция. Это может облегчать насыщение кальцием везикулярных Са2+-сенсоров еще до прихода пресинаптического ПД и, тем самым, повышать вероятность выброса везикул. В этом случае действие обоих буферов может быть равноэффективным в редуцировании повышенного базального уровня кальция.
4.2. Влияние кофеина и кальциевых буферов на параметры вызванной секреции АХ в условиях ритмической стимуляции.
Аппликация 2,5 мМ кофеина оказывала отчетливый
облегчающий эффект на залповую активность синапса (Рис. 10). Так, соотношение ПКП2/ПКП1 в этих условиях достоверно возросло на 6,1±1,6% относительно контроля (р<0,01; п=21), амплитуда максимального пика в залпе составила 109,1 ±2,2% от контроля (р<0,001; п=21), уровень фазы плато также повысился до 109,9±4,2% относительно контроля (р<0,05; п=21). Согласно данным литературы, кофеин способен усиливать начальное облегчение передачи в гиппокампальных нейронах при частоте стимуляции 20 Гц (БЬишги Й а1., 2008). Эти эффекты приписывают способности кофеина выбрасывать депонированный кальций, создающий Са2+-сигналы, взаимодействующие с Са +-доменами от Р/С?-тина потенциал-зависимых Са2+-каналов и облегчающие выброс непосредственно готовых к выбросу везикул (№зЫтига й а1., 1990; Балезина, 2002). Каков именно характер возникающих Са2+-сигналов (локальный или генерализованный подъем кальция) - до сих пор не изучено. В связи с этим, было необходимо сравнить возможности быстрого и медленного Са -буферов редуцировать вышеописанные эффекты кофеина.
Эффекты БАРТА-АМ. Мы установили, что быстрый буфер ВАРТА-АМ полностью предотвращал развитие облегчающих эффектов кофеина (Рис. 10). В этих условиях полностью нивелировалось начальное облегчение, развивалась депрессия (соотношение ПКП2/ПКП1 составило 93,8±0,8% от контроля (р<0,001; п=27)). Следует отметить, что полученные данные соответствуют характерному для ВАРТА-АМ подавлению начального облегчения у интактных синапсов. Кроме того, этот быстрый буфер предотвращал подъем уровня фазы плато под действием кофеина (96,6±1,8% от контрольного значения; р>0,05; п=27).
Эффекты ЕСТА-АМ. Медленный буфер ЕОТА-АМ действовал сходным с ВАРТА-АМ образом (Рис. 10). Предварительная нагрузка нервно-мышечного препарата ЕОТА-АМ предотвращала усиление начального облегчения передачи, вызываемого действием кофеина, сохраняя его на контрольном уровне (соотношение ПКП2/ПКП1 составило 98,8±0,6% от контроля (р>0,05; п=22), а амплитуда максимального ПКП -98,2±1% от контроля (р>0,05; п=27)). Сходный эффект наблюдали и в отношении уровня фазы плато (его уровень составлял 97,9±1,5% от контроля (р>0,05; п=27).
Таким образом, нами впервые показано, что в моторных терминалах мыши предварительная инкубация нервно-мышечного препарата с ВАРТА-АМ или ЕОТА-АМ предотвращала значительное увеличение уровня выброса медиатора, вызванное кофеином, по всему ходу ритмического залпа ПКП. При этом важно отметить, что на
-Контроль Кофеин
»О—ВАРТА+Кофеин -Л— ЕСТА+Кофенн
Рис. 10. Огибающие рисунка залпа ПКП при стимуляции нерва с частотой 20 Гц в контроле, на фоне инкубации препарата в растворе кофеина(2,5мМ), ЕСТА-АМ и ВАРТА-АМ (50 мкМ), а также при совместной аппликации кофеина с ЕвТА-АМ и ВАРТА-АМ (* - р<0,05; ** - р<0,01)
фоне действия кофеина, облегчающего выброс депонированного Са2+ в терминалях, оба буфера сохраняли свое характерное действие на начальное облегчение передачи в залпе ПКП - именно ВАРТА-АМ оказалась способной не только предотвращать прирост начального облегчения, вызванный кофеином, но и полностью нивелировать его (как это было и в контроле).
Нагрузка EGTA-AM также предотвратила усиление начального облегчения под действием кофеина, но не снизила его относительно интактного контроля. Это означает, что при выбросе депонированного Са2+ под действием кофеина, в аксоплазме могут формироваться кальциевые транзиенты (локальные подъемы Са2+), кальций из которых участвует в явлениях начального облегчения передачи в ритмимческом залпе ПКП. При этом источники такого кальция располагаются как в непосредственной близости (около десятка нм) от Са2+ сенсоров везикул (поскольку облегчение редуцирутся ВАРТА-АМ), так и на отдалении в сотни нм (т.к. отчасти облегчение редуцируется и EGTA-AM).
Интересным является и тот факт, что оба буфера в равной степени предотвращали подъем уровня фазы плато в залпе под действием кофеина, но теряли способность подавлять его уровень (как они это способны были делать в отсутствие кофеина).
Однотипное со стороны обоих буферов редуцирование возросшего уровня секреции АХ в залпе, вызванного кофеином, отличается от обнаруженного нами дифференцированного действия медленного и быстрого буферов на подъем уровня секреции в залпе, вызываемой S(-) BAY К 8644 и входом Са2+ по каналам L-типа. Отсюда можно предположить, что в случае S(-) BAY К 8644 избирательное действие EGTA-AM было связано, как мы и предполагали, с редукцией локальных Са2+-доменов, возникающих вокруг L-типа каналов, разобщением Са2+-зависимой активации РиР и предотвращением выброса депонированного Са2+. В данном же случае, на фоне кофеина, равноэффективное редуцирующее действие обоих буферов на подъем уровня секреции в залпе, вызываемый кофеином, по-видимому, обусловлено их активностью в отношении генерализованного подъема уровня Са2+ в терминали. Действительно известно, что кофеин при длительной аппликации, вызывая выброс депонированного Са2+, приводит к генерализованному подъему [Са2+]„, в клетках (Oheim et al., 2006).
В ходе проведения данной серии экспериментов остался нерешенным вопрос, чем обусловлены изменения спонтанных МПКП, которые имели место наряду с увеличением КС ПКП под действием кофеина? Хорошо известны многообразные пресинаптические эффекты кофеина, не связанные с выбросом депонированного кальция (например, ингибирование аденозиновых рецепторов, действие на фосфодиэстеразы и т.д.) (Fredholm et al., 1999). Поэтому важно было понять, являются ли индуцированные кофеином изменения параметров и МПКП последствиями выброса депонированного Са2+, или имеют иную природу. Для ответа на этот вопрос облегчающие эффекты кофеина в отношении спонтанной активности синапсов исследовали на фоне нагрузки терминалей быстрым и медленным Са2+-буферами.
5. Влияние ВАРТА-АМ и EGTA-AM на Са2+-зависимую регуляцию размера
кванта медиатора
В последней серии экспериментов исследовали Са2+-зависимость выявленных изменений МПКП при действии на терминали избирательных агонистов РиР -
кофеина (2,5 мМ) и рианодина (1 мкМ). Исследования проводили на нерассеченных нервно-мышечных препаратах диафрагмы мыши.
250
5.1. Влияние кофеина на частоту МПКП.
Кофеин (2,5 мМ) вызывал увеличение средней частоты МПКП более чем в 2 раза - до 220,4±34,4% от контроля (р<0,01; п=18). Примечательно, что предварительная инкубация препарата в растворах ВАРТА-АМ и EGTA-AM (50 мкМ) сама по себс не вызывала изменений частоты МПКП, и оказалась неспособной предотвратить прирост частоты МПКП, вызванный аппликацией кофеина на фоне буферов. В случае нагрузки ВАРТА-АМ кофеин вызывал прирост частоты до 236,4±31,8% (р<0,001; п=21), а в случае EGTA-AM - до 218,7±30% (р<0,01; п=18). Увеличение частоты спонтанной секреции под действием агонистов РиР принято относить за счет выброса депонированного кальция (Roed, 1986; Балезина, 2000). Однако у кофеина имеется множество других точек действия в термйнали, в том числе - ингибирование пресинаптических аденозиновых рецепторов, активация фосфодиэстеразы, приводящая к повышению уровня цАМФ в клетке (Fredholm et al., 1999). Поэтому неспособность CaJ+ буферов предотвратить прирост частоты МПКП под действием кофеина позволяет заключить, что на самом деле прирост частоты МПКП в данном случае может быть следствием эффектов кофеина, не связанных с выбросом депонированного кальция.
5.2. Влияние кофеина и рианодина на амплитуду МПКП.
Под действием кофеина в течение 1530 минут средняя амплитуда МПКП возросла до 138,9±6,6% от контроля (р<0,001; п=20). Кроме того, наблюдался сдвиг основного пика гистограммы распределения амплитуд МПКП в сторону более высоких значений. Аппликация другого агониста РиР - рианодина (1 мкМ) вызывала сходное увеличение средней амплитуды МПКП до 121,8±6,7% (р<0,01; п=14) и сходный сдвиг гистограммы (Рис. 11). Аналогичное увеличение амплитуды миниатюрных постсинаптических
потенциалов под действием рианодина описано в центральных синапсах (Llano et al., 2000). При этом рианодин не оказывает воздействий на временные параметры нарастания МПК11 на фоне рианодина составило 93,4±3,5% (р>0,05, п=15), а время полуспада МПКП - 94,3±4,4% от контроля (р>0,05, п=15).
Кофеин же, как мы установили, вызывает наряду с увеличении амплитуды МПКП еще и увеличение времени нарастания до 119±2,7% (р<0,001; п=21) и времени полуспада МПКП до 141,5±4,8% от контроля (р<0,001; п=21). Это связано с еще одним побочным эффектом кофеина - его способностью частично блокировать ацетилхолинэстеразу в моторных синапсах (Балезина и др., 1999). Поэтому дальнейший анализ природы феномена увеличения амплитуды МПКП под действием агонистов РиР мы проводили, используя рианодин (1 мкМ).
" Контроль -О—Кофеин 2,5 мМ —й--Рианодин 1 мкМ
3 4 Амплитуда МПКП, мВ
Рис. 11. Огибающие гистограмм распределения амплитуд МПКП в котнроли и при аппликации кофеина (2,5 мМ) и рианодина (1 мкМ)
миниатюрных потенциалов - время
5.3. Влияние везамикола и бафиломицина AI на действие и рианодина в отношении МПКП.
Мы предположили, что увеличение средней амплитуды МПКП при активации РиР может быть связано с Са2+-зависимым увеличением размера кванта медиатора вследствие его усиленной накачки в везикулу. Для проверки этой гипотезы использовали избирательный блокатор активности транспортера АХ в везикулу везамикол (5 мкМ) и блокатор Н+-АТФазы бафиломицин А1 (1 мкМ). Прямая блокада заполнения везикул везамиколом (5 мкМ) полностью предотвращала развитие эффектов рианодина (1 мкМ). Средняя амплитуда МПКП в этих условиях составила 97,4±4,4% от контроля (р>0,05, п=25) (Рис. 12). Поскольку основной движущей силой заполнения везикул является протонный градиент (Van der Kloot, 1991), создаваемый протонной АТФ-азой, мы решили использовать ее блокатор бафиломицин AI (1 мкМ). Предварительная инкубация
препарата с бафиломицином AI предотвратила прирост амплитуды МПКП, вызываемый рианодином: средняя амплитуда МПКП на фоне совместного действия бафиломицина AI и рианодина составила 95,4±2,7% от контроля (р>0,05, п=23) (Рис. 12).
Таким образом, нами впервые показано, что в случае предварительного блокирования процесса накачки везикулы медиатором (как прямым, так и непрямым способом), рианодин теряет способность вызвать прирост амплитуды МПКП. Исходя из этого, можно заключить, что действие рианодина заключается в увеличении размера кванта АХ вследствие усиленной закачки медиатора в везикулу. Важно было понять, является ли этот процесс зависимым от кальция, выбрасываемого из цистерн эндоплазматического ретикулума под действием рианодина. Для ответа на этот вопрос были использованы Са2+-буферы.
5.4 Влияние ВАРТА-АМ и EGTA-AM на способность рианодина увеличивать амплитуду МПКП.
Предварительная нагрузка препарата быстрым буфером ВАРТА-АМ не смогла предотвратить прирост средней амплитуды МПКП, вызванный 1 мкМ рианодина (119±б,4% от контроля, р<0,05; п=12). Также не изменилось положение пика гистограммы распределения амплитуд МПКП (Рис. 13). Ее пик сохранился на том же месте, что и при аппликации чистого рианодина, однако сама гистограмма стала более узкой (снижение дисперсии). В то же время EGTA-AM полностью предотвратил развитие эффектов рианодина. Так, средняя амплитуда МПКП в этих условиях составила 103,4±2,3% от контроля (р>0,05, п=14), гистограмма распределения амплитуд МПКП не отличается от контроля (Рис. 13).
■ Koiirjtojib 3 Везамикол
0 бафиломицин .41 ШРианодин
□ Везлмнкол+Рнаноаии £Э Бафиломицин Al+Риаиохшп
Рис. 12. Средняя амплитуда МПКП в контроле и при действии рианодина (1 мкМ) в условиях предварительной инкубации с везамиколом (5 мкМ) и бафиломицином А1 (1 мкМ) (**-р<0,01).
Обнаруженная нами избирательная способность EGTA-AM предотвращать прирост амплитуды МПКП, вызываемый рианодином, свидетельствует в пользу зависимости эффекта прироста МПКП от кальция, выбрасываемого из цистерн эндоплазматического ретикулума через активированные РиР. Известно, что РиР могут быть расположены кластерами в составе мембраны ретикулума (Dan et al., 2007). При активации кластера РиР происходит образование локальных Са21"-доменов в устье открытых РиР, которые, перекрываясь, создают Са2+-макродомен, действие которого растпространяется на расстояния порядка 100 нм - 1 мкм (Dargan, Parker, 2003). EGTA может играть роль ограничителя такого Са21"-домена и разобщителя действия депонированного кальция на определенную мишень в терминали, ответственную за усиление накачки медиатора в везикулу. Мы предположили, что такой мишенью может быть Ca" -зависимый фермент кальмодулинкиназа II типа (СаМКП), сцепленная с поверхностью везикул (Takamori, 2006). Поэтому в последней серии экспериментов было проверено участие кальмодулина и СаМКП в Са2+-зависимом увеличении размера кванта медиатора.
5.5. Влияние блокаторов кальмодулина и СаМКП на способность рианодина увеличивать амплитуду МПКП.
Мы установили, что предварительная обработка препарата селективным блокатором кальмодулина - кальмидазолом (R24571) (2 мкМ) полностью предотвращает развитие эфффектов рианодина (1 мкМ). Средняя амплитуда МПКП вэтих условиях составила 92±7,2% от контроля (р>0,05, п=12) .Блокада активности СаМКИ ее специфическим ингибитором KN-93 (3 мкМ) полностью предотвращала прирост амплитуды МПКП, вызываемый рианодином. Средняя амплитуда МПКП в этих условиях составила 94,3±4,6% от контроля (р>0,05, п=16).
Амплитуд.-! МПКП, мВ
Рис. 13. Огибающие гистограмм распределения амплитуд МПКП в контроле, при аппликации рианодина (1 мкМ), а также на фоне предварительной нагрузки с ВАРТА-АМ (50 мкМ) и ЕвТА-АМ (50 мкМ).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенные нами исследования эффектов ВАРТА-АМ и EGTA-AM выявили их дифференцированные воздействия на секрецию АХ, позволяющие охарактеризовать участвующие в регуляции секреции медиатора Са2+-сигналы. При активности пула Са2+-каналов P/Q-типа можно предполагать формирование в активных зонах перекрывающихся Са2+-нанодоменов, создающих Са2+-макродомен, избирательно редуцируемый EGTA, участвующий в запуске одиночных актов секреции АХ. Аналогичный характер формирования Са2+-сигналов обнаружен в ряде центральных (Borst, Sakman, 1996; Rozov et al., 2001; Parekh, 2008) и моторных синапсов млекопитающих (Ruiz et al., 2011).
Специфические изменения разных фаз ритмического залпа - начального облегчения (подавляемого только ВАРТА) и фазы плато в залпе (подавляемой обоими буферами с одинаковой эффективностью) позволяет заключить, что в создании облегчения участвует Са2+ из состава Са2+-нанодоменов, формируемых в непосредственной близости (порядка 40-50 нм) от локированных везикул (предположительно, кальцием от активированных Са2+-каналов P/Q-типа и РиР). В то же время уровень фазы плато в ритмическом залпе ПКП поддерживается тоническим базальным подъемом уровня ионизированного Са2+ в цитоплазме терминали.
Эффекты нагрузки терминалей Са2+-буферами на фоне активации L-типа Са2+ каналов показали избирательную способность EGTA редуцировать прирост КС ПКП, вызванный входом Са2+ по этому типу Са2+-каналов, причем не только в актах одиночной секреции, но и при ритмической активности синапсов. Сходство эффектов EGTA с действием блокаторов РиР в этих условиях, а также данные литературы о возможности растормаживания РиР за счет Са2+-тока L-типа в нейронах (Berrout, Isokava, 2009), позволяют заключить, что основным эффектом EGTA было разобщение сопряжения между входящим Са2+-током L-типа и выбросом Са2+ из Са2+-депо. Вместе с тем, неспособность Са2+-буферов полностью подавить потенцирование залповой активности, говорит о наличии у Са2+-входа L-типа самостоятельной функции, направленной, в частности, на усиление процессов рекрутирования везикул и, соответственно, повышение уровня плато в залпе. Способность EGTA, но не ВАРТА, избирательно подавлять прирост размера кванта АХ, вызванный действием кофеина или рианодина, позволяет говорить об обнаружении Са2+-зависимого механизма увеличения размера кванта АХ в моторном синапсе мыши, вызываемого выбросом депонированного кальция через РиР. Нами впервые показано, что в регуляции этого процесса задействованы кальмодулин и CaMKII.
Таким образом, с помощью ВАРТА и EGTA впервые выявлена ранее не известная специфика Са2+-сигналов и их взаимодействий при работе разных Са2+-входов моторных нервных терминалей мыши. Раскрыта возможность дифференцированной регулировки режимов секреции медиатора с помощью различных концентраций и типов работающих в терминалях Са2+-буферов. Это подтвреждает представления об эндогенных и экзогенных Са2+-буферах как самостоятельном звене Са2+-зависимой настройки работы синапсов.
ВЫВОДЫ
1) В нервно-мышечных синапсах мыши быстрый буфер ВАРТА-АМ (10-100 мкМ) не влияет, а медленный буфер EGTA-AM вызывает дозозависимое (10-100 мкМ) снижение КС одиночных ПКП.
2) Быстрый буфер ВАРТА-АМ дозозависимо (1-100 мкМ) подавляет развитие начального облегчения передачи в ритмическом залпе (20 Гц), а медленный буфер EGTA-AM (1-100мкМ) не влияет на этот параметр. Оба буфера равноэффективно снижают амплитуду ПКП на фазе плато в залпе.
3) Установлена избирательная способность EGTA-AM (50 мкМ) редуцировать прирост КС ПКП, запускаемый входом Са2+ по L-типу Са2+-каналов (под действием S(-) BAY К 8644 (1 мкМ)) - как в актах одиночной секреции, так и при ритмической активности синапсов. При этом EGTA-AM не влиет, а ВАРТА-АМ редуцирует усиление начального облегчения передачи в ритмическом залпе ПКП.
4) Активация РиР с помощью кофеина (2,5 мМ) вызывает прирост КС одиночных ПКП, который в равной степени предотвращается предварительной нагрузкой ВАРТА-АМ и EGTA-AM (50 мкМ). Усиление начального облегчения в ритмическом залпе ПКП, вызываемое кофеином, избирательно тормозится ВАРТА-АМ (50мкМ). При этом оба буфера равноэффективно подавляют прирост уровня плато ПКП в залпе, вызываемый кофеином.
5) Активация РиР кофеином (2,5 мМ) и рианодином (1 мкМ) вызывает одинаковое увеличение средней амплитуды МПКП. Предварительная блокада везикулярного транспортера АХ везамиколом (5 мкМ) и Н+-АТФазы - бафиломицином Al (1 мкМ), а также присутствие EGTA-AM - предотвращают развитие этого эффекта, что свидетельствует о Са2+-зависимом увеличении размера кванта АХ под действием рианодина.
6) Предварительная блокада капьмодулина кальмидазолом (R24571) (2 мкМ), фермента CaMKII с помощью KN-93 (3 мкМ) предотвращает прирост амплитуды МПКП, вызванный рианодином.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1) Скитева О.И. Влияние кофеина на спонтанную и вызванную активность рассеченного нервно-мышечного диафрагмального препарата мыши. Тезисы докладов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», 8-11 апреля 2008 г., Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, М.: МАКС Пресс, 2008, С. 226227.
2) Скитева О.И, Изменение параметров нервно-мышечной передачи под действием быстрого внутриклеточного кальциевого буфера ВАРТА-АМ. Тезисы докладов I всероссийской (XVI) молодежной научной конференции "Молодежь и наука на севере", Сыктывкар, 14-17 апреля 2008 г., Т.2, С. 255-256.
3) Скитева О.И., Лаптева В.И., Балезина О.П. Влияние экзогенных Са2+-буферов на вызванную секрецию медиатора в моторном синапсе мыши. Материалы конференции с международным участием, посвященной 90-летию со дня рождения академика Т.М. Турпаева «Механизмы нервных и иейроэндокринных регуляций)). Москва, 24-26 ноября 2008 г., М. Фирма «Слово», 2008, С. 104.
4) Скитева О.И., Лаптева В.И., Балезина О.П. Влияние ВАРТА-АМ на спонтанную и вызванную активность нервно-мышечного препарата мыши. Тезисы докладов VI Сибирского физиологического съезда, Барнаул, 25-27 июня 2008 г. - Барнаул: Принтэкспресс, 2008 г. T. I, С. 75.
5) Скитева О.И., Лаптева В.И., Балезина О.П. Влияние экзогенных буферов кальция ВАРТА-АМ и EGTA-AM на параметры спонтанной активности нервно-мышечного синапса мыши. Сборник статей "Биология: Традиции и инновации XXI века", 6-10 июля 2008г., Казань. Изд-во КГУ, 2008 г., С. 98-100.
6) Скитева О.И., Лаптева В.И., Балезина О.П. Роль внутриклеточного кальция и кальциевых буферов в регуляции размеров кванта медиатора в моторных синапсах. Сборник статей международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", Пущино, 2-4 июня 2009 г., объединенное научно-техническое издательство Пущинского научного центра РАН, г. Пущино. Т.1, С. 212-216.
7) Skiteva О., V. Lapteva, О. Balezina. Influence of slow and fast Ca2+-buffers on ACh sécrétion activated by several Ca2+ inputs in mouse motor terminais. Main meeting of the Physiological Society "Physiology 2009", Dublin, 7-10 July 2009, Abstracts, P. 133.
8) Скитева О.И., Лаптева В.И., Балезина О.П. Вызванная секреция медиатора на фоне действия быстрых и медленных кальциевых буферов. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, ISSN 0365-9615, Издательство Российской академии медицинских наук, 2010, Т.148, №3, С.247-250.
9) Skiteva О., V. Lapteva, О. Balezina Study of ryanodine-induced increases of miniature endplate potentials amplitude in mouse motor synapses. 7tb FENS Forum, Amsterdam, 3-7 July 2010, FENS Abstracts, vol.5,076.41.
10) Скитева О.И., Лаптева В.И., Балезина О.П. Влияние выброса депонированного кальция на размер кванта медиатора в моторном синапсе мыши. Тезисы докладов XXI съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова, 19-25 сентября 2010г., Калуга, С. 562.
11) Скитева О.И., Лаптева В.И., Балезина О.П. Участие ПКС и ПКА в регуляции изменения размера кванта медиатора при активации рианодиновых рецепторов. Сборник докладов Всероссийской молодежной школы «Нейротехнологии 2010. Биоэкономика, основанная на знаниях: политика инновационного пути развития биотехнологии» 24-29 сентября 2010 г., Бекасово, Московская область, С. 26-27.
12) Skiteva О., V. Lapteva, О. Balezina. Probable mechanisms of Ca2+-dependent quantal size régulation in mouse motor terminais. 8'h IBRO World Congress of Neuroscience, Florence, Italy, 14-18 July 2011, Abstracts, B205
13) Скитева О.И., Лаптева В.И., Балезина О.П. Участие депонированного кальция в регуляции размера кванта медиатора. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, ISSN 0365-9615, Издательство Российской академии медицинских наук, 2011, Т.152, №10, С.368-371.
Подписано в печать:
18.01.2012
Заказ № 6513 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru
Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Скитева, Ольга Игоревна, Москва
61 12-3/496
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова
БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ Кафедра физиологии человека и животных
Скитева Ольга Игоревна
РОЛЬ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ Са2+-БУФЕРОВ В РЕГУЛЯЦИИ
СЕКРЕЦИИ МЕДИАТОРА
специальность 03.03.01 - физиология
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель д.б.н., профессор Балезина О.П.
Москва, 2012
ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ...................................................................................................................2
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.......................................................5
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.......................................................................6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................10
1. Са2+ сигналы в нейронах и нервных терминалях..................................................10
1.1 «Са2+-нанодомен» и «Са2+-микродомен».........................................................10
1.2 Са2+-домены Са2+-каналов L-типа.....................................................................14
1.3 Са2+-домены вокруг РиР....................................................................................16
2. Мишени Са2+-сигналов в терминалях синапсов...................................................18
3. Эндогенные Са2+-связывающие буферные белки и их роль в регуляции секреции медиатора.....................................................................................................19
3.1 Общая характеристика эндогенных Са -буферов..........................................19
3.2 Сопоставление эндогенных Са2+-буферов с экзогенными.............................22
4. Экзогенные Са2+-буферы и их роль в модуляции Са2+-сигналов в синапсах ....23
4.1. Физико-химические свойства ВАРТА и EGTA.............................................23
4.2. ВАРТА и EGTA как модуляторы Са -доменов............................................25
4.3. Роль ВАРТА и EGTA в оценке действующих на везикулы Са2+-сигналов. 27
4.4. ВАРТА и EGTA как модуляторы Са -сигналов от Са -каналов L-типа и рианодиновых рецепторов.......................................................................................31
4.4.1 Са2+-буферы и Са2+-домены Са2+-каналов L-типа....................................31
4.4.2 Са2+-буферы и Са2+-домены РиР................................................................32
5. Роль экзогенных Са2+-буферов в регуляции спонтанной секреции квантов медиатора......................................................................................................................34
6. Роль Са2+-буферов в регуляции вызванного выброса медиатора.......................35
6.1. Одиночная активность синапсов.....................................................................35
6.2 Ритмическая активность синапсов...................................................................36
6.2.1 Са2+-зависимое облегчение передачи и роль Са2+-буферов....................37
Л i
6.2.2. Регуляция фазы депрессии и фазы плато в залпе с участием Са -буферов..................................................................................................................39
7. Секреция медиатора в условиях стимулированного выброса депонированного кальция и роль Са -буферов......................................................................................41
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.........................................................44
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.................................................................................52
1. Влияние ВАРТА-АМ и EGTA-AM на параметры одиночной вызванной активности моторных синапсов мыши......................................................................52
1.1 Влияние ВАРТА-АМ на параметры одиночной активности синапсов........52
1.2 Влияние EGTA-AM на параметры одиночной активности синапсов...........56
2. Влияние ВАРТА-АМ и EGTA-AM на параметры ритмической активности моторных синапсов мыши..........................................................................................60
2.1. Частотозависимое изменение параметров ритмической активности..........60
2.2 Частотозависимое влияние ВАРТА-АМ на параметры ритмической активности.................................................................................................................63
2.3 Дозозависимое влияние ВАРТА-АМ на параметры ритмической активности.................................................................................................................67
3. Влияние S(-) BAY К 8644 на параметры вызванной активности синапсов при нагрузке ВАРТА-АМ и EGTA-AM............................................................................75
3.1 Влияние S(-) BAY К 8644 на параметры одиночной активности синапсов при нагрузке ВАРТА-АМ и EGTA-AM.................................................................75
3.2 Влияние S(-) BAY К 8644 на параметры ритмической активности на фоне ВАРТА-АМ и EGTA-AM........................................................................................78
4.1 Влияние кофеина на параметры вызванной активности синапсов при нагрузке ВАРТА-АМ и EGTA-AM.........................................................................86
4.1.1 Влияние кофеина на параметры одиночной активности синапсов при нагрузке ВАРТА-АМ и EGTA-AM.....................................................................86
4.1.2 Влияние кофеина на параметры ритмической активности синапсов при нагрузке ВАРТА-АМ и EGTA-AM.....................................................................91
4.2 Влияние рианодина на параметры вызванной активности синапсов при нагрузке ВАРТА-АМ и EGTA-AM.........................................................................97
4.2.1 Влияние рианодина на параметры одиночной активности синапсов при нагрузке ВАРТА-АМ и EGTA-AM.....................................................................97
4.2.2 Влияние рианодина на параметры ритмической активности синапсов
при нагрузке ВАРТА-АМ и EGTA-AM............................................................100
5. Влияние ВАРТА-АМ и EGTA-AM на параметры..............................................107
спонтанной активности синапса...............................................................................107
6. Влияние кофеина и рианодина на параметры спонтанной активности синапса при нагрузке ВАРТА-АМ и EGTA-AM...................................................................112
6.1. Влияние кофеина и рианодина на параметры спонтанной активности синапса.....................................................................................................................112
7.1 Влияние везамикола и бафиломицина Al на параметры спонтанной активности...............................................................................................................125
7.1.1 Влияние везамикола на параметры спонтанной активности................125
7.1.2 Влияние бафиломицина Al на параметры спонтанной активности ....127
7.2 Влияние везамикола и бафиломицина Al на параметры спонтанной активности синапса при действии рианодина.....................................................130
8. Влияние блокаторов Са -зависимых ферментов на параметры спонтанной активности синапса при действии рианодина.........................................................134
8.1 Влияние кальмидазола (R2457 ) на параметры спонтанной активности синапса при действии рианодина.........................................................................134
8.2 Влияние KN-93 на параметры спонтанной активности синапса при действии рианодина...............................................................................................137
ЗАКЛЮЧЕНИЕ..............................................................................................................142
ВЫВОДЫ........................................................................................................................144
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ......................................................145
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВАРТА - l,2-bis-(o-2-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid
EGTA - ethylene glycol-bis(B-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid
IP3 - инозитол-1,4,5-трифосфат
AX - ацетилхолин
ДМСО - диметилсульфоксид
КС - квантовый состав
МП - мембранный потенциал
МПКП - миниатюрный потенциал концевой пластинки
ПД - потенциал действия
ПКП - потенциал концевой пластинки
РиР - рианодиновый рецептор
СаМКИ - кальмодулин-зависимая протеинкиназа II типа цАМФ - циклический аденозинмонофосфат
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы.
Роль кальция как регулятора синаптической передачи в химических синапсах находится в центре внимания современной физиологии (Neher, 2008; Kyoung et al., 2011). Кальций может одновременно поступать в терминаль из разных вне- и внутриклеточных источников во время активности синапса. Параметры возникающих при этом внутриклеточных Са -сигналов (т.н. Са -доменов)
-у i
находятся под контролем специальных молекул - Са -буферов (Schneggenburger,
Neher, 2005; Nigli, Shirokova, 2007). В нервных терминалях описаны эндогенные
Са2+-связывающие белки, различающиеся Са2+-емкостью, афинностью, скоростью
связывания и высвобождения ионов кальция (Schwaller, 2010). Их роль
заключается в пространственно-временном разграничении Са2+-доменов,
обеспечении их избирательного действия на множество мишеней. В первую
очередь это касается прицельного воздействия различных Са2+-доменов на Са2+-
сенсоры экзоцитоза везикул, Са2+-зависимые канальные и ферментные системы,
вовлеченные в регуляцию секреции медиатора (Urbano et al., 2001; Rozov et
al.,2001; Blatow et al., 2003; D'Angelo et al., 2005; Muller et al., 2007a; Eggermann et
al,. 2012). Реальный спектр функциональных возможностей Са2+-буферов как
регуляторов Са2+-сигналов и секреции медиатора остается малоизученным. В связи
с этим, в последние годы широко используется нагрузка терминалей синапсов
экзогенными Са -буферами. Наиболее известны ВАРТА (бис-(о-
аминофенокси)этан-МДт,№,]\т'-тетра-ацетиловая кислота) и EGTA (этиленгликоль
бис-(бета-аминоэтиловый эфир)-К,Ы,1чР,]Ч'-тетраацетиловой кислоты),
представляющие собой органические полианионные молекулы, имитирующие
работу эндогенных быстрых и медленных Са2+-связывающих буферных белков
(Tsien, 1980; Bortolozzi et al., 2008). Оба буфера, имея одинаковую емкость и
высокое сродство к кальцию, различаются по скорости связывания кальция. Так,
ВАРТА, т.н. «быстрый» Са -буфер, обладает в 100 раз более быстрой, чем EGTA,
кинетикой связывания кальция (Rozov et al., 2001). Соответственно, ВАРТА
преимущественно редуцирует быстрые локальные подъемы уровня Са2+, т.н. «Са2+-
нанодомены», влиящие на экзоцитоз везикул, расположенных в десятках
нанометров от источника Са. EGTA же, как более медленный буфер, эффективен в
6
редукции «Са2+-микродоменов», действующих на везикулы с больших расстояний -порядка долей микрона (Neher, 1998а; Augustine et al., 2003). В последние годы, в исследованиях центральных синапсов ВАРТА и EGTA успешно используются как инструмент для выяснения зависимости механизмов выброса медиатора от Са2+-сигналов разного типа и генеза (Blatow et al., 2003; Felmy et al., 2003; Scott, 2007).
Такого рода исследования на нервно-мышечных синапсах мыши до сих пор малочисленны и противоречивы (Kijima, Tanabe, 1988; Robitaille et al., 1993; Зефиров, Мухамедьяров, 2004). Остается не ясным, какой тип Са -сигналов формируется и регулирует секрецию АХ при входе Са2+ по Са2+-каналам P/Q-типа, L-типа, каналам рианодиновых рецепторов (РиР), а также в какой мере Са2+-буферы способны модифицировать эти Са2+-сигналы и вносить тем самым свой вклад в регуляцию секреции медиатора. Изучению этих актуальных вопросов и была посвящена данная работа.
Цель и задачи работы.
Целью работы было исследовать способность быстрого и медленного экзогенных
Са2+-буферов (ВАРТА и EGTA, соответственно) избирательно модифицировать процесс секреции АХ в нервно-мышечных синапсах мыши при вовлечении в работу различных пресинаптических Са2+-входов. В связи с поставленной целью, в работе решались следующие конкретные задачи:
1) Охарактеризовать дозо-зависимость действия быстрого и медленного Са2+-буферов ВАРТА и EGTA (1-100 мкМ) на параметры вызванного выброса АХ, регистрируемого в виде потенциалов концевой пластинки (ПКП)) при одиночной и ритмической активности синапсов и входе кальция в терминали по потенциал-зависимым Са2+-каналам P/Q-типа;
2) Исследовать способность ВАРТА и EGTA влиять на изменения квантового состава (КС) ПКП, вызываемые входом кальция по пресинаптическим потенциал-зависимым Са - каналам L-типа, расторможенным с помощью S(-) BAY К 8466;
3) Сопоставить способность ВАРТА и EGTA избирательно модифицировать изменения КС ПКП, вызываемые усилением выброса кальция из Са -депо терминалей под действием активаторов рианодиновых рецепторов (РиР) - кофеина и рианодина;
4) Исследовать феномен увеличения амплитуды миниатюрных потенциалов концевой пластинки (МПКП) под действием кофеина и рианодина,
94-
понять роль ВАРТА, ЕвТА и определенных Са -зависимых ферментов в этом процессе.
Положения, выносимые на защиту.
1) В исследованном диапазоне концентраций (10-100 мкМ) EGTA более эффективно, чем ВАРТА, подавляет акты одиночных выбросов медиатора. ВАРТА проявляет аналогичную активность только при сниженном уровне кальция в наружной среде.
2) ВАРТА избирательно и дозо-зависимо предотвращает начальное облегчение передачи в ритмических залпах ПКП с частотой 20-50 Гц, а также -возрастание облегчения при выбросе депонированного кальция под действием кофеина.
3) Возрастание амплитуды МПКП под действием рианодина и кофеина сопряжено с Са2+-зависимым увеличением размера кванта медиатора, происходит с участием СаМКП и избирательно редуцируется с помощью EGTA, но не ВАРТА.
Научная новизна полученных результатов
Установлен ранее не известный факт, что EGTA избирательно и эффективно подавляет акты одиночного вызванного выброса медиатора АХ. Впервые показано, что Са2+-зависимый процесс начального облегчения при ритмической работе синапсов избирательно чувствителен к действию быстрого буфера ВАРТА. Выявлена ранее не известная способность EGTA разобщать сопряжение между входящим по L-типу Са -каналов кальцием и активацией РиР, приводящей к выбросу депонированного кальция и усилению секреции медиатора. Именно это сопряжение - основная причина потенцирования передачи при активации Са2+-каналов L-типа. Впервые получены данные о способности агонистов РиР (кофеина
9+
и рианодина) вызывать Са -зависимое увеличение размера кванта АХ, сопряженное с активацией СаМКП. Впервые показана способность EGTA, но не ВАРТА, полностью предотвращать этот Са2+-зависимый прирост размера кванта АХ.
Научно-практическая значимость работы
Анализ пресинаптических эффектов ВАРТА и ЕвТА позволил получить научно значимую информацию о характере Са -сигналов, формируемых при работе разных
Са2+ -входов в терминали, и специфическом участии этих Са -сигналов в регуляции разных режимов секреции АХ. Показан индивидуальный вклад в вызванную секрецию квантов АХ разных типов Са2+-доменов -узколокальных Са2+-нанодоменов (редуцируемых только с помощью ВАРТА),
'у |
более диффузных Са -макродоменов (редуцируемых с помощью ЕСТА) и тонического подъема уровня Са2+ (равноэффективно редуцируемого с помощью ВАРТА и ЕвТА).
Научный интерес представляет впервые обнаруженный факт регуляции размера кванта медиатора кальцием, выбрасываемым из Са2+-депо, с участием Са2+- зависимого фермента СаМКП.
Полученные данные могут быть использованы и в прикладном аспекте, например, при разработке путей фармакологической коррекции синаптической передачи в моторных синапсах с помощью специфических кальциевых буферных систем, или их ингибиторов.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В настоящее время очевидно, что кальций, как универсальный внутриклеточный посредник, осуществляет свои многочисленные функции в клетке путем формирования в цитоплазме разнообразных Са2+-сигналов со строго индивидульным пространственно-временным паттерном (Berridge, 2006; Parekh, 2008). Эндогенные Са2+-буферы - внутриклеточные белки с разным сродством и кинетикой связывания кальция, позволяют «настраивать» Са2+-сигналы, создавая кратковременные «Са2+-облака» с определенной формой, амплитудой и временным ходом, получившие название «кальциевых транзиентов» (Neher, 1998b; Augustin et al., 2003; Parekh, 2008; Parekh, 2011). Свойства и роль Са2+-буферов в Са2+-сигнализации нервных терминалей синапсов - актуальный и широко обсуждаемый в современной литературе вопрос (Zucker, 2001; Matveev et al., 2004; Gilmanov et al., 2008; Egger, Stroh, 2009; Eggermann, Jonas, 2011; He, Lnenicka, 2011). В нашем обзоре будут рассмотрены данные о локальных и генерализованных Ca -сигналах, встречающихся в терминалях, охарактеризованы эндогенные и экзогенные Са2+-буферы, их роль в формировании Са2+-сигналов нервных терминалей и их способность, модулируя Са2+-сигналы, принимать участие в регуляции секреции медиатора в синапсах.
1. Са2+сигналы в нейронах и нервных терминалях 1.1 «Са2+-нанодомен» и «Са2+-микродомен».
Основным критерием в классификации Са2+-сигналов считается характер их
латерального распространения (латеральной диффузии) из места их возникновения,
каковым является внутреннее устье открытого Са2+-канала. Термин «Са2+-
нанодомен» - по классификации, сформулированной первоначально в работах
Neher, Augustine и соавторов (Neher 1998а; Augustine et al., 2003) и ставшей
общепринятой (Gentile, Stanley, 2005; Schneggenburger Neher, 2005) предполагает
узколокальный подъем уровня кальция в устьи одиночного открытого Са2+-канала,
который охватывает всего десятки нанометров от канальной поры. В этом
пространстве «кальциевой полусферы», имеющей 10-20 нм в диаметре вокруг
устья Са2+-канала - возникшая высокая (порядка 100-400 мкМ) концентрация Са2+
близка к равновесной, но остается таковой всего в течение микросекунд, т.е. во
время открытого состояния Са2+-канала. В отдалении от этого Са2+-домена, на
10
расстоянии порядка 1 мкм от Ca -канала [Ca ]in резко спадает до 1 мкМ (Oheim et al., 2006). Согласно модельным расчетам, для быстро активирующихся потенциалзависимых Са2+-каналов P/Q- или N-типа время нарастания концентрации кальция в Са2+-домене составляет не более 0.1-0.15 мкс, спад - 0,4 мкс, а общее время существования такого Са2+ домена составляет менее 0,1 мс (Müller et al., 2007а).
Изменить профиль такого Са2+-нанодомена, т.е. еще более сузить и ограничить
94-
его способен лишь очень быстрый Ca -буфер, имеющий константу связывания
9+ 9-1-
ионов Ca , сопоставимую со скоростями формирования Ca -нанодомена в микросекундном диапазоне. К числу таких буферов относится экзогенный Са2+-буфер ВАРТА (Stern, 1992; Neher, 1998b). Сразу после закрытия Са2+-канала Са2+-домен вокруг канала рассас�
-
Скитева, Ольга Игоревна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2012
-
ВАК 03.03.01
- Регуляция активности нервно-мышечных синапсов мыши внутриклеточным депонированным кальцием, мобилизуемым кофеином и рианодином
- Разнонаправленное действие кальция, высвобождаемого из Ca2+-депо, на квантовую секрецию медиатора
- Роль кальция, высвобождаемого из внутриклеточных кальциевых депо, в регуляции выброса медиатора в моторных синапсах мыши
- Механизмы Ca2+-зависимого подавления секреции медиатора в новообразованных нервно-мышечных синапсах мыши
- Факторы, определяющие динамику вызванной секреции медиатора в ходе длительной высокочастотной активности нервно-мышечного синапса лягушки
