Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Активность Са2+-АТФ-азы плазматических мембран лимфоцитов больных первичной артериальной гипертензией
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Беликова, Наталья Алексеевна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
Роль ионов Са2+ в жизнедеятельности клеток.
Поступление Са2+ в цитоплазму.
IP3-чувствительные Са2+-депо в лимфоцитах.
Рианодин-чувствительные Са2+-депо в лимфоцитах.
Каналы утечки («1еак»-каналы).
Система выведения Са2+-из цитоплазмы.
Са2+-АТФ-аза плазматических мембран (РМСА).
Са2+-АТФ-аза сарко/эндоплазматического ретикулюма.
Na+/Ca2+-o6MeHHHK.
Вклад митохондрий в снижение [Са2+]ю.
Первичная артериальная гипертензия.
Этиология и патогенез.
Молекулярные механизмы патогенеза ПАГ.
Величина базального уровня [Ca2+]i0 в клетках при первичной артериальной гипертензии.
Связь между [Са2+]| и [Na+]; при ПАГ.
Биологическое действие аллицина.
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Объект исследования.
Реактивы.
Оборудование.
Методика выделения лимфоцитов.
Расчет концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме лимфоцитов
Статистическая обработка результатов.
РЕЗУЛЬТАТЫ.
1. Характеристика обследованных людей.
1.1. Распределение больных ПАГ и здоровых людей по возрасту.
1.2. Распределение больных ПАГ по величине АД.
1.3. Связь АД с возрастом.
1.4. Связь систолического и диастолического АД.
2. Базальный уровень [Са2+]ю в лимфоцитах.
2.1. Изменение базального уровня с течением времени в пределах одной серии экспериментов.
2.2. Распределение здоровых и больных ПАГ людей по величине базального уровня [Са2+]ю.
2.3. Зависимость величины базального уровня [Са2+]ш в лимфоцитах от возраста.
2.4. Зависимость величины базального уровня [Са2+]ю в лимфоцитах от величины АД.
3. Действие тапсигаргина на Са2+-АТФ-азу внутриклеточных депо лимфоцитов.
3.1. Характер ответа на ТГ.
3.2. Концентрационная зависимость действия ТГ.
3.3. Параметры, определяемые по экспериментальной кривой действия ТГ
3.4. Воспроизводимость результатов в пределах одной серии экспериментов.
4. Вклад Ыа7Са2+-обменника в выведение Са2+ через плазматическую мембрану в условиях эксперимента.
5. Подбор экспериментальных условий для изучения активности Са2+-АТФазы плазматических мембран лимфоцитов in situ.
5.1. Влияние изменения градиента Са2! через плазматическую мембрану на работу РМСА.
5.2. Работа РМСА лимфоцитов, находящихся в среде с разной осмотичностью.
5.3. Влияние деполяризации мембраны на работу РМСА.
5.4. Влияние ингибиторов митохондрий на Са2+-ответы лимфоцитов.
6. Наличие в лимфоцитах ТГ-нечувствительных Са2+-депо и активность РМСА при увеличении A[Ca2+]j из разных источников.
6.1. Иономицин-чувствительные Са2+-депо в лимфоцитах человека.
6.2. Кофеин-чувствительные Са2+-депо в лимфоцитах человека.
7. Действие аллицина на [Са2+]; в лимфоцитах, находящихся в среде не содержащей ионы Са2+.
7.1. Действие аллицина на ТГ-чувствительные Са2+-депо.
7.2. Действие аллицина на ИМ-чувствительные Са2+-депо.
8. Содержание Са2+ в ТГ-чувствительном Са2+-депо.
8.1. Распределение больных ПАГ и здоровых людей по параметру содержания Са2+ в ТГ-чувствительном Са2+ -депо в лимфоцитах.
8.2. Возрастной анализ содержания Са2+ в ТГ-чувствительном Са2+-депо
8.3. Сопоставление содержания Са2+ в ТГ-чувствительном Са2+-депо в лимфоцитах и величины систолического и диастолического давления.
8.4. Абсолютное значение увеличения [Са2+]; при действии ТГ.
8.5. Содержание Са2+ в ТГ-чувствительном Са2+-депо и величина базального уровня [Ca2+]i0 в лимфоцитах.
9. Скорость работы РМСА в условиях максимального увеличения [Са2+^ в условиях эксперимента.
9.1. Распределение здоровых и больных ПАГ по параметру максимальной скорости работы РМСА в лимфоцитах.
9.2. Зависимость максимальной скорости РМСА от возраста.
9.3. Анализ максимальной скорости работы РМСА и величины артериального давления.
9.4. Максимальная скорость работы РМСА и величина базального уровня [Ca2+]i0 в лимфоцитах.
9.5. Связь максимальной скорости работы РМСА с величиной содержания Са2+ в ТГ-чувствительного депо лимфоцитов.
10. Запуск работы РМСА лимфоцитов человека, регулируемый увеличением
Са21.
10.1. Распределение здоровых и больных ПАГ по значению A[Ca2+]t пуск.
10.2. Анализ величины АД в зависимости от A[Ca2+]j пуск.
10.3. Корреляция величин начала запуска РМСА и базального уровня Са 'Л VI
10.4. Связь между величиной запуска РМСА A[Ca2+]inycK и величиной содержания Са2+ в ТГ-чувствительном Са2+-депо.
10.5 Корреляция величин запуска РМСА и максимальной скорости работы РМСА.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
Нарушение в регуляции [Са2+]; как причина ПАГ.
Клинические проявления ПАГ и связь с возрастом величины АД.
Базальный уровень [Са2+]ю в лимфоцитах при ПАГ.
Создание модели для исследования системы выведения Са2+ из цитоплазмы
Скорость работы РМСА в условиях эксперимента.
Вклад митохондрий в выведение Са2+ из цитоплазмы.
Существование в лимфоцитах ТГ-нечувствительных Са2+-депо.
Аллицин - ингибитор РМСА.
Содержание Са2+- в ТГ-чувствительном Са2+-депо.
Скорость работы РМСА в условиях полного опустошения Нечувствительного Са2+-депо.
Запуск работы РМСА лимфоцитов человека, регулируемый увеличением
А[Са21.
ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Активность Са2+-АТФ-азы плазматических мембран лимфоцитов больных первичной артериальной гипертензией"
По данным медицинской статистики артериальная гипертензия является причиной смерти 4-5 % умерших [11]. Примерно 40 % от всех болезней сердечно-сосудистой системы составляет артериальная гипертензия. Она является основным фактором риска развития ишемической болезни сердца, а также может привести к другим опасным патологиям - инфаркту миокарда и инсультам.
Выделяют первичную артериальную гипертензию (ПАГ), или непосредственно гипертоническую болезнь (в зарубежной литературе принят термин эс-сенциальная гипертензия), и вторичную гипертензию, при которой увеличение АД является лишь симптомом основного заболевания. Проявление ПАГ зависит от наличия сопутствующих факторов риска - избыточной массы тела, сахарного диабета, чрезмерного потребления поваренной соли, воздействия постоянных стрессовых ситуаций, гиподинамии. Для объяснения патогенеза ПАГ предложено несколько гипотез, предметом дискуссии которых является, главным образом, сущность пускового патогенетического звена ПАГ. Однако вне зависимости от первопричины, увеличение АД может быть объяснено двумя механизмами - физиологическим увеличением сердечного выброса и нарушением расслабления гладких мышц стенок периферических сосудов. Оба эти процесса являются Са2+-зависимыми - сила сокращения сердца регулируется увеличением внутрицитоплазматической концентрации Са2+ ([Са2+]^ в кардио-миоцитах, а расслабление сосудов - удалением Са2+ из цитоплазмы, т.е. снижением [Са2+];.
Согласно гипотезы Ю.В. Постнова о нарушении функций мембранных ионных насосов, первичным фактором в патогенезе ПАГ является наследственный мембранный дефект транспортных систем [14]. В гладкомышечных клетках стенок артериол этот дефект приводит к накоплению избытка катионов в цитоплазме, что приводит к спазму сосудов, а также к повышению чувствительности клеток к внешним воздействиям. Поскольку этот дефект генетически
10 наследуется, и является системным, он может проявлять себя и других клетках - в том числе в лимфоцитах [24], [111].
Система, выводящая Са2+ из цитоплазмы, универсальна - во всех клетках организма она представлена Са2+-АТФ-азой сакро/эндоплазматического рети-кулюма (SERCA), а в плазматической мембране Са2+-АТФ-азой (РМСА) и Ка7Са2+-обменником (NCX) в различном соотношении [38], [39], [58], [52]. Их совместная работа направлена на поддержание [Са2+]; на низком уровне -50200 нМ [58], [39], [142]. Возможно, при генетическом дефекте в каком-либо из этих механизмов, и/или нарушении компенсации выведения Са2+ другими, наступает состояние декомпенсации и болезни [27], [24].
В связи с этим представляет интерес оценить работу каждого компонента Са2+-выводящей системы, а именно РМСА как повсеместно распространенного насоса. Установлено, что во время выделения ферментов из клетки, они меняют свою активность, поэтому изучение Са2+-транспортной системы in situ является более адекватным. В результате открытия веществ, избирательно блокирующих SERCA [184], [138], [195], [175], создались объективные предпосылки изучать транспорт Са2+ через ПМ. Вклад NCX в выведение Са2+ можно легко оценить при помещении клеток в среду, в которой он не работает, и сравнении выведения Са2+ в обычных и этих условиях. Таким образом, в экспериментальных условиях можно изучать активность РМСА in situ, а также исследовать влияние различных химических веществ на скорость ее работы.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Роль коков Са2+ в жизнедеятельности клеток
Все, что ни делается в живом организме на разных уровнях организации -зарождается ли новая жизнь или гибнет клетка, передвигается ли целый организм в пространстве, или происходит сложный процесс творчества, все это так или иначе связано с изменением локальной концентрации ионов кальция [38], [52]. В 1882 году Сидней Рингер первым показал важность кальция как химического элемента в функции клеток. Он обнаружил, что кальций необходим для сокращения сердца и описал его роль в течение развития оплодотворенной яйцеклетки, а также доказал, что кальций необходим для клеточной адгезии . Позже, в 20-х годах прошлого столетия стало очевидно, что внутриклеточные ионы Са2+ является связующим звеном между клеточными рецепторами и физиологическими ответами клетки (подобно секреции и клеточной подвижности) [142]. В настоящее время известно, что изменение внутриклеточной концентрации Са2+ - Л[Са2+^ играет важную роль во всех процессах в клетке - росте, делении, возбудимости, сокращении, секреции и многих других (обзоры [142], [58], [39]).
Почему клетка использовала именно Са2+ в качестве универсального регулятора? Высказывалось предположение, что первоначально клетка пыталась избавиться от ионов Са2+, потому что они образуют плохо растворимые комплексы с фосфатами, а именно фосфаты используются для создания и накопления богатых энергией соединений, необходимых для жизнедеятельности. Одновременное существование внутри клетки фосфатов и Са2+ в высокой концентрации приводило бы к выпадению в осадок солей фосфата кальция и парализовало бы клетку.
Базальный уровень [Са2+]ш в клетках составляет величину около 100 нМ [39], что почти в 10 ООО раз меньше концентрации свободных ионов Са2+ снаружи клеток и концентрации Са2+ во внутриклеточном Са2+-депо, образованном эндоплазматическим ретикулюмом (ЭР). Такое неравенство является результатом ограниченной проницаемости для Са2+ плазматической мембраны (ПМ) и мембраны ЭР, и активных процессов выведения Са2+ наружу и внутрь ЭР. Физические, электрические и химические стимулы вызывают увеличение [Са2+^ в цитоплазме как напрямую, в результате поступления через ПМ снаружи, так и через образование дополнительных медиаторов, мобилизующих Са2+ из внутриклеточных Са2+-депо. Уровень [Са2+]| определяется в результате баланса поступления, выведения, аккумуляции Са2+ внутри клеточных органелл и связывания с Са2+-связывающими белками (рис. 1). Хотя все эти процессы разделены, они могут взаимодействовать друг с другом и тонко регулировать уровень
Са2+],.
Са*]= 1,3* 10"3М
Рецептов
Са2+
Na+/K+ Na+/Ca2+
AT Ф- аза обменник РМСА Са2+ у? Na+ Na+ Са2связывающие белки
Са1*]» 10"7М
Са2+
ЭР/СР каналы утечки
Рис. 1. Схема обмена Са2+ в клетке [4], [39], [1].
Используемые сокращения: ПМ - плазматическая мембрана, ЭР/СР - эн-до/саркоплазматический ретикулюм, PLC - фосфолипаза С, 1Р3 - инозитол трисфосфат, IP3R - рецептор к инозитол трисфосфату, RyR - рецептор к риано-дину, SERCA - Са2+-АТФ-аза сарко/эндоплазматического ретикулюма, РМСА -Са2+-АТФ-аза плазматических мембран.
Поступление Са2+ в цитоплазму
Так как градиент Са2+ через ПМ и мембрану ЭР выражен в значительной степени (104 М) нет необходимости активно транспортировать Са2+ - при действии стимулов он входит в цитоплазму пассивно, по электрохимическому градиенту. На плазматической мембране клеток для входа Са2+ существуют специальные белковые структуры - каналы: потенциал управляемые Са2+-каналы (VOC - voltage operated Ca2+-channel), рецептор управляемые Са2+-каналы (ROC - receptor operated Ca2+-channel), каналы, управляемые вторичными мессендже-рами (SMOC - second messenger operated Ca2+-channel), а также каналы, управляемые внутриклеточным Са2+-депо (SOC - store operated Ca2+-channel).
По последним данным, в лимфоцитах основное значение для поступления Са2+ внутрь цитоплазмы через ПМ играют SOC-каналы [132], [90].
На мембране ЭР помимо специальных каналов (канала, связанного с рецептором к инозитол трисфосфату IP3R и канала, связанного с рецептором к рианодину RyR) существуют еще так называемые каналы утечки - «leak»-каналы [35], [33]. Рассмотрим каналы внутриклеточных Са2+-депо подробнее. IP3-чувствительные Са2+-депо в лимфоцитах
Связывание многих гормонов и факторов роста со специфическими рецепторами на ПМ ведет к цепи событий внутри клетки. В Т-лимфоцитах, которые составляют основную массу лимфоцитов, циркулирующих в периферической крови, рецептором к антигенам на ПМ является комплекс TcR-CD3 [18]. Антигенная детерминанта связывается непосредственно с TcR, а молекулы митоге-нов - с кластером дифференцировки CD3, в результате этого протеин киназа, связанная с CD3, фосфорилирует фосфолипазу Су по остатку тирозина. При активации фосфолипазы Су происходит гидролиз фосфоинозитидов, которые являют собой фосфолипиды с гидрофильной частью, представленной шестиугле-родным спиртом инозитолом. Один из продуктов гидролиза, инозитол 1,3,4-трисфосфат (1Р3) водорастворим и легко диффундирует к ЭР и связывается со своим рецептором - 1Р3Я. Это связывание изменяет конформацию 1Р3Я таким образом, что открывается канал, позволяя тем самым выходить Са2+ из внутриклеточного депо в цитоплазму [17], [131]. 1Р311 представляют собой большие структуры (молекулярная масса -1200 Ша), состоящие из четырех субъединиц. Известны три различных гена, кодирующие эти субъединицы. Рецепторы, кодируемые различными генами, отличаются друг от друга по некоторым характеристикам, в том числе по афинности к инозитол 1,4,5-трисфосфату [62]. Рианодин-чувствительные Са2+-депо в лимфоцитах
В мембране сарко- и эндоплазматического ретикулюма эукариотических клеток описано существование рецепторов к растительному алкалоиду риано-дину [58]. Связывание рианодина с рианодиновыми рецепторами (ЯуК) переводит каналы в открытое состояние [196]. Низкие концентрации рианодина (1 -10 мкМ) переводят рианодиновые каналы в длительно существующее низко проводимое состояние, опустошая внутренние Са2+-депо, а высокие концентрации рианодина 100 мкМ) необратимо ингибируют открывание канала.
Рианодиновые рецепторы также активируются миллимолярными концентрациями кофеина. Активация происходит из-за увеличения сродства рианоди-новых рецепторов к Са2+ в присутствии кофеина, так что базальные концентрации Са2+ становятся активирующими [174], [167].
Рианодиновые рецепторы структурно и функционально гомологичны 1Р311. Также они имеют сходную чувствительность к цитозольным концентрациям Са2+, хотя они активируются и ингибируются более высокими концентрациями Са2+ (активация 1-10 мкМ; ингибирование >10 мкМ). Как и 1Р3К, субъединицы ЯуЯ кодируются тремя генами. В отличие от 1Р311, которые почти одинаково представлены во всех клетках тканей млекопитающих, RyR преимущественно встречаются в возбудимых клетках, таких как мышечные и нервные. Лишь недавно было обнаружено наличие этих рецепторов (типа 2) в невозбудимых клетках, в том числе и в лимфоцитах [109], [100], [112].
Механизм опустошения внутриклеточных Са2+-депо, чувствительных к рианодину, следующий. В сердечной мышце второй тип рианодиновых рецепторов (RyR2) активируется вслед за деполяризацией сарколеммы. Ионы кальция, которые входят в мышечные клетки, в результате активации потенциал управляемого канала, запускают выход Са2+ из саркоплазматического ретику-лума через рианодиновые рецепторы 2 типа. Этот процесс получил название Са2+ индуцированного выхода Са2+ (CICR- calcium induced calcium release) [39]. Высвободившиеся ионы кальция способны переноситься путем диффузии к миофибриллам, где они вызывают взаимодействие между актином и миозином, что и лежит в основе сокращения.
В скелетных мышцах генерация Са2+ сигнала осуществляется в два этапа. Деполяризация сарколеммы ведет к активации 1 типа рианодиновых рецепторов (RyRl) в результате прямого физического контакта этих рецепторов с потенциал управляемыми кальциевыми каналами (VOC - L-типа). Конформаци-онные изменения в этом типе каналов непосредственно передаются на рианодиновые рецепторы 1 типа, что вызывает их переход в открытое состояние и выход Са2+ по этим каналам.
Физиологическим агентом, действующим на RyR, по последним данным является циклическая АДФ-рибоза [98], [99]. Каналы утечки («1еак»-каналы)
Каналы пассивной утечки Са2+ были описаны в сарко/эндоплазматическом ретикулюме различных типов клеток [35], [33], [180]. Наиболее характерным признаком этого канала является его существование в открытом состоянии, которое не подвержено регуляторному воздействию других агентов [39].
Система выведения Са2+-из цитоплазмы
Механизмы выведения Са2+ универсальны во всех клетках - это Са2+-АТФ-аза плазматических мембран (РМСА), Са2+-АТФ-аза сарко/эндоплазмаического ретикулюма (8Е11СА) и Ыа+/Са2+-обменник плазматической мембраны, использующий для переноса Са2+ из области меньших концентраций в большие (против градиента концентрации Са2+) градиент ионов [58], [52],[39]. Роль ядра, аппарата Гольджи, эндосом и других мембранных структур в обмене ионов Са2+ незначительна. Митоходрии также не являются Са2+-выводящей системой, поскольку не способны активно аккумулировать Са2+ на длительный срок [68], [97], [160].
Са2+-АТФ-аза плазматических мембран (РМСА)
Са2+-АТФ-аза плазматических мембран эритроцитов впервые была описана в 1966 году [172]. Этот фермент распространен повсеместно - он был найден во всех клетках эукариот [63], [201], [94], [141], [53]. Строение РМСА
Са2+-АТФ-аза плазматических мембран состоит из 10 трансмембранных доменов, одной небольшой внеклеточной петли и большой внутрицитоплазма-тической петли, которая представляет около 80% всей массы фермента (рис. 2). Цитоплазматические петли содержат АТФ-связывающую область, кальмоду-лин связывающий домен и участок фосфорилирования протеин киназами А и С (РКА и РКС), а также участок регуляции активности фермента кислыми фос-фолипидами. л
•У »
SS »
I 3 » ¿8 v tu 1 "< * f < щр ф f & * V 1
IS t, •I i ш ем а вжаэ» fr 1Э9Т МЛУО FÖliffflAfM» V» *
Рис. 2. Схема строения Са2+-АТФ-азы плазматических мембран [140]. Механизм переноса ионов Са2+
РМСА принадлежит к Р-типу семейств АТФ-аз, которые способны утилизировать энергию АТФ для транспорта ионов против их электрохимического градиента через мембрану. Цикл работы АТФ-азы включает формирование и распад промежуточного фосфорилированного состояния по аспартату. Фермент, который может существовать в двух промежуточных состояниях (El и Е2) с различной аффинностью для Са2+, подвергается конформационному изменению для осуществления транспорта ионов Са2+ [128], [106]. Экспериментальные данные показали, что в нервных клетках, насос функционирует как электрогенный Са2+/Н+ обменник со стехиометрией 1:1 [170]. В мембранах эритроцитов этот насос электронейтрален [147]. На 1 моль перенесенного Са2+ затрачивается 1 моль АТФ. Работа фермента состоит из 6 стадий [95] (рис. 3).
1 - связывание иона Са2+ на поверхности АТФ-азы, обращенной в цитоплазму; 2 - связывание на той же поверхности молекулы АТФ; 3 - фосфорилирование белка (образование фосфо-фермента) и высвобождение АДФ; 4 - высвобождение ионов Са2+ с поверхности АТФ-азы, расположенной наружу клеток; 5 - освобождение фосфатного остатка; 6 - переход молекулы фермента в исходное состояние (центры связывания кальция оказываются опять на цито-плазматической поверхности мембраны).
Регуляция активности РМСА
Активность РМСА находится под влиянием большого числа агентов, в том числе кальмодулина, кислых фософолипидов, длинных полиненасыщенных жирных кислот [201], [141], [155], [7]. РМСА в состоянии покоя имеет низкую аффинность для Са2+, и может быть неактивна при физиологических концентрациях Са2+ в цитоплазме . Кальмодулин увеличивает аффинность и Кт уменьшается с 10 мкМ до 0,2 мкМ [53], [54]. Это связано с особенностью строения фермента - в неактивном состоянии активный центр фермента закрыт аутоингибиторным участком [19], [73]. При связывании РМСА с комплексом Са2+-кальмодулин изменяется конформация молекулы, ингибирование снимается, и АТФ-аза начинает работать более эффективно [54], [74].
В работе на фосфолипидных везикулах было показано, что кислые фосфо-липиды активируют насос в концентрациях, близким к физиологическим [146]. Скорость работы РМСА также изменяется при олигомеризации и фосфорилировании протеин киназами [127], [126]. In vitro Са2+-активируемая внутриклеточная протеаза кальпаин может стимулировать насос в результате протеолиза [21], [118]. Это происходит из-за отщепления от молекулы РМСА участка связывания с комплексом Са2+-кальмодулин, и снятием аутоингибиторного блока. Изоформы РМСА
Изоформы РМСА кодируются четырьмя различными генами рмса1-4. В литературе описано существование более 26 вариантов фермента, получаемых вследствие альтернативного сплайсинга [123], [94]. Локализация генов РМСА человека описана Wang [193], таблица 1.
Таблица 1.
Локализация генов РМСА человека
Ген Хромосома Локус рмса1 12 q21-q23 ршса2 3 р26-р25 ршсаЗ X q28 ртса4 1 q25-q32
Распределение форм РМСА по тканям человека
Существенная роль РМСА находит свое отражение в повсеместной распространенности этого фермента среди многих типов клетки. Распределение изоформ РМСА по локализации в тканях человека представлено в обзорах [182], [94], [96]. Изоформы 2 и 3 представлены в нервных тканях (кора головного мозга, мозжечок, продолговатый мозг). Изоформы 1 и 4 повсеместно распространены во всех тканях организма.
Количество РМСА в клетках редко превышает 0,1-0,3 % от общего количества мембранных белков. Это значение может быть выше в нервных клетках [181].
Процессы фосфорилирования в регуляции активности РМСА.
В настоящее время установлено, что почти все события в функционировании клеток регулируются процессами фосфорилирования-дефосфорилирования. Са2+ насос также является мишенью для действия протеин киназ. Участок С-конца Са2+-АТФ-азы является регуляторным регионом и состоит из аутоингибиторного участка с высокоаффинным участком связывания кальмодулина, участком связывания кислых фосфолипидов, и последовательностью, которая является потенциальной мишенью для фосфорилирования протеин киназами [141]. В различных вариантах РМСА участок цепи, фосфо-рилируемый протеин киназами не является консервативным и фосфорилирова-ние может по-разному регулировать активность насоса [155]. Хотя многие детали остаются невыясненными, важность механизма такой регуляции несомненна.
Первое сообщение, описывающее активацию кальциевого насоса мембран эритроцитов с помощью сАМФ-зависимой протеин киназы (РКА) появилось в 1985 г. [145]. Позднее было установлено, что РКА фосфорилирует сериновый остаток, локализованный в кальмодулин-связывающем домене РМСА [119]. Изоформы РМСА различаются по чувствительности к РКА-фосфорилированию [201].
РКС-опосредованное фосфорилирование было описано в очищенной РМСА эритроцитов, нейтрофилов, интактных тромбоцитов человека, клеток культуры эндотелия аорты, гладкомышечных клеток сосудов [156], [83], [200]. РКС фосфорилирует РМСА по остатку треонина. Исследования на РМСА2 и 3, искусственно экспрессированных в большом количестве в яйцеклетках хомячка, показали, что их активность регулируется РКС по-разному [71]. РМСА 2Ь и РМСА ЗЬ незначительно или совсем не фосфорилируются РКС, тогда как РМСА 2а и РМСА 2Ь фосфорилируются без увеличения их Са2+ транспортирующей активности. Стоит заметить, что фосфорилирование предотвращает стимуляцию PMC А кальмодулином [108]. Фосфорилирование РМСА 4а блокируется, если кальмодулин связан с ферментом, но фосфорилирование в отсутствие кальмодулина не предотвращало ни связывание, ни дальнейшую активацию кальциевого насоса с помощью кальмодулина [191]. Процессы дефосфорилирования в регуляции активности РМСА
В противоположность фосфорилированию, имеются лишь ограниченные данные о процессах специфического дефосфорилирования РМСА. Серин-треониновые фосфатазы РР1, РР2А и РР2В проявляют основную фосфатазную активность in vivo и включены в выполнение множества клеточных функций [32]. Эффект РР2А-опосредованного дефосфорилирования на активность РМСА был показан на эритроцитах, в мембрану которых был введен очищенный заранее фермент [91].
По последним данным протеин фосфатазы РР1 и РР2А обратимо ингиби-руют активность РКС [165]. Эти фосфатазы могут прямо и/или опосредованно (через РКС) регулировать активность Са2+ насоса в клетках.
Функциональные исследования продемонстрировали, что изоформы РМСА и варианты транскрипции ее генов различаются не только по распределению по клеткам различных тканей, но и их регуляции. РМСА 1 а, с и d характеризуются рН-зависимой аффинностью к кальмодулину, в то время как РМСА lb не имеет [124]. РМСА 2 имеет наивысшую аффинность к кальмодулину среди всех изоформ, в частности РМСА 2Ь. Это может означать, что клетки, экс-прессирующие большое количество РМСА 2Ь, могут поддерживать низкий уровень [Ca2+]i0 [54].
Важность РМСА не только как Са2+-насоса
Хотя РМСА играет огромнейшую роль в поддержании низкого базального уровня [Ca2+]l0, ее важность не ограничивается лишь этой функцией. Была показана роль РМСА в перезаполнении внутриклеточных Са2+ депо [125]. Многие исследователи указывают на связь между функцией РМСА и регуляцией клеточной пролиферации и других функций клетки [115], [37]. Противотранспорт иона Н+ при выведении Са2+ наружу может вызвать закисление цитоплазмы [36], [102] и изменять связывание внутриклеточных белков с Са2+. Существуют также данные, указывающие на то, что функция РМСА тесно связана с N0-синтазой типа I [173].
Данные об электрогенности РМСА противоречивы - с одной стороны было показано, что в нервных клетках РМСА работает как электрогенный насос (обменивая Са2+ на Н+) [170], с другой стороны, на липосомах и эритроцитах показано, что насос электронейтрален [147]. Ингибиторы активности РМСА
На сегодняшний момент времени не существуют фармакологические высокоспецифичные ингибиторы РМСА. Как и другие АТФ-азы Р-типа, РМСА ингибируется микромолярными количествами тяжелых металлов, например, ванадатом [186]. Эозин и изотиоцианат флуоросцеина также ингибируют активность РМСА [79], [67]. Хотя эозин влияет на активность и других АТФ-азы Р-типа, но РМСА более чувствительна к нему [87], [86]. Большое ограничение использования эозина заключается в его плохой проницаемости через ПМ, которая необходима для входа эозина внутрь клетки и его взаимодействия с ци-топлазматической стороной РМСА. Неспецифический ингибитор многих ферментов, La3+ был использован в исследованиях для блокирования выведения Са2+ из клеток с помощью РМСА [105], [104], [84]. Было показано также, что La3+ действует двояко - хотя он и ингибирует активность насоса, тем не менее этот же ион усиливает фосфорилирование интермедиата в РМСА [104]. Имеются также данные, что активность РМСА могут ингибировать железосодержащие протопорфирины [187].
Са2+-Л ТФ-аза сарко/эндоплазматического ретикулюма
Са2+-АТФ-аза сарко/эндоплазматического ретикулюма (SERCA) была открыта свыше 20 лет назад (обзоры [69], [95]). Эксперименты с специфическим ингибитором SERCA тапсигаргином (ТГ) [184], [195] выявили, что SERCA играет основную роль в снижении [Са2+]| в кардиомиоцитах при расслаблении сердца [55], [116]. В отличие от РМСА на 1 моль АТФ SERCA переносит не 1, а 2 M ионов Са2+ [95].
Строение SERCA принципиально не отличается от строения РМСА - она также состоит из 10 трансмембранных доменов. С-конец полипептидной цепи направлен внутрь цитоплазму [183], [7]. В отличие от РМСА, активность SERCA регулируется по принципиально отличному механизму - если РМСА в состоянии покоя неактивна в результате аутоингибирования, а комплекс Са2+-кальмодулин снимает этот блок и запускает работу фермента, то в случае с SERCA ситуация противоположна. Регуляторный белок - фосфоламбан инги-бирует работающий в непрерывном режиме насос. При необходимости протеин киназы фосфорилируют фосфоламбан и восстанавливают работу фермента [7], [95].
Описаны три изоформы SERCA, различающиеся по экспрессии в разных тканях [69] - в быстрых скелетных мышцах изоформа SERCA1, в медленных скелетных, сердечных и гладких мышцах изоформа SERCA2, изоформа SERCA3 обнаружена во многих клетках [137] [158], в том числе подвергающихся экспериментальному массивному увеличению Са2+ в цитоплазме, например, тромбоцитах спонтанно гипертензивных крыс [44], [198].
Даже в покоящейся клетке SERCA непрерывно функционирует, закачивая Са2+ внутрь цистерн ЭР против градиента концентрации, величиной в 4 порядка. При блокировании действия этой АТФ-азы с помощью ТГ или других специфических ингибиторов концентрация Са2+ в цитоплазме стремительно увеличивается за счет выхода Са2+ по так называемым каналам утечки («leak»-каналам [35], [33], [180]).
Открытие специфического ингибитора SERCA тапсигаргина [184], [195] начало новый этап в изучении обмена ионов Са2+ в клетках, поскольку создало объективные предпосылки для изучения системы, выводящей Са2+ из клетки через ПМ. Кроме тапсигаргина для блокирования аккумуляции Са2+ внутрь Са2+-депо на сегодняшний момент широко используют 2,5-ди-(1>бутил)-1,4-гидроксихинон (BHQ) [150], [195] и циклопиазоновую кислоту (CPA) [89]. Na+/Ca2+-o6MeHHUK
Работа Na+/Ca2+ обменника (NCX) в его так называемом «прямом» режиме функционирования направлена на удаление Са2+ из цитоплазмы против градиента концентрации в обмен на Na+ в стехиометрии 1 Са2+ на 3 Na+ [43]. Общепринято, что он вносит основной вклад в удаление Са2+ из цитоплазмы через ПМ в электровозбудимых клетках - особенно кардиомиоцитах и синаптиче-ских мембранах нервных клеток [48]. Na+/Ca2+ обменник является высокоскоростным, но низкоаффинным переносчиком Са2+ (по сравнению с высокоаффинной, но низкоскоростной РМСА). Таким образом, он может вносить вклад в выведение ионов Са2+ из цитоплазмы и электроневозбудимых клеток лишь при увеличении [Ca2+]j выше 1 мкМ [43].
Роль Na+/Ca2+ обменника в лимфоцитах дискутируется. Долгое время считалось, что в циркулирующих клетках крови (в том числе в лимфоцитах) Na+/Ca2+ обменника нет [66]. В настоящее время такие данные есть [85], [31]. Однако его роль в лимфоцитах не совсем определена [130], [66], [95], [43], [85], [148], [111]. Некоторые авторы считают, что он вносит вклад не столько в выведение Са2+ из цитоплазмы, сколько в его поступление, когда Na+/Ca2+ обменник работает в так называемом «обратном» режиме [148], [85], [31]. Вклад митохондрий в снижение [Ca2+]i0.
Содержание Са2+ в митохондриях регулируется двунаправленным потоком Са2+ через митохондриальную мембрану. Транспорт Са2+ внутрь митохондрий осуществляется по электрохимическому потенциалу (приблизительно 180 мВ, минус внутри), при этом происходит транспорт Н+ наружу из митохондрий [80]. Транспорт Са2+ из митохондрий осуществляется электронейтральным антипортом, который обменивает митохондриальный Са2+ на цитоплазматиче-ский или Н+. Таким образом, митохондрии не могут активно аккумулировать Са2+ на длительный срок, а лишь выступают в роли Са2+-буфера [136], [160], [97].
Показано, что при увеличении [Са2+]; в пределах до 800 нМ не происходит значительного увеличения Са2+ в митохондриях [60]. Тем не менее, в физиологических условиях, при увеличении [Са2+^ до 1-2 мкМ, митохондрии могут брать на себя Са2+-удар, способствуя уменьшению [Са2+]; до базального уровня, а затем медленно отдавая Са2+ назад, в цитоплазму, тем самым модулируя Са2+-ответ клетки [68]. В лимфоцитах митохондрии могут играть важную роль при активации, запуске их пролиферации, а также для входа их в апоптоз [131], [114], [113].
В некоторых типах клеток (например, хромаффинных клетках коры надпочечников) имеются две субпопуляции митохондрий, одна из которых расположена вблизи Са2+-каналов ПМ и ЭР и может эффективно служить Са2+-буфером. При этом, поскольку митохондрии с большой Са2+-емкостью ограничивают амплитуду и диффузию Са2+-сигнала, общая цитоплазматическая концентрация [Са2+]; увеличивается незначительно. Это является механизмом регулирования секреции гранул с катехоламином [160]. Факт существования различных субпопуляций митохондрий находит свое отражение в последних исследованиях [59].
Первичная артериальная гипертензия
Гипертоническая болезнь (ГБ) — хроническое заболевание, характеризующееся постоянным или периодическим повышением артериального давления. ГБ это самостоятельная нозологическая форма. Ее следует отличать от вторичных, симптоматических гипертензий, при которых увеличение АД является лишь проявлением основного заболевания [11]. Идентичными этому понятию, согласно решению специалистов-экспертов ВОЗ (1978), являются термины «эссенциальная гипертензия» и «первичная артериальная гипертензия». В русскоязычной литературе в основном применятся термин «первичная артериальная гипертензия» (ПАГ).
По критериям ВОЗ, АД ниже. 140/90 мм рт. ст. - норма, 140-159/90-94 -«опасная зона», или пограничная гипертензия. Повышенным считается АД, превышающее 160/95 мм рт. ст. [8].
Распространенность ПАГ среди женщин и мужчин примерно одинакова, в группе обследованных до 40 лет ее частота лежит в пределах 13,5-15%, 40-59 лет - 23,4% и среди лиц старше 60 лет - 30-33%. В некоторых исследованиях доказано, что женщины заболевают ПАГ чаще, особенно в климактерическом возрасте [164].
Социальное значение ГБ определяется не только широким распространением этого заболевания среди трудоспособного населения, определяющим значительные затраты на лечение, но в еще большей степени - усугублением тяжести и частоты осложнений при атеросклерозе, в частности болезни № 1 современного человечества - ишемической болезни сердца. Этиология и патогенез
Причина ПАГ раскрыта еще не до конца, лишь предложены основные механизмы, приводящие к стабильно высокому АД. По последним литературным данным считается, что при первичной артериальной гипертензии потомству передается не болезнь как таковая, а признаки, определяющие предрасположенность к ней [6]. Полагают, что для проявления самой болезни необходимо воздействие на организм неблагоприятных факторов внешней среды, включая известные факторы риска. Но, не смотря на то, что влияние среды в происхождении болезни значительно, это заболевание детерминировано на уровне ДНК [5], [12]. Расчетная величина генетического вклада в ее развитие составляет 3060 % [13]. Однако каждая нозологическая форма болезни с наследственной предрасположенностью на самом деле является генетически гетерогенной группой. ПАГ в действительности не одна болезнь, а группа болезней с одинаковым клиническим конечным проявлением. Причины развития болезней с наследственной предрасположенностью представлены на рис. 4.
6].
Для проявления болезней с наследственной предрасположенностью необходимо конкретное сочетание наследственных и внешних факторов. Чем больше будет выражена наследственная предрасположенность и больше вредных воздействий среды, тем для индивида больше вероятность заболеть (и в более раннем возрасте и в более тяжелой форме).
Для объяснения патогенеза гипертонической болезни предложено много гипотез, предметом дискуссии которых является главным образом сущность пускового патогенетического звена ПАГ. К числу основных из этих гипотез относятся следующие [8], [11], [13].
Гипотеза Э.Гелльгорна и соавторов. Первичным патогенетическим фактором является стойкая повышенная возбудимость и реактивность (гиперергия) высших симпатических нервных центров (в частности, расположенных в заднем отделе гипоталамуса). Факторами, вызывающими стойкую гиперергию этих центров, является длительное, повторное возбуждение эмоциональных центров, тесно связанных с симпатическими ядрами гипоталамуса. Определенное значение при этом имеет наследственная гиперергия центров симпатической нервной системы. Гиперергическое состояние этих структур вызывает, с одной стороны, повышение тонуса прессорных центров (также по природе своей являющихся симпатическими), что ведет к спазму сосудов, увеличению сердечного выброса и повышению АД, а с другой стороны, обуславливает гиперпродукцию гуморальных факторов с прессорным действием адреналина, но-радреналина, вазопрессина, АКТГ, кортикостероидов, а также гиперсекрецию ренина в юкстагломеруллярном аппарате почек. Все эти факторы потенцииру-ют спазм артериол и способствуют еще большему увеличению сердечного выброса. Это ведет к нарастанию и диастолического давления (в результате повышения тонуса стенок сосудов), и систолического (вследствие кардиотропно-го стимулирующего эффекта указанных агентов).
Гипотеза Г.Ф.Ланга и А.Л.Мясникова. Первичным патогенетическим фактором развития ГБ является снижение тормозного влияния коры головного мозга, оказываемого ею в норме на подкорковые вегетативные нервные центры, прежде всего - на прессорные. Это ведет, с одной стороны, к спазму артериол и повышению АД, а с другой - к обусловленному спазмом почечных артерий и другими изменениями включению почечного прессорного патогенетического фактора, эндокринных и рефлексогенного механизмов повышения АД. Согласно этой гипотезе, причиной снижения тормозного влияния коры головного мозга на подкорковые прессорные центры (что ведет к развитию гипертонической болезни) является ослабление ее «тонуса» (активности) под влиянием избыточных сигналов, поступающих от экстеро- и интерорецепторов.
Гипотеза Е.Муирад, А.Гайтона. Пусковым фактором развития гипертен-зии, по мнению указанных авторов, является генетически обусловленный пониженный уровень натрий-хлорид и водовыделительной функции почек. Это ведет к накоплению избытка натрия и воды в организме, включая ткань сосудистых стенок, в том числе их гладкие мышцы. В связи с этим развивается ги-поволемия, повышаются тонус сосудов и чувствительность их стенок к прес-сорным гормонам и другим биологически активным факторам. Это (в конечном итоге) обусловливает развитие артериальной гипертензии.
Гипотеза нарушения функций мембранных ионных насосов Ю.В.Постнова. Пусковым фактором в патогенезе артериальной гипертензии служит наследственный дефект мембран. Дефект может приводить к нарушению работы многих транспортных систем - кальциевых насосов (SERCA, РМСА), Ка7Са2+-обменника, Na7K+-AT<£-a3bi [14], [27], [24], в том числе в гладкомышечных клетках стенок артериол. В результате уменьшается, с одной стороны, «откачивание» ионов Са2+ из цитоплазмы в ЭР, а с другой стороны, снижается выведение Na+ из цитоплазмы в межклеточное пространство. Избыток ионов Na+ и Са2+ в цитоплазме гладких мышечных клеток сосудов вызывает их спазм, а также повышение чувствительности к прессорным факторам. Это и приводит к развитию гипертензии. В последнее время появились основания считать, что причина нарушения транспортной функции кроется в дефиците энергии, поступающей из митохондрий для обеспечения работы мембранных насосов [16], [15].
Развитию заболевания способствует и выделение в кровь различными органами активно действующих веществ. Центральная роль в этой регуляции принадлежит почкам. В результате изменений в их деятельности, выделяемые ими активные вещества-регуляторы с течением времени вызывают более долговременные сдвиги в уровне артериального давления. Его повышение становится постепенно все более и более устойчивым.
Так формируется переход эмоционально обусловленных гипертензивных реакций в хроническую болезнь. Действие тех же механизмов в последующие годы приводит к стабилизации высокого АД. При этом больной нередко перестает испытывать неприятные ощущения, возникает иллюзия благополучия и как следствие — пренебрежение лечением.
Следует отметить, что повышение артериального давления также связано с задержкой в организме поваренной соли, выведение которой почками несколько замедляется при ПАГ. Избыток соли в организме вызывает непосредственно артериальную гипертензию, тогда как устранение такого избытка понижает АД.
В поддержании повышенного АД принимает участие и избыточно усиленная насосная работа сердца при излишне большом объеме крови, участвующей в кровообращении. Такой вариант кровообращения играет ведущую роль в повышении АД у большинства больных. Снижение сердечного выброса крови у таких больных с помощью фармакологических препаратов ведет к снижению АД и облегчению состояния.
При усилении аккумуляции Са2+ в цитоплазме клеток происходит химическое разобщение окисления и фосфорилирования, снижается образование АТФ [16]. При этом происходит смена расходуемого клетками топлива, например, в миокарде резко снижается потребление жирных кислот и усиливается потребление глюкозы, а в головном мозге, где энергетическая потребность покрывается за счет глюкозы, у больных ПАГ повышается потребление жирных кислот и кетонов. Внутри клеток накапливаются метаболиты, прогрессируют проявления метаболического синдрома. В то же время, в результате этих процессов дефицит снабжения мембранных насосов энергией лишь усиливается, следовательно, страдает стабильность концентрации ионов в клетках. Замыкается порочный круг. Гипертензия становится устойчивой (рис. 5).
Рис. 5. Патогенез гипертонической болезни (по Ю.В. Постнову [11], [14]). Молекулярные механизмы патогенеза ПАГ
Циркулирующие клетки, как наиболее доступные для исследования механизмов ПАГ изначально попали в фокус исследований. Основное предположение при изучении молекулярных механизмов ПАГ на этих клетках заключается в том, что при ПАГ наследственный дефект имеется не только в гладкомышеч-ных клетках (определяющих сосудистое сопротивление), но и проявляется во всех остальных клетках живого организма [27].
Величина базального уровня [Ca2+]i0 в клетках при первичной артериальной гипертензии
Исследования по изменению базального уровня [Ca2+]i0 в различных клетках освещены в работах, [49], [152], [50]. В некоторых исследованиях авторы указывают на прямую связь между увеличением [Са2+]ю в лимфоцитах [168], [111], [152], [151], тромбоцитах [151], эритроцитах [189] и гладкомышечных клетках [121], [120] и значением АД. Это хорошо согласуется с гипотезой Ю.В. Постнова о нарушении ионотранспортной функции мембран клеток как пусковом механизме патогенеза ПАГ. Однако, также существуют данные о том, что величина базального уровня [Ca2+]j0 не изменяется достоверно [188], [61], а также может зависеть от предварительной физической нагрузки [143]. Связь между [Са2+]1 и [Na+]i при ПАГ
Для выяснения роли клеточных ионных нарушений в патогенезе ПАГ [27] были предложены две основные гипотезы. Одна гипотеза [42], [41] заключается в том, что ключевым звеном является первичное нарушение в экскреции Na+. Это находит отражение в существовании зависимости между увеличением АД и повышенным потреблением поваренной соли (соль-чувствительные случаи гипертензии). При этом происходит увеличение объема циркулирующей крови и высвобождение эндогенного ингибитора №+/К+-АТФ-азы оубаина [40]. Эндогенный оубаин влияет на Na+/K+-ATO-a3y эпителия почечных трубочек, происходит дальнейшее уменьшение выведения Na+ и сохранение внеклеточного объема жидкости. Однако, ингибирование работы Na7K+-ATO-a3bi также приводит к увеличению [Са2+]ь в результате изменения функционирования работающего в прямом режиме 1Ча+/Са2+-обменника. Увеличение уровня [Са2+]t в гладкомышечных клетках сосудов, может вызывать увеличение периферического сопротивления сосудов. Таким образом, нарушение метаболизма Na+ является первичным нарушением в регуляции содержания ионов внутри клеток при ПАГ , и увеличение [Са2+]; при этом заболевании является вторичным. Эта гипотеза подтверждается экспериментальной работой [101], в которых было показано, что уровень эндогенного оубаина повышен у пациентов с соль-чувствительной ПАГ. Показано также, что концентрация эндогенного оубаина напрямую коррелирует с увеличением потребления натрия в виде поваренной соли.
Вторая гипотеза [25] заключается в том, что ПАГ связана с первичным нарушением, возникающим при дисфункции любой Са2+-регуляторной системы. Может нарушаться как функция Са2+-АТФ-азы плазматических мембран и сар-ко/эндоплазматического ретикулюма, так и работа Ка+/Са2+-обменника или изменяться вход Са2+ через каналы. Так как заболевание имеет полигенную природу, то нарушение может наблюдаться в любом участке регулирования [Са2 :]1. Первичное увеличение [Са2+]> может вызывать активацию Ка+/Н+-обменника и/или стимуляцию протеин киназы С (РКС). Изменения в трио [Са2+];, РКС, Иа7Н+-обменник может вызывать дальнейшее клиническое проявление ПАГ. Например, увеличение активности Ка+/Н+-обменника в эпителии почечных трубочек может усиливать реабсорбцию и вызывать чувствительность к соли. Увеличение [Са2+]^ активности РКС и Ш+/Н+-обменника в гладкомышеч-ных клетках сосудов может не только вызывать вазоконстрикцию, но также усиливать рост гладких мышц, утолщая стенку сосудов, и сужая его просвет.
Возможно, что механизмы лежащие в основе обеих гипотез, могут проявляться в различных клетках, в различное время, или при различных типах ПАГ.
Биологическое действие аллицина
В литературе описан широкий спектр биологической активности чеснока и препаратов на его основе [20], [88], [107], [139], [179]. В последнее время были разработаны методические подходы, позволяющие выделить из чеснока в изолированном, неизмененном виде различные химические соединения [153], [117]. Изучение биологических эффектов таких компонентов позволяет выявить мишени их действия, а также надеяться создать на их основе новые высоко эффективные лекарственные препараты.
Аллицин (диаллилтиосульфинат) - один из основных компонентов экстракта чеснока. В неразрушенной растительной клетке чеснока (в вакуолях) содержится аминокислота аллиин (аллилцистеин-8-оксид). В цитозоле клетки содержится фермент аллиназа, которая при разрушении клеток (измельчении долек чеснока) превращает аллиин в диаллилтиосульфинат (аллицин) (рис. 6). о О О
Рис. 6. Аллицин образуется из аллиина под действием фермента аллиназы.
Аллицин обладает антипролиферативной [20], в том числе противоопухолевой [107], [185], [179] активностью, а также влияет на свертываемость крови [46], [133] изменяет содержание липидов в плазме [88] и снижает значение артериального давления при гипертонии [139], [70]. Примечательно, что многие патологические и физиологические процессы, на которые влияет аллицин, в патогенезе или механизме действия имеют в качестве ключевого звена изменение [Са2+];. Большинство публикаций в области исследования действия аллицина указывают лишь на факты без объяснения механизмов. В работе на цилиар-ных клетках [57] было экспериментально показано, что аллицин вызывает увеличение [Ca2+]j в результате действия на рианодин-чувствительные Са2+-депо. Также имеются данные о том, что в тромбоцитах аллицин увеличивает [Ca2+]j без промежуточного образования 1Р3 [162]. Кроме того, имеются единичные публикации о том, что аллицин обладает антиоксидантной активностью [161], [178], вызывает образование индуцибельной NO-синтазы [64], [129], а также может действовать на серосодержащие белки [163].
35
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ Цель: Изучить активность Са2+-АТФ-азы плазматических мембран лимфоцитов больных первичной артериальной гипертензией in situ
Для этого были поставлены следующие задачи:
1. Создать условия, позволяющие однозначно определять активность Са2+-АТФ-азы плазматических мембран лимфоцитов in situ.
2. В данных условиях оценить вклад №+/Са2+-обменника в выведение ионов Са2+ из цитоплазмы.
3. Проанализировать зависимость скорости работы Са2+-АТФ-азы плазматических мембран in situ от изменения [Са2+];.
4. Оценить скорость работы Са2+-АТФ-азы плазматических мембран в зависимости от выхода Са2+ из различных внутриклеточных Са2+-депо.
5. Охарактеризовать связь некоторых компонентов Са2+-гомеостаза с активностью Са2+-АТФ-азы плазматических мембран лимфоцитов in situ, а именно, стартовой точки ее запуска A[Ca2+]j пуск, максимальной скорости ее работы Vmax, величины базального уровня [Ca2+]j0, содержания Са2+ во внутриклеточных тапсигаргин-чувствительных Са2+-депо.
6. Выявить химические агенты, влияющие на активность Са2+-АТФ-азы плазматических мембран.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объект исследования
В качестве объекта исследования использовали лимфоциты, выделенные из периферической крови людей. Группу больных первичной артериальной ги-пертензией (ПАГ) составили 76 человек, находившихся на лечении и/или обследовании в кардиологическом отделении ГКБ № 59 г. Москвы. Диагноз и стадия болезни устанавливались врачом-кардиологом на основании совокупности данных анамнеза, физикального осмотра, измерения АД и исключения других видов гипертензий (вторичных) при дополнительном инструментальном обследовании. В контрольную группу вошли 15 человек - доноры, АД которых перед забором крови не превышало 120/80 мм рт.ст., не имеющие в анамнезе жалоб на увеличение давления. Забор крови (15-20 мл) производили из вены утром, натощак. Для предотвращения свертывания крови в пробирку добавляли гепарин в конечной концентрации равной 25-30 МЕ/мл (на 20 мл крови -1мл гепарина, активностью 500 ME).
Реактивы
В работе использовались следующие реактивы:
1. FURA-2AM - флуоресцентный индикатор ионов Са2+ (ацетоксиметиль-ный эфир) (Sigma).
2. EGTA - Ethylene glycol-bis(b-aminoethyl ether) N,N,N,N tetraacetic acid (Sigma) - хелатор ионов Ca2+.
3. DMSO - диметилсульфоксид (Sigma).
4. Тапсигаргин (Sigma).
5. Кофеин (Sigma).
6. Иономицин (Sigma).
7. Дигитонин (Sigma).
8. Аллицин (производство ГосНИИОХТ, индивидуальность вещества подтверждена методами ИК и ЯМР, чистота 97,5 %).
9. МпС12 - Хлорид марганца -(Sigma).
10. СаС12 - Хлорид кальция -(производственное объединение «Олайнфарм», Россия).
11. КС1 - Хлорид калия (Sigma).
12. NaCl - Хлорид натрия (Sigma).
13. Гепарин (ОАО «Белмедпрепараты», Россия).
14. Трис-С1 - буфер рН - 9,4 (Sigma).
15. HEPES-NaOH - буфер, рН = 7,4 (Sigma).
При работе с суспензией клеток использовали культуральную среду Хенкса (ЭПП по производству бактерийных и вирусных препаратов ИПВЭ им. М.П. Чумакова, Россия). Для выделения лимфоцитов применяли градиент для выделения лимфоцитов («Flow laboratories», UK). Удельная плотность 1,077 г/мл.
Оборудование
1. Спектрофлуориметр Hitachi-F3000 (Япония). Кюветное отделение оборудовано магнитной мешалкой и термостатом. Параметры прибора, используемые для измерения внутриклеточного содержания свободных ионов кальция ([Са2+],), представлены в таблице 2.
Таблица 2.
Режим работы спектрофлуориметра Hitachi-F3000.
Параметр Значение
Длина волны возбуждения флуоресценции (нм) 335
Длина волны регистрации флуоресценции (нм) 505
Ширина щели возбуждения флуоресценции (нм) 5
Ширина щели испускания флуоресценции (нм) 20
Время ответа (временной интервал, в течение которого снимаются усредненные показания с ФЭУ) (с) 2
Общее время записи одного эксперимента (мин) 40
Запись экспериментальных кривых, полученных на спектрофлуориметре Hitachi-F3000, осуществлялась путем распечатки данных на принтере, встроенном в спектрофлуориметр.
2. Камера Горяева для подсчета клеток в суспензии (Россия).
3. Микроскоп Leitz Wetzlar 513519 (Германия).
4. Центрифуга Опн ЗУХЛ 4.2 (СССР).
5. рН-метр Mettler Toledo М235 (Швейцария).
6. Микропипетки «Biohit» и «Gilson»Ha 50 мкл, 200 мкл, 1 мл.
7. Шприц для микродобавок «Hamilton», позволяющий осуществлять микродобавки 1-10 мкл.
8. В работе использовались специальные пластиковые пробирки, материал которых способствует адгезии моноцитов к поверхности пластика.
Методика выделения лимфоцитов
Лимфоциты выделяли из периферической крови человека по методу Boyum [9] с нашими модификациями.
1. Кровь в пробирке устанавливали в термостат на 37 С до осаждения эритроцитов в течение 30 мин - 1,5 ч.
2. Плазму, обогащенную более легкими клетками (5-7 мл), наслаивали на 3 мл градиента для выделения лимфоцитов (уд. плотность 1,077 г/см3) в специальной пластиковой пробирке.
3. Производили центрифугирование при 3000 оборотах (800 g) в течение 30 минут.
4. После центрифугирования кольцо мононуклеаров помещали в отдельную пробирку из специального пластика.
5. Производили двукратную отмывку лимфоцитов от градиента (800 g, 5 мин) в 10 мл культуральной среды Хенкса (с добавлением 25 мМ HEPES-NaOH, рН 7,4).
6. Суспензию клеток (2 мл, не более 1-2* 107 клеток) помещали в кварцевую кювету для флуоресцентных измерений (10 х 10 х 40 мм).
7. Загрузку суспензии флуоресцентным индикатором ионов Са2+ FURA-2 производили при 37 С. Ацетоксиметильный эфир флуоресцентного зонда FURA-2AM (конечная концентрация 5*10 7 М) добавляли непосредственно к суспензии в кюветном отделении спектрофлуориметра Hitachi-F3000. Процесс загрузки клеток проводили 10-40 мин при непосредственной регистрации флуоресценции. Загрузку заканчивали при достижении флуоресценции суспензии 70-90 % уровня от максимально возможного (при выходе свечения на стационарный уровень).
8. Нагруженные красителем клетки дважды отмывали в 10 мл культуральной среды Хенкса (с добавлением 25 мМ HEPES-NaOH, рН 7,4) от флуоресцентного красителя, оставшегося снаружи клеток.
9. Подсчет клеток производили в камере Горяева. Для дальнейших экспериментов маточную суспензию клеток разводили из расчета 2 млн клеток на одну пробу, объем пробы 2 мл.
10. Оценку жизнеспособности клеток проводили с помощью теста с трипано-вой синью [9].
Расчет концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме лимфоцитов
Сканирование бумажных записей, полученных и распечатанных на спек-рофлуориметре Hitachi-F3000, производили с помощью сканера Hewlett Packard ScanJet 4с. Перевод графиков в цифровую форму осуществляли в программе Graph Digitizer (версия 2.14.).
Для количественной оценки изменения концентрации свободных ионов кальция внутри клеток ([Ca2+]j), применяли следующую формулу [93]:
Cal+\=Kd
F - F
2+i i/- min
F -F max где Kd - константа диссоциации комплекса FURA-2 - Ca2+. При 37 С она равна 224 нМ [103];
F - текущее значение флуоресценции;
Fmax - максимально возможная интенсивность флуоресценции при полном насыщении флуоресцентного индикатора FURA-2 ионами Са2+. При проведении экспериментов в среде, не содержащей ионы Са2+, это значение получали при добавлении к разрушенной суспензии лимфоцитов (дигитонин, 2 мкМ) избытка СаС12 - 15* 10"3 М.
Fmin - минимально возможная интенсивность флуоресценции при полном тушении комплекса FURA-2 - Са2+ ионами Мп2+. Значение Frain получали при добавлении к разрушенной суспензии лимфоцитов (дигитонин, 2 мкМ) избытка МпС12 - 15*10"3 М).
Статистическая обработка результатов
Статистическая обработка результатов производили с помощью программы «Statistica» (версия 5.5, производитель фирма «StatSoft Inc»). Проверка нормальности распределения признака производилась с помощью критериев Лиллиефорса и Шапиро-Уилка. Если распределение исследуемого признака подчинялось нормальному закону распределения, то описание его приводилось в виде: N - число точек для каждой группы, М (mean - среднее значение) ± SD (standard deviation - стандартное отклонение). Если распределение признака отличалось от нормального, то для каждой группы описание его приводилось в виде: Me (median - медиана), QR (Quartile Range - интерквартильный размах).
Сравнение признаков в группе больных ПАГ и здоровых людей, в том случае, если признак был распределен в каждой группе по нормальному закону распределения, производилось методами параметрической статистики с ис
42
РЕЗУЛЬТАТЫ
Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Беликова, Наталья Алексеевна
ВЫВОДЫ
1. Показано, что эффективное выведение Са2+ из цитоплазмы лимфоцитов с помощью Са2+-АТФ-азы плазматических мембран начинается при увеличении концентрации свободных ионов Са2+ выше некоторого критического значения [Ca2+]j пуск. Впервые установлено, что значение [Са2+]; пуск в лимфоцитах больных первичной артериальной гипертензией в 2 раза выше аналогичного параметра у здоровых людей.
2. Выявлено, что скорость работы Са2+-АТФ-азой плазматических мембран была прямо пропорциональна относительному изменению [Са2+]( и не зависела от природы действующего агента.
3. Показано, что базальный уровень [Са2+]ю в лимфоцитах достоверно не различался у больных первичной артериальной гипертензией и здоровых людей и составлял величину равную 143 нМ (QR = 48 нМ) и 131 нМ (QR = 95 нМ) соответственно.
4. Установлено, что содержание Са2' во внутриклеточном тапсигаргин-чувствительном депо в лимфоцитах здоровых людей и больных первичной артериальной гипертензией достоверно не различалось (269 нМ (QR = 237 нМ) и 245 нМ (QR =116 нМ), соответственно).
5. Максимальная скорость работы Са2+-АТФ-азы плазматических мембран, достигаемая in situ при полном опустошении внутриклеточного Са2+-депо, в лимфоцитах больных первичной артериальной гипертензией и здоровых людей была одинакова (1,94 ± 1,54 нМ/с и 1,53 ± 0,71 нМ/с).
6. Обнаружено, что в лимфоцитах больных первичной артериальной гипертензией и здоровых людей помимо тапсигаргин-чувствительных Са2+-депо существуют тапсигаргин-нечувствительные Са2+-депо, опустошаемые с помощью кофеина.
7. Впервые установлено, что аллицин в концентрации 10-140 мкМ эффективно блокирует Са2+-АТФ-азу плазматических мембран in situ.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Беликова, Наталья Алексеевна, Москва
1. Авдонин П.В., Ткачук В А. Рецепторы и внутриклеточный кальций. //М.: Наука. 1994, С. 29-42.
2. Асташкин Е.И., Беспалова Ю.Б., Глезер М.Г., Грачев C.B. Арахидоновая кислота и сфингозин действуют на тапсигаргин-нечувствительные Са2+-депо в нейтрофилах человека. // Доклады Академии наук. 2000. Т. 373. №. 1-6. С. 162-6.
3. Афанасьева Г.В., Авдонин П.В. Повышенная активность Са2+-зависимых К+-каналов в клетках крыс со спонтанной гипертензией. //Кардиология. 1999. V. 7. Р. 29-33.
4. БАЗА ЗНАНИЙ ПО БИОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА ИМГ РАН http://obi.img.ras.ru/
5. Бебихов Д.В., Никоненко Т.А., Постнов А.Ю., Постнов Ю.В. Неменделев-ское наследование артериальной гипертензии: повторяющиеся последовательности ДНК как кандидаты на роль геномных детерминант. //Кардиология. 2001. №. 6. С. 34-39.
6. Бочков Н. П. Клиническая генетика: Учебник. 2-е изд., перераб. и доп. -М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001.-448 е.: ил. - (XXI век). 2001.
7. Владимиров Ю.А. Кальциевые насосы живой клетки. //Соросовский образовательный журнал. 1998. №. 3. С. 20-27.
8. Кардиосайт Все о кардиологии http://www.cardiosite.rn/
9. Клаус Д. Лимфоциты: методы. Пер. с англ. Под ред. Дж.Клауса. М.: Мир, 1990.-400 с. ил. 1990.
10. Ленинджер А. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функций клетки. Пер. с англ. Под ред. А.А.Баева М.:Мир. 1974.
11. Литвицкий П.Ф., Лосев Н.И., Войнов В.А. и др. Патофизиология: Курс лекций: Учеб.пособие М.:Медицина , 752 е., ил. 1995.
12. Постнов Ю.В., Орлов С.Н. Первичная гипертензия как патология клеточных мембран. Москва Медицина, 1987. 189 с. 1987.
13. Постнов Ю.В. К развитию мембранной концепции патогенеза первичной гипертензии (нарушенная функция митохондрий и энергетический дефицит). //Кардиология. 2000. №. 10. С. 4-12.
14. Постнов Ю.В. О роли кальциевой перегрузки митохондрий и энергетического дефицита в патогенезе первичной артериальной гипертензии. //Архив патологии. 2001. №. 3. С. 3-10.
15. Ткачук В.А. Мембранные рецепторы и внутриклеточный кальций. // Соро-совский образовательный журнал. 2001. Т. 7. №. 1. С. 10-15.
16. Ярилин A.A. Основы иммунологии. Учебник. М.: Медицина, 1999. - 608 е.: ил. 1999.
17. Adamo Н. P.Grimaldi М. Е. Functional consequences of relocating the C-terminal calmodulin-binding autoinhibitory domains of the plasma membrane Ca2+ pump near the N-terminus. //Biochem J. 1998. V. 331. Pt 3. P. 763-6.
18. Ankri S.Mirelman D. Antimicrobial properties of allicin from garlic. //Microbes Infect. 1999. V. 1.2. P. 125-9.
19. Ariyoshi H., Shiba E., Kambayashi J., Sakon M., Kawasaki T., Yoshida K.Mori T. Stimulation of human platelet Ca(2+)-ATPase and Ca2+ restoration by calpain. //Cell Calcium. 1993. V. 14. 6. P. 455-63.
20. Aviv A. Cellular calcium and sodium regulation, salt-sensitivity and essential hypertension in African Americans. //Ethn Health. 1996. V. 1. 3. P. 275-81.
21. Aviv A. Recent advances in cellular Ca2+ homeostasis: implications to altered regulations of cellular Ca2+ and Na(+)-H+ exchange in essential hypertension. //Curr Opin Cardiol. 1996. V. 11. 5. P. 477-82.
22. Aviv A. The link between cytosolic Ca2+ and the Na+-H+ antiport: a unifying factor for essential hypertension. //J Hypertens. 1988. V. 6. 9. P. 685-91.
23. Aviv A. Cytosolic Ca2+, Na+/H+ antiport, protein kinase C trio in essential hypertension. //Am J Hypertens. 1994. V. 7. 2. P. 205-12.
24. Aviv A.Lasker N. Defects in membrane transport of ions as possible pathogenic factors in hypertension. //Curr Opin Nephrol Hypertens. 1992. V. 1. l.P. 68-72.
25. Aviv A.Livne A. The Na+/H+ antiport, cytosolic free Ca2+, and essential hypertension: a hypothesis. //Am J Hypertens. 1988. V. 1. 4 Pt 1. P. 410-3.
26. Balasubramanyam M., Balaji R. A., Subashini B.Mohan V. Evidence for mechanistic alterations of Ca2+ homeostasis in Type 2 diabetes mellitus. //Int J Exp Diabetes Res. 2001. V. 1. 4. P. 275-87.
27. Balasubramanyam M., Kimura M., Aviv A.Gardner J. P. Kinetics of calcium transport across the lymphocyte plasma membrane. //Am J Physiol. 1993. V. 265. 2 Pt 1. P. C321-7.
28. Balasubramanyam M., Rohowsky-Kochan C., Reeves J. P.Gardner J. P. Na+/Ca2+ exchange-mediated calcium entry in human lymphocytes. //J Clin Invest. 1994. V. 94. 5. P. 2002-8.
29. Barford D. The mechanism of protein kinase regulation by protein phosphatases. //Biochem Soc Trans. 2001. V. 29. Pt 4. P. 385-91.
30. Beecroft M. D.Taylor C. W. Luminal Ca2+ regulates passive Ca2+ efflux from the intracellular stores of hepatocytes. //Biochem J. 1998. V. 334. Pt 2. P. 4315.
31. Beeler T. J., Jona I.Martonosi A. The effect of ionomycin on calcium fluxes in sarcoplasmic reticulum vesicles and liposomes. //J Biol Chem. 1979. V. 254. 14. P. 6229-31.
32. Bergling S., Dolmetsch R., Lewis R. S.Keizer J. A fluorometric method for estimating the calcium content of internal stores. //Cell Calcium. 1998. V. 23. 4. P. 251-9.
33. Berk B. C., Brock T. A., Gimbrone M. A., Jr.Alexander R. W. Early agonist-mediated ionic events in cultured vascular smooth muscle cells. Calcium mobilization is associated with intracellular acidification. //J Biol Chem. 1987. V. 262. 11. P. 5065-72.
34. Berridge M. J. Elementary and global aspects of calcium signalling. //J Exp Biol. 1997. V. 200. Pt 2. P. 315-9.
35. Berridge M. J., Bootman M. D.Lipp P. Calcium-a life and death signal. //Nature. 1998. V. 395. 6703. P. 645-8.
36. Berridge M. J., Lipp P.Bootman M. D. The versatility and universality of calcium signalling. //Nat Rev Mol Cell Biol. 2000. V. 1. 1. P. 11-21.
37. Blaustein M. P.Hamlyn J. M. Endogenous ouabain: implications for cardiovascular disease diagnosis and therapy. //Md Med J. 1992. V. 41. 6. P. 501-4.
38. Blaustein M. P.Hamlyn J. M. Pathogenesis of essential hypertension. A link between dietary salt and high blood pressure. //Hypertension. 1991. V. 18. 5 Suppl. P. Ill 184-95.
39. Blaustein M. P.Hamlyn J. M. Sodium transport inhibition, cell calcium, and hypertension. The natriuretic hormone/Na+-Ca2+ exchange/hypertension hypothesis. //Am J Med. 1984. V. 77. 4A. P. 45-59.
40. Blaustein M. P.Lederer W. J. Sodium/calcium exchange: its physiological implications. //Physiol Rev. 1999. V. 79. 3. P. 763-854.
41. Bobe R., Bredoux R., Wuytack F., Quarck R., Kovacs T., Papp B., Corvazier E., Magnier C.Enouf J. The rat platelet 97-kDa Ca2+ATPase isoform is the sarcoendoplasmic reticulum Ca2+ATPase 3 protein. //J Biol Chem. 1994. V. 269. 2. P. 1417-24.
42. Brading A. F. The sarcoplasmic reticulum in disease and smooth muscle dysfunction: therapeutic potential. //Novartis Found Symp. 2002. V. 246. P. 244-54; discussion 254-7, 272-6.
43. Briggs W. H., Xiao H., Parkin K. L., Shen C.Goldman I. L. Differential inhibition of human platelet aggregation by selected Allium thiosulfmates. //J Agric Food Chem. 2000. V. 48. 11. P. 5731-5.
44. Brini M., Bano D., Manni S., Rizzuto R.Carafoli E. Effects of PMCA and SERCA pump overexpression on the kinetics of cell Ca(2+) signalling. //Embo J. 2000. V. 19. 18. P. 4926-35.
45. Brini M., Manni S.Carafoli E. A Study of the Activity of the Plasma Membrane Na/Ca Exchanger in the Cellular Environment. //Ann N Y Acad Sci. 2002. V. 976. P. 376-381.
46. Bruschi G., Bruschi M. E., Orlandini G., Cavatorta A., Borghetti A., Ferrandi M.Bianchi G. Why is Ca2+.i increased in blood cells in primary hypertension? //J Hypertens Suppl. 1985. V. 3. Suppl 3. P. S45-7.
47. Bukoski R. D., Lastelic B. A., Xue H., Li J.Bian K. Intracellular Ca2+ and force generation determined in resistance arteries of normotensive and hypertensive rats. //J Hypertens. 1994. V. 12. 1. P. 15-21.
48. Calviello G., Bossi D.Cittadini A. Further observations on the effect of calcium ionophores on ascites tumor cells. //Arch Biochem Biophys. 1987. V. 259. 1. P. 38-45.
49. Carafoli E. Intracellular calcium homeostasis. //Annu Rev Biochem. 1987. V. 56. P. 395-433.
50. Carafoli E. The plasma membrane calcium pump. Structure, function, regulation. //Biochim Biophys Acta. 1992. V. 1101. 2. P. 266-7.
51. Carafoli E., Kessler F., Falchetto R., Heim R., Quadroni M., Krebs J., Strehler E. E.Vorherr T. The molecular basis of the modulation of the plasma membrane calcium pump by calmodulin. //Ann N Y Acad Sci. 1992. V. 671. P. 58-68; discussion 68-9.
52. Chiesi M., Wrzosek A.Grueninger S. The role of the sarcoplasmic reticulum in various types of cardiomyocytes. //Mol Cell Biochem. 1994. V. 130. 2. P. 15971.
53. Cho J. H., Nash F., Fekete Z., Kimura M., Reeves J. P.Aviv A. Increased calcium stores in platelets from African Americans. //Hypertension. 1995. V. 25.3. P. 377-83.
54. Clapham D. E. Calcium signaling. //Cell. 1995. V. 80. 2. P. 259-68.
55. Collins T. J., Berridge M. J., Lipp P.Bootman M. D. Mitochondria are morphologically and functionally heterogeneous within cells. //Embo J. 2002. V. 21.7.P. 1616-27.
56. Collins T. J., Lipp P., Berridge M. J.Bootman M. D. Mitochondrial Ca(2+) uptake depends on the spatial and temporal profile of cytosolic Ca(2+) signals. //J Biol Chem. 2001. V. 276. 28. P. 26411-20.
57. Cooper R. S., Cheng H. Y.Rotimi C. Basal and stimulated platelet calcium and sodium in hypertensive versus normotensive black people. //J Hum Hypertens. 1995. V. 9. 9. P. 747-52.
58. Dawson A. P. Calcium signalling: how do IP3 receptors work? //Curr Biol. 1997. V. 7. 9. P. R544-7.
59. Dhalla N. S.Zhao D. Cell membrane Ca2+/Mg2+ ATPase. //Prog Biophys Mol Biol. 1988. V. 52. l.P. 1-37.
60. Dirsch V. M., Kiemer A. K., Wagner H.Vollmar A. M. Effect of allicin and ajoene, two compounds of garlic, on inducible nitric oxide synthase. //Atherosclerosis. 1998. V. 139. 2. P. 333-9.
61. Donnadieu E., Bismuth G.Trautmann A. Calcium fluxes in T lymphocytes. //J Biol Chem. 1992. V. 267. 36. P. 25864-72.
62. Donnadieu E.Trautmann A. Is there a Na+/Ca2+ exchanger in macrophages and in lymphocytes? //Pflugers Arch. 1993. V. 424. 5-6. P. 448-55.
63. Donnet C., Caride A. J., Talgham S.Rossi J. P. Chemical modification reveals involvement of different sites for nucleotide analogues in the phosphatase activity of the red cell calcium pump. //J Membr Biol. 1998. V. 163. 3. P. 21724.
64. Duchen M. R. Contributions of mitochondria to animal physiology: from homeostatic sensor to calcium signalling and cell death. //J Physiol. 1999. V. 516. Ptl.P. 1-17.
65. East J. M. Sarco(endo)plasmic reticulum calcium pumps: recent advances in our understanding of structure/function and biology (review). //Mol Membr Biol. 2000. V. 17. 4. P. 189-200.
66. Elkayam A., Mirelman D., Peleg E., Wilchek M., Miron T., Rabinkov A., Sadetzki S.Rosenthal T. The effects of allicin and enalapril in fructose-induced hyperinsulinemic hyperlipidemic hypertensive rats. //Am J Hypertens. 2001. V. 14. 4Pt 1. P. 377-81.
67. Enyedi A., Elwess N. L., Filoteo A. G., Verma A. K., Paszty K.Penniston J. T. Protein kinase C phosphorylates the "a" forms of plasma membrane Ca2+ pump isoforms 2 and 3 and prevents binding of calmodulin. //J Biol Chem. 1997. V. 272. 44. P. 27525-8.
68. Enyedi A., Flura M., Sarkadi B., Gardos G.Carafoli E. The maximal velocity and the calcium affinity of the red cell calcium pump may be regulated independently. //J Biol Chem. 1987. V. 262. 13. P. 6425-30.
69. Enyedi A.Penniston J. T. Autoinhibitory domains of various Ca2+ transporters cross-react. //J Biol Chem. 1993. V. 268. 23. P. 17120-5.
70. Erdahl W. L., Chapman C. J., Taylor R. W.Pfeiffer D. R. Ca2+ transport properties of ionophores A23187, ionomycin, and 4-BrA23187 in a well defined model system. //Biophys J. 1994. V. 66. 5. P. 1678-93.
71. Erdahl W. L., Chapman C. J., Taylor R. W.Pfeiffer D. R. Ionomycin, a carboxylic acid ionophore, transports Pb(2+) with high selectivity. //J Biol Chem. 2000. V. 275. 10. P. 7071-9.
72. Fekete Z., Kimura M., Horiguchi M., Gardner J. P., Nash F.Aviv A. Differences between store-dependent Ca2+ fluxes in lymphocytes from African Americans and whites. //J Hypertens. 1996. V. 14. 11. P. 1293-9.
73. Fink C. C., Slepchenko B., Moraru, II, Watras J., Schaff J. C.Loew L. M. An image-based model of calcium waves in differentiated neuroblastoma cells. //Biophys J. 2000. V. 79. 1. P. 163-83.
74. Freire M. M., Mignaco J. A., de Carvalho-Alves P. C., Barrabin H.Scofano H. M. 3-O-methylfluorescein phosphate as a fluorescent substrate for plasma membrane Ca2+-ATPase. //Biochim Biophys Acta. 2002. V. 1553. 3. P. 238-48.
75. Frey T. G.Mannella C. A. The internal structure of mitochondria. //Trends Biochem Sci. 2000. V. 25. 7. P. 319-24.
76. Fulop T., Jr., Barabas G., Varga Z., Csongor J., Hauck M., Szucs S., Seres I., Mohacsi A., Kekessy D., Despont J. P.et al. Transmembrane signaling changes with aging. //Ann N Y Acad Sci. 1992. V. 673. P. 165-71.
77. Furukawa K., Tawada Y.Shigekawa M. Protein kinase C activation stimulates plasma membrane Ca2+ pump in cultured vascular smooth muscle cells. //J Biol Chem. 1989. V. 264. 9. P. 4844-9.
78. Furukawa K., Tawada Y.Shigekawa M. Regulation of the plasma membrane Ca2+ pump by cyclic nucleotides in cultured vascular smooth muscle cells. //J Biol Chem. 1988. V. 263. 17. P. 8058-65.
79. Gardner J. P.Balasubramanyam M. Na-Ca exchange in circulating blood cells. //Ann N Y Acad Sci. 1996. V. 779. P. 502-14.
80. Gatto C., Hale C. C., Xu W.Milanick M. A. Eosin, a potent inhibitor of the plasma membrane Ca pump, does not inhibit the cardiac Na-Ca exchanger. //Biochemistry. 1995. V. 34. 3. P. 965-72.
81. Gatto C.Milanick M. A. Inhibition of the red blood cell calcium pump by eosin and other fluorescein analogues. //Am J Physiol. 1993. V. 264. 6 Pt 1. P. C1577-86.
82. Gebhardt R.Beck H. Differential inhibitory effects of garlic-derived organosulfur compounds on cholesterol biosynthesis in primary rat hepatocyte cultures. //Lipids. 1996. V. 31. 12. P. 1269-76.
83. Goeger D. E.Riley R. T. Interaction of cyclopiazonic acid with rat skeletal muscle sarcoplasmic reticulum vesicles. Effect on Ca2+ binding and Ca2+ permeability. //Biochem Pharmacol. 1989. V. 38. 22. P. 3995-4003.
84. Grafton G.Thwaite L. Calcium channels in lymphocytes. //Immunology. 2001. V. 104. 2. P. 119-26.
85. Gromadzinska E., Lachowicz L., Walkowiak B.Zylinska L. Calmodulin effect on purified rat cortical plasma membrane Ca(2+)-ATPase in different phosphorylation states. //Biochim Biophys Acta. 2001. V. 1549. 1. P. 19-31.
86. Gruska S., Ihrke R., Stolper S., Kraatz G.Siffert W. Prevalence of increased intracellular signal transduction in immortalized lymphoblasts from patients with essential hypertension and normotensive subjects. //J Hypertens. 1997. V. 15. 1. P. 29-33.
87. Grynkiewicz G., Poenie M.Tsien R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. //J Biol Chem. 1985. V. 260. 6. P. 3440-50.
88. Guerini D. The significance of the isoforms of plasma membrane calcium ATPase. //Cell Tissue Res. 1998. V. 292. 2. P. 191-7.
89. Guerini D. The Ca2+ pumps and the Na+/Ca2+ exchangers. //Biometals. 1998. V. 11.4. P. 319-30.
90. Guerini D., Garcia-Martin E., Zecca A., Guidi F.Carafoli E. The calcium pump of the plasma membrane: membrane targeting, calcium binding sites, tissuespecific isoform expression. //Acta Physiol Scand Suppl. 1998. V. 643. P. 26573.
91. Gunter T. E.Gunter K. K. Uptake of calcium by mitochondria: transport and possible function. //IUBMB Life. 2001. V. 52. 3-5. P. 197-204.
92. Guse A. H. Cyclic ADP-ribose (cADPR) and nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP): novel regulators of Ca2+-signaling and cell function. //Curr Mol Med. 2002. V. 2. 3. P. 273-82.
93. Guse A. H. Cyclic ADP-ribose: a novel Ca2+-mobilising second messenger. //Cell Signal. 1999. V. 11. 5. P. 309-16.
94. Guse A.H., Roth E.Emmrich F. Intracellular Ca2+ pools in Jurkat T-lymphocytes. //Biochem J. 1993. V. 291. Pt 2. P. 447-51.
95. Hamlyn J. M., Blaustein M. P., Bova S., DuCharme D. W., Harris D. W., Mandel F., Mathews W. R.Ludens J. H. Identification and characterization of a ouabain-like compound from human plasma. //Proc Natl Acad Sci U S A. 1991. V. 88. 14. P. 6259-63.
96. Hatori N., Fine B. P., Nakamura A., Cragoe E., Jr.Aviv A. Angiotensin II effect on cytosolic pH in cultured rat vascular smooth muscle cells. //J Biol Chem. 1987. V. 262. 11. P. 5073-8.
97. Haugland R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. 1996. V.? P. 507.
98. Herscher C. J.Rega A. F. On the mechanism of inhibition of the PMCa(2+)-ATPase by lanthanum. //Ann N Y Acad Sci. 1997. Y. 834. P. 407-9.
99. Herscher C. J.Rega A. F. Pre-steady-state kinetic study of the mechanism of inhibition of the plasma membrane Ca(2+)-ATPase by lanthanum. //Biochemistry. 1996. V. 35. 47. P. 14917-22.
100. Herscher C. J., Rega A. F.Garrahan P. J. The dephosphorylation reaction of the Ca(2+)-ATPase from plasma membranes. //J Biol Chem. 1994. V. 269. 14. P. 10400-6.
101. Hirsch K., Danilenko M., Giat J., Miron T., Rabinkov A., Wilchek M., Mirelman D., Levy J.Sharoni Y. Effect of purified allicin, the major ingredient of freshly crushed garlic, on cancer cell proliferation. //Nutr Cancer. 2000. V. 38. 2. P. 245-54.
102. Hohenegger M., Berg I., Weigl L., Mayr G. W., Potter B. V.Guse A. H. Pharmacological activation of the ryanodine receptor in Jurkat T-lymphocytes. //Br J Pharmacol. 1999. V. 128. 6. P. 1235-40.
103. Hojo M., Suthanthiran M., Helseth G.August P. Lymphocyte intracellular free calcium concentration is increased in preeclampsia. //Am J Obstet Gynecol. 1999. V. 180. 5. P. 1209-14.
104. Horiguchi M., Kimura M., Skurnick J.Aviv A. Parameters of lymphocyte Na+-Ca2+ regulation and blood pressure: the gender effect. //Hypertension. 1998. V. 32. 5. P. 869-74.
105. Hosoi E., Nishizaki C., Gallagher K. L., Wyre H. W., Matsuo Y.Sei Y. Expression of the ryanodine receptor isoforms in immune cells. //J Immunol. 2001. V. 167. 9. P. 4887-94.
106. Hoth M., Button D. C.Lewis R. S. Mitochondrial control of calcium-channel gating: a mechanism for sustained signaling and transcriptional activation in T lymphocytes. //Proc Natl Acad Sci USA. 2000. V. 97. 19. P. 10607-12.
107. Hoth M., Fanger C. M.Lewis R. S. Mitochondrial regulation of store-operated calcium signaling in T lymphocytes. //J Cell Biol. 1997. V. 137. 3. P. 633-48.
108. Husain M., Jiang L., See V., Bein K., Simons M., Alper S. L.Rosenberg R. D. Regulation of vascular smooth muscle cell proliferation by plasma membrane Ca(2+)-ATPase. //Am J Physiol. 1997. V. 272. 6 Pt 1. P. CI947-59.
109. Hussain A.Inesi G. Involvement of Sarco/endoplasmic reticulum Ca(2+) ATPases in cell function and the cellular consequences of their inhibition. //J Membr Biol. 1999. V. 172. 2. P. 91-9.
110. James P. H., Pruschy M., Vorherr T. E., Penniston J. T.Carafoli E. Primary structure of the cAMP-dependent phosphorylation site of the plasma membrane calcium pump. //Biochemistry. 1989. V. 28. 10. P. 4253-8.
111. Jelicks L. A.Gupta R. K. NMR measurement of cytosolic free calcium, free magnesium, and intracellular sodium in the aorta of the normal and spontaneously hypertensive rat. //J Biol Chem. 1990. V. 265. 3. P. 1394-400.
112. Kahn A. M., Seidel C. L, Allen J. C, O'Neil R. G., Shelat H.Song T. Insulin reduces contraction and intracellular calcium concentration in vascular smooth muscle. //Hypertension. 1993. V. 22. 5. P. 735-42.
113. Karlsson H., DePierre J. W.Nassberger L. Energy levels in resting and mitogen-stimulated human lymphocytes during treatment with FK506 or cyclosporin A in vitro. //Biochim Biophys Acta. 1997. V. 1319. 2-3. P. 301-10.
114. Keeton T. P.Shull G. E. Primary structure of rat plasma membrane Ca(2+)-ATPase isoform 4 and analysis of alternative splicing patterns at splice site A. //Biochem J. 1995. V. 306. Pt 3. P. 779-85.
115. Kessler F., Falchetto R., Heim R., Meili R., Vorherr T., Strehler E. E.Carafoli E. Study of calmodulin binding to the alternatively spliced C-terminal domain of the plasma membrane Ca2+ pump. //Biochemistry. 1992. V. 31. 47. P. 1178592.
116. Klishin A., Sedova M.Blatter L. A. Time-dependent modulation of capacitative Ca2+ entry signals by plasma membrane Ca2+ pump in endothelium. //Am J Physiol. 1998. V. 274. 4 Pt 1. P. CI 117-28.
117. Kosk-Kosicka D.Bzdega T. Effects of calmodulin on erythrocyte Ca2(+)-ATPase activation and oligomerization. //Biochemistry. 1990. V. 29. 15. P. 3772-7.
118. Kosk-Kosicka D., Bzdega T., Wawrzynow A., Scaillet S., Nemcek KJohnson J. D. Erythrocyte Ca2(+)-ATPase: activation by enzyme oligomerization versus by calmodulin. //Adv Exp Med Biol. 1990. V. 269. P. 169-74.
119. Lewis R. S. Calcium signaling mechanisms in T lymphocytes. //Annu Rev Immunol. 2001. V. 19. P. 497-521.
120. Lewis R. S.Cahalan M. D. Potassium and calcium channels in lymphocytes. //Annu Rev Immunol. 1995. V. 13. P. 623-53.
121. Liao F.Jiao L. Ligustrazine, allicin and shear-induced platelet aggregation. //Clin Hemorheol Microcirc. 2000. V. 22. 2. P. 167-8.
122. Lompre A. M. Sarcoplasmic reticulum in vascular cells in hypertension and during proliferation. //Clin Exp Pharmacol Physiol. 1999. V. 26. 7. P. 553-7.
123. Machaty Z., Ramsoondar J. J., Bonk A. J., Bondioli K. R.Prather R. S. Capacitative calcium entry mechanism in porcine oocytes. //Biol Reprod. 2002. V. 66. 3. P. 667-74.
124. Marhl M., Haberichter T., Brumen M.Heinrich R. Complex calcium oscillations and the role of mitochondria and cytosolic proteins. //Biosystems. 2000. V. 57. 2. P. 75-86.
125. Mohamadi A., Jarrell S. T., Shi S. J., Andrawis N. S., Myers A., Clouatre D.Preuss H. G. Effects of wild versus cultivated garlic on blood pressure and other parameters in hypertensive rats. //Heart Dis. 2000. V. 2. 1. P. 3-9.
126. Monteith G. R.Roufogalis B. D. The plasma membrane calcium pump—a physiological perspective on its regulation. //Cell Calcium. 1995. V. 18. 6. P. 459-70.
127. Monteith G. R., Wanigasekara Y.Roufogalis B. D. The plasma membrane calcium pump, its role and regulation: new complexities and possibilities. //J Pharmacol Toxicol Methods. 1998. V. 40. 4. P. 183-90.
128. Mooren F. C.Kinne R. K. Cellular calcium in health and disease. //Biochim Biophys Acta. 1998. V. 1406. 2. P. 127-51.
129. Mooren F. C., Lechtermann A., Fromme A., Thorwesten L.Volker K. Alterations in intracellular calcium signaling of lymphocytes after exhaustive exercise. //Med Sci Sports Exerc. 2001. V. 33. 2. P. 242-8.
130. Neyses L., Reinlib L.Carafoli E. Phosphorylation of the Ca2+-pumping ATPase of heart sarcolemma and erythrocyte plasma membrane by the cAMP-dependent protein kinase. //J Biol Chem. 1985. V. 260. 18. P. 10283-7.
131. Niggli V., Adunyah E. S.Carafoli E. Acidic phospholipids, unsaturated fatty acids, and limited proteolysis mimic the effect of calmodulin on the purified erythrocyte Ca2+ ATPase. //J Biol Chem. 1981. V. 256. 16. P. 8588-92.
132. Niggli V., Sigel E.Carafoli E. The purified Ca2+ pump of human erythrocyte membranes catalyzes an electroneutral Ca2+-H+ exchange in reconstituted liposomal systems. //J Biol Chem. 1982. V. 257. 5. P. 2350-6.
133. Nofer J. R., Pulawski E., Junker R., Seedorf U., Assmann G., Zidek W.Tepel M. Na(+)/Ca(2+) exchange inhibitors modulate thapsigargin-induced Ca(2+) and Na(+) influx in human lymphocytes. //Int J Clin Lab Res. 1999. V. 29. 2. P. 8992.
134. Oshima T., Young E. W.McCarron D. A. Abnormal platelet and lymphocyte calcium handling in prehypertensive rats. //Hypertension. 1991. V. 18. 1. P. 111-5.
135. Palma M.Taylor L. T. Extraction of polyphenols compounds from grape seeds with near critical carbon dioxide. //J Chromatogr A. 1999. V. 849. 1. P. 117-24.
136. Panyi G., Berecki G., Gaspar R., Seres I., Fulop T.Damjanovich S. Peripheral blood lymphocytes display reduced K+ channel activity in aged humans. //Biochem Biophys Res Commun. 1994. V. 199. 2. P. 519-24.
137. Penniston J. T.Enyedi A. Modulation of the plasma membrane Ca2+ pump. //J Membr Biol. 1998. V. 165. 2. P. 101-9.
138. Penniston J. T., Enyedi A., Verma A. K., Adamo H. P.Filoteo A. G. Plasma membrane Ca2+ pumps. //Ann N Y Acad Sci. 1997. V. 834. P. 56-64.
139. Perl A., Gergely P., Jr., Puskas F.Banki K. Metabolic switches of T-cell activation and apoptosis. //Antioxid Redox Signal. 2002. V. 4. 3. P. 427-43.
140. Poch E., Leach S., Snape S., Cacic T., MacLennan D. H.Lytton J. Functional characterization of alternatively spliced human SERCA3 transcripts. //Am J Physiol. 1998. V. 275. 6 Pt 1. P. C1449-58.
141. Pollack M.Leeuwenburgh C. Apoptosis and aging: role of the mitochondria. //J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2001. V. 56. 11. P. B475-82.
142. Pozzan T.Rizzuto R. High tide of calcium in mitochondria. //Nat Cell Biol. 2000. V. 2. 2. P. E25-7.
143. Prasad K., Laxdal V. A., Yu M.Raney B. L. Antioxidant activity of allicin, an active principle in garlic. //Mol Cell Biochem. 1995. V. 148. 2. P. 183-9.
144. Rabinkov A., Miron T., Konstantinovski L., Wilchek M., Mirelman D.Weiner L. The mode of action of allicin: trapping of radicals and interaction with thiol containing proteins. //Biochim Biophys Acta. 1998. V. 1379. 2. P. 233-44.
145. Rangarajan U.Kochar M. S. Hypertension in women. //Wmj. 2000. V. 99. 3. P. 65-70.
146. Ricciarelli R.Azzi A. Regulation of recombinant PKC alpha activity by protein phosphatase 1 and protein phosphatase 2A. //Arch Biochem Biophys. 1998. V. 355. 2. P. 197-200.
147. Rink R. J., Sanchez A., Grinstein S.Rothstein A. Volume restoration in osmotically swollen lymphocytes does not involve changes in free Ca2+ concentration. //Biochim Biophys Acta. 1983. V. 762. 4. P. 593-6.
148. Ritter M., Menon S., Zhao L., Xu S., Shelby J.Barry W. H. Functional importance and caffeine sensitivity of ryanodine receptors in primary lymphocytes. //Int Immunopharmacol. 2001. V. 1. 2. P. 339-47.
149. Rivera A., Conlin P. R, Williams G. H.Canessa M. L. Elevated lymphocyte cytosolic calcium in a subgroup of essential hypertensive subjects. //Hypertension. 1996. V. 28. 2. P. 213-8.
150. Rosa L. F., De Almeida A. F., Safi D. A.Curi R. Metabolic and functional changes in lymphocytes and macrophages as induced by ageing. //Physiol Behav. 1993. V. 53.4. P. 651-6.
151. Salvador J. M., Inesi G., Rigaud J. L.Mata A. M. Ca2+ transport by reconstituted synaptosomal ATPase is associated with H+ countertransport and net charge displacement. //J Biol Chem. 1998. V. 273. 29. P. 18230-4.
152. Sasaki N. Lack of deficiency in extracellular and mtralymphocyte free Mg2+ in genetically hypertensive rats. //Hiroshima J Med Sci. 1999. V. 48. l.P. 1-8.
153. Schatzmann H. J. ATP-dependent Ca++-extrusion from human red cells. //Experientia. 1966. V. 22. 6. P. 364-5.
154. Schuh K., Uldrijan S., Telkamp M., Rothlein N.Neyses L. The plasmamembrane calmodulin-dependent calcium pump: a major regulator of nitric oxide synthase I. //J Cell Biol. 2001. V. 155. 2. P. 201-5.
155. Sei Y., Gallagher K. L.Daly J. W. Multiple effects of caffeine on Ca2+ release and influx in human B lymphocytes. //Cell Calcium. 2001. V. 29. 3. P. 149-60.
156. Seidler N. W., Jona I., Vegh M.Martonosi A. Cyclopiazonic acid is a specific inhibitor of the Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum. //J Biol Chem. 1989. V. 264. 30. P. 17816-23.
157. Shilliday I. R.Allison M. E. Intraplatelet calcium levels in patients with acute renal failure before and after the administration of loop diuretics. //Nephrol Dial Transplant. 2001. V. 16. 3. P. 552-5.
158. Siegers C. P., Robke A.Pentz R. Effects of garlic preparations on superoxide production by phorbol ester activated granulocytes. //Phytomedicine. 1999. V. 6. l.P. 13-6.
159. Siegers C. P., Steffen B., Robke A.Pentz R. The effects of garlic preparations against human tumor cell proliferation. //Phytomedicine. 1999. V. 6. 1. P. 7-11.
160. Smith G. L., Duncan A. M., Neary P., Bruce L.Burton F. L. P(i) inhibits the SR Ca(2+) pump and stimulates pump-mediated Ca(2+) leak in rabbit cardiac myocytes. //Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2000. V. 279. 2. P. H577-85.
161. Stauffer T. P., Guerini D.Carafoli E. Tissue distribution of the four gene products of the plasma membrane Ca2+ pump. A study using specific antibodies. //J Biol Chem. 1995. V. 270. 20. P. 12184-90.
162. Strehler E. E.Zacharias D. A. Role of alternative splicing in generating isoform diversity among plasma membrane calcium pumps. //Physiol Rev. 2001. V. 81. 1. P. 21-50.
163. Sweadner K. J.Donnet C. Structural similarities of Na,K-ATPase and SERCA, the Ca(2+)-ATPase of the sarcoplasmic reticulum. //Biochem J. 2001. V. 356. Pt3.P. 685-704.
164. Thatte U., Bagadey S.Dahanukar S. Modulation of programmed cell death by medicinal plants. //Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 2000. V. 46. 1. P. 199-214.
165. Tiffert T.Lew V. L. Kinetics of inhibition of the plasma membrane calcium pump by vanadate in intact human red cells. //Cell Calcium. 2001. V. 30. 5. P. 337-42.
166. Tiffert T., Lew Y. L., Perdomo D.Ginsburg H. Effect of ferriprotoporphyrin IX and non-heme iron on the Ca(2+) pump of intact human red cells. //J Membr Biol. 2000. V. 175. 2. P. 107-13.
167. Toth S., Csermely P., Beregi E., Szkladanyi A.Szabo L. D. Decreased cytosolic free calcium concentration of aged human lymphocytes in resting state. //Compr Gerontol A. 1989. V. 3. Suppl. P. 16-22.
168. Touyz R. M.Milne F. J. Alterations in intracellular cations and cell membrane ATPase activity in patients with malignant hypertension. //J Hypertens. 1995. V. 13. 8. P. 867-74.
169. Tsao P. W., Diaz R. J., Radde I. C., Wong P. Y., Martell M. F., Augustine J. M., Wilson G. J.Coles J. G. Age-related differences in the effects of cyclosporine on lymphocyte intracellular free calcium. //Transplantation. 1991. V. 52. 2. P. 3459.
170. Verma A. K., Paszty K., Filoteo A. G., Penniston J. T.Enyedi A. Protein kinase C phosphorylates plasma membrane Ca2+ pump isoform 4a at its calmodulin binding domain. //J Biol Chem. 1999. V. 274. 1. P. 527-31.
171. Wacholtz M. C., Cragoe E. J., Jr.Lipsky P. E. Delineation of the role of a Na+/Ca2+ exchanger in regulating intracellular Ca2+ in T cells. //Cell Immunol. 1993. V. 147. 1. P. 95-109.
172. Wehling M., Kasmayr J.Theisen K. The Na(+)-H+ exchanger is stimulated and cell volume increased in lymphocytes from patients with essential hypertension. //J Hypertens. 1991. V. 9. 6. P. 519-24.
173. Wictome M., Michelangeli F., Lee A. G.East J. M. The inhibitors thapsigargin and 2,5-di(tert-butyl)-l,4-benzohydroquinone favour the E2 form of the Ca2+,Mg(2+)-ATPase. //FEBS Lett. 1992. V. 304. 2-3. P. 109-13.
174. Williams A. J. Ion conduction and selectivity in the ryanodine receptor channel. //Front Biosci. 2002. V. 7. P. dl223-30.
175. Wu K. D., Lee W. S., Wey J., Bungard D.Lytton J. Localization and quantification of endoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase isoform transcripts. //Am J Physiol. 1995. V. 269. 3 Pt 1. P. C775-84.146
176. Zaloga G. P., Washburn D., Black K. W.Prielipp R. Human sepsis increases lymphocyte intracellular calcium. //CritCare Med. 1993. V. 21. 2. P. 196-202.
177. Zylinska L., Guerini D., Gromadzinska E.Lachowicz L. Protein kinases A and C phosphorylate purified Ca2+-ATPase from rat cortex, cerebellum and hippocampus. //Biochim Biophys Acta. 1998. V. 1448. 1. P. 99-108.
178. Zylinska L.Soszynski M. Plasma membrane Ca2+-ATPase in excitable and nonexcitable cells. //Acta Biochim Pol. 2000. V. 47. 3. P. 529-39.1471. БЛАГОДАРНОСТИ
179. Данная работа обязана своим появлением многим замечательным людям.
180. Самые теплые слова хочется сказать научным руководителям профессору Евгению Ивановичу Асташкину и академику РАМН Юрию Андреевичу Владимирову за прекрасное отношение к моей работе и ко мне лично несмотря на мой трудный характер.
181. Я глубоко признательна члену-корреспонденту РАМН Сергею Витальевичу Грачеву за возможность проведения работы в Лаборатории экстремальных состояний НИЦ Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова, где эта работа и была выполнена.
182. Отдельные слова благодарности коллективу 59 Городской клинической больницы за помощь в обеспечении клинического материала диссертации.
183. Благодарю Наталию Александровну Тилькунову и Дмитрия Юрьевича За-лепугина из Государственного научно-исследовательского института органической химии и технологии за предоставленный аллицин и плодотворные научные консультации.
184. Большое спасибо всему дружному коллективу Лаборатории экстремальных состояний НИЦ ММА им. И.М. Сеченова и кафедры биофизики Медико-Биологического факультета РГМУ за неоценимую помощь на всех этапах выполнения работы.
185. Я выражаю искреннюю признательность всем, кто поддерживал и вдохновлял меня на продолжение научных исследований.
-
Беликова, Наталья Алексеевна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2003
-
ВАК 03.00.02
- Свойства транспортных АТФаз в различных мембранных препаратах эритроцитов человека и крысы в норме и при первичной артериальной гипертензии
- Na, К-АТФаза как интегральный компонент плазматической мембраны эритроцитов и её свойства при некоторых физиологических состояниях
- Исследование состояния системы Са2+-обмена в клетках крови облученных сельскохозяйственных животных
- Влияние тактивина на структурные и функциональные свойства плазматических мембран лимфоцитов
- Механизмы перераспределения и транспорта Са2+ при ритмическом возбуждении миелинового нерва
