Механизмы Ca2+-зависимого подавления секреции медиатора в новообразованных нервно-мышечных синапсах мыши

Богачева, Полина Олеговна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы Ca2+-зависимого подавления секреции медиатора в новообразованных нервно-мышечных синапсах мыши
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы Ca2+-зависимого подавления секреции медиатора в новообразованных нервно-мышечных синапсах мыши"

00348 1 1БЗ

На правах рукописи

Богачева Полина Олеговна

Механизмы Са -зависимого подавления секреции медиатора в новообразованных нервно-мышечных синапсах мыши

03.00.13 - физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

о О Л-- 23

Москва - 2009

003481163

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова (заведующий - доктор биологических наук, профессор A.A. Каменский)

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова Ольга Петровна Балезина

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной и патологической физиологии факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова Владимир Борисович Кошелев

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории мембранологии с группой генетических исследований ГУ «Научный центр здоровья детей РАМН» Татьяна Павловна Сторожевых

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

Российский Университет Дружбы Народов им. Патриса Лумумбы

Защита диссертации состоится 9 ноября 2009 года в 15~ на заседании диссертационного ученого совета Д 501.001.93 биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, биологический факультет, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан 1 октября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Б. А. Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Механизмы образования и перестройки синалтических контактов - актуальный вопрос современной синаптологии, ключ к пониманию пластичности нейронов. Классической моделью синаптогенеза являются процессы формирования и удаления нервно-мышечных синапсов, происходящие на скелетных мышечных волокнах млекопитающих в период реиннервации мышцы прорастающим к ней двигательным нервом после его повреждения (Bennett et al., 1973; Argentieri et al., 1992; Burden, 2002; Lomo, 2003). Известно, что подрастающие моторные аксоны образуют на волокне избыточное число контактов, из которых большинство вскоре «замолкают», то есть перестают секретировать медиатор, а вслед за этим отторгаются, элиминируются. В результате на волокне сохраняется один синапс, а лолисинаптическая иннервация сменяется на одиночную, лгоносинаптическую. Механизмы и процессы, приводящие к подавлению избыточных синапсов и их последующей элиминации, остаются не ясными, несмотря на актуальность и длительную историю изучения вопроса (Hoh et al., 1975; O'Brien et al., 1978; O'Brien et al., 1984; Barber, Lichtman, 1999; Constanzo et al., 1999; Lanuza et al., 2002; Santafe et al., 2002; Nelson et al., 2003; Buffelli et al., 2004; Li et al., 2004).

В последние годы установлено, что в новообразованных моторных терминалях наряду с потенциал-зависимыми Са2+-каналами P/Q- и N-типа, запускающими секрецию медиатора, имеются потенциал-зависимые Са2+-каналы L-типа, принимающие особое участие в регуляции секреции медиатора (Atchison, 1989; Gray et al., 1992; Fu, Huang, 1994; Rosato-Siri, Uchitel, 1999). Показано, что именно вход кальция в терминали по L-типу Са2+-каналов (при генерации пресинаптического потенциала действия) приводит к подавлению секреции медиатора в новообразованных синапсах, их «замолканию» и, как следствие -последующей элиминации избыточных синапсов. Соответственно, блокаторы Са2+-каналов L-типа (D-600, нифедипин и др.), напротив, способствуют растормаживанию подавленных синапсов и усилению синаптической передачи в период новообразования нервно-мышечных синапсов (Rosato-Siri, Uchitel, 1999; Santafe et al., 2001; Piriz et al., 2003). Явление Са2+-зависимого торможения секреции ацетилхолина (АХ) в новообразованных синапсах выявлено как в период реиннервации зрелых скелетных мышц, так и на ранних стадиях онтогенеза и формирования двигательной иннервации скелетных мышечных волокон. Высказываются предположения, что это торможение имеет отношение к подавлению активности избыточных синапсов и ускорению созревания моторной иннервации в виде одиночной концевой пластинки (Santafe et al., 2002). Механизмы Са2+-зависимого торможения секреции АХ в моторных синапсах в период их новообразования на скелетных мышечных волокнах остаются не изученными и представляют большой интерес для нервно-мышечной физиологии и клинической неврологии.

Цели и задачи работы. Целью работы было изучить внутриклеточные механизмы, с помощью которых ионы кальция, поступающие в новообразованные нервные терминали по L-типу Са2+-каналов, приводят к подавлению секреции

медиатора и передачи сигналов в новообразованных моторных синапсах реиннервируемых скелетных мышц мыши. В работе были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Исследовать явление Са2+-зависимого торможения секреции АХ с помощью агонистов и антагонистов Са2+-каналов Ь-типа, его особенности на разных сроках созревания синапсов, при ритмической залповой и спонтанной активности новообразованных контактов.

2. Выявить вклад депонированного кальция, выбрасываемого через рианодиновые рецепторы (РиР) терминалей, в Са2+-зависимое торможение секреции АХ в новообразованных синапсах.

3. Исследовать участие Са2+-зависимых К+-каналов большой и малой проводимости (ВК- и 5К-типа) в реализации Са2+-зависимого торможения секреции АХ в новообразованных моторных терминалях

4. Выявить участие ряда Са2+-зависимых белков и ферментов - кальмодулина, кальмодулинкиназы II (СаМКП) и протеинкиназы С (РКС) в Са2+-зависимом торможении секреции АХ

5. Исследовать возможный вклад потенциап-активируемых К+у-каналов в Са2+-зависимое торможение, осуществляемое с участием РКС.

Научная новизна полученных результатов.

В работе получен ряд новых ранее не известных фактов. Впервые показано, что Са2+-зависимое торможение секреции АХ в новообразованных нервно-мышечных синапсах мыши наблюдается не только при одиночной, но и при залповой вызванной активности синапсов, однако не затрагивает спонтанную секрецию медиатора. Впервые раскрыта роль кальция, входящего по Ь-типу Са2+-каналов, в активации РиР и выбросе депонированного кальция, который также участвует в механизме Са2+-зависимого торможения секреции медиатора. Выявлен ранее не известный факт, что подавление активности пресинаптической СаМКП может принимать участие в Са2+-зависимом торможении синаптической передачи в новообразованных моторных синапсах. Наконец, впервые показано, что механизм Са2+-зависимого торможения АХ включает Са2+-зависимую активацию РКС, направленную на усиление активности потенциал-зависимых К\гканалов терминалей в новообразованных моторных синапсах мыши.

Теоретическое и практическое значение работы

К числу фактов, имеющих общее теоретическое значение для физиологии синапсов, относится выявленный в работе внутриклеточный каскад реакций, приводящий к Са2+-зависимому торможению секреции медиатора в новообразованных моторных синапсах мыши. Показано, что входящий в терминали потенциал-активируемый Са2+-ток Ь-типа в комплексе с индуцированным им выбросом депонированного кальция, вызывают формирование Са2+-сигналов, реципрокно влияющих на активность Са2+-зависимых ферментов терминали. Происходит: а) подавление облегчающего действия СаМКП на секрецию АХ; б) активация РКС, направленная на усиление работы потенциал-зависимых К+у-каналов терминали и угнетение секреции АХ в исследуемых синапсах. Таким образом, показана способность двух

пресинаптических Са2+ -активируемых ферментов по-разному регулировать секрецию АХ, в зависимости от характера повышения уровня кальция в нервных терминалях. Эти данные приближают нас к пониманию Са2+-зависимых механизмов регуляции синаптической пластичности в химических синапсах.

Результаты работы могут оказаться полезными при решении прикладных задач синаптологии: при разработке способов коррекции посттравматических перестроек периферических нервно-мышечных синапсов, для ускорения восстановления иннервации мышц.

Основные положения работы, выдвигаемые на защиту

1. В новообразованных нервно-мышечных синапсах мыши Са2+-зависимое торможение секреции АХ осуществляется с участием сочетанной активности Са2+-каналов L-типа и выброса депонированного кальция через РиР в составе моторных нервных терминален.

2. Механизм Са2+-зависимого торможения секреции АХ предусматривает подавление потенцирующего действия CaMKII на выброс медиатора и синаптическую передачу в новообразованных синапсах мыши.

3. Вход кальция по L-типу Са2+-каналов приводит к активации Са2+-зависимой РКС, мишенью которой являются потенциал-активируемые KV каналы. Усиление активности К+у-каналов, опосредуемое РКС, является одним из механизмов Са2+-зависимого торможения секреции в новообразованных синапсах мыши.

Апробация диссертации

Результаты исследования были представлены на международной молодежной конференции Ломоносов-2007 (Москва, 2007), XX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007), I Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов-биологов Симбиоз, Россия 2008 «Биология: традиции и инновации в 21 веке» (Казань, 2008), I Всероссийской (XVI) молодежной научной конференции «Молодежь и наука на Севере» (Сыктывкар, 2008), 6-ом Форуме Федерации Европейских Нейронаук (Женева, Швейцария, 2008), 38-ом ежегодном съезде Общества Нейронаук (Вашингтон, США, 2008), конференции с международным участием «Механизмы нервных и нейроэндокринных регуляций», посвященной памяти Т.М. Турпаева (Москва, 2009), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009), ежегодном съезде Британского Физиологического Общества «Физиология 2009» (Дублин, Ирландия, 2009).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в их числе 2 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 188 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, характеристик материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения,

выводов, списка литературы; иллюстрирована 53 рисунками. Список литературы включает 306 источников, из них 24 отечественных.

ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для исследования спонтанной и вызванной синаптической активности в интакттаых и новообразованных нервно-мышечных синапсах мыши были выбраны моторные синапсы мышцы - длинного разгибателя пальцев т. extensor digitorum longus (m.EDL) мыши. Данная мышца иннервируется аксонами малоберцового нерва п. peroneus communis. В работе использовали беспородных мышей массой 20-30 г.

Пережатие нерва. Пережатие малоберцового нерва проводили за 11 суток до электрофизиологического эксперимента под эфирным наркозом. Раздавливание нерва осуществляли при помощи глазного пинцета с тонкими плоскими браншами, защищенными пластиковыми наконечниками, на расстоянии 4-5 мм от иннервируемой мышцы m.EDL. Протяженность раздавленного участка нерва : составляла 1 мм. Разрез зашивали и обрабатывали 1% спиртовым раствором бриллиантовой зелени. Спустя 7-8 суток после операции наблюдали первые признаки восстановления иннервации мышцы проросшим к ней нервом.

Внутриклеточная регистрация спонтанных и вызванных потенциалов концевой пластинки. Для изучения активности новообразованных синапсов на 11 сутки после пережатия нерва животных декапитировали и выделяли изолированный нервно-мышечный препарат. Дга предотвращения мышечных сокращений в ответ на стимуляцию нерва проводили процедуру рассечения мышечных волокон (Barstad, Lilleheil, 1968). Полученный «рассеченный» нервно-мышечный препарат помещали в камеру, заполненную физиологическим раствором Лайли для теплокровных, содержащим 135 мМ NaCl, 1,0 мМ MgCb, 4 мМ KCl, 0,9 мМ NaH2P04, 2,0 мМ СаС12) 11 мМ глюкозы, 16 мМ NaHC03 . Раствор аэрировали карбогеном (96% 02, 4% СОг) до установления pH 7,2-7,4. Исследования проводили при комнатной температуре (21°). Миниатюрные потенциалы концевой пластинки (МПКП) и потенциалы концевой пластинки (ПКП, не менее 50 в каждом синапсе) регистрировали внутриклеточно при помощи стеклянных микроэлектродов (сопротивление 5-10 МОм), заполненных 2,5 М раствором KCl. Для регистрации одиночных ПКП производили стимуляцию нерва импульсами длительностью 0,12-0,2 мм и частотой 0,3 Гц. Амплитуда стимула подбиралась индивидуально в соответствии с особенностями каждого препарата. Для регистрации залповой активности синапсов использовали режим ритмической стимуляции нерва с частотой 50 Гц. Для одиночных ПКП анализировали среднюю амплитуду, квантовый состав (рассчитываемый как отношение средней амплитуды ПКП к средней амплитуде МПКП), параметры временного хода. При анализе ритмически генерируемых ПКП оценивали амплитуду фазы «плато» залпа по средней амплитуде 20 последних ПКП в залпе, выраженной в процентах от амплитуды первого ПКП в залпе.

Статистическая обработка экспериментальных данных. Сравнение выборок производили по непараметрическому критерию Манна-Уитни. Использовали уровень значимости отличий между двумя выборками, равный 0,05.

Все данные представлены как средние значения ± стандартные ошибки среднего, п - объем выборки (количество исследованных синапсов).

Используемые в работе вещества: нифедипин (Biomol); верапамил (Sigma-Aldrich); S(-)-BAY К 8644 (Biomol); рианодин (Biomol); омега-агатоксин (Biomol); апамин (Sigma-Aldrich); паксиллин (Sigma-Aldrich); R-21574 (Serva); KN-62 (Biomol); хелеритрин (Sigma-Aldrich); бисиндолилмалейимид I (BIM) (Sigma-Aldrich); 4-аминопиридин (Biomol); бутандионмоноксим (BDM) (Biomol).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. ВЛИЯНИЕ БЛОКАДЫ Са2+-КАНАЛОВ L- И P/Q-ТИПА НА НЕРВНО-МЫШЕЧНУЮ ПЕРЕДАЧУ В ИНТАКТНЫХ И РЕИННЕРВИРОВАННЫХ СИНАПСАХ

Первая серия работы была посвящена анализу пресинаптических эффектов блокады Са"+-каналов L-типа в отношении секреции медиатора в интактных и новообразованных синапсах. Для блокады Са2+-каналов L-типа были выбраны разные по химическому строению избирательные блокаторы этих каналов: нифедипин (10 мкМ), относящийся к дигидропиридинам, и верапамил (5 мкМ), принадлежащий к фенилалкиламинам. Исследования новообразованных моторных синапсов на волокнах m.EDL проводили на 11 сутки после пережатия малоберцового нерва.

Также были изучены пресинаптические эффекты агонисга Са2+-каналов L-типа S(-)-BAY К 8644 в концентрации 1 мкМ на параметры ритмически генерируемых ПКП.

1.1. Влияние модуляции активности Са2+-каналов L-типа на одиночную вызванную секрецию медиатора в интактных и новообразованных синапсах.

Предварительный анализ параметров вызванных одиночных ПКП показал существенные различия в амплитуде, латентном периоде и длительности сигналов в новообразованных и зрелых синапсах (рис. 1), а также в характере их ответов на действие нифедипина.

Мы установили, что нифедипин оказывает значительное облегчающее действие на секрецию медиатора в новообразованных синапсах: амплитуда одиночных ПКП увеличилась от 6,5±0,9 мВ (в контроле) до 9,3±0,8 мВ на фоне нифедипина, то есть на 43% (р<0,05). Квантовый состав ПКП также возрастал от 10,4±1,4 до 15,8±1,9 под действием нифедипина (п=69, р<0,05).

Для понимания особенностей действия нифедипина были построены гистограммы амплитудного распределения ПКП. На рисунке 2 видно, что гистограмма амплитудных распределений ПКП новообразованных синапсов имеет асимметричную, скошенную форму - у нее имеется «хвост» высокоамплитудных ПКП. Такой вид гистограммы характерен для ранних стадий иннервации мышечных волокон, когда имеет место полисинаптическая полиаксональная иннервация мышечных волокон и вклад в регистрируемый интегральный ПКП нескольких активных синаптических контактов.

зарегистрированных в одном синапсе, а) Сравнение параметров одиночных ПКП ингактных синапсов и синапсов на 11 сутки после пережатия нерва, б) Влияние нифедипина на амплитуду ПКП новообразованных синапсов на 11 сутки после пережатия нерва.

Оказалось, что под действием нифедипина происходит не только сдвиг всей гистограммы в область высокоамплитудных значений, но и изменение ее формы -увеличение дисперсии сигналов и, как правило, достоверное присутствие двух амплитудных пиков (рис. 2). Это позволяет предполагать, что сосуществующие на одном волокне терминали и синапсы функционально гетерогенны по своей чувствительности к нифедипину, а значит - и к входящему тормозному Са2+-сигналу.

Рис. 2. Эффект нифедипина и агатоксина на нормированные гистограммы амплитудных распределений ПКП новообразованных синапсов, а) нифедипин, б) агатоксин.

Вераламил оказывал сходное действие на нервно-мышечную передачу в новообразованных синапсах. В контроле амплитуда ПКП составляла 5,9±0,7 мВ, а после аппликации верапамила - 8,6±0,9 мВ (р<0,05), то есть возросла на 45% (п=48). Квантовый состав же увеличился от 9,7±1,5 в контроле до 15,4±1,2 - на 58% (р<0,05).

Таким образом, различные по химическому строению антагонисты потенциал-чувствительных Са2+-каналов Ь-типа оказывают сходный потенцирующий эффект на секрецию медиатора в новообразованных синапсах. Это свидетельствует о специфичности их пресинаптического действия, связанного именно с блокадой Са2+-тока Ь-типа. Способность блокаторов Са2+-каналов Ь-типа вызывать облегчение выброса медиатора в новообразованных

синапсах мыши и лягушки описана и в ряде других работ (Топде, 1974; Б^ига, Ко, 1997; БаШаГе е! а1., 2001).

Исследование спонтанной секреции АХ путем регистрации МПКП в новообразованных синапсах показало, что под действием нифедипина амплитуда МПКП достоверно не изменилась и составила 86,9±б,6 % от интактного контроля (р>0,05). Не наблюдалось также изменений и частоты МПКП на фоне действия нифедипина, что говорит о пресинаптическом действии блокаторов Са2+-каналов Ь-типа.

В интактных синапсах оба выбранных нами блокатора не вызвали достоверных изменений ни амплитуды, ни квантового состава ПКП. Так, квантовый состав ПКП в зрелых интактных синапсах в среднем составлял 34,15±5,5, а после аппликации нифедипина - 35,8±4,9 (п=45, р>0,05).

1.2. Влияние модуляции Са2+-каналов Ь-типа на вызванную ритмическую активность в интактных и новообразованных моторных синапсах.

Исследования ритмических залпов ПКП показали, что их рисунок в интактных и новообразованных синапсах существенно различается. В интактных синапсах вслед за коротким начальным облегчением развивается спад ПКП и выход на сниженный, но стабильный уровень - фазу «плато». В новообразованных же контактах имеет место продолжительное начальное облегчение передачи по ходу залпа, а средняя амплитуда ПКП на фазе «плато» превышает амплитуду первого ПКП в залпе (рис. 3).

36 41 46 Номер ПКП

Рис. 3. Влияние нифедипина и верапамила на амплитуду ПКП новообразованных и зрелых синапсов в коротком залпе. Данные приведены в процентах от первого ПКП в залпе, а) новообразованные синапсы, б) зрелые ингакгные синапсы.

Действие нифедипина на новообразованные синапсы привело к достоверному (р<0,05) подъему уровня фазы «плато» примерно на 20% - от 127,04±0,48% в контроле до 147,75±0,48% на фоне нифедипина (п=51) (рис. 3). Под действием верапамила (5 мкМ) в новообразованных синапсах также происходило достоверное (р<0,05) увеличение средней амплитуды ПКП на фазе «плато» примерно на 29% - от 114,92±0,65% в контроле до 143,62±0,46% на фоне действия верапамила (п=48).

Исследования интактных мышечных волокон т.ЕВЬ показали, что в зрелых нервно-мышечных синапсах верапамил и нифедипин не оказывали достоверного влияния на параметры залповой активности. Так, например, в контроле уровень

фазы «плато» был равен 80,52±0,28% от средней амплитуды ПКПЬ а на фоне действия верапамила его значение составило 82,78±0,23% (п=57), то есть верапамил не привел к изменению этого функционально важного параметра залповой активности в интактных синапсах (рис. 3).

Итак, проведенные эксперименты показали, что присутствие блокаторов Са2+-каналов L-типа в омывающем нервно-мышечный препарат растворе вызывает ярко выраженное облегчение синаптической передачи при ритмической активности в новообразованных моторных синапсах m.EDL. В связи с этим, в следующей серии экспериментов мы решили проверить, как на синаптическую передачу в новообразованных синапсах повлияет воздействие, обратное блокаде L-типа кальциевых каналов - их активация.

«Отпирание» Са2+-каналов L-типа при помощи специфического агониста дигидропиридиновой природы S(-)-BAY К 8644 (искусственно удерживающего Са2+-канал в открытом состоянии) в концентрации 1 мкМ привела к тому, что уровень фазы «плато» достоверно снизился на 11,5% по сравнению с уровнем фазы «плато» в контроле (р<0,05). Так, в контроле значение уровня фазы «плато» составляло 169,81±0,73% от средней амплитуды ПКП1 в залпах, а при введении в опытный раствор BAY К 8644 уровень «плато» снизился до 158,26±0,48% (п=48). Это означает, что под действием активатора кальциевых каналов L-типа происходит подавление уровня выброса АХ при залповой активности новообразованных синапсов.

В зрелых интактных терминалях на фоне действия S(-)-BAY К 8644 значение уровня фазы «плато» было значительно, достоверно (р<0,05) выше, чем в контроле: в контроле уровень «плато» составлял 69,2±0,87% от средней амплитуды ПКПь а при введении в опытный раствор S(-)-BAY К 8644 уровень «плато» поднялся до 90,46±0,95% (п=51).

Таким образом, только в новообразованных моторных синапсах мыши наблюдается облегчение выброса АХ при действии антагонистов Са2+-каналов L-типа (нифедипина и верапамила) и торможение выброса АХ при действии агонистов Са2+-каналов L-типа (S(-)-BAY К 8644). Причем Са2+-зависимое торможение секреции АХ проявляется лишь при вызванной - одиночной и ритмической - активности синапсов и не затрагивает спонтанную секрецию АХ.

Для понимания механизмов Са2+-зависимого торможения секреции АХ в новообразованных синапсах, важно было выяснить, участвует ли в нем лишь вход кальция по L-типу каналов, либо также и другие источники поступления кальция в терминаль, в частности - вход наружного кальция по потенциал-зависимым Са2+-каналам P/Q-типа, а также выброс депонированного кальция из рианодин-чувствительных Са2+-депо терминалей.

1.3. Влияние блокады Са2+-каналов P/Q-типа на одиночную вызванную секрецию медиатора в интактных и новообразованных синапсах.

В интакных нервно-мышечных синапсах мыши основными потенциал-активируемыми Са2'-каналами, обеспечивающими вход триггерного кальция, запускающего секрецию медиатора, являются Са2+-каналы P/Q-типа (Uchitel et al., 1992). Их блокада за короткое время приводит к подавлению секреции медиатора на 90% (Katz et al., 1996). В новообразованных нервно-мышечных синапсах мыши

также описан пул потенциал-зависимых Са2+-каналов Р/С^-типа. Какую роль играют эти каналы в период существования в терминалях Са2+-зависимого торможения секреции АХ - оставалось не ясным. Для решения этого вопроса мы исследовали изменения режима вызванной секреции АХ в новообразованных нервно-мышечных синапсах т.ЕВЪ мыши на фоне действия селективного блокатора Са2+-каналов Р/<3-типа омега-агатоксина в концентрации 70 нМ.

Добавление агатоксина в омывающий нервно-мышечный препарат раствор приводило в новообразованных синапсах к падению амплитуды ПКП в первые же 5 минут инкубации на 67%, от 7,05±1,18 мВ в контроле до 2,53±0,09 мВ (р<0,05). Далее, на протяжении 40 минут амплитуда ПКП недостоверно колебалась в пределах 10% этого значения пока, наконец, к исходу часовой инкубации вызванный ответ на стимуляцию нерва вовсе не исчезал (п=51). При этом агатоксин не оказывал влияния на амплитуду МПКП новообразованных терминалей, что свидетельствует о пресинаптическом действии этого токсина.

Анализ гистограмм распределений амплитуд ПКП показывает, что асимметричная, имеющая «хвост» высокоамплитудных ПКП гистограмма, характерная для полисинаптического пула новообразованных контактов, после инкубации с агатоксином, резко сдвигается в сторону более низких амплитуд, приобретая компактную симметричную форму (рис. 2). Это свидетельствует о том, что агатоксин (в отличие от нифедипина) одинаково негативно повлиял на все популяции синапсов, сосуществующих на мышечном волокне. Следовательно, в новообразованных терминалях мыши вход кальция по каналам Р/<3-типа направлен исключительно на обеспечение запуска Са2+-зависимой секреции АХ и не участвует в процессах Са2+-зависимого подавления выброса медиатора.

2. ВЛИЯНИЕ ДЕПОНИРОВАННОГО КАЛЬЦИЯ НА ВЫЗВАННУЮ СЕКРЕЦИЮ МЕДИАТОРА В НОВООБРАЗОВАННЫХ СИНАПСАХ.

По данным литературы, в нейронах и других типах клеток вход кальция по Ь-типу Са2+-каналов часто сопряжен с выбросом депонированного кальция через рианодиновые рецепторы (РиР) (БикЬагеуа е1 а1., 2002; Уи е1 а1., 2007; ВеггоШ, кока-'лга, 2009). Роль системы депонированного кальция в новообразованных синапсах до сих пор никем не изучалась. Поэтому в следующей серии нашей работы мы изучали изменения одиночных ПКП и залповой активности новообразованных синапсов на фоне действия рианодина в концентрации 5 мкМ, вызывающей блокаду РиР и в концентрации 0,5 мкМ, приводящей к активации и удержанию РиР в открытом состоянии (Ва1егта, ВиМуа, 2005).

2.1. Влияние рианодина на одиночную вызванную секрецию медиатора

Аппликация рианодина в концентрации, блокирующей РиР и выброс депонированного кальция из пресинаптических Са2+-депо (5 мкМ), приводила к значительному увеличению амплитуды и квантового состава ПКП в новообразованных синапсах т.ЕБЬ. Так, квантовый состав ПКП в контроле равнялся 13.12±1,5, а после добавления рианодина (5 мкМ) поднялся до 22,36±3,3 (р<0,05), что составляет 170% от контроля (п=67). Амплитуда МПКП под действием рианодина не изменяется, что указывает на пресинаптический характер облегчающего действия этого реагента на амплитуду ПКП.

При добавлении в омывающий нервно-мышечный препарат раствор рианодина в низкой, активирующей РиР концентрации (0,5 мкМ), наблюдается прямо противоположный эффект. Квантовый состав ПКП снижается от 18,38±2,07 в контроле до 13,51±1,1 - то есть на 26% (р<0,05, п=61). На гистограмме амплитудных распределений ПКП виден симметричный сдвиг огибающей в сторону низких амплитуд под действием рианодина в концентрации 0,5 мкМ. Амплитуда МПКП осталась при этом неизменной, благодаря чему мы можем считать данный тормозный эффект рианодина пресинаптическим, направленным на торможение квантового выброса АХ в новообразованных синапсах.

2.2. Влияние рианодина на залповую вызванную секрецию медиатора.

Введение в раствор Лайли рианодина в концентрации 5 мкМ привело к значительному повышению уровня фазы «плато» ПКП в ритмических залпах ПКП, регистрируемых в новообразованных синапсах т.ЕБЬ. Уровень фазы «плато» в залпе в контроле составил 174,16±1,49% от средней амплитуды ПКП] и был достоверно (р<0,05) ниже значения уровня фазы «плато» на фоне действия рианодина 5 мкМ - 306,8±5,79% (п=58) (рис. 4).

—контроль й Р|1.1нйдмн 5 мкМ ° РМ.1НПД1В) 0,5 икМ

350 д Таким образом, «выключение»

I 300 | 250 1-200 я 150

Лиг***у - „ 2+

. а^Р кальциевых депо, то есть Са -

1 ^ зависимого выброса

депонированного кальция, в

¡».л. - . Р, _ . Л> й ___О. лЛ... о

# юо' новообразованных синапсах на

ранних стадиях мышечной

................штпиттмщцрццц реиннервации привело к развитию

1 5 9 13 17 21 25 29 33^37^ «^э хорошо выраженного облегчения

выброса медиатора в условиях Рис. 4. Изменение амплитуды ПКП в ходе ритмической стимуляции нерва, залповой активности новообразованных Добавление же рианодина в

синапсов на фоне действия рианодина в ,п с

с л« \м тт низкои концентрации (0,5 мкМ)

концентрации 5 и 0,5 мкМ. Данные приведены в г у '

% от первого ПКП в залпе. привело к полному исчезновению

продолжительного облегчения передачи в коротком залпе ПКП, наблюдавшемуся в контроле. На фоне действия 0,5 мкМ рианодина ярко выражено падение уровня «плато» в залпе. Если в контроле значение фазы плато составило 170,98±0,49% от средней амплитуды ПКПЬ то при введении рианодина (0,5 мкМ) уровень фазы «плато» упал до значения 114,42±0,35% (п=63, р<0,05) (рис. 4).

В результате двух подходов - анализа эффектов блокады и активации РиР -нами получены взаимодополняющие и логически не противоречащие друг другу результаты. Они позволяют говорить о том, что в терминалях новообразованных моторных синапсов т.ЕБЬ мыши эффективно работает выброс депонированного кальция через РиР, который направлен на подавление секреции АХ. В связи с этим важно было выяснить, может ли выброс депонированного кальция запускаться при входе в терминаль кальция по Ь-типу каналов. Для ответа на этот вопрос мы проводили регистрацию и анализ одиночной вызванной активности

новообразованных синапсов на фоне сочетанного действия нифедипина (10 мкМ) и рианодина (5 мкМ).

2.3. Изменение параметров вызванной активности новообразованных синапсов на фопе совместного действия нифедипина и рианодина.

Инкубация реиннервированного нервно-мышечного препарата т.ЕБЬ мыши с нифедипином приводила к значительному облегчению секреции медиатора. Квантовый состав ПКП достоверно увеличивался от 12,2±1,5 в контроле до 19,4±2,3 (р<0,05). Последующее добавление рианодина в концентрации, блокирующей РиР (5 мкМ), не вызывало дополнительного прироста амплитуды или квантового состава одиночных ПКП. Квантовый состав на фоне совместного действия нифедипина и рианодина составил 17,7±1,5 (п=69).

Таким образом, наши данные показывают, что в новообразованных нервно-мышечных синапсах мыши Са2т-зависимое торможение секреции медиатора может происходить с участием как минимум, двух типов Са2+-сигналов: поступлении наружного кальция по Са2+-каналам Ь-типа и сопряженном с ним выбросе депонированного кальция через РиР.

Каковы возможные молекулярные мишени этих тормозных кальциевых сигналов, оставалось неясным. Данные литературы свидетельствуют, что Са2+-зависимое торможение секреции медиатора может происходить с участием Са2+-активируемых К+-каналов либо Са2*-зависимых ферментов нервных терминалей. В связи с этим, в следующих сериях работы были исследованы пресинаптические эффекты избирательных блокаторов К+са-каналов и ряда Са2+-зависимых ферментов.

3. ВЛИЯНИЕ БЛОКАТОРОВ КАЛЬЦИЙ-АКТИВИРУЕМЫХ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ НА СЕКРЕЦИЮ МЕДИАТОРА В НОВООБРАЗОВАННЫХ

СИНАПСАХ.

В этой серии экспериментов были изучены эффекты избирательных блокаторов К+са-каналов двух разных типов: апамина (блокатора низкопроводящих К+Са-каналов БК-типа) и паксиллина (блокатора высокопроводящих К+са-каналов ВК-типа) на амплитуду и квантовый состав ПКП новообразованных синапсов т.ЕБЬ мыши.

Мы установили, что апамин (0,5 мкМ) не вызывает достоверных изменений амплитуды и квантового состава одиночных ПКП или картины залповой акпнвности новообразованных синапсов. Так, уровень фазы плато в контроле был равен 121,71 ±0,33% от амплитуды ПКПЬ а на фоне действия апамина -123,75±0,36% (п=45). Эти данные говорят о полном неучастии низкопроводящих (БК) К+Са-каналов в регуляции секреции медиатора в реиннервированных синапсах.

Под действием паксиллина (1 мкМ) квантовый состав ПКП новообразованных синапсов претерпевает небольшое, но достоверное увеличение. В контроле значение квантового состава ПКП равнялось 13,4±2, а на фоне паксиллина - 16,3±1,1 (р<0,05). Однако при последующем добавлении в омывающий раствор нифедипина наблюдался дополнительный прирост квантового состава ПКП до 20,2±2, что достоверно (р<0,05) превышает значения

контроль -о—паксиллин А- плксиллнн+нифедмпин

квантового состава в контроле и на фоне действия паксиллина (п=84). Тот факт, что на фоне действия паксиллина аппликация нифедипина приводит к дополнительному повышению квантового состава ПКП (сопоставимому с облегчающим действием чистого нифедипина) указывает на не связанное между собой функционирование Са2+-каналов Ь-типа и К+са-каналов ВК-типа в новообразованных синапсах.

Подтверждает этот вывод и гистограмма распределений амплитуд ПКП, приведенная на рисунке 5.

Видно, что паксиллин приводит к относительно небольшому

симметричному сдвигу огибающей гистограммы в сторону высоких амплитуд, но нифедипин на этом фоне дает еще более сильный сдвиг в высокоамплитудную область и вызывает появление

дополнительного пика на гистограмме, характерного именно Рис. 5. Гистограмма амплитудных распределений для эффектов блокады Са2+-каналов ПКП новообразованных синапсов на фоне 1^-типа

действия паксиллина и последующего Таким образом> полученные добавления нифедипина. г '

данные свидетельствуют о том, что

Са2+-ток, входящий в терминаль по каналам Ь-типа, вызывает торможение

секреции АХ без участия К+Са-каналов.

ф<*

12 16 20 24 28 32

Амплитуда, ив

4. ВЛИЯНИЕ КАЛЬЦИЙ-ЗАВИСИМЫХ ФЕРМЕНТОВ НА СЕКРЕЦИЮ МЕДИАТОРА В НОВООБРАЗОВАННЫХ СИНАПСАХ МЫШИ.

В качестве дальнейшего шага в поисках механизма Са2+-зависимого торможения в новообразованных синапсах мыши мы предположили, что кальций, входящий в терминаль по каналам L-типа, может избирательно активировать Са2+-зависимые ферменты, которые далее и осуществляют торможение секреции АХ. Действительно, в нервных терминалях центральных и периферических синапсов описаны многочисленные белки и ферменты, активность которых избирательно регулируется ионами кальция. К их числу принадлежат, в частности, кальмодулин, кальмодулинкиназы, протеинкиназы С (РКС) (Colbran, Brown, 2004; Yamauchi, 2005; Dunlap, 2007; Liu et al., 2007; Santafe et al, 2007; Shakiryanova et al., 2007; Wong et aL, 2009). Их возможное участие в Са2+-зависимом торможении секреции АХ мы исследовали в следующих сериях нашей работы.

4.1. Влияние блокады кальмодулина и СаМКН на параметры одиночной вызванной секреции в новообразованных синапсах.

Блокада кальмодулина при помощи его специфического антагониста Я24571 (кальмидазола) в концентрации 2 мкМ никак не повлияла на амплитуду и квантовый состав одиночных ПКП в течение 90 минут инкубации с этим реагентом. Так, квантовый состав ПКП составил 11,74±0,63 в контроле и

11,22±1,07 на фоне действия кальмидазола (р>0,05, п=53). Это свидетельствует о том, что если кальций, входящий в терминаль по каналам L-типа, и воздействует на кальмодулин аксоплазмы, то это никак не отражается на вызванных одиночных актах секреции АХ. По-видимому, активность кальмодулина не принимает участия в Са2+-зависимом торможении секреции медиатора.

На протяжении 90 минут инкубации с блокатором CaMKII KN-62 (3 мкМ) квантовый состав ПКП также не изменился: его значение составило 11,03±0,84 в контроле и 10,65±0,9 на фоне действия KN-62 (р>0,05, п=41) .Полученные данные означают, что CaMKII тоже, по видимому, не является той мишенью, на активацию которой направлен Са2+-сигнал, формирующийся в терминали при входе кальция по L-типу Са2+-каналов в новообразованных моторных сианпсах мыши.

Однако по данным литературы, активность данного фермента может двунаправлено регулироваться и неоднозначно зависеть от действия различных Са2+-сигналов (Liu et al., 2007; Wang, 2008). В связи с этим, в следующей серии экспериментов мы проводили блокаду CaMKII на фоне вызванного нифедипином облегчения секреции медиатора.

4.2. Влияние блокады CaMKII на активность новообразованных синапсов на фоне действия нифедипина.

Нифедипин вызывал увеличение квантового состава ПКП на 74,4±6,37% и увеличение амплитуды ПКП на 58,4+7,32% (р<0,05). При этом амплитуда МПКП достоверно не изменялась.

На фоне вызванного нифедипином пресинаптического облегчения передачи, блокатор CaMKII KN-62 вызывал достоверное снижение квантового состава ПКП до исходных контрольных значений. Аналогично снижалась и амплитуда ПКП (р<0,05). То есть KN-62 полностью подавлял вызванный нифедипином прирост амплитуды и квантового состава ПКП (п=68).

Таким образом, нами впервые было показано, что облегчающее действие CaMKII на секрецию медиатора в новообразованных моторных терминалях полностью купируется кальциевым сигналом, возникающим в терминалях при входе кальция по L-типу Са2+-каналов. Однако при блокаде этого сигнала специфическим блокатором нифедипином может проявляться способность CaMKII облегчать секрецию медиатора и вызывать прирост амплитуды и квантового состава ПКП.

Возможность неактивного (или подавленного) состояния CaMKII на фоне действия в терминалях Са2+-сигналов определенной модальности и генеза недавно показана в центральных синапсах. В новообразованных синапсах гиппокампа, в частности, это объясняется функционированием CaMKII в едином надмолеклуярном комплексе с Са2+-зависимыми фосфатазами, чья активность может доминировать и маскировать активность CaMKII (Menegon et al., 2002).

Наряду с анализом возможной роли CaMKII, представлялось интересным исследовать возможное участие и другого Са2+-зависимого фермента, протеинкиназы С которая могла бы активироваться входящим в терминаль

кальциевым L-током и принимать участие в торможении секреции АХ (Maasch et al., 2000).

Роль РКС и механизмы ее действия в новообразованных синапсах мало изучены. Поэтому мы решили проверить возможность ее вклада в исследуемый тормозный эффект.

4.3. Влияние блокады РКС на активность новообразованных синапсов.

Мы установили что два разных по химической структуре блокатора РКС -хелеритрин (4 мкМ) и бисиндолилмалеимид I (BIM) (1 мкМ) - вызывают достоверный (р<0,05) прирост квантового состава ПКП на 58% (от 11,9±1,2 в контроле до 18,6±2,2; п=48) и 66% (от 12,3±2,1 в контроле до 20,4±2,4; п=45) соответственно, что сопоставимо с облегчающим действием нифедипина. Более того, на фоне блокады РКС происходят характерные изменения формы гистограммы амплитудного распределения ПКП - дисперсия сигналов и появление полимодальности, аналогичные наблюдаемым при действии

Полученные данные позволяют предположить, что, возможно, не только CaMKII, но и РКС также является мишенью для кальция, входящего по каналам L-типа в незрелые моторные нервные терминали реиннервирумых

мышечных волокон m.EDL.

В настоящее время в научной литературе мало данных о Рис. 6. Гистограмма амплитудных распределений возможности избирательной

одиночных ПКП новообразованных синапсов прицельной активации РКС под действием хелеритряна. кальцием, входящим в терминаль по

каналам L-типа. Такая возможность показана, например, для хромафинных клеток (Park, Kim, 2009). Мы исследовали возможность такой активации РКС в новообразованных синапсах мыши. Для этого в следующей серии анализировали действие хелеритрина на параметры ПКП на фоне блокады Са2+-каналов L-типа нифедипином.

4.4. Действие хелеритрина на активность новообразованных синапсов на фоне блокады Са1+-каналов L-типа.

Если РКС действительно может активироваться входом кальция через Са2+-каналы L-типа, то на фоне блокады этих каналов не должно происходить дополнительного прироста квантового состава ПКП при последующей инактивации РКС.

нифедипина (рис. 6).

0 2 4 6 S 10121416182022242628303234

Амп ЛИ1УДЛ. мВ

Действительно, в контроле квантовый состав равнялся 11,4±0,95, на фоне действия нифедипина достоверно возрастал до 17,47±1,3 (р<0,05), но при последующем добавлении

хелеритрина достоверно не изменился и составил 16,14±1,01 (п=72). Не происходило также и дополнительных изменений формы гистограммы амплитудных

распределений (рис. 7).

Полученные данные

позволяют предполагать, что в J новообразованных синапсах РКС чувствительна к кальцию, поступающему по Са^-каналам L-типа, и ее активность в этом случае направлена и сопряжена с j Са2+-зависимым торможением секреции медиатора.

5. ВЛИЯНИЕ БЛОКАДЫ ПОТЕНЦИАЛ-АКТИВИРУЕМЫХ К*-КАНАЛОВ НА АКТИВНОСТЬ НОВООБРАЗОВАННЫХ СИНАПСОВ. В настоящее время известно, что моторные нервные терминали периферических синапсов позвоночных обладают разнообразным пулом К+-1 каналов, в том числе - потенциал-активируемыми К+-каналами (обозначаемыми как K^v-каналы), избирательно блокируемыми тетраэтиламмонием, дендротоксином и 4-аминопиридином (Зефиров, Ситдикова, 2002) и обеспечивающими вторую фазу пресинаптического потенциала действия. От активности этих каналов и длительности второй фазы пресинаптического потенциала действия будет зависеть поступление в терминаль триггерного кальциевого тока (по P/Q-каналам), запускающего выброс медиатора.

В связи с этим, мы решили проверить, не могут ли в качестве субстрата для РКС выступать К%-каналы терминали, Для этого мы исследовали эффекты двух разных по химической природе и механизмам действия блокаторов К%-каналов -4-аминопиридина и бутандионмоноксима (BDM), и их взаимодействие с эффектами блокады РКС.

5.1. Влияние 4-аминопиридина и BDM на одиночную вызванную активность новообразованных синапсов.

I Добавление в экспериментальный раствор BDM в концентрации 20 мМ

приводило к значительному достоверному возрастанию амплитуды ПКП реиннервированных синапсов: в контроле средняя амплитуда ПКП равнялась 6,7±0,26 мВ, а после добавления BDM - 12,2±1,3 мВ (р<0,05). Квантовый состав ПКП также увеличивался от 11,3±1 в контроле до 25,4±2,8 (р<0,05, п=39) (рис. 8).

При аппликации 4-аминопиридина амплитуда ПКП возрастала от 9,8±0,85 мВ в контроле до 14,8±1,18 мВ. (р<0,05). Квантовый состав увеличился от

контрольного значения 18,8±1,98 до 29,5±2,13 на фоне действия 4-аминопиридина

______ ___________________

Рис. 7. Изменение квантового состава одиночных ПКП новообразованных синапсов под действием хелеритрина, BIM, нифедипина и совместным действием нифедипина и хелеритрина. Данные приведены в процентах от контроля.

Количество ПКП

Рис. 8. Гистограмма амплитудных распределений одиночных ПКП новообразованных синапсов под действием ВОМ и 4-АР.

(р<0,05, п=54), т.е. на 57%, что сравнимо с облегчающими эффектами при блокаде Са2+-каналов Ь-типа или РКС (рис. 8).

Оба блокатора также вызывали не только сдвиг гистограмм амплитудных распределений ПКП в область высокоамплитудных

значений, но и их дисперсию, расширение и распад на несколько пиков, подобно действию нифедипина.

5.2, Влияние 4-аминопиридина на активность новообразованных синапсов в

условиях блокады РКС.

В последней серии экспериментов мы проверяли возможность регуляции К%-каналов РКС в реиннервированных синапсах мыши. Для этого исследовали изменения амплитуды и квантового состава ПКП, вызываемые 4-аминопиридином, на фоне предварительной блокады РКС хелеритрином.

Хелеритрин вызывал прирост амплитуды и квантового состава ПКП новообразованных синапсов. Так, в контроле квантовый состав равнялся 14,3±1,6, а после инкубации с хелеритрином - 20,5±1,7 (р<0,05). На этом фоне 4-аминопиридин терял свою способность к дальнейшему облегчению секреции медиатора и квантовый состав равнялся 20,7±2 (р>0,05, п=73) (рис. 9). Амплитуда же и частота спонтанной секреции оставались неизменными под действием обоих веществ.

ш контроль □ Хелеритрин

ахелерлтрит+лмниопнрццпн

контроль

"^'«хелернтрин

хелеритрин+4-аминопнртщин

20 24 28 32 Амплитуд« ПКП, МВ

Рис. 9. Изменение квантового состава и амплитуды одиночных ПКП новообразованных синапсов под действием хелеритрина и 4-аминопиридина на фоне хелеритрина. а) Квантовый состав ПКП, б) Гистограммы амплитудных распределений ПКП.

50 0

Блокада К%-каналов на фоне предварительной блокады РКС не приводит к дополнительным сдвигам или изменению формы гистограммы амплитудных распределений ПКП (рис. 9).

При проведении противоположной процедуры, когда на фоне предварительного блока К+у-каналов 4-аминопиридином мы провели воздействие

на нервно-мышечный препарат хелеритрином, оказалось, что хелеритрин также теряет способность вызывать дополнительный прирост амплитуды или квантового состава ГЖП. В этом случае квантовый состав от контрольного уровня в 17,3±2,06 поднялся до 28,9±2,2 на фоне действия 4-аминопиридина (р<0,05) и остался равным 28,9±2,4 при дальнейшей аппликации хелеритрина (р>0,05, п=62).

Эти данные свидетельствуют в пользу наличия функционального сопряжения между Са2+-зависимой активностью РКС и усилением активности К+-' каналов терминали. В научной литературе на данный момент отсутствуют данные о подобных взаимодействиях кГ^каналов и РКС в зрелых или новообразованных нервно-мышечных синапсах. Однако прямое фосфорилирование субъединиц К%-каналов РКС, приводящее к их усиленной активации или подавлению, показано для нейронов слуховой зоны ствола мозга (Desai et al., 2008), зрелых нейронов мозга (Wang et al., 2004) и для кардиомиоцитов (Schräder et al., 2009).

Совокупность полученных фактов позволяет говорить о том, что нами впервые обнаружен еще один возможный механизм Ca2-зависимого торможения секреции АХ в новообразованных синапсах - за счет избирательной Са21-зависимой активации пресинаптической РКС, действие которой в новообразованных терминалах направлено на усиление активности К+-тока по потенциал-активируемым К%-каналам терминали. Таким образом, мы показали, что механизм действия тормозного Са2*-сигнала, создаваемого входом медленного Са2+-тока по L-типу Са2+-каналов (в совокупности с выбросом депонированного кальция), реализуется через специфический внутриклеточный каскад реакций с участием РКС и замыкается на усилении активности пресинаптического К\-тока, приводя к снижению секреции медиатора и подавлению работы функционирующих новообразуемых синапсов (рис. 10).

Рис. 10. Схема механизмов Са2+-зависимого торможения секреции медиатора в новообразованных нервно-мышечных синапсах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что в нервно-мышечных синапсах мыши в период их новообразования на скелетных мышечных волокнах, наряду с Са2+-активируемым выбросом АХ имеется также Са2+-зависимое торможение секреции АХ, осуществляемое кальцием, входящим в терминали по «медленным» потенциал-активируемым Са2+-каналам L-типа. Выключение этих каналов избирательными блокаторами приводит к облегчению выброса АХ, а потенцирование их активности - напротив, к подавлению секреции АХ.

Мы установили, что Са2+-зависимое торможение передачи не затрагивает спонтанную секрецию АХ и направлено на подавление вызванного выброса медиатора, в особенности - при ритмической активности синапсов. Нами также показано, что в исследуемых нервных терминалях функциональное назначение разных пресинаптических Са2+-входов не одинаково. Так, Са2+-ток, входящий в терминали по P/Q-типу Са2+-каналов не участвует в торможении секреции АХ и предназначен для запуска вызванного выброса медиатора. Тормозный же Са2+-сигнал, как оказалось, формируется не только входящим Са2+-током L-типа, но и сопряженным с ним выбросом депонированного кальция через РиР.

Известные сегодня случаи Са2+-зависимого торможения секреции медиатора обычно предполагают активацию Са2+-зависимых К+-каналов терминали (Yazejian et al., 2000; Pattillo et al., 2001), кальмодулин-зависимое торможение Са2+-каналов (Dunlap, 2007), либо -модуляцию Са2+-зависимых ферментов (Liu et al., 2007; Santafe et al., 2007; Shakiryanova et al., 2007; Wong et al., 2009; Lee et al., 2009).

Мы установили, что в новообразованных моторных терминалях Са2+-зависимое торможение передачи осуществляется без участия К+Са-каналов и сохраняется в случае их избирательной блокады.

Нами впервые выявлен вклад Са2+-активируемых ферментов - СаМКП и РКС в механизм Са2+-зависимого торможения секреции АХ. Анализ сочетанного действия блокаторов Са2+-каналов и Са2+-зависимых ферментов на секрецию АХ показал , что в условиях входа в терминали кальция по каналам L-типа наблюдается подавление способности пресинаптической СаМКП облегчать выброс медиатора. В то же время мы впервые показали, что входящий L-tok способен прицельно активировать РКС, обеспечивающую усиление работы KV каналов, и это приводит к подавлению секреции АХ.

Наличие в терминалях реципрокно действующих Са2+ -сигналов (запускающих и тормозящих секрецию АХ) предполагает их пространственное и структурно-функциональное разобщение. Действительно, недавно показано, что в моторных нервных терминалях мышей Са2+-каналы L-типа локализованы вне активных зон, а входящий по ним Са2+-ток может лишь опосредованно влиять на секрецию АХ (Urbano et al., 2001; Гайдуков и др., 2009). Известно и о компартментализации Са2+-зависимых ферментов в нервных терминалях, их прицельной активации строго определенными Са2+-сигналами. Например, показана избирательная активация пресинаптической СаМКП депонированным кальцием в моторных терминалях дрозофилы (Shakiryanova et al., 2007), активация РКС входом кальция по L-типу Са2+-каналов в хромаффинных клетках (Park, Kim, 2009). Аналогичным

образом, по-видимому, реализуются и обнаруженные нами механизмы Са2+-зависимого торможения секреции АХ в нервно-мышечных синапсах мыши.

В целом, способность определенных Са2+ -сигналов подавлять выброс медиатора можно рассматривать как проявление ауторегуляции синапсов по принципу отрицательной обратной связи с участием разных механизмов и пресинаптических Са2+ -входов (Yazejian et al., 2000; Pattillo et al., 2001; Dunlap, 2007; Балезина и др., 2007; Федорин, Балезина, 2008). В исследованной нами модели - в новообразованных моторных синапсах мыши - такое торможение, согласно нашим и литературным данным (Santafe et al., 2002), может выполнять специфическую роль. Оно может быть направлено на подавление активности и элиминацию избыточного числа синаптических контактов для перехода от поли- к моносинаптической иннервации мышечных волокон.

ВЫВОДЫ

1. Блокада пресинаптических Са2+-каналов L-типа нифедипином (10 мкМ) и верапамилом (5 мкМ) приводила к возрастанию, а их активация агонистом

' BAY К 8644 (1 мкМ) - к снижению квантового состава одиночных и ' ритмически генерируемых ПКП, демонстрируя способность входящего в нервные терминали Са2+-тока L-типа вызывать торможение секреции АХ в новообразованных моторных синапсах мыши.

2. Частота МПКП не менялась под действием нифедипина в покое и на фоне К+-деполяризации терминали, демонстрируя устойчивость спонтанной секреции АХ к тормозному действию Са +-тока, входящего в терминали по каналам L-типа.

3. Стимулирование выброса депонированного кальция рианодином (0,5мкМ) приводило к снижению квантового состава одиночных и ритмически генерируемых ПКП, а блокада РиР рианодином (5мкМ) напротив, облегчала секрецию медиатора. На фоне нифедипина рианодин (5 мкМ) терял способность вызывать дополнительный прирост уровня секреции АХ, демонстрируя, что в торможении секреции АХ, вызванной входом кальция по L-типу каналов участвует и выброс депонированного кальция.

4. Отсутствие пресинаптических эффектов блокатора SK-типа К+Са-каналов апамина (1мкМ) и способность нифедипина повышать квантовый состав ПКП, несмотря на его предварительное увеличение, вызываемое блокатором ВК-каналов паксиллином (1 мкМ), свидетельствуют о неучастии К+са каналов в реализации тормозного действия Са2+-тока L-типа на секрецию АХ.

5. Блокатор кальмодулина R24571 (2 мкМ) и кальмодулинкиназы II KN-62 (3 мкМ) не оказывали влияния на квантовый состав ПКП, однако на фоне его предварительного увеличения, вызванного нифедипином, блокатор кальмодулинкиназы И приводил к подавлению квантового состава ПКП до контрольного уровня.

6. Блокаторы РКС хелеритрин (4 мкМ) и BIM (1 мкМ) вызывали прирост квантового состава ПКП, сопоставимый с действием нифедипина. На фоне действия нифедипина хелеритрин терял способность к дальнейшему облегчению секреции АХ.

7. Блокаторы К+уканалов 4-аминопиридин (6 мкМ) и BDM (20 мМ) увеличивали вызванный выброс АХ. Предварительная инкубация мышц с хелеритрином предотвращала дополнительное облегчение секреции АХ 4-аминопиридином. На фоне действия 4-аминопиридина хелеритрин также не оказывал дальнейшего потенцирующего действия на нервно-мышечную передачу.

8. Таким образом, можно предполагать, что в новообразованных нервных терминалях Са2+-зависимое торможение секреции АХ происходит с участием Са2+-тока L-типа и выброса депонированного кальция, которые тормозят облегчающее действие кальмодулинкиназы II на секрецию АХ и стимулируют тормозное действие РКС, осуществляемое путем поддержки активности пресинаптических К%-каналов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Богачева П.О. Роль кальция в работе новообразуемых нервно-мышечных синапсов мыши. // Материалы докладов XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», г. Москва, 2007. Богачева П.О., Балезина О.П. Модулирующее действие кальция на активность новообразуемых нервно-мышечных синапсов мыши. // Тезисы докл. XX Съезда физиологического общества им. И.П. Павлова, г. Москва, 2007, С. 152-153.

3. Балезина О.П., Богачева П.О., Орлова Т. Ю. Влияние блокаторов кальциевых каналов L-типа на активность новообразуемых синапсов мыши. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2007. Т. 143 (2). С. 128-32.

4. Богачева П.О., Балезина О.П. Влияние блокаторов Са2+-каналов L-типа и рианодиновых рецепторов на активность новообразуемых синапсов мыши // Статья в сборнике научных трудов по материалам I Всероссийского, с международным участием, конгресса студентов и аспирантов биологов «Симбиоз Россия 2008» - «Биология: традиции и инновации в 21 веке», г. Казань, 2008. С.

5. Богачева П.О. Подавление секреции медиатора с участием Са2+-каналов L-типа и рианодиновых рецепторов в новообразованных синапсах мыши. II Тезисы докл.

I Всероссийской (XVI) молодежной научной конференции "Молодежь и наука на севере", г. Сыктывкар, 2008г. Т. 2. С. 201.

6. Bogacheva P.O., Balezina О.Р. Acetylcholine release's suppression through the activity of L-type calcium channels and ryanodine receptors in newly formed motor synapses in mice. II Abstr. 6th Federation of European Neurosciences Societies (FENS) Forum, Geneva; Switzerland, 2008. V. 4. P. 143.3.

7. Bogatcheva P.O., Balezina O.P. Acetylcholine release's suppression through the activity of L-type calcium channels and ryanodine receptors in newly formed motor synapses in mice. // Abstr. Neuroscience 2008 - 38th annual meeting of the Society for Neuroscience. Washington, DC, USA, 2008. V. 4. P. 722.2/B46.

8. Богачева П.О., Балезина О.П. Модуляция работы новообразованных нервно-мышечных синапсов мыши при помощи пресинаптических рианодиновых рецепторов и кальциевых каналов L-типа. // Тезисы докл. конференции с международным участием, поев. 90-летию со дня рожд. Т.М. Турпаева «Механизмы нервных и нейроэндокринных регуляций», г. Москва, 2008, С. 36-37.

9. Богачева П.О., Ежова Е.В., Балезина О.П. Подавление секреции медиатора в новообразованных синапсах мыши с участием Са2+-зависимых киназ. // Статья в сборнике научных трудов по материалам международной конф. «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», г. Пущино, 2009, Т. 1, С. 167-171.

10. Bogatcheva P.O., Balezina О.Р. Downregulation of ACh secretion in reinnervated mouse neuromuscular junctions involving PKC activity and Voltage-dependent K+-channels. // Abstr. Annual meeting of the Physiological Society "Physiology 2009", Dublin, Ireland, 2009.

11. Балезина О.П, Богачева П.О. Подавление секреции медиатора с участием Са2+-каналов L-типа и рианодиновых рецепторов в новообразованных синапсах мыши.

II Известия РАН. Серия биологическая. 2009. №. 5. С. 591-597.

16-18.

Список использованных сокращений

АХ - ацетилхолин

МПКП - миниатюрный потенциал концевой пластинки;

ГОШ - потенциал концевой пластинки;

РиР - рианодиновые рецепторы;

РШМ - бутандион моноксим;

СаМКИ - кальмодулинкиназа II типа;

РКС - протеинкиназа С.

Заказ № 524. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Пстроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Богачева, Полина Олеговна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. ДЕНЕРВАЦИОННО-РЕИННЕРВАЦИОННЫЙ СИНДРОМ В СКЕЛЕТНОЙ

МУСКУЛАТУРЕ.

1.1 Общая характеристика денервационно-реинервационного синдрома.

1.2. Нейроцентрическая и миоцентрическая гипотезы формирования и созревания нервно-мышечных контактов.

1.3. Свойства новообразованных синаптических контактов.

2. ЭЛИМИНАЦИЯ НОВООБРАЗОВАННЫХ СИНАПСОВ И ЕЕ МЕХАНИЗМЫ.

3. ОСОБЕННОСТИ КАЛЬЦИЕВОГО ГОМЕОСТАЗА НОВООБРАЗОВАННЫХ ТЕРМИНАЛЕЙ.

3.1 Кальциевый гомеостаз в конусе роста моторного аксона.

3.2 Кальциевые каналы интактных и новообразованных моторных нервных терминалей.24 3.3. Са2+-зависимые белки и ферменты в составе центральных и периферических синаптических терминалей.

3.3.1 Са2+-зависимые ионные каналы.

3.3.2.Са

-зависимые ферменты нервных терминалей.

4. ФЕНОМЕН КАЛЬЦИЙ-ЗАВИСИМОГО ПОДАВЛЕНИЯ СЕКРЕЦИИ В > НОВООБРАЗОВАННЫХ СИНАПСАХ.

4.1. История открытия феномена.

4.2. Существующие гипотезы о механизме Са2+-зависимого торможения.

ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Пережатие нерва.

2. Приготовление изолированного нервно-мышечного препарата.

3. Внутриклеточная регистрация спонтанных и вызванных потенциалов и токов концевой пластинки.

4. Используемые в работе вещества.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ СЕКРЕТОРНОЙ АКТИВНОСТИ

ИНТАКТНЫХ И НОВООБРАЗОВАННЫХ СИНАПСОВ т.ЕБЬ МЫШИ.

1.1 Параметры спонтанной секреции медиатора.

1.1.1 Параметры МПКП в интактных нервно-мышечных синапсах.

1.1.2. Параметры МПКП на 9 сутки после пережатия нерва.

1.1.3. Параметры МПКП на 11 сутки после пережатия нерва.

1.1.4. Параметры МПКП на 12 сутки после пережатия нерва.

1.1.5. Параметры МТКП в интактных синапсах.

1.1.6. Параметры МТКП на 9 сутки после пережатия нерва.

1.1.7. Параметры МТКП на 11 сутки после пережатия нерва.

1.2. Параметры одиночной вызванной секреции медиатора.

1.2.1. Параметры ПКП в интактных синапсах.

1.2.2. Параметры ПКП на 11 сутки после пережатия нерва.

1.2.3. Параметры ТКП в интактных концевых пластинках.

1.2.4. Параметры ТКП на 11 сутки после пережатия нерва.

1.2.5. Параметры ПКП и ТКП на 16 сутки после пережатия нерва у крыс.

1.3. Параметры ритмической вызванной активности синапсов.

1.3.1. Залповая активность интактных синапсов.

1.3.2. Залповая активность синапсов на 11 сутки после пережатия нерва.

2. ВЛИЯНИЕ БЛОКАДЫ СА2+-КАНАЛОВ Ь- И Р/д-ТИПА НА НЕРВНО-МЫШЕЧНУЮ

ПЕРЕДАЧУ В ИНТАКТНЫХ И РЕИННЕРВИРОВАННЫХ СИНАПСАХ.

2.1 Влияние модуляции активности Са2+-каналов Ь-типа на одиночную вызванную секрецию медиатора в новообразованных синапсах т.ЕБЬ.

2.2. Влияние модуляции активности Са2+-каналов Ь-типа на вызванную ритмическую активность в новообразованных синапсах мыши.

2.2.1. Пресинаптические эффекты нифедипина при ритмической активности синапсов. .78 2.2.21 Пресинаптические эффекты верапамила при ритмической активности синапсов.

2.2.3. Пресинаптические эффекты верапамила в интактных синапсах.

2.2.4. Пресинаптические эффекты ВАУ К 8644.

2.3. Динамика пресинаптических эффектов нифедипина на разных сроках реиннервации

2.3.1. Изменения параметров ПКП на разных сроках реиннервации.

2.3.2.Изменение эффектов нифедипина на разных сроках реиннервации.

2.4. Влияние нифедипина на спонтанную секрецию в реиннервированных синапсах.

2.4.1.Амплитуда и частота МПКП новообразованных синапсов на фоне действия нифедипина.

2.4.2. Частота МПКП новообразованных синапсов на фоне деполяризации терминали.

2.5. Влияние блокады Са -каналов Р/С)-типа на одиночную секрецию медиатора в интактных и новообразованных синапсах.

3. ВЛИЯНИЕ ДЕПОНИРОВАННОГО КАЛЬЦИЯ НА ВЫЗВАННУЮ СЕКРЕЦИЮ МЕДИАТОРА В НОВООБРАЗОВАННЫХ СИНАПСАХ.

3.1. Влияние рианодина в концентрации 0,5 и 5 мкМ на одиночную вызванную секрецию медиатора.

3.2. Влияние рианодина в концентрации 0,5 и 5 мкМ на залповую секрецию медиатора

3.3. Изменение параметров вызванной активности новообразованных синапсов на фоне совместного действия нифедипина и рианодина.

4. ВЛИЯНИЕ БЛОКАТОРОВ КАЛЬЦИЙ-АКТИВИРУЕМЫХ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ НА СЕКРЕЦИЮ МЕДИАТОРА В НОВООБРАЗОВАННЫХ СИНАПСАХ.

4.1. Влияние апамина на одиночную вызванную активность новообразованных синапсов

4.2. Влияние паксиллина на одиночную вызванную активность новообразованных синапсов.

5. Влияние кальций-зависимых ферментов на секрецию медиатора в новообразованных синапсах мыши.

5.1. Влияние блокады кальмодулина на параметры одиночной вызванной секреции в новообразованных синапсах.

5.2. Влияние блокады CaMKII на параметры одиночной вызванной секреции в новообразованных синапсах.

5:3. Влияние блокады CaMKII на активность новообразованных синапсов на фоне действия нифедипина.

5.4. Влияние блокады РКС на активность новообразованных синапсов.

5.5. Действие хелеритрина на активность новообразованных синапсов на фоне блокады Са -каналов L-типа.

5.6. Действие хелеритрина на активность новообразованных синапсов на фоне блокады РиР.

6. Влияние блокады потенциал-активируемых К+-каналов на активность новообразованных синапсов.

6.1. Влияние бутандионмоноксима на одиночную вызванную активность новообразованных синапсов.

6.2. Влияние 4-аминопиридина на одиночную вызванную активность новообразованных синапсов.

6.3. Влияние 4-аминопиридина на активность новообразованных синапсов в условиях блокады РКС.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы Ca2+-зависимого подавления секреции медиатора в новообразованных нервно-мышечных синапсах мыши"

Актуальность работы. Механизмы образования и перестройки синатггических контактов - актуальный вопрос современной синаптологии, ключ к пониманию пластичности нейронов. Классической моделью синаптогенеза являются процессы формирования- и удаления нервно-мышечных синапсов, происходящие на скелетных мышечных волокнах млекопитающих в период реиннервации мышцы прорастающим к ней двигательным нервом после его повреждения-(Bennett et al., 1973; Argentieri et al., 1992; Burden, 2002; Lomo, 2003). Известно что подрастающие моторные аксоны образуют на волокне избыточное число контактов,,из которых большинство вскоре «замолкают», то есть перестают секретировать медиатор, а вслед за этим отторгаются, элиминируются. В результате, на волокне сохраняется один синапс, а гаш/синаптическая иннервация сменяется на одиночную, люносинаптическую. Механизмы и процессы, приводящие к подавлению избыточных синапсов и их последующей элиминации-остаются не ясными, несмотря на актуальность и длительную историю1 изучения вопроса'экспериментальной и клинической неврологией (Hoh et al., 1975; O'Brien et al., 1978; O'Brien et al., 1984; Barber, Lichtmen, 1999; Constanzo et al., 1999; Lanuza et al., 2002; Santafe et al., 2002; Nelson-et al., 2003; Buffelli et al., 2004; Li et al., 2004).

В последние годы установлено, что в новообразованных моторных

Л 1 терминалях наряду с потенциал-зависимыми Са каналами P/Q- и N-типа, запускающими секрецию медиатора, имеются потенциал-зависимые Са2+-каналы L-типа, принимающие особое участие в регуляции секреции медиатора (Atchison, 1989; Gray et al., 1992; Fu, Huang, 1994; Rosato-Siri, Uchitel 1999). Показано, что

-у I именно вход кальция в терминали по L-типу Ga -каналов- (при генерации пресинаптического потенциала действия) приводит к подавлению секреции медиатора в новообразованных синапсах, их «замолканию» и, как следствие -последующей элиминации избыточных синапсов. Соответственно, блокаторы Са2+-каналов* L-типа (D-600, нифедипин и др.), напротив, способствуют растормаживанию подавленных синапсов и усилению синаптической передачи в период новообразования моторных синапсов (Rosato-Siri, Uchitel, 1999; Santafe et al., 2001; Piriz et al., 2003). Явление Са2+-зависимого торможения секреции АХ выявлено как в период реиннервации зрелых скелетных мышц, так и на ранних стадиях онтогенеза и образовании иннервации скелетных мышечных волокон. Высказываются предположения, что оно имеет отношению к подавлению активности избыточных синапсов и ускорению созревания одиночной иннервации (ЗагйаГе е1 а1., 2002). Механизмы Са2+-зависимого торможения секреции АХ в моторных синапсах в период их новообразования остаются не изученными и имеют большое значение для экспериментальной и клинической неврологии.

Цели и задачи работы. Целью работы было изучить, внутриклеточные механизмы, с помощью которых ионы кальция, поступающие в новообразованные нервные терминали по Ь-типу Са2+-каналов приводят к подавлению секреции медиатора и передачи сигналов в новообразованных моторных синапсах реиннервируемых скелетных мышц мыши. В работе были поставлены следующие конкретные задачи:

1) исследовать явление Са -зависимого торможения- секреции АХ с помощью

О 1 агонистов и антагонистов Са -каналов Ь-типа, его особенности! на разных сроках созревания синапсов, при ритмической залповой и спонтанной активности новообразованных контактов.

2) выявить вклад депонированного кальция; выбрасываемого через РиР

94терминалей, в Са -зависимое торможение секреции АХ в новообразованных синапсах.

3) исследовать участие Са -зависимых К -каналов большой и малой проводимости

94*

ВК- и, БК-типа) в реализации Са -зависимого торможения* секреции АХ в новообразованных моторных терминалях

9-14) выявить участие ряда Са -зависимых белков1 и ферментов - кальмодулина;

СаМКП'и РКС в Са -зависимом торможении секреции АХ

5) исследовать возможный вклад потенциал-активируемых К+у-каналов в Са2+-зависимое торможение, осуществляемое с участием РКС.

Основные положения работы, выдвигаемые на защиту

Л I

1 .В' новообразованных синапсах мыши Са -зависимое торможение секреции АХ

П Г осуществляется с участием сочетанной активности Са -каналов Ь-типа и выброса депонированного кальция через РиР в составе моторных нервных терминалей.

2. Механизм Са -зависимого торможения секреции АХ предусматривает подавление потенцирующего действия СаМКИ на выброс медиатора и синаптическую передачу в новообразованных синапсах мыши.

3. Вход кальция, по Ь-типу Са2+-каналов приводит к активации Са2+-зависимой РКС, мишенью которой являются потенциалактивируемые каналы. Усиление активности К+у-каналов, опосредуемое РКС, является одним из механизмов Са2+-зависимого торможения секреции в новообразованных синапсах мыши.

Научная новизна полученных результатов.

В работе получен ряд новых ранее не известных фактов. Впервые показано, что Са2+-зависимое торможение секреции АХ наблюдается не только при» одиночной, но и при залповой вызванной активности синапсов, но не затрагивает спонтанную секрецию*медиатора. Впервые раскрыта роль кальция; входящего по-Ь-типу Са -каналов; в, активации РиР и выбросе депонированного кальция, который также участвует в механизме Са2+-зависимого торможения- секреции медиатора. Выявлен ранее не известный- факт, что подавление активности, пресинаптической: СаМКП может принимать, участие в. Са2+-зависимом торможении синаптической передачи, в новообразованных- синапсах. Наконец, впервые показано,- что механизм Са2+-зависимого торможения АХ включает Са2+-зависимую' активациюг РКС, направленную на усиление активности потенциал-зависимых К+у-каналов терминалей в новообразованных моторных синапсах мыши.

Теоретическое и практическое значение работы

К числу обнаруженных фактов, имеющих общее теоретическое значение, можно отнести выявленный внутриклеточный каскад реакций, приводящий кСа2+-зависимому торможению секреции медиатора в пуле новообразованных моторных синапсов. Показано, что входящий в терминали потенциал-активируемый Са -ток Е-типа в комплексе с индуцированным им выбросом депонированного кальция, вызывают формирование Са2+-сигналов, реципрокно влияющих на активность Са2+-зависимых ферментов терминали. Происходит: а) подавление облегчающего действия кальмодулинкиназы , II на секрецию АХ; б) активация РКС, направленная на усиление работу потенциал-зависимых К+у-каналов терминали и угнетение секреции АХ в исследуемых синапсах. Таким образом, показана способность двух пресинаптических Са2+-активируемых ферментов по разному регулировать секрецию АХ, в зависимости от характера повышения уровня^ кальция в нервных терминалях. Эти данные приближают нас к пониманию Са2+-зависимых механизмов регуляции синаптической пластичности в химических синапсах.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Данная работа посвящена анализу нервно-мышечных синапсов, на стадии их новообразования и в первую очередь. - особенностям их Са2+ -зависимого функционирования.

Хорошо известно, что активность синапсов в период их новообразования отличается от зрелого стабильного состояния динамичностью и сложностью протекаемых в новообразованных контактах процессов (Bennett et al., 1973; Tonge, 1974). Это связано, во-первых, с необходимостью радикальной- перестройки» функций растущего конуса роста аксона в виде переключения его с обслуживания элонгации аксональной мембраны (путем конститутивного экзоцитоза) (Xie, Poo, 1986; Juttner, Rathjen, 2005; Waites et al., 2005) на стабилизацию в месте контакта и обслуживание сигнального экзоцитоза медиатора с участием специализированных синаптических везикул (Bastmeyer, O'Leary, 1996; Ahmari et al., 2000; Spitzer et al.,

2002). Вторая особенность заключается в одновременном4 протекании? в новообразованных нервных окончаниях противоположно направленных реакций -одни обеспечивают запуск секреторной активности, а другие - ее торможение с целью последующего возможного подавления синапса и его отторжения-(элиминации) в случае несоответствия требованиям клетки-мишени (Herrera, Zeng,

2003). Каждый из этих реципрокных процессов имеет свои механизмы и является предметом отдельного изучения в современной нейрофизиологии (Mark, 1980; Goda, Davis, 2003; Ziv, Garner, 2004; Colon-Ramos, 2009).

Процессы новообразования нервно-мышечных контактов в период реиннервации скелетной мышцы характеризуются всеми вышеперечисленные закономерностями, общими для центральных и периферических синапсов. Вместе с тем, имеются и некоторые особенности. Они связаны с формированием нервно-мышечных контактов на фоне т.н. денервационно-реиннервационного синдрома в скелетной мышце. Поэтому в данном обзоре сначала будут рассмотрены закономерности денервационно-реиннервационного синдрома, а затем (более подробно) - собственно механизмы новообразования моторных синапсов и их Са2+-зависимой регуляции.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Богачева, Полина Олеговна

158 ВЫВОДЫ

1. Блокада пресинаптических Са -каналов L-типа нифедипином (10 мкМ) и верапамилом (5 мкМ) приводила к возрастанию, а их активация агонистом BAY К 8644 (1 мкМ) - к, снижению квантового состава одиночных и ритмически генерируемых ПКП, демонстрируя способность входящего в нервные терминали Са2+-тока L-типа вызывать торможение секреции АХ в новообразованных моторных синапсах мыши.

2. Частота МПКП не менялась под действием нифедипина в покое и на фоне К+-деполяризации терминали, демонстрируя устойчивость спонтанной секреции АХ к тормозному действию Са2+-тока, входящего в терминали по каналам L-типа.

4. Отсутствие пресинаптических эффектов блокатора SK-типа К+са-каналов апамина (1мкМ) и способность нифедипина повышать квантовый состав ПКП, несмотря на его предварительное увеличение, вызываемое блокатором ВК-каналов паксиллином (1 мкМ), свидетельствуют о неучастии К+са каналов в реализации тормозного действия Са -тока L-типа на секрецию АХ.

5. Блокатор кальмодулина R-24571 (2 мкМ) и кальмодулинкиназы II KN-62 (3 мкМ) не оказывали влияния на квантовый состав ПКП, однако на фоне его предварительного увеличения, вызванного нифедипином, блокатор кальмодулинкиназы II приводил к подавлению квантового состава ПКП до контрольного уровня.

6. Блокаторы РКС хелеритрин (4 мкМ) и BIM (1 мкМ) вызывали прирост квантового состава ПКП, сопоставимый с действием, нифедипина. На фоне действия нифедипина хелеритрин терял способность к дальнейшему облегчению секреции АХ.

7. Блокаторы К+уканалов 4-аминопиридин (6 мкМ) и ВБМ (20 мМ) увеличивали вызванный выброс АХ. Предварительная инкубация мышц с хелеритрином предотвращала дополнительное облегчение секреции АХ 4-аминопиридином. На фоне действия 4-аминопиридина хелеритрин также не оказывал дальнейшего потенциирующего действия на нервно-мышечную передачу.

8. Таким образом, можно предполагать, что в новообразованных нервных терминалях Са -зависимое торможение секреции АХ происходит с участием Са2+-тока Ь-типа и выброса депонированного кальция, которые тормозят облегчающее действие кальмодулинкиназы II на секрецию АХ и стимулируют тормозное действие РКС, осуществляемое путем усиления активности пресинаптических К+у-каналов.

160

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данная работа была посвящена анализу необычного и малоизученного феномена, описанного более 30 лет назад - способности избирательных блокаторов Са -каналов L-типа облегчать выброс медиатора в нервно-мышечных контактах (Sugiura, Ко, 1997; Rosato-Siri, Uchitel, 1999; Santafe et al., 2001; Piriz et al., 2003). Облегчение передачи нифедипином и другими блокаторами Са2+-каналов L-типа наблюдается только на ранних стадиях иннервации мышечных волокон, когда происходит формирование многочисленных синаптических контактов и их быстрая1 перестройка - переход от избыточной полисинаптической иннервации волокон к моносинаптической (в виде одиночной концевой^, пластинки) (Santafe et л i al., 2001, 2002). Обнаруженный облегчающий передачу эффект блокаторов Са -каналов L-типа позволял предполагать, что только в новообразованных на

Ai мышечных волокнах незрелых нервных терминалях присутствует пул Са -каналов L-типа, ток через которые приводит к торможению секреции АХ и подавлению активности синапсов вплоть до их полного «умолкания». В работах Сантафе и соавторов было высказано предположение,- что такое Са2+-зависимое торможение секреции АХ - способ подавления активности избыточного числа моторных нервных терминалей и синапсов, перевода их в «молчащее» состояние, как необходимое условие для их последующей элиминации и формирования на волокне одиночной концевой пластинки (Santafe et al., 2002). Действительно, наличие (наряду с другими типами потенциал-зависимых Са -каналов) пула функционирующих потенциал-активируемых

Са2+

-каналов L-типа было подтверждено рядом исследований, как особенность новообразованных моторных синапсов, не характерная для функционально > зрелой* одиночной концевой пластинки скелетных волокон (Katz et al., 1996; Urbano, Uchitel, 1999; Balezina, Bukiya, 2005). Однако вопрос о том, какие конкретно внутриклеточные мишени и процессы оказываются задействованными при поступлении кальция по L-типу каналов и приводят к подавлению секреции АХ и работы синапсов, оставался открытым, несмотря на имеющиеся в литературе единичные, порой противоречивые гипотезы (Sugiura, Ко, 1997; Santafe et al., 2001, 2002).

В" начале нашей работы мы провели анализ пресинаптических эффектов антагонистов и агониста Са -каналов L-типа. Мы убедились что не только нифедипин, но и другой, отличный по химическому строению блокатор Са -каналов L-типа верапамил оказывает аналогичное облегчающее действие на амплитуду и квантовый состав ПКП в новообразованных синапсах мышцы голени - w.EDL-Это совпадало с данным других авторов, выполненных на разных типах мышц - как в раннем онтогенезе, так и в ходе реиннервации зрелых мышц. Кроме того, мы впервые установили что BAY К 8644, избирательный агонист Са2+-каналов L-типа, способствующий их пребыванию в открытом состоянии, оказывает противоположный эффект - подавляет секрецию АХ при залповой активности синапсов как этого и следовало бы ожидать, исходя из специфичности действия нифедипина и участия Са -тока L-типа в торможении секреции в новообразованных синапсах. В пользу специфичности облегчающего эффекта

24*

Са -блокаторов свидетельствовали и результаты работы Сугиуры и Ко о способности внутриклеточного буфера ВАРТА, связывающего входящий в терминали кальций, предотвращать облегчающее действие нифедипина на секрецию медиатора (Sugiura, Ко, 1997). f% 1

Если Са -зависимое угнетение вызванного выброса АХ призвано подавить активность синапсов, то оно, на наш взгляд, должно было бы быть еще более выраженным, при ритмической активности синапсов, как основном способе функционирования- моторных нейронов и синапсов in vivo. Мы впервые установили, что действительно под действием нифедипина происходит значительное облегчение передачи не только одиночных сигналов (в виде увеличения амплитуды и квантового состава одиночных ПКП), но и по всему ходу залпа: уровень амплитуд ПКП на т.н. фазе «плато» ПКП в конце короткого залпа ПКП существенно возрастает и превышает прирост одиночных ПКП.

Важно было выяснить влияние входящего Са2+-тока L-типа не только на вызванную, но и на спонтанную секрецию медиатора. Спонтанный экзоцитоз везикул, как известно, не зависит от действия триггерного кальция, запускающего синхронный выброс квантов АХ, но сохраняет чувствительность к регуляторному i кальцию, и Са - сигналам разного генеза внутри терминалей (Fu, Huang, 1994; Losavio, Muchnik, 1997, 1998; Bouron, 2001; Балезина, 2002; DeLorenzo et al., 2004; Glitsch, 2008;). Кроме того, хорошо известно, что в машинерии экзоцитоза везикул большую роль играют различные Са2+-зависимые белки и ферменты, участвующие в конечных стадиях экзоцитоза (Li, Chin, 2003; Weimer, Richmond, 2005; Wang, л I

Tang, 2006; Leabu, 2006; Malsam et al., 2008). Если входящий Са -ток L-типа направлен на регуляцию Са2+-зависимых белков в конечных стадиях экзоцитоза везикул, общих для спонтанного и вызванного экзоцитоза, то при блокаде нифедипином должен меняться не только вызванный, но и спонтанный экзоцитоз везикул, то есть увеличиваться частота МПКП. В литературе существуют немногочисленные и противоречивые данные относительно эффектов нифедипина и других блокаторов на спонтанную секрецию АХ в новообразованных синапсах (Piriz et al., 2003; Nudler et al., 2003). Поэтому мы провели подробное исследование воздействия нифедипина на частоту МПКП в нормальном растворе и при повышенном уровне калия - деполяризации, способствующей активации L-типа Са2+-каналов. Эти исследования показали, что спонтанная секреция, по-видимому, не чувствительна к действию блокаторов Са2+-каналов L-типа и току кальция по каналам этого типа. Это позволяло предполагать, что L-ток адресован мишеням и процессам, которые срабатывают не на самых конечных этапах машинерии экзоцитоза везикул, а ранее, «обслуживая» преимущественно механизм вызванного выброса медиатора.

Наличие в терминалях двух одновременно функционирующих и реципрокно влияющих на секрецию АХ Са2+-сигналов (триггерного и регуляторного), возникающих вследствие генерации пресинаптического потенциала действия, должно предусматривать структурно-функциональное разобщение этих сигналов -с точки зрения их пространственно-временного паттерна, активации специфических мишеней внутри терминали и т.п. Высокодифференцированным

• "У Лусилителем и модулятором любого Са -сигнала в клетке является система Са -депо и выброса депонированного кальция через РиР. Известны многочисленные примеры, когда вход кальция по L-типу Са2+-каналов в нейронах и других клетках приводит к активации РиР и выбросу депонированного кальция, тем самым дифференцируя входящие кальциевые сигналы и их действие (Cannell, Soeller, 1997; Verchratskyj, 1999; Collier et al., 2000; Балезина, 2002; Sukhareva et al., 2002; Балезина и др., 2004; Berrout, Isokawa, 2009).

Роль депонированного кальция в механизмах Са2+-зависимого торможения в новообразованных синапсах оставалась не изученной. Мы впервые показали, что одной из мишеней входящего в терминаль Са2+-тока L-типа являются о • пресинаптические РиР Са -депо терминалей. Более того, выброс депонированного кальция действует синергично с входящим Са2+-током L-типа - то есть подавляет вызванный выброс медиатора. Действительно, мы убедились, что избирательный блокатор РиР рианодин (5 мкМ) приводил к растормаживанию активности новообразованных синапсов, подобно действию нифедипина. Причем, на фоне предварительного действия нифедипина рианодин терял свое облегчающее влияние. Таким образом, оказалось, что вреализации тормозного действия-кальция в терминалях участвует не только кальций, входящий по L-типу каналов, но и сопряженный с ним выброс депонированного кальция через РиР.

В настоящее время известно немало примеров, когда выброс депонированного кальция приводит к подавлению секреции медиатора в центральных и периферических синапсах (Балезина, Букия, 2005; Балезина, Лаптева, 2007). В литературе случаи торможения процесса секреции медиатора кальцием, входящим

У Л. в терминали через разные Са -входы (через каналы P/Q, N- и L-типа, либо при сопряженном выбросе депонированного кальция) обычно предполагают активацию либо Са -зависимых К -каналов (Yazejian et al., 2000; Pattillo et al., 2001) либо, pi кальмодулин-зависимое торможение Са -каналов (Dunlap, 2007), либо — модуляцию Са2+-зависимых ферментов (Liu et al., 2007; Santafe et al., 2007; Shakiryanova et al., 2007; Wong et al., 2009; Lee et al., 2009).

В связи с этим нами была проведена серия экспериментов по сравнительному анализу последствий избирательной блокады, двух типов Са -зависимых К т каналов: высокопроводящих и низкочувствителььных к кальцию (ВК-типа) и низкопроводящих и высокочувствительных к кальцию (SK-типа): Оказалось, что блокада ВК-каналов избирательным блокатором паксиллином приводит к облегчению секреции и приросту амплитуды и квантового состава, ПКП, однако при этом сохраняется способность нифедипина дополнительно усиливать синаптическую-передачу и вызвать прирост амплитуды ПКП на фоне действия, паксиллина. Эти данные позволили исключить ВК-каналы.в качестве мишени.для прицельного действия на них Са -тока. L-типа либо выброса депонированного кальция. Блокада К+Са каналов SK-типа апамином вообще не вызвала изменений в уровне секреции, новообразованных синапсов, что позволяет также исключить их активность и вклад в механизм торможения секреции АХ при- исследованных нами режимах активности новообразованных синапсов. Таким образом, проведенные нами исследования, а также данные литературы (Sugiura, Ко, 1997) показали, что в новообразованных синапсах Са -зависимое торможение секреции АХ не связано ни с активацией высокопроводящих ВК-каналов, ни низкопроводящих БК-каналов. Вопрос о возможном участии Са2+-зависимых ферментов в

Са2+ -зависимом торможении выброса медиатора в новообразованных синапсах оставался до сих пор не изученным. Поэтому на последнем этапе нашей работы мы исследовали

Л I Л I возможную роль Са -входа по Ь-типу Са -каналов (в совокупности с выбросом

94депонированного кальция) в регуляцию активности Са -зависимых белков и

94ферментов. Эти ферменты, в свою очередь, могли бы опосредовать механизм Са -зависимого торможения выброса медиатора в новообразованных моторных синапсах т.ШЖ мыши.

Для проверки этого предположения нами были исследованы-пресинаптические эффекты блокаторов кальмодулина, СаМКП и РКС. Мы исходили из предположения; что если хотя-бы один из этих белков^ участвует в торможении, секреции- при входе в терминали Са2+-тока Ь-типа, то их блокада должна приводить к облегчению секреции АХ, подобно тому, как это наблюдается-при действии нифедипина.

Мы установили что избирательный блокатор кальмодулина не вызывает достоверных сдвигов квантового состава ПКП. Это делало маловероятным

94* гипотетическое участие кальмодулинзависимой инактивации Са -каналов- Р/ф-типа, которая-имеет место в зрелых концевых пластинках мыши (рип1ар, 2007)

Оказалось, что и блокатор кальмодулинзависимой киназы И - 1Ш-62 не вызывает достоверных изменений вызванной активности новообразованных синапсов: Однако на фоне увеличения квантового состава ПКП, вызванного нифедипином, последующее действие КИ-62 приводило к подавлению квантового состава * ПКП до исходного контрольного уровня; Полученные факты позволяют предположить, что в новообразованных синапсах присутствует СаМКП, способная облегчать секрецию АХ и генерацию одиночных ПКП, но ее активность подавляется Са2+-током, поступающим в терминаль по каналам Ь-типа и проявляется только в случае блокады*этого тока. Подавление секреции медиатора под действием блокаторов СаМКП отмечено недавно в нервных терминалях зрелых моторных синапсов дрозофилы (ЗИакпуапоуа е1 а1., 2007). Известно, что в центральных синапсах активация фермента может происходить за счет разных источников кальция, в том числе при поступлении кальция по Ь-типу Са2+-каналов

Rose et al., 2009). Среди возможных субстратов СаМКИ в интактных синаптичесьсих терминалях называют синапсин, белки цитоскелета, участвующие в процессах мобилизации везикул к активным зонам, модуляцию ионных каналов терминален и многие другие гипотетические мишени, список которых еще далеко не полон (Verona et al., 2000; Ohyama et al., 2002; Colbran, Brown, 2004; Nishiki, Augustine, 2004; Liu et al., 2007; Leal-Ortiz et al., 2008). Что касается новообразованных синапсов, то полученные нами свидетельства присутствия СаМКИ и ее способности облегчать здесь секрецию медиатора, но лишь в условиях блокады, активности L-типа Ca -каналов,, описаны впервые. Следует подчеркнуть, что в зрелых центральных синапсах для пресинаптической CaMKII характерна способность к двунаправленной регуляции секреции: медиатора, зависящей: от уровня: внутриклеточного кальция, степени аутофосфорилирования фермента и ее

94сопряженности с Ca -зависимымшфосфатазами; (Graupner, Brunei; 2007; Pij Lisman, 2008): Каковы мишени и специфика активности СаМКИ в новообразованных синапсах, предстоит выяснить в дальнейшем. Biлюбом'случае важно, что в: нашей* о . работе обнаружен ранее не известный механизм

Ca -зависимого торможения;: секреции? АХ в новообразованных- синапсах - за. счет подавления; входящим кальцием потенцирующего действия СаМКИ на синаптическую передачу.

Дляс исследования; возможной; роли РКС в Са2+-зависимом торможении секреции медиатора были, использованы избирательные блокаторы фермента -хелеритрин и В IM . - Оказалось, что блокаторы РКС вызывают прирост квантового состава ПКП, сопоставимый« с; действием нифедипина. Важно> подчеркнуть, что на фоне нифедипина хелеритрин терял свою потенциирующую активность в отношении вызванной секреции АХ. Это позволяло предположить, что, возможно, не только CaMKII, но и РКС незрелых терминалей: также является« мишенью для входящего по каналам, L-типа и: высвобождаемого из внутриклеточных депо кальция. Причем, в отличие от СаМКИ (активность которой подавляется кальцием, входящим: по Ь-типу каналов), активность РКС, напротив, запускается- и/или избирательно усиливается кальцием, входящим в терминаль по L-типу Са2+-каналов либо высвобождающимся из депо; что и приводит к торможению активности терминалей и подавлению секреции медиатора. Мы впервые показали, что мишенью^ для активируемой; РКС в новообразованных терминалях могут быть потенциал-активируемые К+-каналы и К+-ток задержанного выпрямления, обеспечивающий вторую, реполяризационную, фазу пресинаптического потенциала действия. Используя блокаторы К+у-каналов, мы установили, что именно модуляция работы К+-каналов, осуществляемая путем Са2+-зависимой активности РКС, может существенно подавлять секреторную активность новообразованных терминалей.

В настоящее время в литературе имеются многочисленные данные о том,.что именно модуляция К+у-каналов терминалей и второй фазы пресинаптического потенциала действия является эффективным механизмом регуляции секреции медиатора в химических синапсах (Mathie et al., 2003, 1998; Pongs, 2008; Feinschreiber et al., 2009). Так, недавно показано что торможение секреции АХ в моторных синапсах лягушки, происходящее с участием газообразного NO, также в конечном счете замыкается на усилении активности К+у-каналов (Yakovlev et al., 2002; Яковлев и др., 2005; Герасимова и др., 2008; Ситдикова, 2008). К+у-каналы являются также одной из мишеней при реализации механизма пресинаптического торможения в центральных синапсах (Shapiro et al., 1980; 1980а). Способность именно РКС выступать модулятором активности К+-каналов показана в нейронах (Acosta et al, 2007) и в пресинаптических терминалях центральных синапсов (Hoffman, Johnston, 1998; Cousin et al., 1999), ооцитах лягушек (Boland, Jackson, 1999; Schräder et al., 2009), кардиомиоцитах (Nakamura et al., 1997).

Л I

При рассмотрении- проблемы Ca -зависимого подавления секреции АХ в пуле многочисленных новообразованных синапсов, сосуществующих на каждом мышечном волокне, неизбежно возникает важный вопрос. Если Са2+-зависимое подавление активности синапсов предназначено для элиминации избыточного числа синапсов, то почему и какая из терминалей сохраняется и не будет подавлена? Существует ли функциональное предетерминирование одной из многочисленных формирующихся и сосуществующих на волокне терминалей, различие в характере ее чувствительности к тормозному сигналу в виде входящего Са -тока L-типа? Этот вопрос не был предметом специального анализа в нашей работе. Тем не менее, мы впервые за 30 лет изучения данного феномена в мировой литературе предприняли анализ амплитудных распределений сигналов ПКП и их изменений под действием нифедипина. Оказалось, что под действием нифедипина происходит не только увеличение средней амплитуды ПКП, но и явное изменение характера амплитудных распределений ПКП. Наряду со сдвигом гистограммы ПКП в область более высокоамплитудный значений на фоне нифедипина происходит ее расширение, увеличение дисперсии сигналов и, как правило, достоверное появление двух высокоамплитудных пиков ПКП. Это позволяет предполагать, что сосуществующие на одном волокне терминали и синапсы функционально гетерогенны - отличаются своей чувствительностью к

5 I нифедипину, а значит и к входящему тормозному Са -сигналу. Аналогичные изменения в характере гистограмм амплитудных распределений мы обнаружили при действии рианодина, хелеритрина, блокаторов К+у-каналов, но не при действии блокаторов Р/С)-типа Са2+ -каналов (не имеющих отношения к механизму

Са -зависимого торможения). Вопрос о том имеется ли функциональная гетерогенность аксонов и терминален еще до подрастания к мышечному волокну или она формируется сразу после установления контактов и как обеспечивается

94эта избирательность Са -зависимого торможения АХ, требует специального дальнейшего изучения. В любом случае, на основе обнаруженной гетерогенной чувствительности синапсов, сосуществующих на одном волокне, к нифедипину, рианодину, хелеритрину, легче можно представить механизм избирательного «выживания» одной из терминалей, наименее чувствительной к тормозному действию Са2+-сигнала, запускаемого входом кальция по Ь-типу Са2+-каналов.

Заключая анализ проведенной работы следует подчеркнуть, что Са2+-зависимое торможение секреции медиатора в химических синапсах является в настоящее время, малоизученным феноменом. Считается, что это может быть способом ауторегуляции по принципу отрицательной обратной связи в терминалях синапсов, обладающих большим спектром Са2+-входов. Эти входы и поступающий по ним кальций, в отличие от «триггерного» кальция, сопряженного с везикулами активных зон и запускающего экзоцитоз, могут играть не триггерную, а регуляторную роль в активности терминалей, модулируя процессы секреции медиатора в разных направлениях (Балезина и др., 2001 б; Балезина, 2002; Уакоу1еу е! а1„ 2002; Балезина и др., 2005; Ва1егта, ВиИуа, 2003; Балезина и др., 2006; Герасимова и др., 2008). В нашей работе удалось выявить ранее неизвестный. механизм Са -зависимого подавления секреции АХ, функционирующий в новообразованных синапсах скелетной мышцы. Он ч , включает вход кальция по Ь-типу Са -каналов и сопряженный с ним выброс депонированного кальция. Можно думать, что это в комплексе создает дифференцированные Са2+-сигналы, обеспечивающие разнонаправленную модуляцию двух Са2+-зависимых ферментов терминалей. С одной стороны, подавляется облегчающее действие СаМКИ на секрецию АХ. С другой стороны -стимулируется активность РКС, которая, усиливая работу К+у-каналов, также приводит к подавлению секреторной и сигнальной активности новообразованных синапсов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Богачева, Полина Олеговна, Москва

1. Балезина О.П, Федорин В.В, Гайдуков А.Е. Влияние никотина на нервно-мышечную передачу в моторных синапсах мыши // Бюллетень экспер. биол. и медицины. -2006-. Т. 140 (1). С. 4-8.л .

2. Балезина- О.П. Роль внутриклеточных Са -каналов в регуляции выброса медиатора // Успехи Физиол. Наук. -2002-. Т. 33 (3). С. 38-56

3. Балезина О.П., Букия А.Н., Лаптева В.И. Вызванная активность нервно-мышечных синапсов мыши на фоне действия рианодина и дантролена // Российский Физиологический журнал им. Сеченова. -20015-. Т. 87 (11). С.1511- 1517.

4. Балезина О.П., Букия А.Н., Лаптева В.И. Действие рианодина на вызванный выброс медиатора в условиях забуферивания внутритерминального кальция // Российский физиологический журнал имени И.М. Сеченова. -2004-. Т. 90 (8). С. 237-238.

5. Балезина О.П., Букия А.Н., Лаптева В.И. Разнонаправленное действие внутриклеточно высвобождаемого кальция на квантовую секрецию медиатора // Российский физиологический журнал имеют И.М. Сеченова. -2005-. Т. 91 (1). С. 61-70.

6. Балезина О.П., Вардья И.В., Попов С.И. Эффекты семакса in vivo и in vitro на регенерацию спинальных нейронов и аксонов // Нейрохимия. -2002-. Т. 19 (3). С. 191-197

7. Балезина О.П., Ермишина К.И., Лаптева В.И. Индуцируемые рианодином разнонаправленные изменения частоты спонтанной секреции медиатора // Доклады Российской Академии наук. -2004-. Т. 397 (2). 271-275.

8. Балезина О.П., Лаптева В.И. Дигоксин облегчает нервно-мышечную передачу в диафрагме мыши // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2007-. Т. 144 (10). С. 364-368.

9. Балезина О.П., Хавинсон В.Х., Вардья И.В:, Лаптева В.И. Регенерация моторных и сенсорных волокон передавленных периферических нервов: мыши стимулируется кортагеном // Российский Физиологический журнал им.Сеченова. -2001«-. Т. 278 (4). С. 56-59

10. Ю.Валиуллин В.В., Гусева Д.С., Исламов Р.Р., Челышев Ю.А. Иммуногистохимическое изучение камбаловидной мышцы крысы при различных способах денервации // Бюллетень экспер. биол. и медицины. -2001 . Т.131. (4). С. 477-480.

11. Герасимова Е.В., Ситдикова Г.Ф., Зефиров A.JI. Сероводород как эндогенный модулятор освобождения медиатора в нервно-мышечном синапсе лягушки // Нейрохимия. -2008-. Т. 25. № 1-2. С. 138-145.

12. Гехт Б.М., Никитин С.С. Механизмы компенсаторной реиннервации при повреждениях аксонов периферических нервов // Журнал невропатологии и психиатрии. -1986-. Т. 86 (2). С. 294-300.

13. Зефиров А.Л., Ситдикова Г.Ф. Ионные каналы нервного окончания // Усп. Физиол. Наук. -2002-. Т. 33 (4). С. 3-33.

14. Зефиров А.Л., Черанов С.Ю., Молекулярные механизмы квантовой секреции медиатора в синапсе // Успехи физиологических наук. -2000-. Т. 31 (3). С. 322.

15. Лаптева В.И. Разнонаправленное действие кальция, высвобождаемого из1. Л I

16. Ca -депо, на квантовую секрецию медиатора // М., 2006 Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

17. Николлс Дж.Г., Мартин А.Р., Валлас Б.Дж., Фукс П.А. От нейрона к мозгу // М.УРСС-2003.

18. Персон P.C. Спинальные механизмы управления мышечным сокращением // М. Наука. 1985. С. 15-110.

19. Пшедецкая А.Д., Савина М.Г. Постденервационные изменения мембранных потенциалов мышечных волокон адаптированных к холоду крыс // Физиол. журн. СССР им. И.М.Сеченова. -1988-. №. 8. С. 1134-39.

20. Ситдикова Г.Ф. Газообразные посредники как эндогенные модуляторы освобождения медиатора в нервно-мышечном синапсе // М., 2008. Автореферат на соискание степени доктора биологических наук.

21. Сурова Н.В. Регуляция активности нервно-мышечных синапсов мыши внутриклеточным депонированным кальцием, мобилизуемым кофеином и рианодином // М., 1999 Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

22. Федорин В.В., Балезина О.П. Участие н-холинорецепторов нейронального типа в регуляции выброса медиатора в нервно-мышечных синапсах мыши // Нейрохимия. -2008-. Т. 25 (1-2). С. 99-104.

23. Челышев Ю.А., Сайткулов К. Шванновские клетки: развитие, фенотипическая характеристика // Успехи физиол. Наук. -2000-. Т. 31 (3). С. 61-68.

24. Яковлев A.B., Ситдикова Г.Ф., Зефиров A.JI. Внутриклеточные пресинаптические механизмы эффектов оксида азота (II) в нервно-мышечном соединении лягушки // Нейрохимия. -2005-. Т. 22 (1). С. 81-87.

25. Acosta Е., Mendoza V., Castro Е., Cruzbianca Н. Modulation of a Delayed-Rectffier K+ Current by Angiotensin II in Rat Sympathetic Neurons // J Neurophysiol. -2007-. V. 98. P. 79-85.

26. Adler E.M., Augustine G.J., Duffy S.N., Charlton M.P. Alien Intracellular Calcium Chelators Attenuate Neurotransmitter Release at the Squid Giant Synapse //The Journal ofNeuroscience. -1991-. V. 1 (6). P. 1496-1507

27. Ahmari S.E., Buchanan J., Smith S.J. Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets //Nat Neurosci. -2000-. V. 3 (5). P. 445-51.

28. Alseikhan B.A., DeMaria C.D., Colecraft H.M., Yue D.T. Engineered calmodulins reveal the unexpected eminence of Ca2+ channel inactivation in controlling heart excitation//PNAS. -1992-.V. 99 (26). P. 17185-17190

29. Ann E.S., Mizoguchi A., Okajima S., Ide C. Motor axon terminal regeneration as studied by protein gene product 9.5 immunohistochemistry in the rat // Arch. Histol. Cytol. -1994-. V. 57(4). P.317-330.

30. Arenson M.S., Evans S.C. Activation of protein kinase С increases acetylcholine release from frog motor nerves by a direct action on L-type Ca2+ channels andapparently not by depolarization of the terminal // Neurosci. -2001-. V.104 (4). P.l 157-1164.

31. Argentieri T.M., Aiken S.P., Laxminarayan S., McArdle J.J. Characteristics of synaptic transmission in reinnervating rat skeletal muscle // Pflugers Arch. -1992-. V. 421 (2-3). P. 256-261.

32. Arteaga M.F., Gutierrez R., Avila J., Mobasheri A. Diaz-Flores L., Martin-Vasallo P. Regeneration influences expression of the Na+, K+-ATPase subunit isoforms in the rat peripheral nervous system //Neuroscience. -2004-. V. 129 (3). P. 691-702.

33. Atchison W.D. Dihydropyridine-sensitive and -insensitive components of acetylcholine release from rat motor nerve terminals // J. Pharmacol. Exp. Ther. -1989-. V. 251 (2). P. 672-8.

34. Atchison W.D:, O'Leary S.MI BAY K 8644 increases release of acetylcholine at the murine neuromuscular junction // Brain Res. -1987-. V. 419 (1-2). P.315-9.

35. Augustine G.J., Santamaria F., Tanaka K. Local calcium signaling in neurons. // Neuron. -2003-. V. 40 (2). P. 331-46.

36. Babu Y.S., Bugg G.E., Cook W.J. Structure of calmodulin refined at 2.2 A. resolution. //J. Mol Biol. -1988-. V. 204 (1). P. 191-204

37. Balezina O.P., Bukiya A.N. Facilitation and' Depression of Neuromuscular Transmission, under, Conditions of Blockade of Ryanodine Receptors // Neurophysiology. -2003-. V. 35 (2). P. 83-89.

38. Balice-Gordon R.J., Lichtman J.W. In vivo observations of pre- and postsynaptic changes during the transition from multiple to single innervation at developing neuromuscular junctions //J. Neurosci. -1993- V.13(2), P.834-855.

39. Barber M.J., Lichtman J.W. Activity-driven synapse elimination leads paradoxically to domination by inactive neurons. // J Neurosci. -1999-. V. 19 (22). P. 9975-85.

40. Barry J.A., Ribchester R.R. Persistent polyneuronal innervation in partially denervated rat muscle after reinnervation and recovery from prolonged nerve conduction block//J. Neurosci. -1995-. V. 15. P. 6327-6339.

41. Bastmeyer M., O'Leary D.D. Dynamics of target recognition by interstitial'axon branching along • developing cortical axons // J Neurosci. -1996-. V. 16 (4)/ P. 1450-9.

42. Bennett M.R., Florin T., Woog R. The formation of synapses in regenerating mammalian striated muscle // J. Physiol. -197 V. 238. P. 79-92.

43. Bennett M.R., McLachlan E.M., Taylor R.S. The formation of synapses in reinnervated mammalian striated muscle // J. Physiol. -1973-. V. 233. P. 481-500.

44. Berridge M.J. Elementary and global aspects of calcium signalling. // J Exp Biol. -1997-. V. 200(2). P. 315-9.

45. Berrout J., Isokawa M. Homeostatic and stimulus-induced coupling of the L-type Ca2+ channel to the ryanodine receptor in the hippocampal neuron in slices. // Cell Calcium. -2009-. V. 46 (1). P. 30-8.

46. Boland L.M., Jackson K.A. Protein kinase C inhibits Kvl.l potassium channel function. //Am J Physiol. -1999-. V. 277 (1). P. 100-10.

47. Bouchard R, Pattarini R, Geiger J.D. Presence and functional significance of presynaptic ryanodine receptors. // Prog Neurobiol. -2003-. V. 69 (6). P. 391-418.

48. Bouron A. Modulation of spontaneous quantal release of neurotransmitters in the hippocampus. // Prog Neurobiol. -2001-. V. 63 (6).-P. 613-35.

49. Bowman W.C., Harvey A.L., Marshall I.G. The actions of aminopyridines on avian muscle. // Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. -1977-. V. 297(1). P. 99-103.

50. Buffelli M., Busetto G., Bidoia C.> Favero M., Cangiano A. Activity-dependent synaptic competition at mammalian neuromuscular junction // News Physiol. Sci. -2004-. V. 19. P. 85-91.

51. Burden SJ. Building the vertebrate neuromuscular synapse. // J Neurobiol. -2002-. V. 53 (4). P. 501-11.

52. Burgoyne R.D. Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling. // Nat Rev Neurosci. -2007-. V. 8 (3). P. 182-93.

53. Busetto G., Buffelli M., Tognana E., Bellico F., Cangiano A. Hebbian mechanisms revealed by electrical stimulation at developing rat neuromuscular junctions. // J Neurosci. -2000-. V. 20 (2). P. 685-95.

54. Cannell M.B., Soeller C. Numerical analysis of ryanodine receptor activation<by L-type channel activity in the cardiac muscle diad. // Biophys J5. -1997-. V. 73 (1). P. 112-22.

55. Card D.J. Denervation: sequence of neuromuscular degenerative changes in rats and the effect of stimulation //Exp. Neurol. -1977-. V. 54 (2). P. 251-265.

56. Castle N. Recent advances in the biology of small conductance calcium-activated potassium channels// Perspectives in drug discovery and design. -1999-. V. 15-16. P.131-154

57. Chaudhuri D., Chang S.Y., DeMaria C.D., Alvania R.S., Soong T.W., Yue D.T. Alternative splicing as a molecular switch for Ca2+/calmodulin-dependent facilitation of P/Q-type Ca2+ channels. // J Neurosci. -2004-. V. 24 (28). P. 633442.

58. Chaudhuri D., Issa J.B., Yue D.T. Elementary mechanisms producing facilitation of Cav2.1 (P/Q-type) channels. // J Gen Physiol. -2007-. V. 129 (5). P. 385-401.

59. Chu G.C., Moscoso L.M., Sliwkowski M.X., Merlie J.P: Regulation of the acetylcholine receptor epsilon subunit gene by recombinant ARIA: an in vitro model for transynaptic gene regulation. //Neuron. -1995-. V. 14. P. 329-339.

60. Cohen I., Rimer M., Lomo T., McMahan U.J. Agrin-induced postsynaptic-like apparatus in skeletal muscle fibers in vivo. // Mol Cell Neurosci. -1997-. V, 9. P. 237-253.

61. Colbran R.J., Brown A.M: Calcium/calmodulin-dependent protein kinase ILand synaptic plasticity //Neurobiology. -2004-, V. 14. P. 318-327.

62. Collier M.L., Ji G., Wang Y., Kotlikoff M.I. Calcium-induced calcium release in smooth muscle: loose coupling between the action potential and calcium release. // J Gen Physiol. -2000-. V. 115 (5). P. 653-62.

63. Colon-Ramos D.A. Synapse formation in developing neural circuits // Curr Top Dev Biol. -2009-. V. 87. P. 53-79.

64. Connold A.L., Evers J.V., Vrbova G. Effect of low calcium and protease inhibitors on synapse elimination during postnatal development in the rat soleus muscle. // Brain Res. -1986-. V. 393 (1). P. 99-107.

65. Costanzo E.M., Barry J.A., Ribchester R.R. Competition at silent synapses in reinnervated skeletal muscle. // Nat Neurosci. -2000 -. V. 3 (7). P. 694-700.

66. Costanzo E.M.,.Barry J.A., Ribchester R.R. Co-regulation of synaptic efficacy at stable polyneuronally innervated neuromuscular junctions in reinnervated rat muscle. // J Physiol. -1999-. V. 521 (2). P. 365-74.

67. Cousin M.A., McLaughlin M., Nicholls D.G. Protein kinase C modulates field-evoked transmitter release from cultured rat cerebellar granule cells via a dendrotoxin-sensitive K+ channel. // Eur J Neurosci. -1999-. V. 11 (1). P. 101-9.

68. De Lorenzo S., Veggetti M., Muchnik S., Losavio A. Presynaptic inhibition of spontaneous acetylcholine release induced by adenosine at the mouse neuromuscular junction // Br J Pharmacol. -2004-. V. 142 (1). P. 113-24.

69. DeMaria C.D., Soong T.W., Alseikhan B.A., Alvania R.S., Yue D.T. Calmodulin bifurcates the local Ca2+ signal that modulates P/Q-type Ca2+ channels. // Nature. -2001-. V. 411 (6836). P. 484-9.

70. Dennis M.J., Miledi R. Characteristics of transmitter release at regenerating frog neuromuscular junctions // J. Physiol. -1974a-. V. 239. P. 571-594.

71. Dennis M.J., Miledi R. Non-transmitting neuromuscular junctions during an early stage of end-plate reinnervation // J. Physiol. -19746-. V. 239. P.' 553-570.

72. Desai R., Kronengold J., Mei J., Forman S.A., Kaczmarek L.K. Protein kinase C modulates inactivation of Kv3.3 channels. // J Biol Chem. -2008-. V. 283 (32). P. 22283-94.

73. Di Gregorio F., Fesce R., Cereser S., Favaro G., Fiori MG. Spontaneous and nerve-evoked quantal transmission in regenerated motor terminals // Cell Biol Int Rep. -1989-. V. 13 (12). P. 119-26.

74. Downes G.B., Granato M. Acetylcholinesterase function is dispensable for sensory neurite growth but is critical for neuromuscular synapse stability // Dev. Biol. -2004-. Y. 270 (1). P. 232-245.

75. Dunlap K. Calcium channels are models of self-control // J Gen Physiol. -2007-. V. 129 (5). P. 379-83.

76. Durant N.N., Marshall I.G.The effects of 3,4-diaminopyridine on acetylcholine release at the frog neuromuscular junction. // Eur J Pharmacol. -1980-. V. 67 (2-3).P. 201-8.

77. Erickson M.G., Alseikhan B.A., Peterson B.Z., Yue D.T. Preassociation of calmodulin with voltage-gated Ca(2+) channels revealed by FRET in single living cells. //Neuron. -2001-. V. 31 (6). P. 973-85.

78. Eusebio A., Oliveri F., Barzaghi P., Ruegg M.A. Expression of mouse agrin in normal, denervated and dystrophic muscle // Neuromuscul. Disord. 2003. 13(5). P.408-415.

79. Evans R.M., Zamponi G.W.P resynaptic Ca2+ channels—integration centers for neuronal signaling pathways. // Trends Neurosci. -2006-. V. 29 (11). P. 617-24.

80. Faber E.S., Sah P. Calcium-activated potassium channels: multiple contributions to neuronal function. // Neuroscientist. -2003-. V. 9 (3). P. 181-94.

81. Fallon J.L., Quiocho F.A. A closed compact structure of native Ca(2+)-calmodulin. // Structure. -2003-. V. 11 (10). P. 1303-7.

82. Farley J., Rudy B. Multiple types of voltage-dependent Ca2+-activated K+ channels of large conductance in rat brain synaptosomal membranes // Biophys J. —1988-. V. 53 (6). P. 919-34.

83. Feinshreiber L., Singer-Lahat D., Ashery U., Lotana I. Voltage-gated Potassium Channel as a Facilitator of Exocytosis // Ann. N.Y. Acad. Sci. -2009-. V. 1152. P. 87-92

84. Fischbachi G.D., Cohen S.A. The distribution of acetylcholine sensitivity over uninnervated and innervated muscle fibers grown in cell culture. Dev Biol. -1973. V.31 (1). P. 147-62.

85. Flanagan-Steet H., Fox M.A., Meyer D., Sanes J.R. Neuromuscular synapses can form in vivo by incorporation of initially aneural postsynaptic specializations // Development. -2005-. V. 132 (20). P. 4471-81.

86. Flink M.T., Atchison W.D. Iberiotoxin-Induced Block of Ca2+-Activated K+ Channels Induces Dihydropyridine Sensitivity of ACh Release from Mammalian Motor Nerve Terminals // JPET. -2003-. V. 305 (2). P. 646-652.

87. Frischknecht R., Fejitova A., Viesti M., Stephan A., Sonderegger P. Activity-induced synaptic capture and exocytosis of the neuronal serine protease neurotripsin// J. Neurosci. -2008-. V. 28 (7). P. 1568-79.

88. Fu W.M., Huang F.L. Potentiation by endogenously released ATP of spontaneous transmitter secretion at developing neuromuscular synapses in Xenopus cell cultures // Br J Pharmacol. -1994-. V. 111 (3). P. 880-6.

89. Gage P.W., McArdle J.J., Saint D.A. Effects of butanedione monoxime on neuromuscular transmission //Br. J. Pharmacol. -1990-. V. 100. P. 467-470'

90. Geppert M., Goda Y., Hammer R.E., Li C„ Rosahl T.W., Stevens C.F., Sudhofij t

91. T.C. Synaptotagmin I: a major Ca sensor for transmitter release at a central synapse // Cell. -1994-. V. 79. P. 717-727.

92. Gillis K.D., Mobner R., Neher E. Protein kinase C enhances exocytosis from chromaffin cells by increasing the size of the readily releasable pool of secretory granules //Neuron. -1996-. V. 16. P. 1209-1220.

93. Glitsch MD. Spontaneous neurotransmitter release and Ca2+~how spontaneous is spontaneous neurotransmitter release? // Cell Calcium. -2008-. V. 43 (1). P. 9-15.

94. Goda Y., Davis G.W. Mechanisms of synapse assembly and disassembly // Neuron. -2003-. V. 40 (2). P. 243-64.

95. Gomez T.M., Zheng J.Q. The molecular basis for calcium-dependent axon pathfinding // Nat Rev Neurosci. -2006-. V. 7(2). P. 115-25.

96. Gordon T., Sulaiman O., Boyd J.G. Experimental strategies to promote functional recovery after peripheral nerve injuries// J. Peripher. Nerv. Syst. -2003-. V. 8 (4). P.236-50.

97. Gorelick F.S., Wang J.K., Lai Y., Nairn A.C., Greengard P. Autophosphorylationiand activation of Ca /calmodulin-dependent protein kinase II in intact nerve terminals // J Biol Ghem. -1996-. V. 263. P. 17209-17212.

98. Graupner M., Brunei N. STDP in a bistable synapse model based on CaMKII and associated signaling pathways // PLoS Comput Biol. -2007-. Y. 3 (11). P. 221.

99. Gray, D.B., Brus.es, J.L., Pilar, G.R. Developmental?switch in the pharmacology of Ca2+ channels coupled to acetylcholine release // Neuron. -1992-. V. 8. P. 120.

100. Greensmith L., Dick J., Emanuel A.O., Vrbova G. Induction of transmitter release at the neuromuscular junction prevents motoneuron death after axotomy in neonatal rats //Neuroscience. -1996-. V. 71 (1). P. 213-20.

101. Gu X., Spitzer N.C. Breaking the code: regulation- of neuronal differentiation by spontaneous calcium transients // Dev. Neurosci. -1997-. V. 19 (1).P. 33-41.

102. Gundersen K. Spontaneous activity at long-term silenced synapses in rat muscle // J Physiol. -1990-. V. 430. P. 399-418.

103. Hailing D.B., Aracena-Parks P., Hamilton S.L. Regulation of voltage-gated Ca2+ channels by calmodulin // Sci STKE. -2005-. V. 315

104. He X.P., Yang F„ Xie Z.P., Lu B. Intracellular Ca2+ and Ca2+/Calmodulin-dependent kinase II mediate acute potentiation of neuromuscular release by neurotrophin-3 // J. Cell Biol. -2000-. V. 149 (4). P. 783-791.

105. Henley J., Poo M.M. Guiding neuronal growth cones using Ca2+ signals // Trends Cell Biol. -2004-. V. 14 (6). P. 320-30.

106. Hepp R., Cabaniols J.P., Roche P.A. Differential phosphorylation of SNAP-25 in vivo by protein kinase C and protein kinase A // FEBS Lett. -2002-. V. 532. P. 52-56.

107. Herrera A.A., Zeng Y. Activity-dependent switch from, synapse formation to synapse elimination* during development of neuromuscular junctions // J. Neurocytol. -2003-. V. 32 (5-8). P. 817- 833.

108. Heuser J.E., Reese T.S., Landis D:M., Hinds et al. Functional changes in-frog neuromuscular junctions studied with freeze-fracture, // J Neurocytol. -1974-.V3(l). P. 109-31.

109. Hoffman D.A., Johnston D. Downregulation of transient K+ channels in dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons by activation of PKA and PKC // J Neurosci. -1998-.Y. 18 (10). P. 3521-8.

110. Hoh J.F. Selective and non-selective reinnervation of fast-twitch and slow-twitch rat skeletal muscle // J Physiol. -1975-. V. 251 (3). P. 791-801.

111. Houng A., Polgar J., Reed- G.L. Muncl8-Syntaxin Complexes and Exocytosis in Human Platelets // J. Biol. Chem. -2003-. V. 278. P. 19627-19633.

112. Issa N:P., Hudspeth.A.J. Clustering of Ca2+ channels and Ca(2+)-activated K+ channels at fluorescently labeled presynaptic active zones of hair cells // Proc Natl Acad Sci USA. -1994-. V. 91 (16). P. 7578-82.

113. Jia M., Li M., Dunlap V., Nelson. P.G. The thrombin receptor-mediates functional activity-dependent" neuromuscular synapse reduction-via protein kinase C activation in vitro // J Neurobiol. -1999-. V. 38 (3). P. 369-81.

114. Jiang X., Lautermilch N.J., Watari H., Westenbroek R.E., Scheuer T., Catterall W.A. Modulation of CaV2.1 channels by Ca2+/calmodulin-dependentprotein kinase II bound to the C-terminal domain. // Proc Natl Acad Sci USA. -2008-. V. 105. P. 341-346.

115. Jo S.A., Zhu X., Marchionni M.A., Burden S.J. Neuregulins are concentrated at nerve-muscle synapses and activate ACh-receptor gene expression. //Nature. -1995-. V. 373 (6510). P. 158-61.

116. Juttner R, Rathjen FG. Molecular analysis of axonal target specificity and synapse formation // Cell Mol Life Sci. -2005-. V. 62 (23). P. 2811-27.

117. Kaibuchi K., Fukumoto Y., Oku N., Takai Y., Arai K., Muramatsu M. Molecular genetic analysis of the regulatory and catalytic domains of protein kinase C. J Biol Chem. -1989-. V. 264 (23). P. 13489-96.

118. Kang H., Tian L., Thompson W. Terminal Schwann cells guide the reinnervation of muscle after nerve injury. Review // J. Neurocytol. -2003-. V. 32 (5-8). P. 975-85.

119. Kano M., Garaschuk 0.5 Verkhratsky A., Konnerth A. Ryanodine receptor-mediated intracellular calcium release in rat cerebellar Purkinje neurones. // J Physiol. -1995-. V. 487 (1). P. 1-16.

120. Kaplan D.R., Cooper E. PI-3 kinase and IP3: partners in NT3-induced synaptic transmission // Nature Neurosci. -2001-. V. 4 (1). P. 5-7.

121. Katz E., Ferro P.A., Weisz G., Uchitel O.D. Calcium channels involved in synaptic transmission at the mature and regenerating mouse neuromuscular junction // J. Physiol. -1996-. V. 497 (3). P. 687-967.

122. Kim N., Burden S.J. MuSK controls where motor axons grow and form synapses. // Nat Neurosci. -2008-. V. 11 (1). P. 19-27.

123. Kim Y., Uhm D.Y., Shin J., Chung S. Modulation of delayed rectifier potassium channel by protein kinase C zeta-containing signaling complex in pheochromocytoma cells //Neuroscience. -2004-. V. 125 (2). P. 359-68.

124. Kobayashi T., Yamada Y., Fukao M., Tsutsuura M., Tohse N. Regulation of Cav 1.2 current: interaction with intracellular molecules // J. Pharmacol Sci. -2007-. V. 103. P. 347-353.

125. Korogod N., Lou X., Schneggenburger R., (2007). Posttetanic potenciation critically depends on an enhanced Ca2+-sensivity of vesicle fusion mediated by presynaptic PKC // Proc Natl Acad Sci USA. 2007. V. 104(40). P. 15923-8.

126. Kretsinger R.H. Calmodulin and myosin light chain kinase: how helices are bent // Science. -1992-. V. 258 (5079). P. 50-1.

127. Laskowski M. B., Colman H., Nelson C., Lichtman J.W. Synaptic competition during the reformation of a neuromuscular map // J.Neurosci. -1998-. V.18 (18). P. 7328-7335.

128. Lazdunski M. Apamin, a neurotoxin specific for one class of Ca2+-dependent K+ channels. // Cell Calcium. -1983-. V. 4. P. 421-8.

129. Leabu M. Membrane fusion in cells: molecular machinery and mechanisms // J Cell Mol Med. -2006-. V. 10 (2). P. 423-7.

130. Leal-Ortiz S., Waites C.L., Terry-Lorenzo R., Zamorano P., Gundelfinger E.D., Garner C.C. Piccolo modulation of Synapsinla dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis //J Cell Biol. -2008-. V. 181 (5). P. 831-46.

131. Lee A., Scheuer T., Catterall W.A. Ca2+/calmodulin-dependent facilitation and inactivation of P/Q-type Ca2+ channels // J. Neurosci. -2000-. V. 20. P. 68306838

132. Lee A., Westenbroek R.E., Haeseleer F., Palczewski K., Scheuer T., Catteral W. A. Differential modulation of Cav2.1 channels by calmodulin and Ca2+-binding protein 1 //Nat Neurosci. -2002-. V. 5 (3). P. 210-217.

133. Lee A., Zhou H., Scheuer T., Catterall W.A. Molecular determinants of Ca2+/calmodulin-dependent regulation of Cav2.1 channels // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -2003-. V. 100. P. 16059-16064

134. Lee S.J., Escobedo-Lozoya Y., Szatmari E.M., Yasuda R. Activation of CaMKII in single dendritic spines during long-term potentiation // Nature. -2009-. V. 458 (7236). P. 299-304.

135. Lehouelleur J., Noireaud J., Schmidt H. Acetylcholine-sensitivity and local regenerative activity in denervated frog slow muscle fibres // Pflugers Arch. -1984-. V. 402(1). P. 88-93.

136. Li L., Chin L.-S. The molecular machinery of synaptic vesicle exocytosis // Cell. Mol. Life Sci. -2003-. V. 60. P. 942-960.

137. Liang H;, DeMaria C.D., Erickson M.G.,. Mori M.X, Alseikhan B.A., Yue D.T. Unified mechanisms of Ca2+ regulation across the Ca2+ channel family // Neuron. -2003-. V. 39. P. 951-960.

138. Lichtman J.W, Colman H. Synapse elimination and indelible memory // Neuron.- 2000-. V. 25 (2). P. 269-78.

139. Lin W., Burgess R.W., Dominguez B., Pfaff S.L., Sanes J.R., Lee K.F. Distinct roles of nerve and muscle in postsynaptic differentiation of the neuromuscular synapse. //Nature -2001 -. V. 410. P. 1057-1064.

140. Lin W., Dominguez B., Yang J., Aryal P., Brandon E.P., Gage F.H., Lee K.F. Neurotransmitter acetylcholine negatively regulates neuromuscular synapse formation by a Cdk5-dependent mechanism. //Neuron. -2005-. V. 46. P. 569-579

141. Lindgren C.A., Moore J.W. Identification of ionic currents at presynaptic nerve endings of the lizard. // J Physiol. -1989-. V. 414. P. 201-22.

142. Liou J.C., Tsai F.Z., Ho S.Y. Potentiation of quantal secretion by insulinlike growth factor-1 at developing motoneurons in Xenopus cell culture I I J. Physiol. -2003-. V. 553 (3). P. 719-728.

143. Liu Q., Chen B., Ge Q., Wang Z.W. Presynaptic Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II modulates neurotransmitter release by activating BK channels at Caenorhabditis elegans neuromuscular junction. // J Neurosci. -2007-. V. 27. P. 10404-10413.

144. Llinas R., Gruner J.A., Sugimori M., McGuinness T.L., Greengard P. Regulation by synapsin I and Ca -calmodulin-dependent protein kinase II of the transmitter release in squid giantsynapse. // J Physiol. -1991-. V. 436. P. 257-282.

145. Lomo T. What controls the position, number, size, and distribution of neuromuscular junctions on rat muscle fibers? Review // J. Neurocytol. -2003-. V. 32 (5-8). P. 835-848.

146. Losavio A., Muchnik S. Role of L-type and N-type voltage-dependent calcium channels (VDCCs) on spontaneous acetylcholine release at the mammalian neuromuscular junction // Ann N Y Acad Sci. -1998-. V. 841. P. 63645.

147. Losavio A., Muchnik S. Spontaneous acetylcholine release in mammalian neuromuscular junctions // Am J Physiol. -1997-. V. 273 (6-1). P 1835-41.

148. Lu B., Fu W.-M., Greengard P., Poo M.-M. Calcitonin gene-related peptide potentiates synaptic responses at developing neuromuscular junction. // Nature. -1993-. V. 363. P. 76-79.

149. Mackler J.M., Drummond J.A., Loewen C.A., Robinson I.M., Reist N.E. The C2B Ca2+-binding motif of synaptotagmin is required for synaptic transmission in vivo // Nature. -2002-. V. 418. P. 340-344.

150. Majewski H., Iannazzo L. Protein kinase C: a physiological mediator of enhanced transmitter output // Progress in Neurobiology. -1998-. V. 55. P. 463475.

151. Malsam J., Kreye S., Sollner T.H. Membrane fusion: SNAREs and regulation // Cell Mol Life Sci. -2008-. V. 65 (18). P. 2814-32

152. Margrie T.W., Rostas J.A., Sah P. Presynaptic long-term-depression at a central glutamatergic synapse: a role for CaMKII // Nat Neurosci. -1998-. V. l.P. 378-383.

153. Mark R.F. Synaptic repression at neuromuscular junctions // Physiological reviews. -1980-. V. 60 (2). P. 355-395.

154. Mathie A., Clarke C.E., Ranatunga K.M., Veale E.L. What are the roles of the many different types of potassium channel expressed in cerebellar granule cells? // Cerebellum. -2003-. V. 2 (1). P. 11-25.

155. Mathie A., Wooltorton J.R., Watkins C.S. Voltage-activated potassium channels in mammalian neurons and their block by novel pharmacological agents. // Gen Pharmacol. -1998-. V. 30 (1). P. 13-24.

156. Maximov A., Siidhof T.C. Autonomous function of synaptotagmin 1 in triggering synchronous release independent of asynchronous release // Neuron. -2005-. V. 48 (4). P. 547-54.

157. McArdle J.J., Albuquerque E.X. A study of the reinnervation of fast and slow mammalian muscles // J. Gen. Physiol. -1973-. V. 61 (1). P. 1-2.

158. Meir A., Ginsburg S., Butkevich A., Kachalsky S.G., Kaiserman I., Ahdut R., Demirgoren S., Rahamimoff R. Ion Channels in Presynaptic Nerve Terminalsand Control of Transmitter Release// Physiological reviews. -1999-. V. 79 (3). P. 1020-1064.

159. Miledi R. Properties of regenerating neuromuscular synapses in the frog // J Physiol. -I960-. V. 154. P. 190-205.

160. Millán C., Torres M., Sánchez-Prieto J. Co-activation of PKA and PKC in cerebrocortical nerve terminals synergistically facilitates glutamate release // J Neurochem. -2003-. V.87 (5). P. 1101-11.

161. Misgeld T., Burgess R.W., Lewis R.M., Cunningham J.M1, Lichtman J.W., Sanes J.R. Roles of neurotransmitter in synapse formation: development of neuromuscular junctions lacking choline acetyltransferase. // Neuron. -2002-. V. 36. P. 635-648.

162. Nagy G., Kim J.H., Pang Z.P., Matti U., Rettig J., Sudhof T.C. Sorensen J.B. Different effects on fast exocytosis induced by synaptotagmiir 1 and 2 isoforms and abundance but.not by phosphorylation // J Neurosci. -2006-. V. 26. P. 632-643.

163. Nakamura T.Y., Coetzee W.A., Vega-Saenz De Miera E., Artman M., Rudy B. Modulation of Kv4 channels, key components of rat ventricular transient outward K+ current, by PKC // Am J Physiol. -1997-. V. 273 (4-2). P. 1775-86.

164. Narita K., Akita T., Hachisuka J., Huang S., Ochi K., Kuba K. Functionalicoupling of Ca channels to ryanodine receptors at presynaptic terminals. Amplification of exocytosis and plasticity // J. Gen. Physiol. -2000-. V. 115 (4). P. 519-32.

165. Narita K., Akita T., Osanai M., Shirasaki T., Kijima H., Kuba K. A Ca2+-induced Ca release mechanism involved in asynchronous exocytosis at frog motor nerve terminals // J. Gen. Physiol. -1998-. V. 112 (5). P. 593-609.

166. Neary J.T., Rathbone Mitchel P., Cattabeni F., Abbracchio M.P., Burnstoch G. Trophic action of extracellular nucleotides and nucleosides on glial and neuronal cells // Trends Neurosci. 1996 V.19. P. 13-18.

167. Nelson P.G. Activity-dependent synapse modulation and the pathogenesisof Alzheimer disease // Curr Alzheimer Res. -2005-. V. 2 (5). P. 497-506.

168. Nelson P.G., Fields R.D., Liu Y. Neural activity, neuron-glia relationships, and synapse development // Perspect Dev Neurobiol. -1995-. V. 2 (4). P. 399-407.

169. Nelson P.G., Lanuza M.A., Jia M., Li M.X., Tomas J. Phosphorylation reactions in activity-dependent synapse modification* at the neuromuscular junction during development // J. Neurocyt. -2003-. V. 32. P. 803-816.

170. Nichols R.A., Chilcote T.J., Czernik A.J., Greengard P. Synapsin I regulates glutamate release from rat brain synaptosomes // J Neurochem. -1992-. V. 58. P. 783-785.

171. Nichols R.A., Sihra T.S., Czernik A J., Nairn A.C., Greengard. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II* increases glutamate and noradrenaline release from synaptosomes //Nature. -1990-. V. 343. P. 647-651.

172. Ninan I., Arancio O. Presynaptic CaMKII is necessary for synaptic plasticity in cultured hippocampal neurons //Neuron. -2004-. V. 42. P. 129-141

173. Nishiki T., Augustine G.J. Synaptotagmin I synchronizes transmitter release in mouse hippocampal neurons // J Neurosci. -2004-. V. 24. P: 6127-6132.

174. Nishimura M., Tsubaki K, Yagasaki O., Ito K. Ryanodine facilitates calcium-dependent release of transmitter at> mouse neuromuscular junctions // British J Pharmacol. -1990-. V. 100 (1). P. 114-8.

175. Nomura K., Naruse K., Watanabe K., Sokabe M. Aminoglycoside blockade of Ca2(+)-activated K+ channel from rat brain synaptosomal membranes incorporated into planar bilayers // J Membr Biol. -1990-. V. 115 (3). P. 241-51.

176. Nudler S., Piriz J., Urbano F.J., Rosato-Siri M.D., Renteria E.S., Uchitel9.4

177. O.D. Ca channels and synaptic transmission at the adult, neonatal, and P/Q-type deficient neuromuscular junction // Ann N Y Acad Sci. -2003-. V. 998. P. 11-7.

178. O'Brien R.A.D., Ostberg A.J.C., Vrbova G., Observations on the elimination of polyneuronal innervation in developing mammalian skeletal muscle // J Physiol. -1978-. V. 282. P. 571-582

179. O'Brien R.A.D., Ostberg A.J.C., Vrbova G. Protease inhibitors reduce the loss of nerve terminals induced by activity calcium in developig rat soleus muscles in vitro. Neuroscience. -1984-. V. 12. P. 637-646

180. Ono Y., Fujii T., Igarashi K., Kuno T., Tanaka C., Kikkawa U., Nishizuka Y. Phorbol ester binding to protein kinase C requires a cysteine-rich zinc-fingerlike sequence // Proc Natl Acad Sci USA. -1989-. V. 86 (13). P. 4868-71.

181. Ono Y., Fujii T., Ogita K., Kikkawa U., Igarashi K., Nishizuka Y. The structure, expression, and properties of additional members of the protein kinase C family // J Biol Chem. -1988-. V. 263 (14). P. 6927-32

182. Ooashi N., Futatsugi A., Yoshihara F., Mikoshiba K., Kamiguchi H. Cell adhesion molecules regulate Ca2+-mediated steering of growth cones via-cyclic AMP and ryanodine receptor type 3 // The Journal of Cell Biology. -2005-, V. 170 (7). P. 1159-1167.

183. Panzer J.A., Gibbs S.M., Dosch R.,Wagner D.,Mullins M.G.,Granato M., Balice-Gordon R.J. Neuromuscular synaptogenesis inwild-type and mutant zebrafish // Dev Biol. -2005-. V. 285. P. 340-375

184. Park Y., Kim K.-T. Dominant role of lipid rafts L-type calcium channel in activity-dependent potentiation of large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis //J. Neurochem. -2009-. Epub ahead of print.

185. Peng Y. Ryanodine-sensitive component of calcium transients evoked by nerve firing at presynaptic nerve terminals // J Neurosci. -1996-. V. 16 (21). P. 6703-12.

186. Pi H.J., Lisman J.E. PKA Coupled phosphatase and kinase switches produce the tristability required for long-term potentiation and long-term depression // J Neurosci. -2008-. V. 28 (49). P. 13132-8.

187. Pinter S., Mendler L. and Dux L. Neural impacts on the regeneration of skeletal muscles // Acta Biochim. Pol. -2003-. V. 50 (4). P. 1229-1237.

188. Pongs O. Regulation of excitability by potassium channels // Results Probl Cell Differ. -2008-. V. 44. P. 145-61.

189. Protti D.A., Reisin R., Mackinley T.A., Uchitel O.D. Calcium channel blockers and transmitter release at the normal* human neuromuscular junction // Neurology. -1996-. V. 46 (5). P. 1391-6.

190. Protti D.A., Uchitel O.D. Transmitter release and presynaptic Ca2 + currents blocked by the spider toxin omega-Aga-IVA // Neuroreport. -1993-. V. 5. P. 333-336.

191. Ramon y Cajal S. Degeneration and regeneration of the nervous system. (.1928) New York: Hafner Press, 1959

192. Redfern P:A. Neuromuscular transmission in new-born rats // J. Physiol. -1970-, V. 209. P. 701-709.

193. Ribchester R.R, Taxt T. Repression of inactive motor terminals in partially denervated rat muscle after regneration of activa motor axons // J.- Physiol. -1984-. V. 347. P. 497-511.

194. Ribchester R.R. Co-existence and elimination of convergent motor nerve terminals in reinnervated and paralysed adult rat skeletal muscle // J Physiol. -1993-. V. 466. P. 421-41.

195. Ribchester R.R., Taxt T. Motor unit size and synaptic competition in rat lumbrical muscles reinnervated by active and inactive motor axons // J. Physiol. -1983-. V. 344. P. 89-111.

196. Rich M.M., Lichtman J.W. In vivo visualization of pre- and postsynaptic changes during synapse elimination in reinnervated mouse muscle I I J. Neurosci. -1989-. V. 9. P. 1781-1805.

197. Risinger C., Bennett M.K. Differential phosphorylation of syntaxin and synaptosome-associated protein of 25 kDa (SNAP-25) isoforms // J Neurochem. -1999-. V. 72 (2). P. 614-24.

198. Roberts W.M., Jacobs R.A., Hudsreth A.J. Colocalization of ion channels involved in frequency selectivity and synaptic transmission at presynaptic active zones of hair cells // J Neurosci. -1990-. V. 10 (11). P. 3664-84.

199. Robitaille R., Charlton M.P. Presynaptic calcium signals and transmitter release are modulated by calcium-activated potassium channels // J. Neurosci. -1992-. V. 12 (1). P. 297-305.

200. Robitaille R., Garcia M.L., Kaczorowski G.J., Charlton M.P. Functional colocalization of calcium and calcium-gated potassium channels in control of transmitter release // Neuron. -1993-. V. 11 (4). P. 645-55.

201. Roeper J., Pongs O. Presynaptic potassium channels // Current opinion in neurobiology. -1996-. V. 6. P. 338-341.

202. Rosato-Siri M.D., Piriz J., Tropper B.A., Uchitel O.D. Differential Ca2+-dependence of transmitter release mediated by P/Q- and N-type calcium channels» at neonatal rat neuromuscular junctions //Eur J Neurosci. -2002-. V.15. P. 18741880.

203. Rosato-Siri M.D., . Uchitel O.D. Calcium channels coupled to neurotransmitter release at neonatal rat neuromuscular junctions // J.Physiol. -1999-. V. 514 (2). P. 533-540.

204. Rose J., Jin S.-X., Craig A.M. Heterosynaptic Molecular Dynamics: Locally Induced Propagating Synaptic Accumulation of CaM Kinase II // Neuron. -2009-. V. 61. P. 351-358.

205. Sanes J.R., Lichtman. J.W. Development of the vertebrate neuromuscular junction // Annu Rev Neurosci. -1999-. V. 22. P. 389-442

206. Sanes J.R., Lichtman J.W. Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus // Nat Rev Neurosci. -2001-. V. 2. P. 791-805

207. Sanes J.R., Marshall L.M., McMahan U.J. Reinnervation of muscle fiber basal lamina after removal of myofibers. Differentiation of regenerating axons at original synaptic sites // The Journal of Cell Biology. -1978-. V.78. P. 176-198.

208. Santafe M. M., Garcia N., Lanusa M. A., Tomas M., Tomas J. Interaction between protein kinase C and protein kinase A can modulate transmitter release at the rat neuromuscular synapse // J Neurosci. -2009-. V. 87 (3). P. 683-90.

209. Santafe M.M, Garcia N., Lanuza M.A., Tomas J. Protein kinase C activity affects neurotransmitter release at polyinnervated neuromuscular synapses // J Neurosci Res. -2007-. V. 85. P. 1449-1457.

210. Santafe M.M., Garcia N., Lanuza M.A., Uchitel O.D., Tomas J. Calcium, channels coupled to neurotransmitter release at dually innervated neuromuscular junctions in the newborn rat // Neuroscience. -2001-. V. 102 (3). P. 697-708.

211. Santafe M.M., Lanuza MIA., Garcia N., Tomas J. Calcium inflow-dependent protein kinase C activity is involved in the modulation of transmitter release in the neuromuscular junction of the adult rat // Synapse. -2005- V. 57. P: 76-84.

212. Santafe M.M., Lanuza M.A., Garcia N., Tomas J. Muscarinic autoreceptors modulate transmitter release through protein kinase C and protein kinase A in the rat motor nerve terminal // Eur. J. Neurosci. -2006-. V. 23. P. 2048-2056.

213. Saucerman J.J., Bers D.M. Calmodulin.mediates differential sensitivity of CaMKII and calcineurin to local Ca2+ in cardiac myocytes // Biophys J. -2008-. V. 95 (10). P. 4597-612.

214. Schaarschmidt G., Wegner F., Schwarz S., Schmidt H., Schwarz J. Characterization of Voltage-Gated Potassium Channels in Human Neural Progenitor Cells // PloS One. -2009-. V. 4 (7).

215. Schneggenburger R., Neher E. Presynaptic calcium and control of vesicle fusion // Curr. Opin. Neurobiol. -2005-. V. 15. P. 266-274.

216. Schrader L.A., Ren Y., Cheng F., Bui D., Sweatt D., Anderson A.E./ Kv4.2 is a locus for PKC and ERK/MAPK cross-talk // Biochem J. -2009-. V. 417. P. 705-715.

217. Schraw T.D., Lemons P.P., Dean W.L., Whiteheart S.W. A role for Sec-1/Munk 18 proteins in platelet exocytosis // Biochem J. -2003-. V. 374(1). P.207-17.

218. Sellin L.C., Molgo J., Tornquist K., Hansson B., Thesleff S. On the possible origin of giant or slow-rising miniature end-plate potentials at the neuromuscular junction // Pflugers Arch. -1996-. V. 431 (3). P. 325-34.

219. Sham J.S. Ca2+ release-induced inactivation of Ca2+ current in rat ventricular myocytes: evidence for local Ca2+ signaling // J Physiol. -1997-. V. 500 (2). P. 285-95.

220. Sivaramakrishnan S., Brodwick M.S., Bittner G.D. Presynaptic facilitation at the crayfish neuromuscular junction. Role of calcium-activated potassium conductance // J Gen Physiol. -1991-. V. 98 (6). P. 1181-96

221. Slawinska U., Navarrete R., Kasicki S., Vrbova G. Motor activity patterns in rat soleus muscle after neonatal partial denervation // Neuromuscul. Disord. -1995-. V. 5 (3). P. 179-186.

222. Smith C., Moser T., Xu T. and Neher E. Cytosolic Ca"^ acts by two separate pathways to modulate the supply of release-competent vesicles in chromaffin cells //Neuron. -1998-. V. 20. P. 1243-1253.

223. Snider W.D., Lichtman J.W. Are neurotrophins synaptotrophins? // Mol Cell Neurosci. -1996-. V. 7 (6). P. 433-42.

224. Spitzer N.C. Activity-dependent neuronal differentiation prior to synapse formation: the functions of calcium transients // J.Physiol. Paris. -2002-. V. 96, P. 73-80.

225. Spitzer N.C., Lautermilch N.J., Smith R.D., Gomez T.M. Coding of neuronal differentiation by calcium transients // Bioessays. -2000-. V. 22 (9). P. 811-7.

226. Staal R.G., Hananiya A., Sulzer D. PKC theta activity maintains normal quantal size in chromaffin cells // J Neurochem. -2008-. V. 105 (5). P. 1635-41.

227. Stanton P.K., Gage A.T. Distinct synaptic loci of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II necessary for long-term potentiation and depression // J Neurophysiol. -1996-. V. 76. P. 2097-2101.

228. Stevens C.F., Sullivan J.M. Regulation of the readily releasable vesicle pool by protein kinase C // Neuron. -1998-. V.21 (4). P. 885-93.

229. Stocker M. Ca(2+)-activated K+ channels: molecular determinants and function of the SK family // Nat Rev Neurosci. -2004-. V. 5 (10). P. 758-70.

230. Sugiura Y., Ko Ch.-P. Novel modulatory effect of L-type calcium channels at newly formed neuromuscular junctions // J.Neurosci. -1997-. V. 17. P. 11011111.

231. Sukhareva M., Smith S.V., Marie D., Barker J.L. Functional Properties of Ryanodine Receptors in Hippocampal Neurons Change During Early Differentiation in Culture // J Neurophysiol. -2002-. V. 88. P. 1077-1087

232. Sun X.P., Schlichter L.C., Stanley E.F. Single-channel properties of BK-type calcium-activated potassium channels at a cholinergic presynaptic nerve terminal//J Physiol.-1999-, V. 518 (3)/P. 639-51.

233. Tai C., Kuzmiski J.B., Mac Vicar B.A. Muscarinic enhancement of R-type calcium currents in hippocampal CA1 pyramidal neurons // J. Neurosci. -2006-. V. 26 (23). P. 6249-6258.

234. Takai Y., Kaibuchi K., Tsuda T., Hoshijima M. Role of protein kinase C in transmembrane signaling // J Cell Biochem. -1985-. V. 29 (2). P.' 143-55.

235. Thesleff S, Molgo J. A new type of transmitter release at the neuromuscular junction //Neuroscience. -1983-. V. 9 (1). P. 1-8.

236. Thompson W. Synapse elimination' in neonatal rat muscle is sensitive to pattern of muscle use //Nature. -1983-. V. 302 (5909). P. 614-6.

237. Thomsen R.H., Wilson D.F.J Effects of 4-aminopyridine and 3,4-diaminopyridine on transmitter release at the neuromuscular junction // Pharmacol Exp Ther. -1983-. V. 227 (1). P. 260-5.

238. Tiran Z., Peretz A., Attali B., Elson A. Phosphorylation-dependent regulation of Kv2.1 Channel activity at tyrosine 124 by Src and by protein-tyrosine phosphatase epsilon // J Biol Chem. -2003-. V. 278 (19). P. 17509-14.

239. Tonge D.A. Physiological characteristics of re-innervation of skeletal muscle in the mouse // J. Physiol. 1974. V.241. P. 141-153.

240. Trinidad J.C., Fischbach G.D., Cohen J.B. The Agrin/MuSK signaling pathway is spatially segregated from the neuregulin ErbB receptor signaling pathway at the neuromuscular junction // J Neurosci. -2000-. V. 20. P. 8762-8770

241. Uchitel, O.D. Toxins affecting calcium channels in neurons // Toxicon. -1997-. V. 35 (8). P. 1161-1191.

242. Urbano F.J., Depetris R.S., Uchitel O.D. Coupling of L-type calcium channels to neurotransmitter release at mouse motor nerve terminals // Pflugers Arch Eur J Physiol. -2001-. V. 441. P. 824-831

243. Urbano F.J., Rosato-Siri M.D. and Uchitel O.D. Calcium channels involved in neurotransmitter release at adult, neonatal and P/Q-type deficient neuromuscular junctions // Molecular Membrane Biology. -2002-. V. 19. P. 293300

244. Urbano F.J., Uchitel O.D. L-Type calcium channels unmasked by cell-permeant Ca2+ buffer at mouse motor nerve terminals // Pflugers Arch Eur J Physiol. -1999-. V. 437. P. 523-528

245. Van der Kloot W. The regulation of quantal size // Prog Neurobiol. -1991-. V. 36 (2). P. 93-130.

246. Van der Kloot W., Molgo J. Quantal acetylcholine release at the vertebrate neuromuscular junction // Physiol Rev. -1994-. V. 74 (4). P. 899-991

247. Van Essen D.C., Gordon H., Soha J., Fraser S.E. Synaptic dynamics at the neuromuscular junction, mechanisms and models. //J. Neurobiol. -1990-. V. 21. P. 223-249.

248. Van Lunteren E., Moyer M. Electrophysiologic and inotropic effects of K+-channel blockade in aged diaphragm // Am. Jl Respir Crit Care Med. -1998-. V. 158(3). P. 820-6.

249. Verkhratsky A., Shmigol A. Calcium-induced calcium release in neurons // Cell Calcium. -1996-. V. 19 (1). P 1-14

250. Verona M., Zanotti S., Schafer T., Racagni G., Popoli M. Changes of synaptotagmin interaction with t-SNARE proteins in vitro after calcium/calmodulin-dependent phosphorylation // J Neurochem. -2000-. V.74. P.209-22.

251. Vogel Z., Sytkowski A.J., Nirenberg M.W. Acetylcholine receptors of muscle grown in vitro // Proc Natl Acad Sci USA. -1972-. V. 69. P. 3180-3184.

252. Waites C.L., Craig A.M., Garner C.C. Mechanisms of vertebrate synaptogenesis // Annu Rev Neurosci. -2005-. V. 28. P. 251-74.

253. Walaas S.I., Gorelick F.S., Greengard P. Presence of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II in nerve termi nals of rat brain // Synapse. -1989-. V.3. P.356-362.

254. Wang Y., Tang B.L. SNAREs in neurons beyond synaptic vesicle exocytosis // Molecular Membrane Biology. -2006-. V. 23 (5). P. 377-384

255. Wang Z.-W. Regulation of Synaptic Transmission by Presynaptic CaMKII and BK Channels // Mol Neurobiol. -2008-. V. 38. P: 153-166.

256. Wangemann P., Takeuchi S. Maxi-K+ channel in single isolated cochlear efferent nerve terminals // Hear Res. -1993-. V. 66 (2). P. 123-9.

257. Wehrens X.H., Lehnart S.E., Reiken S.R., Marks A.R. Ca2+calmodulin-dependent protein kinase II phosphorylation regulates the cardiac ryanodine receptor // Circ Res. -2004-. V. 94. P. 61-70.

258. Weimer R.M., Richmond J.E. Synaptic Vesicle Docking: A Putative Role for the Muncl8/Secl Protein Family // Current Topics in Developmental Biology. -2005-. V. 65. P. 83-113

259. Wheeler D.B., Randall A., Tsien R.W. Changes in action potential duration alter reliance of excitatory synaptic transmission on multiple types of Ca2+ channels in rat hippocampus. // J Neurosci. -1996-. V. 16 (7). P. 2226-37.

260. Wong M. Y., Shakiiyanova D., Levitan E. S. Presynaptic Ryanodine Receptor-CamKII Signaling is Required for Activity-dependent Capture of Transiting Vesicles // J Mol Neurosci. -2009-. V. 37. P. 146-150

261. Wu X.-S., Wu L.-G. Protein»kinase C increases the apparent affinity of the release machinery to Ca2+ by enhancing the release machinery downstream of the Ca2+ sensor//J.Neurosci. -2001-. V. 21 (20) P. 7928-36

262. Wyatt R.M., Balice-Gordon R.J: Activity-dependent elimination of neuromuscular synapses // J. Neurocyt. -2003-. V. 32. P. 777-794.

263. Xie Z.P., Poo M.M. Initial events in the formation, of neuromuscular synapse: rapid induction of acetylcholine release from embryonic neuron // Proc Natl Acad Sci USA. -1986-. V. 83 (18)/ P: 7069-73.

264. Yakovlev A.V., Sitdikova G.F., Zefirov A.L. Role of the cGMPand camp-dependent systems in the effects of nitric oxide on transmitter release and potassium currents in-the frog neuromuscular junction // Neurophysiology. -2002. V. 34 (2/3). P. 267-269.

265. Yamauchi T. Neuronal Ca2+/Galmodulin-Dependent Protein Kinase II— Discovery, Progress in a-Quarter of a Century, and Perspective: Implication for Learning and Memory // Biol. Pharm. Bull. -2005-. V. 28 (8). P. 1342—1354

266. Yang F., He X.P., Feng L., Mizuno K., Russell' J., Xiong W.C., Lu B. PI-3 kinase and IP3 are both necessary and»sufficient to mediate NT3-induced synaptic potentiation // Nature Neurosci. -2001-. V. 4 (1). P. 19-28.

267. Yazejian B, Sun X.P., Grinnell A.D. Tracking presynaptic Ca2+ dynamics during neurotransmitter release withtCa2+-activated K+ channels // Nat Neurosci. -2000-. V. 3(6). P. 566-71.

268. Yoshihara M., Littleton J.T. Synaptotagmin I functions as a calcium sensor to synchronize neurotransmitter release //Neuron. -2002-. V. 36. P. 897-908.

269. Yu H.-M., Wen J., Wang R., Shen W.-H., Duan S., Yang H.-T. Critical role of type 2 ryanodine receptor in mediating activity-dependent neurogenesis from embryonic stem cells // Cell Calcium. -2008-. V. 43. P. 417-431

270. Zengel J.E., Lee D.T., Sosa M.A., Mosier D.R. Effects of calcium channel blockers on stimulation-induced changes in transmitter release at the frog neuromuscular junction // Synapse. -1993-. V. 15 (4). P. 251-62.

271. Zhao F., Li P., Chen S.R., Louis C.F., Fruen B.R. Dantrolene inhibition of ryanodine receptor Ca2+ release channels. Molecular mechanism and isoform selectivity // J Biol Chem. -2001-. V. 276 (17). P. 13810-6.

272. Zhu P.-H., Vrbova G. The Role of Ca2+ in the Elimination of Polyneuronal Innervation of Rat Soleus Muscle Fibres // European Journal of Neuroscience. -1992-. V. 4. P. 433-437

273. Ziv N.E., Garner C.C. Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly // Nat Rev Neurosci. -2004-. V. 5 (5). P. 385-99.

274. Zucker R.S. Exocytosis: a molecular and physiological perspective.// Neuron.-1996-, V. 17(6). P. 1049-55.

275. Zucker R.S., Regehr W.G. Short-term synaptic plasticity // Annu. Rev. Physiol. -2002-. V. 64. P. 355-405

276. Zuhlke R. D., Pitt G. S., Deisseroth K., Tsien R. W., Reuter H. Calmodulin supports both inactivation and facilitation of L-type calcium channels // Nature. -1999-. V. 399. P. 159-162.ь

277. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ1. АХ ацетилхолин1. АХР рецептор ацетилхолина1. АХЭ ацетилхолинэстераза

278. МПКП миниатюрный потенциал концевой пластинки;

279. МТКП миниатюрный ток концевой пластинки;

280. ПКП потенциал концевой пластинки;

281. ТКП ток концевой пластинки;

282. РиР рианодиновые рецепторы;1. ВБМ бутандионмоноксим;

283. СаМКИ кальмодулинкиназа II типа;1. РКС протеинкиназа С.

Информация о работе