Роль кальция, высвобождаемого из внутриклеточных кальциевых депо, в регуляции выброса медиатора в моторных синапсах мыши

Букия, Анна Нодаровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль кальция, высвобождаемого из внутриклеточных кальциевых депо, в регуляции выброса медиатора в моторных синапсах мыши
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль кальция, высвобождаемого из внутриклеточных кальциевых депо, в регуляции выброса медиатора в моторных синапсах мыши"

На правах рукописи

Букия Анна Нодаровна

РОЛЬ КАЛЬЦИЯ, ВЫСВОБОЖДАЕМОГО ИЗ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ КАЛЬЦИЕВЫХ ДЕПО, В РЕГУЛЯЦИИ ВЫБРОСА МЕДИАТОРА В МОТОРНЫХ СИНАПСАХ МЫШИ

специальность 03.00.13 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им.М.В .Ломоносова (заведующий - академик РАМН И.ПАшмарин)

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук,

профессор Балезина О.П.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук Пивоваров А.С.

доктор биологических наук Сторожевых Т.П.

Ведущая организация - Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН (гПущино)

Защита диссертации состоится декабря 2004 года в 1530 часов на заседании

диссертационного ученого совета Д.501.001.93 биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, д.1, корп.12, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ. Автореферат разослан 13 ноября 2004 г.

доктор биологических наук

диссертационного совета,

Ученый секретарь

БА.Умарова

9WS94

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время в физиологии синапсов большой интерес вызывают исследования внутриклеточных кальциевых депо и выбрасываемого из них кальция как регуляторов процессов секреции медиатора (Berridge, 1997; Brain, Bennet, 1997; Балезина, 2002). В ряде центральных и периферических синапсов, в том числе - в моторных синапсах мыши - описаны цистерны гладкого эндоплазматического ретикулума, в мембрану которых встроены Са2+-активируемые кальциевые каналы - рианодиновые рецепторы (РиР) (Kashapova et al., 1991; Llinas et al., 1992; Pozzan et al., 1994). Показано, что открывание РиР под действием входящего в терминаль кальция, либо агонистов РиР (рианодина, кофеина) приводит к выбросу кальция из Са2+-депо в аксоплазму терминали и кратковременному повышению уровня [Са2+]вн (Parducz et al., 1987; Kawai, Watanabe, 1989; Konnerth et al., 1992; Sitsapesan et al., 1995; Peng, 1996; Narita et al., 2000). Это, в свою очередь, может отражаться на режиме спонтанной и вызванной секреции квантов медиатора (Nishimura et al., 1990; Narita et al., 2000; Galante, Marty, 2003). В настоящее время спектр регуляторных воздействий, осуществляемых внутриклеточно высвобождаемым кальцием в отношении каналов и рецепторов наружной мембраны терминали, а также режимов спонтанной и вызванной секреции квантов медиатора, остается малоизученным.

Известно, что спонтанная секреция отдельных квантов медиатора относительно независима от поступления кальция из наружной среды и более чувствительна к кальцию, выбрасываемому из внутриклеточных источников (Losavio, Muchnik, 1997). Вместе с тем, сведения о корреляции частоты спонтанной секреции квантов, размеров кванта и других параметров спонтанной секреции с модуляцией активности РиР и наполненностью -депо кальцием носят фрагментарный характер (Балезина, 2002).

Еще менее изучена связь вызванной многоквантовой секреции медиатора с Са2+-активируемым выбросом депонированного кальция в условиях одиночной и ритмической залповой активности синапсов. Известно, что в моторных синапсах мыши имеют место характерные изменения уровня выброса медиатора на разных фазах ритмического залпа импульсов. Сначала наблюдается кратковременное

облегчение передачи

процессом

депрессии передачи (постепенного снижения секреции медиатора) с последующей стабилизацией уровня выброса медиатора на сниженном уровне (т. н. фаза «плато» в ритмическом залпе) (Silinsky, 1985; Zucker, Regehr, 2002). Показано, что большинство этих изменений зависят от колебаний уровня внутритерминального кальция (Silinsky, 1985; Zucker, Regehr, 2002; Балезина, 2002). Какой вклад в регуляцию процессов ранней фасилятации, последующей кратковременной депрессии передачи и в процесс стабилизации выброса медиатора на фазе «плато» осуществляет кальций, высвобождаемый из внутритерминальных Са2+-депо, остается не изученным. Рассмотрение перечисленных вопросов представляется актуальным как для фундаментальной синаптологии, так и для патофизиологии синапсов и поисков новых путей фармакологической коррекции синаптической передачи.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было исследовать роль втгутриклеточно высвобождаемого кальция в регуляции режимов спонтанной и вызванной секреции квантов медиатора ацетилхолина (АХ) в моторных синапсах диафрагмы мыши в условиях облегчения, либо подавления активности пресинаптических РиР и рианодин-чувствительных Са2+-депо терминалей.

В работе решались следующие конкретные задачи.

1. Провести анализ частоты и других параметров спонтанных миниатюрных потенциалов концевой пластинки (МПКП) диафрагмы мыши на фоне действия блокаторов пресинаптических РиР- дантролена (10-100 мкМ) и рианодина (в высоких - 10-100 мкМ - концентрациях), а также избирательных активаторов (агонистов) РиР - кофеина (5 мМ) и рианодина (в низких субмикромолярных концентрациях).

2. Описать изменения токов концевой пластинки (ТКП) в условиях одиночного и ритмического раздражения нерва, выявить частото-зависимые изменения начальной фасилятации, депрессии передачи и уровня ТКП на фазе «плато» по ходу ритмического залпа на фоне усиления, либо торможения выброса депонированного кальция под действием рианодина и дантролена.

3. Исследовать изменения режима спонтанных МПКП и вызванных ТКП на фоне блокады тапсигарджином Са-АТФазы Са2 -депо терминален, приводящей к утечке депонированного Са2+ в аксоплазму и опустошению пресинаптических Са2+-депо.

4. Изучить изменения ТКП в условиях забуферивания колебаний [Са2+]вн быстрым Са2+ буфером ВАРТА. Исследовать, как меняется способность рианодина, стимулирующего выброс депонированного кальция, облегчать ритмическую активность синапсов на фоне ВАРТА.

Новизна полученных результатов. В работе получен ряд новых фактов, касающихся участия кальция, выбрасываемого из внутриклеточных депо, в регуляции спонтанной и вызванной секреции квантов АХ. Впервые установлено, что блокада пресинаптических РиР рианодином (10-100 мкМ) вызывает дозозависимое подавление частоты следования МПКП, а также квантового состава одиночных ТКП в моторных синапсах диафрагмы мыши.

Обнаружена ранее неизвестная способность кальция, выбрасываемого из Са2+-депо под действием рианодина (0,5 мкМ), вызывать двунаправленные изменения секреции квантов медиатора в ходе ритмической активности синапсов: при низких (порядка 4 Гц) частотах рианодин подавляет, а при высоких - 70-100 Гц -увеличивает вызванный выброс АХ на фазе "плато". Впервые установлено, что тормозный эффект рианодина обусловлен активацией Са2+-зависимых К+-каналов под действием внутриклеточно высвобождаемого кальция.

Новыми являются и данные, демонстрирующие участие L-типа Са2+-каналов (растормаживаемых под действием внутриклеточного буфера ВАРТА) в активации РиР и опосредовании облегчающих эффектов рианодина (как агониста РиР) в отношении вызванного выброса медиатора в моторных синапсах мыши.

В работе выявлены ранее неизвестные факты, демонстрирующие связь между опустошением Са2+-депо терминалей и активацией каналов наружной мембраны, проводящих ионы кальция в аксоплазму из наружной среды.

• Положения, выносимые на защиту.

1. В интактных моторныхтерминалях мыши частота спонтанной секреции на 20-50% зависит от выброса внутриклеточно депонированного кальция из рианодин-чувствительных Са^-депо терминалей.

2. В условиях ритмической залповой активности моторных синапсов частично кураризированного нервно-мышечного препарата начальная фасилятация, депрессия и стабилизация передачи на фазе "плато" регулируются частота-зависимым образом со стороны кальция, выбрасываемого из рианодин-чувствительных Са2+-депо терминалей.

3. Усиленный рианодином выброс депонированного кальция в ритмически активных терминалах может вызывать разнонаправленные воздействия на секрецию АХ: при низких частотах (4 Гц) - уменьшать квантовый состав ТКП на фазе "плато" за счет активации апамин-чувствительных Са2+-зависимых К+-каналов терминали, а при высоких частотах (70-100 Гц) - увеличивать квантовый состав ТКП на фазе "плато".

Научно-практическая ценность работы. Полученные в работе данные расширяют современные представления о роли рианодин-чувствительных Са2+-депо нервных терминалей в регуляции секреции квантов медиатора в периферических моторных синапсах млекопитающих. В результате проведенных исследований получены новые важные сведения о вовлечении РиР и внутриклеточно высвобождаемого кальция в регуляцию как спонтанной, так и вызванной квантовой секреции медиатора АХ. Впервые в условиях ритмической активности синапсов показана способность внутриклеточно высвобождаемого кальция вызывать не только облегчающее, но и тормозное действие на секрецию АХ путем вовлечения в активность Са2+-зависмых К+-каналов наружной мембраны. Этот факт позволяет говорить о наличии в терминалях моторных синапсов мыши функционального сопряжения между Са2+-зависимыми каналами наружной мембраны, РиР Са2+-депо и процессами Са2+-зависимой секреции АХ. Научную ценность представляют описанные особенности участия депонированного кальция в регуляции рисунка залповой активности моторных синапсов: способность частото-зависимым образом контролировать процесс начальной фасилятации, а также уровень выброса АХ на поздних, отставленных стадиях залпа, в особенности - на фазе "плато". Обнаруженная в работе способность избирательных агонистов РиР облегчать и

поддерживать ритмическую синаптическую передачу путем усиления вызванного выброса медиатора имеет ценность не только для фундаментальных знаний о Са2+-зависимой регуляции секреции медиатора, но и для решения прикладных задач:

поиска новых классов фармакологических соединений, способных усиливать ослабленную синаптическую передачу в условиях ее патологии у моторных синапсов млекопитающих.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на Международном симпозиуме «Synaptic transmission-100 years after L.Luciani» (Рим, Италия, 2000), на Международной конференции «Progress in Biotechnology and Neurobiology - Integrative Medicine» (Хургада, Египет, 2004), на XVIII Съезде физиологов России (Казань, Россия, 2001), а также на Международных и Всероссийских конференциях молодых ученых.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано пятнадцать печатных работ, в том числе 4 статьи в российских и зарубежных изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора о роли кальциевых депо и выброса депонированного кальция в регуляции активности центральных и периферических синапсов, описания методов исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения (6 глав), выводов и списка литературы (160 ссылок, в том числе 144 - зарубежные работы). Диссертация содержит 123 страницы печатного текста, в том числе 18 рисунков.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования спонтанной и вызванной синаптической активности была выбрана диафрагмальная мышца мыши (musculus diaphragma). Это - непарная поперечно-полосатая мышца, состоящая из двух симметричных сегментов (правого и левого). Оба сегмента иннервируются отростками диафрагмального нерва (nervus phrenicus), причем на каждое волокно в составе диафрагмы приходится один высокоструктурированный синапс. В работе использовали самцов белых лабораторных беспородных мышей весом 20-30 г.

Декапитированное животное помещали на операционный стол и проводили изготовление изолированного нервно-мышечного препарата диафрагмы.

Полученный препарат размещали в экспериментальной камере (объем около 5 мл) с оксигенированным физиологическим раствором Лайли для теплокровных.

Эксперименты выполняли при комнатной температуре (20-22 С). В течение всего эксперимента камеру перфузировали оксигенированным раствором Лайли (скорость перфузии 3-5 мл/мин), в который добавляли исследуемые вещества.

В работе использовали технику, традиционную для регистрации трансмембранных потенциалов и токов. Внутриклеточную регистрацию миниатюрных потенциалов концевой пластинки (МПКП) проводили с помощью стеклянных микроэлектродов, вытянутых из легкоплавкого стекла (Ругех) с диаметром кончика менее 1 мкм, сопротивлением 10-15 МОм, заполненных 2,5 М КС1. Микроэлектродные головки соединяли с усилителем Axoclamp 2В (Ахоп Instruments Inc.)

Контроль попадания в зону синапса осуществляли по крутизне нарастания миниатюрных потенциалов. В дальнейшей обработке использовали МПКП, характеризующиеся временем нарастания менее 1 мс. В ходе опыта осуществляли контроль мембранного потенциала. Если изменения мембранного потенциала в ходе регистрации превышали 5 мВ, записи в дальнейшем анализе не использовали.

Эксперименты проводили по методу набора контрольной и опытной выборок из независимых синапсов. Стандартно регистрировали 100 и более МПКП в каждом синапсе при полосе пропускания усилителя 10-30 кГц. Данные записывали на жесткий диск компьютера при помощи аналогово-цифрового преобразователя (АЦП) DigiLine с интерфейсом Digiscope, обрабатывали с использованием программного обеспечения MiniAnalysis (Synaptosoft, USA) и Microsoft Excel. Анализировали частоту, амплитуду и характеристики временного хода (время нарастания и время полуспада) МПКП.

Регистрацию вызванных токов концевой пластинки (ТКП) проводили с использованием стандартного метода двухэлектродной фиксации потенциалов (потенциал фиксации -70 мВ) на частично кураризированном препарате (0,8 мкМ d-тубокурарина).

Для регистрации одиночных ТКП использовали стимуляцию нерва с частотой 0,3 Гц. Стандартно регистрировали по 100 ТКП в каждом синапсе. Анализировали амплитуду, характеристики временного хода и квантовый состав ТКП

(рассчитываемый как величина, обратная квадрату коэффициента вариации амплитуд ТКП (Воронин, 1982)): m = 1/(CV)2,

где CV - коэффициент вариации, равный

CV = S/A

S - стандартное отклонение, • А - средняя амплитуда ТКП. Для регистрации залповой активности использовали режим ритмической стимуляции диафрагмального нерва частотами 4,7,20,50,70 и 100 Гц. При каждой частоте стимуляции в одном синапсе проводили три записи (по 50 стимулов в залпе) с интервалом не менее 5 минут, которые затем усредняли.

Динамику изменений амплитуд ТКП в ходе ритмической стимуляции нерва описывали, рассчитывая параметры, указанные ниже. Индекс начального облегчения характеризовали отношением амплитуд второго и первого ТКП (ГКЩ/ГКП1). Развитие депрессии оценивали как Кд=1/(амплитуда ЖПрамплитуда ТКПД Уровень амплитуд ТКП в период "плато" выражали в относительных единицах: Ер = nownaii, где - средняя амплитуда последних 20-ти ТКП в залпе

(ТКП30....ТКП50).

Достоверность различий между выборками оценивали по критерию Стьюдента. Использовали уровень значимости отличий между двумя выборками, равный 0,05.

В экспериментах применяли следующие фармакологические препараты производства «Sigma» (США): тапсигарджин, верапамил, апамин, d-тубокураринхлорид, АМ-ВАРТА (ацетометоксилированпая 1,2-бис(2-аминофенокси)этан- -тетраацетиловая кислота), кофеин,

диметилсульфоксид (ДМСО), рианодин, дантролен.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1 ВЛИЯНИЕ БГОКАТОРОВ РИАНОДИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ НА СЕКРЕЦИЮ

КВАНТОВ МЕДИАТОРА 1. Влияние рианодина на спонтанную секрецию АХ. В первой серии мы

исследовали пресинаптическое действие рианодина в высоких концентрациях, блокирующих РиР и предотвращающих выброс кальция из рианодин-чувствительных кальциевых депо нервных терминалей. Мы установили, что рианодин - в диапазоне концентраций 10-100 мкМ - вызывает дозозависимое

уменьшение частоты следования МПКП в 2-5 раз (п=10) и не влияет на амплитудно-временные характеристики МПКП (рис. 1). Уменьшение средней частоты следования МПКП под действием рианодина является показателем его пресинаптического действия. Известно, что в разных типах клеток, включая нейроны и нервные терминали синапсов, имеют место спонтанные локальные выбросы кальция через РиР - т.н. «спарки» (Benidge, 1997). При этом показано, что рианодин, блокируя РиР, способен уменьшать частоту возникновения спонтанных спарков в гладкомышечных клетках и нейронах (Nelson, 1995). Возможно, что и в случае моторных нервных терминалей мыши обнаруженное снижение частоты МПКП под действием рианодина объясняется аналогичной причиной.

2. Влияние рианодина на акты вызванного одиночного высвобождения АХ. Во

второй серии экспериментов была исследована способность рианодина (как блокатора РиР) оказывать влияние на акты вызванного (электрическим раздражением нерва) выброса АХ из нервных терминалей. Мы установили, что рианодин в концентрациях 10-100 мкМ вызывает дозозависимое уменьшение квантового состава одиночных ТКП в 2-5 раз. При этом средняя амплитуда одиночных ТКП на фоне рианодина (100 мкМ) снижается от 7,30±1,20 нА в контроле до 1,12±0,06 нА в опыте, то есть на 85% (п=15; р<0,01). Полученные результаты позволяют предположить, что выброс депонированного кальция важен для реализации как спонтанной активности, так и актов одиночного вызванного выброса АХ в моторных терминалях диафрагмы мыши.

В следующей серии были исследованы изменения вызванного выброса АХ при ритмической активности моторных синапсов в условиях блокады пресинаптических РиР моторных нервных терминалей.

П. ВЛИЯНИЕ БЛОКАТОРОВ РИАНОДИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ - ДАНТРОЛЕНА

И РИАНОДИНАНАРИСУНКИ РИТМИЧЕСКОЙАКТИВНОСТИ СИНАПСОВ 1. Анализ рисунков ритмической активности кураризированного препарата. В

следующей серии экспериментов были определены характерные изменения амплитуд ТКП по ходу ритмических залпов при разных частотах залповой активности (от 7 до 100 Гц). Анализ последовательных изменений ТКП по ходу залпа при указанных частотах стимуляции позволил установить, что в начале залпа имеет место прирост амплитуды ТКП или - начальная фасилятация (облегчение) передачи, сменяющаяся снижением ТКП - то есть депрессией передачи и затем -выходом амплитуд ТКП на стабильный, но сниженный уровень - фазу «плато» (общее число исследованных синапсов, п=110) (рис. 2). Дальнейший анализ параметров залпа показал, что все они демонстрируют индивидуальный характер частсто-зависимости. Так, степень начальной фасилятации возрастает с увеличением частоты стимуляции нерва, тогда как уровень ТКП на фазе "плато" снижается по мере увеличения частоты следования импульсов.

Порядковый номер ТКП в залпе контроль ■ дантролен —йг—рианодин ЮмкМ

Рис. 2..Изменения рисунка залповой активности при частоте стимуляции нерва 7 Гц под действием блокаторов РиР - рианодина (п= 15) и дантролена (п=5).

Представляло интерес исследование изменений параметров ритмического залпа ТКП на фоне блокады выброса депонированного кальция через пресинаптические РиР.

2. Влияние (¡локаторов РиР на рисунки залповой активности синапсов. В ходе данной серии экспериментов были использованы фармакологические блокаторы РиР - дантролен (50 мкМ) и рианодин (10 мкМ). Оказалось, что блокада РиР как дантроленом, так и рианодином, вызывает сходные изменения в рисунке залповой активности - подавление начальной фасилятации (при больших межимпульсных интервалах порядка 70-150 мс), усиление депрессии передачи, а также снижение уровня ТКП на фазе «плато» в среднем в 2-3 раза во всем исследованном диапазоне частот. На рис. 2 показан пример изменений амплитуд ТКП по ходу залпа при частоте разряда 7 Гц в контроле и на фоне блокады РиР.

Обнаруженное нами в моторных синапсах мыши отсутствие чувствительности процесса фасилятации к блоку РиР и выбросу депонированного Са2+ при коротких межимпульсных интервалах - порядка 20-50 мс - описано и другими авторами в центральных и периферических синапсах (Castonguay, Robitaille, 2001; Балезина, 2002). Что касается фазы «плато», то в настоящее время процессы, определяющие амплитуду ТКП на фазе "плато" по ходу залпов малоизучены, в том числе, - и их зависимость от разных источников поступления кальция в аксоплазму терминали. Между тем, уровень вызванного выброса АХ именно на фазе "плато" является одним из основных рабочих режимов в моторных синапсах млекопитающих (Персон, 1985; Moyer, van Lunteren, 1999). Поэтому в нашей дальнейшей работе были подробно исследованы изменения амплитуды ТКП на фазе «плато» в залпе в зависимости от частоты залпового разряда и фармакологических воздействий, приводящих к блокаде, либо активации высвобождения кальция из рианодин-чувствительных Са2+-депо.

III. ИЗМЕНЕНИЯ АМПЛИТУДЫ ТКП НА ФАЗЕ "ПЛАТО" В УСЛОВИЯХ БЛОКАДЫ РИАНОДИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ 1. Частото-зависимые изменения уровня амплитуд ТКП на фазе "плато" у кураризированного препарата. На рис. 3 показано, как изменяется уровень амплитуд ТКП на фазе «плато» по ходу залпа при разных частотах стимуляции

нерва. В контроле с увеличением частоты стимуляции нерва уровень амплитуд ТКП на фазе «плато» закономерно уменьшается. Принято считать, что этот факт является отражением процесса "вычерпывания", истощения пула везикул с медиатором, непосредственно готовых к высвобождению (Zucker, Regehr, 2002).

0 20 40 60 80 100

Частота стимуляции, Гц

Рис. 3. Изменения уровня амплитуд ТКП на фазе «плато» под действием блокаторов и активаторов РиР. Каждая точка - результат усреднения значений, полученных при регистрации активности не менее 7 синапсов (* - р<0,05).

2. Изменения уровня амплитуд ТКП на фазе "плато" под действием блокаторов РиР - дантролена и рианодина. Мы установили, что при аппликации на нервно-мышечный препарат блокаторов РиР - дантролена (50 мкМ) и рианодина (10 мкМ) уровень «плато» резко снижается уже при низких частотах ритмической активности (4, 7 и 20 Гц) (рис. 3). Это означает, что механизмы поддержания секреции медиатора на фазе «плато» во всем диапазоне исследованных частот зависимы от выброса кальция из внутритерминальных Са2+-депо, но наиболее чувствительной к выбросам депонированного кальция оказалась секреция медиатора именно при низкочастотных разрядах.

3. Изменения уровня амплитуд ТКП на фазе "плато" под действием активатора РиР - рианодина. Мы установили, что рианодин в низкой концентрации - 0,5 мкМ (облегчающей высвобождение кальция из депо через РиР) не оказывает воздействий на степень начальной фасилятации, но достоверно увеличивает уровень ТКП на фазе «плато» (рис. 3). Однако такое облегчающее действие рианодина (как стимулятора

выброса депонированного кальция) имело место только на высоких частотах залповых разрядов - 70 и 100 Гц.

На рис. 3 видно, что при низких частотах стимуляции (порядка 4 Гц) проявляется противоположный эффект - уровень «плато» снижается под действием рианодина, несмотря на то, что высвобождение кальция из депо усилено.

Мы предположили, что неожиданный тормозный эффект рианодина связан со способностью кальция, высвобождаемого из депо, активировать низкопроводящие кальций-зависимые калиевые каналы, которые описаны в составе наружной мембраны терминалей в моторных синапсах мыши (Flink, Atchison, 2003). Для проверки участия К+-каналов в реализации тормозного действия рианодина на амплитуду ТКП на фазе «плато» (при частоте залповых разрядов 4 Гц) в следующей серии экспериментов были исследованы эффекты специфического блокатора низкопроводящих К+са-каналов - апамина (0,5 мкМ).

4. Влияние рианодина на уровень ТКП фазы "плато" на фоне блокады низкопроволяших К+СЬ-каналов. Мы установили, что в норме апамин (0,5 мкМ) не оказывает влияний на рисунок залповой активности синапсов при частоте стимуляции 4 Гц (п=10). Однако апамин полностью предотвращал тормозное действие рианодина на амплитуду ТКП на фазе «плато» в залпе (рис. 4).

Рис. 4. Рисунок залповой активности синапсов при частоте стимуляции нерва 4 Гц под действием аиамина (п=10), рианодина (п=10) и рианодина на фоне апамина (п=10).

контроль

апамин+рианодин

16 Номер ТКП в залпе

В настоящее время роль и функции апамин-чувствительных К+са-каналов мало изучены. В моторных терминалях ящерицы их активность и вызываемая ими следовая гиперполяризация (сопровождающая пресинаптические потенциалы действия) усиливается кофеином, что позволяет предполагать участие РиР и депонированного кальция в модуляции работы К+са-каналов (Morita, Barret, 1990). В моторных терминалях мыши точные места локализации апамин-чувствительных К+-каналов пока не установлены. Судя по неспособности апамина влиять на частоту МПКП в покое и квантовый состав ТКП при ритмической активности терминали, эти каналы, скорее всего, удалены от Са2+-каналов активной зоны и мало зависимы от кальция, поступающего в терминаль по потенциалактивируемым Са2+-каналам (P/Q-типа). Однако, К+са-каналы могут, по-видимому, прицельно, избирательно активироваться кальцием, выбрасываемым через РиР из расположенных поблизости цистерн гладкого эндоплазматического ретикулума (кальциевых депо). Это, в свою очередь (через гиперполяризацию наружной мембраны) может снижать вход потенциалзависимых Са2+-токов и, в конечном счете, тормозить Са2+-зависимую секрецию медиагора. В пользу существования такой системы отрицательной обратной связи свидетельствуют данные Schwartz и соавторов. Показано, что под действием кофеина, активирующего РиР (и блоке аденозиновых рецепторов терминали) наблюдается не облегчение, а уменьшение вызванного выброса и амплитуды потенциалов концевой пластинки в ходе залповой активности моторных синапсов диафрагмы крысы (Schwartz et al., 1999).

Таким образом, нам впервые удалось показать, что в моторных синапсах диафрагмы мыши стимуляция выброса депонированного кальция через РиР может не только облегчать секрецию медиатора в ходе залповой активности, но и - при определенных условиях - тормозить её через прицельную активацию работы низкопроводящих апамин-чувствительных К+Са-каналов наружной мембраны терминалей.

III. ДЕЙСТВИЕ БЛОКАТОРА ВАКУОЛЯРНОЙ Са2+-АТФазы

ТАПСИГАРДЖИНА НА СЕКРЕЦИЮ АХ В МОТОРНЫХ ТЕРМИНАЛЯХ

В следующей серии экспериментов был использован подход, широко применяемый в современной экспериментальной практике для тестирования участия кальциевых депо и высвобождаемого из них кальция в регуляции активности

нервных клеток, а именно - блокада Са^-АТФазы эндоплазматического ретикулума С этой целью был использован тапсигарджин - высокоизбирательный необратимый блокатор вакуолярной Са^-АТФазы. Показано, что тапсигарджин приводит к пассивной утечке кальция из депо и их опустошению (Гакешига е£ а1., 1989), в том числе - в терминалях синапсов гиппокампа (Бшраер е1 а1., 2002), а также в моторных нервных терминалях лягушки (СаЯтпиау, КоЬйаШе, 2001).

1. Эффекты тапсигарлжина на спонтанную секрецию и акты одиночного вызванного выброса АХ. Мы установили, что под действием тапсигарджина в течение 40-50 минут происходит увеличение квантового состава одиночных ТКП в 3-5 раз (п=9), а также увеличение средней частоты МПКП в 3-10 раз (п=6). При этом динамика прироста квантового состава ТКП и частоты МПКП на фоне тапсигарджина носит не монотонный, а двухфазный характер. Первая достоверная волна увеличения квантового состава ТКП и частоты МПКП наблюдается через 1020 минут после начала действия тапсигарджина, вторая - на 30-40-ой минуте (рис.5). Вслед за периодом двухфазного увеличения частоты МПКП и квантового состава ТКП наблюдается уменьшение указанных параметров, которые к 50-60-ой минуте действия тапсигарджина составляют лишь 30-50% от контрольного уровня.

Известно, что частота следования МПКП является высокочувствительным индикатором изменений концентрации внутриклеточного кальция (ВеЬ, Ап^евоп, 2001; Савйэщиау, КоЬйаШе, 2001). Поэтому мы предположили, что обнаруженный нами первоначальный прирост частоты МПКП под действием тапсигарджина отражает кратковременное повышение [Са2+]>н в терминали в результате выхода (а точнее - неконтролируемой утечки) кальция в аксоплазму терминалей из кальциевых депо в условиях блокады Са2+-АТФазы. Оставалась неясной природа второй волны увеличения частоты МПКП на фоне тапсигарджина. Для исследования этого вопроса мы сопоставили динамику изменений частоты МПКП под действием тапсигарджина с влияниями на частоту МПКП известного стимулятора высвобождения кальция из депо через рианодиновые рецепторы - кофеина (5 мМ).

2. Влияние кофеина на частоту следования МПКП. Мы установили, что кофеин приводит к сопоставимому с тапсигарджином достоверному увеличению (в среднем в 2-3 раза) частоты МПКП в первые 10-20 минут действия, но без последующей

второй волны прироста частоты МПКП на ЗО-ой - 40-ой минутах инкубации мышцы в реагенте (п=3; р<0,05) (рис. 5).

Поэтому мы предположили, что вторая волна увеличения частоты МПКП под действием тапсигарджина хотя и обусловлена повышением концентрации [Са2+]вн в терминали, но не связана с выходом кальция из депо, которые, по-видимому к этому моменту уже опустошены. Для проверки этого предположения в следующей серии экспериментов проводили аппликацию кофеина (5 мМ) на мышцу на фоне действия тапсигарджина в период развития второй волны прироста частоты МПКП (на 40-ой минуте действия тапсигарджина).

3. Влияние кофеина на частоту МПКП на фоне действия тапсигарджина. Мы

убедились, что при аппликации кофеина на фоне тапсигарджина в период второй волны прироста частоты МПКП (то есть в период 35-40-ой минут от начала действия тапсигарджина) кофеин не вызывает дополнительного увеличения частоты МПКП (п=8) (рис. 5).

Эти данные позволили предположить, что, возможно, вторая волна увеличения частоты МПКП (а также прироста квантового состава ТКП) под действием тапсигарджина связана с поступлением кальция из наружной среды. Действительно, по данным литературы известно, что в ответ на опустошение Са2+-

депо происходит активация особого типа каналов наружной мембраны, так называемых SOC или CRAC каналов (от англ. «Store Operated Channels» - «депо-управляемые каналы») (Parekh, 1991; Savic, Sciancalepore, 1998; Nilius, 2004; Penner, Fleig, 2004). Для проверки возможного участия SOC-каналов наружной мембраны терминалей в реализации второй волны увеличения частоты следования МПКП под действием тапсигарджина мы исследовали действие тапсигарджина на частоту МПКП в бескальциевой среде.

4. Эффекты тапсигарджина на частоту следования МПКП в бескальциевой среде. На рис. 6 видно, что в бескальциевом растворе, содержащем Mg2+ и ЭГТА, частота МПКП резко уменьшается до критических значений (0,01 Гц). Под действием тапсигарджина в этих условиях имеет место только одна волна прироста частоты МПКП, динамика развития которой (20 минут инкубации) соответствует первой волне прироста частоты МПКП под действием тапсигарджина в нормокальциевой среде.

Мд2+- ЭГТА [ тапсигарджин 2 мкМ Время, мин

Рис. 6. Изменения частоты МПКП в бескальциевом растворе под действием тапсигарджина На рисунке представлены результаты двух опытов, в каждом из которых регистрация изменений частоты МПКП на протяжении всего эксперимента проводилась в одном синапсе.

Таким образом, полученные данные позволяют предполагать, что в нервных терминалях моторных синапсов мыши, подобно многим другим объектам, в

условиях опустошения кальциевых депо имеет место работа SOC-каналов. Возможность существования SOC-каналов в нервных терминалях показана пока в единственной работе, проведенной на центральных нейронах гиппокампа (Emptage, 2001).

В целом, анализ эффектов тапсигарджина в сравнении с эффектами кофеина позволяет заключить, что независимо от способа высвобождения кальция из депо (за счет его пассивной утечки, либо путем активации РиР) наблюдается облегчение секреции медиатора в виде прироста частоты следования МПКП в 2-3 раза. В то же время при выключении высвобождения кальция из депо, либо их опустошении (на поздних этапах действия тапсигарджина, или путем блокады РиР рианодином) наблюдается резкое снижение частоты спонтанной секреции АХ и квантового состава одиночных ТКП.

IV. АНАЛИЗ ВЫЗВАННОЙ АКТИВНОСТИ СИНАПСОВ В ПРИСУТСТВИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО КАЛЬЦИЕВОГО БУФЕРАВАРТА

В заключительной части работы был использован относительно новый подход к тестированию вклада изменений концентрации внутриклеточного кальция в активность синапсов, а именно - введение в терминаль быстрого кальциевого буфера ВАРТА Для нагрузки терминалей ВАРТА проводили инкубацию мышцы в растворе ВАРТА-АМ - ацетометоксилированной ВАРТА, способной проникать через клеточную мембрану в аксоплазму, где ВАРТА-АМ подвергается действию диэстераз и, теряя ацетометоксигруппу, становится неспособна к обратному проникновению в омывающий мышцу раствор (Strayer et al., 1999; Zucker, Regehr, 2002). В настоящее время показано, что ВАРТА в возбудимых клетках эффективно предотвращает только быстрые колебания концентрации внутриклеточного кальция (Adleretal., 1991).

1. Эффекты ВАРТА на вызванную активность моторных синапсов. Мы

обнаружили, что при нагрузке моторных терминалей ВАРТА происходит многократное уменьшение квантового состава одиночных ТКП (в 4 раза меньше контрольного значения) (п=8; р<0,01). Это означает, что в моторных синапсах мыши ВАРТА может «перехватывать» кальций, поступающий по быстрым кальциевым

каналам (Р/р-типа) наружной мембраны терминален и, тем самым, снижать вызванный выброс медиатора АХ.

Мы также установили, что в условиях ритмической активности синапсов 1,2мМ ВАРТА полностью предотвращает развитие начальной фасилятации передачи в диапазоне частот 7-100 Гц (под действием ВАРТА в начале залпа вместо облегчения доминирует депрессия передачи). Под действием ВАРТА уменьшается уровень амплитуд ТКП на фазе «плато» в среднем в 2 раза по сравнению с контрольными значениями. Этот эффект наблюдается во всем исследованном диапазоне частот ритмической активности (рис. 7).

—О— контроль 1 _ —ВАРТА-АМ

* § ВАРТА-АМ+рианодин

0 i-1-1-1 i

0 20 40 60 80 100

Частота стимуляции нерва, Гц

Рис. 7. Уровень амплитуд ТКП на фазе «плато» под действием ВАРТА, рианодина (0,5мкМ) и верапамила (5 мкМ). Каждая точка - результат усреднения данных, полученных в ходе регистрации активности не менее 7 синапсов (* - р<0,05).

Такое действие ВАРТА обычно связывают со способностью «перехватывать» кальций, поступающий из наружной среды по быстрым потенциалактивируемым кальциевым каналам нервной терминали, обеспечивающим вызванный выброс медиатора (Losavio, Muchnik, 2002). При этом остается открытым вопрос, способна ли ВАРТА связывать кальций, высвобождаемый из внутриклеточных депо через РиР и, тем самым, предотвращать облегчающие эффекты рианодина (0,5 мкМ) на ритмическую активность при высоких частотах стимуляции нерва.

Для решения этого вопроса мы исследовали действие рианодина в концентрации 0,5 мкМ, как активатора рианодиновых рецепторов и стимулятора выброса депонированного кальция на фоне предварительной инкубации диафрагмальной мышцы в ВАРТА-АМ

2. Эффекты рианодина на уровень амплитуд ТКП фазы "плато" на фоне

действия ВАРТА. Мы установили, что на фоне ВАРТА рианодин не только сохраняет, но и усиливает свое облегчающее действие на синаптическую передачу. Под действием рианодина на фоне ВАРТА начальная фасилятация восстанавливается до контрольных значений, а уровень «плато» достоверно увеличивается по сравнению с контролем не только на высоких, а и во всем исследованном диапазоне частот (в среднем на 30-50%) (рис. 7).

Такое усиление облегчающего действия рианодина на фоне ВАРТА могло означать, что в присутствии ВАРТА в терминалях появился фактор, избирательно облегчающий работу риаподиновых рецепторов. Согласно данным литера гуры, таким фактором может выступать Ь-тип потенциалактивируемых Са2+-каналов наружной мембраны, который в моторных терминалях мыши обычно не участвует в запуске секреции медиатора, т.к. инактивирован со стороны аксоплазмы кальцием, поступающим в терминаль по Р/р-типу Са2+-каналов во время пресинаптического потенциала действия. Однако при забуферивании быстрых колебаний внутриклеточного кальция под действием ВАРТА может происходить растормаживание Са2+-каналов Ь-типа (Ьоваую, Muchnik, 2002)

Мы предположили, что обнаруженное нами усиление потенциирующего действия рианодина на выброс АХ на фоне ВАРТА связано с активацией кальциевых каналов Ь-типа наружной мембраны. Поступление ионов кальция по этим каналам способствует активации РиР и облегчению выброса депонированного кальция, что может приводить к потенциации облегчающих эффектов рианодина Для проверки этого предположения в следующей серии экспериментов были исследованы эффекты рианодина на фоне ВАРТА в присутствии верапамила (5 мкМ) - блокатора Са2+- каналов Ь-типа

3. Эффекты ВАРТА и рианодина на фоне блокады Са2+-каналов Ь-типа верапамилом. Предварительно мы установили, что сам верапамил (5 мкМ) не

оказывает каких-либо воздействий на амплитуду и квантовый состав ТКП на фазе «плато» в залпе. Однако верапамил устранял потенциирующее действие рианодина на амплитуду ТКП на фоне ВАРТА (рис. 7). При этом график частото-зависимых изменений уровня «плато» проходит ниже кривой, отражающей облегчающие эффекты рианодина без ВАРТА.

Рис. 8. Схема функционального взаимодействия выброса депонированного кальция и каналов наружной мембраны терминам моторных синапсов мыши.

Таким образом, в моторных терминалях мыши мы показали, что, во-первых, существует связь между активностью рианодиновых рецепторов кальциевых депо и кальциевых каналов Ь-типа наружной мембраны. Во-вторых, в отсутствие работы Ь-типа кальциевых каналов (на фоне верапамила) ВАРТА в значительной мере способна предотвращать облегчающие эффекты рианодина, то есть "перехватывать" выбрасываемый из Са2+-депо кальций. Это позволяет предположить, что в нервных терминалях моторных синапсов мыши «Са2+-спарки», то есть подъемы концентрации внутриклеточного кальция за счет Са2+-активируемого выброса депонированного кальция - достаточно быстрые, и сопоставимы по динамике воздействия на секрецию АХ с динамикой модулирующего действия кальция, поступающего в терминаль из наружной среды по Р/р-типу Са2+-каналов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что в нервно-мышечных синапсах мыши частота спонтанной секреции квантов АХ примерно на 50% определяется кальцием, высвобождаемым из внутриклеточных кальциевых депо. Аналогичные эффекты описаны недавно в ряде центральных и периферических синапсов, где от частоты Са2+-«спарков», то есть спонтанных выбросов депонированного кальция через РиР, зависит частота спонтанного выброса квантов глутамата, ГАМК или АХ (Statham, Duncan, 1975; Publicover, 1982; Castonguay, Robitaille, 2001; Emptage et al., 2001; Балезина, 2002).

В работе показано, что в моторных терминалях мыши вызванный выброс АХ может быть усилен благодаря внутриклеточно высвобождаемому кальцию (через РиР) - как при одиночных сигналах, так и при коротких ритмических залпах импульсов. Эффективность этих облегчающих воздействий зависит от частоты залповых разрядов синапса. Оказалось также, что выброс депонированного Са2+ может не только облегчать, но и тормозить секрецию АХ. Так, при низких частотах разрядов тормозное действие на секрецию АХ со стороны кальция, высвобождаемого из депо, опосредовано прицельной активацией низкопроводящих апамин-чувствительных кальций-зависимых К+-каналов наружной мембраны.

Забуферивание быстрых колебаний [Са2+]вн в моторных терминалях с помощью внутриклеточного буфера ВАРТА показало, что Са2+-активируемый выброс депонированного кальция зависит не только от работы P/Q, но и L-типа кальциевых каналов наружной мембраны (в случае растормаживания их активности). Оказалось также, что динамика выброса Са2+ из депо и его воздействий на секрецию медиатора сопоставима, либо незначительно уступает скоростям модулирующих влияний на секрецию медиатора со стороны кальция, поступающего в терминаль из наружной среды.

Анализ эффектов тапсигарджина показал, что в нервных терминалях моторных синапсов мыши, подобно многим другим объектам, в условиях опустошения кальциевых депо имеет место активация каналов наружной мембраны, обеспечивающих поступление кальция в аксоплазму. Нельзя исключить, что эти каналы являются разновидностью так называемых SOC - "депо-управляемых" Са2+-каналов.

ВЫВОДЫ

1. В нервно-мышечных синапсах мыши частота спонтанной секреции квантов АХ на 20-50% определяется выбросом кальция из пресинаптических рианодин-чувствительных Са2+-депо нервных терминален.

2. При ритмической активности моторных синапсов мыши изменения уровня секреции АХ по ходу залпа демонстрируют частото-зависимые облегчающие влияния со стороны кальция, высвобождаемого из депо через РиР.

3. Стимуляция рианодином (0,5 мкМ) выброса депонированного кальция в моторных терминалях может приводить к разнонаправленным изменениям уровня квантовой секреции АХ, потенциируя ее в 1,5-2,0 раза при высоких (70-100 Гц), и подавляя в 22,5 раза при низких (4 Гц) частотах залповой активности.

4. Снижение уровня амплитуд ТКП под действием рианодина (0,5 мкМ) при низкочастотной (4 Гц) активности синапсов полностью предотвращается блокадой К+Са-каналов апамином (0,5 мкМ). Это свидетельствует о способности внутриклеточно высвобождаемого кальция прицельно активировать К+Са-каналы наружной мембраны терминали, тем самым снижая ее возбудимость и подавляя секрецию АХ.

5. Блокада тапсигарджином (2 мкМ) Са -АТФазы пресинаптических Са2+-депо вызывает две волны достоверного возрастания частоты МПКП и квантового состава ТКП. Первая волна (15-20 мин) связана с утечкой кальция из Са2+-депо в аксоплазму,

, а вторая (35-45 мин) - с поступлением Са2+ из наружной среды, предположительно -по "депо-управляемым" каналам.

6. Забуферивание колебаний внутритерминального кальция быстрым кальциевым буфером ВАРТА (1,2 мМ) приводит к снижению в 4-5 раз вызванного выброса АХ. Рианодин (0,5 мкМ) на фоне ВАРТА увеличивает в 3-5 раз вызванный выброс медиатора.

7. Увеличение вызванного выброса АХ, вызываемое рианодином на фоне ВАРТА, предотвращается блокадой потенциалактивируемых Са2+-каналов Ь-типа верапамилом (5 мкМ). Это свидетельствует о растормаживании (на фоне ВАРТА) Ь-типа Са2+-каналов терминалей и их участии в Са2+-активируемом выбросе депонированного кальция, облегчающем секрецию АХ в моторных синапсах мыши.

8. В моторных синапсах мыши выброс депонированного кальция способен непосредственно, либо через регуляцию каналов наружной мембраны терминалей облегчать или тормозить секрецию квантов АХ.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ

1. О.Р. Balezina and A.N. Bukiya "Spontaneous activity of murine neuromuscular junctions in the presence of dantrolene" //Neirofiziologiya/Neurophysiology - 2001 -V.33(2),pp.90-97.

2. O.P. Balezina and A.N. Bukiya "Facilitation and depression of neuromuscular transmission under conditions of blockade of ryanodine receptors" // Neirofziotogiya/Neuropbysiology - 2003 - V.35 (2), pp.83-89.

3. Балезина О.П., Букин A.H., Лаптева В.И. "Вызванная активность нервно-мышечных синапсов мыши на фоне действия дантролена и рианодина" // Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова - 2001 - Т.87 (11), с. 15111517.

4. О.П. Балезина, АН. Букин. В.И. Лаптева "Разнонаправленное действие внутриклеточно высвобождаемого кальция на квантовую секрецию медиатора" // Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова, 2004 (в печати).

5. Balezina O.P., Bukiya AN.. Surova N.V., Lapteva V.I. "Ryanodine and caffeine effects on the spontaneous activity of mouse motor synapses" // International sympozium "Synaptic transmission-100 years after LXuciani", Roma, Italy, 28-30 September 2000, p.15-16.

6. Вардья И.В., Букин АН., Балезина О.П. "Сйнаптическая, механическая и электрическая активность скелетной мышцы мыши в ходе процесса реиннервации"// Международная конференция "Физиология мышечной деятельности", Москва, 21-24 ноября 2000 года, стр.37-38.

7. Букин АН., Балезина О.П. "Анализ параметров миниатюрных потенциалов концевой пластинки мыши на фоне действия дантролена" // VII Всероссийская школа молодых ученых 'Актуальные проблемы нейробиологии", Казань, Татарстан, 27-29 сентября 2000 года, стр.33-34.

8. Букин А.Н., Балезина О.П. "Анализ действия дантролена и рианодина на спонтанную активность нервно-мышечных синапсов мыши" // Конференция

молодых ученых по нейронаукам, посвященная 80-летию академика РАО, профессора Е.Н.Соколова, Москва, Россия, 25 сентября, 2000, стр.5.

9. Букия А.Н.. Балезина О.П. "Параметры миниатюрных потенциалов концевой пластинки мыши на фоне действия рианодина и дантролена" // Научная конференция молодых ученых, посвященная 50-летию основания института Высшей Нервной Деятельности и нейрофизиологии РАН (в рамках выполнения Федеральной целевой программы "Государственная под держка интеграции высшего образования и фундаментальной науки на 1997-2000 гт"), Москва, Россия, 11-12 октября 2000 года, стр. 19-20.

10. O.P.Balezina, A.N. Bukiva "Ryanodine and dantrolene modulatory action on the spontaneous and evoked activity of mouse motor synapses" // 28-th Goettingen neurobiology conference, Germany, 7-10 June 2001.

11. Балезина О.П., Букия А.Н., Лаптева В.И. "Модуляция рианодином и дантроленом Са2+-зависимого выброса медиатора в нервно-мышечном синапсе мыши" //XVIII Съезд физиологов России, Казань, 25-28 сентября 2001, стр.23.

12. Букия А.Н. "Анализ влияния выброса кальция из внутриклеточных Са2+-депо терминалей на рисунки залповой активности нервно-мышечных синапсов мыши" // Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов - 2002", Москва, 10-11 апреля 2002 года, стр. 15-16.

13. Букия А.Н. "Параметры нервно-мышечной передачи на фоне блокады рианодиновых рецепторов" // Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов - 2003", Москва, 15-18 апреля 2003 года, стр.6-7.

14. Букия А.Н. "Анализ действия тапсигарджина на параметры активности нервно-мышечных синапсов мыши" // II Международная конференция по физиологии мышц и мышечной деятельности, МГУ им. М.В.Ломоносова, Москва, 29 января-1 февраля 2003 года, стр.48-49.

15. Balezina O.P., Bukiva A.N. "Comparative analysis of thapsigargin and ryanodine action on mediator release in nerve terminals of mice motor synapses" // International Workshop "Progress in Biotechnology and Neurobiology - Integrative Medicine", Hurgada (Egypt), 14-24 February, 2004.

Подписано в печать 05.11.2004 Формат 60x88 1/16. Объем 1.75 усл.п.л.

Тираж 100 экз. Заказ № 176 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д. 1 Главное здание МГУ, к. 102

»22441

РНБ Русский фонд

2005-4 24129

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Букия, Анна Нодаровна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.Общая характеристика внутриклеточных кальциевых депо нейронов.

2.Рианодиновые рецепторы.

2.1 .Основные характеристики рианодиновых рецепторов.

2.2. Регуляция активности рианодиновых рецепторов.

2.3.Рианодин и дантролен как модуляторы активности рианодиновых рецепторов.

2.3.1. Рианодин.

2.3.2. Дантролен.

2.3.3. Взаимодействие дантролена и рианодина.

3.Роль рианодин-чувствительных кальциевых депо в регуляции секреции медиатора.

4.Механизмы запуска выброса кальция из Са2+ депо нервных терминалей.

5.Взаимодействие выброса кальция из внутриклеточных депо с ионными каналами наружной мембраны.

6.Функциональные последствия опустошения кальциевых депо.

7.Спонтанная и вызванная секреция медиатора в нервно-мышечных синапсах как функция выброса депонированного кальция.

7.1. Спонтанный выброс медиатора.

7.2. Вызванное высвобождение медиатора как многоквантовый выброс

7.3. Особенности вызванной ритмической активности синапса.

7.3.1. Депрессия.

7.3.2. Облегчение.

7.3.3. Мобилизация медиатора.

8.Использование кальциевых буферов для анализа короткоживущих Са2+- сигналов.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1 .Приготовление нервно-мышечного препарата диафрагмы мыши.

2.Внутриклеточная регистрация спонтанных миниатюрных потенциалов и вызванных токов концевой пластинки.

2.1. Метод регистрации спонтанной синаптической активности.

2.2.Эксперименты на синапсах в условиях вызванной синаптической активности.

3.Статистическая обработка экспериментальных данных.

4.Используемые в работе вещества.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1.Действие блокаторов рианодиновых рецепторов на спонтанный выброс медиатора.

1 .Воздействие дантролена на спонтанный выброс медиатора.

1.1. Эффекты дантролена на амплитуду и амплитудное распределение МПКП.

1.2. Эффекты дантролена на частоту спонтанного выброса.

2.Воздействие рианодина как блокатора рианодиновых рецепторов на спонтанный выброс медиатора.

3.Дантролен как блокатор эффектов рианодина.

3.1.Эффекты рианодина на спонтанный выброс медиатора.

3.2.Эффекты рианодина на фоне действия дантролена.

3.2.1. Изменения частоты МПКП.

3.2.2. Изменения средней амплитуды и амплитудного распределения МПКП.

II.Действие блокаторов рианодиновых рецепторов на вызванный выброс медиатора.

1. Действие дантролена на одиночные ТКП.

2.Изменение параметров одиночных ТКП на фоне блокады рианодиновых рецепторов рианодином.

Ш.Изменения ритмической активности нервно-мышечных синапсов диафрагмальной мышцы в присутствии блокаторов рианодиновых рецепторов.

1 .Частото-зависимые особенности ритмической активности синапсов.

2.Частото-зависимые эффекты действия дантролена на рисунки залповой активности синапсов.

З.Частото-зависимые эффекты действия рианодина на рисунки залповой активности синапсов.

IV.Действие рианодина как активатора рианодиновых рецепторов на вызванный выброс медиатора.

1 .Действие активации рианодиновых рецепторов рианодином на одиночные ТКП.

2.Эффекты рианодина на рисунки залповой активности синапсов.

V.Действие блокатора Са2+-АТФазы - тапсигарджина на спонтанный и вызванный выброс медиатора.

1 .Действие тапсигарджина на спонтанный выброс ацетилхолина.

2.Действие тапсигарджина на одиночные ТКП.

3.Эффекты тапсигарджина на рисунки залповой активности синапсов.

VI. Действие Са2+-буфера ВАРТА-АМ на спонтанный и вызванный выброс медиатора.

1.Действие ВАРТА-АМ на спонтанный выброс ацетилхолина.

2.Действие ВАРТА-АМ на одиночные ТКП.

3.Эффекты ВАРТА-АМ на рисунки залповой активности синапсов.

4.Эффекты активатора рианодиновых рецепторов - рианодина на фоне действия ВАРТА-АМ.

5.Действие верапамила на спонтанный и вызванный выброс ацетилхолина.107 б.Эффекты верапамила и рианодина на рисунки залповой активности синапсов на фоне предварительной инкубации мышцы в растворе ВАРТА-АМ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль кальция, высвобождаемого из внутриклеточных кальциевых депо, в регуляции выброса медиатора в моторных синапсах мыши"

2+ повышению уровня [Са ]вн (Parducz et al., 1987; Kawai, Watanabe, 1989; Konnerth et al., 1992; Sitsapesan et al., 1995; Peng, 1996; Narita et al., 2000). Это, в свою очередь, может отражаться на режиме спонтанной и вызванной секреции квантов медиатора (Nishimura et al., 1990; Narita et al., 2000; Galante, Marty, 2003). В настоящее время спектр регуляторных воздействий, осуществляемых внутриклеточно высвобождаемым кальцием в отношении каналов и рецепторов наружной мембраны терминали, а также режимов спонтанной и вызванной секреции квантов медиатора, остается малоизученным.

Известно, что спонтанная секреция отдельных квантов медиатора относительно независима от поступления кальция из наружной среды и более чувствительна к кальцию, выбрасываемому из внутриклеточных источников (Losavio, Muchnik, 1997). Вместе с тем, сведения о корреляции частоты спонтанной секреции квантов, размеров кванта и других параметров спонтанной секреции с модуляцией активности РиР и наполненностью Са2+-депо кальцием носят фрагментарный характер (Балезина, 2002).

Еще менее изучена связь вызванной многоквантовой секреции медиатора с Са -активируемым выбросом депонированного кальция в условиях одиночной и ритмической залповой активности синапсов. Известно, что в моторных синапсах мыши имеют место характерные изменения уровня выброса медиатора на разных фазах ритмического залпа импульсов. Сначала наблюдается кратковременное облегчение передачи (т.н. начальная фасилятация), сменяющаяся процессом депрессии передачи (постепенного снижения секреции медиатора) с последующей стабилизацией уровня выброса медиатора на сниженном уровне (т. н. фаза «плато» в ритмическом залпе) (Silinsky, 1985; Zucker, Regehr, 2002). Показано, что большинство этих изменений зависят от колебаний уровня внутритерминального кальция (Silinsky, 1985; Zucker, Regehr, 2002; Балезина, 2002). Какой вклад в регуляцию процессов ранней фасилятции, последующей кратковременной депрессии передачи и в процесс стабилизации выброса медиатора на фазе «плато» осуществляет кальций, высвобождаемый из внутритерминальных Са2+-депо, остается не изученным. Рассмотрение перечисленных вопросов представляется актуальным как для фундаментальной синаптологии, так и для патофизиологии синапсов и поисков новых путей фармакологической коррекции синаптической передачи.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было исследовать роль внутриклеточно высвобождаемого кальция в регуляции режимов спонтанной и вызванной секреции квантов медиатора ацетилхолина (АХ) в моторных синапсах диафрагмы мыши в условиях облегчения, либо подавления активности пресинаптических РиР и рианодин-чувствительных Са2+-депо терминалей.

В работе решались следующие конкретные задачи.

1. Используя регистрацию спонтанных миниатюрных потенциалов концевой пластинки (МПКП) диафрагмы мыши, выявить изменения частоты и других параметров МПКП на фоне действия двух блокаторов пресинаптических РиР-дантролена (10-100 мкМ) и рианодина (в высоких 10-100 мкМ) концентрациях.

2. Исследовать изменения частоты МПКП под действием экзогенных избирательных агонистов РиР - кофеина (5мМ) и рианодина (в низких субмикромолярных концентрациях).

3. Описать частото-зависимые изменения квантового состава ТКП на фазе начальной фасилятации, последующей депрессии передачи и на фазе «плато» в ходе ритмической активности моторных синапсов.

4. Исследовать частото-зависимые изменения квантового состава ТКП по ходу ритмического залпа на фоне усиления, либо торможения выброса депонированного кальция с помощью рианодина и дантролена.

5. Исследовать изменения режима спонтанных МПКП и вызванных ТКП на фоне утечки депонированного Са2+ и опустошения пресинаптических Са2+-депо в условиях блокады тапсигарджином Са2+-АТФазы Са2+ -депо терминалей.

6. Исследовать воздействие рианодина (как агониста РиР и стимулятора высвобождения депонированного кальция) на выброс медиатора на фоне процедуры забуферивания колебаний [Са2+]вн быстрым Са2+ буфером ВАРТА.

Обнаружена ранее неизвестная способность кальция, выбрасываемого из Са -депо под действием рианодина (0,5 мкМ), вызывать двунаправленные изменения секреции квантов медиатора в ходе ритмической активности синапсов: при низких (порядка 4 Гц) частотах рианодин подавляет, а при высоких - 70-100 Гц - увеличивает вызванный выброс АХ на фазе "плато". Впервые установлено, что тормозный эффект рианодина обусловлен активацией Са2+-активируемых К+-каналов под действием внутриклеточно высвобождаемого кальция.

Новыми являются и данные, демонстрирующие участие L-типа Са2+-каналов (растормаживаемых под действием внутриклеточного буфера ВАРТА) в активации РиР и опосредовании облегчающих эффектов рианодина как агониста РиР) в отношении вызванного выброса медиатора в моторных синапсах мыши.

Положения, выносимые на защиту.

1. В интактных моторных терминалях мыши частота спонтанной секреции на 20-50% зависит от выброса внутриклеточно депонированного кальция из рианодин-чувствительных Са2+-депо терминалей.

2. В условиях ритмической залповой активности моторных синапсов частично кураризированного нервно-мышечного препарата характерные изменения квантового состава ТКП по ходу залпа (такие как начальная фасилятация, депрессия и процесс стабилизации передачи на фазе "плато") регулируются частотно-зависимым образом со стороны кальция, выбрасываемого из рианодин-чувствительных Са2+-депо терминалей.

3. Усиленный рианодином выброс депонированного кальция в терминалях при ритмической активности моторных синапсов может приводить к разнонаправленным эффектам: при низких частотах (4 Гц) -уменьшать квантовый состав ТКП на фазе "плато" за счет активации апамин-чувствительных Са2+-зависимых К+-каналов терминали, а при высоких частотах (70-100 Гц) - вызывать увеличение квантового состава ТКП на фазе "плато".

Научно-практическая ценность работы. Полученные в работе данные расширяют современные представления о роли рианодин-чувствительных Са2+-депо нервных терминалей в регуляции секреции квантов медиатора в периферических моторных синапсах млекопитающих. В результате проведенных исследований получены новые важные сведения о вовлечении РиР и внутриклеточно высвобождаемого кальция в регуляцию как спонтанной, так и вызванной квантовой секреции медиатора. Впервые в условиях ритмической активности синапсов показана способность внутриклеточно высвобождаемого кальция вызывать не только облегчающее, но и тормозное действие на секрецию АХ путем вовлечения в активность Са2+-зависмых К+-каналов наружной мембраны. Этот факт позволяет говорить о наличии в терминалях моторных синапсов мыши тесной функциональной сопряженности работы Са2+-зависимых каналов наружной мембраны, Са2+-активируемых Са2+-депо и процессов Са2+-зависимой секреции АХ. Научную ценность представляют и описанные особенности участия депонированного кальция в регуляции рисунка залповой активности моторных синапсов: способность частото-зависимым образом контролировать процесс начальной фасилятации, а также - уровень выброса АХ на поздних, отставленных стадиях залпа, в особенности - на фазе "плато". Обнаруженная в работе способность избирательных агонистов РиР облегчать и поддерживать ритмическую синаптическую передачу путем усиления вызванного выброса медиатора, имеет ценность не только для фундаментальных знаний о Са2+-зависимой регуляции секреции медиатора, но и для решения прикладных задач: поиска новых классов фармакологических соединений, способных усиливать ослабленную синаптическую передачу в условиях ее патологии у моторных синапсов млекопитающих.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В последние 10-15 лет в научной литературе накоплен большой

94- w материал о роли внутриклеточного кальция и Са -депо в электрической и секреторной активности не только нейронов, но и нервных терминалей. В

94обзоре будут рассмотрены литературные данные о самих Са -депо, о внутриклеточных Са2+-каналах и о способах их эндогенной и экзогенной модуляции в нейронах и нервных терминалях синапсов.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Букия, Анна Нодаровна

выводы

3. Стимуляция рианодином (0,5 мкМ) выброса депонированного кальция в моторных терминалях может приводить к разнонаправленным изменениям уровня квантовой секреции АХ, потенциируя ее в 1,5-2,0 раза при высоких (70100 Гц), и подавляя в 2-2,5 раза при низких (4 Гц) частотах залповой активности.

5. Блокада тапсигарджином (2 мкМ) Са2+-АТФазы пресинаптических Са2+-депо вызывает две волны достоверного возрастания частоты МПКП и квантового состава ТКП. Первая волна (15-20 мин) связана с утечкой кальция из Са2+-депо в аксоплазму, а вторая (35-45 мин) - с поступлением Са2+ из наружной среды, предположительно - по "депо-управляемым" каналам.

6. Забуферивание колебаний внутритерминального кальция быстрым кальциевым буфером ВАРТА (1,2 мМ) приводит к снижению в 4-5 раз вызванного выброса АХ. Рианодин (0,5 мкМ) на фоне ВАРТА увеличивает в 35 раз вызванный выброс медиатора.

7. Увеличение вызванного выброса АХ, вызываемое рианодином на фоне у,

ВАРТА, предотвращается блокадой потенциалактивируемых -каналов L-типа верапамилом (5 мкМ). Это свидетельствует о растормаживании (на фоне ВАРТА) L-типа Са2+-каналов терминалей и их участии в Са2+-активируемом выбросе депонированного кальция, облегчающем секрецию АХ в моторных синапсах мыши.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нашей работе была предпринята попытка разностороннего анализа роли ионов кальция, высвобождаемых из внутриклеточных депо, в регуляции секреции медиатора в моторных синапсах мыши. Известно, что высвобождение депонированного кальция через специализированные каналы

- рианодиновые рецепторы вносит вклад как в спонтанную, так и вызванную секрецию медиатора в ряде центральных и периферических синапсов (Losavio, Muchnik, 1997; Балезина и др., 2001; Galante, Marty 2003; De Crescenzo et al., 2004). Полученные нами результаты позволяют дополнить и отчасти изменить существующие представления об участии кальция, высвобождаемого из рианодин-чувствительных Са2+-депо в регуляции выброса квантов медиатора на примере АХ в моторных синапсах мыши (рис. 18).

Влияние внутриклеточно высвобождаемого кальция на спонтанную секрецию квантов изучается, главным образом, на примере воздействий кофеина (известного стимулятора выброса депонированного кальция через

РиР) на параметры потенциалов концевой пластинки (Narita, et al., 2000), либо i

- эффектов блокаторов Са -АТФ-азы - тапсигарджина и циклопиазоновой кислоты (Emptage et al., 2002; Castonguay, Robitaille, 2002; Балезина, 2002). Что касается способности блокаторов РиР приводить к урежению частоты МПКП, то такой эффект описан лишь для дантролена в отношении частоты МПКП в нервно-мышечных синапсах лягушки (Statham, Duncan, 1975; Publicover, 1982). В нашей работе впервые были исследованы эффекты двух разных блокаторов РиР -дантролена и рианодина в моторных синапсах мыши. Мы впервые установили, что рианодин - в концентрациях 10-100 мкМ -вызывает дозозависимое уменьшение частоты спонтанной секреции АХ в 2-3 раза. В то же время эффекты дантролена оказались противоположно направленными. Он вызывал прирост частоты МПКП в концентрациях выше 50 мкМ. Известно, что дантролен избирательно блокирует только РиР1 и РиРЗ, но не затрагивает активность РиР2. Поэтому мы предположили, что облегчающий эффект дантролена может быть следствием демаскирования

Рис. 18. Схема функционального взаимодействия выброса депонированного кальция и каналов наружной мембраны терминали моторных синапсов мыши.

1 12 спонтанной активности РиР2 и облегчающего влияния Са2+, высвобождаемого через РиР2, на частоту следования МПКП под действием дантролена.

Такой феномен возможен в том случае, если между разными типами активных РиР существует функциональный антагонизм. Возможность таких реципрокных отношений между разными типами РиР в одной клетке нельзя исключить. Действительно, в последние годы показано сосуществование разных типов РиР и в скелетной мышце и в нервной ткани (Pozzan et al., 1994; Berridge, 1997). Характер взаимодействия между разными типами РиР пока неизвестен. Попытки фармакологического выявления активности одного из трех ныне известных типов РиР до сих никем не предпринимались. Использование с этой целью дантролена является, в общем, традиционным фармакологическим подходом. Этот подход позволяет с помощью выключения одних типов рецепторов более четко выявить функции других. В настоящее время описан антагонизм в отношении активности рианодин- и 1Р3-чувствительных кальциевых депо нейронов (Simpson et al., 1995). Поэтому нельзя исключить, что обнаруженные нами впервые парадоксальные эффекты дантролена являются следствием возможного существования функционального антагонизма между подтипами РиР в составе моторных нервных терминалей мыши. О возможном растормаживании активности РиР2 типа на фоне дантролена говорит и тот факт, что именно и только на фоне дантролена проявилась способность рианодина (как активатора РиР) увеличивать частоту МПКП.

В пользу предположения о наличии функционально значимой активности РиР2 в составе моторных нервных терминалей мыши свидетельствует и обнаруженное недавно в лаборатории О.П. Балезиной достоверное двукратное увеличение частоты спонтанной секреции АХ под действием избирательного активатора РиР2 - дигоксина (Балезина О.П., Лаптева В.И., 2004 - неопубликованные результаты).

Таким образом, на основании полученных нами данных можно сделать предварительное заключение о возможном наличии физиологического антагонизма между РиР2 и другими подтипами РиР в составе моторных нервных терминалей мыши. Однако это предположение нуждается в дальнейших более детальных исследованиях.

В настоящее время в синаптологии рианодин используют почти исключительно как блокатор РиР. Между тем известно, что он может выступать и как «мягкий» активатор РиР, "переключающий" РиР в полупроводящее состояние и, тем самым, обеспечивающий слабую (по сравнению в кофеином или тапсигарджином) утечку кальция из Са2+-депо. В связи с этим, представляло интерес выяснение физиологических последствий «мягкого» типа утечки Са из Са -депо через РиР на уровень секреции медиатора.

Мы установили, что рианодин, действуя как агонист РиР (в низких субмикромолярных концентрациях) не вызывает достоверных изменений частоты спонтанного выброса квантов АХ. По-видимому, это связано со спецификой взаимодействия рианодина с РиР, требующей предварительного «кондиционирования» РиР и самих Са2+-депо - то есть перевода РиР в открытое состояние и загрузки депо кальцием. В пользу такой гипотезы свидетельствуют данные об увеличении частоты спонтанной секреции под действием рианодина в условиях предварительной калиевой (16 мМ) деполяризации мембраны (Nishimura, 1990; Балезина О.П., Лаптева В.И., 2004 - неопубликованные результаты). В нашей работе еще раз показано, что интенсивное воздействие агонистов на РиР, приводящее к их активации и выбросу депонированного кальция - например, эффекты кофеина (либо рианодина на фоне дантролена) - может приводить к учащению спонтанной секреции квантов АХ.

Таким образом, модулируя работу РиР, нам удалось показать, что частота спонтанного выброса квантов АХ в моторных синапсах мыши находится под воздействием кальция, высвобождаемого из рианодин-чувствительных Са2+-депо терминалей.

Следующая часть работы была посвящена исследованию вызванной секреции квантов АХ в моторных синапсах и ее изменениям под действием рианодина (как агониста и антагониста РиР) и дантролена (как блокатора РиР). Мы впервые установили, что блокада РиР как дантроленом, так и рианодином, приводит к значительному подавлению выброса медиатора и снижению в 2-3 раза квантового состава одиночных ТКП. Это по существу означает, что вызванный нервным импульсом выброс квантов медиатора обеспечивается не только входом наружного кальция в терминаль, но отчасти детерминирован и кальцием, высвобождаемым в этот момент из Са2+ -депо.

Активация РиР рианодином, вопреки ожиданиям, не привела к увеличению квантового состава одиночных ТКП. Отсутствие облегчающих эффектов рианодина на одиночный выброс медиатора, по-видимому, связано с особенностями его взаимодействия с РиР и «мягкой» неполной активацией высвобождения депонированного кальция под действием этого реагента (Pozzan et al., 1994). Однако следует отметить, что в условиях растормаживания Са2+-каналов L-типа нервных терминалей на фоне действия ВАРТА-АМ рианодин оказался способным потенциировать синаптическую передачу, увеличивая квантовый состав ТКП даже при одиночном раздражении диафрагмального нерва. По-видимому, для проявления облегчающего действия рианодина необходимо дополнительное «кондиционирование» РиР и Са2+-депо входящим в терминаль кглщием (в особенности - по L-типу Са2+-каналов).

Таким образом, мы обнаружили, что акты одиночного выброса медиатора в моторных нервных терминалях мыши при определенных условиях могут регулироваться высвобождением депонированного кальция.

Вклад кальция, высвобождаемого из депо, в ритмическую активность синапсов в настоящее время наименее изучен. Вместе с тем, этот вопрос представляется особенно актуальным. Показано, что практически все процессы, протекающие во время ритмической активности нервной терминали - такие, как начальное облегчение (фасилятация), скорость развития депрессии, мобилизация везикул и процесс стабилизации выброса медиатора на сниженном уровне (фаза "плато" по ходу залпа ТКП) - в той или иной мере зависят от колебаний внутриклеточного ионизированного кальция (Зефиров, Черанов, 2000; Балезина 2002). В связи с этим, наши дальнейшие исследования были посвящены анализу роли внутриклеточно высвобождаемого кальция в регуляции выброса медиатора по ходу ритмической активности моторных синапсов диафрагмы мыши.

В предварительной серии экспериментов нами были выявлены частотные режимы (в диапазоне 4-100 Гц), при которых наиболее выражены начальная фасилятация, начальная депрессия и фаза стабилизации передачи на сниженном уровне - фаза "плато", характерная для поздних стадий залпа, состоящего из 50 ТКП .

Если феномену начальной фасилятации традиционно приписывали связь с "остаточным" кальцием (то есть кальцием, накапливающимся в терминали в результате поступления в аксоплазму из внеклеточной среды по потенциалактивируемым каналам наружной мембраны), то в отношении регуляции процесса депрессии и фазы "плато" лишь недавно была показана зависимость от интенсивности поступления кальция из наружной среды (Neher, 1998; Zucker, Regehr, 2002). Вместе с тем, практически отсутствуют данные об относительном вкладе внутриклеточно высвобождаемого кальция из рианодин-чувствительных Са2+-депо в регуляции рисунка залповых разрядов ТКП (Балезина, 2002).

Мы установили, что активация РиР рианодином (облегчающим утечку Са2+ из Са2+-депо терминалей) приводит к частотно-зависимому увеличению амплитуды ТКП на фазе "плато" (при частотах стимуляции нерва 70 и 100 Гц). В то же время как действие блокаторов выброса кальция из депо (рианодина в высоких концентрациях и дантролена) вызывало противоположный эффект -подавление амплитуд ТКП на фазе "плато".

Таким образом, нам впервые удалось показать, что в ходе ритмической активности моторных синапсов мыши кальций, высвобождаемый из депо, вносит существенный вклад в формирование отставленного во времени (от момента прихода первого ПД в залпе) процесса формирования уровня вызванного выброса АХ на фазе "плато".

Особый интерес представляет обнаруженный нами феномен, когда активация рианодином выброса депонированного кальция приводит при определенных частотах залповой активности (4 Гц) к достоверному уменьшению амплитуд ТКП на "плато" в среднем в 2 раза. Мы предположили, что столь выраженное тормозное действие рианодина могло бы быть следствием взаимодействия кальция, высвобождаемого под действием рианодина из Са2+-депо, с каналами наружной мембраны, например - К+Са-каналами. Показано, что в моторных терминалях имеются низкопроводящие К+Са-каналы, которые расположены вдали от активных зон (как раз в тех местах, где предполагается и расположение кальциевых депо) (Urbano et al., 2001; Morita, Barret, 1990).

Для проверки нашего предположения о возможном взаимодействии депонированного кальция с каналами наружной мембраны, мы использовали избирательный блокатор К+Са-каналов - апамин. Оказалось, что в условиях блокады К+Са-каналов апамином рианодин не вызывает подавления уровня "плато" ТКП в залпе с частотой 4 Гц. Таким образом, нам впервые в моторных нервных терминалях мыши удалось зарегистрировать (при определенном режиме активности синапсов) действие кальция, высвобождаемого из Са2+-депо, как активатора низкопроводящих К+Са-каналов наружной мембраны. Это означает, что выброс депонированного кальция в терминалях может играть двоякую роль - не только усилителя входящего сигнала и выброса медиатора, но и ограничителя этих процессов. Следует отметить, что аналогичное (по принципу отрицательной обратной связи) действие депонированного кальция уже обнаружено в некоторых центральных нейронах млекопитающих (Akita, Kuba, 2000; Stocker, 2004). Авторы предполагают наличие в нейронах так называемой «триады» - функционального сопряжения, взаимодействия

•j , л I потенциал-зависимых Са -каналов наружной мембраны, Са -активируемого

21 ^ выброса Са через РиР и работы К ca-каналов наружной мембраны, активируемых за счет прицельного воздействия на них внутриклеточно высвобождаемого кальция. Эта триада может тонко регулировать возбудимость, форму ПД, частоту разряда нейронов и другие параметры

Stocker, 2004).

Наряду с фармакологической модуляцией РиР кальциевых депо терминалей, позволяющей подавить, либо, напротив, усилить утечку депонированного кальция через РиР из Са2+-депо, в дальнейших исследованиях мы использовали процедуру "выключения" кальциевых депо

1 I путем блокады Са -АТФазы тапсигарджином. Под действием этого агента происходит неконтролируемая утечка Са2+ из Са2+-депо в аксоплазму терминалей и их полное опустошение (Castonguay, Robitaille, 2001; Emptage et al., 2001). Мы показали, что под действием тапсигарджина происходит двугорбое, бимодальное увеличение и квантового состава одиночных ТКП, и частоты МПКП, причем первый пик наблюдается на 15-20-ой минутах, а второй - на 40-50-ой минутах действия тапсигарджина). Детальное исследование наблюдаемого феномена (регистрация изменений частоты следования МПКП в бескальциевом растворе в присутствии тапсигарджина, а

Л j также тестирование кофеином степени и динамики опустошения Са -депо) позволило заключить, что вторая волна увеличения частоты МПКП вызвана поступлением кальция из наружной среды. Мы предполагаем, что генерализованная утечка кальция из Са2+-депо в аксоплазму терминали под действием тапсигарджина, о которой можно косвенно судить по первой волне прироста частоты МПКП, приводит к опустошению Са2+-депо и, как следствие, - открыванию особого типа каналов наружной мембраны - так называемых SOC (от англ. Store Operated Channels). Вход кальция по этим каналам, по-видимому, определяет вторую волну прироста частоты МПКП. Существование каналов SOC-или CRAC-типа (от aHni."Ca2+-Release Activated Ca2+-channels") предполагается во многих типах невозбудимых и возбудимых клеток (Bode, Netter, 1996; Smaili et al., 1998; Usachev, Thayer, 1999). Недавно возможность существования такого феномена описана Emptage и соавторами при рассмотрении эффектов тапсигарджина на нервных терминалях нейронов гиппокампа (Emptage et al., 2001). Возможность существования подобного феномена и в моторных терминалях млекопитающих описана нами впервые. Хотя для окончательного заключения о существовании таких каналов в терминалях мыши необходимы дальнейшие исследования

На фоне действия тапсигарджина нам удалось зарегистрировать выраженный прирост как квантового состава одиночных ТКП, так и амплитуд ТКП на фазе "плато" во всем исследованном диапазоне частот стимуляции нерва (4-100 Гц). В связи с тем, что на 30-45-ой минутах действия тапсигарджина возможно поступление Са2+ из наружной среды, обнаруженное потенциирующее действие тапсигарджина на этом этапе, по-видимому, связано именно со входом наружного кальция. Важно подчеркнуть, что вслед за потенцирующими эффектами тапсигарджина, - на 50-60-ой минуте его действия - происходил спад частоты МПКП, а также амплитуды и квантового состава ТКП ниже контрольных значений (до уровней, сопоставимых с эффектами полной блокады РиР рианодином). Таким образом, использованные нами разные способы фармакологического выключения из активности РиР, Са2+ -депо и высвобождения депонированного кальция привели к сходному конечному результату - снижению интенсивности и спонтанного, и вызванного выброса АХ.

Как видно из последней главы, мы исследовали также действие быстрого кальциевого буфера - ВАРТА-АМ на спонтанный и вызванный выброс АХ. ВАРТА-АМ - относительно новый в синаптологии фармакологический агент, позволяющий купировать быстрые изменения л .

Са ]в„. Показано, что ВАРТА-АМ оказывает выраженное тормозное действие как на одиночный вызванный выброс, так и на параметры начальной фасилятации (Бурнашев, 2000; Zucker, Regehr, 2002). Обнаруженные нами эффекты ВАРТА-АМ в отношении указанных параметров полностью согласуются с данными литературы. Так, мы зарегистрировали многократное (в 5 раз) уменьшение квантового состава одиночных ТКП и выраженное подавление (даже полное исчезновение) начальной фасилятации во всем исследованном диапазоне частот стимуляции диафрагмального нерва (4-100 Гц).

Представляло интерес выяснить, способен ли быстрый внутриклеточный кальциевый буфер (ВАРТА) «перехватывать» Са2+, поступающий не только из наружной среды по потенциалактивируемым Са2+-каналам, но и кальций, высвобождаемый из Са2+ -депо (под действием рианодина), и тем самым элиминировать облегчающее действие рианодина в отношении вызванного выброса на фазе "плато". Исследование эффектов рианодина как агониста РиР на фоне действия ВАРТА-АМ привело к парадоксальному результату. ВАРТА-АМ не только не блокировала облегчающее действие рианодина в виде увеличения амплитуды ТКП на фазе плато", но и позволила рианодину оказать еще более выраженное потенциирующее действие на параметры как одиночной, так и вызванной активности во всем диапазоне исследованных частот стимуляции нерва. Согласно литературным данным, под действием ВАРТА-АМ может происходить демаскирование работы Са2+-каналов L-типа в различных типах возбудимых клеток, в том числе - в нервных терминалях моторных синапсов (Urbano, Uchitel, 1999; Urbano et al., 2001). Поэтому мы предположили, что потенциирующее действие рианодина, наблюдаемое на фоне инкубации мышцы в ВАРТА-АМ, связано с активацией, растормаживанием Са2+-каналов L-типа и избирательным взаимодействием Са2+-тока, входящего по этим каналам, с РиР. Эксперименты, проведенные с использованием блокатора Са2+-каналов L-типа - верапамила, полностью подтвердили выдвинутую нами гипотезу. Действительно, верапамил устранял потенциирующее действие рианодина на фоне инкубации мышцы в ВАРТА-АМ во всем диапазоне исследованных частот стимуляции нерва (4-100 Гц).

В настоящее время вопрос о функциональном назначении L-типа Са2+-каналов в моторных терминалях млекопитающих остается открытым. Наши исследования поволяют предполагать, что их активность может быть специально связана с «кондиционированием» РиР (облегчением их перехода в открытое состояние) и загрузки кальцием Са2+-депо. Возможно, что именно вход кальция из внеклеточной среды по L-типу Са2+-каналов опосредует j I активацию РиР и Са -активируемый выброс депонированного кальция, который, в свою очередь, облегчает и спонтанную, и вызванную секрецию медиатора.

В целом, полученные в работе данные позволяют по-новому представить механизмы функционирования внутриклеточных кальциевых депо нервных терминалей. Показанная взаимосвязь кальция, высвобождаемого из Са2+ -депо, с Са2+- и К+Са-каналами наружной мембраны, а также секрецией квантов АХ, вынуждает пересмотреть классическую парадигму регуляции спонтанного и вызванного экзоцитоза медиатора лишь за счет поступления в терминаль наружного кальция. Очевидно, что выброс депонированного кальция может тонко регулировать и работу разных пулов каналов наружной мембраны, и машинерию экзоцитоза синаптических везикул, тем самым осуществляя разносторонний, многоуровневый контроль за спонтанной и вызванной секрецией медиатора.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Букия, Анна Нодаровна, Москва

1. Авдонин П.В., Ткачук В.А. Рецепторы и внутриклеточный кальций. // Москва: "Наука" 1994.

2. Балезина О.П. Сравнительная организация нервно-мышечных синапсов фазных скелетных мышц позвоночных // Усп. Физиол. Наук 1989 -Т.20(1), стр.68-89.

3. Балезина О.П. Роль внутриклеточных кальциевых каналов нервных терминалей в регуляции секреции медиатора // Усп. Физиол. Наук -2002 Т.ЗЗ(З), стр.38-56.

4. Балезина О.П., Сурова Н.В., Лаптева В.И. Кофеин- и рианодин-индуцированные изменения параметров спонтанного выброса медиатора в нервно-мышечном синапсе мыши // ДАН 2001 - Т.380, стр.435-437.

5. Балезина О.П., Сурова Н.В., Лаптева В.И. Эффекты кофеина на амплитуду и частоту миниатюрных потенциалов концевой пластинки в скелетной мышце мыши // Вест. МГУ 1999 - Т. 16(4), стр. 15-20.

6. Бурнашев С.И. Блокировать, чтобы усилить // Биол. Мемб. 2000 -Т.З, стр. 16-29.

7. Воронин Л.Л. Анализ пластических свойств центральной нервной системы // Тбилиси: Мецниереба 1982 - стр. 110-125.

8. Зефиров А.Л., Ситдикова Г.Ф. Ионные каналы нервного окончания // Усп. Физиол. Наук 2002 - Т.33(4), стр.3-33.

9. Коспок П.Г. Кальций и клеточная возбудимость // Москва: "Наука" -1986, стр.5-256.

10. Николлс Дж.Г., Мартин А.Р., Валлас Б.Дж., Фукс П.А. От нейрона к мозгу // Москва 2003 - стр.75-76.

11. Персон Р.С. Спинальные механизмы управления мышечным сокращением// М.: Наука 1985 стр. 15-110.

12. Рубцов A.M., Батрукова М.А. Кальциевые каналы (рианодиновые рецепторы) саркоплазматического ретикулума: структура и свойства // Биохимия 1997 Т.62(9), стр. 1091 -1105.

13. Сурова Н.В. Регуляция активности нервно-мышечных синапсов мыши внутриклеточным депонированным кальцием, мобилизуемым кофеином и рианодином // Москва: Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук 1999.

14. Adachi-Akahane S., Cleemann L., Morad M. Cross-signalling between L-type Ca channels and ryanodine receptors in rat ventricular myocytes // J.Gen.Physiol. 1996 - V.108, pp.435-454.

15. Adler E.M., Augustine G.F., Duffy S.N., Charlton M.P. Alien intracellular calcium chelators attenuate neurotransmitter release at the squid synapse // J. Neurosci. 1991 - V.l 1, pp.1496-1507.1. Л I

16. Akita Т., Kuba K. Functional triads consisting of ryanodine receptors, Ca channels, and Ca2+-activated K+ channels in bullfrog sympathetic neurons. Plastic modulation of action potential // J.Gen. Physiol. 2000 - V.l 16(5), pp.697-720.

17. Anderson L., Fruen В., Jordan R., Louis Ch., Gallant E. The action of perchlorate on malignant-hyperthermia-susceptible muscle // Eur. J. Physiol. 1997 - V.435, pp. 91-98.

18. Augustine G., Adler E., Charlton M., Hans M., Swandulla D., Zipser K. Presynaptic calcium signals during neurotransmitter release: detection with fluorescent indicators and other calcium chelators // J.Physiol.Paris 1992 -V.86(l-3), pp.129-134.

19. Auld D., Colomar A., Belair E-L., Castonguay A., Pinard A., Rousse I., Thomas S., Robitaille R. Modulation of neurotransmission by reciprocal synapse-glialinteractions at the neuromuscular junction // J. Neurocyt. -2003 V.32, pp.1003-1015.

20. Bardo S., Robertson В., Stephens G. Presynaptic internal Ca2+ stores contribute to inhibitory neurotransmitter release onto mouse cerebellar Purkinje cells // Br. J. Pharmacol. 2002 - V.137(4), pp.529-537.

21. Berridge M.J. Elementary and global aspects of calcium signaling // J. Physiol. 1997 - V.449(2), pp.291-306.

22. Berridge M.J., Irvine R.F. Inositol triphosphate: a novel second messenger in cellular signal transduction // Nature. 1984 -V.312, pp.315-321.

23. Betz W.J., Angleson J.K. Intraterminal Ca and spontaneous transmitter release at the frog neuromuscular junction // J.Neurophysiol. 2001 -V.85(l), pp.287-294.

24. Blaustein M.P., Ratzlaff R.W., Schweitzer E.S. Calcium buffering in presynaptic nerve terminals II. Kinetic properties of nonmitochondrial sequestration mechanism // J. Gen. Physiol. 1978 - V.72, pp.43-66.

25. Brain K.L., Bennet M.R. Calcium in sympathetic varicosities of mouse vas deferens during facilitation, augmentation and autoinhibition // J. Physiol. -1997 -V.502 (3), pp.521-536.

26. Castonguay A., Robitaille R. Differential regulation of transmitter release by presynaptic and glial Ca2+ internal stores at the neuromuscular synapse // Neurosci. -2001 V.21(6), pp.1911-1922.

27. Carter A.G., Vogt K.E., Foster K.A., Regehr W.G. Assessing the role of calcium-induced calcium release in short-term presynaptic plasticity at excitatory central synapses // J.Neurosci. 2002 - V.22(l), pp.21-8.

28. Cheng H., Lederer W., Cannel MB. Calcium sparks: elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle // Science -1993 V.262, pp.740-744.

29. David J., Barrett E. Stimulation-evoked increases in cytosolic Ca . in mouse motor nerve terminals are limited by mitochondrial uptake and are temperature-dependent// J.Neurosci. -2000 V.20(19), pp.7290-7296.

30. Del Castillo J., Katz B. Statistical factors involved in neuromuscular facilitation and depression // J. Physiol. 1954 - V.124(3), pp.574-585.

31. Durant N., Lee C., Katz R. The action of dantrolene on transmitter mobilization at the rat neuromuscular junction // Eur. J.Pharmacol. 1980- V.68(4), pp.403-408.

32. Ehrlich E., Kaftan E., Bezprozvannaya S., Bezprozvanny I. The pharmacology of intracellular Ca2+-release channels // Tr. Neurosci. (TINS)- 1994 V.15, pp.145-149.

33. Emptage N.E., Reid Ch.A., Fine A. Calcium stores in hippocampal synaptic1. Л Lboutons mediate short-term plasticity, store-operated Ca entry and spontaneous transmitter release // Neuron 2001 - V.29, pp. 197-208.

34. Elmquist D., Quastel D. A quantitative action of hemiholinium at the neuromuscular junction // J. Physiol. 1965 - V. 177(3), pp.463-482.

35. Flink M.T., Atchison W.D. Iberiotoxin-induced block of Ca -activated К channels induces dihydropyridine sensitivity of acetylcholine release from mammalian motor nerve terminals // J.Pharmacol. Exp. Ther. 2003 -V.305(2), pp.646-652.

36. Frandsen A., Schousboe A. Dantrolene prevents glutamate cytotoxicity and Ca"^ release from intracellular stores in cultured cerebral cortical neurons // J. Neurochem. 1991 - V.56(3), pp.1075-1078.

37. Fruen В., Mickelson J., Louis Ch. Dantrolene inhibition of sarcoplasmic reticulum Ca release by direct and specific action at skeletal muscle Ryanodine Receptor // J. Biol. Chem. 1997 - V.272(43), pp.26965-26971.

38. Galante M., Marty A. Presynaptic ryanodine-sensitive calcium stores contribute to evoked neurotransmitter release at the basket cell-Purkinje cell synapse // J.Neurosci. 2003 - V.23(35), pp.11229-11234.

39. Ginsborg B.L., Hirst G. The effects of adenosine on the release of the transmitter from the phrenic nerve of the rat // J. Physiol. (Lond.) 1972 -V.224, pp.629-645.

40. Gomez R.S., Guatimisim C., Barbosa J. Jr., Massensini A.R., Gomez M.V., Prado M.A. Halothane-induced intracellular calcium release in cholinergic cells // Brain Res. 2001 - V.921(l-2), pp. 106-114.

41. Henzi V., MacDermott A.B. Characteristics and function of Ca2+ and inositol 1,4,5-triphosphate-releasable stores of Ca2+ in neurons // Neurosci. -1992 -V.46, pp.251-274.

42. Heuser J.E., Reese T.S. Evidence for recycling of synaptic vesicles membrane during transmitter release // J. Cell. Biol. 1974 - V.57, pp.315344.

43. Hutter D.E., Burton P.R. Laveri L.A. Distribution and calcium-sequestering ability of smooth endoplasmic reticulum in olfactory axon terminals of frog brain // Neuroscie. 1987 - V.23, pp.371-386.

44. Irving A.J., Collingridge G.L., Schofield J.G. Interactions between1. Ca2+mobilizing mechanisms in cultured rat cerebellar granule cells // J. Physiol. -1992 V.456, pp.667-680.

45. Jackson Т., Patterson S., Thastrup O., Hanley M. A novel tumour promoter, thapsigargin, transiently increases cytoplasmic free Ca2+ withoutgeneration of inositol phosphates in NG115-401L neuronal cells // Biochem. J. 1988 - V.253, pp.81-86.

46. Капо M., Garaschuk O., Verkhratsky A., Konnerth A. Ryanodine receptor-mediated intracellular calcium release in rat cerebellar Purkinje neurones // J. Physiol. 1995 -V. 487(1), pp. 1-16.

47. Kashapova L.A., Moshkov D.A., Bezgina E.N. Active zones and plasticity of motor nerve terminals // In: "Plasticity of Motoneuronal Connections". A.Wernig (Ed.), Elsevier 1991 - V. 17, pp. 163-173.

48. Katz В., Miledi K. Further study of the role of calcium in synaptic transmittion // J. Physiol. 1970 - V.207(3), pp.789-801.

49. Kawai Т., Watanabe M. Effects of ryanodine on spike afterhyperpolarization in sympathetic neurons of the rat superior cervical ganglion // Pflug. Arch. 1989 - V.413, pp.470-475.

50. Kijima H., Tanabe N. Calcium-independent increase of transmitter release at frog end-plate by trinitrobenzene sulphonic acid // J. Physiol. 1988 -V.403, pp. 135-149.

51. Kiselyov K., Muallem S. Fatty acids, diacylglycerol, Ins(12,3,5)p3 receptors and Ca2+ -influx // TINS 1999 -V. 22(8), pp.334-337.

52. Kiselyov K., Shin D.M., Shcheynikov N., Kurosaki Т., Muallem S. Regulation of Ca -release-activated Ca current (Icrac) by ryanodine receptors in inositol 1,4,5-trisphosphate-receptor-deficient DT40 cells // Biochem. J. 2001 - Nov 15;360(1), pp.17-22.

53. Koizumi S., Bootman M.D., Bobanovic L.K., Schell M.J., Berridge M-, Lipp P. Characterization of elemntary Ca release signals in NGFdifferentiated PC-12 cells and hyppocampal neurons // Neuron. 1999 -V.22, pp.125-137.

54. Konnerth A., Dreessen J., Augustine G.J. Brief dendritic calcium signals initiate long-lasting synaptic depression in cerebellar Purkinje cells // PNAS- 1992 V.89, pp.7051-7055.

55. Kuba K. Ca2+-induced Ca2+ release in neurones // Jap. J. Physiol. -1994 -V.44, pp.613-650.

56. Kuba K. Release of calcium ions linked to the activation of potassium conductance in caffeine treated sympathetic neurons // J. Physiol. 1980 -V.298, pp.251-259.

57. Kuba K., Nishi S. Rhythmic hyperpolarizations and depolarization of sympathetic ganglion cells induced by caffeine // J. Neurophysiol. 1976 -. V.39, pp.547-563.

58. Langeron O., Coirault C., Fratea S., Orliaguet G., Coriat P., Riou B. Effects of dantrolene on the diaphragm muscle of the normal and myopathic hamster//Br. J. Anasthes. 1998 - V.81(4), pp.553-555.

59. Lee H.C. Mechanisms of calcium signalling by cyclic ADP-ribose and NAADP // Physiol. Rev. 1997 - V.77, pp.1133-1164.

60. Li Zh., Hatton G. Ca** release from internal stores: role in generating depolarizing after-potentials in rat supraoptic neurons // J. Physiol. 1997 -V.498(2), pp.339-350.

61. Liang Y., Yuan Li-L., Jonston D., Gray R. Calcium signaling at single mossy fiber presynaptic terminals in the rat hippocampus // J. Neurophysiol.- 2002 V.87(2), pp.l 132-1137.

62. Lipscombe D., Madison D.V., Poenie M., Reuter H., Tsien R.W., Tsien R.Y. Imaging of cytosolic Ca2+ transients arising from Ca2+ stores and Ca2+ channels in sympathetic neurons // Neuron. 1988- V.l, pp.355-365.

63. Lipscombe D., Madison D.V., Poenie M., Reuter H., Tsien R.W., Tsien R.Y. Spatial distribution of calcium channels and cytosolic calcium transients in growth cones and cell bodies of sympathetic neurons // PNAS 1988 - V.85, pp.2398-2402.

64. Liu G. Presynaptic control of quantal size: kinetic mechanisms and implications for synaptic transmission and plasticity // Curr. Opin. Neurobiol. 2003 - V.13(3), pp.324-331.

65. Llano I., Gonzalez J., Caputo C., Lai F., Blayney L., Tan Y., Marty A. Presynaptic calcium stores underlie large-amplitude miniature IPSCs and spontaneous calcium transients // Nat.Neurosci. 2000 - V.3(12), pp. 12561265.

66. Llinas R.R., Sugimori M., Silver R.B. Microdomains of high calcium concentration in presynaptic terminal // Science. 1992 - V.256, pp.677679.

67. Losavio A., Muchnik S. Spontaneous acetylcholine release in mammalian neuromuscular junctions // Amer. Physiol. Soc. 1997 - V.273(6/l), pp.1835-1841.

68. Magleby K.L., Zengel J.E. A quantitative description of tetanic and post-tetanic release at the frog neuromuscular junction // J. Physiol. 1975 -V.245, pp. 183-208.

69. Magleby K.L., Zengel J.E. Long-term changes in augmentation potentiation and depression of transmitter release as a function of repeated activity at the frog neuromuscular junction // J. Physiol. 1976 - V.257, pp.471-494.

70. Martinez-Serrano A., Satrustegui J. Caffeine-sensitive calcium stores in presynaptic nerve endings: a physiological role // Biochem. and Biophys. Res. Communic. -1989-V. 161(3), pp.965-971.

71. McGarry S.J., Williams A. Digoxin activates sarcoplasmic reticulum Ca -release channels: a possible role in cardiac inotropy // Brit. J. Pharmacol. -1993 V.108, pp.1043-1050.

72. McGraw C.F., Somlyo A.U., Blaustaein M.P. Localization of calcium in presynaptic nerve terminals // J. Cell. Biol. 1980 - V.85, pp.228-241.

73. Meissner G. Ryanodine receptor/Ca release channels and their regulation by endogenous effectors //Ann. Rev. Physiol. 1994 - V.56, pp.485-508.

74. Melamed N., Helm P.J., Rahamimoff R. Confocal microscopy reveals coordinated calcium fluctuations and oscillations in synaptic boutons // J. Neurosci. 1993 - V.l3 (2), pp.632-649.

75. Melamed N., Kachalsky S., Kaizerman, R.Rahamimoff .Neuronal calcium sparsks and intracellular calcium "noise" //pnas- 1999- v.96(26), pp. 15217-15221.

76. Melzer W., Herrmann-Frank A., Ltittgau H.Ch. The role of Ca2+ ions in excitation-contraction coupling of skeletal muscle fibres // Biochim. Biophys. Acta. 1995 - V.l241, pp.56-116.

77. Mikkelsen E., Thastrup O., Christensen S. Effects of thapsigargin in isolated rat thoracic aorta // Farmakol. Toksikol.(Mosc.) 1988 - V.62, pp.7-11.

78. Miller R. The control of neuronal Ca homeostasis // Progr. Neurobiol. -1991 V.37, pp. 255-285.•ji

79. Mironov S.L. Mechanisms of Ca mobilization in chick sensory neurons // NeuroReport. 1994 - V.5, pp.445-448.

80. Mironov S.L., Usachev Y.M. Caffeine affects Ca2+ uptake and Ca2+a release from intracellular stores // Neurosci. Lett. 1991 - V.l23, pp.200-202.

81. Mitra P., Slaughter M. Calcium-induced transitions between the spontaneous miniature outward and the transient outward currents in retinal amacrine cells // J.Gen.Physiol. 2002 - V.l 19(4), pp.373-88.

82. Morita K., Barret E.F. Evidens of two calcium-dependent potassium conductances on lizard motor nerve terminals // J. Gen Physiol. 1990 -V.10(8), pp.2614-2625.

83. Moyer M., van Lunteren E. Effect of phasic activation on endplate potential in rat diaphragm // J. Neurophysiol. 1999 - V.82(6), pp.3030-40.

84. Narita K., Akita Т., Hashisuka J., Huang S.-M., Ochi K., Kuba K. Functional coupling of Ca Channels to Ryanodine Receptors at Presynaptic Terminals // J. Gen. Physiol. 2000 - V.l 15, pp.519-532.

85. Narita K., Akita Т., Osanai M., Shirasaki Т., Kijima H., Kuba K. A Ca2+• 2+ • ♦ ■induced Ca release mechanism involved in asynchronous exocytosis atfrog motor nerve terminals // J. Gen. Physiol. 1998 - V.112(5), pp.593609.

86. Naves L.A., Van der Kloot W. Repetitive nerve stimulation decreases the acetylcholine content of quanta at the frog neuromuscular junction // J. Physiol. 2001 - V.532(3), pp.23-31.

87. Neher E. Vesicle Pools and Ca2+ Microdomains: New tools for Understanding Their Roles in Neurotransmitter Release // Neuron 1998 -V.20, pp.389-399.

88. Nelson M., Cheng H., Rubart L., Santana A., Bonev H., Knot H., Lederer H. Relaxation of arterial smooth muscle by Ca2+ -sparks // Science 1995 -V.270, pp.633-637.

89. Nilius B. Store-operated Ca2+ entry channels: still elusive! // Sci. STKE -2004 V.243, pe36.

90. Parducz A., Toldi J., Joo F., Siklos L., Wolff J.R. Transient increase of calcium in pre- and postsynaptic organelles of rat superior cervical ganglion after tetanizing stimulation // Neurosci. 1987 - V.23, pp. 1057-1061.

91. Parekh A. Neuronal Ca signalling: pathways and targets // Trends Neurosci. 2001 - V.24(7), pp.369-70.

92. Parekh A.B., Penner R. Store depletion and calcium influx // Physiol. Rev. -1997 V.77, pp.901-930.

93. Parness J., Palnitkar S. Identification of dantrolene binding sites in porcine skeletal muscle sarcoplasmic reticulum // J. Biol. Chem. 1995 -V.270(31), pp.18465-18472.

94. Parsons St.M., Prior Ch., Marshallt I.G. Acetylcholine transport, storage and release // Int. Rev. of Neurobiol. 1993 - V.35, pp.279-347.

95. Peng Y. Ryanodine-sensitive component of calcium transients evoked by nerve firing at presynaptic nerve terminals // J. Neurosci. 1996 - V.l, pp.6703-6712.

96. Penner R., Fleig A. Store-operated calcium entry: a tough nut to CRAC // Sci. STKE 2004 - V.243, pe38.

97. Piriz J., Rosato S., Pagani R., Uchitel O. Nifedipine-mediated mobilization of intracellular calcium stores increases spontaneous neurotransmitter release at neonatal rat motor nerve terminals // JPET -2003- V.l03, pp.515524.

98. Pozzan Т., Voipe P., Rizzuto R., Meldolesi J. Molecular and cellular physiology of intracellular calcium stores // Physiol. Rev. 1994 - V.74, pp.595-636.

99. Publicover S. The effect of dantrolene on tetanic potentiation of MEPP frequency in EGTA containig salines // Brain Res. 1982 - V.253, pp.321324.

100. Putney J.W., McKay R.R. Capacitative calcium entry channels // Bioessays. 1999 - V.21(l), pp.38-46.

101. Robitaille R., Garsia M., Karczorowski D., Charlton M. Functional colocalization of calcium and calcium gated potassium channels in control of transmitter release // Neuron 1993 - V. 11, pp.645-655

102. Roed A. Caffeine-induced blockade of neuromuscular transmission and its reversal by dantrolene sodium // Eur. J. Pharmacol. 1982 - V.83, pp.8390.

103. Rosato S., Uchitel O. Calcium channels coupled to neurotransmitter release at neonatal rat neuromuscular junctions // J.Physiol. 1999 - V.514(2), pp.533-540.

104. Sah P. Ca -activated К currents in neurons: types, physiological roles and modulation // TINS -1996 V.l 1, pp. 150-154.

105. Satin L.S., Adams P.R. Spontaneous minituare outward currents in cultured bullfrog neurons // Brain. Res. 1987 - V.401, pp.331-339.

106. Saiki Y., Ikemoto N. Coordination between Ca release and subsequent re-uptake in the sarcoplasmic reticulum // Biochem. 1999 -V.38(10), pp. 3112-3119.

107. Savic N., Sciancalepore M. Intracellular calcium stores modulate miniature GABA-mediated synaptic currents in neonatal rat hippocampal neurons // Eur. J. Neurosci. 1998 - V. 10(11), pp.3379-86.

108. Sengupta C., Meyer U.A., Carafoli E. Binding of dantrolene sodium to muscle intracellular membranes // FEBS Lett. 1980 - V.l 17(1), pp.37-38.

109. Schwartz A., Whitacre C.L., Wilson D. Do ryanodine receptors regulate transmitter release at the neuromuscular junction of the rat? // Neurosci. Letter 1999 - V.274, pp. 163-166.

110. Sharma G., Vijayaraghavan S. Modulation of presynaptic store calcium induces release of glutamate and postsynaptic firing // Neuron 2003 -V.38, pp.929-939.

111. Silinsky E.M. The biophysical Pharmacology of Calcium-Dependent Acetylcholine Secretion // Pharmacol. Rev. 1985 - V.37 (1), pp.81-131.

112. Simkus C., Strieker C. The contribution of intracellular calcium stores to mEPSCs recorded in layer II neurones of rat barrel cortex // J.Physiol. -2002 V.545(2), pp.521-535.

113. Simpson P.B., Challiss R.A.J., Nahorski S.R. Neuronal Ca stores: activation and function // TINS 1995 - V.l8, pp.299-306.

114. Sitsapesan R., McGarry S., Williams A.J. Cyclic ADP-rybose, the ryanodine receptor and Ca2+ -release // TIPS 1995 - V.16, pp.386-391.

115. Smaili S.S., Cavalcanti P.M., Oshiro M.E., Ferreira A.T., Jurkiewicz A. Ca release-activated channels in rat stomach smooth muscle cells // Eur. J. Pharmacol. 1998 - V.342(l), pp.119-22.

116. Smith A.B., Cunnan T.C. Ryanodine-sensitive calcium stores involved in neurotransmitter release from sympathetic nerve terminals of the guinea-pig // J. Physiol. (Lond.) 1996 -V.493(3), pp.657-664.

117. Smith S.J., MacDermott A.B., Weight F.F. Detection of intracellular Ca2+ transients in sympathetic neurons using arsenazo III // Nature. 1983 - V. 304, pp.350-352.

118. Snyder H.R, Davis C.S, Bickerton R.K., Halliday R.P. l-(5-arylfurfurylidene)amino.hydantoins. A new class of muscle relaxants // J. Med. Chem.- 1967-V.l 0(5), pp.807-810.

119. Statham H.E., Duncan C.J. The action of ionophores at the frog neuromuscular junction // Life Sci. 1975 - V.l 7, pp. 1401-1406.

120. Stocker M. Ca2+-activated K+-channels: molecular determinants and function of the SK family // Neurosci. 2004 - V.5, pp.758-770.

121. Strayer D.S., Hoek J.B., Thopmas A.P., White M.K. Cellelar activation byj I

122. Ca release from stores in the endoplasmic reticulum but not by increased free Ca2+ in the cytosol // Biochem. J. 1999 - V.344, pp.39-46.

123. Sun Z.-P., Schlichter L., Stanley E.F. Single-channel properties of BK-type calcium-activated potassium channels at cholinergic presynaptic nerve terminal // J. Physiol. 1999 - V.518(3), pp.639-651.

124. Sun X.-P., Yazejian В., Grinell A.D. Electrophysiological properties of BK-channels in Xenopus motor nerve terminals // J. Physiol. 2004 - V.557(l), pp.207-228.

125. Sutko J.L., Airey J.A. Ryanodine receptor Ca2+ release channels: does diversity in form equal diversity in function? // Physiol. Rev. 1996 - V.76, pp. 1027-1071.

126. Suzuki S., Osanai M., Murase M., Suzuki N., Ito K., Shirasaki Т., Narita K., Ohnuma K., Kuba K., Kijima H. Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal // Pflugers Arch. 2000 - V.440(3), pp.351-365.

127. Takemura H., Hughes A., Thastrup O., Putney J. Activation of calcium entry by the tumor promoter thapsigargin in parotid acinar cells // J. Biol. Chem. 1989 - V.246(21), pp. 12266-12271.

128. Tanabe N., Kijima H. Ca2+-dependent and -independent components of transmitter release at the frog neuromuscular junction // J.Physiol. 1992 -V.455, pp.271-289.

129. Tareilus E., Breer H. Presynaptic calcium channels: pharmacology and regulation // Neurochem. Int. 1995 - V.26(6), pp.539-558.

130. Thesleff S., Molgo J. A new type of transmitter release at the neuromuscular junction // Neurosci. 1983 - V.9(l), pp. 1-8.

131. Tsien R.Y. New calcium indicators and buffers with high selectivity against magnesium and protons: design, synthesis and properties of prototype structure // Biochem. 1980-V. 19, pp.2396-2404.

132. Tsien R.W., Tsien R.Y. Calcium channels, stores and oscillations // Rev. Cell. Biol. 1990 -V.6, pp.715-760.

133. Urbano F.J., Depetris R., Uchitel O.D. Coupling of L-type calcium channels to neurotransmitter release at mouse motor nerve terminals // Pflug. Arch. (Eur. J. Physiol.)-2001 V.441, pp.824-831.

134. Urbano FJ, Uchitel O.D. L-type calcium channels unmasked by cell1. Л Ipermeant Ca buffer at mouse motor nerve terminals // Pflug. Arch. (Eur J. Physiol.) 1999 - V.437, pp.523-528.

135. Usachev Y.M., Thayer S.A. Ca2+ influx in resting rat sensory neurones that* * 2+regulates and is regulated by ryanodine-sensitive Ca stores // J. Physiol. -1999 V.519(1), pp.l 15-30.

136. Van der Kloot W. The regulation of quanta! size // Prog. Neurobiol. 1991- V.36(2), pp.93-130.

137. Van der Kloot W. Loading and recycling of synaptic vesicles in the Torpedo electric organ and the vertebrate neuromuscular junction // Prog. Neurobiol.- 2003 V.71(4), pp.269-303.

138. Van der Kloot W., Benjamin W.B., Balezina O.P. Calcitonin gene-related peptide acts presynaptically to increase quantal size and output at frog neuromuscular junctions // J. Physiol. 1998 - V.507(3), pp.689-695.

139. Van der Kloot W., Molgo J. Quantal acetylcholine release at the vertebrate neuromuscular junction // Physiol. Rev. 1994 - V.74(4), pp.899-991.

140. Wilson D.F. Effects of caffeine on neuromuscular transmission in the rat // Am. J. Physiol. 1973 - V.225, pp.862-865.

141. Yazejian В., Dgregorio D.A., Vergara J.L., Poage R.E., Meriney S.D.,

142. Grinell A.D. Direct measurments of presynaptic calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses // J. Neurosci. 1997 - V.9, pp.2990-3001.1. Л 1

143. Yazejian В., Sun X.-P., Grinnell A. Tracking presynaptic Ca dynamics during neurotransmitter release with Ca -activated К channels II Nature Neurosci. 2000 - V.3(6), pp.566-571.

144. Znao F, Li P, Chen S.R, Louis C.F, Fruen B.R. Dantrolene inhibition of ryanodine receptor Ca2+ release channels: molecular mechanism and isoform selectivity // J.Biol. Chem. 2001 - V.276(17), pp. 13810-13816.

145. Zorzato F., Fujii J., Otsu K., Phillips M., Green N.M. Molecular cloning of cDNA encoding human and rabbit forms of Ca2+ release channel (ryanodine receptor) of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum // J. Biol.Chem. 1990- V.265, pp.2244-2256.

146. Zucker P.S. Changes in statistics of transmitter release during facilitation // J. Physiol. 1973 - V.229, pp.787-810.

147. Zucker R. Exocytosis: a molecular and physiological perspective // Neuron- 1996 -V. 17, pp. 1049-1105.

148. Zucker R., Regehr W. Short-term synaptic plasticity // Ann.Rev.Physiol. -2002 V.64, pp.355-405.

149. Zucchi R., Ronca-Testoni S. The sarcoplasmic reticulum Ca channels/ryanodine receptor: modulation by endogenous effectors, drugs and deseas states // Pharm. Rev. 1997 - V.49, pp. 1-50.

Информация о работе

Букия, Анна Нодаровна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.13

Диссертация

Роль кальция, высвобождаемого из внутриклеточных кальциевых депо, в регуляции выброса медиатора в моторных синапсах мыши - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы