Разнонаправленное действие кальция, высвобождаемого из Ca2+-депо, на квантовую секрецию медиатора

Лаптева, Валентина Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разнонаправленное действие кальция, высвобождаемого из Ca2+-депо, на квантовую секрецию медиатора
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Разнонаправленное действие кальция, высвобождаемого из Ca2+-депо, на квантовую секрецию медиатора"

На правах рукописи

ЛАПТЕВА ВАЛЕНТИНА ИВАНОВНА

РАЗНОНАПРАВЛЕННОЕ ДЕЙСТВИЕ КАЛЬЦИЯ, ВЫСВОБОЖДАЕМОГО ИЗ Са2+-ДЕПО, НА КВАНТОВУЮ СЕКРЕЦИЮ МЕДИАТОРА

03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова (заведующий - академик РАМН И.П. Ашмарин)

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

- доктор биологических наук, профессор О.П. Балезина ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

- член-корреспондент РАН, доктор биологических наук JI.M. Чайлахян

- доктор биологических наук A.C. Пивоваров

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Российский Университет Дружбы Народов

Защита диссертации состоится 27 февраля 2006 года в 1530 на заседании диссертационного ученого совета Д 501.001.93 биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д.1, корп. 12, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 27 января 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

Б.А.Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рассмотрение роли кальция как триггера и регулятора секреции медиатора является одной из центральных проблем современной синаптологии. Особый интерес вызывает чувствительность процессов секреции медиатора к кальцию, высвобождаемому из внутритерминалышх Са2+-депо - цистерн гладкого эндоплазматического ретикулума (ГЭР) (Berridge, 1997; Балезина, 2002; Bardo et al., 2003; Verkhratsky, 2005). В терминалях синапсов описаны цистерны ГЭР, способные выбрасывать ионы кальция в аксоплазму через специальные Са2+-каналы - рианодиновые рецепторы (РиР) (Peng, 1996; Narita et al., 2000; Bouchard et al., 2005; Kubota et al., 2005). Выброс депонированного Ca2+ через каналы РиР запускается повышением уровня кальция в аксоплазме, а также действием специфических активаторов РиР - кофеина, рианодина, дигоксина и др.. Каким образом активация РиР и следующий за ней выброс депонированного кальция отражается на спонтанной и вызванной секреции медиатора, остается во многом не ясным.

Известно, что наружный кальций, поступающий в терминаль по потенциал-активируемым Са2+-каналам, усиливает вызванную и спонтанную секреции квантов медиатора (Katz, Miledi, 1970; Zucker, 1996; Neher, 1998). Выброс депонированного кальция из цистерн ГЭР синаптических терминалей, также, по данным литературы, может приводить к подъему цитоплазматического кальция и увеличению секреции медиатора (Fossier et al., 1999; Emptage et al., 2001). В частности, в нервно-мышечных синапсах скелетных мышц описаны пресинаптические РиР (Narita et al., 2000; Castonguay, Robitaille, 2001; Kubota et al., 2005). Их активация - при определенных условиях - может увеличивать внутриклеточный Са2+-сигнал, уровень спонтанной и вызванной секреции квантов ацетилхолина (АХ) (Nishimura et al., 1990; Narita et al., 2000; Балезина, 2002; Балезина, Букия, 2005). Однако во многих возбудимых структурах - в соме нейронов, в сердечных, гладкомышечных и других клетках выброс Са2+ из цистерн ГЭР способен играть двоякую роль: как усилителя внутриклеточного кальциевого сигнала, так и его ограничителя - путем торможения входящего в клетку потока наружного кальция (Nelson et al., 1995; Liang et al., 2002; Flink, Atchison, 2003). Тормозный эффект обычно обусле^юкгвовж^^г^яСа2+-зависимых К^-каналов либо инактивацией Са2+-каналоветярушвговКАембрр1Ш

] ¡TStUtj

за счет прицельного действия на них кальция, высвобождаемого из примембранных цистерн ГЭР (Nelson et al., 1995; Sah, 1996; Sham, 1997; Schwartz et al., 1999; Urbano et al., 2001; Bondarenko et al., 2004). Какой из противоположных эффектов будет преобладать (облегчение либо торможение Са2+ сигнала), зависит от числа и типа активируемых РиР, потока входящего кальция и ряда других причин (Kuba, 1997; Sah, McLachlan, 1991; Akita et al., 2000; Bondarenko et al., 2004; Bolton, 2006).

В терминалях синапсов возможность разнонаправленных воздействий на Са2+-сигнал и процессы секреции медиатора со стороны внутриклеточно высвобождаемого кальция до сих пор не описана. Выявление таких разных по знаку влияний способствует расширению современных представлений о механизмах Са2+-зависимой регуляции синаптической передачи.

Дели и задачи исследования. Целью работы было обнаружение и анализ механизмов, обеспечивающих разнонаправленные изменения интенсивности квантовой секреции АХ (ее усиление либо торможение) при выбросе ионов Са2+ из рианодин-чувствительных Са2+-депо в моторных синапсах мыши.

В связи с поставленной целью решались следующие конкретные задачи:

1. Исследовать изменения режима спонтанной секреции АХ путем регистрации МПКП в нервно-мышечных синапсах диафрагмы мыши, в условиях воздействия на терминали рианодина (стимулятора выброса Са2+ из Са2+ -депо терминали). Сопоставить эффекты рианодина при разных режимах кальциевой нагрузки терминали, создаваемых путем градуальной калиевой деполяризации терминали и варьирования наружной концентрации кальция.

2. Исследовать участие разных типов кальциевых и калиевых каналов в реализации облегчающих и тормозных воздействий рианодина на частоту МПКП при разных уровнях деполяризации терминали.

3. Сопоставить изменения режимов спонтанной секреции квантов АХ, вызываемых разными по механизму и спектру действия активаторами РиР рианодина (взаимодействующего с 1, 2, 3-им типами РиР) и дигоксина (активатора РиР 2-го типа).

частоты залпа и кальциевой нагрузки терминалей - у кураризированного и у рассеченного нервно-мышечного препарата диафрагмы мыши.

Новизна полученных результатов. В работе экспериментально показан важный новый факт - выброс депонированного кальция под действием активаторов пресинаптических РиР может сопровождаться не только усилением, но и снижением уровня спонтанной либо вызванной секреции квантов АХ. Впервые описаны условия и механизмы, при которых преобладают облегчающие, либо тормозные воздействия со стороны внутриклеточно высвобождаемого кальция на выброс квантов АХ.

Показано, что кальций-индуцированный выброс депонированного кальция в терминали может действовать как система отрицательной обратной связи, притормаживая поток наружного кальция (и прирост уровня квантовой секреции АХ) путем прицельного воздействия на низкопроводящие (чувствительные к апамину) кальций-активируемые калиевые каналы наружной мембраны терминали.

Новыми являются полученные в работе данные об участии Са2+-каналов Ь-типа в кальциевой нагрузке терминали в условиях покоя и при небольших уровнях деполяризации терминали. Впервые установлено, что вход кальция по Ь-типу Са2+ каналов может быть прицельно предназначен для активации выброса депонированного кальция из рианодин-чувствительпых Са2+-депо.

В моторных синапсах мыши впервые описана способность дигоксина (активатора РиР 2-го типа) вызывать разнонаправленные изменения частоты МПКП, а также модулировать уровень вызванной секреции АХ в залпе. Впервые показано, что эти пресинаптические модуляторные эффекты дигоксина предотвращаются блокадой РиР.

Положения, выносимые на защиту.

1. В нервно-мышечных синапсах диафрагмы мыши выброс депонированного кальция из рианодин-чувствительных Са2+-депо может, в зависимости от условий и режима работы синапса, вызывать как облегчение, так и торможение спонтанной и вызванной секреции квантов медиатора АХ.

2. В реализации облегчающего действия рианодина на секрецию АХ может участвовать вход Са2+ по Ь- и Р/С>-типам потенциалзависимых Са2+-каналов;

в реализации тормозных эффектов - блокада Са2+-каналов L-типа и активация апамин-чувствительных К+Са каналов нервной терминали. 3. В моторных синапсах мыши дигоксин (ЗнМ), избирательный активатор РиР 2-го типа, может вызывать разнонаправленные изменения спонтанной секреции, сходные по условиям и характеру реализации с действием рианодина.

Научно-практическая значимость работы. Полученные в работе новые данные о способности депонированного кальция, высвобождаемого из рианодин-чувствительных Са2+-депо, разнонаправленно воздействовать на режим спонтанной и вызванной активности моторных синапсов существенно расширяют современные представления о существующих в моторных терминалях разных источниках кальция, влияющих на выброс медиатора. Проведенная работа позволяет яснее представить место такого феномена, как Са2+-зависимый выброс кальция, в регуляции процессов секреции АХ в моторных синапсах. В результате проведенных исследований получены новые важные сведения о участии РиР разных типов и выбрасываемого через них депонированного кальция не только в контроле секреции АХ, но и активности Са2+-зависимых К+-каналов наружной мембраны. Научную ценность представляет выявленная у сердечного гликозида дигоксина способность в низких наномолярных концентрациях облегчать вызванный выброс АХ в периферических синапсах мыши за счет избирательной активации пресинаптических РиР 2-го типа. Обнаруженные в работе факты эффективной модуляции режимов секреции медиатора под действием рианодина и дигоксина имеют не только общефизиологическое научное значение, но могут быть использованы и при разработке новых средств фармакологической коррекции нарушений нервно-мышечной передачи.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на Международном симпозиуме «Synaptic transmission - 100 years after L. Luciani» (Рим, Италия, 2000), на XVIII Съезде физиологов России (Казань, Россия, 2001), на XIX Съезде физиологов России (Екатеринбург, Россия, 2004, а также на международных и всероссийских конференциях.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано одиннадцать печатных работ, в том числе 5 статей в российских изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора о роли кальциевых депо и выброса депонированного кальция в регуляции активности синапсов, описания методов исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (133 ссылки, в том числе 118 зарубежные работы). Диссертация содержит 118 страниц машинописного текста, в том числе - 41 рисунок.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для исследований спонтанной и вызванной синаптической активности в моторных синапсах млекопитающих в качестве объекта была выбрана диафрагмальная мышца мыши (m. diaphragma), получающая иннервацию от диафрагмального нерва (и. phrenicus).

Для работы выделяли левую часть диафрагмы с подходящим к ней нервом, изолированный препарат размещали в экспериментальной камере, заполненной оксигенированным физиологическим раствором Лайли для теплокровных следующего состава (мМ): NaCl - 135; КС1 - 4; NaH2P04 - 0,9; СаС1г - 2,0; MgC^ - 1; NaHCOj - 16,3; глюкоза - 11. Раствор аэрировался карбогеном (95% 02/ 5% С02), рН раствора - 7,2-7,4.

Мышцу фиксировали на полимерной подложке, расположенной на дне камеры. Эксперименты выполнялись при комнатной температуре (20°С). В течение всего эксперимента камеру перфузировали оксигенированным раствором Лайли (скорость перфузии 3-5 мл/мин), в который добавляли исследуемые вещества.

Для внутриклеточной регистрации синаптических потенциалов применяли стеклянные микроэлектроды, с диаметром кончика порядка 0,1мкм и сопротивлением 10-15 МОм. Миниатюрные потенциалы концевой пластинки (МПКП) и вызванные потенциалы концевой пластинки (ПКП) регистрировали при помощи микроэлектрода, вводимого в область постсинаптической мембраны мышечного волокна.

Эксперименты проводили по методу набора контрольной и опытной выборок из независимых синапсов, регистрировали 100 и более МПКП в каждом синапсе.

Данные записывали на жесткий диск компьютера при помощи АЦП DigiLine с интерфейсом Digiscope, затем обрабатывали с использованием программного обеспечения MiniAnalysis (Synaptosoft, USA) и Microsoft Excel. Анализировали частоту миниатюрных потенциалов концевой пластинки.

Вызванную активность синапса проводили путем внутриклеточной регистрации потенциалов концевой пластинки (ПКП). Эксперименты проводили используя 2 модели: рассеченный изолированный препарат m.diaphragma-n.phrenicus (мембранный потенциал рассеченных мышечных волокон диафрагмы составлял -60 - -50мВ); частично кураризированный нервно-мышечный препарат (препарат перфузировали раствором Лайли, содержащим d-тубокурарин в концентрации 1-2мкМ).

Для непрямого раздражения мышцы (в обоих случаях) использовали стимуляцию нерва импульсами длительностью 0,1-0,2 мс с частотой 0,3, 4, 7 и 50Гц. Стимуляцию нерва с частотой 0,3Гц использовали для регистрации одиночных 11КГ1 (Каменская, 1972). Стандартно регистрировали по 50-100 ПКП в каждом синапсе. Анализируемыми параметрами были: амплитуда, временной ход и квантовый состав ПКП при одиночном раздражении, а также - рисунок залповой активности (облегчение, депрессия и фаза плато ПКП) при ритмической стимуляции. При залповой активности использовали режимы ритмической стимуляции диафрагмального нерва (50 стимулов) частотами 4,7 и 50Гц.

Достоверность различий между выборками оценивали по t-критерию Стьюдента (в случае нормального распределения) и критерию Манн-Уитни. Использовали уровень значимости отличий между двумя выборками, равный 0,05.

В работе использовали самцов белых лабораторных беспородных мышей весом 20-30г.

В экспериментах применяли следующие фармакологические препараты: d-тубокурарин, кофеин; рианодин; дигоксин; блокаторы кальциевых каналов - верапамил, й-ага-токсин; блокатор кальций- активируемых калиевых каналов - апамин. Все препараты получены от фирм Sigma или Biomedicals.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. ДЕЙСТВИЕ ДИГОКСИНА И РИАНОДИНА НА РЕЖИМ СПОНТАННОЙ СЕКРЕЦИИ МЕДИАТОРА

В первой серии опытов исследовали изменения спонтанной секреции квантов АХ (в виде частоты МПКП) на фоне действия двух разных по механизму и спектру действия активаторов РиР - рианодина и дигоксина. Рианодитт, по данным литературы, взаимодействует с предварительно открытым каналом РиР, переводя его в долговременное открытое (полупроводящее) состояние, что сопровождается медленной и продолжительной утечкой кальция из цистерн ГЭР в аксоплазму (Ehrlich et al., 1994; Hui, 2004). Дигоксин, более известный как блокатор активности NaVK^-АТФазьт клетки (Катцунг, 1997), был использован нами в низких (наномолярных) концентрациях, при которых он не оказывает блокирующего действия на ам-изоформы №+/К+-АТФазы, и вместе с тем, способен, проникая через мембрану клетки, избирательно активировать РиР второго типа (РиР2), что также сопровождается высвобождением депонированного кальция (McGarry, Williams, 1993; Sagawa et al., 2002).

1.1. Изменения частоты МПКП интактных синапсов па фоке рианодииа и дигоксина.

Среднее значение мембранного потенциала (МП) мышечных волокон диафрагмы мыши в постсинаптической области составляло 72,0±2мВ. Частота спонтанных МПКП у интактных моторных синапсов диафрагмы в контроле, в среднем, составляла 0,92±0,02Гц (n=12, m=78) (т - количество опытов, п - количество зарегистрированных синапсов). Влияние дигоксина на частоту МПКП. При действии дигоксина (ЗнМ) не наблюдали достоверных изменений МП мышечных волокон на всем протяжении эксперимента (-71,8±1,2мВ). При этом дигоксин повышал среднюю частоту МПКП в 2 раза (от 0,83±0,05 в контроле до 1,68±0,16 на фоне дигоксина (т=5, п=59, р<0,001). Предварительная блокада РиР высокими дозами рианодина (20мкМ) полностью предотвращала облегчающее действие дигоксина на частоту МПКП (частота составила 0,85±0,14Гц на фоне дигоксина и 0,83±0,05Гц в контроле (т=3, п=42).

Влияние рианодииа на частоту IVlllKII. Аппликация рианодина в низкой концентрации (0,5мкМ) на мышцу в течение 30 минут не вызывала достоверных изменений частоты МПКП по сравнению с контролем (0,92±0,02Гц - в контроле, 1,11±0,17Гц - при действии рианодина (т=3, п=32)). Отсутствие облегчающего эффекта, по-видимому, было связано со спецификой действия рианодина, для проявления эффектов которого нужна предварительная активация РиР ионами кальция (Ehrlich et al., 1994; Sitsapesan et al., 1995, Nishimura et al., 1990).

1.2. Действие рианодина и дигоксина на частогу МИ КМ при изменении кальциевой нагрузки терминалей.

В данном разделе работы проводился анализ изменений частоты МПКП волокон диафрагмы мыши под действием рианодина (0,5мкМ) и дигоксина (ЗнМ) на фоне предварительной дополнительной «кальциевой нагрузки» терминалей. Дополнительную Са2+-нагрузку терминалей создавали либо путем повышения содержания наружного кальция в 2,5 раза (до 5мМ), либо -путем калиевой деполяризации, которая, в зависимости от создаваемого ею сдвига МП мышечных волокон, сопровождается активацией разных типов потенциал-зависимых Са2+ -каналов мембраны терминалей и поступлением наружного Са2+ в терминаль по разным типам каналов (Betz, Angleson, 2000; Flink, Atchison, 2003).

Действие рианодина и дигоксина на Фоне деполяризации терминалей с помощью 16мМ K+f.1ffi Мы использовали деполяризацию терминалей раствором, содержащим 16мМ К+иар., так как, по данным литературы, возникающая при этом деполяризация терминалей является достаточной (пороговой) для активации определенного - P/Q-типа потенциалзависимых Са2+ -каналов терминали (Urbano, Uchitel, 1999, Losavio, Muchnik, 1997). На фоне К+-деполяризации происходил быстрый прирост частоты МПКП в 15 раз, в среднем, до 13,44±1,0Гц (ш=3, п=34, р<0,001) (рис.1). Аппликация рианодина (0,5мкМ) на этом фоне приводила к дополнительному приросту частоты МПКП в 2,5 раза от 13,44±1,0 Гц до 33,19±3,39 Гц (т=4, п=39, р<0,01). Дигоксин (ЗнМ) также приводил к дополнительному приросту частоты МПКП, но всего в 1,5 раза (от 13,44±1,0Гц до 20,21±2,7Гц (ш=4, п=44, р<0,05)). Таким образом, в данных условиях и рианодин, и дигоксин оказывали облегчающее действие на спонтанную секрецию АХ.

Время, мин

Рис.1. Изменение частоты МПКП во времени при увеличении [К*]шр До 16мМ и действии 0,5мкМ рианодина и ЗнМ дигоксина на фоне 16мМ К+-деполяризации.

Далее мы исследовали эффекты агонистов РиР при более слабой калиевой деполяризации мембраны (с помощью 8мМ К'нар), при которой, согласно данным литературы, в моторных терминалах мыши активируется другой тип потенциалзависимых Са2+-каналов - низкопороговые кальциевые каналы L-типа (Losavio, Muchnik, 1997; Urbano et al., 2001). Действие рианодина и дигоксина на фоне деполяризации терминалей с помощью 8мМ К*-.- Калиевая деполяризация (8мМ К*,^) сопровождалась повышением частоты МПКП в 3,6 раза (от 0,94±0,04Гц до 3,4±0,26Гц (т=3, п=46, р<0,01) (рис.2).

Время, мин

Рис.2. Изменение частоты МПКП во времени при увеличении [К^щр до 8мМ и действии ЗнМ дигоксина и 0,5мкМ рианодина на фоне 8мМ К+ деполяризации.

На фоне такого прироста частоты МПКП, введение рианодина приводило к снижению частоты МПКП до контрольного уровня (т=4, п=42). Дигоксин вызывал качественно сходный с рианодином тормозный эффект -

прирост частоты, вызванный К*-деполяризацией (3,54±0,26Гц), снижался, хотя и в меньшей степени (на 11%) - до 2,51±0,03Гц (ш=4, п=35, р<0,05).

Таким образом, нам удалось обнаружить разнонаправленные - как облегчающие, так и тормозные - эффекты агонистов РиР (рианодина и дигоксина) в отношении частоты МПКП. Мы предположили, что способность агонистов РиР облегчать или тормозить спонтанную секрецию АХ зависит от того, по каким именно Са2+-каналам входит в терминаль наружный кальций, так как от этого зависит, какие внутриклеточные каскады, пулы РиР и других Са2+ зависимых каналов будут активированы в терминали.

Эффекты рианодина на фоне 8мМ К1"...., и блокатора Ь-типа Са2+-каналов. Мы установили, что аппликация верапамила на интактный препарат диафрагмы мыши приводит к достоверному снижению контрольной частоты МПКП от 0,83±0,068 до 0,45±0,02Гц (ш=3, п=29, р<0,001).

На фоне верапамила деполяризация терминали с помощью 8мМ К+щ, вызывает значительно меньший прирост частоты МПКП (рис. 3) - всего до

1,32±0,13Гц (т=5, п=45, р<0,01). Это означает, что при таком уровне деполяризации терминали Ь-тип Са2+-каналов обеспечивает значительный вход ионов кальция в терминаль, вызывающий прирост частоты МПКП. В присутствии верапамила и 8мМ рианодин терял свою способность снижать частоту спонтанной секреции АХ и никак не влиял на среднюю частоту МПКП (частота составила 1,32±0,13Гц в контроле и 1,44±0,08Гц на фоне рианодина т=3, п=31, р>0,05). Эффекты рианодина на фоне 16мМ К+„.„ и блокатора Р/О-типа Ся2*-каналов. Мы установили, что прирост частоты МПКП, возникающий при Г -деполяризации с помощью 16мМ К нар опосредуется, в основном, входом Са2+ через Р/(?-тип Са2+-каналов, т.к. на фоне действия ш-ага-токсина (0,1мкМ) - избирательного блокатора РЛ^-типа Са2' -каналов Г-

Рис. 3. Изменение средней частоты МПКП в норме (Н); при действии 5мкМ верапамила (В); при аппликация 0,5мкМ рианодина (Р), верапамила, верапамила и рианодина (В+Р) на фоне деполяризации 8мМ К+1ир (К*)-

деполяризация (16мМ К+нар) не вызывала значительного прироста частоты МПКП (на фоне ОДмкМ и-ага-токсина частота МПКП увеличивалась всего до 5,34±0,9Гц) (т=3, п=58, р<0,001) (рис. 4). Введение рианодина на фоне ш-ага-токсина (ОДмкМ) и 16мМ К+-деполяризации не приводило к дополнительному

Рис 4. Изменение средней частоты МПКП приросту частоты МПКП по

в норме (Н), при действии 0,5мкМ сравнению с калиевой деполяризацией рианодина (Р), ОДмкМ «-ага-токсина,

со-ага-токсина и рианодина (+Р) на фоне на Ф<>не ш-ага-токсина (частота МПКП деполяризации 16мМ К'нар (К"). составила 5,34±0,9Гц до и 6,28±1Д8

после аппликации рианодина (т=4, п=42, р>0,05)).

Эффекты рианодина на фоне 16мМ К^.р в гипокальциевом растворе. В

следующей серии экспериментов мы проводили деполяризацию терминалей с помощью 16мМ К+Нар, (при которых активируются Р/О-тип Са2+ каналов), но с уменьшенной [Са2,]|ир до 0,1мМ (и повышенной [М£2+]нар до 2,9мМ) (рис. 5). В этом случае наблюдался прирост частоты МПКП, в среднем, от

0,94±0,04Гц до 6,8±1,89Гц (т=4, п=35, р<0,01), что значительно меньше, чем прирост в нормокальциевом растворе (13,44±1,0Гц). Введение рианодина на этом фоне приводило уже не к увеличению (как в нормокальциевом растворе), а к быстрому подавлению прироста частоты МПКП до

Рис.5. Изменение средней частоты МПКП 2,66±0,49Гц (ш=4, п=37, р<0,01).

на фоне деполяризации 16мМ К4"^ при Эффекты рианодина и дигоксина на

сниженной [Са2+]„ар до ОДмМ и действии _ 2+ „

на этом фоне 0,5мкМ рианодина (+Р) фоне 5мМ Са щд При повышении

[Са ^нар до 5мМ наблюдается

увеличение средней частоты МПКП в 1,7 раза - до 1,58±0,04Гц (т=4, п=39,

р<0,05) (рис. 6). На фоне такого незначительного прироста частоты МПКП

действие рианодина (т=3, п=39) и дигоксина (т=3, п=32) приводило к

20'

2 Ю'

Й 5-

2,5

¡1,5 Н

1 1 50,5 г

Са

5 мМ Са'

подавлению спонтанной секреции и снижению средней частоты МПКП до контрольного уровня (до 1,07±0,06Гц и 0,98±0,07Гц, соответственно).

Таким образом, опыты с использованием разных Са2+-нагрузок терминалей показали, что при низких нагрузках агонисты РиР способны

»--------------^-л

Рис.6. Изменение средней частоты подавлять прирост частоты спонтанной МПКП при увеличении ГСа2+]ш» до 5мМ . ,,

и действии 0,5мкМ рианодина (Р) и ЗнМ секреции АХ, независимо от того, дигоксина (Д) на этом фоне. какими путями и с участием каких

Са2+ -каналов нервной терминали эти малые нагрузки создаются. Способность агонистов РиР подавлять прирост частоты МПКП была ранее не известна, поэтому далее мы исследовали возможные механизмы этого тормозного эффекта. Мы предположили, что это может быть связано либо с блокадой изнутри Ь-типа Са2+-каналов либо - активацией Са2+-зависимых К+-каналов терминали.

П. АНАЛИЗ РОЛИ Са2*-КАНАЛОВ Ь-ТИПА И Са2+-ЗАВИСИМЫХ К+-КАНАЛОВ ТЕРМИНАЛИ В РЕАЛИЗАЦИИ ТОРМОЗНЫХ ЭФФЕКТОВ РИАНОДИНА

В данной серии сначала воспроизводили тормозный эффект рианодина (как агониста РиР) который заключается в том, что на фоне небольшой деполяризации терминали с помощью 8мМ К1^ и прироста частоты МПКП в 3,6 раза рианодин приводил к снижению частоты МПКП до контрольного уровня. На фоне введения в перфузат блокатора Ь-типа каналов верапамила (5мкМ) и калиевой деполяризации (8мМ К1^) рианодин не вызывал подавления прироста частоты МПКП и других достоверных изменений частоты МПКП (рис. 3). Поэтому нельзя исключить, что поток Са2+, высвобождаемый из РиР под действием рианодина, способен изнутри связываться и тормозить работу Са2+-каналов Ь-типа, что уменьшает вход кальция и Са2+-зависимую спонтанную секрецшо АХ. В пользу такой возможности свидетельствуют и данные литературы о способности выбрасываемого через РиР депонированного кальция тормозить работу Са2+-

4 5 g4

u 1 я 1

го

каналов L-типа сердечных и других клеток (Kubalova, 2003; Bondarenko et al., 2004; Cens et al., 2006).

д+р В следующей серии опытов мы

|Н исследовали эффекты рианодина на

д RM фоне ^-деполяризации терминали и

Ш Ни действия 0,5мкМ апамина -

Ш Д избирательного блокатора К+о,-каналов.

__ Ш Д Под действием апамина средняя частота

i Ш! Ш Ш МПКП не изменялась и составила

i . . J......J 0,94±0,04Гц в контроле и 1,02±0,03Гц на

фоне апамина (ш=3, п=29, р>0,05). На

Рис. 7. Изменение средней частоты ф0це апамина калиевая деполяризация МПКП в норме (Н), при действии ,Г1Г+1 _ л

0,5мкМ рианодина (Р), 0,5мкМ апамина (РП„ар-8мМ) также не приводила к

(А), апамина и рианодина (А+р) на фоне достоверным изменениям частоты

деполяризации 8мМ K+™, (К*). . ,„ ____

у ^ МПКП (3,50±0,27Гц - при

деполяризации 8мМ К1",^ и 3,80±0,09Гц - при калиевой деполяризации на

фоне апамина (ш=3, п=36, р>0,05). В этих условиях рианодин (0,5мкМ)

вызьшал противоположный эффект - дополнительный, до 6,12±0,18Гц,

прирост частоты МПКП (ш=3, п=31, р<0,001) (рис. 7).

Полученные факты свидетельствуют, что в нервных терминалях под

действием рианодина в условиях небольшого потока входящего наружного

кальция (при 8мМ К^р) запускается выброс депонированного кальция,

нацеленный на активацию К+Са-капалов.

III. ВЛИЯНИЕ БЛОКАДЫ РиР НА ЧАСТОТУ МПКП У ИНТАКТНЫХ И ДЕПОЛЯРИЗОВАННЫХ ТЕРМИНА ЛЕЙ

Наряду с анализом действия экзогенных агонистов РиР - рианодином и дигоксином - нас интересовал вопрос, как будет меняться спонтанная активность терминали, когда РиР Са2+-депо активируются не экзогенным агонистами, а только действием входящего в терминаль наружного кальция.

Для ответа на этот вопрос мы исследовали изменения частоты МПКП на фоне блокады РиР и выброса депонированного Са2+ с помощью высоких доз рианодина (20мкМ).

Введение 20мкМ рианодина, блокирующего пресинаптические РиР, не вызывало достоверных изменений частоты МПКП (частота МПКП составила 0,92±0,04Гц в контроле и 0,89±0,1Гц после введения рианодина, ш=3, п=31, р>0,05). Однако в синапсах, деполяризованных с помощью 8мМ (рис. 8) или 16мМ К+нар, где наблюдался прирост частоты МПКП

Время, мин

Рис. 8. Изменение частоты МПТСП при деполяризации терминали 8мМ К+!ир на фоне блокады РиР 20мкМ рианодином

соответственно - в 3,6 (рис. 8) и 15 раз, блокада пресинаптических РиР приводила к еще большему, дополнительному приросту частоты МПКП -соответственно в 2,5 и 5раз, то есть к растормаживанию спонтанной секреции АХ. Это означает, что в деполяризованных термипалях, когда имеет место тоническое поступление наружного кальция, выброс депонированного кальция, возникающий в ответ на вход наружного кальция, предназначен, главным образом, для притормаживания входящего потока кальция, Са2+-сигнала и, как следствие дополнительного прироста спонтанной секреции АХ.

IV. РОЛЬ ДЕПОНИРОВАННОГО КАЛЬЦИЯ В РЕГУЛЯЦИИ УРОВНЯ ВЫЗВАННОЙ СЕКРЕЦИИ МЕДИАТОРА

В предыдущих сериях было установлено, что выброс депонированного Са2+ способен, в зависимости от способов активации РиР, разнонаправленно регулировать спонтанную секрецию. Оставался открытым вопрос, существует ли аналогичная регуляция при вызванной секреции квантов АХ?

Мы исследовали вызванную активность моторных синапсов в условиях: а) рассеченного препарата. - у которого поток входящего в терминаль

кальция соответствует таковому у интактного препарата, то есть сохранен в полном объеме (Di Gregorio et al., 1996);

б) частично кураризированного препарата. - у которого, согласно данным литературы, квантовый состав ПКП снижен на 30% (Tian et al., 1994), усилена депрессия передачи в залпах ПКП (Gibb, Marshal, 1984; Tian et al., 1994) вследствие блокады пресинаптических нХР, уменьшения деполяризации терминали ацетилхолином и снижения потока наружного кальция в терминаль (Di Gregorio et al., 1996).

1У.1. Облегчающее действие рианодина и дигоксина на вызванную активность синапсов у рассеченного препарата

Мы установили, что рианодин (0,5мкМ) и дигоксин (ЗнМ) достоверно увеличивают амплитуду одиночных ПКП, соответственно - на 30% (ш=4, п=34, р<0,05) и 26% (ш=4, п=30, р<0,05).

В следующей серии экспериментов исследовали изменения рисунка залповой активности синапсов (рис. 9). Были использованы залпы, состоящие

4Гц 113 ПКП с частотой 4, 7 и 50Гц (т=9, п=69). Можно проследить характерные параметры залпов - начальную депрессию передачи (при 4Гц), начальное облегчение передачи и прирост амплитуды ПКП в начале залпа (слабо выраженные при 7Гц и значительно - при 50Гц) и фазу "плато" в конце залпа (хорошо

130 120 110 100 90 80

11111111

15 22 29 36 43 50 Номер ПКП в залпе Рис. 9. Изменения амплитуды ПКП в пкП ходе залповой активности синапсов при частоте стимуляции нерва 4, 7 и 50Гц выраженную при всех частотах - 4, 7 и (рассеченный препарат). 50Гц)

Мы установили, что наиболее чувствительным параметром к облегчающему действию агонистов РиР оказалась фаза "плато" в конце залпа - оно повышалось под действием рианодина и дигоксина, хотя и в разной степени. Так, при частоте стимуляции 4Гц и рианодин и дигоксин практически одинаково поднимают уровень фазы плато (на 6 и 5% соответственно (ш=7, п=65, р<0,05)). При частоте 7Гц дигоксин более эффективно, чем рианодин увеличивал амплитуду ПКП на фазе плато, до уровня не отличимого ПКП] (рис. 10). При частоте 50Гц эффекты дигоксина

сходны с действием рианодина - оба агониста РиР незначительно повышали уровень плато (на 4%) (рис. 11).

дигоксин

контроль

11111

8 15 22 29 36 43 50 Номер ГГК11 в залпе Рис. 10. Изменение амплитуд ПКП при раздражении нерва с частотой 7Гц под дейС1иием ЗнМ дигоксина и 0,5мкМ рианодина.

15 22 29 36 43 50 Номер ПКП в залпе

Рис. 11. Изменение амплитуд ПКП при раздражении нерва с частотой 50Гц под действием ЗнМ дигоксина и 0,5мкМ рианодина.

Обнаруженная способность дигоксина (ЗнМ) вызывать сходные с рианодином облегчающие эффекты на ритмическую передачу говорит о его возможном активирующем действии на РиР2 в моторных нервных терминалях мыши. В пользу этого говорит и тот факт, что облегчающие эффекты дигоксина на вызванную секрецию АХ синапсов удается полностью предотвратить блокадой РиР (с помощью высоких, блокирующих РиР, доз рианодина). На фоне ЮмкМ рианодина (и частоте залпового разряда 7Гц) воздействие дигоксином не вызывало достоверных изменений показателя уровня "плато" в залпе (отношение ПКП на "плато" к первому ПКП в залпе). Этот показатель составил 0,89 - в контроле и 0,91 - при действии ЮмкМ рианодина, блокирующего РиР (ш=4, п=37, р>0,05).

1У.2.0блегчающее действие рианодина и дигоксина на вызванную активность кураризированного препарата

Мы установили, что у кураризированного препарата (по сравнению с рассеченным) более выражена депрессия передачи по ходу залпа из 50-ти ПКП. Так, при низкой частоте (4Гц) проявляется более сильная начальная депрессия чем у рассеченного препарата, и фаза плато снижена на 30% от ПКП] (ш=4, п=28). При 7Гц появляется начальное облегчение с последующей депрессией и выходом на плато, уровень которого не отличается от такового при 4Гц (ш=3, п=31). При частоте 50Гц начальное облегчение почти в 2 раза

менее выражено, чем у рассеченного препарата, по амплитуде и длительности, и кроме того, невысок уровень "плато" (который устанавливается на уровне 40% от первого ПКП) (ш=4, п=34).

Действие рианодина в этих условиях вызвало слабо выраженные облегчающие эффекты в виде повышения уровня "плато" на 10-18% при частотах 7-50Гц (т=6, п=54, р<0,05).

1У.З Тормозное действия кальция, высвобождаемого из Са - депо на ритмическую активность синапсов.

Тормозное действие агонистов РиР на вызванную активность.

Обнаруженная нами способность агонистов РиР облегчать синаптическую передачу как у рассеченного, так и кураризированного препарата позволяла предположить, что выброс депонированного кальция, под действием агонистов РиР направлен на усиление Са2+-зависимой секреции АХ и синаптической передачи при ритмической активности синапсов, независимо от интенсивности входящего в терминаль потока кальция. Однако, наряду со способностью облегчать вызванную ритмическую активность (повышая уровень "плато" ПКП в залпе), нам удалось выявить условия, при которых рианодин или дигоксин приводят к подавлению синаптической передачи в следующих случаях:

1. В условиях рассеченного препарата и ритмического разряда с частотой

50Гц торможение передачи под действием агонистов РиР проявлялось в виде

подавления начального облегчения ПКП на 15% (см. рис. 11).

2. В условиях кураризированного

препарата при низкой (4Гц) частоте

стимуляции рианодин вызвал снижение

уровня "плато" на 64% (т=3, п=32,

р<0,01) (рис. 12). Таким образом, в

данном случае имел место тормозный

эффект рианодина. Для проверки

возможного участия Са2+-зависимых

в этом тормозном

,„ „ , гг+ воздействии рианодина на уровень плато

Рис. 12. Влияние блокады Кса-каналов г г

апамином на фазу плато залпа 4Гц ШОП были исследованы эффекты

специфического блокатора К+са-каналов -

контроль рианодин

I I-г

20 30 40 50 Номер ПКП в залпе К^са-каналов

кураризированного препарата.

апамина (0,5мкМ). Мы установили, что в норме апамин не оказывает влияний на амплитуду ПКП в залпе и рисунок залповой активности синапсов. Аппликация рианодина в присутствии апамина в перфузате не вызвала каких-либо изменений в рисунке залпа, отличных от наблюдаемых в контроле (ш=7, п=62, р>0,05) (рис. 12). Таким образом, апамин полностью предотвращал тормозное действие рианодина на амплитуду ПКП на фазе "плато" в залпе. Изменение вызванной активности синапсов под действием блокады РиР. Исследование рисунка залповой активности синапсов на фоне блокады РиР позволило ответить на вопрос, как функционирует процессы Са2+-зависимой секреции АХ, если блокирован процесс высвобождения депонированного кальция в нервной терминали.

Исследования ритмической

контроль

ЮмкМ рианодин активности рассеченного препарата в условиях предварительной блокады РиР (при аппликации па мышцу высоких (ЮмкМ) концентраций рианодина) выявили существенные

а 5

| '1 изменения рисунка залповой

1 8 15 22 29 36 43 50 Т1

Номер ПКП в залпе активности. На рис. 13 видно, что у

Рис. 13. Изменение рисунка залповой рассеченного препарата при действии

активности ПКП при частоте 7 Гц под на МЬШ1Цу блокатора РиР рианодина

влиянием блокады РиР ЮмкМ

рианодином. (ЮмкМ) возрастает амплитуда ПКП на

фазе начального облегчения и далее по всему ходу залпа. Оно становится более выраженным (и составляет 1,112 по сравнению с 1,034 в контроле) (т=3, п=28, р<0,01). Таким образом, происходит растормаживание начального облегчения и фазы плато. Это означает, что в условиях полноценного поступления в терминаль ионов кальция при высокочастотной ритмической активности синапсов Са2+-активируемый выброс депонированного кальция действует по принципу отрицательной обратной связи, притормаживая вход наружного кальция, а следовательно, и выброс медиатора.

Важно подчеркнуть, что у кураризированного препарата, (где снижены потоки кальция в терминаль по сравнению с рассеченным препаратом), блокада РиР приводит не к облегчению, а к подавлению ритмической синаптической передачи: наблюдается частото-зависимое подавление

начального облегчения и уровня плато по всему ходу залпа (Балезина, Букия, 2001; 2003). Эти данные позволяют предполагать, что у кураризированных моторных терминалей, работающих в условиях ограниченного поступления в них наружного кальция, также происходит выброс депонированного кальция, но он, по-видимому, направлен не на притормаживание, а на усиление кальциевого сигнала и облегчение вызванной секреции медиатора.

Таким образом, и в случае вызванной ритмической работы синапсов нам удалось продемонстрировать принцип двунаправленной регуляции секреции АХ со стороны внутриклеточно высвобождаемого депонированного кальция.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что в работающих моторных нервных терминалях мыши (когда имеет место вход наружного кальция) всегда (в той или иной степени) происходит активация РиР и выброс депонированного кальция, который вовлекается в регуляцию секреции АХ. При этом возможны два противоположных способа регуляции входящего в терминаль кальция и Са2+-зависимой секреции их притормаживание либо облегчение. Притормаживающее действие (как страховка от избытка поступающего кальция) по-видимому, всегда присутствует и включается первым. Тормозный механизм особенно важен и силен, если достаточно велик вход наружного кальция, как это имеет место у тонически деполяризованных терминалей, либо при высокочастотной ритмической активности и больших потоках входящего кальция (у интактного или рассеченного препарата). Выключение из работы РиР в этих условиях приводит к растормаживанию секреции (и спонтанной, и вызванной). Наши данные позволяют предполагать, что механизмом торможения секреции АХ (вследствие выброса депонированного кальция) служит подавление входа наружного кальция в терминаль - за счет активации низкопроводящих К+Са-каналов и гиперполяризации терминали или блокады потенциал-зависимых Са2+-каналов терминали при прицельном действии на них изнутри кальция, выбрасываемого из Са+-депо. Аналогичные механизмы ограничения входа наружного кальция и Са2+ -сигнала под действием кальция, освобождаемого

из Са2+-депо через РиР, недавно описаны и в других типах клеток (нервных, мышечных) (Sah, 1996; Sham, 1997; Schwartz et al., 1999; Urbano et al., 2001; Bondarenko et al., 2004). Таким образом, у терминалей с высоким уровнем активности и потоков входящего кальция, выброс депонированного кальция действует по принципу отрицательной обратной связи, притормаживая вход наружного кальция в терминаль и как следствие - секрецию квантов АХ.

Вместе с тем, мы установили, что выброс депонированного может приводить и к усилению секреции АХ. Согласно нашим (и литературным данным), облегчение секреции АХ под действием высвобождаемого из депо кальция имеет место, если синаптическая передача ослаблена и работает в условиях ограниченного, сниженного поступления наружного кальция в терминали. В частности, это имеет место в случае кураризации нервно-мышечного препарата, либо в случае повышения ионов Mg2+ и дефицита кальция в среде (Narita et al., 2002). Можно предполагать, что в этих случаях механизм облегчающего действия внугриклеточно высвобождаемого кальция заключается в подпитке активных зон кальцием, увеличении квантового состава ПКП, усилении Са2+ -зависимой мобилизации квантов АХ (Балезина, 2002; Балезина, Букия, 2003). Действие экзогенных агонистов РиР (рианодина и дигоксина), искусственно усиливающих, делающих более пролонгированным и/или генерализованным выброс депонированного кальция в терминали, может приводить не только к усилению секреции АХ (как это принято было считать), но и (в ряде случаев) к подавлению секреции АХ. Направленность эффекта зависит от интенсивности входящего потока кальция, Са2+-нагрузки терминали и других причин.

Возможность существования разнонаправленных механизмов действия одной и той же системы РиР в моторных нервных терминалях обусловлена, по-видимому, сложной пространственной локализацией цистерн ГЭР и разных типов РиР в терминали, их разной чувствительностью к кальцию, избирательным функциональным сопряжением с калиевыми и кальциевыми каналами наружной мембраны терминали.

ВЫВОДЫ

1. В моторных синапсах мыши, деполяризованных с помощью 8 или 16мМ К+нар, блокада пресинаптических РиР приводит к растормаживанию спонтанной секреции АХ и дополнительному приросту частоты МПКП в соответственно в 2,5 раз и 5 раз.

2. На фоне 8мМ ТС1^, активация РиР с помощью рианодина приводит к подавлению частоты спонтанной секреции АХ до исходного уровня. Это подавление предотвращается блокадой К+Са-каналов апамином либо Са+-каналов Ь-типа - верапамилом.

3. Активаторы РиР рианодин и дигоксин вызывают облегчение спонтанной секреции и прирост частоты МПКП в условиях усиленной деполяризации терминалей (16мМ К"1^).

4. В условиях ритмической активности моторных синапсов (в виде коротких залпов с частотой 4-50Гц) выброс депонированного кальция с помощью рианодина (либо дигоксина) приводит к облегчению передачи в виде прироста амплитуды ПКП по ходу всего залпа.

5. Обнаружены условия, при которых рианодин или дигоксин приводят к подавлению ритмической активности синапсов. В зависимости от частоты разряда и степени Са2+-нагрузки терминали, торможение проявляется в подавлении начального облегчения ПКП, либо уровня плато ПКП в залпе. Показано участие апамин-чувствительных К+са-каналов в подавлении рианодином уровня плато ПКП в низкочастотном залпе.

6. Обнаруженные воздействия дигоксина на спонтанную и вызванную активности синапсов, качественно сходные с эффектами рианодина и предотвращаемые блокадой РиР позволяют предполагать наличие пула РиР 2-ого типа в составе моторных терминалей мыши.

7. Таким образом, активация РиР и выброс депонированного Са2+ в моторных терминалях мыши могут приводить к двунаправленным изменениям как спонтанной, так и вызванной секреции АХ (в виде их облегчения или торможения). Направленность изменений зависит от Са2+-нагрузки, участия апамин-чувствительных К+Са-каналов и Са2+-каналов Ь-типа нервной терминали.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Surova N.V., Balezina О.Р., Lapteva V.l., Poskonova M.A. Effects of caffeine on the spontaneous acetylcholine secretion at the mouse neuromuscular junction. //J.Neurochem., 1998, V. 71 (Suppl.)P.19C

2. Сурова H.B., Балезина О.П., Лаптева В.И. Эффекты кофеина на амплитуду и частоту спонтанных миниатюрных потенциалов концевой пластинки в скелетных мышцах мыши. // Вестник Моск. Ун-та, 1998, Биология, Сер.16. N4, С. 24-29.

3. Balezina О.Р., Bukiya A.N., Surova N.V., Lapteva V.l. Ryanodine and caffeine effects on the spontaneous activity of mouse motor synapses. // Abstr. Intern Symposium "Synaptic tpansmission: 100 years after L.Luciani", Roma, Italy, 2000, P.15-16.

4. Сурова H.B., Балезина О.П., Лаптева В.И. Изменение режима квантовой секреции ацетилхолина в моторном синапсе под действием кофеина и рианодина. // Физиология нейротрансмиггеров, тезисы докладов VIII Всеросс. конфер., поев. 100-летию со дня рожд. Х.С.Коштоянца, 2000, С.16

5. Букия А.Н., Балезина О.П., Лаптева В.И. Модуляция рианодином и дантроленом Са2+-зависимого выброса медиатора в нервно-мышечном синапсе мыши. // Тезисы докл. XXVIII Съезда физиологов России, г. Казань, 2001, С. 23.

6. Сурова Н.В., Балезина О.П., Лаптева В.И. Изменение спектра спонтанно секретируемых квантов медиатора под действием кофеина и рианодина в нервно-мышечном синапсе мыши. // Доклады Академии наук, 2001, Т.380 (1), 2001, С. 1-3.

7. Букия А.Н., Балезина О.П., Лаптева В.И. Вызванная активность нервно-мышечных синапсов мыши на фоне действия рианодина и дантролена. // Росс. Физиол. журнал им. Сеченова, 2001, Т. 87(11), С. 15111517.

8. Балезина О. П., Лаптева В. И., Ермишина К. И., Двунаправленное изменение режима спонтанной секреции медиатора под действием рианодина. // Тезисы VI Всероссийского симпозиума молодых ученых и учителей, 2002, С. 20-21.

9. Балезина О.П., Ермишина К.И., Лаптева В.И. Индуцируемые рианодином разнонаправленные изменения частоты спонтанной секреции медиатора. // Доклады Российской Академии наук, 2004, Т.397(2), С. 271-275.

10. Балезина О.П., Букия А.Н., Лаптева В.И. Разнонаправленное действие внутриклеточно высвобождаемого кальция на квантовую секрецию медиатора. // Российский физиологический журнал имени ИМ. Сеченова, 2005,91(1), С.61-70.

11. Балезина О.П., Лаптева В.И. Регуляция режима спонтанной секреции медиатора рианодином. // Российский физиологический журнал имени И.М. Сеченова, 2004,90(8), С.259.

Зак. № 1 Тир. 100 экз. ПКБ ЦВ ОАО «РЖД» Москва 2006 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лаптева, Валентина Ивановна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Рианодин-чувствительные кальциевые депо нейронов и нервных ^ * терминалей.

2. Рианодиновые рецепторы.

2.1. Основные характеристики рианодиновых рецепторов.

2.2. Типы рианодиновых рецепторов и их представленность в нейронах и ^ терминалях.

2.3. Рианодин как модулятор активности рианодиновых рецепторов.

2.4. Роль рианодин-чувствительных кальциевых депо в регуляции ^ секреции медиатора.

2.4.1. Эффекты риаподина в моторных синапсах.

2.4.2. Эффекты рианодина в центральных синапсах.

3. Механизмы запуска выброса кальция из Са2+депо нервных терминалей

4. Взаимодействие выброса кальция из внутриклеточных депо с ионными ^ каналами наружной мембраны.

5. Функциональные последствия опустошения кальциевых депо.

Ф 6. Характеристика дигоксина и его эффектов.

7. Спонтанная и вызванная секреция медиатора в нервно-мышечных ^ синапсах как функция выброса депонированного кальция.

7.1. Спонтанный выброс медиатора.

7.2. Вызванное высвобождение медиатора как многоквантовый выброс

7.3. Особенности вызванной ритмической активности синапса.

7.3.1. Депрессия.

7.3.2. Облегчение.

7.3.3. Мобилизация медиатора.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Приготовление изолированного нервно-мышечного препарата диафрагмы ^ мыши.

2. Внутриклеточная регистрация спонтанных и вызванных потенциалов ^ концевой пластинки.

2.1. Метод регистрации спонтанной синаптической активности.

2.2. Эксперименты на синапсах в условиях вызванной синаптической ^ 'Ф активности

2.2.1. Приготовление рассеченного препарата диафрагмы мыши.

2.2.2. Эксперименты с частичной блокадой никотиновых ^ холинорецепторов постсинаптической мембраны с1-тубокурарином.

3. Статистическая обработка экспериментальных данных.

4. Используемые в работе вещества.

5. Блок-схема экспериментальной установки для регистрации ^ синаптических потенциалов

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА I. РАЗНОНАПРАВЛЕННОЕ ДЕЙСТВИЕ РИАНОДИНА НА РЕЖИМ СПОНТАННОЙ СЕКРЕЦИИ МЕДИАТОРА.

1. Изменения средней частоты МПКП на фоне рианодина и кофеина в ^ интактных синапсах.

1.1. Эффекты рианодина.

1.2. Эффекты кофеина.

2. Действие рианодина на частоту МПКП при изменении кальциевой ^ нагрузки терминалей.

2.1. Изменения частоты МПКП на фоне повышенной Са2+-нагрузки ^ терминалей.

2.1.1. Эффекты рианодина.

2.2. Изменения частоты МПКП при действии рианодина на фоне ^ деполяризации терминалей с помощью 16мМ К+нар.

2.2.1. Изменение частоты МПКП на фоне 16мМ К+нар в ^ нормокальциевом растворе.

2.2.2. Эффекты рианодина.

2.2.3. Изменение частоты МПКП на фоне 16мМ К+нар в ^ гипокальциевом растворе.

2.2.4. Эффекты рианодина.

3. Анализ причин подавления спонтанной секреции АХ под действием ^ рианодина.

4. Влияние блокады РиР на частоту МПКП в условиях деполяризации ^ терминали 8мМ наружного калия.

5. Анализ роли кальций-активируемых калиевых каналов в реализации ^ тормозных эффектов рианодина.

6. Анализ механизмов действия рианодина на частоту МПКП на фоне 16мМ ^ наружного калия.

6.1. Частота МПКП на фоне 16мМ К нар и блокаторов Са -каналов.

6.2. Эффекты блокады РиР на фоне 16мМ К+Нар.

6.3. Эффекты рианодина на фоне 16мМ К+нар и блокаторов Са2+-каналов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разнонаправленное действие кальция, высвобождаемого из Ca2+-депо, на квантовую секрецию медиатора"

Актуальность проблемы. Рассмотрение роли кальция как триггера и регулятора секреции медиатора является одной из центральных проблем современной синаптологии. Особый интерес вызывает чувствительность процессов секреции медиатора к кальцию, высвобождаемому из внутритерминальных Са2+-депо - цистерн гладкого эндоплазматического ретикулума (ГЭР) (Berridge, 1997; Балезина, 2002; Bardo et al., 2003 Verkhratsky, 2005). В термипалях синапсов описаны цистерны ГЭР, способные выбрасывать ионы кальция в аксоплазму через специальные Са2+-каналы -рианодиповые рецепторы (РиР) (Peng, 1996; Narita et al., 2000; Bouchard et al., 2005; Kubota et al., 2005). Выброс депонированного Ca через каналы РиР запускается повышением уровня кальция в аксоплазме, а также действием специфических активаторов РиР - кофеина, рианодина, дигоксина и др. Каким образом активация РиР и выброс депонированного кальция отражается на спонтанной и вызванной секреции медиатора, остается во многом не ясным.

Известно, что наружный кальций, поступающий в терминаль по потенциалактивируемым Са2+-каналам, усиливает вызванную и спонтанную секреции квантов медиатора (Katz, Miledi, 1970; Zucker, 1996; Neher, 1998). Выброс депонированного кальция из цистерн ГЭР синаптических терминалей, также, по данным литературы, может приводить к подъему цитоплазматического кальция и увеличению секреции медиатора (Fossier et al., 1999; Emptage et al.,2001). В частности, в нервно-мышечных синапсах скелетных мышц описаны пресинаптические РиР (Narita et al., 2000; Castonguay, Robitaille, 2001; Kubota et al., 2005). Их активация - при определенных условиях - может увеличивать внутриклеточный Са2+-сигнал, уровень спонтанной и вызванной секреции квантов ацетилхолина (АХ) (Nishimura et al.,1990; Narita et al., 2000; Emptage et al., 2001; Балезина, 2002;

Bouchard et al., 2005). Однако во многих возбудимых структурах - в соме

У Анейронов, в гладкомышечных и других клетках выброс Са из цистерн ГЭР способен играть двоякую роль: как усилителя внутриклеточного кальциевого сигнала, так и его ограничителя - путем торможения входящего в клетку потока наружного кальция (Nelson et al., 1995; Emptage et al.,2001; Liang et al., 2002; Flink, Atchison, 2003). Тормозный эффект обычно обусловлен вовлечением Са2+-зависимых К+-каналов либо инактивацией Са2+-капалов наружной мембраны за счет прицельного действия на них кальция, высвобождаемого из примембранных цистерн ГЭР (Nelson et al., 1995; Sah,1996; Sham,1997; Schwartz et al., 1999; Urbano et al., 2001). Какой из противоположных эффектов будет преобладать (облегчение либо торможение Са сигнала), зависит от числа и типа активируемых РиР, потока входящего кальция и многих других причин (Kuba 1980, 1997; Sah, Mclachlan, 1991; Akita et al., 2000).

В терминалях синапсов возможность разнонаправленных воздействий на Са2+-сигнал и процессы секреции медиатора со стороны внутриклеточно высвобождаемого кальция до сих пор не описана. Выявление таких разных по знаку влияний расширило бы современные представления о механизмах Са2+-зависимой регуляции синаптической передачи.

Цели и задачи исследования. Основной целыо работы было обнаружение и анализ механизмов, обеспечивающих разнонаправленные изменения интенсивности квантовой секреции АХ (ее усиление либо

У Аторможение) при выбросе ионов Са из рианодин-чувствительных Са -депо в моторных синапсах мыши.

В связи с поставленной целью в работе решались следующие конкретные задачи:

1. Исследовать изменения режима спонтанной секреции АХ путем регистрации МПКП в нервно-мышечных синапсах диафрагмы мыши, в условиях воздействия на терминали рианодина (стимулятора выброса Са2+ из рианодин-чувствительных Са2+-депо). Сопоставить эффекты рианодина при разных режимах кальциевой нагрузки терминали, создаваемых путем градуальной калиевой деполяризации терминали и варьирования наружной концентрации кальция.

3. Сопоставить изменения режимов спонтанной секреции квантов АХ, вызываемые разными по механизму и спектру действия активаторами РиР -рианодина (взаимодействующего с 1, 2, 3-им типами РиР) и дигоксина (активатора РиР 2-го типа).

4. Исследовать возможности разнонаправленных изменений амплитуды и квантового состава ПКП в ритмическом залпе на фоне действия рианодина и дигоксина. Сопоставить эффекты рианодина и дигоксина в зависимости от частоты залпа и кальциевой нагрузки терминалей - у кураризированного и у рассеченного нервно-мышечного препарата диафрагмы мыши.

Новизна полученных результатов. В работе экспериментально показан важный новый факт, согласно которому выброс депонированного кальция под действием активаторов пресинаптических РиР может сопровождаться не только усилением, но и снижением уровня спонтанной либо вызванной секреции квантов АХ. Впервые описаны условия и механизмы, при которых преобладают облегчающие, либо тормозные воздействия со стороны внутриклеточно высвобождаемого кальция на выброс квантов АХ.

Показано, что кальций-индуцированный выброс депонированного кальция в терминали может «работать» как система отрицательной обратной связи, притормаживая поток наружного кальция (и прирост уровня квантовой секреции АХ) путем прицельного воздействия на низкопроводящие (чувствительные к апамину) кальций-активируемые калиевые каналы наружной мембраны терминали.

Л 1

Новыми являются полученные в работе данные об участии Са -каналов Ь-типа в кальциевой нагрузке терминали в условиях покоя и при небольших уровнях деполяризации терминали. Впервые установлено, что вход кальция по Ь-типу Са2+ каналов может быть прицельно предназначен для активации выброса депонированного кальция из рианодин-чувствительных Са2+-депо.

Положения, выносимые на защиту.

1. В нервно-мышечных синапсах диафрагмы мыши выброс депонированного л I кальция из рианодин-чувствительных Са -депо может, в зависимости от условий и режима работы синапса, вызывать как облегчение, так и торможение спонтанной и вызванной секреции квантов медиатора АХ.

2. В реализации облегчающего действия рианодина на секрецию АХ может участвовать вход Са2+ по Ь- и Р|С2-типам Са2+- каналов; в реализации тормозных эффектов - Са2+ каналы Ь-типа и апамин-чувствительные К+Са каналы нервной терминали.

3. В моторных синапсах мыши разнонаправленные изменения спонтанной секреции, сходные по условиям и характеру реализации с эффектами рианодина, могут быть вызваны дигоксином (ЗнМ), избирательным активатором РиР 2-го типа.

4. В условиях ритмической активности синапсов действие дигоксина на уровень вызванного выброса АХ имеет индивидуальный характер, лишь частично совпадающий с эффектами рианодина.

Научно-практическая значимость работы. Полученные в данной работе новые данные о способности депонированного кальция, высвобождаемого из рианодин-чувствительных Са2+-депо, разнонаправленно воздействовать на режим спонтанной и вызванной активности моторных синапсов существенно расширяют современные представления о существующих в терминали разных источниках кальция влияющих на выброс медиатора. Проведенная работа позволяет яснее представить место такого феномена как Са -зависимый выброс кальция в регуляции процессов секреции АХ в моторных синапсах. В результате проведенных исследований получены новые важные сведения о участии РиР разных типов и выбрасываемого через них депонированного кальция не только в контроле секреции АХ, но и активности Са -зависимых К -каналов наружной мембраны. Научную ценность представляет и обнаруженный у сердечного гликозида дигоксина способность в низких наномолярных концентрациях облегчать вызванный выброс АХ в периферических синапсах мыши за счет избирательной активации пресинаптических РиР 2-го типа. Обнаруженные в работе факты эффективной модуляции режимов секреции медиатора под действием рианодина и дигоксина имеют не только общефизиологическое научное значение, но могут быть использованы и при разработке новых средств фармакологической коррекции нарушений нервно-мышечной передачи.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В настоящее время в литературе представлены многочисленные данные об участии кальция, выбрасываемого из цистерн ГЭР, в активности нейронов. Показана роль внутриклеточно высвобождаемого кальция в регуляции Са -зависимой секреции медиаторов в центральных и периферических синапсах; рассматриваются возможные механизмы, посредством которых кальций, высвобождающийся через РиР, воздействует на активность нервных терминалей. Этот круг вопросов имеет непосредственное отношение к теме работы и будет рассмотрен в обзоре литературы.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Лаптева, Валентина Ивановна

ВЫВОДЫ

1. В моторных синапсах мыши, деполяризованных с помощью 8 или 16мМ К+„аР, блокада пресинаптических рианодиновых рецепторов приводит к растормаживанию спонтанной секреции АХ и дополнительному приросту частоты МПКГТ в соответственно в 2,5 раз и 5 раз.

2. На фоне 8мМ К+нар, активация рианодиновых рецепторов с помощью рианодина приводит к подавлению частоты спонтанной секреции АХ до исходного уровня. Это подавление предотвращается блокадой К+Са-каналов апамином либо Са+-каналов Ь-типа - верапамилом.

3. Активаторы рианодиновых рецепторов рианодин и дигоксин вызывают облегчение спонтанной секреции и прирост частоты МПКП в условиях усиленной деполяризации термипалей (16мМ К+нар).

5. Обнаружены условия, при которых рианодин или дигоксин приводят к подавлению ритмической активности синапсов. В зависимости от частоты разряда и степени Са -нагрузки термипали, торможение проявляется в подавлении начального облегчения ПКП, либо уровня плато ПКП в залпе. Показано участие апамип-чувствительных К+са-каналов в подавлении рианодином уровня плато ПКП в низкочастотном залпе.

6. Обнаруженные воздействия дигоксина на спонтанную и вызванную активности синапсов, качественно сходные с эффектами рианодина и предотвращаемые блокадой рианодиновых рецепторов, позволяют предполагать наличие пула рианодиновых рецепторов 2-ого типа в составе моторных терминалей мыши.

7. Таким образом, активация рианодиновых рецепторов и выброс депонированного Са2+ в моторных термипалях мыши могут приводить к двунаправленным изменениям как спонтанной, так и вызванной секреции АХ (в виде их облегчения или торможения). Направленность изменений зависит от Са2+-нагрузки, участия апамин-чувствительных К+са-каналов и Са2+-каналов Ь-типа терминали.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данная работа была посвящена выявлению разнонаправленных (облегчающих и тормозных) воздействий на секрецию медиатора со стороны кальция, высвобождаемого из Са -депо терминалей. Были использованы два приема: а) активация (открывание) каналов рианодиновых рецепторов (РиР) с помощью агонистов, каковыми служили ионы кальция, входящие в терминаль из наружной среды, экзогенные агонисты рианодин и дигоксин; б) фармакологическая блокада РиР с последующим анализом изменений в работе синапсов.

Мы обнаружили ранее не известные облегчающие воздействия со стороны внутриклеточно высвобождаемого кальция на секрецию квантов. Это проявлялось в облегчающих влияниях агонистов РиР на спонтанную и вызванную секрецию АХ. Обнаружены: увеличение частоты МПКП, прирост амплитуды и/или квантового состава одиночных ПКП, а также - увеличение ПКГТ при ритмической активности синапсов как у рассеченного, так и кураризированного нервно-мышечного препарата.

Облегчающее действие рианодина (в малых субмикромолярных концентрациях) описано и в целом ряде других - центральных и периферических синапсов (см. обзоры Балезина, 2002; Bouchard et al., 2003). Что касается дигоксина, то его активность как агониста РиР 2-го типа в моторных терминалях - проведено нами впервые. Этот реагент до сих пор использовался и обсуждался лишь в контексте активации РиР2 в составе CP кардиомиоцитов (Sagawa et al., 2003). Наши исследования впервые показали, что в моторных синапсах скелетных мышц дигоксин (ЗнМ) действует качественно сходно с рианодином, то есть открывает пресинаптические РиР, не влияя (в этой концентрации) па АТФазу мембраны терминали.

Несмотря на качественное сходство, имели место количественные отличия облегчающих эффектов дигоксина и рианодина. Учитывая, что рианодин активирует все три типа РиР, а дигоксин - только РиР2, можно было предполагать, что дигоксин будет менее эффективен. Однако дигоксин в ряде случаев оказывал более сильное, чем рианодин, облегчающее действие на спонтанную активность покоящихся (но не деполяризованных) терминалей, а также - на квантовый состав одиночных ПКП и уровень плато в залпе при строго определенных (низких - 7Гц) частотах залповой активности. Можно предполагать, что это связано с различиями в механизмах взаимодействия рианодина и дигоксина с РиР и дальнейшего перехода и удерживания РиР в открытом состоянии. Рианодин - экзогенный алкалоид, связывается с каналом РиР только в открытом состоянии, удерживает его в полупроводящем состоянии, обеспечивая длительную, но небольшую утечку депонированного кальция именно и только через РиР (Ehrlich et al., 1997; Hui et al., 2004). Имитирует ли рианодин действие какого-то эндогенного агониста РиР, и возможна ли такая медленная утечка депонированного кальция из Са2+-депо в норме, пока не известно. Тем не менее, этот реагент, в силу высокой специфичности, широко используется для выявления эффектов, опосредуемых именно РиР (Nishimura et al, 1990; Coronado et al., 1994; Ohizumi 1996; Hui et al., 2001, 2004). Мы установили, что рианодин (0,5мкМ) может привести к облегчению синаптической передачи лишь в случае достаточной предварительной Са2+-нагрузки терминали: чем она больше, тем более выражены облегчающие эффекты рианодина при спонтанной и вызванной активности синапсов.

Дигоксин можно считать более физиологичным и естественным реагентом (McGarry, Williams, 1995). Дигоксин с высоким сродством связывается с закрытым каналом РиР и переводит его в открытое состояние, причем взаимодействует только с РиР2. Мы установили, что облегчающее действие дигоксина не требует дополнительной кальциевой нагрузки терминалей (как это было характерно для рианодина). Исследование эффектов дигоксина позволяет, во-первых, выявить наличие пресинаптических РиР 2-го типа и, во-вторых - представить последствия воздействия на моторные синапсы эндогенных гликозидов - эндоксинов - структурно сходных либо идентичных дигоксину. (Такие гликозиды постоянно синтезируются и циркулируют в крови человека в норме, а также при ряде патологий (Ке,2001; Sagava, 2003)). Недавно в литературе появились сведения о присутствии в составе моторных терминалей лягушки РиР 3-го типа (Kubota et al., 2005). Вопрос о наличии в составе моторных терминалей РиР 2-го типа оставался открытым. Мы впервые обнаружили облегчающие передачу пресинаптические эффекты дигоксина, которые полностью нивелировались предварительной блокадой РиР. Это позволяет предполагать наличие выраженного пула РиР 2-го типа в моторных терминалях, способного избирательно, при определенных условиях (например, при действии эндогенных эндоксинов), усиливать выброс медиатора АХ и, тем самым, облегчать передачу в моторных синапсах.

Облегчающее эффекты рианодина и дигоксина означают, что пролонгирование ими активности РиР и/или увеличение вероятности и частоты перехода РиР в открытое состояние, приводя к усилению, пролонгированию выхода депонированного кальция в аксоплазму, действует синергично с потоком наружного кальция - то есть облегчает секрецию квантов АХ. Такой синергизм двух потоков кальция описан во многих типах клеток, а также терминалях центральных и периферических синапсов (см. обзоры Балезина, 2002; Bouchard et al., 2003; Verkhratsky, 2005). Он позволяет за счет стимулирования выброса депонированного кальция дополнительно усилить Са2+-сигнал и активацию Са2+-зависимых процессов, в том числе -секреции медиатора.

Обнаруженные количественные различия облегчающих эффектов у рианодина и дигоксина означают, что выброс кальция через разные типы РиР может быть адресован разным структурам и микропроцессам в терминали. Например, могут усиливаться разные по генезу кальциевые сигналы (формируемые поступлением наружного кальция по разным типам кальциевых входов - разным Са2+-каналам (L- или P/Q-типа), каналам н-ХР и другим). Интересной оказалась и ранее не описанная роль Са -каналов L-типа в активации РиР в деполяризованных терминалях. Роль этих каналов в активности моторных терминалей до сих пор остается не вполне ясной (Miller 1991; Балезина 2002; Зефиров, Ситдикова, 2002). Мы впервые установили, что при тонической деполяризации терминали этот тип каналов оказывает влияние на спонтанную секрецию медиатора, но лишь опосредованно - через активацию РиР и выброс депонированного Са2+. По-видимому, места расположения L-типа Са -каналов удалены от активных зон, но сближены с местами локализации РиР. В таком случае кальций, входящий по этим каналам в терминаль при деполяризации, сам может не достигать активных зон, по может быть нацелен исключительно на активацию близкорасположенных РиР и запуск выброса депонированного кальция. Сходное пространственно-функциональное сопряжение Са -каналов L-типа наружной мембраны с внутриклеточными РиР описано в соме нейронов, гладкомышечных и других типах клеток (Nelson et al., 1995; Chavis et al., 1996; Flink, Atchison, 2003).

Несмотря на многообразие облегчающих эффектов, обнаруженных нами при действии агонистов РиР, в ряде случаев мы выявили противоположные эффекты - подавление как спонтанной, так и вызванной секреции под действием агонистов РиР. Это позволило поставить вопрос о возможном существовании тормозных влияний на секрецию АХ при выбросе депонированного кальция. До сих пор такой способ еще не был описан в пресинаптических структурах.

В нашей работе впервые удалось выявить условия, при которых ярко проявляется противоположная вышеописанной функция высвобождаемого из депо кальция - ограничение Са2+-сигнала, противодействие Са2+-зависимому спонтанному и вызванному выбросу медиатора. Эта способность выявилась при использовании двух альтернативных подходов, а именно - и в экспериментах с блокадой РиР и с активацией РиР.

При фармакологической модуляции РиР мы не имели возможности

О 4напрямую наблюдать колебания [Са ]вн в терминали, но могли отслеживать изменения средней частоты МПКП, которая порой является более тонким и чувствительным индикатором колебаний [Са ]вн, чем Са -связывающий краситель Fura-2 (Angleson, Betz, 2001; Castonguay, Robitaille, 2001). Так, кривая повышения частоты МПКП при калиевой деполяризации терминали у, прямо отражает прирост [Са ]В11 и может служить своеобразной калибровочной кривой для определения степени повышения [Са2+]вн (Angleson, Betz, 2001; Castonguay, Robitaille, 2001). Мы убедились, что на фоне К+-деполяризации (с помощью 8мМ К+нар) имеет место трехкратный прирост частоты МПКП. Это соответствует подъему [Са2+]вн от 0,1 мкМ (в покое) до 0,2мкМ (на фоне деполяризации), достаточному для активации РиР (Angleson, Betz, 2001; Verkhratsky, 2005). Можно думать, что рианодин в этих условиях, связываясь с открытыми РиР, переводит их в долговременное полу проводящее состояние. Такое действие рианодина, как оказалось, подавляет возникший прирост частоты МПКП до базалыюго уровня. Если же использовать противоположный прием, то есть блокировать РиР, то прирост частоты МПКП, вызываемый с помощью 8мМ К+нар, становится значительно (в 10 раз) больше. Аналогичный феномен, а именно - растормаживание начального облегчения передачи на фоне блокады РиР, выявлен нами и в случае ритмической залповой активности терминалей (например, в залпах с частотой 7Гц у кураризированного препарата).

Эти факты означают, что входящий в терминаль (при деполяризации) наружный кальций активирует РиР и выброс депонированного кальция в аксоплазму, который, в свою очередь, начинает притормаживать вход наружного кальция и прирост частоты спонтанной секреции, то есть действует по принципу отрицательной обратной связи. (Аппликация рианодина (0,5мкМ) лишь усиливает этот тормозный процесс). Целесообразность такого тормозного механизма очевидна: при деполяризации терминали (часто развивающейся у работающего синапса) тоническое поступление кальция в терминаль чревато кальциевой перегрузкой.

Ограничение либо подавление входящего в клетку кальция с помощью выброса депонированного кальция (по принципу отрицательной обратной связи) уже описано в гладкомышечных, сердечных и нервных клетках, где это происходит путем активации К+Са-каналов (Nelson et al., 1995; Akita, Cuba, 2001). Нам также удалось показать, что блокада апамином К+Са-каналов приводит к прекращению тормозного действия рианодина. До сих пор главную роль в ограничении входящего Са2+-потока отводили высокопроводящим ибериотоксин-чувствительным К+Са-каналам (Sun et al., 2004). Эти каналы, локализованные в моторных терминалях, активируются

2+ 9+ при входе наружного Са по P/Q -типу Са -каналов и ограничивают вторую фазу пресинаптического ПД. Роль низкопроводящих апамин-чувствительных К+Са-каналов в моторных нервных терминалях оставалась не вполне понятной

Зефиров, Ситдикова, 2003). Мы установили, что в моторных синапсах этот тип каналов активируется кальцием, выбрасываемым из Ca -депо через РиР. Наши данные созвучны мнению Акиты и Кьюбы о том, что в нейронах существует своеобразная триада, состоящая из потенциал-зависимых Са2+-каналов, обеспечивающих вход наружного кальция, из активируемых этим кальцием РиР Са+-депо, и из К+Са-каналов, которые могут быть активированы за счет выброса депонированного кальция. Такая функционально сопряженная триада может контролировать входящий в клетку наружный кальций и Са2+-зависимые процессы по принципу отрицательной обратной связи (Akita, Cuba, 2000).

Однако наши (и литературные) данные не исключают и другую возможность, - когда торможение секреции медиатора при выбросе

2+ депонированного кальция обусловлено блокадой потенциал-зависимых Ca -каналов, вследствие прицельного воздействия ионов Са2+ на их внутреннее устье. Такой механизм обсуждается в работе Шварца, обнаружившего тормозное действие кофеина на вызванную ритмическую активность моторных синапсов крыс (Schwartz et al.,1999).

Обнаруженное нами подавление рианодином и дигоксином начального облегчения в высокочастотных залпах (50Гц) также, на наш взгляд, может происходить за счет избытка накапливающегося в активной зоне кальция, частично инактивирующего P/Q-тип Ca -каналов, либо насыщающего быстрые Са2+-буферы, работа которых обусловливает начальное облегчение секреции АХ в залпе (Zucker, Regher 2002).

Таким образом, суммируя проведенные исследования, можно сделать следующее заключение. В работающих моторных нервных терминалях мыши, когда имеет место вход наружного кальция, всегда (в той или иной степени) происходит активация РиР и выброс депонированного кальция, который может по-разному взаимодействовать с потоком входящего кальция и по-разному влиять на секрецию АХ. Возможны два противоположных способа регуляции - притормаживание либо - облегчение входящего в терминаль

2+ кальция и Ca -зависимой секреции (схема 1.).

Притормаживающее действие (как страховка от избытка поступающего кальция) по-видимому, всегда присутствует и включается первым. Тормозный механизм особенно важен и силен, если достаточно велик вход наружного кальция, как это имеет место у тонически деполяризованных герминалей, либо при высокочастотной ритмической активности и больших потоках входящего кальция (у интактного или рассеченного препарата). Выключение из работы РиР в этих условиях приводит к растормаживанию секреции (и спонтанной, и вызванной). Наши данные позволяют предполагать, что механизмом торможения секреции АХ (вследствие выброса депонированного кальция) служит подавление входа наружного кальция в терминаль, - за счет активации низкопроводящих К+са- каналов и гиперполяризации терминал и, либо - блокада потенциал-зависимых Са2+-каналов терминали, за счет прицельного действия на них изнутри кальция, выбрасываемого из Са+-депо.

Схема I. Нервная терминаль моторного синапса. Схематически показаны пути реализации тормозного и облегчающего действия на секрецию медиатора со стороны внетриклеточно высвобождаемого кальция. Аналогичные механизмы ограничения входа наружного кальция и Са2-сигнала под действием кальция, освобождаемого из Са2+-депо через РиР, недавно описаны и в других типах клеток (нервных, мышечных) (Sah, 1996; Sham, 1997; Schwartz et al., 1999; Urbano et al., 2001). Таким образом, у терминален с высоким уровнем активности и потоков входящего кальция, выброс депонированного кальция действует по принципу отрицательной обратной связи, притормаживая вход наружного кальция в терминаль и как следствие - секрецию квантов АХ.

•Л i

2002) - в случае повышения ионов Mg и дефицита кальция в среде. Можно предполагать, что в этих случаях механизм облегчающего действия внутриклеточно высвобождаемого кальция заключается в подпитке активных зон кальцием, увеличении квантового состава ПКП, усилении Са2+-зависимой мобилизации квантов АХ и др. (Балезина, 2002; Балезина, Букия, 2003).

Действие экзогенных агонистов РиР (рианодина и дигоксина) искусственно усиливающих, делающих более пролонгированным и/или генерализованным выброс депонированного кальция в терминали, может приводить не только к усилению секреции АХ (как это принято было считать), но и (в ряде случаев) к подавлению секреции АХ. Направленность эффекта зависит от интенсивности входящего потока кальция, Са2+-нагрузки терминали и других причин.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лаптева, Валентина Ивановна, Москва

1. Авдонин П.В., Ткачук В.А. Рецепторы и внутриклеточный кальций. // Москва: "Наука" 1994.

2. Айрапетян С.Н. Новая теория метаболической регуляции функциональной активности мембраны // Метаболическая функция мембран. Тр. Всес. Симпоз. «Мембранная энзимология и проницаемость мембран», Ереван. Изд-во АН Арм.ССР 1990 - С. 8-66.

3. Балезина О.П. Роль внутриклеточных кальциевых каналов нервных терминален в регуляции секреции медиатора // Усп. Физиол. Наук 2002 -Т. 33(3), С. 38-56.

4. Балезина О.П., Букия А.Н. Спонтанная активность нервно-мышечных синапсов мыши на фоне действия дантролена // Нейрофизиология 2001 -Т. 33, (4), С. 45-50.

5. Балезина О.П., Букия А.Н., Лаптева В.И. Разнонаправленное действие внутриклеточно высвобождаемого кальция на квантовую секрецию медиатора. // Российский физиологический журнал имени И.М. Сеченова -2005-Т. 91,(1), С. 61-70

6. Воронин Л.Л. Анализ пластических свойств центральной нервной системы //Тбилиси: Мецпиереба- 1982-С. 110-125.

7. Драбкина Т.М., Кривой И.И. От разнообразия молекулярных форм к функциональной специализации олигомерных белков Никотиновый холинорецептор, ацетилхолинэстераза и Ыа+,К+-АТФаза // Цитология -2004-Т 46(2), С. 89-104.

8. Зефиров А.Л., Ситдикова Г.Ф. Ионные каналы нервного окончания // Усп. Физиол. Наук 2002 - Т. 33(4), С. 3-33.

9. Зефиров А.Л., Черанов С.Ю. Молекулярные механизмы квантовой секреции медиатора в синапсе // Усп. Физиол. Наук 2000 - Т. 31(3), С. 322.

10. Ю.Каменская М.А. Современные представления о механизме квантового освобождения медиатора из моторных нервных окончаний скелетной мышцы //Усп. Физиол. Наук 1972-Т. 3(3), С. 22-63.

11. П.Катцунг Б.Г. Базисная и клиническая фармакология // Бином-Невский Диалект 1998.

12. Костюк П.Г. Кальций и клеточная возбудимость // Москва: "Наука" -1986, С.5-256.

13. П.Николлс Дж.Г., Мартин А.Р., Валлас Б.Дж., Фукс П.А. От нейрона к мозгу // Москва 2003 - С. 75-76.

14. Персон Р.С. Спинальные механизмы управления мышечным сокращением НЫл Наука- 1985 -С. 15-110.

15. Пивоваров А.С., Богуславский Д.В. Na+-K+-Hacoc регулирует снижение холиночувствительности нейронов виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания: зависимость от внутриклеточного кальция. // Ж. ВНД, 2000 - Т. 50, С. 855-965.

16. Рубцов A.M., Батрукова М.А. Кальциевые каналы (рианодиновые рецепторы) саркоплазматического ретикулума: структура и свойства // Биохимия 1997 - Т. 62(9), С. 1091-1105.

17. Adachi-Akahane S., Cleemann L., Morad M. Cross-signalling between L-type Ca channels an ryanodine receptors in rat ventricular myocytes // J.Gen.Physiol. 1996 - V. 108, P. 435-454.

18. Akita Т., K.Kuba. Functional triads consisting of ryanodine receptors, Ca(2+) channels, and Ca(2+)-activated K(+) channels in bullfrog sympathetic neurons. Plastic modulation of action potential // J.Gen.Physiol. 2000 -V. 116(5), P. 697-720.

19. Anderson AJ, Harvey AL, Rowan EG, Strong PN. Effects of charybdotoxin, a blocker of Ca2+-activated K+ channels, on motor nerve terminals. ю.//Вг J Pharmacol. 1988 Dec;95(4): 1329-35

20. Angleson J.K., Betz W.J. Intraterminal Ca2+ and spontaneous transmitter release at the frog neuromuscular junction // J.Neurophysiol 2001 - №1, P. 287-294.

21. Auld D., Colomar A., Belair E-L., Castonguay A., Pinard A., Rousse I., Thomas S., Robitaille R. Modulation of neurotransmission by reciprocal synapse-glial interactions at the neuromuscular junction // J. Neurocyt. 2003 - V.32, P.1003-1015.

22. Bardo S., Robertson B., Stephens G. Presynaptic internal Ca2+ stores contribute to inhibitory neurotransmitter release onto mouse cerebellar Purkinje cells // Br. J. Pharmacol. 2002 - V. 137(4), P. 529-537.

23. Berridge M.J. Elementary and global aspects of calcium signaling // J. Physiol. -1997 -V. 449(2), P. 291-306.

24. Berridge M.J., Irvine R.F. Inositol triphosphate: a novel second messenger in cellular signal transduction//Nature 1984 - V. 312, P. 315-321.

25. Bezprosvanny I, Watras J., Ehrlich B.E. Bell-shaped calcium response curve of Ins(l,4,5) P3 and calcium gated channels from endoplasmic reticulum. // Nature-1991 - V. 351, P. 751-754.

26. Bouchard R., Pattarini R., Geiger J.D. Presence and functional significance of presynaptic ryanodine receptors // Prog.Neurobiol. 2003 - V. 69, P. 391-418.

27. Castonguay A., Robitaille R. Differential regulation of transmitter release byj Ipresynaptic and glial Ca internal stores at the neuromuscular synapse // Neurosci. -2001 V. 21(6), P. 1911-1922.

28. Chavis P, Ango F, Michel JM, Bockaert J, Fagni L. Modulation of big K+ channel activity by ryanodine receptors and L-type Ca2+ channels in neurons // Eur J Neurosci. 1998 - V. 10(7), C. 2322-7.

29. Cheng H., Lederer W., Cannel MB. Calcium sparks: elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle // Science 1993 -V. 262, P. 740-744.

30. Coronado R., Morrissette J., Sukhareva M., Vaughan D.M. Structure and function of ryanodine receptors // Am. J. Physiol. 1994 - V. 266, P. 14851504.

31. Dajas-Bailador F., Wonnacot S. Nicotinic acetylcholine receptors and regulation of neuronal signaling.//Trends in Neurosci. 2004 - V. 25(6), P. 317-324.

32. Del Castillo J., Katz B. Statistical factors involved in neuromuscular facilitation and depression // J. Physiol. 1954 - V. 124(3), P. 574-585.

33. Durant N., Lee C., Katz R. The action of dantrolene on transmitter mobilization at the rat neuromuscular junction // Eur. J.Pharmacol. 1980 - V. 68(4), P. 403408.

34. Ehrlich E., Kaftan E., Bezprozvannaya S., Bezprozvanny I. The pharmacologyof intracellular Ca2+-release channels // Tr. Neurosci. (TINS) 1994 - V. 15, P. 145-149.

35. Elmquist D., Quastel D. A quantitative action of hemiholinium at the neuromuscular junction // J. Physiol. 1965 - V. 177(3), P. 463-482.

36. Emptage N.J., Reid C. A., Fine A. Calcium stores in hippocampal synaptic boutons mediate short-term plasticity, store-operated Ca entry, and spontaneous transmitter release // Neuron 2001 - V. 29, P. 197-208.

37. Flink M.T., Atchison W.D. Iberiotoxin-induced block of Ca -activated K channels induces dihydropyridine sensitivity of acetylcholine release from mammalian motor nerve terminals // J.Pharmacol. Exp. Ther. 2003 - V. 305(2), P. 646-652.

38. Fossier F., Tauc L., Baux G. Calcium transients and neurotransmitter release at an identified synapse // TINS 1999 - V. 22, P. 161-166.

39. Ginsborg B.L., Hirst G. The effects of adenosine on the release of the transmitter from the phrenic nerve of the rat // J. Physiol. (Lond.) 1972 - V. 224, P. 629645.

40. Gruber KA, Whitaker JM, Buckalew VM Jr. Endogenous digitalis-like substance in plasma of volume-expanded dogs // Nature 1980 - V. 287(5784), C. 743-5

41. Haiman C., Torri-Tarelli F., Fesce R., Ceccarelli B., Measurment of quantal secretion induced by ouabain and its correklation woith depletion of synaptic vesicles.// J.CellBiol. 1987- V. 101, P. 1953-1965.

42. Hennig R., LomoT. Firing patterns of motor units in normal rats // Nature -1985-T. 314(6007), C. 164-6.

43. Henzi V., MacDermott A.B. Characteristics and function of Ca and inositol 1,4,5-triphosphate-releasable stores of Ca2+ in neurons // Neurosci. -1992 -V. 46, P. 251-274.

44. Hui C.S., Bidasse K.R., Besch HR Effects of ryanodine on calcium sparks in cut twitch fibres of Rana temporaria // J. Physiol. 2001 - V. 15;534(Pt. 2) P. 32742

45. Hui CS, Besh H.R, Bidasee KR Effects of ryanoids on spontaneous and depolarization-evoked calcium release events in frog muscle // Biophys. J.2004-V. 87(1), C. 243-55.

46. Irving A.J., Collingridge G.L., Schofield J.G. Interactions between Ca2+ mobilizing mechanisms in cultured rat cerebellar granule cells // J. Physiol. -1992-V. 456, P. 667-680.

47. Kano M., Garaschuk O., Verkhratsky A., Konnerth A. Ryanodine receptor-mediated intracellular calcium release in rat cerebellar Purkinje neurones // J. Physiol. 1995 - V. 487(1), P. 1-16.

48. Kashapova L., Moshkov D.A., Bezgina E.N. Active zones and plasticity of motor nerve terminals // In: Plasticity of Motoneuronal connections". A.Wernig (Ed.). Elsevier. 1991 - Chapt. 17, P. 163-173.

49. Katz B., Miledi K. Further study of the role of calcium in synaptic transmittion // J. Physiol. 1970 - V. 207(3), P. 789-801.

50. Kawai T., Watanabe M. Effects of ryanodine on spike afterhyperpolarization in sympathetic neurons of the rat superior cervical ganglion // Pflug. Arch. 1989 - V. 413, P. 470-475.

51. Ke Y-Sh.Endoxin: major factor regulating cardiovascular system // Acta Pharmcol.Sin 2001 - V. 22(3). P. 201-209.

52. Kiselyov K, Muallem S. Fatty acids, diacylglycerol, Ins(l,4,5)P3 receptors and Ca2+ influx // Trends Neurosci. 1999 - V. 22(8), C. 334-7.

53. Konnerth A., Dreessen J., Augustine G.J. Brief dendritic calcium signals initiate long-lasting synaptic depression in cerebellar Purkinje cells // PNAS 1992 - V. 89, P. 7051-7055.

54. Kuba K. Ca2+-induced Ca2+ release in neurones // Jap. J. Physiol. -1994 V. 44, P. 613-650.

55. Kuba K. Release of calcium ions linked to the activation of potassium conductance in caffeine treated sympathetic neurons // J. Physiol. 1980 - V. 298, P. 251-259.

56. Kuba K., Nishi S. Rhythmic hyperpolarizations and depolarization ofsympathetic ganglion cells induced by caffeine // J. Neurophysiol. 1976 V. 39, P. 547-563.

57. Kubota M., Narita K., Murayama T., Suzuki S., Soga S., K. Kuba // Type-3 ryanodine receptor involved in Ca-induced Carelease and transmitterexocytosisat frog motor nerve terminals. // Cell Calcium 2005 - V. 38(6) P.557.567.

58. Lee H.C. Mechanisms of calcium signalling by cyclic ADP-ribose and NAADP // Physiol. Rev. 1997 - V. 77, P. 1133-1164.

59. Liang Y., Yuan Li-L., Jonston D., Gray R. Calcium signaling at single mossy fiber presynaptic terminals in the rat hippocampus // J. Neurophysiol. 2002 -V. 87(2), P. 1132-1137.

60. Lipscombe D., Madison D.V., Poenie M., Reuter H., Tsien R.W., Tsien R.Y. Imaging of cytosolic Ca2+ transients arising from Ca2+ stores and Ca2+ channels in sympathetic neurons // Neuron 1988- V. 1, P. 355-365.

61. Lipscombe D., Madison D.V., Poenie M., Reuter H., Tsien R.W., Tsien R.Y.

62. Spatial distribution of calcium channels and cytosolic calcium transients in growth cones and cell bodies of sympathetic neurons // PNAS 1988 - V.85, P.2398-2402.

63. Llano I., Gonzalez J., Caputo C., Lai F., Blayney L., Tan Y., Marty A. Presynaptic calcium stores underlie large-amplitude miniature IPSCs and spontaneous calcium transients // Nat.Neurosci. 2000 - V. 3(12), P. 12561265.

64. Llinas R.R., Sugimori M., Silver R.B. Microdomains of high calcium concentration in presynaptic terminal // Science 1992 - V. 256. P. 677-679.

65. Losavio A. and Muchnik S. Spontaneous acetylcholine release in mammalian neuromuscular junction//Am. J. Physiol. 1997 - V. 273, P. 1835-1841.

66. Maeno T., Hara N., Enomoto K.,IchinoseM., Sawadam.//Effects of inhibitors of ouabain-sensitive Na-KATPase and Li ions on the neuro-muscular transmission of the frog. //Jap. J.Physiol. 1995 - V. 45, P. 397-410.

67. Magleby K.L., Zengel J.E. A quantitative description of tetanic and post-tetanic release at the frog neuromuscular junction // J. Physiol. 1975 - V. 245, P. 183208.

68. Magleby K.L., Zengel J.E. Long-term changes in augmentation potentiation and depression of transmitter release as a function of repeated activity at the frog neuromuscular junction // J. Physiol. 1976 - V. 257, P. 471-494.

69. Mallart A. Electric current flow inside perineurial sheats of mouse motor nerves.//J.Physiol. 1982 - V. 363, P. 565-575.• • • • • • 94

70. McGarry S.J., Williams A. Digoxin activates sarcoplasmic reticulum Ca -release channels: a possible role in cardiac inotropy // Brit. J. Pharmacol. 1993 -V. 108, P. 1043-1050.

71. McGraw C.F., Somlyo A.U., Blaustaein M.P. Localization of calcium in presynaptic nerve terminals // J. Cell. Biol. 1980 - V. 85, P. 228-241.

72. Meissner G. Ryanodine receptor/Ca release channels and their regulation by endogenous effectors // Ann. Rev. Physiol. 1994 - V. 56, P. 485-508.

73. Melamed N., Helm J., Rahamimoff R. Confocal microscopy reveals coordinated calcium fluctuations and oscillations in synaptic boutons // J. Neurosci. 1993 -V. 13 (2), P. 632-649.

74. Melzer W, Herrmann-Frank A, Luttgau HC. The role of Ca2+ ions in excitation-contraction coupling of skeletal muscle fibres // Biochim Biophys Acta 1995 -V. 1241(1), C.59-116

75. Mikkelsen EO, Thastrup O, Christensen SB. Effects of thapsigargin in isolated rat thoracic aorta // Pharmacol Toxicol. 1988 - V. 62(1), C. 7-11.

76. Miller R.J. The control of neuronal Ca2+ homeostasis.// Prog. Neurobiol. 1991 -V. 37, P. 255-285.

77. Mironov S.L. Mechanisms of Ca mobilization in chick sensory neurons // NeuroReport. 1994. V. 5. P. 445-448.

78. Mironov S.L., Usachev Y.M. Caffeine affects Ca2+ uptake and Ca2+a release from intracellular stores //Neurosci. Lett. 1991 - V. 123, P. 200-202.

79. Mitra P., Slaughter M. Calcium-induced transitions between the spontaneous miniature outward and the transient outward currents in retinal amacrine cells // J.Gen.Physiol. 2002 - V. 119(4), P. 373-88.

80. Morita K., Barret E.F. Evidens of two calcium-dependent potassium conductances on lizard motor nerve terminals // J. Gen Physiol. 1990 - V. 10(8), P. 2614-2625.

81. Narita K, Akita T, Hachisuka J, Huang S.-M., Ochi K, and Kuba K. Functional coupling of Ca channels to ryanodine receptors at presynaptic terminals // J. Gen. Physiol. 1989 - V. 115, P. 519-532.

82. Narita K, Akita T, Osanai M, Shirasaki T, Kijima H, and Kuba K. A Ca2+~-induced Ca2+ release mechanism involved in asynchronous exocytosis at frog motor nerve terminals // J. Gen. Physiol. 1998 - V. 112, P. 593-609.

83. Neelands T.R.,Herson PS, Jacobson D.,Adelman JP,MaylieJ. Small-conductance calcium-activated potassium currents in mouse hyperexcitable denervated skeletal muscle. //J.Physiol. 2001 - V.15;536(Pt 2), P. 397-407.

84. Neher E. Vesicle pools and Ca2+ microdomains: new tools for understanding their roles in neurotrasmitter release // Neuron 1998 - V. 20, P. 389-399.

85. Nelson M., Cheng H., Rubart L., Santana A., Bonev H., Knot H., Lederer H. Relaxation of arterial smooth muscle by Ca -sparks // Science 1995 - V.270, P.633-637.

86. Nilius B. Store-operated Ca2+ entry channels: still elusive! // Sci. STKE -2004 -V. 243, P 36-.

87. Parsons S.M., Prior Ch., Marshallt I.G. Acetylcholine transport, storage and release // Int. Rev. of Neurobiol. 1993 - V. 35, P. 279-347.

88. Peng Y. Ryanodine-sensitive component of calcium transients evoked by nerve firing at presynaptic nerve terminals // J. of Neurosci. 1996 - V. 16 (21), P. 6703-6712.

89. Pozzan T., Voipe P., Rizzuto R., Meldolesi J. Molecular and cellular physiology of intracellular calcium stores // Physiol. Rev. 1994 - V. 74, P. 595-636.

90. Robitaille R., Garsia M., Karczorowski D., Charlton M. Functional colocalization of calcium and calcium gated potassium channels in control of transmitter release // Neuron 1993 - V. 11, P. 645-655

91. Roed A. Caffeine-induced blockade of neuromuscular transmission and its reversal by dantrolene sodium // Eur. J. Pharmacol. 1982 - V. 83, P. 83-90.

92. Sagawa T., Sagawa K., Kelly J., Tsushima R., Wasserstrom A., Activation of cardiac ryanodine receptors by cardiac glycosides.// Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2002 - V. 282, P. 1118-1126.

93. Sah P. Ca2+-activated K+ currents in neurons: types, physiological roles and modulation // TINS 1996 - V. 11, P. 150-154.

94. Saiki Y, Ikemoto N. Coordination between Ca release and subsequent reuptake in the sarcoplasmic reticulum // Biochemistry 1999 - V. 38(10), C. 3112-9.

95. Satin L.S., Adams P.R. Spontaneous minituare outward currents in cultured bullfrog neurons// Brain. Res. 1987 - V. 401, P. 331-339.

96. Satrustegui J .Martinez-Serrano A, Bogonez E, Vitorica J, Slatrustegui J.1. • • ^ • •

97. Reduction of K -stimulated 45Ca influx in synaptosomes with age involves inactivating and noninactivating calcium channels and is correlated with temporal modifications in protein dephosphorylation // J Neurochem. 1989 -V. 52(2), C. 576-84

98. Satrustegui J.,Martinez-Serrano A, Bogonez E, Vitorica J. Caffeine-sensitive calcium stores in presynaptic nerve endings: a physiological role? // Biochem Biophys Res Commun. 1989-V. 161(3), C. 965-71.

99. Schwartz A., Whitacre C.L., Wilson D. Do ryanodine receptors regulate transmitter release at the neuromuscular junction of the rat? // Neurosci. Letter -1999-V. 274, P. 163-166.

100. Sham J.S.//J.Physiol. 1997-V. 500. P. 285-299.

101. Sharma G, Vijayaraghavan S. Modulation of presynaptic store calcium induces release of glutamate and postsynaptic firing // Neuron 2003 - V. 38(6), C. 929-39.

102. Silinsky E.M. The biophysical Pharmacology of Calcium-Dependent Acetylcholine Secretion // Pharmacol. Rev. 1985 -V. 37(1), P. 81-131.

103. Simkus C., Strieker C. The contribution of intracellular calcium stores to mEPSCs recorded in layer II neurones of rat barrel cortex // J.Physiol. 2002 -V. 545 (2), P. 521-535.

104. Simpson P.B., Challiss R.A.J., Nahorski S.R. Neuronal Ca2+ stores: activation and function // TINS 1995 - V. 18, P. 299-306.

105. Sitsapesan R, McGarry SJ, Williams AJ. Cyclic ADP-ribose, the ryanodine receptor and Ca2+ release // Trends Pharmacol Sci. 1995 - V. 16(11), C. 38691.

106. Sitsapesan R, Montgomery RA, Williams AJ. New insights into the gating mechanisms of cardiac ryanodine receptors revealed by rapid changes in ligand concentration // Circ Res. 1995 - V. 77(4), C.765-72.

107. Smith A.B., Cunnan T.C. Omega-conotoxin GVIA-resistant neurotransmitter release in postganglionic sympathetic nerve terminals // Neurosci. 1996 - V. 70 (3), P. 817-824.

108. Smith A.B., Cunnan T.C. Ryanodine-sensitive calcium stores involved in neurotransmitter release from sympathetic nerve terminals of the guinea-pig // J. Physiol. (Lond.). 1996 - V. 493 (3), P. 657-664.

109. Statham H.E., Duncan C.J. The action of ionophores at the frog neuromuscular junction // Life Sci. 1975 - V. 17, P. 1401-1406.

110. Stocker M. Ca -activated K -channels: molecular determinants and function of the SK family // Neurosci. 2004 - V. 5, P. 758-770.

111. Sun X.-P., Yazejian B., Grinell A.D. Electrophysiological properties of BK-channels in Xenopus motor nerve terminals // J. Physiol. 2004 - V. 557(1), P. 207-228.

112. Sun Z.-P., Schlichter L., Stanley E.F. Single-channel properties of BK-type calcium-activated potassium channels at cholinergic presynaptic nerve terminal // J. Physiol. 1999 - V. 518(3), P. 639-651.

113. Sutko J.L., Airey J.A. Ryanodine receptor Ca2+ release channels: does deversity in form equal diversity in function // Physiol. Rew. 1996 - V. 76, 1027-1071.

114. Takemura H., Hughes A., Thastrup O., Putney J. Activation of calcium entry by the tumor promoter thapsigargin in parotid acinar cells // J. Biol. Chem. -1989 V. 246(21), P. 12266-12271.

115. Tareilus E., Breer H. Presynaptic calcium channels: pharmacology and regulation // Neurochem. Int. 1995 - V. 26(6). P. 539-558.

116. Teshima K., Kim SH,Allen CN Characterization of an apamin-sensitive potassium current in suprachiasmatic nucleus neurons // Neuroscience 2003 -V. 120(1), P. 65-73.

117. Tsien R.W., Tsien R.Y. Calcium channels, stores and oscillations // Rev. Cell. Biol. 1990 - V. 6, P. 715-760.

118. Urbano F.J., Depetris R., Uchitel O.D. Coupling of L-type calcium channels to neurotransmitter release at mouse motor nerve terminals // Pflug. Arch. (Eur. J. Physiol.) 2001 - V. 441, P. 824-831.

119. Urbano FJ, Uchitel O.D. L-type calcium channels unmasked by cellj Ipermeant CaZT buffer at mouse motor nerve terminals // Pflug. Arch. (Eur J. Physiol.) 1999 - V. 437. P. 523-528.

120. Van der Kloot W. Loading and recycling of synaptic vesicles in the Torpedo electric organ and the vertebrate neuromuscular junction // Prog. Neurobiol. -2003-V. 71(4), P. 269-303.

121. Van der Kloot W., Molgo J. Quantal acetylcholine release at the vertebrate neuromuscular junction // Physiol. Rev. 1994 - V. 74(4), P. 899-991.

122. Verkhratsky A. Physiology and pathophysiology of calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons. // Phys.Rev. 2005.-V.85.P.201-278.

123. Vizi E.S. Na-K activated adenosintriphosphatase as a trigger in transmitter release.//Neurosci. 1978 - V. 3, P. 367-384.

124. Yamada S., Takeuchi H., Kanchiku I., Kita T.,KatoN. Small-conductance Ca2+-dependent K+ channels are the target of spike-induced Ca2+ release in a feedback regulation of pyramidal cell excitability // J.Neurophysiol. 2004 - V. 91(5) P. 2322-9.

125. Yazejian B., Sun X.-P., Grinnell A. Tracking presynaptic Ca2+ dynamics• • • 2+ • +during neurotransmitter release with Ca -activated K channels // Nature

126. Neurosci. 2000 - V. 3(6), P. 566-571.

127. Zhao F, Li P, Chen S.R, Louis C.F, Fruen B.R. Dantrolene inhibition of ryanodine receptor Ca release channels: molecular mechanism and isoform selectivity//J.Biol. Chem. 2001 - V. 276(17), P. 13810-13816.

128. Zorzato F., Fujii J., Otsu K., Phillips M., Green N.M. Molecular cloning of cDNA encoding human and rabbit forms of Ca2+ release channel (ryanodine receptor) of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum // J. Biol.Chem. 1990 - V. 265, P. 2244-2256.

129. Zucchi R., Ronca-Testoni S. The sarcoplasmic reticulum Ca2+ channels/ryanodine receptor: modulation by endogenous effectors, drugs and deseas states // Pharm. Rev. 1997 - V. 49, P. 1-50.

130. Zucker R.S. Changes in statistics of transmitter release during facilitation // J. Physiol. 1973 - V. 229, P. 787-810.

131. Zucker R., Regehr W. Short-term synaptic plasticity // Ann.Rev.Physiol. -2002-V. 64, P. 355-405.

Информация о работе

Лаптева, Валентина Ивановна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.13

Диссертация

Разнонаправленное действие кальция, высвобождаемого из Ca2+-депо, на квантовую секрецию медиатора - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы