Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция входа Са2+ в электроневозбудимых клетках Са2+-мобилизирующими агентами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Регуляция входа Са2+ в электроневозбудимых клетках Са2+-мобилизирующими агентами"

РГ6 од

2 4 МАЙ 1999

На правах рукописи

ДЕДКОВА ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

РЕГУЛЯЦИЯ ВХОДА С;Г+ В ЭЛЕКТРОНЕВОЗБУДИМЫХ КЛЕТКАХ Са-+-МОБИЛИЗУЮЩИМИ АГЕНТАМИ.

Биофизика 03.00.02

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

V. Пущино 1999

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Зинченко В.П.

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук, профессор Печатников В.А. Кандидат биологических наук Гогвадзе В.Г.

Ведущая организация - Институт общей патологии и патологической физиологии РАМН

Защита диссертации состоится 1999 г. в $час на заседании специалюированнс

совета Д 200.23.01 по защите диссертаций по специальности "биофизика" при Институте биофизики клетки РАН, г. Пущино

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 14225 г. Пущино Московской области, ИБК РАН.

Автореферат разослан

МАРТА 1999 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических нау Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Увеличение уровня цитозолыюго Са2* ([Са2*],) является одним из важнейших сигналов в системе внутриклеточной передачи информации. Поддержание кальциевого гомеостаза - тонкий, сложный, хорошо отрегулированный процесс, в котором принимают участие многочисленные Са2*-транспортиругощие системы клетки. Хорошо установлено, что агонисты активируют как выход Са из внутриклеточных запасов, так и вход Са"* из внешней среды. В электровозбудимых клетках вход Са3* осуществляется по потенциалзависимым Са"*-каналам. Молекулярные механизмы, связанные с входом Са2* в электроневозбудимых клетках изучены значительно меньше. В настоящее время предполагают, что одним из основных механизмов входа Са2* в электроневозбудимые клетки является запас-оперируемый или "емкостный" вход Са2*, который регулируется степенью опустошения Са2*-депо (Berridge. 1997, 1998). Запас-оперируемый вход Са"* является, по-видимому, универсальным механизмом входа Са"* в невозбудимых клетках и обнаружен также в ряде возбудимых клеток. Для объяснения регуляции запас-опернруемых каналов (store-operated channels) предложено несколько альтернативных механизмов: 1) модель, предполагающая наличие структурного звена между внутриклеточными запасами Са2* и плазматической мембраной (ПМ) -"coupling model"; 2) гипотеза о существовании растворимого вторичного мессенджера. осуществляющего связь между запасами Са"* и ПМ. такие как "фактор входа Са_+" (Randriamampita and Tsien. 1993) или цитохром Р450 (Montero et al. 1992); 3) модель,

г* 2+

указывающая на исключительную роль повышения цитозольнои концентрации Са в активации входа Са2* (Haverstick & Cray. 1993; Трепакова и др.. 1994). Однако данных, указывающих на определяющую роль одной из этих моделей недостаточно.

Для того, чтобы в экспериментальных условиях индуцировать запас-оперируемый вход Са"* в клетку, применяются вещества различной химической природы, но обладающие одним общим свойством - способностью истощать внутриклеточные депо

Са" . Это могут быть как

блокаторы Са2*-АТРаз эндоплазматического ретикулума (ЭР). Са2*-ионофоры. так и природные агонисты. способные мобилизовать Са"* из внутриклеточных запасов. С этой целью наиболее широко применяются Са2*-нонофоры. Ранее считалось, что они повышают [Са"*], исключительно за счет транслокацин комплекса с Са"* через плазматическую мембрану. Однако оказалось, что способность ионофоров имитировать рецептор-зависимый Са"* сигнал обусловлена сложным и не до конца изученным механизмом активации природных Са- каналов ПМ ц ЭР. Известно, что Са2*-нонофоры стимулируют образование арахидоновой кислоты (АА) (Sekar & Hokin. 1986; Pollock et al.. 1986). которая, с одной стороны, способна повышать [Са-*], за счет мобилизации внутриклеточных Са"*-пулов (Volpi et al.. 1980; Dettbam & Palade. 1993) и стимулировать вход внешнего Са"* (Alonso-Тогте et al.. 1990); а с другой стороны. АА способна подавлять повышение базального уровня [Са"*], под действием агентов, инициирующих вход

Са~~ извне и выход Са"~ из внутриклеточных пулов (Трепакова. 1994; Alonso-Torre & García-Sancho. 1997). Эти факты позволили предположить, что АА или ее метаболиты являются медиаторами входа С а2* при действии Са2*-мобшизуюцшл: соединений.

Однако, несмотря на многочисленность литературных данных, механизм, посредством которого мобилизация Са2* из депо регулирует вход Са2*. а также физическая природа запас-оперируемых Са каналов остаются неясными.

Цель и основные задачи исследования. Целью работы было изучение регуляции входа Са2* в электроневозбудимых клетках Са"*-мобилизую1Цими агентами.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. На примере наиболее часто применяемых Са:+-мобилизующих агентов - Са2+-ионофоров -изучить механизм их активирующего действия на вход и мобилизацию Са2* в интактных клетках.

2. Исследовать роль эндогенной АА и продуктов ее метаболизма в генерации Са2*-сигнала под действием Са2*-мобилизуюших агентов и клетках АКЭ.

3. Идентифицировать возможные внутриклеточные мишени ингибиторного действия экзогенной АА на вход Са2* под действием Са2'-мобилизующих агентов.

4. Определить факторы, необходимые для усиления Са2*-ионофорами одного из основных функциональных ответов нейтрофила - респираторного взрыва нейтрофилов.

Научная новизна наботы. Впервые показано активирующее действие низких доз Са2*-ионофороа на Са^-транспортирующие системы клеток. Обнаружено существование клеток с редуцированной Са2*-системой передачи сигнала. Показано, что повышение уровня эндогенной АА способно ингибировать вход Са2' в клетки. Предложен вероятный механизм инпюирующего действия АА. Исследован механизм усиливающего действия Са2*-ионофоров на функциональный ответ клетки на примере респираторного взрыва, вызываемого форболовым эфиром в нейтрофилах мыши.

Научно-практическая ценность. Проведенные исследования вносят существенный вклад в представления о механизмах регуляции входа Са:* в электроневозбудимых клетках Са2*-мобилпзучошнми агентами. Исследований механизм активирующего действия Са2+-ионофоров позволит более корректно использовать данные вещества в экспериментальной практике. Полученные»=1__данные открывают новые возможности использования АА как высокоспецифичного ингибитора запас-оперируемых Са2*-каналов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 1, II, III Пушинских конференциях молодых ученых (Пущине, май 1996; Пущино. апрель, 1997; Пущино, апрель, 1998); на международных конференциях; "41 st Annual Meeting of Biophysical Society" (2-6 March 1997. New Orieans. Lousiana); "42nd Annual Meeting of Biophysical Society" (22-26 February 1998, Kansas City. Missouri). "25"' Siher Jubilee FEBS Meeting" (July 5-10. 1998, The Bella Center,

Copenhagen. Denmark). "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (21-25 сентября, 1998, г. Пущино). "1st International Conference on Signal Transduction" (8-11 October 1998, Dubrovnie, Cavrat, Croatia).

Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 печатная работа, из них 7 статей. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 150 страницах, включает 30 рисунков: состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных экспериментальных данных и irx обсуждения, заключения и выводов. Список литературы содержит 200 ссылок.

Список сокращений. АА-арахидоновая кислота; РЬАгфосфогшпаза А2; PLC-фосфолипаза С; LO-липокснгеназа; 1Рз-инозитол-1.-1.5-трисфосфат; NDGA-норгигидрогуаретиковая кислота; BrPKBr-4-Сромофенацил бромид; {Са"*], -концентрация Са2* в цитоплазме; ЭР эндоплазматический ретикулум. ПМ - плазматическая мембрана. MX - митохондрии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Работа выполнена на клетках асцитной карциномы Эрлиха. перитонеальных нейтрофилах мыши. Г-лимфоцитах мыши, макрофагоподобных клетках линии Р388Д. Клетки выделялись в стандартный солевой буфер, содержащий в мМ: NaCl-140. КС1-5.4. СаС12-1. MgSOj-1. KHiPO-j-1. Na:HP04-l. ЫаНСОз-1. Hepes-20. глюкозу-б. рН-7.2. Бескальциевая среда представляла собой стандартный солевой буфер не содержащий СаСЬ с добавлением 2 мМ ЭГТА.

Измерения (Са"*], и рН( проводили спектрофлуориметрически с помощью внутриклеточных ион-селективных флуоресцентных зондов Fura-2/AM (Tsien et al.. 1982) и BCECF/AM (Rink et al.. 1982). За перераспределением Ca"4" во в]гутриклеточных структурах следили с помощью флуоресцентного зонда хлортетрацикдина (ХТЦ). Функциональную активность нептрофилов оценивали по продукции активных форм кислорода (АФК) методом люмипол-зависнмой хеммлюмннсшсннпн (ХЛ).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

/. Ионофор-индуцируелшй ахw) Са" и клетка.

Основная часть экспериментов выполнена на клетках асцитной карциномы Эрлиха (АЮ). Эти клетки имеют па своей поверхности пурпнорецепторы Р;у-типа. которые активируются экзогенным ATP (Dubyak & DeYoung. 1985; Dubyak. 1986). Известно, что при активации клеток АТР быстрая фаза увеличения (Са"+], обусловлена мобилизацией Са'+нз ЭР, а медленная фаза (плато) активацией входа Са"+ снаружи (Gukovskaya & Zinchenko. 1990). Добавление иономнцина к клеткам ЛЮ приводит к повышению [Са2+], а цитозоле. однако характер повышения различен в зависимости от концентрации ионофора. На рис. 1.а показаны

типичные Са2* ответы в клетках АКЭ при добавлении различных доз ионофоров. Видно, что низкие концентрации ионофора вызывают только медленное увеличение Ca2t в цитозоле о выходом на плато (рис.1.а. кривая 1). Увеличение [Са2+], происходит за счет активации его входа снаружи, так как в бескальциевой среде добавление иономицина не вызывает изменений [Са2*],. Более высокие концентрации ионофора (IO''-Ю"6 М) индуцируют двухфазный ответ. Первая фаза обусловлена мобилизацией Са2+ из ЭР. а вторая фаза - поступлением Са2+ из внешней среды. При повышении концентрации ионофоров растут как амплитуда первой

Рис. 1. а -Изменения [Ca'*]i клеток АКЭ, окрашенных Fura-2 при действии различных концентраций иономицина:

1 - 10"9 М. 2 -10"7 М, 3 - 10"6М, 4 -10"s М.

б- Зависимость изменения амплитуды Са2+ сигнала (по флуоресценции Fura-2) клеток АКЭ в максимуме (1) и на плато (2) от концентрации иономицина.

(мобилизационной) фазы, так и второй - активации входа Са"+ снаружи (рис. 1,а. кривая 2). При дальнейшем повышении концентрации ионофора наблюдается подавление входа Са2+ снаружи (рис. 1.а. кривая 3). Ионофоры в концентрациях более 10'5 М повышают [Са2+], в клетках необратимо (рис. 1,а. кривая 4).

На рис. 1.6 приведены зависимости амплитуд первой (кривая 1) и второй фазы (кривая 2) Са"* ответа клеток АКЭ от концентрации иономицина. Видно, что зависимость амплитуды первой фазы от концентрации ионофора описывается S-образной кривой с насыщением, а амплитуда второй фазы, характеризующей вход Са2+ в клетку, проявляет более сложную зависимость. С ростом концентрации ионофора происходит рост [Са2+], в цитозоле, затем его падение, а за ним следует фаза активного роста [Са2*],. Наличие такой зависимости позволяет предположить, что генерация Са"+-сигнала обеспечивается не одним (ионофорным), а несколькими механизмами, вклад которых меняется при увеличении концентрации ионофора. 1.2. Влияние арахиОоновой кислоты (АА) и ингибиторов метаболизма АА на иономицин-индуцирп'еыый С а' -сигнал плеток.

Известно, что рецептор-зависимый вход Са~* в клетках АКЭ блокируется АА, а также ингибиторами фосфолиназы А: и липокенгеназы (Gukovskaya Si Zinchenko, 1990; Gukovskaya et al.. 1989). Поэтому, на данном нане была поставлена цель - выяснить возможное участие АА и ее метаболитов в иономицин-инлуцированном Са^-сигнале. Для исследования данного вопроса применяли два ингибитора: 4-бромофенацил бромид (BrPliBr) - ингибитор фосфолипазы Аг 4

0 2 4 Вреж»,мин

-11 -10 -9 -8 -7 -в -5 -4 [Иономшин], Log(M)

(Borin et al.. 1989; Chang & Muser. 1987) и нордигидрогуаретиковуго кислоту (NDGA) -ингибитор липоксигеназы (Vindlacheravu et al., 1991; Chang & Muser, 1987). Это позволило независимо оценивать вклад эндогенной АА (блокируя PLA2) и ее липоксигеназных продуктов 600Г

Рис. 2. а- Изменение в

клетках АКЭ под действием 10'9 M (3) и 10"7 M (1) иономишша в контроле и на фоне 10 мкМ NDGA (4 и 2, соответственно), б- Влияние 10 мкМ NDGA на иономицин-индуцированный Са2*-вход в клетки АКЭ. За 100% (в каждой точке) принята амплитуда Са2*-ответа без предварительной обработки NDGA.

0 2 4 6

Время, мин

-9-8-7-6-5 Иономицин, Log(M)

окисления в иономишш-индуцируемом Са"*-сигнале. Предварительная обработка клеток ЖЮА приводит к значительному снижению входа Са"* при действии низких концентраций иономишша (10~ч М). но практически не влияет на вход Са"\ индуцируемый более высокими дозами иономицина (10л М) (рис. 2.а). На рнс. 2.6 представлена зависимость степени ингибпрованпя входа Са"* ЫРОА от концентрации иономицина. Видно, что чем меньше концентрация иономицина. тем больше степень ингибирования иономицин-индуцированного входа Са" в клетки АКЭ. При концентрациях, близких к иономицина ингибпрованпя

практически не наблюдалось.

Ингибитор фосфолипазы А; - ВгРЬВг также ингибировал вход Са"* в диапазоне концентрации

10 -10 М иономицина. но а меньшей степени чем МОвА. Однако, начиная с 10" М иономишша и выше, ингибпрованпя входа Са"* не наблюдалось, а наоборот отмечалось 600 -

Иономицин

б

60

Ж) А

3

20 3

3

а

ос

0 s X

m о

-20 s ю

£

х

-Ю

-60

0 2 4 Время, мин

-8 -7 -6 -5 Иономицин, Log(r.T)

Рнс. 3 а- Изменение [Са ], в клетках АКЭ под действием И)"4 и 10"6 М иономицина в контроле (1 и 3, сответственно) и па фоне 10 мкМ ВгРЬВг (2 и 4, сответственно). б- Влияние 10 мкМ ВгРКВг на вход Са2*. вызываемый иономищшом в клетках АКЭ. За 100% (в каждой точке) принята амплитуда Са2*-ответа без предварительной обработки ВгРЬВг.

достоверное увеличение Са"*-огвета на 34+4% (рис. З.а). На рис. З.б представлена зависимость степени ингибировання входа Са"* в ответ на иономицин при блокировании Р1.А2 от

а

концентрации ионофора. Область концентраций иономицина, при которых наблюдается усиление входа Са"* в клетках, обработанных BrPhBr, совпадает с наблюдаемым ранее на рис. 1.6 подавлением входа Са"* в интактных клетках АКЭ. Поскольку прямыми измерениями показано накопление АА в различных клетках при действии ионофоров (Irvine. 1982; Sekar & Hokin. 1986; Pollock et al.. I9S6). можно предположить, что наблюдаемый эффект подавления входа Са2* при увеличении концентрации ионофора обусловлен интенсивным образованием АА - одного из природных эндогенных блокаторов Са2* какала плазматической мембраны (Трепакова и др.. 1994). Тот факт, что при блокировании PLA2 происходит снятие ингибирования иономпцин-индуцированного входа Са2*, наблюдаемого при добавлении высоких концентраций попомиинна. при которых NDGA практически не влияет на [Са2*],, говорит о том. что именно АА. а не продукты её окисления, блокирует вход Са2*.

Данные, представленные выше, свидетельствуют о вовлечении арахидоковой кислоты и лиггаоксигеназных продуктов ее окисления в формировании Са2*-сигнала в ответ на иономицин. Причем при низких концентрациях иономицина (10"'-10"7М) эндогенная АА усиливает вход Са*'. за счёт образования линокспгеназных продуктов и стимулирования ими дополнительного входа Са2* в клетку, а при более высоких концентрациях иономицина (выше 10"7 М) эндогенно-образуемая АА ингибирует эгот вход. В литературе существуют данные о двойственном эффекте экзогенной АА на рецептор-зависимый и депо-зависимый вход Са2+ (Трепакова и др.. 1994; Alonso-Torre & García-Sancho. 1997). Таким образом, вопреки распространенным представлениям, повышение [Са"*], под действием иономицина обусловлено не только ионофоретическнм переносом Са:* в клетку, но и активацией входа Са2* через Са2+-каналы плазматической мембраны, и участием в этом процессе эндогенной АА и её метаболитов.

Известно, что иономицин транспортирует не только Са2\ но и другие двухвалентные ионы, в частности, ионы Мп"". транспорт которых можно регистрировать по тушению флуоресценции Fura-2 (PíeilTer et al.. 197S). Нами показано, что в бескальциевой среде высокие концентрации (>1мкМ) поиомншша вызывают шщукшпо входа Мп** в клетки АКЭ, что не наблюдалось при снижении концентрации иономицина <10'7 М. Следовательно, высокие и низкие концентрации иономицина различаются по способности индуцировать селективный вход Са2*. Иономицин активирует вход Са2+. обеспечивая генерацию Са2+-сигнала, ко только в высоких концентрациях иономицин активирует транспорт ионов Мп2+. Известно, что рецептор-зависимый вход Са"* в кмегкп АКЭ происходит через высокоселективные Са2+-каналы. которые не транспортируют МзГ* и Sr' (Gnkovskaya & Zinchenko. 1990). Таким образом, иономицин в низких концентрациях активирует селективный вход Са2*. но не Мл2*. Такая селективность не характерна для ионофоретического переноса, индуцированного иономицином. и указывает на существование механизма повышения [Са~*],. не опосредованного ионофорным переносом Са2* при низких дозах иономнцина.

2. Ионофор-индуцируелгая мобилизация Си'' ш внутриклеточных структур.

Первая фаза увеличения Са2+ в цитозоле клеток АКЭ под действием иономицина в диапазоне 5-10"8М - 10'6М. также как и под действием АТР - агониста пуринорецепторов, носит временный характер и обусловлено мобилизацией Са2* из ЭР. Са2+-мобилизуюшие свойства ионофоров. не связаны с активацией рецепторов, поскольку протеинкиназа С- и сАМР-зависимое фосфорилпрование не действует на ионофор-индуцируемый сигнал, но подавляет Са2* сигнал на ATP (Gukovskaya & Zinchenko, 1990). Поэтому, учитывая, что в ряде клеток ионофоры активируют фосфоинозитидный обмен и образование инозитолтрисфосфата (Rittenhouse. 1984; Halenda &. Rubin. 1982), Са2<"-мобилизующие свойства ионофоров могут быть обусловлены их активирушим действием на фосфолипазу С. Для исследования вклада Независимого механизма в Са'^-мобилизугошую способность ионофоров измерения проводились с использованием хлортетрациклина. изменение флуоресценции которого отражает изменение Са"т во внутриклеточных структурах. На рис. 4 показано, что иономицин в низких концентрациях вызывает мобилизацию Са2* из ЭР клеток АКЭ. Амплитуда мобилизации Са2+ под действием 50 нМ иономицина сопоставима по амплитуде с максимальной мобилизацией,

Рис. 4 Мобилизация Са2+ из ЭР клеток АКЭ при действии 10 мкМ АТР (а) и 50 нМ иономицина (б), регистрируемая по флуоресценции ХТЦ, в контроле (кривые 1) и в присутствии 2-10"*% и 6AQa°/o дигитонина (кривые 2 и 3 соответственно). На кривых al и а2 в конце добавлен иономицин в концентрациях 5-10'8 и МО'6 М, соответственно. За 100% принят исходный уровень флуоресценции.

вызванной активацией луринорецепторов экзогенным АТР. Добавление АТР после иономицина, как и иономицина после АТР не вызывает дальнейшей мобилизации Са2+. Известно, что мобилизация Са"* под действием А'ГР происходит вследствие активации фосфолипазы С и образования (Wiener et al.. 1986: Gukovskaya & Zinchenko. 1990; Covven et al.. 1990). Таким образом, низкие концентрации иономицина и АТР мобилизуют Са2+ из одного и того же пула, вероятно, используя один м тот же lPj-завнспмый механизм.

Ранее на клетках АКЭ была обнаружена инактивация 1Рз-рецептора при повышении концентрации цитоллазматнческого Са"* (Зннченко. 1992). Мы предположили, что если повышение уровня цитозольного Са"+ будет ингибнровать индуцированный низкими концентрациями иономпцнна выход Са~* из ЭР. аналогично тому, как это происходит в случае активации клеток экзогенным АТР. и не ингибнровать индуцируемый высокими концентрациями иономицина выход Са~* из ЭР. то можно говорить о том. что выход Са"+ из ЭР

и в случае применения низких доз иономицина происходит по ^-зависимому механизму. [Ca2*]i повышали добавлением низких концентраций дигитонина в стандартную среду инкубации. Добавление таких концентраций дигитонина дозозависимо увеличивало [Са2*],, но не изменяло флуоресценции ХТЦ. В присутствии различных концентраций дигитонина измеряли скорость и амплитуду мобилизации Са2+ из ЭР при добавлении иономицина или АТР. На рис. 4 показано, что предварительное повышение [Ca2+]i снижает начальную скорость и амплитуду мобилизации под действием как иономицина. так и АТР. Последующее добавление большой концентрации иономицина вызывает выход остаточного Са2* по ионофорному механизму (кривая 2.а). Данные изменения скорости и амплитуды мобилизации Са2* из ЭР в зависимости от концентрации цнтозольного Са2+ суммированы на рисунке 5. Видно, что с увеличением уровня Са"' в цитозоле уменьшаются скорость (рис. 5,а), и амплитуда мобилизации Са2* из ЭР (рис. 5.6) как в случае иономицина. так и в случае АТР.

Рис. 5. Зависимость

максимальной скорости (а) и амплитуды (б) мобилизации Са2* из ЭР от [Са2*]; при добавлении 50 нМ иономицина (кружки) и 10 мкМ АТР (квадратики). [Са2*], изменяли добавлением различных концентраций дигитонина.

Зависимости ингибпрования были практически идентичны для обоих соединений. Концентрация полуингибирования составила 350-400 нМ. что совпадает с литературными данными, по регуляции 1Р.;-рецептора уровнем цитоплазматического Са2* (Dufour et al., 1997; Chang & Musser, 1987). Таким образом, мы получили доказательство того, что мобилизация Са2* из ЭР происходит по 1Рз-зависимому механизму, благодаря активации фосфолипазы С Са2* -ионофорами. Молекулярный механизм этой активации пока не известен.

Полученные результаты свидетельствуют о том. что при концентрациях ионофоров Ю'^-Ю"6 М удается выявить механизмы повышения [Са2*],. не связанные непосредственно с ионофорными свойствами антибиогнков. Дочовая зависимость Са2* ответа на иономицин показала, что можно выделить три концентрационные зоны, обладающие разным эффектом на клетки:

1. Зона низких концентрации нопофора - ионофор активирует природный Са2* канал.

2. Зона средних концентраций ионофора - ионофор активирует природную систему мобилизации Са"* из внутренних структур и через это дополнительный вход Са2* в клетку. В

данной зоне существует ооласть концентрации, которая характеризуется подавлением входа Са2* в клетки за счет образования эндогенных ингибиторов входа Са2+.

3. Зона высоких концентраций ионофора - Са2* переносится за счет ионофорных свойств соединения.

3. Нонофор-резистентные клетки

Обнаружено, что различные типы клеток отличаются по чувствительности к ионофору на несколько порядков. Под чувствительностью клеток к ионофорам мы понимаем способность последних повышать внутриклеточный Са~* посредством активации природных Са2+-транспортирующгх систем. К наиболее чувствительным относятся "наивные" Т-лимфоциты, тимоциты. нейтрофилы и клетки АКЭ. а к менее чувствительным Т-лимфоциты иммунной памяти и недифференцированные макрофагоподобные клетки линии Р388Д. Поскольку мы показали, что Са2+-ионофоры активируют природные Са2+-транспортирующие системы клетки: 1Р;-зависимую мобилизацию и вход Са~* через каналы ПМ. и учитывая, что в клетке существуют механизмы Са2*-зависимого усиления Са"*-сигнала (Са2+-зависимый выброс Са2+ из ЭР; Са"*-зависимый вход Са"* в клетки, регулируемый опустошением ЭР), можно предположить, что различная чувствительность клеток к ионофорам обусловлена наличием или

Рис. б. а-Зависимость уровня [Са2+], в Т-клетках памяти и "наивных" Т-клетках от концентрации иономицина. б -Увеличение уровня [Са~*], в Т-клетках памяти и наивных Т-клетках под действием 1 мкМ иономицина (Ионо) в бескальциевой среде. 1<Г М тимеросала (Тимер) и 10"5 М тапсигаргина (Тв) в Са"+-среде.

О -11 -10 -9 -а -7 -« Ионо Тимер ТС Иономицин, 1.од(М)

отсутствием соответствующих механизмов усиления Са"+-сигнала. Для экспериментального доказательства этого предположения был проведен сравнительный анализ Са2*-систем сигнализации "наивных" Т-лимфоцитов и Т-лимфоцитов иммунной памяти. Показано, что аналогичные концентрации ионофора повышают [Са'+], гораздо сильнее в наивных, чем в Т-клегках памяти (рис. 6.а). Следовательно. Т-клетки памяти являются резистентными к действию иономицина и наши результаты согласуются с данными (ЬШа & С1шзес1. 1988). Резистентность Т-клеток памяти к действию нономицина может быть обусловлена отсутствием запасов внутриклеточного Са~* в этих клетках. Чтобы это проверить, измерялись количества Са2+, мобилизуемого иономицином (1 мкМ) из внутриклеточных пулов обеих субпопуляцпй клеток в бескальциевой среде. Поскольку в этом случае исключается вход Са2* в клетки снаружи, то

амплитуда Са"*-ответа коррелирует с количеством Са2+ во внутриклеточных запасах. В этих условиях добавление иономицина вызывало увеличение [Са2*], в "наивных" Т-клетках до 400±35 нМ (рис.б.б). Существенных изменений этого параметра в Т-клетках памяти выявлено не было. Согласно нашей гипотезе, отсутствие внутриклеточных запасов Са2* влечет за собой отсутствие механизма индукции входа Са2* снаружи при действии Саг*-мобилизующих соединений. Ингибитор Са2"-АТРазы ЭР тапсигаргин (TG) вызывает мобилизацию Са2+ из ЭР и индуцирует вход Са~* в клетки (Tomquist et al.. 1994). Добавление 10"5 M TG вызывало быстрое увеличение [Са2*], до 931 ±52 нМ в "наивных" клетках и практически не оказывало влияния на [Са2*], в клетках памяти (рис. 6.5). Другой причиной отсутствия входа Са2* в клетки памяти может быть уменьшение проводимости плазматической мембраны для Са2*. Известно, что химическая модификация Са""-каналов гимеросалом. фиксирует их в открытом состоянии (Gukovskaya et al., 1992). Кроме того, тимеросал способен ингибировать активность Са2*-АТРазы Р-типа (Berridge. 1993). Инкубация наивных Т-клеток в течение 8 мин с тимеросалом в концентрации 10° M приводила к повышению [Са"*], до 1200±58 нМ, а клеток памяти-лишь до 280+17 нМ (рис. 6.6).

Таким образом, нечувствительность клеток к ионофору можно объяснить несколькими причинами: отсутствием Са'* во внутриклеточных пулах этих клеток, отсутствием самих пулов Са2*, уменьшением числа или снижением проводимости Са2+-каналов плазматической мембраны, регулируемых степенью заполненности ретикулума кальцием. 4. Механизм шиибироеаишi //хода Са2* в метках АКЭ арахидаиоаой кислотой.

При исследовании механизма ингибиторного действия АА на вход Са2* в клетки АКЭ сравнивали ее эффекты с эффектами классического разобщителя окислительного фосфорилировання -протоиофора FCCP. поскольку в последнее время широко обсуждается роль энергетического состояния клетки в регуляции запас-оперируемого входа Са2*. Так как на модельных системах показано, чго жирные кислоты, в том числе АА, также обладают протопофорным действием, мы предположили существование единого механизма подавления входа Са"* в клетки АА и FCCP. Наличие протонофорных свойств у АА подтверждается нашими данными по измерению pli, с помощью рН,-чувсгвительного зонда BCECF в клетках АКЭ. Обнаружено, что АА-стимулированное закисление значительно подавлялось в клетках, обработанных FCCP. Сам 1'ССР вызывал закисление цитоплазмы, что позволяет предположить одинаковый механизм понижения р| 1, под действием АА и FCCP.

Для того, чтобы прямо рассмотреть эффекты АА и FCCP на вход Са2* в клетку, были проведены эксперименты с использованием бескальциевон среды и последующим введением Са2* в среду с клетками. Добавление 1.5 мМ СаСЬ приводило к увеличению [Са2*],, которое в этих условиях отражает исключительно вход Са"* в клетки. Показано, что АА. как и FCCP дозозавнеимо снижали как начальною скорость, гак и амплитуду Са2*-ответа (рис. 7). При

обработке клеток 10 мкМ АА наблюдается одинаковый ингибирующий эффектна вход Са *, как и в случае применения 200 нм БССР. Ингибирующий эффект АА обусловлен самой АА, а не её метаболитами: добавление ЬГОСА (блокатора липоксигеназы) перед АА. не только не отменяет,

/ии Г"

500 Г

1 L-

200 Л / 4

\

100 J V [ / ^

A f 4

АТР АА, FCCP Са

Рис. 7. Эффекты АА и FCCP на запас-оиерируемыи вход Са"* в клетки АКЭ. Запасы Са"' истощали инкубацией клеток с 25 мкМ АТР в бескальциевой среде с 0,5 мМ EGTA. Вход Са"* индуцировали добавлением 1,5 мМ СаСЬ (1-контроль). За 2 мин до СаСЬ добавляли 5 мкМ АА (2), 10 мкМ АА (3), 200 нМ FCCP (4), 1 мкМ FCCP (5).

0 2 4 6 Время, мин

но и значительно усиливает эффекты АА. а добавление индометацина (ингибитора цнклоокснгеназы) перед АА не влияло на эффект АА.

В последнее время стало появляться всё больше информации о роли митохондрий (МХ), а точнее уровня энергизации клетки в регуляции Са"+-гомеостаза (СашЬепсс1 И а1., 1994; Крутецкая и др.. 1998). Известно, что МХ клеток АКЭ принимают активное участие в поддержании Са"*-гомеостаза н при активации АТР-рецептора временно захватывают до 30% выходящего из ЭР Са"* (Сико\'5кауа & Zmchenko. 1990). По изменению флуоресценции в области ЫАОИ можно судить о функциональном состоянии МХ и транспорте Са* в МХ (Зинченко и др., 1991). Известно, что МХ в клетках АКЭ в покое находятся в состоянии по дыхательному контролю, близком к 3-ему по Чансу (Тенлова и др.. 1977; Ягужинский и др.. 1979). когда ЫАОН частично окислен. Добавление олнгомнцина (ингибитора протонной АТР-спнтетазы) в этом состоянии вызывает восстановление ЫАОН. что приводит к росту флуоресценции примерно до исходного \ ровня и резкому торможению дыхания (Зинченко и др.. 1982). При помещении клеток АКЭ в стандартную среду инкубации вначале регистрируется высокий уровень флуоресценции в области МАОН. который падает до стационарного уровня в течение нескольких минут. Это свидетельствует о том. что МХ в таких условиях находятся в активном состоянии, контролируемом процессами окислительного фосфорилирования. При стимуляции пуринорецепторов клеток АКЭ экзогенным АТР в контроле наблюдается временное увеличение флуоресценции за счет входа Са"* в МХ. которое сменяется быстрым понижением флуоресценции, характеризующим скорость выхода Са2* из МХ благодаря работе Са2*/Н* и №*/Са"*-обменников (рис. 8.а) (Зинченко. 1992). Предварительная обработка клеток низкими концентрациями АА (10 мкМ) и РССР (200 нМ). вызывает окисление ИАЛН (рис. 8.б.в), но не

влияет на вход Са"~ в МХ. вызванный активацией пуринорецепторов, однако блокирует последующий выход Са~' из МХ. В случае применения больших концентраций РССР (1 мкМ) степень окисления ЫАОН возрастает примерно в 2 раза, при этом вход Са2+ в МХ полностью блокируется (рис. 8.г). Это не было неожиданным, поскольку искусственный протонофор РССР

Рис. 8. Изменение

флуоресценции клеток АКЭ в области NADH при добавлении 25 мкМ АТР (а), 10 мкМ АА и 25 мкМ АТР (б), 200 нМ FCCP и 25 мкМ АТР (в), 1 мкМ FC CP и 25 мкМ АТР (г), 1 мкМ олигомицина и 10 мкМ АА (д). В местах, где указано стрелками добавлен 1 мкМ ротенона (Rot). Ротенон был добавлен для калибровки NADH-сигнала флуоресценции.

является мощнейшим разобщителем окислительного фосфорилирования и в данной концентрации сбрасывает мембранный потенциал практически до нуля (Ягужинский и др., 1979). Вызванное АА окисление ЫАОН является олигомицин-нечувствительным, так как добавление 10 мкМ АА после олигомицина уменьшает флуоресценцию до уровня, который наблюдается при обработке клеток ЛА без олигомицина (рис. 8.д). Это говорит о том, что АА не действует непосредственно на И -АТРазу митохондрии. Неполное окисление ИАБН при действии АА в исследуемом диапазоне концентраций говорит о частичном разобщении окислительного фосфорилирования. В работе (Ягужинский и др., 1979) было показано, что при действии низких концентраций разобщителя РССР ускоряется дыхание МХ, а мембранный потенциал не падает (отрабатывается дыхательной цепью). Это и объясняет, почему аккумуляция Са:+ в МХ в о гнет на АТР. в присутствии АА и РССР. не уменьшается. Таким образом. АА частично разобщает окислительное фосфорилпрование, аналогично низким концентрациям классического ироюнофора. и способствует удерживанию Са2+ в митохондриях.

Известно, что РССР инпгомрует вход Са" в клетку за счет способности протонофора разобщать окислительное фосфорн.шрование в МХ. и. соответственно понижать энергетический уровень клетки (Оикочакач а & £пи:1тепко. 1991; ОатЬепса егак. 1994; Крутецкая и др.. 1998). На рис. 9 представлены кривые зависимости иншбнрования входа Са*+ в цитозоль и степени окисления ЫАОН от концентраций АА и РС'СР. соответственно. АА ингибирует вход Са"* с

K5II%= 6,5-10'6 M, a FCCP с К5о^= 1.13-10"7 М. Видно. кривые зависимости эффектов как АА (рис. 9.а). так и низких доз FCCP (рис. 9.6) на вход Са"* и окисление NADH практически идентичны,

Рис. 9. Зависимость степени ингибирования входа Са2+ (•) и окисления NADH (о) от концентрации АА (а) и FCCP (б), соответственно. Степень окисления NADH нормирована в каждом отдельном случае к максимальному значению флуоресценции.

т.е. наблюдается корреляция между степенью разобщения окислительного фосфорилирования и блокированием входа Са2*. Таким образом, механизм ингибирования входа Са2+ АА может быть связан с ее действием на энергетическое состояние клетки.

5. Усиливающее действие Са~*-иопофоров на вызываемый форболовьш эфиром респираторный взрыв в перитонеапьиых нейтрофилах мыши.

Многочисленные литературные данные свидетельствуют об активирующем действии Са~+-мобилизующих агентов на физиологические функции клеток. Такой эффект обычно связывали со способностью данных агентов мобилизовать Са2* из внутриклеточных пулов Са2+, имитируя действие инозитолтрисфосфата. Поскольку мы показали, что Са:+-иопофоры способны активировать природные Са2*-транспортирующие системы клетки и в регуляции этого процесса принимает участие арахидоновая кислота и ее метаболиты мы предположили, что данные элементы внутриклеточной сигнализации принимают участие и в активации функционального ответа клеток. Одним из основных функциональных ответов нейтрофилов является респираторный взрыв. С помощью вырабатываемых при этом активных форм кислорода (АФК), нейтрофилы уничтожают поглощенные ими микроорганизмы. Респираторный взрыв нейтрофилов инициировали активацией протеинкиназы С (РКС) форболовым эфиром (РМА). Интенсивность респираторного взрыва, оцененного по люминол- зависимой хемилюминесценции (ХЛ). зависела от концентрации РМА. Мы выбрали концентрацию PMA 1 мкМ. которая вызывает максимальный ответ нейтрофилов. Предварительная обработка нейтрофилов определенными концентрациями Са2+-ионофоров многократно усиливает респираторный взрыв в ответ на РМА (рис. 10.j, кривая 4) по сравнению с контролем (рис. 10,а, кривая 3). Са!+-ионофоры в низких концентрациях (менее 0,1 мкМ А23187 и менее 0,01 мкМ иономиципа) не изменяют уровень спонтаплой XJ1 нейтрофилов. В концентрациях выше указанных они являются слабыми активаторами, однако как показано на рис. 10.а кривая 2,

увеличение продукции активных форм О; (АФК) при действии одного ионофора не вносит вклада в усиление продукции АФК при последующем добавлении РМА. После кратковременного незначительного увеличения уровень продукции АФК снижается, и в дальнейшем не отличается от контроля. Поэтому, для определения суммарной продукции АФК обработанных Са2+-ионофорами нейтрофилов после активации посредством ФМА мы измеряли

Рис. 10. а - Демонстрация спонтанной XJI интактных клеток ( 1 ) и развития XJI ответа на добавление 500 нМ иономицина (2), 1 мкМ РМА (3) и последовательного добавления 500 нМ иономицина и 1 мкМ РМА (4). б - Зависимость величины коэффициента К от концентрации ионофоров. Для каждой точки усреднено 10 и более точек, указана средняя квадратичная ошибка.

[иомафор), Log|M)

интегральный ответ за 6 минут, пренебрегая ионофор-индуцируемыми изменениями XJI. На рис. 10.6 представлена зависимость суммарной продукции АФК в нейтрофилах от концентрации ионофоров. По оси ординат отложен коэффициент К. который показывает во сколько раз в присутствии ионофора изменяется ответ на РМА за указанный промежуток времени. Видно, что А23187 и иономицин увеличивают продукцию АФК. в концентрациях 0.05-2 и 0,001-0,5 мкМ, соответственно. Наиболее эффективными являются концентрации 2 мкМ для А23187 и 0,5 мкМ для иономицина. при которых наблюдалось увеличение продукции АФК более чем в 3 раза. При дальнейшем увеличении концентрации ионофоров наблюдается подавление реакции. J. /. Роль зкапраклеточного Са' в усилении Р МА-индуцируемого респираторного взрыва Са.''-ионофореши.

Для определения того, какой пул Са2* внешний или внутренний, играет роль в усилении продукции АФК Са" -нонофорами. мы сравнивали кинетику развития XJT реакции в среде, содержащей 1 мМ C'a"' (рис. 11: кривая 1) и в бескальциевон среде (рис. 11; кривая 2). В отсутствие внеклеточного Са"+ не наблюдалось усиления продукции АФК клетками, предварительно обработанных ионофором. в ответ на РМА. Эффект отсутствовал при использовании всех исследуемых концентрации ионофоров. Таким образом, несмотря на то, что данная концентрация А23187 повышала [Са2*], примерно до 400 нМ за счет мобилизации Са2* из внутриклеточных запасов усиливающий эффект ионофора отсутствовал. Следовательно, для усиливающего действия Са"*-ионофоров (иономицина и А23187) на РМА-индуцируемый респираторный взрыв недостаточно мобилизации Са2* из внутриклеточных запасов.

Респираторный взрыв, вызываемый РМА был менее чувствителен к отсутствию внеклеточного Са2* (кривые 1 и 3).

Рис. 11. Кинетика PMA-индуцируемого XJI ответа перитонеальных нейтрофилов в ответ на РМА в контроле (1, 3) и нейтрофилов, обработанных 1 мкм А23187 (2, 4). 1, 2 - в среде с Са2*; 3, 4 - в бескальциевой среде. Моменты добавки веществ указаны стрелками. __,

0 12 1

Чтобы показать, что именно вход Са" играет определяющую роль в усиливающем действии Са2*-ионофоров на вызываемую РМА продукцию АФК. внутриклеточные запасы Са2+ истощали инкубацией клеток в присутствии ЮО нМ иономишша и 50 нМ тапсигаргина в бескальциевой среде, содержащей 0.5 мМ EGTA. Через 15 минут в инкубационную среду добавляли различные концентрации CaCN и 1 мкМ РМА. и наблюдали за изменениями XJI ответа и [Са" ],. Добавление возрастающих концентраций СаСЬ в инкубационную среду

2000

Рис. 12. Зависимость изменения jo коэффициента К (1, левая шкала) и входа

Са"* (2. правая шкала) от концентрации 5 добавленного СаСЬ- Представлены средние ю значения по результатам 6 экспериментов,

а. указана средняя квадратичная ошибка.

1 1.» 2 з

Концентрация Са1*, мМ

приводило как к увеличению [Са2*],, так и к усилению PMA-индуцированного респираторного взрыва (рис. 12). Рассчет коэфицнента корреляции (R) между увеличением входа Са'* в клетки и изменением продукции АФК нейтрофилов в ответ на РМА при совместной активации с Са"*-ионофорами. показал, что между этими процессами существует положительная прямолинейная корреляция (R=0.8±0.15).

Таким образом, мы показали, что для усиления Са2*-ионофорамн РМА-индуцированной продукции АФК нейтрофилами требуется повышение [Са2*],, обусловленное входом Са"* в клетку, а не его выходом из внутриклеточных депо.

5.2. Роль фосфолипазы Ai и арахидоновой кислоты (АА,1 в усилении Са *-ионофорами РМА-инйуцируемого респираторного взрыва.

В процессах функциональной активности фагоцитирующих клеток большое значение имеет метаболизм арахидоновой кислоты. Нами показано, что липоксигеназный продукт окисления АА участвует в активации природного кальциевого канала нейтрофилов при действии иономицина и А23187 (Дедкова и др.. 1999). Известно также, что PLA2 является одним из ключевых ферментов, участвующих в активации нейтрофилов (Thelen et al, 1993). Для выяснения роли АА в ионофор-индуцируемом праймировании респираторного взрыва нейтрофилов наблюдали за развитием ионофор-праймированного РМА-активировашгого респираторного взрыва в присутствии ингибитора PLA2 бромофенацил бромида (BrPhBr). На рис. 13 представлена кинетика ХЛ реакции клеток, предварительно обработанных А23187 в присутствии 10 мкМ BrPhBr (кривая 2) и без блокатора (кривая 1). Обнаружено, что BrPhBr ингибировал продукцию АФК. клеток предварительно обработанных 1 мкМ А23187 на 54,4±4%. Здесь же показано влияние данного блокатора на развитие ХЛ реакции при активации клеток 1 мкМ РМА без обработки ионофором (кривая 4). Видно, что по сравнению с контролем (кривая 3) значительного снижения продукции АФК не происходит. Таким образом, блокирование

Рис. 13. Изменение продукции АФК нейтрофилов в ответ на 1 мкМ РМА (1), и клеток, предварительно обработанных 1 мкМ А23187 (3) без блокатора и на фоне блокатора фосфолипазы Аг - 10 мкМ ВгРЬВг, кривые 2 я 4 соответственно Моменты добавки веществ указаны стрелками.

Одного из путей образования АК приводит к заметному снижению продукции АФК нейтрофилов, обработанных А23 187. Аналогичные результаты были получены и при использовании иономицина для предварительной обработки клеток. Эффект ингибирования был сильнее выражен при использовании ионофоров в концентрациях, вызывающих максимальное усиление продукции АФК. Следовательно, эндогенно образуемая АК является одним из факторов, участвующих в процессе усиления Са2>-ионофорами РМА-индуцируемого респираторного взрыва.

выводы.

1. Показано, что механизм повышения [Ca"*], Ca" -ионофорами включает в себя помимо прямой транслокации Ca2*, активацию природных Ca"'-каналов плазматической мембраны и активацию фосфолипаза С-зависимой мобилизации Ca"* из эндоплазматического ретикулума.

2. Обнаружено существование популяций иономицин-резнстентных клеток в культуре Р388Д1 и в селезенке мышей. Показано, что .механизм резистентности к ионофорам состоит в редуцировании таких Са"*-трансп0ртир\10Щих систем клетки, как эндоплазматический ретикулум и Са"*-каналы плазматической мембраны.

3. Эндогенная АЛ. образуемая при действии высоких концентраций иономишша. икгибирует вход Ca"* в клетки АКЭ. Продукт липоксигеназного окисления АА участвует в генерации Са2*-сигпала при действии низких концентрации иономишша.

4. Экзогенная АА блокирует запас-оперируемый вход Ca2* в клетки АКЭ. не влияя при этом на базальный уровень [Ca"*],. Ингнбирующее действие АА не связано с ее окислением до эйкозаноидов. Показана корреляция между ингибированием входа Ca"* и степенью протонофорпого разобщения окислительного фосфорплирования.

5. Показано, что основными факторами усиливающего действия Са"*-ионофоров на вызываемый форболовым эфиром респираторный взрыв в иейтрофилах. является вход Ca2* из внешней среды и образование эндогенной АА.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ.

1. Дедкова H.H.. Сигова A.A.. Зинченко В.П. "О механизме активирующего действия Са2*-ионофоров на интактные клетки: ионофор-резистентные клетки." // Биологические мембраны, 1999, Т. 16, №3. в печати.

2. Дедкова H.H.. Аловская A.A.. Габдулхакова А.Г. "Механизм активирующего действия Са2+-ионофоров на интактные клетки. Различная чувствительность клеток к ионофорам." // Городская Научная Конференция Молодых Ученых. Пушимо, 15-17 мая 1996 года. С.ЗО.

3. Сигова E.H.. Дедкова E.H.. Зинченко В.П.. Литвинов u.C. "Редукция Са2*-транспортирующих систем вТ-клетках памяти." // Биологические мембраны, 1999. в печати.

4. Дедкова E.H.. Аловская A.A., Габдулхакова А.Г.. Сафронова В.Г.. Зинченко В.П. "Праймнрующее действие Са2*-нонофоров на РМА-индуцпруемый респираторный взрыв нептрофилов".//Биохимия. 1999. в печати.

5. Saf'ronova V.G.. Aknskaya A.A.. Gabdulliakova Л.G.. Dedko\a E.N.. Zinchenko V.P.. Chemeris N.K. "Priming mechanism of calcium ionoplioivs in activation of neutrophil respiratory burst."//41 st Annual Meeting of Biophysical Society. 2-6 March 1997. New Orleans. Lousiana. 4 Biophysical J„ 1997. Vol. 72. N. 2. Part 2 ot'2. \V-Pos274.

6. Dedkova E.. Sigova A„ Zinchenko V.. Litvinov I. "'A comparative study of calcium system in memory T-cells and naive T-cells" /7 1st International Conference on Signal Transduction. 8-11 October 1998. Dubrovnic. Cavrat Croatia.

7. Габдулхакова А.Г.. Аловская A.A.. Дедкова E.H. "Элементы механизма синергистпческой активации респираторного взрыва нептрофилов."// 2 открытая городская научная конференция молодых ученых города Пущпно. 23-25 апреля 1997 года. С.96.

8. Сигова A.A.. Дедкова E.H.. Зинченко В.II.. Литвинов И.С. "Причины резистентности клеток памяти к Са"*-нонофорам".// 2 открытая городская научная конференция молодых ученых города Пушнно. 23-25 апреля 1997 года.

9. Abdrasilov B.S.. Kim Yu.A.. Nurieva R.I., Dedkova E.N.. Leonteva G.A., Hwa-Jin Park. Zinchenko V.P.'The effect of total saponins from Panax Ginseng C.A.Meyer on the intracellular signalling system ¡11 F.hrlich ascites tumor cells. // Biochemistry and Molecular Biology International, 1996, Vol. 38, N. 3.P. 519-526

10. Нуриева Р.И.. Дедшва E.H.. Леонтьева Г.А.. Абдрасилов Ь.С., Хва Дин Пак, Ким Ю.А., Зинченко В.П. "Механизм активации клеток асцитной карциномы Эрлиха общей фракцией сапонинов из корейского женьшеня." /I Антибиотики и химиотерапия, 1995, Т. 40, № 11/12, С. 25-28.

11. Zinchenko V.P.. Mysyakin Ye.B.. Dolgachev V.A.. Dedkova E.N.. Safronova V.G., Gapeev A.B., Shebzukhov Yu.V., Vaisbud M.Yu. "The action of structural analogues of the platelet-activating factor on the transmission of intracellular signals in mouse peritoneal neutrophils and macrophages of the P388D1 line"//Biophysics. 1997, Vol.42.N. 5.P. 1097-1105.

12. Safronova V.G., Alovskaya A.A.. Gabdulhakova A.G., Dedkova E.N., Zinchenko V.P., Chemeris N.K. "Role extracellular calcium in priming of neutrophil respiratory burst by calcium ionophore." // 42nd Annual Meeting of Biophysical Society. 22-26 February 1998. Kansas City, Missouri. // Biophisical Journal. 1998. Vol. 74. № 2. Part 2 of 2. M-Pos 286.

13. Дедкова E.H.. Аловская. A.A.. Габдулхакова А.Г.. Сафронова В.Г., Зинченко В.П. "Кальциевые ионофоры в праймировании и активации клеток." // 3 открытая городская научная конференция молодых ученых г. Пущино. 27-30 апреля 1998 года, С. 111-112.

14. Дедкова Е.Н.. Мусиенко B.C.. Зинченко В.П. "Арахидоновая кислота ингибирует вход Са2+ и обладает протонофорными свойствами." // 3 открытая городская научная конференция молодых ученых г. Пущино. 27-30 апреля 1998 года. С. 145.

15. Сигова Е.Н.. Дедкова Е.Н.. Зинченко В.П.. Литвинов И.С. "Сравнительное исследование внутриклеточной системы сигнализации в Т-клетках памяти и наивных Т-клетках."// 3 открытая городская научная конференция молодых ученых г. Пущино. 27-30 апреля 1998 года. С.145.

16. Dedkova E.N.. Gabdulhakova A.G.. Alovskaya А.А.. Safronova V.G.. Zinchenko V.P. "Calcium ionophores in cell activation and priming" // 25l" Silver Jubilee FEBS Meeting, July 5-10, 1998, The Bella Center. Copenhagen. Denmark. P 6.51. P. 91.

17. Alovskaya A.A.. Dedkova E.N.. Safronova V.G. "Neutrophil respiratory burst: mechanism of inactivation." // 25'1' Silver Jubilee FEBS Meeting. July 5-10. 1998. The Bella Center, Copenhagen, Denmark. P 6.52. P. 91

18. Сигова A.A.. Дедкова E.H.. Зинченко В.П., Литвинов И.С. "Сравнительный анализ Са2* систем Т клеток памяти и наивных Т клеток." // 17 Съезд Всероссийского Физиологического Общества имени И.П. Павлова. Ростов-на-Дону, сентябрь 1998. тезисы докладов, С. 268-269.

19. Дедкова Е.Н.. Зинченко В.П. "Арахидоновая кислота ингибирует иономицин-индуцируемый и запас-регулируемый вход Са"* в клетки асцитной карциномы Эрлиха." // Международная конференция "Рецепция и внутриклеточная сигнализация". 21-25 сентября. 1998. г. Пущино. тезисы докладов, С. 15-17.

20. Сигова А.А.. Дедкова Е.Н.. Зинченко В.П.. Литвинов И.С. "Сравнительный анализ Са2+ систем Т клеток памяти и наивных Т клеток." // Международная конференция "Рецепция и внутриклеточная сигнализация". 21-25 сентября. 1998. г. Пущино. тезисы докладов. С. 52-55.

21. Sigova A.. Dedko\a Е.. Zinchenko V.. Litvincn I. "A comparative study of calcium system in memory T-cclls and naive T-cells"" U FEBS Lett.. 1999. in print.