Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы перераспределения и транспорта Са2+ при ритмическом возбуждении миелинового нерва

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы перераспределения и транспорта Са2+ при ритмическом возбуждении миелинового нерва"

л

На правах рукописи УДК 577.3; 612.01 А

МАКСИМОВ ГЕОРГИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

МЕХАНИЗМЫ ПЕРЕРАСПРЕДЕЛЕНИЯ И ТРАНСПОРТА Са2* 1РИ РИТМИЧЕСКОМ ВОЗБУЖДЕНИИ МИЕЛИНОВОГО НЕРВА

03.00.02-биофизика 03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА-199?

Работа выпо/иена на касредре биофизики биологического факу/ътета Московского государственного университета им.М.В.Ломоносова

Научный консультант доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН Рубин А.Б.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук ТкачукВ.Я. профессор, член-коррРАН

доктор физико-математических наук,профессор Фадеев В.В.

доктор биологических наук Чемерис Н.К.

Ведущая организация: НИИ Общей патологии и Патофизиологии РАМН

Защита состоится 1997г. в 1 Бчас.ЗО мин на заседании

Диссертационного СоветаД.053.05.53 при Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова по адресу: 119899 Москва Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет (ЛИК)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ

Автореферат разослан " 1997г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор биологических наук, профессор

Т.Е.Кренделева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность_Проблемы, Функциональным проявлением

активности нервной клетки шляэтся генерация и проведение потенциалов действия (ПД), что служит основным механизмом передачи информации в организме. Как правило, данная функция осуществлязтся путем формирования ритмических рядов ПД разги'-ной частоты и длительности т.е. за счет проведения нервом ритмического возб^ркдения (РВ). В настоядее время накоплен значительный эхпериментшъный материал электрофизиологических и биофизических исследования свидетельствующий о том, чта для генерации ПД в аксоне достаточно на-гичля селективных, потен циалозависимых канатов, тогда как для про ведения РВ необходимы допошительные ионтранспортирующие системы (ИТС), специфические изменения состояния аксолеммы, а также миелина и шванновской клетки (ШК)[Ходоров,1975;Ройтбак,1993;Hodgkin, Keynes.l957;Tasakl1982;Vülegas et al.,1986;H¡lle,1990; Waxman et al, 1995].

При исследовании структуры о- м орфошгических изменений основных компонентов миешнового нервного волокна было обнаружено, что взаимодействия аксона и ШК в ходе РВ сопрово+даются накоплением в межклеточной среде Ю, глотамата, ацеггилхоллна и изменениями обьема аксона ШК и миегина [Rosenbluth.1980; Villegas et al.,1986; Ariyasu, Ellis-man,1987;Couíter et al.,1992]. Таким образом, перераспределение и транспорт ионов и воды входе РВ контролируется системам а координирующими межклеточные взаимодействия аксона и ШК, причем существенное значение приобретают не изоляторные, а ионообменные свойства миешна [Сотников,1976; Ellisman et al.,1980; Padrón, Mateu,1982; Kahn. Morell,1988; Waxman.Rítchie.1 992].

Важные успехи современной биофизики нервной клетки быш достигнуты при изучение молекул^ных и мембранных процессов, контролирующих активность потенциалозависимых канашв при генерации ПД

[Cohen,Lesher, 1986; Ritchie в» aJ.1990; Hille, 1990;Franklin et all 992]. В ходе физико-химического и биофизического исследования РВ был выявлен ряд параметров, изменения которых характеризуют составив аксолем-мы при активации ИТС нервного волокна: изменения теплопродукции светорассеамя и двойного лучепреломления гипидного состава клеточных мембран, а также конформационного состоянияотде/ьных бежовых молекул и их мембранных комплексов. Эти, а также результаты погучен-ные с помощью флуоресцентных зондов, спектроскопии ЭПР, ЯМР и комбинационного рассеяния отражают совокупность молекулярных и мембранных процессов, сопутствующих перераспределению и трале-порту Na* К.*, Ca2*, СГ и Н* в нервном волокне при РВ [Szalontai et al.,1977; Georgescauld et al.,1980; Tasaki, 1982; Waxman etal.1995].

Среди многообразия мембранных и клеточных процессов, сопровождающих РВ нервного волокна клочевое место занимает феномен, отражающий зависимость возбудимости аксона от градиента концентрации Ca2* на аксолемме [Frankenhauser, Hodgkin,1957; Hille,1978; Strickholm, 1981; Tasaki.1982]. Изменение содержания Ca2* в экстраклего,-ной среде приводит к модификации поверхностного заряда внутримембранного электрического поля и потенциала активации ионных каналов. Модуляции критического потенциала аксолеммы отражаются в характере ритмического ответа вогакна: при увеличении экстраклеточюй концентрации Ca2* порог возбуждения повышается и происходит блокирование РВ, а при уменьшении -порог снижается и возникает спонтанный ритмический ответ.

Изменениям концентрации свободного внутриклеточного кагъция принадлежит важная рогь в регулщии функциональной активности клетки. Отметим гишь некоторые системы, функционирование которых свиде-тте/ъствуето важной роли кэю>цияв регугшии клето^ого метабогмзма проводимость межклеточных контактов [Gillula, Epstein,! 976; Чайлахян,

1980]; проницаемость плазматических мембран для одновалентных катионов и воды [Romero, Whhtam.19?1;Colombe,1974]; активность рша мемб-раносвяэанных и цитоплазматтических ферментов.среди которых (ТГФаза актомиозинового комплэкса [Weber.Gergely.1980}. Na*,K*-ЯГФаза [Dun-hamGJynn,1961], цмклазы трифосфонуклэотидов и фосфодиэстераза [Na-rayan, Sulakhe,1977;Северин,Ткачщк. 1979), киназа фосфоригазы b [Brost-гощ.1971] и др. Вход межклеточного кальция при РВ стимушр.ует существенные перестройки метабошзиа аксона и ШК. что проявляется в усилении поглэшения кислорода и окисгмтельного фосфюригмрования активации фосфо/ипаз фосфорилирования мембранных бегков и активации аксонагьного транспорта [Howarth et al.,1968; McDougal et el.,1975; Lan-downe 1990]. Сто/ъ широкий характер участия кагьция в регугшии метаболизма определяет актуальность изучения механизмов, обеспечивающих низкую концентрацию иона в цитоплазме. Таким образом, перераспределение и транспорт экстраклэтичного и внутриклеточного Саг* яэгиэтся одним из важнейших, кпочевых процессов, контролирующих функционирование межклеточных и внутриклеточных систем при проведении РВ в миелиновом нерве.

Цель и запачи исследования. Основная це/ъ настоял ей работы заклочалась в изучении механизмов компертментагмзшии, перераспределения и транспорта Са2+ в аксоне и шванновской клэтке. а также роги Са2+ в регулялии экстр ак лето'-пых и внутриклеточных процессов, обеспечивающих мембран о-клеточные перестройки при проведении ритмического возб'^кдения в миелиновом нервном волокне. В связи с злим быш поставлены следующие задачи:

• исследование механизмов перераспределзния и транспорта Са2" в межклеточных компаргтментах нервного волокна (межклеточное пространство, миелин, поверхность плазматической мембраны аксона и ШК);

■ исследование механизмов перераспределвния и транспорта Са2*во внутриклеточных компартментзх нервного волокна (внутренняя поверхность плазматических мембран аксона и ШК, митохондрии, эндоплазм этический ретикулум);

• исследование механизмов перераспределения и транспорта Са2* в аксо-лемме (Са2*-канал, Ыа*/Са2*-обмен и Са 2*-ЯТФеза, состояние липидов)

Наичная новизна В результате проведенного исследования впервые установлено, что проведение ритмического возб^аденияв мие-анновом нерве осуществляется за счэт активации допогнитвлзных мембранных ИТС, структурных перестроек плазматических и субклеточных мембран, атакже координации межклеточных взаимодействий аксона и шванновской клетки. Клочевую ро/ь в координации мембран о-клеточных процессов выполняот межклеточные структуры (миелин) и ШК, а также внутриклеточные системы перераспределения и транспорта Са2*. Впервые доказано, что распределение межклеточного Са2* в миелиновом нерве обеспечивается эа счет связывания иона на поверхности ШК и внутренних структур миепнна (мезаксон и область насечэк Шмидтаг Ла-термана). РВ сопровождается перераспределением свободного и связанного Са2* за счет входа иона в аксон и ШК из м ежклеточного пространства атакже Са2*, десорбированного с экстраклеточной поверхности ШК и внутренней поверхности насечек Шмидта-Латермана При РВ нерва миежн выполняет роль межклеточного катионобменника (буфера Са2*), обеспечивающего поддержание стационарного уровня с£*.

Впервые показано, что вход Са2* в аксон миешнового нерва при РВ осуществляется по потенциалозависимым Ыа*- и Са2+- каналам, атакже за счет обратной моды Ыа7Са2+- обмена Основную ро/ъ в восстановлении исходного уровня межклеточного Са2*в перехвате Ранвье выполняет Ыа*/Са2*-обмен аксона и ШК. а в п арап одагъ ной области-Са2*-ЯТФ аза

аксолэммы. При РВ миепинового нерва поступление Са2* в аксон и ШК сопровождается деумя последовательными процессами: первый обеспечивает связывание иона на внутриклеточной поверхности плазмэтических мембран, мембран эндоплазм этического ретикуг^м а и митохондрия а второй- Эффективное ЯТФ-зависимое связывание (аккумуляций Са2+в данных структурах. В аксоне аккумуляция Са2* осуществляется Са2-ЯТФазои, а в шваннобской кгетке-Ыа7Са2*~ и Са2*/Н+-обменом митохондрий. Выявлена четкая последовательность данных процессов при РВ: аккумушдия Са2* в аксоне запускается при более низких концентрация* поступившего Са2*. чем в ШК, причем сначала активируется Са2+- РИФ аза аксолеммы. а затем Са2*-ЯТФазазндоплазматическ.ого ретикулума.

Впервые обнаружено, что при РВ миеяинового нерва перераспределение Са2*, связанного на экстракгеточной поверхности аксолеммы, осуществляется за счет зарякенных групп фосфо/ттидов и БН-содержащих бегков, что проявится в изменении упорядоченное™ неполезной фазы и способствует формированию латера/ъной гетерогенности мембранных фосфолипидов. Вход Са2<" в аксон и ШК стимугирует активность фосфо-липаз и фосфоригмрование мембранных бежов, что сопровождается изменениями фосфошпидного состава и чист активных форм Ыа+.К*-ЯТФазы в аксолемме и ацетигкогинового рецептора в ШК. Впервые изучена рогь межклеточных мессенжеров (К", глотам ест и ацетижошн) в регуляции уровня меж- и внутриклеточного Са2*. рН и координации межклеточных взаимоотношений аксона и ШК при РВ.

Наччно - практическая ценность работы. Обнаруженные в работе закономерности Са2+-зависимых процессов, координирующих ионный транспорт, изменения состояния мембран и межклеточные взаимоотношения аксона и ШК, расширяют существующие представления о первичных процессах, определяющих состояние мембрэно-клеточных структур при РВ миелинового нерва и важны для понимания функциониро-

еания нервных клеток ЦНС и ПНС. Результаты исследования могут быть испогъзованы при изучении могвкулфных механизмов генерации и проведения РВ, разработки фармакологических подходов воздействия на перераспределение и транспорт Са2\ а также для понимания патологии ЦНС и ПНС, сопровождающейсядемиегмнизацией иги ишемией. Практическим результатом исследования жляотся теоретические заключения представленные в четырех монография* и в двух патентах РФ, что ис-по/ъзуется в курсах лекций и практикумах по биофизике для студентов и аспирантов кафедры биофизики Биологического факугьтета МГУ им. Ломоносова и Биологического факультета МГУ (Саранск),

Апробация работы. Результаты работы быт доложены и/и представлены на более 30 научных конференция«: и симпозиумах в том числе: секции биофизики МОИП (Москва 1972-1996); 12-ом Всесоюзном съезде физиологического общества (Тбигиси,1975); Всесоюзном симпозиуме "Свободнорадикалзное окисление шпидов в норме и патоло-гии"(МосквэИ 976);Всесоюзной конференции "Транспортные РГГФазьГ (Тбилиси, 1978):2-й Международной конференции "Вода и ионы в биологических системах" (Бухарест,1981); 1-ом Всесоюзном биофизическом съезде (Москва.1 982); 9-ом Всесоюзном съезде по нейрохимии (Ере-ван,1983);3-еи Международной конференции "Вода и ионы в биологических системах" (Бухарест, 1984); Всесоюзной конференции "Динамика и механизмы переноса электрона в бегковых системах и молекулах (Вильнюс, 1985):Совещании "Морфофункционагьная роль мембрано-про-теиновых комплексов в норме и патологии" (Саранск, 1985); 4-ой Всесоюзной школе "Лазеры в биологии" (К.ишинев,1986); 4-ой Международной конференции "Вода и ионы в биологических системах" (Бухарест,1987); 19-ом Югосшвском симпозиуме по биофизике (Сараево. 1988); 19-ом Конгрессе Югославского физиологического общества (Бел"рад,1988): 31-ой Конференции химического общества Сербии (Белград, 1989); 19-ом

Совещании Европейского биохимического общества (Рим, 1989); Международной конференции "Лазеры в медицине"(Москва.1989); Межцуна-родном симпозиуме Югосгавского биофизического общества "Биофизика мембранных процессов" (Риека1990); 3-ей Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул(Болония1989); 12-ой Международной конференции по спектроскопии Рамана (Южная Каролина, 1990); 3-ей Международной конференции по лазерной спектроскопии и диагностики биологических объектов (Москва 1990); Международной конференции "Применение лазеров в науках о жизни" (Москва! 990); 2-ом Международном конгрессе по применению низкоинтенсивного лазерного излечения в медицине (Токио,1 990); 1-ом Международном биофизическом конгрессе по биотехнологии (Стамбул 1991); 11-ом Международном биофизическом конгрессе (Будапешт, 1 993); 5-ом Конгрессе Европейского общества фотобиолзгов (Мврбург,1993); 1-ом Европейском совещании по функционированию глмалэных клэток в норме и патологии (Хейдегьберг,1994); Ежегодном симпозиуме Американского общества нейробиологов (Вашингтон,1 996), 2-ом съезде биохимического общества российской академии наук. (Москва, 1997), 2-ом конгрессе по биофизике (ЕВБА Орлеан, 1997), Симпозиуме по биомедицинской оптике (Сан Ремо, 1997).

Основные результаты доложены и обсуждены на специашзированном научном семинаре в Московском государственном университете.

Публикации. По по/ученным результатам опубликовано 105 печатных работ, в том числе 4 монографии и два патента РФ.

Структура и обьем работы. Диссертация состоит из введения, двух глав описания объектов, методов исследования и полученных результатов, обсуждения и заклочения выводов и списка цитируемой литературы из 484 наименований. Работа изложена на 267 страницах ил люстрирована 11 таблицами и 101 рисунком.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследования испо/ъзовагп изолированные нервы конечностей травяной лтушки (Rana temporaria), краба (Carcenus maenas) и крысы (Ratus norvegicus), а так же нервы мантии кальмара (Ommantostrephus sloanei pasiphicus), зрите/ьные нервы кролика и мыши. Объектами исследования служили также нейроны виноградной уллтки (Helix pornatia) и пиявки (Hirudo medicinalis и Macrobdella decora), клетки ку/ътуры астроцитов и ггиомы С6 (коллекция клеточных кугьтур Института цитологии, С.-Питербург).

Решение поставленных в работе задач требовало привлечения широкого набора физико-химиуэских биофизических и биохимических методов, основные из которых перечислены ниже.

Препаративные методы. Липиды экстрагировали из нервов смесью хлороформ- метанол-вода [Bligh,Dyer, 1959], разделяя с помощью тонкослойной хроматографии в системе хлороформ-метанол-аммиак и идентифицируя фосфожп иды с помощью свидетелей; мембраны саркоплазм этического ретикулума выделяли из гомогената мышц задних конечностей кротка [Ритов 1971]; мембранные фракции из нерва лягушки и мозга крысы получали с помощью центрифугирования в градиенте фикола [Кравцов идр.,1979]; идентификацию полученных мембранных фракций проводит определяя активность маркерных ферментов: сукцинатаегцц-рогеназы [Соорег,1967),5'-нуклеотадазы [Ruthbum. 1 969], Na+,K+-(ТГФазы [Болдырев, 1978] и ацетилколинзстеразы [Ellman et al.,1961]. При исследовании связывания и аккумугшии Са2* мембранными фракциями исполэ-зоваги комбинацию метода изотопного замещения и метода осаждения фракций на фильтрах при встраивании ^-каротина в мембраны саркоплазм этического ретикугума использовали модифицированную методи-

ку, разработанную для встраивания ф/уоресцентн ого зонда 1.6-дифенил 1,3,5-гексатириена в липосомы и клетки [Shinitzky,1976],

Методы рвгиггтртши. В связи с конкретными задачами исследования в работе испогьзоваш следующие методы определения содержания кальция атом но-адсорбционная спектрофотометрия метод меченых атомов и ф/щоресцентных зондов. Связанный и свободный Са2* в нервном волокне и гшагьных клетках регистрировала с помощью ф/уоресцентных зондов хлортетрациклин (ХТЦ) и fura - 2 [Gryrik¡sw¡c2,1985], а также с помощью ряаа гистохимических методов с применением ХТЦ [Карнаухов, 1975], пироанттноната калия [Krishnan,Singer,1974] и оксалата калия [The-ron et al.,1974]. Изменения pH регистрировали с помощью селективных м акрозгвктродов и фгуоресцентного зонда, ф^оресцеиндиацетата [Ли-тинская и др. 1 984]; мембранный потенциал и потенциал действия нейронов и аксонов регистрировали с помощью микрозлектродов и методом изолированного мостика [Гасаки, 1957;Kleinbaus et al, 1990]; с помощью изотопного анализа регистрировали связывание с клетками оуабаина бунгаротоксина. ацетигколина хояинхлорида, фосфаттидилинозитога и инозитила а также транспорт в клетках Na*, Rb* К* и Са2*. Определение радиоактивности проводил! методом жидкостной сцинтипяаии на установках Mark-2 и Intertechnique (Франция); резонансное комбинационное рассеяние (РКР) клеток регистрировали на спектрометре "Dilor z-24" (Франци^ стройным монохроматором и фотоэлектронной регистрацией сигнала. Зались и обработку спектров проводили с помощью "Leonard РС/АТ"(Франция). В качестве источника возбуждения испогьзовали аргоновый лазер "Spectra-Physics'l64-03 (США). В ряде случаев применяли РКР спектрометр, разработанный на кафедре биофизики МГУ; регистрацию сигнала ЗПР от спин-мечэной пагьмитиновой кислоты, встроенной в миелиновое волокно проводили на спектрометре "Varían Е-9"; время спин-спиновой релаксации протонов воды определяли с по-

мощью установки ЯМР-спиновое з<о с цифровой регистрацией амплитуды з<о-сигналов (рабочая частота 17 мГц) [Аксенов и др,1971]; содержание компонентов адениловой системы в нерве (АТФ. РЦФ и АМФ) определяли с помощью высоковольтного электрофореза.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУ>КДЕНИЕ

1.Исследование перераспределения и транспорта межклеточного Са2* при ритмическом возбуждении нерва

Для характеристики систем, регулирующих содержание межклеточного Са2+ при РВ мы исследовали перераспределение и транспорт иона в аксоне, миелине и ШК. В состоянии покоя 28% Са2* сосредоточено в аксоне иШК, а 72%в межклеточной среде, причем 48% Са2* локализовано в периаксоналъном пространстве и перехвате Ранвье, а 24% Са2* в структурах миелина с ограниченным доступом к межклеточной среде (мезак-сон, пространство насечек ШмиигегЛантермана), а так же в связанной форме на поверхности аксолеммы и плазмати'-еской мембраны ШК. Мы показали, чгго более 60% Са2+ в межклеточном пространстве находится в свободной форме, а поверхность ШК, внутренние структуры миелина с/ужат зкстраклвточным "Са^-депо" аксона, где ион локализован как в свободной, тек и связанной формах. Таким образом, свободный Са2* межклеточного пространства (18% от всего Са2* нерва) шляется основным источником для поддержания постоянного градиента Са2+ на плаз-лаг тмческих мембранах аксона и ШК. При этом, значительная часть Са2*, связанного на поверхности плазматической мембраны ШК и в миелине гвляется дополнительным источником Са2*. используемого при РВ аксона.

В состоянии покоя перераспределение межклеточного 45Са осуществляется быстрее у немиелиновых, но более выражено у миелиновых нер-

Еов. При РВ нерва процессы перераспределения и транспорта межклеточного 45Са усиливаются и в первую очередь в миелиновых нервах.РВ. наряду с активацией входа Са2* в аксон и ШК, ускоряет выход <5Са из миелина свидетельствуя о перераспределении Са2*в межклеточных ком-партментах волокна и диффузии иона к аксону (рис Л ).

РВ приводит к увеличению входа Са2* в аксон и ШК из межклеточного пространства {ЗОЦ, что компенсируется десорбцией Са2* с поверхности ШК, транспортом иона по мезаксону (1и выходом из области насечек Шмидта-Лантермана миелина (около 7 Последние два процесса сопоставимы с прямым входом Са2* в аксон из межклеточной среды и выполняют существенную роль при длительном РВ. В ходе исследования бы ла выдалена последовательность данных процессов: по мере проведения РВ вход 45Са в аксон и ШК из межклеточного пространства сменялся входом Са2*, десорбированного с поверхности ШК и миелина причем последний процесс максимапэн, когда первый уже близится к завершению (рис.2). Перераспределение и вход межклеточного Са2+ зависят от частоты РВ аксона; максимальные изменения наблюдаются у миелнно-вых нервов и при больших частотах РВ. Подученные данные свидетельствуют о различной лабильности мембранных и клеточных процессов, обеспечивающих перераспределение и транспорт межклеточного Са2* в миелиновых и немиелиновых нервах при РВ аксонов.

Основными ионтрэнспортирующими системами, регулирующими уровень межклеточного Ca2t в состоянии покоя нерва жлиотся Na+/Ca2+-обмен, контролируемый Na^K-РГГФазой и Са27Н+ - обменом митохондрий, а при РВ к ним добавляется вход Са2+ по потенциалоззвисимым Na+-и Са2+- каналам. Увеличение содержания межклеточного калия при РВ аксона стимулирует вход Са2* в ШК за счэт К+-деполфизации плазматической мембраны, перераспределения воды из аксона в ШК и изменения обьема внутренних структур миелина. Перераспределение и транспорт

Содержание "5Са,1аш моль/мг

20 л

151050-

10 15

Время,мин.

300-

х

1

Д 200-

100-

□к

основная мембрана

наружный компартменг шванновск.ой клетки внутренний мезаксон внутренняя губа шванновскои клетки линии высокой плотности в миелине линии низкой плотности в миелине внутренний компаргтмент шванновской клетки периаксональное пространство наружный мезаксон внутренняя губа шванновской клетки

Содержание ,5Са,1 СГ,!| мопь/мг

15

20 о 50 100 150 200 250 300 Время.мин.

1 2 3

Рис.1 Перераспределение и транспорт Са2* при ритмическом возбу+пе-нии нерва Я. Схема строения миелинового нервного волокна; Б.Кинетика входа 45Са в немиелиновые нервы краба и кальмара (1,2) и миелиновый нерв (3) при РВ; В.Кинетика выхода Са из миелинового нерва при РВ (1) и в покое (2);Г.Константы времени г (1-3) выхсща45Са из миелинового нерва в покое (К) и при РВ (0)

¡3

о

межкгетачного Са2* при РВ осуществляется и в перехвате Ранвье,и в па-ранодальной области миелинового волокна. Помимо прямого входа С^*

15-

л

§ 10-ъ

а

о-1

—I— 10

20

30

Время ,мин.

110

3

О/

100 £

п> I

с

X

—I

90 'з

В

80.

—1 40

Рис.2 . Вход Са2+(1) и содержание связанного Са?*(2) в миелиновом нерве при ритмическом возбуждении

в аксон из межклеточной среды в области перехвате Ранвье (аналогично Ыа*), Са2+ накапливается на зк страх лето чной поверхности плазматической мембраны ШК, и при РВ поступает в ШК, а затем и в аксон. В пара-нодальной обтсти волокна данный процесс уступает место транспорту Са2* по мезэксону или десорбции иона в области насечек Шмидта- Лан-термана миегина Структурные изменения миелина при РВ нерва стимулируют поступление Са2* к аксолэмме по мезаксону, а вход Са2* в ШК регулирует изменения обьем а клетки. Таким образом, перераспределение межклеточного Са2" при РВ затрагивает миелин. что обеспечивает координацию взаимодействий аксона и ШК. В честности десорбция связанного Са2* в области насечек Шмидта-Лалтермана жлявтся одним из механизмов поддержания стационарного уровня С'а2* в межклеточном пространстве, атак же контролирует перераспределение воды и соо-пно-

шение объемов аксона и ШК при РВ миелинового нерва [Ппеал,1957; Ellisman et al., 1980]. Нами было показано, что гипотоническое набухание глиальных клеток (глиом аС^астроцит) активировало Na^/H"-обмен, 1Ма*,К+,2СГ-котранспорт, атакже выход К+по каналам, чувствительным к хинидину и Ва2+. Эти результаты, как и факт увеличения входа Са2* зз. счет актмваиии L-тнла Са2+-каналов свидетельствуют о наличии Са2*-активмруемого К+-тока регулирующего набухание ШК входе РВ аксона Вход Ca2t в ШК может быть также обусловлен обращением моды №7Са2-обмена [Kirrt-Lee et al,1 992; Fatatis, Brenneman, 1 990; Blaustain et el, 1991] или активацией Са2*-кальмодулин зависимой протеин киназы или протеин киназы С [ПК-С], регулирующих изменения объема астроцитов [HazaimOkadaJ 990]. Таким образом, изменения содержания межклеточного Са2* при РВ тесно связаны с процессами осморегулядии аксонаШК и зависят от перераспределения С§" в миелине.

В ходе проведенного исследования быт выявлены и другие Са2*-зави-симые процессы, контролирующие межклеточные взаимодействия аксона и ШК при РВ. Известно, что наряду К* при РВ из аксона выходит г по там ест и активирует рецепторы в ШК [Villegas et al.,138G;Cornelf- Bell, Finkbe¡ner,1991; Waxmari et al.,199Б]. Мы обнаружили увеличение входа и содержания Са2+ в астроцитэх при увеличении экстраклеточной концентрации К* и глотамата. Вероятно, данные процессы запускают выход из ШК ацетилсолина (№<) и вход Са2* черезацетилколиновый рецептор (FKP) или L-тип Са2+-каналов, что обеспечивает поддержание стационарного уровня межклеточного Сё^при РВ аксона.

С другой стороны, вызванные РВ аксона изменения в миелине и ШК воздействуют на возбудимость и самого аксона Так, снижение межклеточного рН приводит к инактивации потенциалозависимых каналов, активации выхода Са2* из аксона и перераспределению Са2+ в миелине [Roos,Boron,1981; Wakabayashi et al.,1992]. Этот процесс зависит от рит-

ма возбуждения аксона свидетельствуя о важной роли межклеточных взаимодействий в регуляции уровня межклеточного Са2*. а следовательно возбудимости и лабильности аксона. Мы обнаружили, что рН межклеточной среды контролируется ШК. и зависит от РВ аксона; блокирование потенциалюзависимых 1Ма\ Са2*-каналов и Ыа+-насоса существенно снижало, вызванные стимуляцией изменения межклеточного рН. Увеличение рН межклеточной среды при РВ миелинового нерва приводило к смещению рК входа 45Са. свидетельствуя о наличии зависимости межоу входом Са2*в аксон и функционированием ИТСШК(рис.З,Я ).

Содержание. СГП мояь/мг

60-

40-1

6

рН

рН аксоплазмы

655 6(45-5356,15-1

рН 8.5

рН 6,4

5 10 15

Время.мин

20

Рис.3. Зависимость входа 45Са (Я) и рН аксоплазмы (Б) при РВ миелинового нерва от экстраклеточного рНЯ,1-контроль; Я.2-РВ

Увеличение концентрации межклеточного К" при РВ обращает моду Ма+/Са2+-обмена и запускает Ыа+/Н*- обмен и Ыа+-зэ.висимый СГ/НСОз"-котранспорт ШК, чгго сопровождается уменьшением межклеточного рН и способствует восстановлению исходного градиента Са2+ на аксолемме

(снижается вход Са2* по потенциалозависимым каналам и увеличивается выход Са2* за. счет активации Са2*- ЯТФазы) рро1о, Веаиде,1988; СагЫоН, 1991].

2.Исследование перераспределения и транспорта внутриклеточного Са 2+ при ритмическом возбуждении нерва

При исследовании процессов, регулирующих содержание внутриклеточного Са2+ было обнаружено, что связывание Са2* мембранными фракциями, выделенными из миелинового нерва и мозга завершается значительно быстрее и менее вы ражено,чем (ТГФ-зависимое связывание иона (аккумуляция (рис.4).

Время,мин.

Рис.4. Кинетика ЯТФ-независимого (связывание,1-3) и АТФ-зависимо-го поглощения (аккумуляция,4-6) Сё* мембранными фракциями, выделенными из миелинового нерва.1,4-фракция плазматических мембран; 2,5-фракция митохондрий; 3.6-фракция эндоплазмати-ческого ретикулума.Максимальная С§Г-связывающая и Са2*-ак-кумулируюшая способность каждой фракции принята за 100%

Поглощение ьСа фракциями плазматических мембран и зндоплазмагш-ческого ретакулума зависит от содержания Са2, в клетке: по/уактивация поглощения обнаружена при концентрациж Са2+ 0,1 и ЗмкМ, соответственно, а в случае фракции митохондрий зга ветчина составляла 10-12мкМ (рис. 5, Я). Таким образом, при входе Са2* в клетку, в первую очередь активируется Са2*-ЯГФаза плазматической мембраны, а затем Са2*-ЯТФаза эндоплазм аттического ретикугума и только в условия* значительной Са2+ перегрузки ион аккумулируется в митохондриях. При РВ в миелиновом нерве уменьшается содержание ЯТФ и креатин фосфата, что снижает Са"-аккумулирующую способность митохондрий, затем плазматических мембран и мембран эндоплазм этического ретикугума (рис.5,Б ).Таким образом, поступающий в аксон и ШК Са.2+, в первую оче-

1-1-1-г 1-1-1-1-1

■7 -6 -5 -4 0 1 2 3 4

Концентрация Ca2*,log Концентрация ЯТФ.мМ

Рис.5. Поглощение 45Са фракциями плазматических мембран (1), зндо-плазматического ретикулума (2) и митохондрий (3) в зависимости от концентрации Са2+ (Я) и ЯТФ (Б)

редь связывается на внутренней поверхности аксолеммы и плазматической мембраны ШК, внешней поверхности мембраны митохондрий и эндоплазм этического ретикугума. В дагънейшем запускаются процессы аккумуляции Са2* в плазматических мембранах и эндоплазматическом ретикулуме, а затем в митохондриях.

При исследовании ИТС аксолеммы, регулирующих содержание внутриклеточного Са2+,мы испогьзовапи везикугы плазматических мембран, предварительно загруженные К* или Ыа+ По/ученные результаты свидетельствуют, что К+-индуцированный вход Са^* в везикулы с высокой концентрацией К* и Ма* обусловлен различными процессами (таблица 1). При К+-депол?ризации мембран везикул загруженных кашем, вход Са2* полностью блокируется верапамилом (блокатор Са2*-каналов) и не зависит от присутствия как К7К-(валиномицин). так и №7Ю-(монензин) переносчиков, что свидетельствует об активации потенциалозависимых Са2*-каналов. При К*-деполяризации мембран везикул загруженных натрием, вход иона снимается при действии вераламила и валиномицина (на 25-ЗСГ/^ и монензина (на что свидетельствует об активации обратной моды №+/Са2+-обмена В обоих случаж поглощение45Са значительно увеличивается при добавлении ЯТФ, что свидетельствует о наличии в аксолемме Са2+- ЯТФазы. Отсутствие существенного влияния сукцината оксалата и ЫаМ3 на скорость ЯТФ-зависим ого поглощения Са2" свидетельствует, что этот процесс связан с активностью Са2+-насоса именно плазматических мембран, а не митохондрий и эндоплазм аттического ретикугума присутствующих в исследуемой фракции в качестве сопутствующих примесей. [КЬап,0сИз,1974;Сагга|1ап,1Чеда 1990].

Различиятрех обнаруженных путей транспорта Са2+ везикулами плазматических мембран проявляотся в зависимости скорости этих процессов от концентрации Са2* (рис.6). Полумаксимальное увеличение ЯТФ-зависимого и К"-индуцированного входа Са2* в везикуш, загруженные

натрием наблодается при значительно более низких концентрация* Са2*, чем в везикулах загруженных калием. О наличии №7Са2*-обмена свидетельствует и то, что увеличение концентрации в среде приводит к практически полному устранению влияния К на вход Са2* только в вези-Таблица1

Скорость поглощения кальция везикулами плазматических мембран нервного волокна (Санмоль/ мг белка в мин)

Добавки в среду инкубации Везикулы сЮОмМ KCl Везикулы с 95мМ мМ №С1 и 5 мМ КС1

одновалентные ионы в среде инкубации 10ОмММаС! 1 OOmMKCI одновалентные ионы в среде инкубации 100мМ№С1 ЮОмМКС!

1. контроль 0.89±0.01 5.48 ±0.1 0.95 ±0.01 731 ±0.1

2. верапамил,100 мкМ 0.95±0.02 1.03 ±0.01 0.93 ±0.01 4.98 ±0.06

З.Тетродотоксин, 300 нМ 0.94 ±0.01 5.01 ±0.1 0.98 ±0,02 7.30 ±0.2

4.вератридин,50мкг/мл 3.42±0.05 1.05 ±0.01 0.89±0.01 6.90 ±0.1

5,вератридин,50мкг/мл итетродотоксин, 300 нМ 1.1 □ ±.0.02 0.96 ±0.02 1.10+0.01 7.03 ±0.2

В.вератридин,50мкг/мл и верапамил,100 мкМ □ ЭЭ+0.01 0.87 ±0.01 0.97 ±0.01 6.81 ±0.1

7. валиномицин,2 мкМ 1.05±0.01 5.94 ±0.2 0.98 ±0.01 5.21 +0.2

3. монензин,2 мкМ 197 ±0.01 5.41 ±0.01 1.05 ±0.02 2.04 ±0 01

9. Я 23187,2 мкМ 2.40±0.06 2.12 ±0.05 2.17 ±0.03 2.09 ±0.03

10. ЯТФМд, 2 мМ 9.30 ±0.4 11.80 ±0.6 9.60 ±0.6 12.10 ±0.9

кулы, загруженные натрием. Судя по полученным результатам, сродство данного переносчика к Ма* и Са2* составляет 20-30 мМ и 2-4 мкМ, соответственно.

В следующей серии экспериментов мы исследовали зависимость входа Са2+ через Са2* -канал и Ыа+/Са2-обмен от величины мембранного потенциала. По/умаксим алчное увеличение скорости входа45Са в вези-ку/ы по Са2*-каналам наблодалось при 40мМ К+ (Ек=-20мВ) (рис.7). Влияние мебранного потенциала на скорость ЯТФ-зависим ого входа Са2+ нами не обнаружено. Вход Са2+ в везнкуш за счет NaVCa2*-обмена возрастает в 3-4 раза при изменении мембранного потенциала от 60 до ЮОмВ (от 50 до 200 мМ К4). Судя по полному ингибированию К+-ин-дуцированного входаСа2+в везику/ы, загруженные калием при действии не только Я23187. но и верапамила. плазматические мембраны содержат

Содерюание^Са.нмаль/мг.мин 15129630-

I-1-1-1-1-1-1

-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2

Концентрация Саг* .log

Рис.6 .Зависимость скорости погяощения45Са везикулами,загружен-ными натрием (1-3) или калием (5,6) от концентрации Са2' . В сериях 2 и 3 среда содержит 2 мМ МдЯТФ.ав серии 3-10 мкМ кальмодулина. Кривая А получена как разность между кривыми 2 и 1 .В серии G среда инкубации содержала вместо 100 мМ KCI -100 мМ NaCI.

Са2*-каналы, полумаксимальная и полная активация которых наблюдается при значениж мембранного потенциала -20 мВ и -10 мВ, что соответствует данным литературы [Вакег.1 972].

Как уже отмечалось. РВ сопровождается накоплением в аксоне натрия и кальция а выведение Са2* осуществляется с помощью Са2+-РГГФазы и Са27Н* -обмена митохондрий, что сопровождается снижением внутриклеточного рН. Мы показали, что увеличение концентрации 1Чанли под-кисление среды приводит к снижению содержания Са2+ в митохондриях

Рис.7 .Зависимость скорости поглощения45Са везикулами плазматических мембран, загруженных 100 мМ КС1 (Я) и 100 мМЫаС! (Б) от концентрации калия. В случае А: 2,-2 мкМ валиномицина: 3.-1 ООмкм ЭГЩ 2 мМ МдЯТФ и 1 00 мкМ верапамила; в случае Б: кривые 2 и 3 соответствуют расчетным зависимостям скоростей входа кальция за счет Ы^Са2"-обмена со стехиометрией 3:1 и 4:1, соответственно.

но не эндоплазм этическом ретикулуме. Эти результаты согласуются с данными литературы о наличии №7Са2- и Ыа7Н*- обмена в митохонд-риж и возможности регуляции внутриклеточного Са2* системами, конт-

ролирующими внутриклеточный рН [ОрловЛЭаг^ппйем.РоШ^етЛ986]. Мы показат что рН аксоплазмы практически линейно зависит от экстраклеточного рН и снижается при РВ аксона (рис. 3,5) В отличне от бло-каторов Ыа+-каналов, блокаторы Са2* - каналов и Ма+-насоса нивелировали изменения рН аксоплазмы при РВ Известно, что при увеличении концентрации внутриклеточного Са2+ наблодается снижение скорости рефосфорилнрования РДФ до ЯТФ и обмена Н* на Са2+ в митохондриж [Вакег,1972] При снижении рСааксоплазмы уменьшаетсявелнчнна отношения ЯТФ к ЯДФ, увеличивается содержание неорганического фосфора и наблюдается уменьшение рН аксоплазмы.

Полученные результаты свидетельствует о том, что регуляция рН аксоплазмы в нервном волокне в покое и при РВ осуществляется за счет Ма*/Н+ -обмена и Са27ЬГ- обмена митохондрий, атакже изменений межклеточного рН, контролируемого ИТС ШК. РВ приводит к активации-Ыа7Н+- и Са27Н*-обмена в митохондриж аксона за счет накопления внутриклеточного Ыа" и Са^ или снижения межклеточного рН, что приводит к падению рН аксоплазмы. Активация Ыа+- и Са2* -насосов при РВ восстав навливает исходное содержание Ма+, Са2+ и, соответственно, рН-аксо-плазмы. Таким образом, изменения рН аксоплазмы при РВ контролируются рядом ИТС аксона и ШК.

3. Исследование перераспределения и транспорта Са2+ в аксолемме при ритмическом возбуждении.

Результаты,изложенные в предыдущих разделах свидетельствуют о наличии процессов перераспределения и транспорта Са2* в аксоне и ШК при РВ, что модифицирует поверхностный заряд, вязкость и гидратиро-ванность липидов плазматических мембран згих клеток [51пск11о!т,1975]. Известно,что функционирование многих мембралных ИТС зависит от

упорядоченности общих и вннул?рных липидов мембраны [1кето(о. 1974; веогдезсаЫс! е1 а1.,1979; 2есы\с, 1_еЛап, 1930; Ропд, МсНатее,1985]. С другой стороны, изменение конформации или кластеризация ИТС при РВ аксона может прожиться в формировании доменов с различной латеральной упорядоченностью фосфогипидов аксолеммы [Гелэтюк. Каза-ченкоЛ 990; ВогосЬоу. БЫп^куЛ 97В; Регез.1981; 5сЬЫе1ег е1 а1.,198-1].

В связи с этим нами было проведено исследование изменений вязкости общих жпидов аксолеммы при РВ миелинового нерва Было покат зено, что при увеличении температуры упорядоченность гипидного микроокружения спин-метки, локализованной в полярной фазе птазматп-ческих мембран миелинового нерва снижается и наблодается фазовый переход, температура которого зависит от концентрации экстраклеточного Са2*. Данный процесс является реэ^/ътатом изменения упорядоченности липидов в полярной фазе мембраны и отрицательного заряда, локализованного на экстрекозточной поверхности аксолеммы и плазматической мембраны ИЖ. При увеличении температуры менялась упорядоченность жпидного микроокружения спин-метки, локализованной в гидрофобной фазе мембран миелинового нерва а температура фазового перехода не зависила от концентрации гкетраклеточюго Са2*. Отметим, чти наблодаемые температурозависимые изменения упорядоченности мембранных плпидов коррелируют с состоянием воды в нерве: снижение времени спин-спиновой релаксации протонов молекула воды при увеличении упорядоченности мембранных липидов свидетельствует о повышении структурированности воды, локализованной в ограниченных компартментах нервного волокна (аксон, ШК. миелин). Одним из факторов, определяющим данный процесс, шляется изменение характера взаимодействия компонентов мембраны с водой. Гидратация мембраны меняет характер липид-липидных и липид-белковых взаимодейст-

вий, что способствует формированию доменов фосфолипидов и кластеризации мембранных белков при РВ нерва.

Проведенные исследования свидетельствуют о зависимости вязкости от поверхностного заряда и степени гидратации гипидов плазматических мембран, но не позволяют отделить изменения вязкости аксолеммы от вязкости плазматической мембраны ШК ига миелина Дга идентификации изменений вязкости аксолеммы при РВ нами впервые использовалась спектроскопия РКР каротиноидов нерва. Исследование изменений величины интенсивности полосы 1 522см"1 спектра РКР каротиноидов поперек одиночного миелинового волокна показало, чп-о молекулы каротиноидов, локализованы на его поверхности и отсутствуют в аксоплазме. Регистрация изменений сигнала РКР вдоль поверхности волокна свиде-телэствовала о шкажзации молекул каротиноидов в аксолемме, но не в миелине. Аналогичные исследования проведенные на нейронах и астро-цитах показали что в нейронах кэротиноиды локализованы в субклеточных органеллах цитоплазмы (цитосомы), в астроцитах-отсутствуют. Вероятно, керотиноиды поступают в аксон из нейрона с помощью аксо-нального транспорта и встраиваются в аксолемму. Данное наблюдение позволяет не только исследовать процессы перераспределения каротиноидов в нервной клетке, но испогъзоватъ РКР-спектроскопию для характеристики упорядоченности липидов аксолеммы миелинового нерва.

Как отмечаюсь, при увеличении температуры упорядоченность липидов аксолеммы снижается что меняет состояние микроокружения молекулы каротиноидов и сопровождается снижением величины отношения полос 1526см"1 к 1160 см"1 спектра РКР (рис.8). Корреляция между параметрами РКР каротиноидов и спин-метки, локализованной в гидрофобной фазе, свидетельствует о том, что с помощью РКР регистрируются изменения упорядоченности той части молекул фосфолипидов.

которая локализована в непол?рной фазе аксолеммы [Caspar. Kirschner, 1971].

При РВ нерва упорядоченность жпидного окружения молекул каро-тиноидов в гидрофобной фазе аксолеммы (вязкость) обратимо меняется сначала наблюдается ее увеличение, а при длительном РВ-снижение.

1пт, отнед IiksAiso .отн.ед

,1.3

200-

150

100-

50-

0J

1.1

■09

-0.7

0.5

3 29 3.39 3 49

Температура,1 /К х 10"3

3.59

3.69

Рис.8 .Температурная зависимость изменений Iш спин-меченой пальмитиновой кислоты (1) и величины отношения полос 1526см- и 1160см 4 спектра РКРкаротиноидов (2) в миелиновом нерве.

Двухфазовый характер изменений вязкости аксолеммы обусловлен процессами, инициируемыми развивающейся следовой деполяризацией и гиперполяризацией аксолеммы при РВ [Коннелн1961; Каташмов,1 975, 1978].Увеличение вязкости аксолеммы не связано с активацией потен-циалэзависимых Ыа+- и Са2*-каналов. но зависит от концентрации межклеточного Ю, Са2* и рН. а также внутриклеточной концентрации Са2+ и №*. Важно, что увеличение вязкости л-тидов аксолеммы зависит от кон-формации мембранных белков, ЭН-группы которых локализованы на

1-1-1-1-1-1-1

4 5 6 7 8 9 10

РН

1,52еЛш .ОТПЕЛ

I-—I-1-1-1-1-Г—-I-1

0 25 50 75 100 125 150 175 200 Время.мин.

Рис.9 .Изменения величины отношения интенсивности полос 152Б см1 и 1160 см "1спектраРКРкаротиноидов миелинового нерва при действии 0.4 мМ ЬаС13 О.БмМ ЭГТЯ(2.А) и изменении рН(Б).

экстрах легочной поверхности мембраны [Marquis, Mautner, 1974]. Так, при действии на нерв таоговых блэкаторов. связывающих SH-группы бегков на внешней и внутренней поверхности аксолеммы, наблодалось снижение вязкости общих липидов аксолеммы, в то время как связывание SH-групп, локализованных на экстраклеточной поверхности - к ее повышению.

Рогь следовой гиперполяризации в изменении вязкости аксолеммы была вышлэна при варьировании режимов PB нерва при заданной частоте и длительности импульса 0.1 мс наблодали толжо увеличение вязкости липидов аксолеммы; при длительности импульса 0,3 мс вышлен двухфазовый характер изменений вязкости, а при длительности импульса 0,5 мс-тплэко ее снижение. Таким образом, в условиях формирования посттетанической гиперпол?ризации (ПТГ) нервного волокна вязкость аксолеммы снижается Вероятно, изменения вязкости аксолеммы при PB обеспечиваются следующими процессами: увеличение вязкости аксолеммы обусловлено изменением поверхностного заряда в результате перераспределения мембраносвязанного Са2+ и H' , а снижение вязкости-активацией |\]а,К+-ЯТФазы и Са2+-ЯТФазы.

Подобные предположения нашли подтверждение в экспериментах, выполненных на модельных системах. Нами было показано, что активация пассивного транспорта К* и Ca2* через мембрану липосом из фос-фатидилсолина способствовала повышению упорядоченности микроокружения встроенных молекул каротиноидов. Гидролиз РГГФ Са2+-РГТФазой сопровождался снижением упорядоченности липидного микроокружения молекул каротиноидов, встроенных в саркоплазматический ретикулум. Действие аденозинметилентрифосфата. негидролизуемого аналога ЯТФ, не приводило к изменениям конформации энзима и, соответственно, упорядоченности фосфолипидов сэркопшзматического ретикулума. В связи со сказанным отметам, что изменения конформации Са2*-(ТГФазы

в условиях фазового перехода фосфолипидов детально исследованы с помощью регистрации наносекундной подвижности спин-меченых SH-групп, кинетики протон-дейтериевого обмена и спектроскопии комбинационного рассе^ия [Inesi et al.,1973; Lippert et al.,1981;Squ¡er et al ,1 985]. Эти исследования доказали, чпз фосфорилированная стадия Са2+ЯГФазы повышает белок-бел<овые взаимодействия в результате которых формируются температуроц^вствитегьные комплексы молекул фермента [Murphy.1976; Ikemoto et al.,1978; HaidmanJ 982]. Латера/ъная подвижность белков образовавшегося комплекса способствует их интеграции, что важно для успешного функционирования ассоциата Изменения кон-формации Са2*-ЯГФазы при гидролизе ЯТФ предохраняет бежовые SH-группы фермента от блокирующего действия SH-реагента n-ЭМ. Murphy (Murphy.1976) обнаружил увеличение взаимодействия SH-групп Са2*-ЯТФазы с ДТНБ при действии Са2*, a Ikemoto с сотрудниками выявили три класса SH-групп, взаимодействие которых с S-меркури-Ы-дансил цистеином зависят от концентрации Ca2t [Ikemoto et al,1 978] Таким образом, активность Са2+- ЯТФ азы зависит от упорядоченности мембранных липидов. конформации бежа и его комплексов и коррелирует с изменениями реактивности SH-rpynn. Вероятно, перераспределение и вход Са2* в аксон при РВ сопровождается не толжо повышением активности Са2+-РГГФазы, но и кластеризацией фермента, что формирует в аксолемме домены с низкой упорядоченностью фосфолипидов.

С другой стороны, состав мембранных фосфогипидов имеет прямое отношение к эффективности транспорта Са2+ [Navarro et al..1984; Nishizu-ka1 992]. Так, наличие фосфатидилзганоламина и других фосфолипидов, способных образовывать неламелярную, гексагональную фазу повышает эффективность функционирования Са2+-ЯТФазы [SuidaTomura.1974;Та-kahashi et al., 1995]. При РВ в нервах меняется содержание фосфатидной кислоты (ФК), фосфоинозитола (ФИ) и кардиошпинэ. (КЛ). Снижение ФК

сопровождается уменьшением плотности отрицательного заряда на поверхности плазматических мембран аксона, ммегнна и ШК, а также снижением неспецифического входа Са2* в клетки, обусловленного Са2-ионофорными свойствами ФК [Ohki. 198B;Dennis et al., 1991]. Тот факт, что при РВ немиешнового нерва содержание ФК уменьшается а ФИ возрастает свидетельствует о возможности синтеза мембранного ди-ацилгшцерола в результате активации фосфолипазы С и Д [Hanum.Be!!, 1986;Nishizuka.1 992;Takahashi et al.,1995], В ходе нашего исследования было показано, что изменения фосфолипидного состава при РВ нерва коррелируют с различными фазами поступления Са2+ в аксон: неспецифический транспорт иона по Na+-каналам стимулирует процессы, контролирующие содержание ФК и ФИ, в то время как вход Са2* по СаА-каналам сказывается на процессах контролирующих содержание К.Л.

Таким образом, перераспределение и транспорт Са2*" при РВ нерва сопровождается не только изменениями вязкости, но и состава фосфолипи-дов аксолеммы, чш проявлтется в активации протеин киназы С (ПК-С) и фосфорилировании бежов ИТС [Levitan, 1 985]. Известно, что ПК-С фос-форилируетшъ фа-субъединицу Na-канала вызывая быстрое и обратимое замедление инактивации и снижение амплитуды Na*-тока нейронов [Numan et al..1991;Li et aJ.,1992;Catarsi, Drapean.1 993]. Мы исследовали значение данных процессов для Ыа'.К'-РГГФазы аксогеммы и ацетил-холинового рецептора (FKP) ШК, регистрируя изменения числа центров связывания специфических блокаторов данных ИТС-оуабаина и бунгарсг токсина(БТ) [Baker, Willis, 1972]. При РВ связывание оуабаина на поверхности аксона и плазматической мембраны ШК возрастает за счет увеличения чист молекул насоса, а не за счет изменения сродства зкстракле-Tt)4ibix участков молекулы Na*,K+- ЯТФазы к оуабшину [Harris et aJ.,1973; Hansen, 1974.1976;Baker et all 987]. Максим ал>ное связывание оуабаина зависило от частоты РВ и у миелиноеых нервов наблодалось при более

высоких частотах РВ, что. вероятно, свидетельствует о различной скорости процессов, контролирующих фосфорилирование 1Ча+,К+-ЯТФазы. Увеличение числа1\1а+.1С- ЯГФаз в аксоне при РВ зависило от кон формации мембранных белков, ЭН-группы которых локализованы на экстраклеточной поверхности аксолеммы (рис.10). Вероятно, при РВ нерва наблюдается не только кластеризация отдельных молекул СЙгЯТФазы

cpm/W. 150-,

к 1 2 3 А

Рис.10 . Связывание3Н-оуабаина немиелиновыми нервами в покое

(белые столбики) и при РВ (черные столбики) в зависимости от экстраклеточной концентрации р-ХМБ: 1 .-10 "7 М; 2.-10 М; 3.-10 "5М; 4.-10 "4М.

или Na+,K+-ЯТФазы в олигомерные структуры в результате изменения упорядоченности фосфошпидов аксолэммы, но и влияние данного процесса на фосфорилирование этих энзимов [Marquis, Mautner, 1974;Takai et al, 1 979; Schindrel et al, 1984; Rang, Ritchie,1 987; Налтип. Belli 986]. Изменения фосфолипидного состава при РВ нерва происходят и в ШК, что сопровождает фосфорилирование FKP. Так, специфическое связыва-

нме БТ зависит от частоты РВ аксона свидетельствуя о запуске фос-форигирования FKP в ШК в ответ на РВ аксона Вероятно, изменения межклеточной концентрации и вход Ca2t в ШК при РВ аксона, инициируют процессы, контролирующие фосфорилирование FKP. увеличение числа которого способствует дополнительному поступлению иона в ШК [Dunant et al.,1974; Gray, Ritchie, 1335;Villegas et al.,1986;Ройтбак.1993].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования было установлено, что ритмическое возбуи<дение миелинового нерва сопровождается перераспределением и транспортом Са2*, которые координируют межклеточные взаимодействия аксона и ШК и обеспечивают высокую функциональную лабильность миелинового нерва. Впервые доказаны представления о том, что перераспределение и вход межклеточного Са2* не только контролирует формирование одиночного ПЯ но запускает процессы, обеспечивающие проведение долгосрочного РВ в миелиновом волокне. В состоянии покоя в нерве постоянно функционируют системы компарт-ментализации и поддержания стационарного уровня межклеточного и внутриклеточного Са2* В результате, более 70% всего Са2* содержится в межклеточном пространстве (периаксоналэное пространство) и миешне (мезаксон и насечки ШмидтагЛантермана), а остальная часть сосредоточена в аксоне и ШК. Таким образом, основной пул Ca2t локализован в межклеточном компартгиенте и поддерживается за счет работы Na7Ca2t-обмена. Ыа4,К*-1ТГФазы, Са2+- ЯТФазы, а так же ИТС, запускающихся в результате активации межклеточных взаимодействий аксона и ШК. В миелине 16% Ca2t находится в связанной форме и 9% в свободной форме, локализованной в мезаксоне и насечках Шмидта-Лантврмана. Следовательно, в миелиновом нерве существует сбалансированная система контролирующая распределение и транспорт Са2* на трех уровнях: аксон.

ШК и миелин, что обеспечивает постоянную готовность аксона к проведению РВ.

При РВ, вход межклеточного Са2* в аксон осуществляется по потен-циалозависимым 1Ча+- и Са2*-каналам и засчет обратной моды №7Са2*-обмена. ав ШК за счет1.-типаСа2+-каналов. Проведение РВ сопровождается определенной последовательностью процессов, обеспечивающих вход иона в аксон: первая фаза обусловлена входом Са2* по потенциало-зависимым Ыа*-каналам и быстро мнактивируется, вторая фаза обусловлена входом Са2* по медлэнным, потенциалозависимым Са2+-каналам и характеризуется длительной инактивацией; третья фаза обусговлена входом Са2+засчет обратной моды Ма7Са2+-обмена и инакпивируетсяпо мере активации 1\1а+,К* -ЯТФазы. При длительном РВ запускается четвертая фаза, когда вход Са2+ в аксон из межклеточного пространства компенсируется Са2+, десорбироеанным с поверхности аксона ШК и внутренних отделов миелина что обеспечивает градиент Са2+ на мембране аксона необходимый для проведения продолжительного РВ. Таким образом, универсальность миелинового волокна заклочается в том, что поддержание постоянного уровня межклеточного Са2+ обеспечивается координацией целого ряда процессов. Восстановление исходного уровня межклеточного Са2* в области перехвата Ранвье осуществляется за счет Ма7Са2*-обмена контролируемого Ма+.К+-ЯТФаэои, а в паранодальной области -Са2*- ЯТФазой.

Участие ШК в перераспределении межклеточного Са2+ при длительном РВ миелинового нерва обусловлено последовательным выходом из аксона К* и глотамата. Первый процесс сопровождается деполяризацией плазматической мембраны ШК, увеличением входа Са2*, К* и объема клетки за счет поступления воды из аксона. Второй процесс сопровождается входом Са2* по Ь-типу Са2*- каналов и, стимулируя выход К+ и Н* за с-ет активации Са2"-зависимых К*-каналов и Ма7Н*-обмена приво-

дитк восстановлению мембранного потенциала и объема ШК. Снижение рН межклеточной среды является одним из механизмов "обратной связи" РВ, модифицирующим активность ряаа ИТС аксолеммы и перераспределение Са2* в миелине. В миелине усиливается десорбция Са2*, связанного в мезаксоне и н асе чох Шмидта-Л антермана и диффузия иона к аксолэмме, что сопровождается поступлением воды из паранодалзного отдела волокна и увеличением обьема насечек. С другой стороны, снижение межклеточного рН уменьшает вход Са2+в аксон, инактивируя проводимость потенциалозависммых №*- и Са2+- каналов и увеличивает выход Са2+ из аксона, активируя Са2+-ЯГФ азу, что способствует восстановлению низкой концентрации Сё* в аксоплазме

Перераспределение Са2<, поступившего в аксон и ШК при РВ, обеспечивается быстрым связыванием иона на внутриклеточной поверхности аксолеммы, наружной поверхности митохондрий и эндоплазм аттического ретикулума, а при продол+зителэном РВ-более эффективным ЯТФ-зави-симым связыванием Са2*(аккумуляция) данными органелпами. В аксоне аккумуляция Са2+ осуществляется в основном за счет Са2+-ЯТФазы аксолеммы и эндоплазм этического ретикулума а в ШК-засчет Ыа+/Са2+-и Са27Н-обмена митохондрий. Аккумуляция Са2* в аксоне запускается при более низких концентрация«: внутриклеточного Са2*, чем в ШК. Восстановление исходного уровня Са2+ в аксоплазме осуществляется Са2+-ЯГФазой аксолеммы, а при длительном РВ подклочается Са2*-РП"Фаза эндоплазматического ретикулума.

Основными ИТС, обеспечивающими вхоа Са2* в аксон шляются Са2+-каналы, полуактмвация и максимальная активация которых наблюдается при -20мВ и -10 мВ, а также обратная мода Ыа7Са2*-обмена обедающая стехиометрией ЗЫаМСа2* и сродством к Ыа+ и Са2+, составляющим 20-30 мМ и 2-4 мкМ, соответственно. При РВ, перераспределение Са2* в аксолемме контролируется зкстраклеточными группами отрицательно-

заряженных фосфолипидов и БН-содержащих бежов, что сопровождается обратимыми изменениями упорядоченности гидрофобной фазы аксолеммы. Данный процесс формирует оптимальные условия для функционирования потенциалозависимых каналов и На7Са2*-обмена При продолжительном РВ, вход Са2+ в аксон и ШК активирует процессы, контролирующие фосфоригирование ИТС, что, наряду с изменениями фосфолипидного состава сопровождается увеличением тела функционирующих №+.К+-и Са2*-ЯТФаз в аксолемме и ацепилсолиновых рецепторов в плазматической мембране ШК. Оптимальное функционирование ЯГФаз аксолеммы при РВ обеспечивается Са2*-зависимым перераспределением фосфодшидных доменов и кластеризацией молекул фермента.

Анализ полученных результатов свидетельствует о существенной роли перераспределения и транспорта Са2+ при РВ миелинового нерва в координации широкого спектра процессов: от контроля за состоянием вязкости аксолеммы, активности ряда ИТС до межклеточных взаимодействий и обьема аксона и ШК

ВЫВОДЫ

С целью изучения роли Са2+ в процессе проведения ритмического возбуждения в миелиновых нервах, исследовали механизмы компарт-менташзации, перераспределения и транспорта Са2* в аксогемме, аксоне и шванновской клетке. Было установлено:

1 .Реализация важнейшей биологической функции, проведение ритмического возбуждения е миелиновом нерве обеспечивается за счет координации функционирования всех основных компонентов: аксона миелина и шванновской клетки. В обеспечзнии данной координации ведущая роль принадлежит системам перераспределения и транспорта межкле-

точного и внутриклеточного Са2*. поддерживающим постоянный уровень свободного и связанного Са в нерве.

2.Системы компартменташзации и транспорта Са2* в миелиновом нерве контролируют содержание свободного Са в межклеточном пространстве и Са, связанного на поверхности аксона шванновской клетки, а также в миелнне (поверхность миелина мезаксон и область насечек Шмидта-Лантермана).

3.При РВ миелин, помимо изолирующей функции, компенсирует изменения концентрации межклэтючного Са2* ("Са2*-депо"), что сопровождается перераспределением свободного и связанного Са воды и изменениями объема насечек Шмидта-Лантермана.

А.По мере проведения РВ в миелиновом нерве осуществляется поста-дийное перераспределение и транспорт ме+клеточного калэци^ Са2* входит в аксон из межклеточного пространствен в результате десорбции иона с поверхности аксона, шванновской клетки и в области насечэк Шмидта-Лантермана миелина Последние два процесса близки по величине прямому входу Са2* в аксон из межклэточного пространства но активируются лишь при продолжительном возб^-кцении. Вход Са2* в аксон осуществляется по потенциагозависимым N8*- и Са2*-каналам, а также за счет обратной моды №а*/Са2*-обмена Восстановление исходной концентрации межклеточного Са2* в области перехвата Ранвье обеспечивается Ыа*/Са2+-обменом, контролируемым Ыа*,К*-ЯТФазоя авпарано-дальной области-Сёг*-ЯТФазой.

5.Выход К* и глютамата из аксона при длительном ритмическом возб(^к-дении стимулирует вход межклеточного Са2* в шванновскую клетку за счет деполяризации плазм этической мембраны, активации глотаматовых рецепторов и увеличения клеточного объема Последние два процесса обеспечивают вход Са2* по Ьтипу Са2*- каналов, восстанавливая мембранный потенциал и объем шванновской клетки за

счет активации Са2"*-зависимых К-каналов, 1Ма7Н+-обмена и 2СГ

-котран спорта.

6.При ритмическом возбуждении аксона снижение рН межклеточной среды, обусловлено активацией Ыа"/Н+- обмена и Ыа*-зависим ого СГ/ НС03"-обмена шванновской клетк.и и вызывает десорбцию Са2*, связанного в мезаксоне и насечках Шмидта-Лантермана а также увеличение обьеманасечек Шмидтаг Лантермана за счет поступление воды из шванновской клетки в миелин. Снижение рН межклеточной среды при РВ уменьшает вход Са^ в аксон, инактивируя потенциалозависимые и Са2+- каналы и стимулирует выход иона, активируя Ы^-ЯТФазу.

7.Вход Са2+ в аксон и шванновскую клетку при ритмическом возбуждении миелинового нерва сопровождается связыванием иона на внутриклеточной поверхности плазматических мембран, наружной поверхности митохондрий и эндоплазм аттического ретикугума или более эффективным РГТФ-зависимым связыванием (аккум улядией) Са2* в данных структурах. Аккумуляция Са2* в аксоне обеспечивается последовательной активацией Са2*- ЯГФазы аксолеммы и эндоплазм этического ретику/ума а в шванновской клетке №*/Са2*- и Са 2*/Н*-обменом митохондрий.

8.Ритмическое возбуждение сопровождается перераспределением Са, связанного с фосфолипидами и ЭН-содержащими бежами, что меняет упорядоченность гидрофобной фазы аксогеммы, формируя специфические фосфолипидные домены и олигомерные структуры (кластеры) Са2*-и№*,К*-ЯТФаз.

9.Вход Са2* при ритмическом возбуждении миелинового нерва активирует процессы фосфорилирования мембранных ИТС, что сопровождаг ется изменениями в содеркании фосфатидной кислоты и фосфатидил-инозитола. а.также числа На", (С-ЯГФазв аксолемме и ацетилхолиновых рецепторов в плазматической мембране шванновской клетки.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Колье O.P., Федоров Г.Е., Максимов Г.В., Бурлекова Е.В. Изменения ЯГФазной активности в нерве краба при проведении ритмического возбуждения. ДАН СССР. Т.216. N.4. 943-945.1974

2.Колье O.P., Федоров Г.Е.. Максимов Г.В., Бурлакова Е.В. Изменения ЯТФазной активности в нерве крысы при проведении ритмического возбуждения и действии температуры. ДАН СССР.Т.219.N.6.1505-1507.1974.

3.Максимов Г.В., Федоров Г.Е., Когьс O.P. Изменения ЯГФазной активности в нерве кальмара в зависимое™ от частоты стимуляции. Био-физикаТ.23, вып.3,552-553,1973

4.Максимов Г.В., Федоров Г.Е., Колье O.P. Исследование связывания оуабаина в зависимости от частоты ритмического возбуждения нерва. Биофизика.Т.24,вып.6,1113-1115.1978.

5.Колье О.Р.,Максимов Г.В.,Федоров Г.Е.Некоторые свойства энергообеспечения ритмического возбуждения в соматических нервах. Физиологический журнал СССР. Т.65, N.2,230-237,1979.

6.Когьс О.Р.,Максимов ГВ.,Федоров Г.Е., Бурлакова Е.В. ЯГФазная активность в соматических нервах при различных условиж функционирования. Физиологический журнал СССР, Т.65, N4,557-564,1979.

7.Когьс О.Р..Максимов Г. В., Федоров Г.Е. Регугшия M а.4, К1"- ЯГФазы в нерве при проведении ритмического возбуждения Физиологический журнал СССР.Т.65, N.5,678-686, 1979.

8.Максимов Г.В.;Федоров Г.Е.,Колье О.Р.Исследование связывания оуа-баинанервом кальмарав зависимости от частоты ритмического возбу-к-дения. Биофизика Т.25, вып.2, 307-308,1980.

Э.Максимов Г.В.,Станкова И.С.,Когьс О.Р.Механизм активации Na*,K*-АГФазы в нервных волокнах при проведении ритмического возбуждения. Биофизика.Т.26.вып.6.1073-1076, 1981.

10.Kols O.R.,Maximov G.V..Fedorov G.E.Changes NaVK* relationship as factor of regulation of Na*,K"-ATPase activity on rhythmic excitation of netve. Studia biophysics V.84, N.1,47-48.1981.

П.Максимов Г.В.,Каверина H.B.,Орлов С.Н.,Ко/ъс О.Р.Поглощение кальция нервными стволами кальмара в зависимости от частоты ритмического возбуждения. Биофизика, Т. 27, N.5,841-843,1982.

12.Максимов Г В.,Тилов Б.О.,Лихачев Ю В.,Чурин А. А.Рубин Л.Б. Исследование спектров комбинационного рассеяния нервов при проведении и блокировании возбуждения. ДАН СССР.Т.2В2. N.5,1272-1274,1982.

13.Кравцов Г.М.,Максимов Г.В.,Орлов С.Н.,Покудин Н.И..Р»кский Г.Г., Свердлова Е.Д Поглощение ионов кальция мембранными фракциями головного моха крысы и нерва ля-ушки. Нейрохимия Т.1. N.4, 375-382,

1982.

И.Максимов Г.В.Тишв Б.О.,Лихачев Ю.В.,Чурин А.А.,Рубин Л.Б. Изучение спектров комбинационного рассеяния соматических нервов в различных условиж функционирования Биологические науки Т.5, 29-32,

1983.

1 Б.Максимов Г.В.Даверина Н.В..Когьс О.Р.,Орлов С.Н.Связывание ионов ка/ьция в соматических нервах при проведении ритмического возбуждения. Физиологический журнал CCCP,T.70,N Л 1.0.1559-1563,1984.

16.Максимов Г.В..Станкова И.С..Кондратов В.Е.,Бурлакова Е.В.,Кольс O.P. Транспорт протона в нерве при возбуждении. Биофизика.T.29.N.2, 302-305,1984.

17.Ревин В.В.,Максимов Г.В.,Мусурагиева Г.Т.,Кольс О.Р.Рогь перекис-ного окисления липидов в изменении проницаемости нервных волокон. БиофизикаТ.30.вып.2,278-280,1985.

18.Maximov G.V..Kols О.R.Mechanism of activation of Na+,K*-ATPase in nep^e fibres during rhythmic excitation. Gen.Physiol. Biophys,V.4.,279-285,1985.

1 Э.Максимов Г.В.,Чурин ЯЯ.Пащенко В.З.,Рубин А.Б.Исследование регуляции потенциалозависимых каналов с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния. Биофизика.Т.30,вып.4.620-624, 1985

20.Максимов Г.В.,Чурин ЯЯ,Пащенко В.З.,Рубин Я.Б.Исследование потенциалозависимых изменений конформации молекулы каротина с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния Биофизика.Т.31. вып.3,456-458,1986

21.Максимов Г.В.,Мусурагиева Г.Т., БургаковаЕ.В., К0!ъс O.P. Связывание 3Н-бунгаротоксина нервными стволами лягушки при проведении возбуждения.Физиологический журнал СССР, Т.72, N.5,585-589,1986.

22.Максимов Г.В.,Федотова Г.Г.,Покудин Н.И.,Ря+<ский Г.Г.,Орлов С.Н., Рубин ЯБ. Транспорт Са2* в плазматических мембранах нервного волокна лягушки.Биологические мембраны.Т.З, N.7,735-743,1986.

23.Максимов Г.В.Федотова Г.Г.,Орлов С.Н.Транспорт Ca2t в субклеточных фракциях нервного волокна /вгушки. Биологические мембраны, Т. 3. N.8,613-619,1986.

24.Колье О.Р.,Максимов Г.В. Ритмическое возбуждение в соматических нервах. Физико-химические аспекты. М„ "Наука" 175,1987.

25.Каверина Н.В.,Чернов Ю.В.,Ревин В.В..Чураев М.Ю.,Максимов Г.В., Ко/ьс O.P. Реакция аксо-глнагьных структур нервного ствола далзне-восточюго кагьмара Shenoteuthis baitrani на ритмическое раздражение. Журнал эволюционной биохимии и физиологии,Т.22.!М.2.170-173,1986.

26.Максимов Г.В..Мусуралнева Г.Т.,Бурлакова Е.В.,КолзС О.Р.Связыва-ние 3Н-бунгаротоксина при проведении возбчр+иения в нерве ля-ушки. Физиологический журнал CCCP,T.72.N.5,585-589.1986.

27.Максимова Н.В., Туровецкий В.Б., Мещерж.ов В.Н., Максимов Г.В., Колье O.P. Распределение кальция в немиелнновых и миелиновых нервных стволах. Физиологический журнал СССР.Т.73, IM.5, 666-671,1987

28.Maximov G.V.,Kols O.R.,Radenovic C.N.Oscillator/ processes in biological membranes.2.The role protein-lipid interaction in the neive. Yugoslav.Physiol. Pharmacol. Acta. V..24, N.6,245,1988.

29.Radenovic C.N.,Maximov G.V.Oscillatory processes in biological membra-nes.1.Characterization of selected classes of membrane potential oscillations. Yugoslav Physiol.Pharmacol. Acta, V.24. N.6.373-374.1988

30.Максимов Г.В..Мусурагиева Г.Т., Свердлова E.Я, КогьсО.Р. Ро/ъ SH-групп мембранных белков в регуляции связывания оуабамна и бунгег ротоксинав нерве краба. Биофизика Т.34, вып. 4, 693-696,1989.

31.Максимов Г.В.,Мусурагиева Г.Т.,Чурин Я.Й,Пащенко В.З. Роль состояния белок-липидных взаимодействий в возбудимых мембранах на конформации С4о- каротиноидов.Биофизика, Т.34, вып.З, 420-424,1989.

32.Максимов Г.В., Пэщенко В.З., Рубин ЯБ. К вопросу о молекулярных механизмах действия местных анестетиков. Физиологический журнал СССР.Т.75, N.2.184-188,1989.

33.Кондратов В.Е.,Туроеецкий В.Б.,Литинская Л.Л.,Максимов Г.В.. Бур-лакова Е.В. Микроф/^ориметричэское изучение рН в нерве лягушки в покое и при ритмическом возбуждении. Биофизика Т.35,вып.5, 841-845, 1990.

34.Maksimov G.V.,Churin A.A.,Paschenko V.2.,Rubin A.B. Raman spectroscopy of "potential sensor" of potential-dependent channels. Gen. Physiol. Biophys.V.,9. 353-360,1990.

35.Maximov G V.,Radenovic C..Jeremic M .Shara M.,Sentiurc M.Oscillatory processes on ion transport and microviscosity of excitable membranes "potential sensor'of potential dependent ion channels.Studia biophysicaV. 138. 157167,1990.

36.Kondratov V.E..Meximov G.V.,Churin A.A.,Turovetsky V.B.Paschenko V.2. pH changes during rhythmic excitation of netve. Studia biophysica. V.140, N.1, 57-71.1990.

37.Шшгин В.В.,Максимов Г.В. Теоретическая оценка влияния гальванического воздействия на нерв. Биофизика. Т.36, выл.5, 908-914,1991.

38.Максимов Г.В.,Чурин ЯЯ, Соколова Т.Н., Пащенко В.З. Механизмы изменения конформвции порфиринов гемоглобина крови в норме и при патологии. Биологические науки, 6 (342),.22-26,1992.

ЗЭ.Шгыгин В.В.,Ярнаутов Л.Н„Максимов Г.В.Модегь метаболизма каро-тиноидов в стационарном состоянии. Биохимия Т.57, вып.7, 1065-1076, 1992.

40.Колье О.Р.,Максимов Г.В.,Раденович Ч.Н. Биофизика ритмического возбуждения. М.: Издательство Моск.ун-та. 207,1993.

41.Шлыгин В.В.,Арнаутов Л.Н.Максимов Г.В. О возможном механизме лечения электромагнитным полем дистрофии сетчатки. Биофизика Т. 38, вып.3,507-510, 1993.

42.Максимов Г.В., Орлов С.Н. Влияние объема эритроцитов человека и крысы на структуру протопорфирина гемоглобина Биофизика.Т.38, вып.5. 80-808,1993.

43.Ш/ыгин В.В.,Максимов Г.В.,Чохарадзе Т.Я. Каротиноиды возбудимой мембраны при генерировании потенциалов действия и в состоянии покоя. БиофизикаТ.39. Вып 1, 63-67, 1994.

44.Федоров С.Н., Линник. Л.Ф., Антропов Г.М.. Арнаутов Л И.. Шигина H.A., Оглезнева O.K., Пащенко В.З., Максимов Г.В.. Канюков И.В., Магат рамов Д.Я. Способ лэчения заболеваний зрительного тракта прямой электростимуляцией. Патент РФЯ1). 2025114.С1,Бюл.1М. 24,1994.

45. Антропов Г.М., Бошышева И.Я, Захаркин Н.С., Ипполитов В.В., Максимов Г.В., Ноздрин ЯГ., Стрельцов В.Ф., Огромаков ЯП., Чернов Д.Я Стимулятор. Патент РФ. RU. 2045294. С. Бюл.1Ч28,1995

46. Mongin AA.Aksentsev S.L.Orlov S.N.,S!epko N.G.,Kozlova M.V., Maximov G.V., Konev S.V. Swelling-induced K* influx in cultured primary astrocytes. Brain Research.,V.655. pp. 110-11 4. 1995.

47.Борисова Ю.Э..Максимов Г.В.,Слепко Н.Г.,Рубин Я.Б. Исследование роли температуры и Саг+ в связывании 3Н-оуабаина и эН-бунгаротокси-на в нервах и гжалзных клетках. Вестник м оск.ун-та сер. 16, биология N.3,35-39,1994.

48.Radenovic C„Jeremic W.,Maximov G.V..Misovic M.Trifunovic B.V.. Resonance Raman spectra of carotenoids in the maize seed tissue-new approach in studies on effects of temperatures and other enviromental factors on the state of vital functions. J. Sci. Agric.,V.55. N.200, 33-47,1994.

49.Максимов Г.В.,0рлзв C.H. Транспорт ионов ка/ъция при функционировании нервного волокна; механизмы и регулшия Издательство Московского ун-та. Биология, 88,1994.

50.Максимов Г.В.,Чохарадзе Т.Я.Чурин ЯЯ,Пащенко В.З.Профихъ возбуждения каротиноидов нерва при стимуляции и бшке. Биофизика Т.40. Вып.1.122-125,1995.

51.Ревин В.В.,Максимов Г.В.,Ко^с О.Р. Биофизика и физиология мембран. Издательство Саранского ун-та.Саранск.80,1995.

52.ЯксенцевС.Л.,Монгин ft Я., Орлов С. Н.. Слеп ко Н.Г., Козлова М.В., Максимов Г.В., Конев С.В. Обьем-зависимые изменения входа и выхода К+ в клетках глиомы Q. Биологические мембраны,Т.12, N.4,418-424,1995.

53.Максимов Г.В.Раденович Ч.Н..Борисова Ю.Э.,Еремич М.К. Исслэдо-вание вяжссти возбудимых мембран с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния. Биофизика. Т.41, выл.2,400-406,1996.

54. Андреев ЯП, Туровецкий В.Б., Максимов Г.В., Рубин ЯБ. Внутриклеточный рН волокон седалищного нерва лягушки при модификации внеклеточного рН и действии блокаторов транспорта протонов. Вестаик моек, ун-та.. Сер.16, биофизика N.2. 44-48,1996

55.Maximav G.V.,Chatterjee S.,Churin AA.Rubin A.B. Investigation of nerve membrane fluidity using Raman spectroscopy. European Biophysics Journal V.26, N.1. 5-22.1997

56. Андреев А.И.,Максимов Г.В.,ЧатгерджиШ.,Туровецкий В.Б..Кольс О.Р. Исследование транспорта Саг* в миешновых нервных волокнах при высоких экстраклзтдчных: концентрация« калия Вестник моск.ук-та (в печати).