Роль кальциевых каналов разных типов в регуляции квантовой секреции в нервно-мышечных синапсах мыши и лягушки

Васин, Александр Львович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль кальциевых каналов разных типов в регуляции квантовой секреции в нервно-мышечных синапсах мыши и лягушки
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль кальциевых каналов разных типов в регуляции квантовой секреции в нервно-мышечных синапсах мыши и лягушки"

ИУ4607779

На правах рукописи

Васиы Александр Львович

РОЛЬ КАЛЬЦИЕВЫХ КАНАЛОВ РАЗНЫХ ТИПОВ В РЕГУЛЯЦИИ КВАНТОВОЙ СЕКРЕЦИИ В НЕРВНО-МЫШЕЧНЫХ СИНАПСАХ МЫШИ И ЛЯГУШКИ

03.03.01 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 2 СЕН 2010

Казань 2010

004607779

Работа выполнена в лаборатории биофизики синаптических процессов Учреждения Российской Академии наук Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН и на кафедре медицинской и биологической физики ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Бухараева Элля Ахметовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Гайнутдинов Халил Латыпович доктор биологических наук, доцент Ситдикова Гузель Фаритовна

Ведущая организация: Московский государственный

университет им. М.В. Ломоносова (биологический факультет)

Защита состоится «14» сентября 2010 г. в _ часов на заседании

Диссертационного совета при ГОУ ВПО «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» по адресу: 420021, г. Казань, ул. Татарстан, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» по адресу: 420021, г. Казань, ул. Татарстан, 2

Автореферат разослан « 3 » еЖ^ста 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Зефиров ТЛ.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Исследование молекулярных механизмов процессов передачи возбуждения в синапсе является одним из перспективных подходов для понимания способов обеспечения пластичности нервной системы, лежащих в основе таких фундаментальных физиологических процессов как обучение, память, управление движением, патогенез ряда заболеваний центральной и периферической нервной системы, а также для создания фармакологических препаратов, избирательно действующих на разные этапы процесса передачи информации в синапсе. Традиционно в качестве ведущих пресинаптических факторов обеспечения синаптической пластичности рассматриваются изменение количества квантов медиатора, освобождающихся в ответ на нервный импульс (Zucker R.S. and Regehr W.G., 2002) и размера кванта (Van der Kloot W., 1991). Вместе с тем, в последние годы показано существование еще одного, ранее не учитываемого эффективного механизма пресинаптической модуляции передачи возбуждения, связанного с изменепием временного хода (кинетики) секреции выделения квантов, формирующих многоквантовый ответ (Bukharaeva Е. et al., 1999, 2002; Nikolsky Е. et al., 2004). Ранее проведенные экспериментальные исследования дают основания полагать, что механизмы, контролирующие кинетику секреторного процесса, являются кальций-зависимыми, однако отличными от механизмов, определяющих количество освобождаемых квантов медиатора (Bukharaeva Е. et al., 1999; Pamas I. et al., 1999; Neher E., 2005; Bukharaeva E. et al., 2007), что ставит задачу более тщательного изучения путей кальциевой регуляции кинетики выделения квантов.

окончаниях каналов других типов (Robitaille R. et al., 1996; Day N.C. et al., 1997; Sand 0. et al., 2001; Pagani R. et al., 2004). Однако вопрос о том, какую роль играют разные каналы в регуляции таких параметров секреторного процесса как кинетика и количество освобождаемых квантов, остается открытым. В связи с многообразием пресинаптических потенциал-зависимых кальциевых каналов, разным представительством в нервно-мышечных синапсах теплокровных и холоднокровных, для понимания механизмов регуляции интенсивности и кинетики секреции и поиска эффективных способов избирательного воздействия на эти механизмы, актуальным является сопоставление роли потенциал-зависимых кальциевых каналов, участвующих в регуляции вызванной секреции ацетилхолина в нервно-мышечных синапсах позвоночных.

Цель и задачи исследования

Целью исследования является изучение роли потенциал-зависимых кальциевых каналов разных типов в регуляции количества и кинетики секреции квантов, освобождаемых из двигательных нервных окончаний лягушки и мыши.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать зависимость количества освобождаемых квантов и кинетики их секреции в синапсах лягушки и мыши от содержания ионов кальция во внеклеточной среде.

2. Изучить влияние неспецифических блокаторов потенциал-зависимых кальциевых каналов магния и кадмия на параметры квантовой секреции медиатора в синапсах лягушки и мыши.

3. Определить влияние специфических блокаторов потенциал-зависимых кальциевых каналов разных типов (N, P/Q и L) на параметры квантовой секреции медиатора в синапсах лягушки и мыши.

4. Оценить эффекты совместной блокады потенциал-зависимых кальциевых каналов разных типов на параметры квантовой секреции в синапсах лягушки и мыши.

Положения, выносимые на защиту ■ В нервно-мышечном синапсе холоднокровных (лягушка) N, P/Q и L

потенциал-зависимые кальциевые каналы участвуют в регуляции как

количества квантов ацетилхолина, освобождаемых в ответ на нервный импульс, так и кинетики их секреции.

■ В нервно-мышечном синапсе теплокровных (мышь) Р/С* потенциал-зависимые кальциевые каналы контролируют только количество выделившихся квантов медиатора, а каналы Ь-типа участвуют в модуляции числа выделяемых квантов и кинетики их секреции в условиях высокой степеии асинхронности освобождения, каналы № типа не принимают участия в регуляции вызванной секреции квантов.

Научная новизна

В ходе проведенных исследований сопоставлена кальциевая регуляция параметров вызванной квантовой секреции ацетилхолина в традиционных для классической нейрофизиологии объектах - синапсах лягушки и мыши. Впервые выявлено, что в исследованном диапазоне концентраций кальция, который позволяет оценить кинетику секреции отдельных квантов, при качественно одинаковой кальциевой зависимости количества выделяемых квантов в этих синапсах наблюдается разная кинетика их освобождения. Кинетика секреции квантов в синапсах мыши проявляет более выраженную зависимость от внеклеточной концентрации ионов кальция, чем в синапсах лягушки, и освобождение становится более синхронным при насыщающей концентрации кальция. Впервые на основании сопоставления коэффициентов Хилла для концентрационных зависимостей квантового состава и кинетики секреции в синапсах лягушки и мыши сделан вывод о том, что количество освобождаемых квантов и кинетика их выделения находятся под контролем разных механизмов с отличающейся чувствительностью к ионам кальция. Несмотря на то, что при уменьшении концентрации кальция степень асинхронности секреции возрастает в обоих типах синапсов, уменьшение входа кальция при использовании неспецифических блокаторов кальциевых каналов сопровождается разнонаправленным изменением степени синхронности секреции. Впервые показано, что в синапсах лягушки кальциевые каналы Ы, Р/<3 и Ь типов участвуют в регуляции как квантового состава, так и кинетики секреции. В синапсах мыши проявляются различия в функциональной роли этих каналов: каналы Р/'С>-типа регулируют только квантовый состав, не затрагивая кинетику секреции, а каналы Ь-типа могут принимать участие в регуляции как количества секретируемых квантов, так и их кинетики в условиях исходно высокой степени асинхронности секреции.

Научно-практическая значимость

Основное значение результатов проведенного исследования состоит в

получении данных о функционально различной роли потенциал-зависимых кальциевых каналов разных типов в синапсах теплокровных и холоднокровных, о разном характере зависимости кинетики секреции квантов от концентрации кальция в этих синапсах, что необходимо учитывать при анализе эффектов различных фармакологических агентов, обладающих каналоблокирующими свойствами. Выявленная способность блокатора P/Q каналов в синапсах мыши избирательно модулировать квантовый состав, не затрагивая кинетику секреции, дает дополнительное доказательство того, что разные механизмы участвуют в регуляции квантового состава и кинетики секреции медиатора. Полученные данные важны для сравнительной физиологии, а также для понимания механизмов развития каналопатий и фармакологических исследований, направленных на тестирование новых лекарственных препаратов, обладающих каналоблокирующими свойствами.

Апробация работы

Материалы работы доложены на VIII East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology (Kazan, 2006); Всероссийских научно-практических конференциях «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007,2008,2009); Международной школе PENS Summer course «Contemporary Problems of Neurobiology: Molecular Mechanisms of Synaptic Plasticity» (Kazan, 2007); международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2008,2010); IV и V международных междисциплинарных конгрессах «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2008, 2009); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009).

Работа выполнена при поддержке грантами РФФИ № 08-04-00923, Президента РФ «Ведущая научная школа» НШ-4177.2008.4 и Американского Фонда Гражданских исследований (CRDF RUB1-2823-KA06).

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 107 страницах., иллюстрирована 38 рисунками и 2 таблицами. Список цитируемой литературы содержит 165 источников, из них 154 иностранных авторов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнялись на изолированном френико-диафрагмальном препарате белых лабораторных мышей обоего пола весом 20-25 г и на изолированном нервно-мышечном препарате кожно-грудинной

мышцы озерных лягушек (R. ridibunda) в осенне-зимний период. Приготовление изолированных нервно-мышечных препаратов производили в условиях эфирного наркоза.

Выделенные мышцы с фрагментом нерва закрепляли на подложке из смолы Sylgard в экспериментальной ванночке, объемом 5 мл, через которую со скоростью 5 мл/мин протекал физиологический раствор следующего состава: а) для теплокровных (ммоль/л): NaCl - 115.0; KCl - 5; Hepes 5.0; глюкоза 11.0; б) для холоднокровных: NaCl 113.0; KCl 2.5; NaHC03 3.0. Концентрацию СаС12 изменяли в диапазоне 0.2 - 0.6 ммоль/л, a MgCb 4.0 — 8.0 ммоль/л. Для сохранения изоосмотичности растворов, изменение содержания двухвалентных катионов корректировали соответствующим изменением концентрации NaCl. pH растворов поддерживали на уровне 7.2 — 7.4. Все эксперименты проводили при температуре 20.0±0.3°С, стабилизацию которой осуществляли при помощи встроенных в дно ванночки элементов Пельтье и отслеживали с помощью миниатюрного датчика, расположенного в ванночке в непосредственной близости от микроэлекгрода.

В экспериментах были использованы следующие вещества (все фирмы Sigma): со -конотоксин GVIA, ю -агатоксин IVA, нитрендипин, ДМСО (диметилсульфоксид). Поскольку нитрендипин растворялся в ДМСО, конечная концентрация которого в растворе не превышала 0.1%, то предварительно были проведены эксперименты по анализу эффектов растворителя на исследуемые процессы.

Одновременная регистрация токов действия нервного окончания и одпоквантовых токов концевой пластинки

Для одновременной регистрации токов действия нервного окончания и токов концевой пластинки (ТКП) под визуальным контролем к области синапса подводился микроэлеетрод, заполненный физиологическим раствором, с оплавленным кончиком и диаметром 2.5-3.5 мкм, (сопротивление 2.0-4.0 Мом). Для визуализации синаптической области использовали микроскоп Olympus BW-51, оснащенный водоимерсионным объективом LUMPPlan FI 40х фирмы Olympus. Микроэлектрод подводили таким образом, чтобы была возможна одновременная регистрация токов действия нервного окончания и постсинаптического ПШ в проксимальной области синаптического контакта на расстоянии 5-10 мкм от последнего перехвата Ранвье.

Стимуляцию двигательного нерва осуществляли с помощью «всасывающего» электрода прямоугольными электрическими импульсами длительностью 0.1 мс супрамаксимальной величины с частотой 0.5 имп/с.

Зарегистрированные сигналы после фильтрации до 10 кГц усиливали и подавали на вход 16 разрядного аналого-цифрового преобразователя, квантуя с интервалом 3-5 мкс. Анализ вызванных сигналов в «окне» регистрации длительностью 10 мс осуществляли с помощью персонального компьютера и созданной в нашей лаборатории программы.

Так как при попадании в «окно» регистрации спонтанно возникающих миниатюрных ТКП возможны искажения результатов измерения, в каждом опыте на основании измерений средней частоты спонтанных сигналов рассчитывали вероятность их попадания в окно регистрации. Если эта вероятность превышала значение 0.005 (то есть 5 сигналов на 1000 стимулов), то такой эксперимент не принимался в расчет.

Анализ параметров токов действия нервного окончания и одноквантовых ТКП

Для оценки параметров тока действия нервного окончания измеряли максимальное значение амплитуды натриевой компоненты и ее длительность на уровне 50% от максимальной амплитуды. Для оценки одноквантовых токов концевой пластинки (ТКП) анализировали максимальную амплитуду, время нарастания переднего фронта от 20 до 80% максимального значения амплитуды и постоянную времени спада ТКП. Амплитуду зарегистрированных экстраклеточных сигналов выражали в мВ.

Средний квантовый состав (ш) определяли, используя прямой метод подсчета количества выделившихся квантов или метод «выпадений» (Del Castillo J. and Katz В., 1954; Katz В. and Miledi R., 1965; Martin A., 1955), no формуле: m=ln N/n0, где N - общее число импульсов, n0 - число выпадений. Количество зарегистрированных одноквантовых ответов в каждом опыте варьировало в пределах 300-500.

Оценка параметров временного хода вызванной секреции квантов медиатора

Величину истинной синаптической задержки определяли как временной интервал от пика натриевой компоненты тока нервного окончания до начала ТКП на уровне 20% от максимального значения его амплитуды. Для анализа временного хода квантовой секреции медиатора строили гистограммы и кумулятивные кривые распределения истинных синаптических задержек одноквантовых ТКП.

Анализировали следующие характеристики временного хода секреции:

1) величину минимальной синаптической задержки. С этой целью зарегистрированные величины истинных синаптических задержек

одноквантовых ТКП ранжировали по возрастанию и усредняли первые 5% значений от общего количества сигналов в контрольных условиях или после подачи вещества.

2) главную моду гистограммы распределения синоптических задержек.

3) степень асинхронности секреции квантов медиатора. Исходя из результатов измерения истинных синаптических задержек для отобранных одноквантовых ТКП (соответствующих первому пику на гистограмме амплитуд всех зарегистрированных ТКП) строили кумулятивные кривые и анализировали значение квантиля на уровне 90% (Бронштейн И.Н. и Семендяев К.А., 1986; Van der Kloot W., 1991). Параметр P90 характеризовал временной интервал, в который попадало 90% измеренных значений истинных синаптических задержек одноквантовых ПОТ. Чем выше значение параметра Р90, тем более выражена асинхронность секреции медиатора.

Статистическая обработка результатов

Для статистической обработки использовали программу Microcal Origin 7.5. Использовали стандартные методы определения средних величин, стандартных ошибок, а также параметрический t-критерий Стьюдента для попарно связанных вариант. Достоверность различия двух кумулятивных кривых определяли по критерию Колмогорова-Смирнова (Бронштейн И.Н. и Семендяев К.А., 1986; Van der Kloot W., 1991) на уровне значимости 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сопоставление параметров секреции медиатора в синапсах лягушки и мыши при варьировании внеклеточной концентрации ионов кальция1

Прежде чем сопоставлять роль потенциал-зависимых кальциевых каналов в регуляции параметров вызванной секреции в синапсах теплокровных и холоднокровных, необходимо было сравнить характер зависимости параметров секреции квантов от изменения внеклеточной концентрации ионов кальция ([Ca2v]0) для того, чтобы определить насколько существенно сказывается изменение входа кальция из внеклеточной среды на количестве освобождаемых квантов и временном ходе их выделения. Число освобождающихся квантов и их истинные синаптические задержки оценивали при варьировании [Са2+]0 в диапазоне от 0.2 до 0.6 ммоль/л при

1 Часть исследований, представленных а данном разделе, выполнена совместно с кбн А.Н.Ценцевицким и кбн Д.В.Самигуллиным

постоянной концентрации ионов магния (4 ммоль/л). Амплитудно-временные параметры одноквантовых ТКП и параметры тока действия нервного окончания в препаратах лягушки и мыши не изменялись при варьировании [Са2+]0. Эти данные свидетельствуют об отсутствии изменения чувствительности постсинаптической мембраны к ацетилхолину и возбудимости мембраны нервного окончания в исследуемом диапазоне концентраций кальция.

Характер изменения среднего квантового состава постсинаптических ответов при варьировании [Са2+]0 в обоих исследованных препаратах (Рис.1А) соответствовал описанной ранее экспоненциальной зависимости (Dodge FA. and Rahamimoff R., 1967; Shahrezaei V. et al., 2006). Коэффициент Хилла для концентрационной зависимости квантового состава в синапсах мыши составил 3.01±0.22 (п=10), а для лягушки 3.15±0.21 (п=7), что свидетельствует о необходимости кооперативного связывания не менее 3 ионов Са2+ для освобождения каждого кванта (Dodge F.A. and Rahamimoff R., 1967). Анализ временных параметров секреторного процесса показал, что как в синапсах мыши, так и у лягушки значения минимальной синаптической задержки и главной моды гистограмм синаптических задержек не изменялись при варьировании [Са2+]0. Эти данные свидетельствуют о независимости ранней фазы синхронной секреции квантов от кальция. Сопоставление степени флуктуаций синаптических задержек, выполненное при сравнении гистограмм их распределения и параметра Рю показало, что качественно характер изменения кинетики секреции в синапсах мыши и лягушки одинаков: при понижении [Са2+]0 степень флуктуаций синаптических задержек увеличивалась, что отражалось в возрастании величины параметра Рэо, т.е. наблюдалось повышение асинхронности секреции квантов. При этом в обоих видах синапсов повышение [Са2+]0 до 0.4 ммоль/л сопровождалось резким падением параметра Р90, величина которого выходила на насыщение при дальнейшем увеличении [Са2+]0. Однако количественные характеристики зависимости степени синхронности от [Са2+]0 в исследуемых синапсах были различны. Так при минимальной [Са2']о=0.2 ммоль/л, несмотря на более высокий квантовый состав, в синапсах мыши секреция имела менее синхронный характер (существенное превышение параметра Р90 в синапсах мыши, по сравнению с лягушкой), тогда как стационарный уровень параметра Р90 при более высокой [Са2,]0 (>0.4 ммоль/л) был выше (т.е. секреция была более несинхронна) в синапсах лягушки (Рис. 1Б). Коэффициент Хилла, вычисленный для концентрационной зависимости параметра Р90, в синапсах мыши составил 0.92±0.49 (п=10), а для лягушки 0.35±0.60 (п=7), что существенно ниже, чем этот коэффициент для величины

квантового состава. Различия величии коэффициентов кооперативное™ свидетельствует о том, что количество освобождаемых квантов и кинетика их выделения контролируются различными механизмами. Проведенные исследования показали, что в синапсах лягушки и мыши наблюдалась качественно сходная по характеру зависимость от [Са2+]0 как числа выделяющихся в ответ на нервный стимул квантов, так и временных параметров их освобождения: уменьшение квантового состава при понижении [Са2+]„ сопровождалось увеличением несинхронности секреции. Однако количественно временные параметры секреции (как временные, так и квантового состава) при разных [Са2+]0 отличались в синапсах лягушки и мыши, указывая на то, что морфологические особенности строения активных зон секреции и их сопряжения с потенциал-зависимыми кальциевыми каналами, запускающими процесс экзоцитоза в этих синапсах (Harlow M.L. et al., 2001; Nagwaney S. et al., 2009), вносят вклад в определение кинетики секреции квантов.

А Б

Рис. 1. Зависимость квантового состава (А) и степени синхронности секреции (Б) от концентрации кальция в синапсах мыши и лягушки

2. Эффекты блокирования потенциал-зависимых кальциевых капалов в синапсах лягушки

2.1. Влияние неспецифического блокатора потенциал-зависимых кальциевых каналов кадмия на выделение медиатора в синапсах лягушки

Учитывая описанные выше данные о разной степени синхронности секреции в зависимости от [Са2+]0, а также полученные ранее сведения о том,

что выраженность модуляции временных параметров в синапсах лягушки зависит от исходной степени несинхронности выделения квантов (ВикЬагаеуа Е. е! а1., 2002; МкоЬку Е. с1 а!., 2004) в качестве исходных условий была выбрана [Са2+]о=0.3 ммоль/л, при которой параметр Р90 еще не достигал насыщения. Экспериментальным путем была подобрана концентрация 1 мкмоль/л хлорида кадмия (Сс1СЬ), блокирующего все типы потенциал-зависимых кальциевых каналов (Ьапзтап Л$. е1 а1., 1986), при которой интенсивность вызванной секреции квантов была достаточна для того, чтобы накопить не менее 200-300 одноквантовых ТКП.

Под действием С(1СЬ средний квантовый состав уменьшился от 0.47±0.09 до 0.12±0.03 кванта (п=7, р<0.05), т.е. на 74%, что примерно соответствовало снижению числа выделяющихся квантов при уменьшении [Са2<]0 от 0.2 ммоль/л до 0.3 ммоль/л. Однако в отличие от десинхронизации секреции, наблюдаемой при снижении [Са2+)0, уменьшение квантового состава под действием Сс1С12 сопровождалось падением параметра Р90 до 1.70±0.17 мс по сравнению с исходной величиной 2.12±0.29 мс (п=7, р<0.05), т.е. синхронизацией процесса выделения квантов. Примерно такое же по выраженности изменение степени флуктуаций синаптических задержек наблюдалось при повышении [Са2+]0 от 0.2 ммоль/л до 0.3 ммоль/л. Полученные данные демонстрируют, что уменьшение входа ионов Са2+ в нервное окончание за счет снижения концентрационного градиента (при понижении [Са2+]0) и за счет уменьшения количества открываемых во время пресинаптического потенциала действия ионных каналов (при блокировании их С<Ю12), вызывая примерно равное по величине угнетение квантовой секреции, диаметрально противоположно меняют кинетику секреции: блокада каналов синхронизирует освобождение, тогда как уменьшение градиента, напротив - десинхронизирует. Для того чтобы выяснить, какой именно тип кальциевых каналов может участвовать в регуляции кинетики секреции проводили эксперименты со специфическими блокаторами каналов разных типов.

2.2 Влияние специфического блокатора N (Сау2.2) каналов на выделение квантов ацетилхолина в синапсах лягушки

Согласно данным литературы основным типом потенциал-зависимых кальциевых каналов, обеспечивающих процесс экзоцитоза квантов медиатора из двигательных нервных окончаний лягушки, являются каналы N (Сау2.2) типа (СоЬеп МЖ й а1., 1991; Ка^ Е. й а1., 1995). Одним из наиболее специфических блокаторов каналов этого типа является т-конотоксин БVIА (ОТХ) (МсС1езкеу Е.\¥. й а1., 1987). Исследуемая концентрация СТХ,

составляющая 10 нмоль/л, была подобрана экспериментально так, чтобы наблюдаемое уменьшение числа выделяющихся квантов позволяло набирать достаточное для анализа синаптических задержек количество одноквантовых ЖП. Через 1.5 часа после введения GTX в перфузионный раствор, его удаляли, для того, чтобы избежать дальнейшего падения уровня секреции. GTX уменьшал средний квантовый состав на 66±5% (п=8, р<0.05). При этом наблюдалось уменьшение флуктуаций синаптических задержек одноквантовых ТКП, т.е. синхронизация секреции, что проявлялось в уменьшении параметра Р90 на 21±5% (п=8, р<0.05). Эти эффекты не устранялись при отмывке, т.е. были необратимыми. Причем, степень уменьшения параметра Род была более выражена в тех синапсах, где в исходных условиях асинхронность выделения квантов была выше.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что также как и блокада потенциал-зависимых кальциевых каналов неспецифическим блокатором CdCl2, действие специфического блокатора каналов N (Cav2.2) типа наряду со снижением квантового состава вызывала синхронизацию выделения квантов ацетилхолина. Появившиеся в последние годы данные о возможности совместного сосуществования на двигательных нервных окончаниях кальциевых каналов других типов (Katz Е. et al., 1995; Sand О. et al., 2001; Thaler С. et al., 2001) позволяют предполагать их участие в регуляции параметров экзоцитоза. В связи с этим было проведено исследование влияния блокаторов каналов других типов.

2.3. Влияние специфического блокатора P/Q (Cav2.1) каналов на выделение квантов ацетилхолина в синапсах лягушки

В периферических синаптических контактах другим наиболее распространенным видом Са2+ каналов, участвующих в процессе экзоцитоза, являются P/Q (Сау2.1) каналы. В связи с этим было исследовано действие аь агатоксина IVA - специфического блокатора этих каналов. В концентрации 20 нмоль/л токсин вызывал необратимое снижение среднего квантового состава на 38±8% по сравнению с исходной величиной (п=8, р<0.05). При этом также наблюдалось уменьшение количества ответов, имеющих большие синаптические задержки и величина параметра Рэд уменьшалась на 23±7% от исходного значения (п= 9, р<0.05).

Увеличение концентрации блокатора до 40 нмоль/л не приводило к более выраженному изменению квантового состава, что свидетельствует о том, что концентрация блокатора 20 нмоль/л уже является насыщающей. Таким образом, также как и блокада основного для синапсов лягушки N (Cav2.2) типа каналов, выключение P/Q (Cav2.1) каналов приводило к

снижению квантового состава и синхронизации секреторного процесса.

2.4. Квантовая секреция при совместном блокировании P/Q (Сау2.1) и N (Cav2.2) каналов в синапсах лягушки

Для выявления возможности совместного, модулирующего секрецию, действия N (Cav2.2) и P/Q (Сау2.1) каналов исследовали одновременное действие их блокаторов. Добавление 20 нмоль/л ф-агатоксина IVA (блокатора P/Q каналов) в раствор после развития эффектов GTX (блокатора N каналов) приводило к дальнейшему снижению среднего квантового состава, т.е. наблюдалась аддитивность эффектов блокаторов на величину квантового состава. Однако при этом не наблюдалось дополнительного снижения параметра Р90- Полученные данные свидетельствуют о том, что на фоне повышенной синхронности секреции, вызванной «выключением» N (Cav2.2) каналов, блокатор P/Q (Cav2.1) каналов, продолжая снижать квантовый состав, не оказывал влияния на кинетику выделения квантов медиатора, что указывает на различия и независимость работы механизмов, обеспечивающих регуляцию количества освобождаемых квантов и временных параметров их выделения.

2.5. Влияние блокатора L (Сау 1.2) кальциевых каналов на параметры квантовой секреции в синапсах лягушки

Потенциал-зависимые дигидропиридин-чувствителыше L (Cav 1.2) каналы, согласно данным литературы, во многих химических синапсах являются более долгоживущими и пространственно удаленными от мест освобождения медиатора, чем каналы других типов (Atchison W.D., 1989; Meir A. et al., 1999). В связи с этим можно предположить, что кванты, выделившиеся с более длинными синаптическими задержками, могут быть обусловлены активацией именно этих каналов. Для проверки этой гипотезы были проведены исследования действия нитрендипина, блокатора L (Cav 1.2) каналов, в концентрации 5 мкмоль/л, превышающей величину 1С5о=20-150 нмоль/л (Mery P.F. et al., 1996). Нитрендипин вызывал обратимое снижение квантового состава на 27±7% (п=9, р<0.05). При этом, также как и при действии блокаторов других каналов, наблюдалось уменьшение степени несинхронности секреции квантов: параметр Р<ю снижался на 22±4% (п= 9, р<0.01).

Таким образом, проведенное исследование влияния блокаторов потенциал-зависимых Са2+ каналов в синапсах лягушки показало, что при действии как неспецифического блокатора - ионов кадмия, так и специфических блокаторов основных типов Са2+ каналов (N, P/Q и L)

снижение количества освобождаемых в ответ на нервный импульс квантов сопровождалось устранением квантов, выделившихся с синаптическими задержками, существенно превышающими значения главной моды гистограмм распределения синаптаческих задержек. Повышение степени синхронности секреции и снижение квантового состава, наблюдаемые вследствие блокирования Са2+ каналов, позволяют сделать вывод о том, что все исследованные каналы вносят вклад в секреторный процесс.

3. Исследования эффектов блокирования потенциал-зависимых кальциевых каналов в синапсах мыши

3.1. Влияние, неспецифических блокаторов потенциал-зависимых кальциевых каналов кадмия и магния на выделение медиатора в синапсах мыши

По аналогии с исследованиями, проведенными на синапсах лягушки, изучение роли кальциевых каналов разных типов в синапсах мыши начали с экспериментов с неспецифическим блокатором Са2+ каналов СсЮг. Для того, чтобы достичь сопоставимого с наблюдаемым в синапсах лягушки эффекта снижения квантового состава была подобрана концентрация CdCl2 2.5 мкмоль/л, которая существенно превышала использованную у лягушки концентрацию. CdCl2 вызывал уменьшение величины среднего квантового состава на 62±10% (п=6, р<0.05). Однако, в отличие от синапсов лягушки, где CdClî вызывал синхронизацию секреции, в нервно-мышечном соединении мыши блокирование кальциевых каналов приводило к возрастанию числа одноквантовых ТКП с большими значениями синаптаческих задержек. Появление ответов с большими синаптическими задержками привело к расширению гистограммы и сдвигу кумулятивной кривой вправо и, как следствие, к увеличению параметра Рдо на 85±12% (п=6, р<0.05). Таким образом, в отличие от синапсов лягушки, в нервно-мышечном соединении мыши блокирование каналов ионами кадмия, вызывая сходное по выраженности снижение количества выделяющихся квантов, приводило не к синхронизации, а к десинхронизации секреторного процесса.

В связи с обнаруженным различием в эффектах кадмия, были проведены эксперименты с использованием другого двухвалентного катиона магния, который также является блокатором Са2+ каналов (Lansman J.B. et al., 1986; Allana J. and Lin J., 2004). При повышении концентрации ионов магния от 4 до 8 ммоль/л квантовый состав снизился на 73% от 0.38±0.03 до 0.12±0.03 (п=8, р<0.05). При этом происходило возрастание числа ТКП с большими значениями синаптаческих задержек и параметр Р^ увеличился на 95% от 1.69±0.12 мс до З.ЗШ.45 мс (п=8, р<0.05). Таким образом, в

синапсах мыши снижение входа ионов кальция в нервное окончание за счет действия двухвалетных катионов, также как и при уменьшении [Са2+]0, вызывало возрастание несинхронности секреции квантов.

3.2. Влияние специфического блоштора P/Q (Cav2.1) каналов на выделение квантов ацетилхолина в синапсах мыши

Поскольку в нервно-мышечном соединении мыши основным типом Са2+ каналов, обеспечивающим экзоцитоз медиатора, являются P/Q (Сау2.1) каналы (Westenbroek R.E. et al., 1998; Nudler S. et al., 2003), то исследования были начаты с использования со-агатаксина IVA. Его концентрация, вызывающая 50% блокирования освобождения квантов (1С5о), составляла в синапсах мыши 2-20 нмоль (Mintz I.M. et al. 1992). В наших экспериментах 10 нмолъ/л токсина вызывало уменьшение среднего квантового состава на 56±6% по сравнению с исходной величиной (п=6, р<0.05). Однако при этом не наблюдалось изменения временных параметров секреции квантов: параметр Рм составлял 1.61±0.08 мс в контроле и 1.72±0.31 мс (р>0.05, п=6) после действия токсина. Увеличение концентрации Ф-агатоксина IVA до 20 и 40 нмоль/л не привело к дальнейшему усилению эффекта токсина на квантовый состав, который снижался на 53±5% и 41±9%, соответственно, при этом также не наблюдалось изменения параметра Р90, т.е. степени синхронности секреции квантов. Таким образом, в синапсах мыши P/Q (Cav2.1) каналы регулируют только число освободившихся в ответ на нервный стимул квантов медиатора. То обстоятельство, что при достижении насыщающей концентрации блокатора, не происходило дальнейшего снижения количества выделившихся квантов свидетельствует о том, что помимо P/Q (Cav2.1) каналов, заблокированных т-агатоксипом IVA, другие каиаЛы могут принимать участие в обеспечении экзоцитоза в синапсах мыши.

3.3 Влияние специфического блокатора N (Сау2.2) каналов на выделение квантов ацетилхолина в синапсах мыши

Для выяснения роли N (Сау2.2) каналов в регуляции экзоцитоза в синапсах мыши был использован тот же ca-конотоксин GVIA (GTX), что и в экспериментах на синапсах лягушки. Концентрация токсина (1 мкмоль/л) на два порядка превышающая использованную у лягушки (10 нмоль/л), не оказывала влияния ни на квантовый состав (0.26±0.06 в контроле, 0.23±0.08 после действия токсина, р>0.05, п=6), ни на временные параметры секреции квантов (Р90 в контроле составлял 3.16±0.41 мс и равнялся 3.07±0.76 мс после

действия токсина, р>0.05, а=6). Таким образом, использование блокатора N (Cav2.2) каналов не оказывало влияния на процессы квантового освобождения ацетилхолина в синапсах мыши.

3.4. Влияние блокатора L (Cay 1.2) кальциевых каналов на параметры квантовой секреции в синапсах мыши

Для блокирования каналов этого типа, также как и в синапсах лягушки, использовали нитрендипин, но в два раза большей концентрации (10 мкмоль/л), основываясь на данных о влиянии этого агента в реинервированных синапсах мыши (Katz Е. et al., 1996). В исходных условиях (при внеклеточной [Са2+]0 =0.5 ммоль/л) добавление нитрендипина не вызывало достоверного уменьшение квантового состава: в контроле 0.41±0.08 и 0.35±0.09 после добавления нитрендипина (п=7, р>0.05). Не наблюдалось также и изменения временных параметров секреции. Однако, учитывая данные, свидетельствующие о том, что в синапсах теплокровных L (Cav 1.2) каналы могут находиться в «молчащем» состоянии (Urbano F. J. et al., 2001) было предпринято исследование эффектов нирендепина при исходно высоком уровне асинхронности секреции квантов при [Са2+]„ =0.2 ммоль/л.

Рис. 2. Относительное изменение величины квантового состава и степени синхронности секреции в синапсах лягушки (А) и мыши (Б) при действии специфических блокаторов потенциал-зависимых Са2+ каналов разных типов

В этих условиях нитрендипин вызывал достоверное уменьшение

квантового состава на 27±8% (п=7, р<0.05), а также уменьшал количество одноквантовых ТКП с большими значениями синаптичсских задержек и достоверно снижал параметр Р% на 18±7% (р<0.05).

Таким образом, в синапсах мыши блокатор L (Cay 1.2) каналов оказывал влияние на процесс выделения квантов ацетилхолина, снижая их количество и синхронизируя освобождение, только в условиях исходно высокой степени несинхронности секреции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Независимо от видовой и функциональной принадлежности синапсов химического типа, основные процессы, происходящие в них, принципиально схожи - будь то межнейрональный синапс центральной нервной системы или нервно-мышечное соединение (Зефиров А.Л. и Черанов С.Ю., 2000; Van der Kloot W. and Molgo J., 1994; Pietrobon D, 2005; Slater С., 2008). Именно это обстоятельство определяет тот факт, что нервно-мышечные синапсы лягушки и мыши являются классическими объектами для физиологических и фармакологических исследований, результаты которых обобщаются и переносятся на синапсы других теплокровных, в том числе и человека. Однако морфологические и физиологические особенности каждого из этих синапсов делают необходимым более тщательный анализ механизмов регуляции их работы, поскольку именно эти объекты служат тестовыми системами для испытания многих фармакологических препаратов, в том числе и каналоблокаторов. Проведенные исследования позволяют сопоставить характер изменения процесса выделения квантов ацетилхолина в ответ на нервный импульс в нервно-мышечных соединениях лягушки и мыши при изменении условий входа ионов кальция в нервное окончание путем снижения концентрационного градиента (при уменьшении [Са2+]0) или путем блокирования потенциал-зависимых Са2+ каналов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в синапсах мыши и лягушки имеет место сходная по характеру зависимость от [Са2+]0 как числа выделяющихся в ответ на нервный стимул квантов, так и временных параметров их освобождения: уменьшение квантового состава при понижении [Са2+]0 сопровождается увеличением несинхронности секреции. Однако оценка степени кооперативности - коэффициента Хилла показала, что его величина для зависимости степени синхронности существенно ниже, чем для квантового состава. Полученные данные указывают на то, что для синхронного освобождения квантов с низкой степенью флуктуаций синаптических задержек необходимо действие не менее трех ионов кальция, тогда как для несинхронного выделения квантов с большими значениями

синаптических задержек достаточно одного иона кальция.

Анализ роли потенциал-зависимых Са2+ каналов в регуляции квантового состава и кинетики секреции показал, что в отличие от широко распространенного мнения, согласно которому процесс экзоцитоза медиатора из моторных нервных окончаний лягушки опосредован входом ионов кальция через потенциал-зависимые N (Cav 2.2) кальциевые каналы, в условиях сниженного содержания ионов кальция во внеклеточной среде в контроле количества освобождаемых квантов медиатора и их кинетики принимают участие также P/Q (Cav 2.1) и L (Cav 1.2) каналы. Блокада всех исследованных типов кальциевых каналов приводит как к снижению количества освобождаемых квантов, так и к уменьшению дисперсии синаптических задержек (Рис. 2А). В отличие от описанной десинхронизации освобождения квантов при понижении [Са2+]а, блокада кальциевых каналов сопровождается синхронизацией этого процесса, что свидетельствует о разной реакции аппарата экзоцитоза на изменение условий входа Са2+ в нервное окончание. В синапсах мыши, где наблюдалось десинхронизирующее секрецию действие пониженного внеклеточного Са2+, блокада каналов неспецифическими блокаторами кадмием и магнием вызывала также появление ответов с большими синаптическими задержками, т.е. повышение несинхронности секреции. В то же время, в отличие от синапсов лягушки, блокирование основных для этих синапсов P/Q (Cav2.1) каналов не изменяло временных параметров секреции квантов, а только снижало их количество. Отсутствие влияния блокатора N (Cav 2.2) каналов на вызванную секрецию ацетилхолина свидетельствует о том, что в зрелом синапсе мыши эти каналы не участвуют в регуляции экзоцитоза синаптических везикул, а появление квантов, выделяющихся с затянутыми синаптическими задержками в условиях существенно сниженной внеклеточной концентрации ионов кальция может быть обусловлено включением в секреторный процесс L (Cay 1.2) каналов, поскольку их блокирование нитрендипином вызывает снижение квантового состава и синхронизацию секреции. Выявленные различия в механизмах кальциевой регуляции параметров вызванной секреции квантов ацетилхолина в синапсах теплокровных и холоднокровных могут быть обусловлены особенностями морфофункционального состояния секреторного аппарата, к которым относятся: разные геометрические параметры области активной зоны и взаимного расположения ионных каналов и Са2+ сенсоров; разное сродство к Са2+ и скорость связывания Са2+-чувствительных сенсоров (изоформ везикул ассоциированного белка синаптотагмина), обеспечивающих синхронное и асинхронное освобождение квантов; разная степень активности Са2+-

секвестрирующих систем, способных элиминировать Са2+ из области активной зоны.

ВЫВОДЫ

1. Понижение концентрации ионов кальция от 0.6 до 0.2 ммоль/л во внеклеточной среде в синапсах лягушки и мыши наряду со снижением количества освобождаемых квантов ацетилхолина вызывает десинхронизацию их освобождения, при этом кинетика секреции в синапсах мыши зависит от внеклеточной концентрации ионов кальция в большей степени, чем в синапсах лягушки.

2. Значения коэффициента Хилла для зависимости квантового состава от концентрации ионов кальция во внеклеточной среде примерно равны в синапсах лягушки и мыши и указывают на необходимость действия не менее трех ионов кальция для синхронного освобождения квантов ацетилхолина.

3. Значения коэффициентов Хилла для зависимости от кальция параметра Р90, характеризующего степень несинхронности секреции, в обоих синапсах меньше единицы, что свидетельствует об отсутствии необходимости взаимодействия нескольких ионов кальция для освобождения квантов с большими синаптическими задержками.

4. Неспецифический блокатор кальциевых каналов хлорид кадмия в нервно-мышечном синапсе лягушки, уменьшает количество выделившихся квантов и синхронизирует процесс их секреции.

5. В нервно-мышечном соединении мыши снижение квантового состава потенциалов концевой пластинки при блокаде кальциевых каналов ионами кадмия и магния, в отличие от синапсов лягушки, сопровождается увеличением асинхронности секреции квантов ацетилхолина.

6. Блокада основных для синапсов лягушки потенциал-зависимых кальциевых каналов N (Сау2.2) типа специфическим блокатором конотоксином вVIА, вызывает уменьшение числа освободившихся квантов и повышает степень синхронности их освобождения, у мыши применение этого токсина не влияет на параметры вызванного экзоцитоза.

7. В синапсах мыши блокирование Р/<3 (Сау2.1) потенциал-зависимых кальциевых каналов вызывает снижение количества квантов, но не влияет на кинетику их освобождения, а в синапсах лягушки приводит к снижению квантового состава и синхронизации процесса секреции.

8. Потенциал-зависимые кальциевые Ь (СаЛ.2) каналы в синапсах мыши и

лягушки вносят вклад в обеспечение несинхронного освобождения квантов ацетилхолина, поскольку их блокада вызывает снижение квантового состава потенциалов концевой пластинки и синхронизацию процесса выделения квантов.

9. Изменение условий входа ионов кальция в нервное окончание: снижение концентрационного градиента и блокирование потенциал-зависимых кальциевых каналов по-разному влияет на временные параметры секреции квантов в синапсах мыши и лягушки.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Ценцевицкий А.Н., Васин А.Л., Бухараева Э.А., Никольский Е.Е. Участие разных типов потенциал-зависимых кальциевых каналов в обеспечении вызванного освобождения медиатора в нервно-мышечном соединении лягушки. Доклады Академии наук, 2008, т.423, №6, с. 846-849.

2. Бухараева ЭЛ., Ценцевицкий А.Н., Васин А.Л., Самигуллин Д.В., Никольский Е.Е. Пресинаптические потенциал-зависимые кальциевые каналы и регуляция экзоцитоза нейромедиатора в периферической нервной системе. Биологические мембраны, 2009, т.4, №6, с. 308-309.

3. Самигуллин Д.В., Васин АЛ., Бухараева Э.А., Никольский Е.Е. Особенности кальциевого транзиента в различных участках нервной терминала лягушки в ответ на нервный импульс. Доклады Академии наук, 2010, т.431,№5, с. 711-713.

4. Васин А.Л., Самигуллин Д.В., Бухараева Э.А. Роль кальция в модуляции кинетики синхронного и асинхронного освобождения квантов медиатора в нервно-мышечном синапсе. Биологические мембраны, 2010, т. 27, № 1, с. 92-100.

Статьи в сборниках и тезисы докладов:

5. Самигуллин Д., Васин А., Никольский Е., Бухараева Э. Роль двухвалентных катионов и кальциевых каналов в регуляции кинетики вызванного освобождения квантов медиатора в нервно-мышечном соединений теплокровных. Сборник «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 2007, с. 135-138.

6. Васин А.Л., Самигуллин Д.В., Бухараева Э.А. Кальциевая регуляция синхронного и асинхронного освобождения квантов медиатора в нервно-мышечном синапсе. Сборник «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2009, с. 172-177.

7. Vasin A., Samigullin D., Bukharaeva Е., Nikolsky Е. Change of the kinetics of

evoked quantal release in neuromuscular junction of mouse by bivalent cations. Abst. VTO East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology, Kazan, 2006, September, 13-17, p. 94.

8. Samigullin D.V., Vasin A.L., Bykhovskaia M.B., Bukharaeva E.A. Modulation of the kinetics of evoked quantal release at mouse neuromuscular junctions by calcium and strontium. PENS Summer course «Contemporary Problems of Neurobiology: Molecular Mechanisms of Synaptic Plasticity». Kazan, 10-24 September 2007. p.25-26.

9. Васин АЛ., Самигуллии Д.В. Роль ионов кальция в регуляции кинетики вызванного освобождения квантов медиатора. Тезисы XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине». Казань, 25-26 апреля 2007 г. стр. 283-284.

,;. 10. Самигуллин Д.В., Васин A.JI., Бухараева Э.А., Никольский Е.Е. Кальциевые каналы и регуляция кинетики вызванного освобождения квантов медиатора. Тезисы докладов XX Съезда физиологического общества им. И.П. Павлова, Москва, 4-8 июня 2007г., с. 407

11. Васин АЛ., Самигуллин Д.В. Влияние блокаторов кальциевых каналов на интенсивность и кинетику вызванной секреции квантов медиатора. Тезисы конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2008». Москва. МГУ, 8-11 апреля 2008г. с. 208-209.

12. Васин A.JI., Самигуллин Д.В., Бухараева Э.А. Синхронное и асинхронное освобождение квантов нейромедиатора при ритмической стимуляции двигательного нерва. Тезисы VI Сибирского физиологического съезда. Барнаул 25-27 июня 2008г. с. 73.

13. Васин АЛ., Самигуллин Д.В. Потенциал-зависимые кальциевые каналы в модуляции синхронности выделения квантов медиатора. Тезисы IV Международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак, Крым. 10-20 июня 2008г. с. 76-77.

14. Васип А.Л., Самигуллин Д.В. Модуляция интенсивности и кинетики вызванной секреции квантов медиатора блокаторами кальциевых каналов. Тезисы XIII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине». Казань, 23-24 апреля 2008г. с. 196-197.

15. Бухараева Э.А., Самигуллин Д.В., Васин АЛ., Никольский Е.Е. Пресинаптические механизмы обеспечения пластичности сикаптической передачи в нервно-мышечном соединении позвоночных. Тезисы IV Международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак, Крым. 10-20 июня 2008г. с. 70-71.

16. Самигуллин, Д.В., Васин A.JI., Бухараева Э.А. Роль двухвалентных катионов в регуляции кинетики вызванной секреции квантов медиатора.

Тезисы IV Международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины я психологии». Судак, Крым. 10-20 июня 2008г. с. 260-262.

17. Бухараева ЭЛ., Васин AJL, Самигуллин Д.В., Никольский Е.Е. Особенности кинетики синхронной и асинхронной секреции квантов медиатора из двигательных нервных окончаний. Материалы конференции с международным участием, посвященная 90-летию со дня рождения академика Т.М. 'Гурпаева «Механизмы нервных и нейроэндокринных регуляций», Москва, 24-26 ноября 2008, с. 41-42.

18. Васин А.Л., Самигуллин Д.В. Исследование вызванного освобождения квантов ацетилхолина в синапсах животных разного возраста при ритмической стимуляции. Городское здравоохранение. Тезисы XIV Всероссийской научно-практическая конференции «Молодые ученые в медицине». Казань. 29-30 апреля 2009г. с. 162.

19. Самигуллин Д.В., Васин АЛ., Бухараева Э.А. Внутриклеточный кальций: роль в модуляции экзоцитоза нейромедиатора и оптические методы регистрации в пресинаптическом нервном окончании. Тезисы V Международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак, Крым. 3-13 июня 2009г. стр. 194-195.

20. Васин АЛ., Самигуллин Д.В., Бухараева ЭА. Особенности процесса экзоцитоза нейромедиатора в синапсах теплокровных на разных этапах онтогенеза. Тезисы V Международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак, Крым. 3-13 июня 2009, с. 66-67.

21. Samigullin D.V., Vasin A.L., Bukharaeva Е.А., Nikolsky Е.Е. Calcium transient in different parts of the frog neuromuscular junction in the response to nerve pulse. Abstract Book of International Conference "Molecular mechanisms of intracellular calcium signalling", Kiev, Ukraine, October 11-13, 2009, p. 49.

22. Vasin A., Samigullin D., Huzahmetova F., Tsentsevitsky A., Nikolsky E. Time course of evoked quantal secretion under change of the intracellular calcium at the motor nerve terminal. Abstract Book of International Conference "Molecular mechanisms of intracellular calcium signalling", Kiev, Ukraine, October 11-13,2009, P. 27.

23. Васин АЛ. Роль дигидропиридин-чувствительных кальциевых каналов нервного окончания в регуляции квантовой секреции ацетилхолина. Тезисы докладов XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2010» секция «Биология», Москва, 2010, с.268-269.

Отпечатано в типографии «Деловая полиграфия» 420111, г. Казань, ул.М. Межлаука, 6 т/ф (843) 292-08-43 e-mail: minitipografia@list.ru Подписано в печать 12.07.2010г. Бумага офсетная Тираж 100 экз. Заказ №98/2010

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Васин, Александр Львович

1 .Введение

Глава 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Вызванное освобождение квантов медиатора и параметры, его характеризующие: квантовый состав и временной ход секреции квантов в нервно-мышечном синапсе

2.2. Значение кинетики секреции квантов в формировании амплитудно-временных параметров постсинаптического ответа

2.3. Факторы, модулирующие кинетику вызванной секреции квантов медиатора

2.3.1. Роль ионов Са в процессе квантового освобождения медиатора

2.3.2. Роль Са2+ в модуляции временных параметров секреции

2.4. Потенциал-зависимые кальциевые каналы нервных окончаний и их роль в регуляции процесса выделения квантов медиатора 2 Ь 2.4.1. Разнообразие потенциал-зависимых Са каналов- классификация, строение 21 2.4.2'Особенности L (Cav 1) каналов

2.4.3.Потенциал-зависимые кальциевые N- (Сау2.2) каналы

2.4.4.Потенциал-зависимые кальциевые каналы P/Q-типа (Cav2.

2.4.5. Потенциал-зависимые кальциевые каналы R-тигта (Cav2.3)

2.4.6. Потенциал-зависимые кальциевые каналы Т-типа (Cav3)

2.5. Фукнции потенциал-зависимых Са" каналов и пресинаптические белки, связанные с экзоцитозом.синаптической везикулы

2.6. Белки SNARE комплекса, связанные с кальциевыми каналами

2.7. Кальциевая регуляция кальциевых каналов

2.8. Потенциал-зависимые кальциевые каналы на двигательных нервных окончаниях и их вклад в процесс передачи возбуждения

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 43 3.1 Одновременная регистрация токов действия нервного окончания и одноквантовых токов концевой пластинки

3.2 Анализ параметров токов действия нервного окончания и одноквантовых ТКП 46

3.3 Оценка параметров временного хода вызванной секреции квантов медиатора

3.4 Статистическая обработка результатов

Глава 4.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Средний квантовый состав токов концевой пластинки и кинетика секреция медиатора в синапсах лягушки и мыши при изменении внеклеточной концентрации ионов кальция

4.1.1 Сопоставление величины квантового состава и параметров кинетики секреции при изменении внеклеточной концентрации ионов кальция в синапсах лягушки

4.1.2 Изменение квантового состава и кинетики секреции при варьировании внеклеточной концентрации ионов кальция в синапсах мыши

4.1.3 Сопоставление параметров секреции медиатора в синапсах лягушки и мыши при варьировании внеклеточной концентрации ионов кальция

4.2 Эффекты блокирования потенциал-зависимых кальциевых каналов в синапсах лягушки

4.2.1 Влияние неспецифического блокатора потенциал-зависимых кальциевых каналов кадмия на выделение медиатора в синапсах лягушки

4.2.2 Влияние специфического блокатора N (Cav2.2) каналов на выделение квантов ацетилхолина в синапсах лягушки

4.2.3 Влияние специфического блокатора P/Q (Сау2.1) каналов на выделение квантов ацетилхолина в синапсах лягушки

4.2.4 Квантовая секреция при совместном блокировании P/Q (Сау2.1) и N (Cav2.2) каналов в синапсах лягушки

4.2.5 Влияние блокатора L (Cav 1.2) кальциевых каналов на параметры квантовой секреции в синапсах лягушки

4.3 ИССЛЕДОВАНИЯ ЭФФЕКТОВ БЛОКИРОВАНИЯ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫХ КАЛЬЦИЕВЫХ КАНАЛОВ В СИНАПСАХ МЫШИ

4.3.1 Влияние неспецифических блокаторов потенциал-зависимых кальциевых каналов кадмия и магния на выделение медиатора в синапсах мыши

4.3.2 Влияние специфического блокатора P/Q (Cav2.1) каналов на выделение квантов ацетилхолина в синапсах мыши

4.3.3 Влияние специфического блокатора N (Сау2.2) каналов на выделение квантов ацетилхолина в синапсах мыши

4.3.4 Влияние блокатора L (Cav 1.2) кальциевых каналов на параметры квантовой секреции в синапсах мыши

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль кальциевых каналов разных типов в регуляции квантовой секреции в нервно-мышечных синапсах мыши и лягушки"

Актуальность исследования

Исследование молекулярных механизмов процессов передачи возбуждения в синапсе является одним из перспективных подходов для понимания способов обеспечения пластичности нервной системы, лежащих в основе таких фундаментальных физиологических процессов как обучение, память, управление движением, патогенез ряда заболеваний центральной и периферической нервной системы, а также для создания фармакологических препаратов, избирательно действующих на разные этапы процесса передачи информации в синапсе. Традиционно в качестве ведущих пресинаптических факторов обеспечения синаптической пластичности рассматриваются изменение количества квантов медиатора, освобождающихся в ответ на нервный импульс (Zucker R.S. and Regehr W.G., 2002) и размера кванта (Van * der Kloot W., 1991). Вместе с тем, в последние годы показано существование еще одного, ранее не учитываемого эффективного механизма пресинаптической модуляции передачи возбуждения, связанного с изменением временного хода (кинетики) секреции выделения квантов, формирующих многоквантовый ответ (Bukharaeva Е. et al., 1999, 2002; Nikolsky Е. et al., 2004). Ранее проведенные экспериментальные исследования дают основания полагать, что механизмы, контролирующие кинетику секреторного процесса, являются кальций-зависимыми, однако отличными от механизмов, определяющих количество освобождаемых квантов медиатора (Bukharaeva Е. et al., 1999; Parnas I. et al., 1999; Neher E., 2005; Bukharaeva E. et al., 2007), что ставит задачу более тщательного изучения путей кальциевой регуляции кинетики выделения квантов.

Вход ионов кальция в нервное окончание через потенциал-зависимые кальциевые каналы инициирует цепь событий, приводящих к экзоцитозу синаптических везикул (для обзора: Зефиров A.JI. и Ситдикова Г.Ф., 2010; Catterall W.A. and Few А.Р., 2008). Принято считать, что в отличие от синапсов центральной нервной системы, где в запуске процесса секреции участвуют потенциал-зависимые кальциевые каналы разных типов, в синапсах периферической нервной системы взрослых животных экзоцитоз опосредован преимущественно одним типом кальциевых каналов. Для нервно-мышечного соединения теплокровных- это каналы P/Q (по современной классификации Cav2.1), а для синапсов лягушки - N (Сау2.2) каналы (Uchitel O.D. et al., 1992; Wright C.E. and Angus J.A., 1996; Katz E. et al., 1995, 1996). Тем не менее, современные данные, полученные методами иммуногистохимии, свидетельствуют о наличие на двигательных нервных окончаниях каналов других типов (Robitaille R. et al., 1996; Day N.C. et al., 1997; Sand O. et al., 2001; Pagani R. et al., 2004). Однако вопрос о том, какую роль играют разные каналы в регуляции таких параметров секреторного процесса как кинетика и количество освобождаемых квантов, остается открытым. В связи с многообразием пресинаптических потенциал-зависимых кальциевых каналов, их разным представительством в нервно-мышечных синапсах теплокровных и холоднокровных, для понимания механизмов регуляции интенсивности и кинетики секреции и поиска эффективных способов избирательного воздействия на эти механизмы, актуальным является сопоставление роли потенциал-зависимых кальциевых каналов, участвующих в регуляции вызванной секреции ацетилхолина в нервно-мышечных синапсах позвоночных.

Цель и задачи исследования

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

2. Изучить влияние неспецифических. блокаторов потенциал-зависимых кальциевых каналов магния и кадмия- на параметры квантовой секреции медиатора в синапсах лягушки и мыши.

4. Оценить эффект совместной блокады потенциал-зависимых кальциевых каналов разных типов на параметры квантовой секреции в синапсах лягушки и мыши.

Положения, выносимые на защиту

В нервно-мышечном синапсе холоднокровных (лягушка) N, P/Q и L потенциал-зависимые кальциевые каналы участвуют в регуляции как количества квантов ацетилхолина, освобождаемых в ответ на, нервный импульс, так и кинетики их секреции.

В нервно-мышечном синапсе теплокровных (мышь) P/Q потенциал-зависимые кальциевые каналы контролируют только количество выделившихся квантов медиатора, а каналы L типа участвуют в модуляции числа выделяемых квантов и- кинетики их секреции в условиях высокой степени асинхронности освобождения, каналы N типа не принимают участия в регуляции вызванной секреции квантов.

Научная новизна

В. ходе проведенных исследований сопоставлена кальциевая регуляция параметров вызванной квантовой секреции ацетилхолина. в традиционных для классической нейрофизиологии объектах- синапсах лягушки и мыши. Впервые выявлено, что в исследованном диапазоне концентраций кальция, который позволяет оценить кинетику секреции отдельных квантов, при качественно одинаковой кальциевой зависимости количества выделяемых квантов в этих синапсах наблюдается разная кинетика их освобождения. Кинетика секреции квантов в синапсах мыши проявляет более выраженную зависимость от внеклеточной концентрации ионов кальция, чем в синапсах лягушки, и освобождение становится более синхронным, при насыщающей концентрации кальция. Впервые на основании: сопоставления коэффициентов Хилла для концентрационных зависимостей квантового состава и кинетики секреции в синапсах лягушки и мыши сделан вывод о том, что количество освобождаемых квантов и кинетика их выделения находятся под контролем разных механизмов с отличающейся чувствительностью к ионам кальция. Несмотря на то, что при уменьшении концентрации кальция степень асинхронности секреции возрастает в обоих типах синапсов, уменьшение входа кальция при использовании неспецифических блокаторов кальциевых каналов сопровождается разнонаправленным изменением степени синхронности секреции. Впервые показано, что в синапсах лягушки кальциевые каналы N, P/Q и L типов участвуют в регуляции как квантового состава, так и кинетики; секреции. В синапсах мыши проявляются различия в функциональной роли этих каналов: каналы P/Q типа регулируют только квантовый состав, не затрагивая кинетику секреции, а каналы Ь типа могут принимать участие в регуляции как количества секретируемых квантов, так и их кинетики в. условиях исходно высокой степени асинхронности секреции.

Научно-практическая значимость

Основное значение результатов проведенного исследования состоит в получении данных о функционально различной роли потенциал-зависимых кальциевых каналов разных типов? в синапсах теплокровных и холоднокровных, о разном характере зависимости кинетики: секреции квантов от концентрации кальция в этих синапсах, что необходимо учитывать при: анализе эффектов различных фармакологических агентов, обладающих каналоблокирующими свойствами. Выявленная способность блокатора P/Q каналов в синапсах мыши избирательно модулировать квантовый состав, не затрагивая кинетику секреции, дает дополнительное доказательство того, что разные механизмы участвуют в регуляции квантового состава и кинетики секреции медиатора. Полученные данные важны' для,. сравнительной физиологии, а также для понимания механизмов развития каналопатий и- фармакологических исследований; направленных на тестирование новых лекарственных препаратов, обладающих каналоблокирующими свойствами. Апробация работы

Материалы работы доложены на VIII East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology (Kazan, 2006); Всероссийских научно-практических конференциях «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007, 2008- 2009); Международной школе PENS Summer course «Contemporary Problems of Neurobiology: Molecular Mechanisms of Synaptic Plasticity» (Kazan, 2007); международной научной^ конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2008, 2010); IV и V международных: междисциплинарных конгрессах «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2008, 2009); Международной конференции «Рецепция ивнутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009):

Работа; выполнена при поддержке; грантами РФФИ № 08-04-00923, Президента РФ «Ведущая научная школа» НШ-4177.2008:4 и Американского Фонда Гражданских исследований (CRDF RUB1-2823-KA06). Структура и объём диссертации

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Васин, Александр Львович

6. ВЫВОДЫ

1. Понижение концентрации ионов кальция от 0.6 до 0.2 ммоль/л во внеклеточной среде в синапсах лягушки и мыши наряду со снижением количества освобождаемых квантов- ацетилхолина вызывает десинхронизацию их освобождения, при этом кинетика секреции в синапсах мыши зависит от внеклеточной концентрации ионов кальция в большей степени, чем в синапсах лягушки.

2. Значения коэффициента Хилла для зависимости квантового состава от концентрации ионов кальция во внеклеточной среде примерно равны в синапсах лягушки и мыши и указывают на необходимость кооперативного действия не менее трех ионов кальция для синхронного освобождения квантов ацетилхолина.

3. Значения коэффициентов Хилла для зависимости от кальция параметра Род, характеризующего степень несинхронности секреции, в обоих синапсах меньше единицы, что свидетельствует об- отсутствии необходимости взаимодействия нескольких ионов кальция для освобождения*квантов-с большими синаптическими задержками.

4. Неспецифический блокатор кальциевых каналов хлорид кадмия в нервно-мышечном синапсе лягушки, уменьшает количество выделившихся, квантов и синхронизирует процесс их секреции.

5. В нервно-мышечном соединении мыши снижение квантового состава потенциалов концевой пластинки при, блокаде кальциевых каналов ионами кадмия и магния, в отличие от синапсов лягушки, сопровождается увеличением асинхронности секреции квантов ацетилхолина.

6. Блокада основных для синапсов1 лягушки потенциал-зависимых кальциевых каналов N (Cav2.2) типа специфическим блокатором конотоксином GVIA, вызывает уменьшение числа освободившихся квантов и повышает степень синхронности их освобождения, у мыши применение этого токсина не влияет на параметры вызванного экзоцитоза.

7. В синапсах мыши блокирование P/Q (Cav2.1) потенциал-зависимых кальциевых каналов вызывает снижение количества квантов, но не влияет на кинетику их освобождения, а в синапсах лягушки приводит к снижению квантового состава и синхронизации процесса секреции.

8. Потенциал-зависимые кальциевые L (Cavl.2) каналы в синапсах мыши и лягушки вносят вклад в обеспечение несинхронного освобождения квантов ацетилхолина, поскольку их блокада вызывает снижение квантового состава потенциалов концевой пластинки и синхронизацию процесса выделения квантов.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Независимо от видовой и функциональной принадлежности синапсов химического типа1, основные процессы, происходящие в них, принципиально схожи - будь то межнейрональный синапс центральной нервной системы или нервно-мышечное соединение (Зефиров A.JL и Черанов С.Ю., 2000; Van der Kloot W. and Molgo J., 1994; Pietrobon D., 2005; Slater C., 2008). Именно это обстоятельство определяет тот факт, что нервно-мышечные синапсы лягушки и мыши являются классическими объектами для физиологических и фармакологических исследований, результаты которых обобщаются и переносятся на синапсы других теплокровных, в том числе и человека. Однако морфологические и физиологические особенности каждого из этих синапсов делают необходимым более тщательный анализ механизмов, регуляции их работы, поскольку именно эти объекты* служат тестовыми системами для- испытания» многих фармакологических препаратов, в том числе и каналоблокаторов. С помощью методов электронно-микроскопической томографии установлены различия в строении активных зон в синапсах лягушки и мыши (Harlow М. et al. 2001; Nagwaney S. et al. 2009). Прежде всего, это относится, к билатеральной организации белков активной зоны в синапсе мыши. У лягушки имеется лишь один ряд белков активной зоны. Вследствие этого вероятность освобождения? локированных везикул в активной зоне лягушки составляет около 1%, а у мыши примерно 10%. Таким образом, можно заключить, что секреция происходит намного эффективнее в активной зоне мыши. Также следует отметить, что активная зона лягушки имеет в 10 раз. большую протяженность, чем зона секреции синаптических везикул у мыши.' В связи с этим становится особенно интересно сопоставить механизмы модуляции секреторного процесса, и в первую очередь временных его параметров, в ограниченном участке нервного окончания в синапсах мыши и лягушки.

Проведенные; исследования- позволяют сопоставить характер "изменения процесса выделения.' квантов? ацетилхолина; в ответ на нервный импульс в нервнр-мышечных соединениях лягушки и мыши при изменении условий входа ионов, кальция в нервное окончание путем снижения концентрационного градиента (при уменьшении [Са" ]0) или путем блокирования потенциал-зависимых Са2+ каналов: Полученные результаты свидетельствуют о том, что- в синапсах мыши и лягушки имеет место качественно сходная по характеру зависимость от. [Са2+]0 числа выделяющихся в ответ на нервный стимул квантов и временных:, параметров их освобождения: уменьшение квантового; состава при понижении» [Са2+]0 сопровождается? увеличением несинхронности секреции. Однако' оценка степени кооперативное™ - коэффициента Хилла показала:, что его величина для зависимости*степени, синхронности существенно ниже,, чем; для; квантового состава. Полученные данные указывают на то, что1 для • синхронного освобождения квантов - с низкой степенью флуктуации синаптических задержек' необходимо действие не менее трех ионов ■ кальция^ тогда, как для несинхронного выделения» квантов с большими значениями . синаптических задержек достаточно одного иона кальция: Анализ роли потенциал-зависимых Са2+ каналов в регуляции квантового состава, и кинетики секреции показал, что в отличие от широко- распространенного мнения, согласно которому процесс экзоцитоза медиатора из моторных нервных окончаний, лягушки опосредован! входом ионов кальция^ через, потенциал-зависимые; N (Cav 2.2) кальциевые каналы, . в« условиях сниженного содержания ионов кальция во внеклеточной среде в контроле количества освобождаемых квантов медиатора и их кинетики принимают участие также P/Q (Cav 211) и L (Cav 1.2) каналы. Блокада, всех исследованных типов кальциевых каналов приводит как к; снижению количества освобождаемых квантов, так и к уменьшению флуктуаций синаптических задержек. В отличие от описанной десинхронизации освобождения квантов при понижении [Са2+]0, блокада кальциевых каналов сопровождается синхронизацией этого процесса, что свидетельствует о разной реакции аппарата экзоцитоза на-изменение условий входа Са" в нервное окончание: В- синапсах мыши, где наблюдалось десинхронизирующее секрецию действие пониженного внеклеточного Са , блокада каналов неспецифическими блокаторами кадмием и магнием вызывала также появление ответов с большими синаптическими задержками, т.е. повышение несинхронности секреции. В то же время; в отличие от синапсов лягушки, блокирование основных для этих синапсов P/Q (Cav 2.1) каналов не изменяло временных параметров секреции квантов^ а только снижало их количество. Отсутствие влияния блокатора N (Cav 2.2) каналов на вызванную секрецию ацетилхолина свидетельствует о том, что в зрелом синапсе мыши эти каналы не участвуют в регуляции экзоцитоза синаптических везикул, а появление квантов; выделяющихся с затянутыми; синаптическими задержками в условиях существенно сниженной внеклеточной концентрации ионов; кальция' может быть, обусловлено включением в секреторный процесс L (Сау 1.2) каналов, поскольку их блокирование нитрендипином вызывает снижение квантового состава и' синхронизацию секреции;- Выявленные различия в механизмах кальциевой1 регуляции параметров вызванной секреции;квантов ацетилхолина в синапсах теплокровных и холоднокровных, могут быть обусловлены особенностями морфофункционального состояния секреторного аппарата, к которым относятся: разные геометрические параметры области активной зоны, и взаимного расположения ионных каналов и Са2+ сенсоров; разное сродство к Са и скорость связывания Са тчувствительных сенсоров (изоформ везикул ассоциированного белка синаптотагмина), обеспечивающих синхронное и I асинхронное освобождение квантов; разная степень активности Са I секвестрирующих систем, способных элиминировать Са из области активной зоны.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Васин, Александр Львович, Казань

1. Бронштейн, И. Н: Справочник по математике / И. Н. Бронштейн, К.А. Семендяев // М.: Наука, 1986.

2. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц // М.: Практика, 1999.

3. Зефиров, A. JL Секреция медиатора в проксимальных и дистальных участках нервного окончания портняжной мышцы лягушки / A. JI. Зефиров // Нейрофизиология. 1983. - Т. 15. - N 4. - С. 362-369.

4. Зефиров, A. JI. Возникновение и распространение возбуждения в двигательной нервной терминали / A. JI. Зефиров, И. А. Халилов // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1990. - Т. 59. - № 3. - С. 219-222.

5. Зефиров, A. JI. Влияние асинхронности на амплитудно-временные параметры вызванного постсинаптического тока и потенциала в нервно-мышечном синапсе / A. JI. Зефиров, О. Ш. Гафуров // Физиол. журн. им. И. М: Сеченова. 1997. - Т. 83. - № 9. - С. 22-31.

6. Зефиров, A.JI. Молекулярные механизмы квантовой секреции медиатора в синапсе / A.JI. Зефиров, С.Ю. Черанов // Успехи физиол. наук. 2000. - Т. 31. - № 3. - С. 3-22.

7. Каменская, М. А. Современные представления о механизме квантового освобождения медиатора из моторных нервных окончаний скелетной мышцы- / М. А. Каменская // Успехи физиол. наук. 1972. - № 3. - С. 22-63.

8. Магазаник, JI. Г. Передача в периферических синапсах / Общая физиология нервной системы. Руководство по физиологии // М.: Наука, 1979.-С. 278-346.

9. Магазаник, JI. Г. Полимодальность распределения синаптических задержек в нервно-мышечном соединении лягушки / JI. Г. Магазаник, М. Л. Миненко // Нейрофизиология. 1986. - Т. 18. - № 6. - С. 748755.к 1- 91

10. Allana, J. Relative distribution of Са channels at the crayfish inhibitory neuromuscular junction / J. Allana; J. Lin // J. Physiol. 2004. - V. 92. - P. 1491-1500.

11. Andersonj A. Omega -conotoxin does not block the veraparmil- sensitive calcium channels at mouse nerve terminals / A. Anderson, A. Harvey // Neurosci. Lett. 1987. - V. 82. - P. 177-180.

12. Atchinson, W. Dihydropyridine-sensitive and -insensitive components of acetylcholine release from rat motor nerve terminals / W. D. Atchison // J. Pharmacol. Exp; Ther. 1989. - V. 251. - №'2. - P. 672-678.

13. Atluri, P. Delayed release of neurotransmitter from cerebellar granule cells / P.- Atluri, W. Regehr // J. Neurosci. 1998. - V. 18. - P. 8214-8227.

14. Augustine, G. Calcium action in synaptic transmitter release / G. Augustine, M. Charlton, S. Smith // Ann. Rev. Neurosci. 1987. - V. 10.' -P: 633-693.

15. Augustine, G. The calcium signal for transmitter secretion from presynaptic nerve terminals / G. J. Augustine, E. M. Adler, M. P. Charlton // Ann. NY Acad. Sci. 1991. - V. 635. - P. 365-381.

16. S.Augustine, G. How does calcium trigger neurotransmitter release? / G. J. Augustine // Curr. Opi. Neurobiol. 2001. - V. 11. - P. 320-326..92- у • . ; .

17. Baldo, G. Facilitation and the conduction; of the. nerve action potential at the frog neuromuscular junction / G: J. Baldo, E, S. Cohen, W. Van der Kloot // Pflugers Arch. 1983. - V. 399. - P. 161-165.

18. Barret, E. E. Quantal independence and uniformity of presynaptic release kinetics at the frog neuromuscular junction / E. E. Barret, C. F. Stevens // J. Physiol. 1972 (a). - V. 227. - P. 665-691.

19. В arret, E. E. The kinetics of transmitter release at the frog neuromuscular junction / E. E. Barret, C. F. Stevens // J. Physiol. 1972 (b). - V. 227. - P. 691-708:

20. Beam, C. A. Analysis of clustered data in receiver operating characteristic studies / C. A. Beam // Stat. Methods Med. Res. 1998.-V. 7 - № 4. - P. 324-336;.

21. Bean, B. P. Two kinds of calcium channels in' canine; arteriaH cells. Differences in kinetics, selectivity and farmacology / B. P. Bean // J: Gen. Physiology. 1985. -V. 86. - P. 1-30.

22. Bean, B. More than a Ca2+ channel / B. Bean // Trends Neurosci. 1989. — • V. 12-№4.-P. 128-130. .

23. Bennet, M. R. Development of neuromuscular synapses ./ M: R. Bennet // Physiol; Rev. 1983^ - V. 63. - № 3. - P. 1048.

24. Bennet, M. R. The probability of quantal- secretion at release sites in different calcium^ concentrations in toad (Bufomarinus) muscle / M. R;. Bennet, N. A. Lavidis //J. Physiol. 1989. -V. 418. - P. 219-233.

25. Benoit, P. Modification of transmitter release by ions which prolong the presynaptic action / P. Benoit, J. Mambrini // J. Physiol. 1970.-V. 210.-P. 681-695.

26. Beutner, D. Calcium dependence of exocytosis and endocytosis at ther cochlear inner hair cell afferent synapse / D. Beutner, Th. Voets, E. Neher, T. Moser // Neuron. 2001. - V. 29. - P. 681-690.

27. Borst, J. Calcium current during a single action potential in a large presynaptic terminal of the rat brain stem / J. Borst, B. Sakmann // J. Physiol. 1998. - V. 506. - P. 143-157.

28. Braun, M. Potential changes recorded from motor nerve terminal during its activation / M. Braun, R. Schmidt // Pflugers. Arch. 1961. - V. 287 - P. 56-80.

29. Bukcharaeva, E. Noradrenaline synchronizes evoked quantal release at frog neuromuscular junctions / E. Bukcharaeva, K. Kim, J. Moravec, E. Nikolsky, F.Vyskocil // J. Physiol. 1999. - V. 517. - P. 879-888.

30. Bukharaeva, E. Protein kinase A cascade regulates quantal release dispersion at frog muscle endplate / E. Bukharaeva, D. Samigullin, E. Nikolsky, F. Vyskocil // J. Physiol. 2002. - V. 538. - P. 837-848.

31. Bykhovskaia, M. Asynchrony of quantal events in evoked multiquantal responses indicates presynaptic quantal interaction / M. Bykhovskaia, J; T. Hackett, M. K. Worden. // J. Neurophysiol. 1999. - V. 181. - P. 22342242.

32. Carbone, E. A low voltage-activated, fully inactivating Ca channel in vertebrate sensory neurons / E. Carbone, H. D. Lux // Nature. 1984. — V. 310.-№5977.-P. 501-502.

33. Catterall, W. A. Structure and function of voltage-gated ion channels / W. A. Gatterall // Trends Neurosci. 1993. - V. 16. - № 12. - P. 500-506.

34. Catterall, W. International5 union of pharmacology. XL. Compendium, of voltage-gated calcium channels / W. Catterall, J. Striessing // Pharm. Rev.-2003.-V. 55.-P. 579-581.

35. Catteral, W. A. Calcium channel regulation and presynaptic plasticity / W. A. Catterall A. P. Few // Neuron. 2008. - V. 59. - № 6. - P. 882-90V.

36. Charlton, M: Classification of presynaptic calcium channels at the-squid, giant synapse: neither T-, L- nor N-type / M. P.Charlton, G. J. Augustine // Brain.Res. 1990. -V. 525. - P. 133-139.

37. Correges, P. Disorganization of quantal acetylcholine release by zinc at the Torpedo nerve-electroplate junction / P. Correges, Y. Dunant // Pflugers Arch Eur. J. Physiol. - 1996. - V. 432. - P. 859-866.

38. Cooper, R. L. Synaptotagmin- like expression in the motor nerve terminals of crayfish / R. L. Cooper, D. R. Hampson, H. L. Atwood // Brain Res. 1995. - V. 703 - P. 214-216.

39. Csillik, B. Fine structural localization of calcium binding sites in the neuromuscular junction / B. Csillikand, E. Knyihar Csillik // Acta. Biol. Acad. Sci. Hung. 1980.-V. 31. - P. 49-56.

40. Del Castillo, J. Statistical factors involved in neuromuscular facilitation and depression / J. Del Castillo, B. Katz // J. Physiol (L). 1954. - V. 124. -P. 574-585.

41. DeMaria, C. D. Calmodulin bifurcates the local Ca2+ signal that modulates P/Q-type Ca2+ channels / C. D. DeMaria, T. W. Soong , B. A. Alseikhan, R. S. Alvania, D. T. Yue // Nature. 2001. - V. 411. - № 6836. p. 484-489.

42. Depetris, R. Altered synaptic synchrony in motor nerve terminals lacking P/Q-calcium channels / R: S. Depetris, S. I. Nudler, O. D. Uchitel, F. J. Urbano // Synapse. 2008. - V. 62. - № 6. - P. 466-471.

43. Dodge, F. A. Co-operative action a calcium ions in transmitter release at the neuromuscular junction / F. A. Dodge, R. Rahamimoff // J. Physiol. -1967. V. 193. - № 2. - P. 419-432.

44. Dolphin; A. Voltage-dependent calcium channels and their modulation by neurotransmitters and G proteins / A. C. Dolphin // Exp. Physiol. 1995. V. 80. - P. 1-36.

45. Dreyer, F. Ultrastructure of the "active zone" in the frog neuromuscular junction / F. Dreyer , К. Peper, K„ Akert, C. Sandri, H. Moor // Brain Res.-1973. -V. 62 № 2: - P. 373-380.

46. Dunlap; K. Neurotransmitters decrease the calcium conductance activated by depolarization of embryonic chick sensory neurons / K. Dunlap, G. D. Fischbach //J; Physiol.-1981. V. 31T7.-P: 519-535.

47. Dunlap, K. Exocitotic Ca channels: in mammalians central neurons / K. Dunlap, J. L. Luebke, T. J. Turner // TINS. 1995. - V. 18: - P. 89-98.

48. Giniatullin, R. Modelling endplate curre:nt: dependence on quantum secretion probability and postsynaptic miniature current: parameters / R.

49. Giniatullin, L. S. Kheeroug, F. Vyskocil1// Eur. Biophys. J.1995.-V. 23.-P. 443-446.

50. Goda, Y. Two components of transmitter release at a central synapse / Y. Goda, C. F. Stevens // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V. 91. - P. 12942-12946.

51. Grinnell, A. Synaptic length as a function of motor unit size in the normal frog sartorius / A. Grinnell, L. Trussell // J. Physiol. 1983. - V. 338. - P. 221-241.

52. Gundersen, С. B. Suppression cloning of the cDNA for a candidate subunit of a presynaptic calcium channel / С. B. Gundersen , J. A.Umbach // Neuron. 1992. - V. 9. - № 3. - P. 527-537.

53. Hagiwara, S. Voltage clamp analysis of two inward current mechanisms in the egg cell'membrane of a starfish / S. Hagiwara, S. Ozawa, O. Sand // J. Gen. Physiol. 1975. - V. 65. - P. 617-644.

54. Harlow, M. The architecture of active zone material at the frog's neuromuscular junction / M. L. Harlow, D. Ress, A. Stoschek, R. M. Marshall, U. J. McMahan // Nature. 2001. - V. 409. - № 6819. - P. 479484.

55. Hubbard, J. Microphysiology of vertebrate neuromuscular transmission / J. Hubbard // Physiol. Rev. 1963. - V. 53. - P. 674-723.

56. K+ channels at fluorescently labeled presynaptic active zones of hair cells / N. P. Issa, A. J. Hudspeth // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994. - V. 91. -P. 7578-7582.

57. Jarvis, S. E. Molecular determinants of syntaxin 1 modulation of N-type calcium channels / S. E. Jarvis , W. Barr, Z. P. Feng, J. Hamid, G. W. Zamponi // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - № 46. - P. 44399-44407.

58. Kasai, K. Comparative biology of Ca -dependent exocytosis: implications of kinetic diversity for secretory function / K. Kasai // TINS. 1999. - V. 22. -№2.-P. 88-93.

59. Katz, B. The measurement of synaptic delay, and the time course of acetylcholine release at the neuromuscular junction/ B. Katz, R. Miledi // Proc. R. Soc. B. 1965 (a). -V. 161. - P. 483-495.

60. Katz, B. Propagation of electric activity in motor nerve terminals / B. Katz, R. Miledi // Proc. R. Soc. B. 1965 (b). - V. 161. - P. 453-483.

61. Katz, B. The effect of calcium on acetylcholine release from motor nerve ending / B. Katz, R. Miledi // Proc. R. Soc. B. 1965 (с). - V. 161. - P. 496-503.

62. Katz, B. The effect of temperature on the synaptic delay at the neuromuscular junction / B. Katz, R. Miledi // J. Physiol. 1965 (d). - V. 181.-P. 656-670.

63. Katz, B. Further study of the role of calcium in synaptic transmission / B. Katz, K. Miledi // J. Physiol. 1970. - V. 207. - № 3. - P. 789-801.I

64. Katz, E. Effects of Ca channel blockers on transmitter release and presynaptic currents at the frog neuromuscular junction / E. Katz, P. A. Ferro, B. D. Cherksey, M. Sugimori, R. Llinas, O. D. Uchitel // J. Physiol.-1995. V. 486. - № 3. - P. 695-706.

65. Katz, E. Calcium channels involved in synaptic transmission at the mature and regenerating mouse neuromuscular junction / E. Katz, P. A. Ferro, G. Weisz, O. D. Uchitel // J. Physiol. 1996. - V. 497. - № 3. - P. 687-697.

66. Lansman, J. В. Blockade of current through single calciums channels by Cd2+, Mg2+, and Ga2+. Voltage and concentration dependence of calcium entry into pore / J. B: Lansman, B. Hess, R. W. Tsein // J. Gen Physiol. 1986. - V. 88. - P. 321-347.

67. Lee, H. C. Mechanisms of calcium signalling by cyclic ADP-ribose and NAADP / H. C. Lee // Physiol. Rev. 1997. - V. 77. - P. 1133-1164.

68. Liang, H. Unified mechanisms of Ca2+ regulation across the Ca2+ channel family/ H. Liang, C. D. DeMaria, M. G. Erickson, M. X. Mori, B. A. Alseikhan, D. T. Yue // Neuron. 2003. - V. 39. - № 6. - P. 951-60.

69. Lin, J.-W. Modulation of synaptic delay during synaptic plasticity / J.-W. Lin, S. Faber // Trends in Neurosci. 2002. - V. 25. - P. 449-455.

70. Llinas, R. R. Voltage-dependent calcium conductances in mammalian neurons. The P channel / R. R. Llinas, M. Sugimori, B. Cherksey // Ann. NY Acad. Sci. 1989: - V. 560. - P. 103-111.

71. Llinas, R. R. The concept of calcium concentration microdomains in synaptic transmission / R. Llinas, M. Sugimori, R. B. Silver // Neuropharmacology. 1995. -V. 34. - № 11. - P. 1443-1451.

72. Lindgren, G. Calcium current in motor nerve endings of the lizard' / C. A. Lindgren, J. W. Moore // Ann. NY Acad. Sci. 1991. - V. 635. - P: 58-69.

73. Lopez, M. A dihydropyridine-resistant component in the rat adrenal secretory response to splanchnic nerve stimulation / M. G. Lopez, R. Shukla, A. G. Garcia, A. R. Wakade // J. Neurochem. 1992. - V. 58. - P. 2138-2144.

74. Lustig, G. Release kinetics as a tool' to describe drug effects on neurotransmitter release / C. Lustig, H. Parnas, I. Segel // J. Theor. Biol: -1991.-V. 144'.-P. 225-248.

75. Magleby, K. L. A study of desensitization of acetylcholine receptors using nerve-released transmitter in the frog / K. L. Magleby, B.S. Pallotta // J. Physiol. 1981. - V. 16. - P. 225-250.

76. Martin, A. A, further study of the statistical composition on the end-plate potential / A. R. Martin // J. Physiol. 1955. - V. 130. -№ 1. - P. 114-122.

77. McDonough, S. I. Alteration of P-type calcium channel gating by the spider toxin omega-Aga-IVA / S. I. McDonough, I. M. Mintz, B. P. Bean // Biophys. J. 1997. - V. 72. - № 5. - P. 2117-2128.

78. McGraw, C. F. Localization of calcium in presynaptic nerve terminals / C. F. McGraw, A. U. Somlyo, M. P. Blaustaein // J. Cell. Biol. 1980. - V. 85.-P. 228-241.

79. Meir, A. Ionic channels in presynaptic nerve terminals and control of transmitter release / A. Meir, S. Ginsburg, A. Butkevich, S. Kachalsky, R. Rahamimoff// Physiol. Rev. 1999. - V. 79. - P. 1019-1088.

80. Miledi, R. Strontium as a substitute for calcium, in the process, of transmitter release at the neuromuscular junction / R. Miledi // Nature. -1966. V. 212. - № 10. - P. 1233-1234.

81. Nagwaney, S. Macromolecular connections of active zone material to docked synaptic vesicles and presynaptic membrane at neuromuscularjunctions of mouse / S. Nagwaney, M. L. Harlow, J.

82. H. Jung, J. A. Szule, David Ress, J. Xu, R. M. Marshall, U. J. McMahan //J. of Сотр. Neurol. 2009. - V. 513. - P. 457-468.

83. Neher, E. Presynaptic calcium and control of vesicle fusion / R. Schneggenburger, E. Neher / Curr. Opin. Neurobiol. 2005. — V. 3. - P. 266-274.

84. Neher, E. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release / E. Neher, T. Sakaba // Neuron. 2008. - V. 59. -P. 861-872.

85. Neely, A. Ca(2+)-dependent inactivation of a cloned cardiac Ca2+ channel alpha 1 subunit (alpha 1С) expressed in Xenopus oocytes / A . Neely, R. Olcese, X. Wei, L. Birnbaumer, E. Stefani // Biophys J. 1994. -V. 66.-№6.-P. 1895-1903.

86. Nestler, E. J. Protein phosphorylation and the regulation neuronal function, in Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular, and Medical Aspects / E. J. Nestler, P. Greengard // Raven Press, New York. 1994. -V. 5. - P. 449-474.

87. Nicholls, J. From neuron to brain/ J. Nicholls, R.Martin, B. Wallace, P.Funch // Sinauer Ass. Publishers, 2001.

88. Nikolsky, E. Cholinergic regulation of the quantal release at frog neuromuscular junction / E. Nikolsky, D. Samigullin, F. Vyskocil, E. Bukharaeva // J. Physiol. 2004. - V. 560. - P. 77-88.

89. Nowycky, M. C. Three types of neuronal calcium channel with different calcium agonist sensitivity / M. C. Nowycky, A. P. Fox, R. W. Tsien //Nature. 1985. - V. 316. - № 6027. - P. 440-443.

90. Olivera, В. M. Peptide neurotoxins from fish-hunting cone snails / В. M. Olivera, W. R. Gray, R. Zeikus, J. M. Mcintosh, J. Varga, J. Rivier, V. de Santos, L. J. Cruz // Science. 1985. - V. 230. - № 4732. - P. 1338-1343.

91. Olivera, В. M. Calcium channel diversity and neurotransmitter release: the omega-conotoxins and omega-agatoxins / В. M. Olivera, G. P. Miljanich, J. Ramachandran, M. E. Adams //Annu. Rev. Biochem. 1994. -V. 63.-P. 823-867.

92. Ousley, A. H. An anti-peptide antibody specific for the class A calcium channel alpha 1 subunit labels mammalian neuromuscular junction / A. H. Ousley, S. C. Froehner //Proc. Natl! Acad. Sci. USA. 1994: - V. 91. - № 25.-P. 12263-12267.

93. Parnas, H. Effect of Ca diffusion on the time-course- of neurotransmitter release / H. Parnas, G. Hovav, I. Parnas // Biophys. J. -1989.-V. 55.-P. 859-574:

94. Parnas, I. Different mechanisms control the amount and time course of neurotransmitter release / I. Parnas, H. Parnas // J. Physiol. 1999. - V. 517.-P. 629.

95. Parnas, H. Autoreceptors, membrane potential and the regulation-of transmitter release / H. Parnas, L. Segel, J. Dudel, I*. Parnas / Trends Neurosci. 2000. - V. 2. - P. 60-68.

96. Peper, K. Structure and ultrastructure of the frog motor endplate. A freeze-etching study / K. Peper, F. Dreyer, C. Sandri, K. Akert, H. Moor // Cell Tissue Res. 1974 - V. 149. - № 4. - P. 437-455.

97. Perissinotti, P. P. L-type calcium channels are involved in fast endocytosis at the mouse neuromuscular junction / P. P. Perissinotti, B. Giugovaz Tropper, O. D. Uchitel //Eur. J. Neurosci. 2008. - V. 7. - № 6. -P. 1333-1344."

98. Pietrobon, D. Function and dysfunction of synaptic calcium channels: insights from mouse models / D. Pietrobon // Curr. Opin. Neurobiol. -2005.-V. 15.-№3.-P. 257-265.

99. Platzer, J. Congenital deafness and sinoatrial node dysfunction in mice lacking class D L-type Ca2+ channels / J. Platzer, J. Engel, A. Schrott-Fischer, K. Stephan, S. Bova, H. Chen, H. Zheng, J: Striessnig // Cell. -2000. V. 102. - № 1. - P. 89-97.

100. Pumplin, D. W. Normal variations in1 presynaptic active zones of frog neuromuscular junctions / D. W. Pumplin // J. Neurocytol. 1983: - V. 12. -№ 2.-P. 317-323.

101. Rahamimoff, R. Delayed release of transmitter at the frog neuromuscular junction / R. Rahamimoff; Y. Yaari // J. Physiol. 1973. -V. 228: - P. 241-257.

102. Randall, A., Pharmacological dissection of multiple types of Ga2+ channel currents in rat cerebellar granule neurons / A. Randall, R. W. Tsein // J. Neurosci. 1995. - V. 15. - № 4. - P. 2995-3012.

103. Robitaille, R. Localization of L-type Ca2+ channels at perisynaptic glial cells of the frog neuromuscular junction / R. Robitaille, M. J: Bourque, S. Vandaele //J. Neurosci. 1996. -V. 16. - № 1. - P. 148-158.

104. Rosato-Siri, M. D. Calcium channels coupled to neurotransmitter release at neonatal rat neuromuscular junctions / M. D. Rosato Siri, O. D. Uchitel // J. Physiol. 1999. - V. 514. - № 2. - P. 533— 540.

105. Rossoni, G. Omega-Gonotoxin GVIA binds to and blocks rat neuromuscular junction / G. Rossoni, F. Berti, L. La Maestra, F. Clementi //Neurosci. Lett. 1994. -V. 1. - № 176. - P. 185-188.

106. Ruzzier, F. Effect of repetitive stimulation on the frog neuromuscular transmission / F. Ruzzier, M. Scuka//Pflugers Arch. 1979. - V. 382. - № 2. - P. 127-132.

107. Sabatini, B. L. Timing of synaptic transmission / B. L. Sabatini, W. G. Regher // Annu. Rev. Physiol. 1999. - V. 61. - P. 521-542.

108. Sand, O. Contribution.of L-type Ca(2+) channels to evoked transmitter release in cultured Xenopus nerve-muscle synapses / O. Sand; В. M. Chen, A. D. Grinnell // J. Physiol. 2001. -V. 1. - № 536. - Pt. 1. - P. 21-33.

109. Santafe, M. Calcium channels coupled to neurotransmitter release at dually innervated neuromuscular junctions in the newborn rat / M. M. Santafe, N. Garcia, M. A. Lanuza, O. D. Uchitel, J.Tomas // J. Neurosci. -2001.-V. 102.-P. 697-708.

110. Sidach, S. S. Kurtoxin, a gating modifier of neuronal high- and low-threshold Ca channels / S. S. Sidach, I. M Mintz // J. Neurosci. 2002. - V. 15.-P. 2023-2034.

111. Schneggenburger, R. Presynaptic calcium and control of vesicle fusion / R. Schneggenburger, E. Neher // Curr. Opin. Neurobiol. 2005. - V. 15. - № 3. - P. 266-274.

112. Shahrezaei, V. Ca2+ from one or two channels controls fusion of a single vesicle at the frog neuromuscular junction / V. Shahrezaei, A. Cao, K. R. Delaney // J. Neurosci. 2006. - V. 26. - № 51. - P. 13240-13249.

113. Soucek, B. Influence of latency fluctuations and the quantal process of transmitter release / B. Soucek // Biophys. J. 1971.- V. 11. - P. 127-139.

114. Stevens, C. F. Facilitation and depression^ single central'synapses / C. F. Stevens, Y. Wang // Neuron. 1995. - V. 14. - № 4. - P. 795-802.

115. Sudhof, T. Synapses / T. Sudhof, S. Steven, Ed. M. Covan. London: Johns Hopkins University Press, 2001.

116. Sudhof, Т. C. The synaptic vesicle cycle / Т. C. Sudhof // Annu. Rev. Neurosci. 2004. - V. 27. - P. 509-547.

117. Tareilus, E. Presynaptic calcium channels: pharmacology and regulation / E. Tareilus, H. Breer // Neurochem. Int. 1995. - V. 26 - № 6. - P. 539558.

118. Thaler, G. Calcium channel isoforms underlying synaptic transmission at embryonic Xenopus neuromuscular junctions / C. Thaler, W. Li, P. Brehm // J. Neurosci. 2001. - V. 15*. - Y: 412-422.

119. Tsein, R. W. Multiple types of neuronal calcium channels and their selective modulation / R. W. Tsien, D. Lipscombe, D. V. Madison, K. R. Bley, A. P. Fox //Trends Neurosci. 1988. -V. 11. - № 10. - P. 431-438.

120. Umemiya, M. Single-channel properties of four calcium channel types in rat motoneurons / M. Umemiya, A. J. Berger // J. Neurosci. 1995. - V. 15. - № 3. - Pt. 2. - P. 2218-2224.о I

121. Urbano, F. J. L-type calcium channels unmasked by cell-permeant Ca buffer at mouse motor nerve terminals / F. J. Urbano, O. D. Uchitel // Pflug. Arch. (Eur. J. Physiol.). 1999. - V. 437. - P. 523-528.

122. Urbano, F. Coupling of L-type calcium channels to neurotransmitter release at mouse motor nerve terminals / F. J. Urbano, R. S. Depetris, O. D. Uchitel // Eur. J. Physiol. 2001. - V. 441. - P. 824-831.

123. Urbano, F. J. Calcium channels, neuromuscular synaptic transmission and neurological diseases / F. J. Urbano, M. R. Pagani, O. D. Uchitel // J. Neuroimmunol. 2008. - V. 15. - P. 136-144.

124. Van der Kloot, W. Estimating-the timingof quantal'releases during end-plate currents at the frog neuromuscular junction / W. Van der Kloot // J. Physiol. 1988 (a). - V. 402. - P. 595-603.

125. Van der Kloot, W. The kinetics of quantal releases during end-plate currents at the frog neuromuscular junction / W. Van der Kloot // J. Physiol. (Lond). 1988 (b). - V. 402. - P. 605-626.

126. Van der Kloot, W. The regulation of quantal size / W. Van der Kloot // Progr. in Neurobiol. 1991. -V. 36.- P. 93-130.

127. Weakly, J. N. The action of cobalt ions on neuromuscular transmission in the frog / J. N. Weakly // J. Physiol. 1973. - V. 234. - № 3. - P. 597612.

128. Wood, S. Safety factor at the neuromuscular junction, / S. Wood; C. Slater // Progr. In NeurobioL 2001. - V. 64. - P; 393-429.

129. Wu, L. R-type Ca currents; evoke transmitter release at rat central synapse / L. G.Wu,.G. Borst, B. Sakmann // Proc. Natl; Acad. Sci. USA -1998. V. 95.-P. 4720-4725.

130. R; S. Zucker // Neuron. 1996. - V. 17. - P: 1049-1055165. Zucker, R. S. Short-term synaptic plasticity / R. S.: Zucker,; W. G. Regehr// Annu. Rev. Physiol. - 2002 - V. 64 - P. 355-405.

Информация о работе

Васин, Александр Львович
кандидата биологических наук
Казань, 2010
ВАК 03.03.01

Диссертация

Роль кальциевых каналов разных типов в регуляции квантовой секреции в нервно-мышечных синапсах мыши и лягушки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы