Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция входа Ca2+ в электроновозбудимых клетках Ca2+-мобилизующими агентами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дедкова, Елена Николаевна, Пущино

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ КЛЕТКИ

На правах рукописи

ДЕДКОВЛ ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

РЕГУЛЯЦИЯ ВХОДА Са2+ В ЭЛЕКТРОНЕВОЗБУДИМЫХ КЛЕТКАХ Са2+-МОБИЛИЗУЮЩИМИ АГЕНТАМИ.

Биофизика 03.00.02

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Зинченко В.П.

г. Пущино 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 1

ВВЕДЕНИЕ 2

Глава I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 9

1. Са2+-ТРАНСПОРТИРУЮЩИЕ СИСТЕМЫ КЛЕТКИ 9

2. МЕХАНИЗМЫ ВХОДА Са2+ В КЛЕТКИ. 10 2.1 Рецептор-управляемые Са2+-транспортирующие каналы плазматической мембраны. 10

2.1.1. Истинные рецептор-управляемые каналы. 10

2.1.2. Са2+-каналы, активируемые вторичными посредниками. 12

2.1.3. G-белок-управляемые Са2+- каналы. 14 2.2. Са2+ -каналы, регулируемые высвобождением Са2+ из внутренних депо

(store-release-activated channel, CRAC). 16

2.2.1. Характеристика запас-регулируемого входа Са2+. 18

2.2.2. Механизм активации Icrac. 18

2.2.3. Фактор входа Са2+ (Ca2+-influx factor, C1F). 20

2.2.4. Другие цитозольные факторы. 21 2.3. Потенциал-управляемые кальциевые каналы. 23

3. ПОДДЕРЖАНИЕ НИЗКОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ Ca2f В ЦИТОПЛАЗМЕ КЛЕТОК.

ПУТИ ВЫХОДА С а2' ИЗ КЛЕТКИ. 24

3.1. Кальциевые насосы внешней и внутренних мембран клетки. 24

3.1.1. Са2+-АТРаза плазматических мембран. 27

3.2. Na+/Ca2+ -обменник. 27

3.3. Транспорт Са2+митохондриями. 28

3.4. Са2УН -обменник. 30

4. ВЫСВОБОЖДЕНИЕ ИОНОВ Са2+ ИЗ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ДЕПО

ПОД ДЕЙСТВИЕМ ИНОЗИТОЛ-1,4,5-ТРИСФОСФАТА. 31

4.1. Активация инозитол 1,4,5-трисфосфатом кальциевых каналов. 31

4.2. Молекулярная структура рецепторов инозитол 1,4,5-трисфосфата. 33 4.3. Факторы, влияющие на высвобождение Са2+ из внутриклеточных депо под

действием 1Рч. 33

5. АР АХИ ДОНОВ АЯ КИСЛОТА И ЕЁ ВЛИЯНИЕ НА РЕГУЛЯЦИЮ

ТРАНСПОРТА Са2+. 35

5.1. Влияние АА на концентрацию свободных ионов. 36 5.1.1. Действие АА на мобилизацию Са2+ из внутриклеточных депо. 36

5.2. Модуляция АА активности рецептор-управляемых Са2+-каналов. 39

5.2.1. АА-индуцируемое повышение [Са2 ]; в интактных клетках. 39

5.2.2. Действие АА на рецептор-стимулируемое повышение [Са2+]ь 41 6 Са2+-ИОНОФОРЫ - ОСНОВНОЙ ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

РОЛИ Са2+ КАК ВТОРИЧНОГО МЕССЕНДЖЕРА. 43

7. Т-КЛЕТКИ ПАМЯТИ - ОСНОВА ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ПАМЯТИ. 47

7.1. Изоформы СР45 отличают "наивные" Т клетки и Т-клетки памяти. 48

Глава И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. 50

1. Получение клеток. 50

2. Используемые среды. 50

3. Измерение [Са2]]. 51

4. Измерение рН;. 52

5. Измерение Са2+ во внутриклеточных структурах. 52

6. Установка. 53

7. Измерение продукции активных форм кислорода (АФК) 53

8. Используемые реактивы. 53 Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. 54

1. МЕХАНИЗМ АКТИВИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ Са2+-ИОНОФОРОВ

НА ИНТАКТНЫЕ КЛЕТКИ. 54

1.1. Ионофор-индуцируемый вход Са2+ в клетки. 55 1.1.2. Влияние арахидоновой кислоты (АА) и ингибиторов

метаболизма АА на иономицин-индуцируемый Са2 -сигнал. 57

1.2. Ионофор-индуцируемая мобилизация Са2+ из внутриклеточных структур. 62

1.3. Ионофор-резистентные клетки. 65

1.4. Обсуждение результатов. 68

2. МЕХАНИЗМ ИНГИБИРОВАНИЯ ВХОДА Са2+ В КЛЕТКИ

АРАХИДОНОВОЙ КИСЛОТОЙ. 70

2.1 .Обсуждение результатов. 78

3. ВЗАИМОСВЯЗЬ ВХОДА Са2+, ВЫЗЫВАЕМОГО Са2+-М0БИЛИЗУЮЩИМИ

АГЕНТАМИ И ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ОТВЕТА КЛЕТОК. 82

3.1. Усиливающее действие Са2+-ионофоров на вызываемый форболовым эфиром

респираторный взрыв нейтрофилов. 83 3 .2. Роль экстраклеточного Са2+ в праймировании РМА-индуцируемого респираторного

взрыва Са2+-ионофорами. 88

3.3. Роль фосфолипазы кг и арахидоновой кислоты (АА) в усилении Са2+-ионофорами РМА-

индуцируемого респираторного взрыва. 89

3.4. Обсуждение результатов 90 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 93 ВЫВОДЫ 95 СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 96 СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 125

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АА - арахидоновая кислота (5,8,11,14-эйкозатетраеновая кислота);

АС - аденилатциклаза;

АКЭ - асцитная карцинома Эрлиха;

ATP, ADP - аденинтри и дифосфорная кислота;

BCECF/AM - -2', 7'-бискарбоксиэтил-5 (б)-карбоксифлуоресцеин ацетоксиметиловый эфир;

BCECF/FA - свободная кислота;

BHQ - 2,5-ди-(тетр-бутил)-1,4-бензогидрохинон;

BrPhBr - 4-бромофенацил бромид;

BSA - бычий сывороточный альбумин;

[Ca2+]j -внутриклеточная концентрация Са2+;

сАМР-циклический аденозинмонофосфат;

СО - циклооксигеназа;

СопА - конканавалин А;

DAG - 1,2-диацилглицерол;

EIPA - 5-(N-3tiw изопропил)-амилорид;

FCCP - карбонилцианид-р-трифторметоксифенилгидразон;

Fura -2/АМ - {1[2-(5-карбонилоксазол-2-ил)-6-аминобензафуран-5-окси]-2-(2'-амино-5'-метилфенокси)-этил-М,М,Ы',М'-тетрауксусная кислота} ацетоксиметиловый эфир; IP - инозитолфосфат; IPi - инозитолмонофосфат; 1Р3 - инозитол-1,4,5-трисфосфат; IP4 - инозитол тетракисфосфат;

HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота;

5-НЕТЕ - 58-гидрокси-5,8,11,13-эйкозатетраеновая кислота;

15-HETE - 158-гидрокси-5,8,11,13-(Z,Z,Z,E)- эйкозатетраеновая кислота;

LO - липоксигеназа;

LT -лейкотриен;

MX - митохондрия;

КАО(Р)Н-никотинамиднуклеотид (фосфат) восстановленный;

NADH - никотинамиднуклеотид восстановленный;

НЖК - ненасыщенные жирные кислоты;

NDGA - нордигидрогуаретиковая кислота;

PG - простагландин;

pH¡ - внутриклеточный рН;

PLA2 - фосфолипаза А2;

PLC - фосфолипаза С;

РМА - форбол 12-миристат 13-ацетат;

РКА - сАМР-зависимая протеинкиназа;

РКС - протеинкиназа С;

ТРА - 12-а-тетрадеканоил форбол-13-ацетат;

ТХ - тромбоксан;

EGTA - этилен-бис-(оксиэтиленнитрил)-тетрауксусная кислота; ХТЦ - хлортетрациклин; ЭР -эндоплазматический ретикулум.

ВВЕДЕНИЕ

Увеличение уровня цитозольного Са2+ ([Са2+]0 является одним из важнейших сигналов в системе внутриклеточной передачи информации. Поддержание кальциевого гомеостаза - тонкий, сложный, хорошо отрегулированный процесс, в котором принимают участие многочисленные Са2+-транспортирующие системы клетки. Хорошо установлено,

уч 2"i" л 2+

что агонисты активируют как выход Са из внутриклеточных запасов, так и вход Са из внешней среды. В электровозбудимых клетках вход Са2+ осуществляется по потенциалзависимым Са2+-каналам. Молекулярные механизмы, связанные с входом Са2+ в электроневозбудимых клетках изучены значительно меньше. В настоящее время предполагают, что одним из основных механизмов входа Са2+ в электроневозбудимые клетки является запас-оперируемый или "емкостный" вход Са2+, который регулируется степенью опустошения Са2+-депо (Berridge, 1997, 1998). Запас-оперируемый вход Са2+ является, по-видимому, универсальным механизмом входа Са2+ в невозбудимых клетках и обнаружен также в ряде возбудимых клеток. Для объяснения регуляции запас-оперируемых каналов предложено несколько альтернативных механизмов: 1) модель, предполагающая наличие структурного звена между внутриклеточными запасами С а2 и плазматической мембраной (ПМ) -"coupling model" (Kiselyov et al., 1998); 2) гипотеза о существовании растворимого вторичного мессенджера, осуществляющего связь между запасами Са2+ и ПМ, такие как "фактор входа Са2+" (Randriamampita and Tsien, 1993) или цитохром Р450 (Montero et al, 1992); 3) модель, указывающая на исключительную роль повышения цитозольной концентрации Са2+ в активации входа Са2+ (Haverstick & Cray, 1993; Трепакова и др., 1994). Однако данных, указывающих на определяющую роль одной из этих моделей неостаточно.

Для того, чтобы в экспериментальных условиях индуцировать запас-оперируемый вход Са2+ в клетку, применяются вещества различной химической природы, но обладающие одним общим свойством - способностью истощать внутриклеточные депо Са2+. Это могут быть как Са2+-ионофоры, блокаторы Са2+-АТРаз эндоплазматического ретикулума (ЭР), так и природные агонисты, способные мобилизовать Са2+ из внутриклеточных запасов. С этой целью наиболее широко применяются Са2+-ионофоры. Ранее считалось, что они повышают [Ca2+]i исключительно за счет транслокации комплекса с Са2+ через плазматическую мембрану. Однако оказалось, что способность

ионофоров имитировать рецептор-зависимый Са2+ сигнал обусловлена сложным и не до конца изученным механизмом активации природных Са2+ каналов ПМ и ЭР. Известно, что Са -ионофоры стимулируют образование арахидоновой кислоты (АА) (Sekar & Hokin, 1986; Pollock et al., 1986), которая, с одной стороны, способна повышать [Са2 ]; за счет мобилизации внутриклеточных Са2+-пулов (Volpi et al., 1980; Dettbarn & Palade, 1993) и стимулировать вход внешнего Са2+ (Alonso-Torre et al., 1990); а с другой стороны, АА способна подавлять повышение базального уровня [Ca2+]¡ под действием различных агентов (Трепакова, 1994; Alonso-Torre & Garcia-Sancho, 1997). Эти факты позволили предположить, что АА или ее метаболиты являются медиаторами входа Са24 при действии Са2+-мобилизующих соединений.

Однако, несмотря на многочисленность литературных данных, механизм, посредством которого мобилизация Са2+ из депо регулирует вход Са2+, а также физическая природа запас-опернруемых С а2 каналов остаются неясными.

Исходя из вышесказанного цель настоящей работы заключалась в изучении регуляции входа Са2' в электроневозбудимых клетках Са2+-мобилизующими агентами. Объектом исследования были клетки асцитной карциномы Эрлиха, перитонеальные нейтрофилы мыши, Т-лимфоциты мыши, макрофагоподобные клетки линии Р388Д1. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. На примере наиболее часто применяемых Са2+-мобилизующих агентов - Са2+-ионофоров -изучить механизм их активирующего действия на вход и мобилизацию Са2+ в интактных клетках.

2. Исследовать эффекты эндогенной АА и продуктов ее метаболизма в генерации Са2 -сигнала под действием Са2+-мобилизующих агентов в клетках АКЭ.

3. Идентифицировать возможные внутриклеточные мишени ингибиторного действия экзогенной АА на вход Са2' под действием Са2+-мобилизующих агентов.

4. Определить факторы, необходимые для усиления Са2+-ионофорами одного из основных функциональных ответов нейтрофила - респираторного взрыва нейтрофилов.

С помощью флуоресцентных Са2+-чувствительных зондов проведен детальный анализ способности Са2+-ионофоров повышать [Ca2f]¡ в цитозоле различных клеток. Показано, что зависимость уровня Са2+ от концентрации ионофора обычно носит нелинейный характер и не объясняется ионофорными свойствами антибиотиков. Вход Са2+ в клетки, активированный ионофором, ингибируется соединениями, блокирующими

рецептор-зависимым вход в эти клетки. Механизм действия Са2+-ионофоров на клетки зависит от концентрации ионофора. Показано, что ионофоры, мобилизуя Са2+ из ЭР, могут активировать вход Са2+ через Са2+-каналы плазматической мембраны по так называемому запас-регулируемому механизму. Применяя низкие дозы дигитонина, мы смогли рецептор-независимым способом увеличивать концентрацию Са2+ в цитозоле, не затрагивая при этом внутриклеточные пулы Са2+. Используя полученную нами зависимость активности 1Р;, рецептора от [Са2 ], мы показали на интактных клетках АКЭ, что мобилизация Са2+ при действии низких концентраций иономицина идет по 1Ря-зависимому механизму через активацию фосфолипазы С. Таким образом, показано активирующее действие низких доз Са2+-ионофоров на Са2+-транспортирующие системы клеток.

Обнаружено существование популяций иономицин-резистентных клеток в культуре Р388Д1 и в селезенке мышей. Показано, что механизм резистентности к ионофорам состоит в редуцировании таких Са2+-транспортирующих систем клетки, как ЭР и Са2' каналы ПМ.

Выявлен двойственный эффект эндогенной АА на вход Са2+, вызванный Са2+-мобилизующими соединениями. Эндогенная АА, образуемая при действии высоких концентраций иономицина, ингибирует вход Са2+ в клетки АКЭ. Продукт липоксигеназного окисления АА участвует в генерации Са2+-сигнала при действии низких концентраций иономицина.

Экзогенная АА блокирует запас-оперируемый вход Са2+ в клетки АКЭ, не влияя при этом на базальный уровень [Са2 ];. Ингибирующее действие АА не связано с ее окислением до эйкозаноидов. Показана корреляция между ингибированием входа Са2+ и степенью протонофорного разобщения окислительного фосфорилирования.

Показано, что основными факторами усиливающего действия Са2+-ионофоров на вызываемый форболовым эфиром респираторный взрыв в нейтрофилах, является вход Са2+ из внешней среды и образование эндогенной АА.

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Целью обзора было, во-первых, рассмотрение данных литературы, характеризующих современное представление о механизмах трансмембранной передачи сигнала, в которых Са2+ выступает в качестве вторичного мессенджера. В последнее время, все чаще, кальциевая система сигнализации выделяется в отдельную область внутриклеточной сигнализации. Поэтому, в литобзоре подробно рассмотрены Са2+-транспортирующие системы (глава 1) и механизмы регуляции входа Са2+ в электроневозбудимых клетках (глава 2). Механизмы поддержания низкой концентрации Са2+ в цитоплазме клеток рассматриваются в главе 3. О механизмах высвобождения ионов Са2+ из внутриклеточных депо под действием 1Р? сообщается в главе 4. Особый акцент сделан на анализе механизмов образования и метаболизма арахидоновой кислоты, ее роли в процессах внутриклеточной сигнализации (глава 5). В главе 6 охарактеризованы Са2+-ионофоры как инструмент для исследования роли Са2+. Что такое иммунная память и что является ее основой, на этот вопрос можно найти ответ в главе 7 литобзора.

1. Са2+-ТРАНСПОРТИРУЮЩИЕ СИСТЕМЫ КЛЕТКИ

Большинство процессов, регулируемых Са2+ контролируются внутриклеточными ионизированными концентрациями Са2+ в диапазоне 10"7 М, тогда как концентрация Са2+ во внеклеточной среде намного выше, около 10"3 М (Могс1еса1 е1 а!., 1982). С другой стороны, мембранный потенциал эукариотических клеток в покое составляет от -40 до -90 шУ (внутри отрицательно). Таким образом, катионы, такие как Са2+, будучи распределены согласно электрохимическому градиенту, должны присутствовать в цитоплазме в гораздо более высоких концентрациях, чем 10"7 М (Могёесш й а1., 1982; СагайэН, 1987). Однако Са2+ не распределен по потенциалу, а в клетках имеются механизмы, которые выводят ионы Са2+ наружу.

Эукариотические клетки содержат системы транспорта Са2+ в плазматической мембране, в митохондриях и в эндоплазматическом ретикулуме (СагайэН а1., 1978; исЫ:тап е1 а1., 1983). Как правило, плазматическая мембрана содержит три системы: Са2'-каналы, специфичную АТРазу и №+-Са2+ обменник (СагаБэН, 1978; Бйи^тапп, 1982).

Вход внеклеточного Са2+ по градиенту концентрации осуществляется, в основном, по Са2+-каналам плазматической мембраны. Выход Са2+ осуществляется Са2+-АТРазой и

Na+-Ca2f обменником плазматической мембраны. Низкий [Ca2+]i поддерживается также Са2-АТРазой эндоплазматического ретикулума (ЭР) и митохондриальнымн Са2+-транспортиругощими системами (Schatzmann, 1982; Mordecai et al., 1982; Carafoli, 1987).

2. МЕХАНИЗМЫ ВХОДА Ca2+ В КЛЕТКИ.

Наиболее важными мембранными структурами, контролирующими поток Са2+ через поверхностную мембрану, являются Са2+-каналы, представляющие собой гликопротеины высокой плотности. При активации каналы образуют мгновенные ионселективные поры, через которые ионы Са2+ проникают внутрь клетки по направлению градиента концентрации.

Существует три основных типа кальциевых каналов, классифицированные на основе их регуляторных механизмов - рецептор-управляемые (receptor-operated channels-ROC), потенциал-управляемые (voltage-operated channels-VOC) и запас-управляемые (store-operated channels-SOC).

2.1 Рецептор-управляемые Са2+-транспортирующие каналы плазматической

мембраны.

К рецептор-управляемым относятся проводящие Са2+ каналы, которые активируются исключительно по рецептор-опосредованному пути, а не в результате деполяризации плазматической мембраны. Различают три подгруппы рецептор-управляемых ионных каналов, участвующих в транспорте Са2+.

2.1.1. Истинные рецептор-управляемые каналы.

К этой подгруппе относятся каналы, в которых рецептор агониста либо сам выполняет функцию канала, либо непосредственно взаимодействует с канальной структурой. Прототипом для этих каналов послужил никотиновый холинорецептор, который сам непосредственно является неселективным катионным каналом (Popot & Changeaux, 1984). Никотиновый холинорецепторный канал проницаем для Са2+, однако в физиологических условиях он транспортирует преимущественно Na+ и К+. К числу истинных рецептор-управляемых каналов наряду с никотиновым холинорецепторным каналам относятся, по всей вероятности , каналы, активируемые глютаминовой кислотой (NMDA-рецепторы) и адениловыми нуклеотидами (Р2-пуринорецепторы). Са2+ каналы, активируемые

глутаминовой кислотой через рецепторы, агонистом которых является 1Ч-метил-0-аспартат (]ММОА) в электрофизиологическом плане изучены подробно (Соипап & 1уегзеп, 1987).

Активируемые адениловыми нуклеотидами кальциевые каналы были зарегистрированы первоначально в гладкомышечных клетках ушной артерии кролика (ВепЬат & Тэ1еп, 1987). Сопряженные с Р2-пуринорецепторами каналы были обнаружены в макрофагах (Нага е! а1., 1990), в тромбоцитах (МаЬаШ-ЗткИ е1 а1., 1990), сердце (Рпе1 &

Рис. 1. Механизмы и пути входа Са2+ при активации рецептора. Вход Са2 может происходить через рецептор-оперируемые каналы (ROC), G-белок-оперируемые каналы (GOC), каналы, активируемые вторичными мессенджерами - second-messennger-operated channel (SMOC) и каналы, регулируемые высвобождением Са2 из внутрик�