Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Na, К-АТФаза как интегральный компонент плазматической мембраны эритроцитов и её свойства при некоторых физиологических состояниях

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Na, К-АТФаза как интегральный компонент плазматической мембраны эритроцитов и её свойства при некоторых физиологических состояниях"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХ1ШИИ им. И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи УДК 577.152.313:612.111

КАЗЕННОВ Алексеи Михайлович

К-АТФаза КАК ИНТЕГРАЛЬНЫЙ КОМПОНЕНТ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТОВ И ЕЕ СВОЙСТВА ПРИ НЕКОТОРЫХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЯХ

Специальность: 03.00.04 — Биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1991

Работа выполнена в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. Сеченова АН СССР.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Р. Н. Этингоф; доктор биологических паук, профессор А. А. Болдырев; доктор медицинских наук, профессор С. С. Михайлов.

Ведущее учреждение: Ленинградский Государственный Университет.

Защита состоится « 1992 г. па заседания Спе-

циализированного совета' Д 002.89.01 по присуждению ученой степени доктора биологических наук при Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова АН СССР (194223, Санкт-Петербург, пр. Мориса Тореза, 44).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан « @ * ^^СМ^риЯ/г.

Ученый секретарь Специализированного Ученого совета-доктор биологических наук, профес» Н. Маслоса

ОШЛЯ ХАРЛКП'РКТИКА РАБОТ»

Актуальность проблемы. Одной из наиболее важшх систем активного транспорта иопоп и метаболитов через плазматические номерами кивотнмх клеток является на-нпсос, который рассматривает как один из ЭВОПВЦ1ЮННО перпичинх способов осморсгуляцпи в клетке (Голдырев, Х970). В холе эволюции по меро усложнения организмов этот, "однажды найдецннЯ фундаментальны!} принцип" (Сент-Дьо-рди), стал использоваться для Функционирования более сложных биологических систем, как биохимических, таких как нторнчнмп иа-за-мсиииЯ актиышл транспорт метаболитов, регуляция клеточного цикла, так ¡i физиологических - обеспечение генерации электрического потенциала и проведение возбуждения по нервному и мышечному волокнам, поддергтаино иолно-^оледого баланса в многоклеточных организмах (Болдырев, 1955; leohene, 1988).

Новая opa и изучении молекулярных принципов Функционирования Na-imcoca началась более 30 лет тону назад после открытия Я. Скоу (skou ,1957) Иа,К-АТ<5азн. Било доказано, что этот фермент является молекулярным эквивалентом Ыа-насоса: он осуществляет активный ьиброс из клетки ионов натрия и "закачку" гг клетку ионов калия против градиентов их концентраций, используя для этого метаболическую пиергип, запасенную в виде АТ5. За истекшее после открытия йа,К-АТ§аза время усилиями многочисленных ученых были подробно изучены молекулярные свойства фермента, определен его субъединичниП состав, расшифрована первичная, вторичлая, третичная и четвертичная структур», предложены модели трансмембранной упаковки и функционирования На,К-АТФази. Было установлено, что лля нормальной работа фермента требуется определенное липидное окружение ферментного комплекса..

Согласно развиваемой в. последние годи А.М.Уголевнм (Уголев, 1905, 1989, 19?0) концепции о блоковом'принципе организации и. эволюции биологических систем, различные физиологические функции клеток складываются из элементарных функций, реализуемых универсальными функциональными блокями (У5Б), которые представля»т собой молекулы и надмолекулярные комплексы. А.М.Уголев рассматривает ма.К-АТЗазу как блок 2-го порядка, а плазматическую мембрану, в состав которой входит этот ферментный блок,как комбинированный блок более высокого' порядка, причем функционирование мембраны оп-

редопяетсл ьаатюсвязанной работой ее элементарных блоков. В от он плано исследования особенностей функционирования иа,К~АТФ~ азы целенаправленно не проводилось.

Кроме того, в последние годи, в овязи о открытием эндогенных дигоксин-подобных ингибиторов (дай) Ьа,К~АТФазц в организме вусших животных, содержание которых увеличивается при ряде физиологических и патологических состояниях, стало в« с называться мнение ( Schwartz et al.,' \3'15¡ Anner, 1985 ), ЧТО На,К-АТ$аза мокет выполнять рецепториуо фучкцио в плазматической мембране и,' таким образом, может осуществляться гуморальная регуляция работы Ыа-наооса. По-видимому, это, в первую очередь, важно для Ив,К-АТФазц почек, ответственной за реабсорбции натрия в канальца* и, следовательно, поддержание зводно-ооиевого гомеостаза в организме. Представления о рецепториой функции иа,К-АТФаац дают дополнительное оонование предположить, что работа фермента, как транспортного блока, тесно овязана о функционированием других УФБ плазматической .мембраны. ' ' - .

£яедуег отметить, что имеются отдельные работ, свидетелю!* вукиие о тесной пространственной и функциональной взаимосвязи . Иа,К-АТ$ази о анионтранспортирующей системой бейка полооы 3 (tfoseel, Solomon ,3983', Janoahaai, Solomon ,1989), с якорным белкой анкирином (nelson, Veataock ,1987; Korrow et al. ,1989), о мембраносвязанными гликолитическкыи ферментами (Proverbio, Но--ffmoa, 1977; torcer,. Dunhum. , 1981) в тенях безъядерных эритроцитов. Показано такие измерение чувствительности ферменте к специфическому ингибитору уабадау посла удаления ряда периферических белков р внутренней стороны мембраны ( Lelievre ot al. » 1977, 1983; Charlemagne et al, ,1980). /

Таким образом, походя из сказанного выше, возникает ряд вопросов, имеющих, на наш взгляд, важное теоретическое значение. Среди них, в частности, следующие: имеют пи -структурние бэяки плазматической мембраны и, в том числе бапки цитос'кеяета, окружающие цигопиазматический .домен Ка.К-АТФазного комплекса, влияние на работу ферменту и, если да, го важна пи эта связь для рецепториой функции ва»К-АТ$а'зы; кбку» роль играют Д1И s поддержании водно-солеюгб баланса в организме и хакие механизмы обеспечивают втог гсмеостаэ, ..

В овоей работе ми попыталиоь ответить на оти вопросы, Дня

этого, прежде воеги, било необходимо определить стратеги») исследовании, наПти адекватные методические и методологические подхода . Важно также било выбрать подходяиий объект исследовшшя. В результате анализа ястературних данных ма прими к шводу, что, несмотря на относптелию низкую и трудновыявляомув активность ыаД-АТФазк с ненброне безъядерных эритроцитов млекопитающих, этот объект является наиболее подходящим препаратом плазматической мембраны для подобного рода исследовании. Это обусловлено, прежде всего, тем, что орнтроцитарнне момбраш могут быть легко получены без примесей других клеточных мембран и, кроме того, в последние годы достигнут значительный прогресо в изучении структурной организации периферических и интегральных белков эритро-цитарной мембраны ( о^гег Д901; Соо1тап, £>Ь1£Гег ,1903; Ьочг ,1986; Вейпе^ ,Д985, 1909). Направление наших исследований складывалось постепенно в ходе собственной работы и по мере накопления новых литературных данных и, в конечном итоге, цели и задачи были сформулированы следующим образом.

Цели и задачи исследования. Основной целью настоящего исследования явилось вменение ропи структурных белков плазматической мембраны эритроцитов в функционировании на.К-АТФззы. В связи о этим били поставлены олодувщие задачи:

1. Выяснить оптимальные условия и механизм выявления активности ЫаД-АТЗазы в целых эритроцитах и в мембранных препаратах эритроцитов (тенях) о использованием мембранотропных агентов о разным механизмом действия на биологические мембраньй (ионные и неионные детергенты, хелаторы).

2. Провести сравнительное исследование активности На,К-АТФ-аэы й оообённостей ее выявления в ядерных и безъядерных эритро-г цитах и в их мембранных препаратах (тенях) в ряду позвоночных и оопоставигь свойства фермента с полипептидным ооставом плазматических мембран этих клеток.'

•3. Исоледовать влияние белков цитоскелета (мембранного скелета) безъядерных эритроцитов на активность и свойства Ма,К-АТФ-азы. . ,

Другой целью работы было изучение особенностей функциокиро--вания ЫаД-АТФазы при некогорых патологичеоких и физиологических состояниях, сопровождающихся изменением вояно-оолевого балан-

В атом плане били поставлена следующие задачи:

1. Исследовать изменение активности и свойств ыа.К-АТФазц в эритроцитах и тенях эритроцитов больных первичной артериальной • гипертензией (гипертоническая болезнь), а также в эритроцитах, тенях и почках спонтанно гипертонзивнцх крыс линии эни .

2, Провести аналогичное исследование у животных при адаптации' к висотиой гипоксии, сопровождающейся, как известно, сдвигами

в водно-солевом равновесии.

В данной части работа предоолагалось получить новые данные, которие позволили 6« углубить представления о возможных механизмах развития первичней артериальной гипертензии у человека и экспериментальных животных,

Научная новизна. Впервые проведёно сравнительное изучение влияния различных по структуре и заряду детергентов на активность ыа,К-АТФазы эритроцитов и теней эритроцитов различных представителей млекопитающих и рыб. Полученные данные позволяет сделать вывод, что в безъядерных эритроцитах-и их тенях активация ыа,К-АТ$азц под действием детергентов происходит за счет увеличения проницаемости мембран для низкомолекуляркых ведейтв, в.результате чего открывается свободный доступ АТФ и эффекторов внутрь клеток.

Наиболее полную активность Ка,К-АТФазы в безъядерных эритроцитах и их тенях можно выявить 1»' у!Лто только при одновременном воздействии на клетки детергентов и xeлaгopoвi при этом, активирующее действие детергента реализуетая.о внешней стороны _ мембраны» а хелатора - о внутренней и, очевидно, связано с дезинтегрирующий влиянием на мембранный скелет, который экранирует активные центры фермента.

. ■ В ядерных эритроцитах пресноводных рыб активность ыа.К-АТФ-аэы была в несколько раз выше, чем в безъядерных эритроцитах, большинства млекопитающих, и,выявлялась без применения детергентов, которые инактивировали ферментативную активность. В изолированных мембранных препаратах ядерных эритроцитов активность Ца,К-АТ§азы практически на выявлялась.

Впервые продемонстрировано, что"удаление белков мембранного окелета из мембран безъядерных эритроцитов приводит к снижении активнооти и изменении) кинетических свойств Ца,К~АТФази, а также

других мембранных ферментов (Са-АТ^аза, ацетилхолинэстеразо), а обратное связывание спектрина о мембраной сопровождается реактивацией ферментов. Это является доказательством того, что для оптимальной работы ферментов вакно не только состояние штидней фаза мембрана, но необходима также иотвктиость периферических белков, образупиих мембранный скелет.

ВперЕие прй первичной артериальной гипертензии у человека и спонтанно гипертензивннх крыс выявлено снижение активности на,К~АТФазн в целях эритроцитах без изменения ее в отмитих от внутриклеточного содержимого тенях эритроцитов и пониженная чувствительность фермента в целых эритроцитах к"высоким концентрациям Полученные данные свидетельствуют о наличии в эритроцитах больных людоЛ и животных факторов, шггибируюцих активность на,К~АТ*азн и нарушавших кооперативное взаимодействие субъеднниц фермента. Кроме того, у крыс линии ¡5НН , а в некоторых сериях опытов и у крыс линии га выявлена более низкая по сравнению о крысами В ист ар активность ИаД-АТФазы. в почках (особенно в корковом вещество), что / по нашему мнению, мокет являться фактором, предрасполагающим к развитие повышенного АД у животинх. ■ „

Научно-практическая значимость работы. Обнаруженный феномен влияния структурных белков плазматической мембраны эритроцитов, об разувших мембранный окелет, на функционирование Ма.К-АТФазы свидетельствует о связи работы штегральных ферментов мембрана о ее структурными элементами. Полученные данные имеют'общебио-логическое значение и распиряот напи представленга о структурно-функциональных связях в биологических мембранах; это позволяет ' развить новой направление по изучению роли мембранного скелета, плазматических мембран в функционировании транспортных и ферментных У§Б мембраны. ' _

На основании данных исследования влияния мембранотропных веществ на активность транспортных АТ15аэ в эритроцитах разработаны относительно простые методы выявления наиболее полной активности ферментов в целых эритроцитах и их тенях, причем сравнительное определение активности в этих двух объектах позволяет ■ оудить о наличии эндогенных-модуляторов На.К-АТ^азн в целых эритроцитах, что важно при исследовании крови больных с нарушениями воДно-солсбого обмена. Эти методические подхода позволили разра-.'

ботать "Способ дифференциальной диагностики почечных заболеваний, сопровождающихся гематурией". (Заявка № ЬЧ9У1Ъ ; метод признан изобретением I7.IO.fi9). Разработанные нами методы определения ■ активности ла,К-АТ#аэц в целых эритроцитах и тенях применяется в ряде научных и медицинских учрездений.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Иссяедован механизм активирующего действия детергентов и Леиаторов двухвалентных катиоиов на На.К-АТФазу целых эритроци-мв и мембранных препаратов эритроцитов. На основании полученных дан них предложены методы для выявления наиболее полной активности ферментов.

2. Показано качественное аходотво. белкового ооотава плазматических мембран безъядерных я ядерных эритроцитов. Выявленные различия в соотношении периферических и интегральных белков определяют мех&ничеокую прочность клеток и проницаемость для растворен-ных-вещёств и показывай связь выявляемой активности Л а,К-АТФ-азы о особенностями полипептидного состава;

3. Мембранный скелет эритроцитов млекопитающих является структурой, через которув осуществляется модулирующее (регулирующее) действие внутриклеточных АТ5 и на активность транспортных. АТФаз. Выдвинута гипотеза возможного включения белков мембранног го скелета в частние реакции НаД-АТФазного цикла.

На основании впяленных различий/в изменении активности и свойств Ка,К-А1$&зы в эритроцитах и тенях у разных групп больных первичной артериальной гипертензией по- сравнению о нормотен-зивными'лицами представляется, что первичная артериальная гшер-тензия у человека ио является'однородным заболеванием о точки зрения участия Ла,К-А7Фази в патогенезе данной патологии.

5. У большинства больных первичней артериальной гипертензией И у спонтанно гипертензивных крыо обнаружено-присутствие в. эриг» роцитах эндогенного ингибитбра ца,к-ат$азы. У крысГ линии знй . отсутствие прогресоиъного повышения активности ка,К~АТ#азы в корковом веществе почек в ходе постнатапьного онтогенеза расома* триваетоя как. фактор,- предрасполагачциИ к повышению .адтеркаиько» го даваения.

• Апробация диссертации. Результаты работы докладывались на:

1У-0И (Ленинград, 1979) и У-ом (Киев, 198б) Биохимических съездах; УГ1, УК и IX Всесоозннх, совеванмях по эволюционной физиологии (Ленинград, 1970, 198?, 1986); УМ, Х-Ш Всесоюзных созе-«аииях по транспортным АТФаэам (Тарту, 1900; Алма-Ата, 1983; Ташкент, I9C6 ; Иркугск, I9B7); I6-oil Конференции ?3D0 (Москва, IfO'í); Нендународном сишозиумо 'Транспорт ионоп и махшшзми ого регуляции" (Тбилиси, 1909); Всесоюзном съезде кардиологов (Свердловск, 1903); У£ Bceoonaiioil конференция по экологической физиологии и биохимии риб (Вильнюс, 19ЯЗ); У1 Конференции биохимиков прибалтийских республик, Белорусской ССР и Ленинграда (Рига, 1981); Всесоюзном совещании "Транспорт газов в тканях при гипоксии" (Нальчик, 190б); Всесоюзном совещании по клинической энэпмологин (Черновцы, 1989); 8-ой Всесоюзной конференции по физиологии почок и водно-солевому обмену (Харьков, 1909); Рабочих совещаниях по проблеме "Тонус" (Ленинград, 1987, 1989, 1991); Всесоюзно» симпозиуме "Ионнш! транспорт и.регуляция функция клетки" (Ленинград, 1990) и других.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы О глав»), описания основных методов исследования, акспериненталыюй части (<f главы), общего заключения, , выводов н рписка литературы. Работа содержит 317 страниц машинописного текста, 18 таблиц и М7 рисунков. Библиография включает литературных источников, в том числа Чов- иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 5

Основными объектами исследования явились безъядерные эритроциты -млекопитающих: человека (здоровые и больные гипертонической болезнью ), крысы линий Вистар, Вистар-Киото ( шас ) и Окамото-Аоки (спонтанно гипертензнвные крысы, SUR ), морской свинки, хомячка, белой мыши, кролика,' собаки,кошки, теленка, и ядерные эритроциты пресноводных рыб - карпа ( С.carpió, L. ), леща (Abremis brama, I.) и окуня (íerca fluvial; til íe^I»). В части работы В качестве экспериментального материала использовали почки крыс пиний Вистар, №CY и siffi ■ в возрасте 1,5; 3; и б месяцев.

.В ходе исследования били обследованы две группы больных, страдающих гипертонической болезнь» (первичная артериальная гипе-ртензия, АГ)..Первая группа состояла из 57 больных обоего пола

с дебильной АГ (пограничная AF или ПАР и АГ-1 - но кй&ссиг.нкацнн ВОЗ) и стабильной АГ О.Г-П) в возрасте от 16 до ГО лот и продолжительностью заболевания от I года до 20 лет. Контрольная группа включала У/ практически здоровых человек в возрасте от 22 до 50 лет. Клиническое обследован но болышх и здорохмх лиц згой групп» было проведено частично на базе ЛснНИИ кардиологии КЗ РМСР (Ленинград) д.м.н. В.С.Гуревичбм и частично в опециапиэиротшшсй клинике^ К 92 (Лешшгрйд) д.м.я Я.Ю.Еагровдм. Вторая группа больных и контрольных яиц (всего (9 человек) была обследована на ба~. зо кардиологического отделения больницы им. В.И.Ленина (Ленинград) к.м.н. Н.А.Кручишшой и была отобрана из группы 5Ш мужчин, руководящих инженеров Ш'И, в возрасте 50-55 лет, которые постоянно наблюдались в течение не менее 10 лег. В нее входили 16 человек с нормальным АД, 12 человек с переходной зоной АГ (паг), 13 о АГ-Г и 26 с At-П.

Акклиматизация крыо к высотной 'гипоксии проводилась путем . экспозиции животных в барокамере по 8 часов в день (5 дней ъ неделю)4 с постепенным увеличением высоти до 7d00 м над уровнем моря к 13-оп экспозиции. Работа проведена на базе лаборатории эк-* 'опериментальной кардиологии Института физиологии АН ЧСФР- Oil para).

Забор крови проводили из локтевой вены у человека, из ушной, вены у кролика, ковки и собаки; у остальных животных после, декаггитации. Все исследования проводились в день забора крови. ■

Тени эритроцитов млекопитавщих получали с помощью гипоосмо-тического гемолиза отмытых от. плазцы эритроцитов'по принципу Dodge at al.(l963). В качестве гемолизирующей среды использовали 10 мМ тркс-НС1-буфер- (pii 7,6 при 25содержащий и не содержащий ЭДТА, в соотношении к эритроцитам 20:1..

"Бесолектршовие" везикулы получали по методу Steele & Kent (1974) путем инкубации свежеприготовленных теней в' среде с низкой ионной оилой (в 10 объемах 1 мМ трио-НС1-буфера, рН 7,6) в течение ЗО-УЗ мин при 37°С,. посла чего мембраны осаждали и дважды.. • промывали в 10 мМ трис-НИ-буфере'(рН 7,6). Надосадочнуя жидкость после первого осаждения мембран концентрировали в 3-4 раза путей поглощения врды и нцзкомолек'улярны^ веществ сухим сефадексом Г-50 (грубый). Еелкошй концентрат содержал, преимущественно опек-трин и использовался для обратной посадки спектрина на "йесспе--' ктриновые" мембраны как описано у Baskm & iangdon ' (1981).

- п-

Плазноптсвне центрам« .эритроцитов рыб шдояяпи видоиэце-иеннцм методом у nilefj.no (19^0) получения мембран и дерн их

«рптроцитов,

Электр'>*оротпческое разделенно попшвптидов теней, "беосиек-трнпогчх" Мчнбраи н надооадочноЯ кидкооти проводили по Fa i г batik п et al, (V/i'l) о незначительными изменениями.

Пролннг.убатп цолчх эритроцитов и гоиогонатов почек о детергентами »»оголили при штатной температуре в течение 30-60 мин, ГСрод!'тгАч/(!гы тенеЯ пригроцпгои проводили прк тех же.уоло-тзних при постоянном 'содаркпнии белка (2,5 мг/мп).

Определение активности транспортных АТФаз проводили в еродо инкубации, содержатся (мМ): IJaCI - ICO, KCl - 10, трнс-ÜCI - 50, ATi - 2, Г/УЛр - 0,г>-1? ; ЭД'ГА - 0-2, СаС1? - 0-2 кМ (pH 7,1 при 'й°С). Температура инкубации составляла 37° или Активность

АТ^гп рассчитывали по приросту неорганического фоофята ($,,), содержание которого определяли модифицированным нами методом Clien 'et q1,(I957). Активность иа.К-АТ^азы. рассчитывали по разнице ме-г:лу АТ?азиоп пктивнойтьв в отсутствие и присутствии 0,2 - 2 мМ уабаина. Активность Са~АТ?а?ы - по приросту .АТФазной активности в прпсутлт1ня1 Са^'. Активность. АТ$аз выражали в нгиюль,$н/чао на I нг белка или I мл упакованных эритроцитов. Геиатокрит упа-' кованных эритроцитов определяли на центрифуге TH-I2 при I2CC0 об/мин.

Определение активности фосфатаз осуществляли как описано Fl atmen к Lew (I960) с использованием в качестве субстрата пара-нигрО'Т.енилфоофата (n-!№S) ,ю приросту п-нитрофенола.,

Содержание белка в пробах определяли-методом Lowry ot al.' (1950. •

Измерение концентрации натрия и калия в эритроцитах и-плазме крови проводили методом фотометрии пламени на приборе шиенсг 4 (DDK) ., а магния - методом, атомно-адсорбционноя спектрофотометрики

Степень деформируемости эритроцитов определяли по методу Dintenfaas (1971) на реогонисметре Байссенберга (модель а -18, Великобритания). • i . •

Концентрацию свободного кальция рассчитывали о по-

мощью' метода Katz et al. (1970).

. -• . . v

Использовали стандартные метода отагистической обработки результатов. ' ■•■''''.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСЯЩНИВ

I. Особенности выявлзния активности и свойства маД-АТФааи в эритроцитах и мембранных препаратах эритроцитов

Изучение активности и свойств траномембранных ферментов, активный центр которцх расположи с внутренней стороны плазма- • тической мембраны, в ингакгких эритроцитах in vitro представляет определенные трудности из-за крайне низкой проницаемости мембраны клеток для экзогенных субстратов. Для выявления активности таких ферментов (в том числе йа.К-АТФазы) в целых клетках применяются различные способы мягкого повреждения мембран (замораживание-оттаивание клеток, обработка детергентами, хела-торани, ультразвуком), в результате чего, повышается ее проницаемость для метаболитов и.ионов. Кроме того, наиболее распространенным объектом исследования являются мембранные препараты ори-. троциФов, полученные путем гипо- или'изоосмотического гемолиза клеток и отмытые от внутриклеточного содёрж!мого (тени зршро- ' цктов). Тени предотавляют собой мембранные оболочки эритроцитов, сохранившие свою целостность и правильную ориентацию мембраны, •а также форму клетки. D изотоничной. среде (например, среде определения ферментативной активности) тени способны в той или. иной степени восстанавливать низкую проницаемость мембраны для низкомолекулярных веществ. Этот процесс называется "запечатыванием" теней и его степень зависит от способа получения теней.

Имевшиеся в литературе данные по активности ва,К-АТ$азц в тенях'эритроцитов млекопитающих отличаются на порядок, что, видимо, обусловлено разными условиями как получения мембранных . препаратов, гак и определения ферментативной активности. Между тем знание механизмов повышения активности фермента под действием различных факторов важно для правильной трактовки получаемых результатов. .

' _ Одной из первых задач нашего исследования явилась разработка надежных, хорошо воспроизводим« методов определения активности . ма,К~АТ$аэц в целых'эритроцитах и их мембранных препаратах. Для выявления "латентной" активности фермента были исполь--зрваны детергенты и хелаторы. Были применены три отличающихся по химической структуре мягких детергента: один анионный (дезокси-хояат натрия, ДОХ) и два неионных (тритон Х-ЗСО и твин 20) и

проведено сравнительное изучение их влияния на активность На,К-АТФазы в целых эритроцитах и в тенях, полученных путем гшооомо-тического гемолиза по Dodge et al. (1963). При использовании в качестве гемолизирующей среды 10 мМ трис-НС1-буфер полученные мембранные препараты (далее в тексте - трио-тени) обладали относительно низкой активность»! как на.К-АТ^ази (?.,0+0,3 мкмоль Ф^/чос.мл), так и внутриклеточного фермента Ug-АТФазы (7,^+0,6 мкмоль Ф /час.мл). Введение в среду гемолиза 0,5 мМ ЭДГА позволило повысить активность ферментов соответственно в 3,6 и 1,5 раза (ЭДГА-тоии).

Прединкубация целых эритроцитов и их теней о разными детергентами в широком диапазоне концентраций последних позволяла выявить активность фермента в эритроцитах и повысить ее в тенях, причем каждый детергент имел свой оптимум активирующего действия на фермента (табл. I), который оказался одинаковым для обоих ферментов. Из таблицы видно, что в оптимальных концентрациях ис-* " следованные детергенты повыпали активность каждого из ферментов до одного и того же уровня как в целых эритроцитах, так и в тенях обоего вида. В стандартной инкубационной среде, содержащей 0,5 мМ ЗДТА, все использованные детергенты повыпата активность Яа,К-АТ9а'эн в трио-тенях в среднем в раза, а в ЭДГА-тенях в 1,3 раза. При этом абсолютная активность фермента после обработки теней детергентами в оптимальных концентрациях достоверно не различалась в трис-тенях и ЭДТА-тенях, не зависела от использованного детергента и составляла приблизительно 13 укмоль-9 / чао.мл.

Активность f^-АТФазц в трис-тенях, обработанных детергентами, оказалась на 35$ выше, чем в ЭДТА-тенях, что очевидно связано с тем, что часть водорастворимого фермента вымывается из эритроцитов в ходе получения теней в присутствии ЭДТА. По степени активации детергентами внутриклеточного фермента Мг-АТ§азы (моояа & Мапегу ,1981) был рассчитан^незамкнутнх теней, который составил -для трио-теней и ЭДТА-тенея соответственно 32% и 75£. Если принять наибольшую, выявляемую с помощью детергентов, активность на,К-АТФазы за 100$,. то в исходных, не обработанных детергентами, препаратах три'с-теней и ЭДТА-теней определялось' соответственно 2% я 75# активности фермента, т.е. процент выя-являемой активности транспортной АТФази соответствовал проценту

■ ■ Таблица I

Влияние детергентов в оптимальных концентрациях на активность ыа.Н-АТФазы и Н|-АТ§аза (мкмоль §н/ча:с.мл) в эритроцитах к тенях грктроцитов крысы . (М ±т)

Детергент - . ~ Твин 20 Тритон Х-100 Д)Х

$ермент Исходная активность фермента Оптимальная концентрация, Смг/мл) , Активность фермента ■ Оптимальная . концентрация "акт ио-кость фермента Оптима-мальная концентрация (мг/мл) Ахстиз-втасть фермента'

ЭРИТРОЦИТЫ (п.* б)-

' ЛаД-АМаза - .- 0 ■5.0 - 22,1+2,0 . 1,75 ' 22,3+1,7 2,25 15,6+2,6

мд-АТэаза 3,5+1.1 .5,6 35,5+1.6 1,75' 39,2+ 3,9 2,25 X,4+2,5

- .. ' .- ТРИС - Т "Е Н И С П/ « 6)

Ма,К-АТ§аза 2,5+0,3 ■ 0,5 12.7+ 0,2 ■0,38 П. 0+0. Б 1.0 П.8+1,4 '

1.7,*; р.б 0,5 20,7+1,0 о.зз 19,7+ ЗД 1.0 ' 15,5 + 2.8

ЩК - ТЕНИ- ("- - 6)

№.Д-А?§аза •10.2 ¿0.5 " 0,5 . 13.5 V 0,2 0,25 12,4+ 1,4 0,5 - ■ т Г< 14,9+1,0

-М£-А1эаза - II ,5 + 0,4 . 0.5 15,4+ 0,4 0,25 15,5_+г,4 0,5 -1,0 17,8+2,0

- Vj -

незамкнутых теней.

Полученные данные свидетельствуют о том, что in vitro активность на,К-АТ?ази определяется только в незамкнутых тенях, а активация фермента под действие детергентов связана с увеличением проницаемости мембран замкнутых тоней. Очевидно, детергенты в оптимальнох концентрациях не влияют существенно на каталитические свойства фермента. Об отом говорит тот факт, что детергенты, отличающиеся по химическому строения и заряду друг от друга, обладали одииакожм активирующим эффектом в отношении ыа,К-АТ?ази как трло-теней, так и ЭЛГА-тоней, а также данные о том, что обработка теней детергентами приводила линь к увеличения максимальной скорости реакции и не влияла .на сродство фор- • мента к Mg2+.

В отличие от безъядерных эритроцитов млекопитающих,]! ядерных эритроцитах рыб активность ИаД-АТ£азы определялась без применения детергентов и была шше, чем у большинства млекопитающих, (табл.2), а изменение концентрации MgClg и ЭДГА в инкубационной среде практически не влияло на активность фермента, эа исключением наД-АТФази эритроцитов карпа, активность которой резко (в 4 раза) возрастала при введении в среду GVI мМ ЭДГА и

бистро падала при увеличении концентрации ЭДГА до 0,5 мМ (рис.1). *

Таблица 2

Активность ЫаД-АТФазы и Mg-АТФазы (мкмоль Фн/час,мл) в интактннх эритроцитах пресноводных рыб и в эритроцитах человека, обработанных твином-20 (5 мг/мл), в стандартной инкубационной средо, содержащей 0,5 мМ ЭДГА. (М' + т)

Вид - • '

животного НаД-АТ$аза ■ Mg-ATf аза

Человек - ' 5 2,ff+ 0,2 3,6+0,4

'Карп (негемопизиро- "■•б" 14,3 + 2,6 21,2+2,9 ;

вавшиеся.эритроциты)

Карп '(гемоиизирова-вшиеоя эритроциты) 5 51,0+ < * 4,0 43,0+3,2

Лещ б' 17.3 + 2,8 53,0+ 4,2

Окунь б 5,0+ ЗД 17,7+3,8

О 0,1 0,5 • <0 ЗАТЛ ■

О 123 4 se

ЫСЬ ■

Pifo. I. Зависимость активности (А) и а ,-К-АТФазц (1,3) и

Ms-АТ^азы (2,4) в негеиолиэьровавиихся (1,2) и г.емоди- ' ■ зировавшихся О,1«) эритроцитах от концентрации (мЮ (концентрация ЭДТА 0,5 иН) и ЭДГА (концентрация

MgOr2 3 «ГО

Кроме того оритроцйтц карпа сказались очень нестабильными клетками. и гемолизировагись в ходе отмывания их от плазмы после 3-*нсй промывок. При этом активность Ыа,К-АТФазц' и Mg-АТФазы повышалась в несколько раз и появлялась чувствительность ha,K-АТФазы к характерная для фермента эритроцитов млекопита-

ющих (рис. I).

Таким образом, можно сделать вывод, что эритроцит млекопитающих практически не проницаемы дия экзогенной ДТ$ и, очевидно, in vivo источником энергии для работы ца;К-А1$азн является только АГ§, оинтезированнйя в ходе внутриклеточного гликолиза, В то же вр емя активный центр й.а,К-АТ$азц эритроцитов рыб в достаточной степени доступен экзогенной АТФ (но не Mg^+), vio может иметь физиологическое значение низших позвоночных. По-видимому, эритроциты млекопитапдих, являясь в значительно большей, степени, чем эритроциты рыб, изолированной системой, нуждаются'' для поддержания ионного гомеостаза в. меньшей мощности натриевого

насоса, что и выражается а более низкой активности иа,К-АТ5ази,

Более олотоой задачей является интерпретация активирующего влияния на На.К-АТФаэу комплексонов. Как отмечалось, введение ЭДГА на этапе гемолиза повывает в несколько раз активнооть фермента в тенях и этот эффект, вероятнее всего, связан с потерей их способности "запечатываться" в изотоничной среде определение ферментативной активности. Однако, введение ЭДТА в ореду при определении ферментативной активности, дополнительно активирует на,К-АТ#азу в оритроцитах и их тенях. В литературе имеется ряд объяснений относительно механизма активирующего действия хелато-ров на на,Н-АТ$взу: предполагает связывание следовых количеств двух- и трехвалентных катионов, ингибируоцих фермент (Зеае1 въ а.и 1981 ); влияние хелаторов на "функциональное" состояние фермента (Кометиаки и соавт., 1970).

Для анализа этого вопроса была проведена оерия'экспериментов, в которой была предпринята попытка, применяя одновременно детергенты и хелаторы в разных соотношениях, добиться наибольшей активации фермента в тенях эритроцитов. Изучалось влияние твина 20 на активнооть на,К-АТ$азн в трис-тенях и ЭДТА-тенях эритроцитов крысы в отсутствие и в присутствии ЭДГА. Показано,.что, если в инкубационной среде отсутствовал хелатор,.детергент в широком диапазоне концентраций не влиял на активнооть Ма.К-АТФазм в ■ эдга-тенях и позволяя выявлять но более 50$ активности в трио-тенях (рис. 2). Для выявления наибольшей активности фермента в обоих мембранных препаратах кроме преобработки их детергентом необходимо присутствие хелатора в инкубационной среде, который оам по себе на влиял на активность ка.К-АТФазы в трис-тенях и незначительно. повышал в ЭДТА-тенях.

Таким образом, только совместное применение детергентаи хелатора позволяет выявить наибольшую активность Иа.К-АТФаэы в обоих препаратах теней эритроцитов крывн, причем активирующее действие хелатора реализуется о внутренней стороны мембраны, так как, во-первых, отсутствует активация фермента в интактных преимущественно "запечатанных" трис-тенях при повышении концентрации ЭДТА до 2 мМ и, во-вторых,, активирующий эффект проявляется только после увеличения проницаемости мембран под действием твина 20.

Поскольку хелаторы действуют с внутренней стороны мембраны, то,точкой приложения их действия, по воей вероятности, являются

- in -

iS

e 10

Э

1,0 O

[tbiih 2o] и^д

iO

Рис. 2. Зависимость активности Ь'а.К-АТФазы в тенях эритроцитов крысы от концентрации твина 20 при содержании ЗДТА в среде инкубации G (I), 0,5 иМ (2) и 2. мМ (3) ч) » трис-тени; б) ЗДГА-тени

Отруктури, занимаыцио наиболее-периферическое положение в'.мембра-не. К таким структурам отнооитоя,. в первую очередь, мембранная овалет эритроцита, состоящий из ряда белков (спектрин, актин, белок k.l и другие), которые полностью выстилают внутреннюю поверх-, -кость менбраыы (Мац л ер, 1980). Можнр предположить, что опектрин-ашшовая. сеть цитоокелета "экранирует" внутренний поверхность фоофолипидного матрикса мембраны .(место локализации активных, це- . нтров транспортных АТ$аз) от остального внутриклеточного пространства, и АТФ, даисе проникнув внутрь клетки, не может'свободно • подойти к активному центру фермента. Доступ субстрату к активному центру можно открыть, например, путем дезинтеграции мембранного скелета в результате удаления мембраноовяэанного кальция хепато-рами. В пользу предлагаемого объяснения активирующего действия •холаторов свидетельствуют данные Mercar & цшпша (1991), '

что для своей работа Яй,К-*АТ$аэа использует не весь внутриклеточный фонд АТ$, а лишь его небо льву» часть - компартментализован-. ный пул АТФ; барьером между этими пулами АТ$ и может быть мембранный скелет эритроцита. . . .

Для проверки предложенного гипотетического механизма активации На,К-АТФаэы под деяотвием хелаторов в тенях безъядерных эри-

троцитов было проведено изучений рэлн структурных белков плазматической мембраны эритроцитов в Функционировании п а,К-ЛТ?азы.

2. Роль мембранного скелета эритроцитов в функционировании транспортних АГФаз.

Результаты исследования, представление в данном разделе, ' позволяют обсудить возмокнуп взаимосвязь и взаимовлияние транспортных АГФаз и белков мембранного скелета эритроцита. Что касается влияния мембранного скелета на функционирование На,К~АТФазн, то, очевидно, следует разграничивать, ш-перодх, его роль в огнэиении возможности шявленип in vitro активности фермента а эритроцитах п тенях, связанной с проницаемостью мембраны для метаболитов, и, во-вторых, его влияние на работу самого фермента путем, например, "экранирования" активного центра от внутриклеточного пространства или в результате участия тех «ли иных белков цитоскэлв-; та в частных реакциях АТФазного цикла.

В своей работе мы использовали два подхода: сравнительное исследование полипептидного состава мембран в сопоставлении с активностьп На,К-АТ$аэи в ряду млекопитающих и у рыб, а также изучение влияния искусственного изменения полипептидного' состава мембрана эритроцитов на свойства фермента.

На рис. 3 представлены схемы электрофореграмм мембранных полипептидов эритроцитов 9 видов млекопитающих и 3 видов риб. Видно, что, несмотря на больную филогенетическую дистанции между этими классами животных, имеется выраженное качественное сходство в белковом ооставе плазматических мембран эритроцитов и, вероятно, в в принципе организации периферических (мембраноскелетных) и интегральных белков в мембране. Между тем, обнаружены количественные отличия в относительном содержании отдельных белковых компонентов в плазматической мембране эритроцитов рыб: по сравнению с иле копи-тающими'они, в частности, содержали в 2 раза больше интегрального белка полосы 3 и в 2 раза меньше основного белка мембранного оке* лета - спектрина, что, вероятно, отражается в повышенной хрупкости эритроцитов рыб, большей проницаемости их мембран для АТ$, т.о. возможности выявления активности на,К-АТФазы в интактных клетках.

Представляет интерес обнаруженная нами для эритроцитов млекопитающих закономерность: отсутствие белков 4.5, ответственных за транспорт Сахаров и нукяеотидов в клетку, в мембранах эритроцитов

Р

да

Ш1

"1 £

3

■й

^ 5 & ? в о Ю Рис. 3 (схема). ПолипептшишП состав плазматических' мембран безъ-ядкрнцх эритроцитов млекопитающих (1-9) и я дер них эритроцитов рыб (10-12); I - человеку 2 - крыса, 3 - морская свинка, и -кролик, 5 - мышь , б - хомячок, 7 койка, В - собака, 9 - теленок, 10 - карп, II - окунь, 12 лещ. Слева обозначены отдельные полшеп'шдные полосы по номенклатуре Га1гЬал.кз аА. (1971): I и 2 спектрин, 2.1 - анкирда, 5 - актин.

•: Мд-ДТФа^.

Рис, Ч. Взаиыоовязь между активность» На,К-А7$азы и И^-АТФазы (мкыоль Фн/час>мг белка) в тенях эритроцитов в ряду млекЬпи- ■ уаяадих. I - человек, 2 - крыса, Э -морская свинка, ^ - кролик, 5 - миаь, 6 - хомячок, 7 - кошка, 8 - собака, 9 - теленок.

"животных о Kpíiííне низко« активностью фермента (ксихл, собака, теленок) (рис. 3). Это свидетельствует о низкой метаболической ак- ' тявности этих клеток: в силу вщошх" особенностей эритроцитам этих животных не тръбуется поддерживать внсокил градиент концентрации одновалентных катионов и, следовательно, имоть высокуп активность JJа ,К-АТ<5азн, которая, ю'К известно ( окопь» ct &1, , 1975) утилизирует для своей работы 70-Ю,? оинтозирусцоЯся а ходе гликолиза ATí. Помимо aro го, в мембранных препаратах эритроцитов (но но целых эритроцитах) обнаружена Енсокодостовериая положительная корреляция мемду активностью Ма,1С-АТФаэц и Mg-АТФаэн ( г " 0,96; р<0,С1) (р;ю. 4). Исклоченикм явились эритроциты кмеки, для Цй,К-АТФазы которых выявлена парадоксальная реакция на уабанн -активация фермента.

Представленные данные не даст возмокности судить о роли белков мембранного скелета в функционировании Иа.К-АТЗазы, о чем косвенно свидетельствует активирующий эффект внутриклеточных хе~ латоров в отношении фермента. Ввиду этого представлялось цолооо-образным провести анализ свойств Иа,К-АТ5аэц в мембранах эритроцитов одного вида животного, но с различным по'липептидним соста-bomí в тенях .эритроцитов и в мембранных препаратах, лишенных периферических белков мембранного, скелета (см. рис. 5)..

Рио. 5. Полдаептидный состав мембранных препаратов эритроцитов крысы и концентрированных белков мембранного скелета (охема^ электрофорез в 5,6/? ПААГ в присутствии ' додецидсульфата натрия, окраска кумаоои голубым, а - Исходные тени эритроцитов крысы ; б - мембранный препарат после инкубации теней в I нМ трис-НИ, рН 7, б (25°С) в течение 30 мин при 37°0 а последующей двухкратной отмывкой 10 мМ трио-НС1 ("бесспектриновие" везикулы); в -концентрированный оупернатоит поело обработки теней, как указано в "б". Слева обозначены отдельные полшептидныо полосы по номенклатуре Ра1гЬапка вt а1.(1971).

с nenfn/xj*^ ÚHKip'JH 2.1' те —

3 |WJt

.11

. AS

, 0.9 актин g -

е.

у

КЬ

■ При стон интересно было изучить свойства не только общей ЛГФазной октпеностн, но.и свойства уабаин-чувогвительноп К-фосфатазы, катализирующей частнуп реакцию ферментативного цикла. В сравнительное плане исследовалась также активность и свойства другого мембранного фермента 7 Са-АТФазц (Са-фосфатази), работавщего, также как и в а,К~А'ТФаза, по принципу алпостерического перехода Е^ -Так как внутриклеточные АТЗ и Са*"4" являются, с одной стороны, факторами, регулирующими свойства мембранного скелета ( йгаЬгег ■ , 1961), а с другой, - естественными модификаторами работы транспо-ртпих АТФаз, исследовалось влияние АТФ и на активность АТ$-аз и соответствующих фосфагаз.

Впервые обнаруадм, что удаление белков мембранного скелета •.из теней безъядерных эритроцитов крысы приводит к выраженному снижению активности обеих транспортных АТФаэ и соответствующих фосфат аз. Так, активность Са-АТФазц в "бесспектриновых" везикулах

■ при концентрации 5-Ю мкМ была в Ч раза ниже, а активнооть

а,К-АТФазы (в отсутствие и при низких его концентрациях) в 2 раза ниже, чем в исходных тенях (рис. б). Обнаруженное снижение активности транспортник АТФаз было специфичным, так как после инкубации "бесспектриновых" мембран с белками мембранного . скелета в условиях, приводящих к связыванию спектрина с мембраной ( Вавк1п & Ьаг^аоп ,1981), полностью восстанавливалась активность Са-АТФази с высоким сродством к Са2+ и на 40-5С$ ак- ' тивность Ла.К-АТФазы (для восстановления активности последней требовалось присутствие в среде-рредынкубации везикул со епект-рином в концентрации 5 мкМ) (рис.. б).

Активность уабаин-чувствигельной фосфатазы и Са-фосфатазы, которая выявлялась только в присутствии АТФ, после удаления белков мембранного скелета также уменьшалась, причем в еще больмей степени, чем общие АТФазные активности: соответственно на 6070,'? и в 8-10 раз. При отом исчезало модулирующее (активирующее), влияние АТ§ и низких концентраций Са^4" на уабаин-чувствительную фосфатазу (рис. 7). При изучении кинетики гидролиза-АТ$ и п-Н$Ф под действием Ыа,К-АТ§азы и уабаин-чувотвительной фосфатазы установлено, что Умако гидролиза обоих субстратов уменьшалась • , приблизительно в одинаковой степени (^ в 3 раза). Однако, на-блсдавшапся активация уабаин-чувствительной фосфатазы в тенях под влиянием АТС' в стандартной, инкубационной среде, содержащей

1о ■ 8 6 Ч

I— ^

I* 14

7

6

5

_ / рСа3^ _

Рис. б. оависшюсть активности Са-А'Мазц (а) и На,К- АТ->азц (о;

от концентрации С."/* в тенях (I), "бесспектриношх" везикулах (2) и везикулах после связывания с ними спектрина О,О.

- активность Ка.К-АТФазц в отсутствие ^ - активном ь

'Иа,К-АТФазц после связывания спектрина с "бесспоктриновими" мембранами в присутствии мкМ Достоверность различая

между 2 и 3 СО:

12 110 I 8

а

ь—г

xx

б 5 Н 3

д /

р 0,01.

5- Ч

. Рио. 7. Зависимость! активности уабаин-резистентной (а) и уабаин-

.чувствительной (б) К-фосфатаз от концентрации в тенях (1,2) и "бесспектриношх" мембранах 0,4).;2, - в присутствии 0;5 мН АГ5; I, 3 - в отсутствие АТФ. - активность фе-

рментов в отсутствие Са'

,2+

- гч -

10 мМ оказалась связана но с изменением ?мчкс> (5,7 мкмоль

п~Ц?/час.мл), а с внрадоншм сиитсниен (8 нМ против 25 мН в тоня-), т.е. для полун&сиисния фермента субстратом требовалась значительно меньшая концентрация п-Н$5. В то время в случае "бесепектрнпових" везикул введение АТФ в инкубационную среду оу-яестг!?!!но не изменяло ни (соотв. 1,55 и 1,8 мкмоль/час.мл),

ни !{,, гидролиза п-1КН? (соотв. 12,5 и 10,5 мМ), причем К,., для фе~ -риента везикул била близка к К^ гидролиза ферментом в те-

Н'тх в присутствии ЛГ5. ,

■ Эти данные укладываются в представления о том, что опеетрин-актшавая сеть является плохо проницаемым для субстрата п-НЗФ барьером в отсутствие ЛТФ; при добавлении АТФ в инкубационную ;среду доступ субстрата к активному центру фермента, находящемуся в конформации , увеличивается, 'что может быть связано с изменением физико-химических свойств мембранного скелета под влиянием АТ<5, сопровождавшимся повышением проницаемости для п-НФФ. В, пользу этой версии свидетельствует и факт выраженного снижения К^ гидролиза п-Н$Ф ферментом после удаления белков мембранного скелета. Значительное снижение Уиако> уабаин-чувствительно-го гидролиза АТФ и п-Н§§ в результате удаления белков цитоскепе-та из мембраны свидетельствует также об изменении каталитичеокой активности На,К-АТФазы.

. Механизм влияния белков мембранного скелета на работу транспортних АТФаз не вполне ясен. Можно предположить, что удаление опектрина из мембран, который,как. известно, стабилизирует фоофо-яиишный биолой, сопровождается нарушением упорядоченности упа— ковки фосфолипидов и таким образом приводит к нежелательным кон-, формацтоншм изменениям молекул интегральных ферментов.

С другой стороны, учитывая цитоплазматическую локализации активных центров транспортных А1$аз на мембране и, следовательно, их тесную стерическую- близость к спектрин-актиновой сети, можно полагать, что спектрин (или иные белки мембранного скелета) вовлечены в какую-то из реакций каталитического цикла .этих ферментов, что может обеспечивать взаимосвязь процессов активного транспорта катионов с процессами локального изменения физико-хими- , ческих свойств мембранного скелета и, как следствие, механических -свойств клетки в целом. Но как бы то ни было полученные данные свидетельствуют о том, что. для оптимальной и регулируемой работы транспортных АТФазных систем важно не только состояние

с

• яипилной фазы, но необходима также ингаганость структуры периферических белков.

3. Изменение свойств 1} а,К-АТФазы в эритроцитах и неубранных препаратах эритроцитов при адаптации юр,)с к шсот-. ной гипокиии

Одним из методов эволюционной физиологии является изучение формирования-и изменений функций в'экстремальных условиях внешней среда, а тшеко анализ путей срочной адаптации к действию необычных факторов внешне!) ореды (Наточии, 1937). Наиболее вамым и подверженным значительны!» колебаниям факторен внешней среды для животных организмов является содержание кислорода и среде обитания, причем vane всего человек и животные испитыпакг недо-. статок кислорода в результате его низкого парциального давления в воздухе (например, в условиях высокогорья) или при ряде патологических состояний (сердечно-сосудистые и легочнке заболевания). . Наиболее выраженные адаптационные изменения при гипоксии претерпевает система красной крови (OSt'&lal at al., 1975).

В данном разделе работы проведено изучение овойств транспортных АТ^аз эритроцитов в ходе акклиматизации крыс к гыоотной ' гипоксии, сопровождающейся увеличением копичества эритроцитов . - в^периферической крови и возрастанием концентрации гемоглобина за счет ускоренного созревания эритроцитов в костном моэго и выброса молодых форм клеток в кровь. Молодые формы эритроцитов обладает несколько иными, чем зрелые клетки, физико-химическими свойствами г в частности, у них могут быть изменены и свойства' ферментов активного транспорта катионов.

' На рис.8 полученные данные по изменении активности Иа.К-АТ$азы и Са-АТФазц на протяжении всего периода исследования (21-дневная фаза адаптации к пАохсин и 28-дневная фаза регрессии) представлены в виде ¿pi¡Bax изменения относительной активности (в %%. к конгролв)\ При определении активности Иа,К-АТ£азы в стандартных уоловиях выявлено, что активность фермента в целых, эритроцитах на протяжении как фазц адаптации, так и фазы регрессии быт нижа, чем у контрольных животных, а активнооть в тенях в период адаптации выше, чем в контроле. Активнооть Са-АТ$азы в фазу адаптации повышалась как в тенях, так. и в эритроцитах.

На основании выявленных различий в активности и.свойствах

Гио. 8 Изменение активности на,Н-АТ$азы (в $ к контроле) в эритроцитах и тонях эритроцдаов крыс в хода акклиматизации к высотной гипоксии и в фазу регрессии. I -на,К-ЛТ§-аза; 2 - Са-ЛТФаза;«--о - тени; «-• - эритроциты.

На,К~АТФазы в цолцх эритроцитах, и их тенях можно сделать вывод, что в эритроцитах крас, адаптирован них к высотной гипоксии,, присутствует фактор (ы), ингибирующий (ие) ва,К-АТ5азу. Природу этого фактора еще предстоит выяснить, тем не менее, можно виска--зать предположение, что таким ингибитором может быть дигокоин-по-до'бний ингибитор. Это предположение основано на том, что по литературным данным при тренировке крыс к гипоксии происходят на-рулз,:;!я экскреции натрия из организма, что является предрасполагавшим фаисором для поваленной секреции Д1И. Известно также, что расширение малого круга кровообращения такжэ стимулирует выработку Д1И (Ера^еЛп et а1.,'1Э7В; Ноп1е, 1.983).

Для выяснения механизма повышения активности транспортных АТФаз в мембранных препаратах (тенях) 5ритроцитов крыс после ги-поксического воздействия, был -использован методический подход, примененный в предыдущем разделе работы. Было проведено сравнительное изучение активности На,К-АТ$азы и Са-АТФазы в исходных тенях и в "бесспектриновых" везикулах в ходе адаптация животных к гипоксии. Премде всего было установлено, что у акклиматизированных к'высотной гипоксии животных общее, содержание белка в тенях эритроцитов не изменялось, однако соотношение интегральных и периферических (цитоскелетных) белков изменялось и составляло-

- а

*

3 в

<

«Г. в

I«

I

г о

гЬ

¿4 -

го

г£1*

>6

А й «

I:

гЬ*

Л

й

1 я

в тенях С] (в расчете на

м щ ул

_____¥А___

контроль 1 3. контроль

Рис. 9. Активность .'иа.К-АКааы и Са~АТ$азц и "бесспектринових" везикулах Щ I мл первоначально взятых эритроцитов) у контрольных животных и после воздействия висотной гипоксии 1-15 экспозиций; 2 -26 экспозиций;

40:60 против 5С:50 в контроле. Таким образом имело меото увеличение относительного содержания без ко в мембранного скелета, что свидетельствует о перераспределении белкового материала в мембране молодых-эритроцитов в пользу тех структур, которые определяет целостность,прочность и механические овойства клеток.

Вместе с тем, если активность да.К-АТФазц в тенях била достоверно пошшена на и 22$ через 15 и 26 экспозиция на высоте, то в бесспектрииовнх мембранах различий в активности фермента между контрольными и адаптированными животными не выявлено (рис.9). Что касается Са-АТФазц, то и в тенях'и в "бесспектриновцх" везикулах активность фермента была увеличена в период гипоксического воздействия, однако прирост активности в тенях (8С~1СО$) был несоизмеримо ваше, чем в,везикулах (3(М0О. Эти результаты подтверждает наши представления о "существовании связи между белками мембранного скелета и транспортными АТФазами, так как имеется параллелизм между увеличением содержания периферических белкса в мембране и активацией йа,К-АТ*$ази иСа-АТ$азы.

Альтернативным объяснением активации транспортных АТФаз в ' тенях при гипоксичеоком воздействии может быть изменение содержания'специфических актгааторсв ферментов белковой природы, отно-оотелгно прочно связанных с мембраной.

- гя.-

'I. Свойства Ий,К-АТ$аз;| эритроцитов и плазматических мембран эритроцитов при первичной артериальной гнпер-тенэии у человека и крнс ШИ .

В настоящее время наиболее распространены две концепции этиологии и патогенеза первичной артериальной гипертеизии САГ): концепция Постнова и Орлова (1987), рассматривающая АГ как мембрано-патда, шраяавщуюся в генерализованном дефекте плазматических мембран разных клеток организма, и концепция Иасйхеаог & ¿в Иаг<3а-лег(190'0, которые считают, что первопричиной АГ является наследственный дефект почки в экскреции натрия, а ведущим патогенетическим звеном заболевания - гиперсекреция ДЛИ в ответ на задержку натрия в организме. Обе концепции, таким образом, подразумевают возможность изменения функционирования Ы а, К-ДТ'5азы при АГ и поэтому но исключено, что фермент играет определенную роль в патогенезе заболевания.

, В нашей работе било проведено сравнительное исследование 'активности и некоторых кинетических характеристик ва.К-АТФазц в эритроцитах и тенях эритроцитов больных АГ, а татка в эритроцитах и почках спонтанно пшертепзивных крнс линии Бна . .

У больных АГ первой группы (57 человек обоего пола) обнаружена пониженная (на ЗЭЯ активность фермента в целых эритроцитах и отсутствие изменений в тенях. При этом в эритроцитах (но не в тенях) больных в среднем чувствительность Ыа,К-АТФазы к повышавшимся концентрациям оказалась пониженной. Более детальный анализ полученных данных по зависимым свойствам иа.К-АТФазы в эритроцитах больных АГ позволил разделить всех больных, по крайней мере, на 3 группы (рис.10); наиболее многочисленной оказалась группа из 30 человек, у которых активность фермента была снижена при физиологических концентрациях и не ингибировалась при повышении концентрации МвС^ До 12 мМ, а также группа из 20 человек, у которых активность фермента была снижена при всех исследованных концентрациях ¡^^{соотв. кривые 2а и 2 на рис. 10).

Гетерогенность-биохимических показателей обнаружена также вс второй исследованной группе больных-мужчин (см. "Материалы иссле--дованиЮ- Активность и а,К-АТ'Тгзы оказалась сниженной у больных АГ—I 'и у 55д больных АГ-П (АГ-П-1). У остальных больных АГ-П (АГ-П-2) активность фермента оказалась выше, чем в норме. Изучение этих больных вну^риэритроцктарной концентрации катионов и деформи-

а. б

[МзС14],мИ

Рис. 1С. Зависимость активности И а,К-АТ$азы а эритроцитах (а) и тенях эритроцитов (б) от концентрации, MeCI2 ; I - здоровые лоди, 2 - болыше АГ;2а, 2°, 2В - разные группы больных.

руеноотн клеток выявило лиаь небольшое повышение (на 18;0 содержания натрия в эритроцитах больных АГ-П-1 и магния (на 2С,'0 в эритроцитах, больных АГ-П-2 (табл. 3). В to жа время обнаружена более ' высокг.я вязкость суспензии эритроцитов в групп© больных АГ-П-2 . " (с высокой активностьв На.К-АТ.Зазц), что свидетельствует о пониженной деформируемости этих эритрбцитов.

KoppeляционныЯ анализ показал положительную корреляции ме-кду внугризритроцитарной концентрацией натрия, с одной стороны, и активностьв' н а-,К-АТ$азн (г - 0,48; р<0,С5) и показателями деформируемости эритроцитов (г.» 0,65 ; рсО,С5), о другой стороны, • у здоровых людей. У больных АГ-I и АГ-П указанные корреляционные отношения имели отрицательные значения.

. ■ У спонтанно гипергензйвных крыс и у крыс двух нормо'тензшз-ных "линий ( WKY и Вистар) свойства На.К-АТФазы в эритроцитах, . тенях эритроцитов 1и почках исследовали в пост катальном онтогенезе (у животин* в возрасте 1,5 ; 3; k,5 и б месяцов)( рис, Ц).

Активность И а,К-АТФаэи в тенях эритроцитов всех трех линия . крыс с,возрастом (до Ц,5 меояцев) снижалась на 20-Э(#, причем у крыс - знн. и wkx в этот период она быиа достоверно ниже, чем у , крыс Вистар. Обращают на себя внимание фазовые изменения активности фермента р целых эритроцитах у крыо линии sub ! выраженное

Таблица 3

îktjjbi-ootj» , Л п,К-ЛТ5азм и концентра яга катионов в прнтцоци-тах и лс^ортруеиоо'ть клеток у больных первичной АГ и здоро-ечх лгдс.-п (h + m).

Контроль п = га

АГ-1 п = ,13

АГ-П-1 л »• >5

АГ-П-2 и» 11

xxx xx

2 0,15 1,45 4 0,29' 0,91 + 0,13 3,03+0,25

Активность на.К-АТ^язп

(нкмоль Ф / -

чаолн) . .

~ — — — — — — ~ — — — — — — — — « — — — — — — ^^ — — —

Коицгп- натрия б,5<1 + 0,18 6,38+ 0,33 7 , 60+ 0.35 6.1*»± 0,21

трацпя ~ • 1

катионов кадий 70,5+ 1,0 79,2 + 1,9 01,1+1,1 70,0+2,3

и эритр- ~ х

оцитах" магний 3,96+0,22 4,00+0,36 4,Й!+С,40 4,80+С,2С

(мзкв/я). - ■ ~ ;

ДпФормД & 0,323 16.7+1.3 16,7+2,5 14,4+1,5 24,2+ 3,0*

русмооть ~

эрнтро- ty

Cffa.c.IO э)

русмость т m? эрнтро- 11,6+С,0 11,8+1,2 10,6+0,7

15,7+1,4

- р<С,С5; хк- р<0,0Гл -

по ссарненив с контролем). Индекс при показателе деформируемости ( ty ) эритроцитов указивает на скорость сдвига, при котором рассчитано данное-значение.

ее падение у З-хмесячнцх животных на 38? по сравнению о 1,5-меся-чпыми крысами ЗШ и на 2Э$ »иже, чем-у крыс шаг в возрасте 3-х месяцев. Отсутствие в то же время различил в активности фермента в тенях у крыс shr и wky в возрасте 3-х месяцев свидетельствует в пользу присутствия в эритроцитах спонтанно типертензив-. пых крыс фактора, икгибир'ующего ла,К-АТ§азу, по-видимому, дигок-екп-подобной природы, так как по 'литературным данным повыпение содержания ДШ в крови гипертонзивних нивотйцх ( Sowers et al. , Т9?3); Chen Lin shlau Д98б) и больных АГ ( lieyr et'al. , 190Ù Kaddj, pamnani ■ ,1985 ) отмечено в период стабилизации повышенного АД. . ' '

Динамика изменения активности На,К-АТФаэа в почках крыс-с

S ■ ■ -:----:--

Работа выполнена совместно с к.б.н. Г.П.Гуоешм (НЖ>) и к.м.Н. Г.П.Ульяновой (?Ш)

XXX

р<0,0И (достоверность различий

Таблица 1

Показатели 1Ссп (х 10', ¡0 ингийироиания уабвином ва,К-АТ-£-вач эритроцитов, теней эритроците^, паркового и мозгового ле-цоотза почек крыс линий аак , тх и Вистар (М + а)

Вопраст (кос.)

Лшим

1.РИС

1.5

4,5

ЬНЯ В1"!тяр

ЗИП

■ки Вистар

анн 'лс/ В тот ар

ЗИЛ ; УЖУ Вне тар

Э р

0. «(-б + о,зс5 0,5^7 0,12® 0.57 7 0,72°

1,10+ 0,21 т,io7o.ro

0,97 + ОД».

Корковое 2,60.;. 0,25* .1,517 о, 11х 2,12+0,1)0

Мозговое 1,65+ 0,29? 2,90+ 0,35х ■ 1,62 7 о,-31

и г р о ц и т и 0,58 + 0,13 0,1(64; 0,12 0,146+0,20 0,70+ 0,16 0,55+0,11° 0,(5+0,11

Тени

0,70+ 0,15 0,68+ 0,17 0,96+ 0,15

0,81+ 0,17 0,83+ 0Д7 0,97+ 0,18

вещество почки 0,93+0,17 0,62+0,11

1,зо7о,1з5(, о,бо7о,п 0,59^ 0,12 о, ад ¿одз

вещество почки 0,15+ 0;12 0,33 + 0,10

о,е/7о,и о, 37 7 о,с9 0,32 7 0,11 • 0,297 О,XI

0,63 ± 0.1-3 0,95+0,19

0.557 0.13

1,С2+ 0,19 0,75 7 0,16 0,91+ 0,17

0,71 + 0,13

0,7б7 0,13 0,83+0.15

0,66+ 0,11 0,83 7 0,17 .0,597 0,12

а - р<0,Сб (достоверность .различий между тенями и эритроцитами)

* - р<0,С5 (достоверность различия по сравнению с крысами Ви-> „ _ ..стар) ■ - ' ■

- р < О, С5 (достоверность различий по сравнению с крысами или )

возрастом имела иные. закономерности. Так, в ходе постнаталыюго развития ксис Вис^гар обнаруюно прогрессивное повышение активности фермента в корковом веществе (на 12 ¡? в период между 1,5 и 1,5 месяцами жизни). При' этом изменения активности на,К-АТ$азц в мозговом веществе с возрастом йе наблодали. У крыс таг и ЗНй активность ма.К-АТ'Ьази в корковом вещество была в 1,5-2 раза низка, чем у. крыс Вистар соответствующих возрастных. групп. Также, как и в эритроцитах у 3-хиесячннх спонтанно гипертензивных крио

3

6

I

* ¿0 *

*

$ го £

$ ю

х

Х О

А ■

4 *

5

<2 £

О

г 1

Г

* „

1,5- 5 е

г

ч,

« 8 Н

4

15 3 &

(мес )

Рис. II. Возрастные.изменения активности ыа.К-АТ^азы в целых ' эритроцитах (а), тенях эритроцитов (б), корковом веществе (в) и мозговом веществе (г) почек у крыс линий Виотар (I), ШЛ '(г) и ЗНД (3); к)-.- р<^0,С5, кх - р<0,СП (достоверность различий между «КХ и аш ).

имело место отчетливое падение на ЗЕ$ активности фермента в корковом (но не мозговом) веществе почки по сравнения с крысами ИКУ. Следует отметить тот факт, что активность Мй-АТФазц в обоих отделах почки крыс эна и юа всех возрастных групп былаприблизи-тельио одинаковой, но выражение ниже, чем у крыс Вистар, Снижение активности и а, К-АТФазы в корковом веществе 3-хмесячных крыс ЗШ. такие момег быть обусловлено действием Д1И, так как именно в ди-стайьных канальцах фермент имеет наибольшее сродство-к, уабаину и ДЛИ ( Бойсе'!;, ВаПЛ' ■ • -,1986,1988).

В табл. представлены показатели полумаксимального ингиби-рования иа,К-АТ5азы уайаином (1050). Видно, что чувствительность фермента к ингибитору как в целых эритроцитах, так и в мембранных препаратах была одинаковой у всех исследованных линий крыс и не

„ изменялась с возрастом, однако чувствительность фермента теней к уабаину у 1,5-кесячних крыс всех трех линий оказалась -дсстоъе-рно ниже (Юздвише), чем фермента эритроцитов. В то же время ъ отличие от эритроцитарного фермента чувствительность 1»а,К~АТ0>-'азы к уабаину у 1,5-несячних крио всех трех линия как в корковом, так и мозговом отделах почки била достоверно ниже, чем у крио более старшего возраста (габл, О- Кроме того, у всех исследованных линий крыс в возрасте 3-х месяцев и старше (помимо фермента коркового вещества крнс ) уабаина длл 1) а,К-АТЗази обоих отделов почки не отличалась друг от друга, а таюгс от для фермента эритроцитов, т.е. с возрастом чувствительность аа,Н--АТ?азы почок к уабаину.''увеличивалась до уровня зритроцитарного фермента. На основании приведенных данных можно сделать вывод о том, что в ходе развития животных происходят процессы, которые ' момно рассматривать как "созревание" Иа.К-АТФазц в почках. Прежде всего это касается коркового вещестьа почки, где в ходе пост-натального онтогенеза повивается активность фермента и измен л ет-' оя его чувствительность, к уабаину и, очевидно, Д1И. В эритроцитах таких изменений не происходит и поэтому можно полагать, что в почках это отражает-молекулярные, механизмы развития специфических физиологических функций, которые у спонтанно гипертецзпвных крыс нарушены. ' '

, ' На основании полученных данных можно высказать гипотезу, что фактором, предрасполагавшим к развития пяертензш является пониженная активность йа,К-АТ4азы в почках,'причем важную роль в развитии АГ у .спонтанно гшертенз'ивяых крыс играет изменение нормального соотношения активности фермента в корковом и мозговом 'веществах почек. Нам предйтавляется, .что изменение этого оо- ' отношения . сопровождается дисбалансом в реабдорбции натрия и води в почках, что "создает порочный круг в системе внепоченой регуляции, водно-солевого, обмена и приводи? .к повышении АГ.

БНВОДИ

1. Установлено, что з безъядерных эритроцитах и их тенях наибольшую активность Л'а,К-АТ5ази нокно выявить при одновременном воздействии на клзтки детергента и хелатора. Активирующее действие детергентов реализуется с внешней стороны мембраны; оно обусловлено увеличением мембранной проницаемости и открытием свободного доступа экзогенной АТФ и эффекторам внутрь клетки. Действие хела-торов реализуется о внутренней стороны мембраны и, очевидно, связано о удалением мембранаопязанного кальция и дезинтеграцией мембранного скелета, экранирующего активные центры фермента. Б результате проведенного исследования предложены хорошо воспроизводимые методы выявления латентной активности транспортных АТ5аз в эритроцитах и тенях эритроцитов. ' '

2. В ядерных эритроцитах рыб активность иаД-АТ^азц выявлялась без применения детергентов, повышалась при мягком механическом . повреждении клеток и была в несколько раз шпе, чем в эритроцитах ''млекопитающих. Эти данные свидетельствуют о том, что эритроциты млекопитапщих являются в значительной степени более изолированными от внешней среды клетками и для поддержания в них ионного го-меостаза требуется меньшая мощность Н а-насоса, чем в эритроцитах рыб. • ■ - _

3. В ряду млекопитающих (9 видов) и у 3-х видов рыб изучен по-липептнлный состав плазматических мембран эритроцитов в сопоставлении с активностью И а,К-АТ§аэы: При качественном сходстве по-липептидногосостава мембран ядерных и безъядерных эритроцитов имеются существенные различия в относительном содержании отдельных белковых компонентов мембраны: в мембранах эритроцитов рыб содержаний основного цитоскелетного бедка спектрша в 2 раза меньше,

а содержание интегрального белка полосы 3 в два раза выше, чем в мембранах эритроцитов «лекопитаюпмх. В тенях эритроцитов млекопитающих выявлена положительная корреляция между активиостьп В а,К-АТФа-зы и [-^-АТФазы, причем у животных с очень низкой .активностью ферментов отмечено отсутствие белков полос Ь.5, отвественных за транспорт Сахаров и нуклеотидов. . .

Ц: Впервые продемонстрировано, что удаление белков цитоскелета из мембран (теней) эритроцитов крысы приводит к выраженному снижению активности и,изменению кинетических характеристик Н а,К-АТФазц

" и других мембранных ферментов (Са-АМаза, ацетилхолинзстераоа), а обратное связывание спектрина с мембраной сопровождается частичной или полной реактивацией ферментов. После удаления из мембраны цптоскелетных белков исчезает модулирующее (регулирупщее) влияние АТ4 и Са^+ на ла,К-АТЗ?азу и уабапн-чуЕствитсльнув. фосфатазу.

5. В. ходе длительной акклиматизации крыо Вистар к высотной гипоксии и в период регрессии обнаружена пониженная (на 20-ЗСл) активность Ма,К-АТ«азц в целых эритроцитах относительно активности фермента в тенях; при этом колебания относительной активности Са~ АТФаэи в эритроцитах и их тенях носили однонаправленный характер. Данные свидетельствуют о присутствии в эритроцитах крце при гипоксии специфического ингибитора л а,К-АТ-?азц.

Показано, что при акклиматизации крыс к гипоксии в тенях эритроцитов, наряду с увеличением активности транспортных АТ$аз на ЗС-

повышалась также относительное содзрдание периферических белков (с 50? до 6С#) без изменения содержания общего белка. После удаления цнтоскелетных белков активность На,К-АТ§азы. в мембранных препаратах снижалась до одного уровня у йксперкментальних и контрольных животных, что является еще одним свидетель с твом в пользу вовлеченности периферических белков мембранного скелета в функционировании транспортных ДГ5аз.

6. У большинства больных первичной артериальной гшертензией и у 3-хмесячных спонтанно гипортензившх крыс обнаружена более низкая активность На,К-АТ5азц в целых эритроцитах без ее изменения в тенях, что доказывает наличие в эритроцитах больных имей и животных' ингибитора » а,К-АТ?ази,

7. По активности эритроцитарной йа,К-АТ<5азы и по чувствительности фермента к модификаторам его работы (высокие концентрации

хелаторы), а также по внутриклеточной концентрации натрия и деформируемости эритроцитов иоследоваИнне больные АГ подразделяется на несколько групп. • ■ -

0. У крыо линщ1 эна отсутствовало характерное для нормотензи-вннх крыс Вистар и линии ШСС повышение активности Иа,К-АТФ-азы и Мв-АТФазы'в корковом веществе почки в ходе постнатального онтогенеза, причем активность ферментов у спонтанно гипертензив-ных крыо всех возрастных групп была на 20-50$ ниже, чем у крыо Вистар, а у Э-хмосячных животных, кроме того, активность На,К-АТ$азы была ниже на 38*, чем у крыс ШН .

Е корксвси и мозговом вепоствах почке чувствительность на,К- . ДТ®йй1,' к уабашу у 1,5-месячпых крыс всох трех линий была в 3-9 раз ниже, чем в эритроцитах и достигала уровня чувствительности оритроцитарного фермента к 3-х- (крысы Вис тар к знн) иди *(~хме-сячиону (крысы wkï ) возрасту. Таким образом, в ходе постнатально-го развития норыотензивннх животных выявленные изменения активности и свойств Иа.К-АТФазы можно рассматривать как процесс "со-г зреваиня" фермента, который, очевидно, карупен у спонтанно гипер-тензпвных крыс. ,

9. На основании всей совокупности полученных результатов при сопоставлении с литературными данными можно заключить, что соот-вегствошю'разным уровням организации животных организмов, Иа,К-АТ$азу можно рассматривать как ферментный блок, как транспортный блок ( На-насос) и как рецепторный блок (в клетках-мишенях), воспринимающий специфические гуморальные сигналы. Регуляция работы На.К-АТФазы гак транспортного блока отдельных клеток осуществляется, очевидно, с цитоплазматической стороны мембраны АТФ и Са^ + и другими внутриклеточными модуляторами через цитоскепетный блок. Центральная же регуляция натриевого обмена на уровне.целого организма осуществляется с помощью эндогенных Д1И через ингибирова-ние Ва-насоса, прежде всего, в почечных канальцах.

сп так основных работ по теш диссертации

1. Казэнноз A.M., Mac лова М.Н. Особенности активации детергентами Ыа,К-АТФазы головного мо.зга позвоночных // Еурн.эвол. биохим.физиол. - 1980,- Т. 16, }f 5.- С. Ч30-ЦЭ5.

2. Наточив C.B., Мае лова М.Н., Казеннов A.M., Резник и др. Изучение активности Ферментов в срезах клеток коры почек // ■ доклады АН СССР.- 1980.- Т. 252, )г 2.- С. 5СО-5С2.

3. Наточин C.B., Маслова М.Н., Казеннов A.M., Резник Л.В. и др. Влияние адреналэктомш на активность ферментов в тонких срезах и гомогенатах почки. // Вопросы мед.химии.- I960,- Т. 26,

л 5.- с. 627-632. f

• if. Казеннов А.К., Маслова К.Н. Сравнительное исследование активности Ьа,К-АТФазы эритроцитов в ряду позвоночных // Тез. докл. УИ Всесоюзного совещания по эволюционной физиологии, посвя-пенного памяти Л.А.Орбели.- Ленинград, 1982.- С. 131.

5. Казеннов A.M., Маслова M.H., Савина Г.В. Сравнительная характеристика свойств. Иа.К-АТФази эритроцитов человека и карпа// Еурн.эгюл.биохим.физиол.- 1984.- Т. 20, К 2.- С. 167-173.

6. Казенное А.И., Павлова М.Н.. Иалабодов А.Д. Исследование активности m,K-AT'ianu в эритроцитах млекоппгаьвдх // Биохимия. - 19т.- 1981).- т. '(9, № 7,- С. ЗШ-1095.

7. Казенной A.M., Мао лова М.Н. Сравнительное изучение полипептидного состава плазматической мембраны эритроцитов млсда-питавдих и рыб // Тез.докл. 1б-ой конференции ®1Ю.- Москва, 198«».- С. 2$6.

0. Иалабодов А.Л., Маслова М.Н., Казеннов A.M. ila.K-AT'Saaa эритроцитов крнс со спонтанной генетической гипертонии ей // Рук. деп. в РИНШГ26.03.G5.- 1985,- £ 2II2-G5.

9. Казеннов A.M., Пас лова М.Н,, Иалабодов А.Д.. Багров Я-М. и др. Некоторые свойства йа,К-АТбазц эритроцитов болышх гипертонической болезньв // Тед.жури."Если.зкеп.биол,мод.".- 1905.-Рук.депонпропана в ВИШД'ц 23.05;ф.- !S Э5ЧО-Й5.

10. Казенной A.M.,'Macлозза М.Н. Полипептпдшй состав мет'ран эритроцитов риб // Тез.докл. У1 Всесоюзной конфссенции по экологической физиологии и.биохимии риб.-Вильнюс,1505.- С.'1'|2-1^3.

. II. Казеннов A.M., Маслова М.Н., Иалабодов А.Д., Механизм активирующего действия детергентов и хелаторов на i.a,К-ЛТ>азу теней безъядерных эритроцитов // Биохимия.- 1986.- Т. 51, 15 2.-С. 22^-229,

12. Казеннов A.M., Mac лова M.-fl'. Свойства - На, К~АТ$ази зригро-цитрв млекопитающих в нормо и при первичной артериальной гиперте-нзии // Тезисы стендовых сообщений У Всесоюзного биохимическою съезда.- Киев, 1586.-Т.2.- С..271.

v' 13. Казеннов A.M., Масло ва,М.Н., ГуревичВ.С., Иалабодов А,Д. Биохимические особенности функционирования ■ Ма.К-насоса в эритроцитах при первичной артериальной гипертензии // В сб.: "Артериальная гшастензия" (ред. чл.-корр. АМН СССР.В.А.Алмазов).- Ленинград, 1986.- С. 28-33. ...

■ J4'. Казеннов'A.M., Mac лова М.Н. Сравнительное исследование фу.; нкционирования На-насоса эритроцитов человека и крыси.при первичное артериальной гтергензиг// Тез.сообщ. IX Всесоюзного cone- • щания'по эволюционной физиологии,-Ленинград, Г906, ."Наука".-С.' НО,

15. Казеннов A.M., Мацкавич Ю.А. Ка,К-АТФаза и полшептпдний состав плазматической мембраны безъядерных эритроцитов // Тозисн сообщений ТЛ'Всесовзного совскания по эволюционной физиологии.-' Ленинград, "Наука", 1966.- С. НО.

16;.Kazennov Д..И., Proah&eka J., Paloucb. V., iTbt&dal В., Uaa-lova U.'jH. Traneport ATPaee in the erythrocytea of rats acclimatised to intermitten-altitude hypoxia // Phyaiologla Botiemoelove-oa.- 1986.- Vol. 35, Ы. 5.- P. 406-413.

17. Kazennov A.¡J., Maalova U.H., Ourevicft Y.S.. Bogrov Y.Ju., ahalabodov A.D. Sops propertiee of erythrocyte На -K -llPnae in eoeential hypertension // Olin.Kxp.Hypertension.- 1987.-Tol. А-9,- S. 7.- P. 12Z1r1232.

10. Казеннов A.M., Мао лова И .11, Активность jr, К-ЛТФааы в

эритроцитах спонтанно гипертонзивных крис п крио, акклиматизированных к шсогноП гипоксии // Тоз. до кладов Ж Воесоизного совещания по транспортным А?*>азаи.- Иркутск, 1907.- С. 122.

19. Маслова H.H., Рустамов Ф.А., Казенно в A.M. Сравнительная характеристика Ка,К-АТ5азн плазматических мембран оритроди-тов и клеток почек крис различных линий // Тез.докл. )П Всесоюзного совещания по транспортниц АТ^азам.- Иркутск, 1907.- С. 129.

2Г. Казеннов А.Н., Маслова М.Н. Структурно-биохимические свойства мембраны безъядерных эритроцитов // ^изшл.курн.СССР им. И.И.Сочоновва.- 1987 .-Т.73, ff 12.- С. 1507-1590.

21. Sergeava K.M., UaeLova M.lU, Kazenaov А.Ц., Smirnova Ji.li., Gorbijnova I.I.:, Bed cell 0а,К-АП'ввв activity in gloaeruloneph-ritie in children // Abstract of XXIst annual Нее ting of the European Society for peadiatrlc.- 1987.- £. гг.

22. Казенной A.'!., Маслова H.H. .•Русланов i.A., ТавровскаяТ.В. Возрастные изменения активности М а, К-АТФазы плазматической момб-

§аны клеток почки и эритроцитов у спонтанно гипертонзивных крис// нзиол.кури.СССР им. II.И,Сеченова.- I960,- Т. 74,К II.- С. 1536-16'й.

23. Рустамов i.A., Казеннов A.M., Маслова М.Н. Чувствительность на, 1С-ATS»азы к уабаину в эритроцитах и оетках почки у спонтанно гипертензивных крыс // Тез,докл. У0 Всесоюзной конференции по физиологии ночки и водно-солевого обмена. - Харьков, 19,89.-С. 164. . . '

24. Казеннов A.M., Маслова М.Н., Шалабодов А.Д. Участие белков цитосколета безъядерных эиггроцитов в функционировании транспортных АТ5аз // Тез.докл. Международного симпозиума "Транспорт ионов и механизмы его регуляции".-Тбилиси, 1909.- С. .

, 25. Казеннов A.M., Ульянова Т..П., Ганелина U.E., Гусев Т.П., Кручинина H.A.. Маслова М.Н. Ионный гомеостаз и деформируемость эритроцитов у больных с первичной артериальной гипертонзией // Кардиология.- 1990, »7.-6. 19-22.

26. Казеннов A.M., Маслова М.Н., Шалабодов А.Л. Роль белков мембранного скелета безъядерных эритроцитов в функционировании мембранных йепыентов // Доклада АН СССР.- 1990.- Т. 312,

if I.- С. 223-22б.-

27. Казеннов A.M., Маслова М.Н. Влияние мембранного скелета безъядерных эритроцитов на свойства транспортных АТ5аз // Цитология.- 1991, №11.- С.

РТП.Тип.BliP.Зак.026.Тир. 100. П.11.21.Беслдатно.