Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование фосфорилирования Na, К-АТФазы протеинкиназой А

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Муртазина, Диляра Ахметалимовна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

МУРТАЗИНА ДИЛЯРА АХМЕТАЛИМОВНА

УДК 577.152

ИССЛЕДОВАНИЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ^,К-АТФазы

ПРОТЕИНКИНАЗОЙ А

03.00.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель Старший научный сотрудник Кандидат биологических наук О. Д. ЛОПИНА

Москва - 1999 год

Содержание

Список сокращений..................................................................................................................4

Введение......................................................................................................................................5

Обзор литературы......................................................................................................................5

1. Общая характеристика К-АТФазы.............................................................................6

2. Структура Ма,К-АТФазы...................................................................................................7

2.1. Субъединичный состав фермента..................................................................................7

2.2. Структурная организация а-субъединицы...................................................................9

Первичная структура, изоформы..................................................................................9

Топография а-субъединицы.............................................................................................9

Структура цитоплазматического домена. Организация активного

центра Иа.К-АТФазы.....................................................................................................10

Структура катион-связывающих центров.................................................................12

2.3. Структурная организация Р-субъединицы..................................................................13

2.4. Четвертичная структура К-АТФазы......................................................................15

3. Механизм функционирования К-АТФазы...............................................................18

3.1. Общая характеристика реакции, катализируемой №,К-АТФазой...........................18

Субстратная специфичность Ыа,К-АТФазы..............................................................19

3.2. Частные реакции, обеспечиваемые №,К-АТФазой...................................................19

Окклюдированные катионы..........................................................................................21

Основные конформационные состояния Иа,К-АТФазы.............................................22

3.3. Модифицирующее действие АТФ на Ыа,К-АТФазу.................................................23

4. Механизмы регуляции активности ЫаД-АТФазы.......................................................24

4.1. Участие Ыа,К-АТФазы в осуществлении различных функций клеток

животных...............................................................................................................................24

4.2. Изоферменты Ыа,К-АТФазы и их свойства................................................................26

4.3. Регуляция активности 1Ма,К-АТФазы за счет взаимодействия с липидным бислоем мембраны.........................................................................................................................29

4.4. Долгосрочная регуляция активности ИаД-АТФазы.................................................30

Регуляция количества молекул Иа,К-АТФазы в клетке.............................................30

4.5. Краткосрочная регуляция активности Ыа,К-АТФазы...............................................33

Фосфорилирование Ма,К-АТФазы протеинкиназами.................................................33

4.6. Белки, взаимодействующие с ИаД-АТФазой............................................................36

Анкирин............................................................................................................................38

Взаимодействие анкирина с Ма,К-АТФазой................................................................39

Пектины и их влияние на активность Ыа,К-АТФазы................................................40

Мелиттин.......................................................................................................................41

Цель и задачи исследования..................................................................................................44

Материалы и методы...............................................................................................................45

Материалы.............................................................................................................................45

Получение имидазолъной формы АТФ.........................................................................45

I. Препаративные методы....................................................................................................45

1. Получение очищенного препарата Ыа, К-АТФазы из солевых желез утки.........45

2. Выделение каталитической субъединицы ПКА.....................................................47

Получение холофермента ПКА....................................................................................47

Получение каталитической субъединицы ПКА.........................................................48

3. Выделение анкирина из эритроцитов крупного рогатого скота.........................49

4. Получение фракции микросом Н,К-АТФазы из слизистой оболочки желудка кролика.......................................................................................................................50

П. Аналитические методы....................................................................................................51

1. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН-Иа. 51

2. Вестерн-блоттинг.....................................................................................................52

3. Иммунохимическая идентификация белков, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране..................................................................................53

4. Аффинная очистка моноклональных антител на протеинА-сефарозе...............53

5. Определение концентрации белка............................................................................53

6. Определение активности Nа,К-АТФазы...............................................................54

7. Определение активности каталитической субъединицы ПКА............................54

8. Фосфорилирование очищенного препарата N0, К-АТФазы из солевых желез утки под действием ПКА..............................................................................................55

9. Определение стехиометрии фосфорширования а-субъединицы Nа,К-АТФазы под действием ПКА........................................................................................................56

10. Авторадиография.....................................................................................................57

11. Включение флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ) в препараты Ыа,К- и Н,К-АТФазы............................................................................................................................57

12. Измерение флуоресценции ФИТЦ-меченых препаратов Ыа,К- и Н,К-АТФаз....58

13. Анализ фосфоаминокислот.....................................................................................58

14. Определение количества гидролизованной АТФ...................................................59

15. Кинетический анализ ингибирующего действия мелиттина..............................59

Результаты и их обсуждение..................................................................................................60

1. Фосфорилирование а-субъединицы К-АТФазы из солевых желез утки под действием ПКА...............................................................................................................60

2. Подбор условий для фосфорилирования активной Ка,К-АТФазыиз солевых желез

утки под действием ПКА...............................................................................................62

3. Анализ фосфоаминокислот при фосфорилировании Иа,К-АТФазы из солевых желез утки ПКА..............................................................................................................73

4. Влияние фосфорилирования №,К-АТФазы под действием ПКА на ее активность.75

5. Фосфорилирование Н,К-АТФазы из слизистой оболочки желудка кролика под действием ПКА...............................................................................................................79

6. Образование комплекса анкирин-№,К-АТФаза и его фосфорилирование под действием ПКА...............................................................................................................84

7. Взаимодействие мелиттина с Ыа,К-АТФазой...............................................................89

8. Влияние антител против (3-субъединицы и конканавалина А на фосфорилирование

Иа,К-АТФазы под действием ПКА..............................................................................94

Заключение................................................................................................................................98

Выводы.....................................................................................................................................102

Список литературы................................................................................................................103

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДФ - аденозиндифосфорная кислота АТФ - аденозинтрифосфорная кислота ГТФ - гуанозинтрифосфорная кислота ДАБ - 3,3' - диаминобензидин ДДС-Na - додецилсульфат натрия ДМФА - диметилформамид ДТТ - дитиотреитол кДа - килодальтон

кДНК - кодирующая дезоксирибонуклеиновая кислота Км - констатна Михаэлиса ЛДГ - лактатдегидрогеназа

НАДН - никотинамиддинуклеотид восстановленный

ПКА - цАМФ - зависимая протеинкиназа

ПКС - Са фосфолипид зависимая протеинкиназа

C12Eg - w-додециловый эфир октаэтиленгликоля

Трис - трис (гидроксиметил) метиламин

ТХУ - трихлоруксусная кислота

УТФ - уридинтрифосфорная кислота

ФЕП - фосфоенолпируват

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат

ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид

Фн - неорганический фосфат

ФСБТ - фосфатно-солевой буфер, содержащий Твин-20

цАМФ - циклический аденозин-3 ',5'-монофосфат

ЦТФ - цитидинтрифосфорная кислота

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭФ в ПААГ - электрофорез в полиакриламидном геле

CHAPS- 3-[(3-холамидопропил) диметиламмоний-]-1 -пропансульфонат

Ыа,К-АТФаза - Na,K

-активируемая, Mg -зависимая аденозинтрифосфогидролаза PIPES - пиперазин-М,К'-2-этансульфоновая кислота

ВВЕДЕНИЕ

Плазматическая мембрана клетки участвует в передаче сигналов, направленных от внешнего источника в клетку, из клетки в окружающую среду, а также внутри самой клетки. Это происходит в результате сложной работы многих белков, часть из которых пронизывает мембрану насквозь, другие лишь погружены в нее, а третьи ассоциированы с мембраной с помощью белок-белковых или белок-липидных взаимодействий.

Одним из интегральных белков плазматической мембраны является Na,K-АТФаза, обеспечивающая активный транспорт ионов Na+ и К+ против электрохимического градиента за счет энергии гидролиза АТФ. Ионные градиенты, создаваемые Ма,К-АТФазой, используются различными клетками для поддержания трансмембранного потенциала, формирования потенциала действия, регуляции клеточного объема, транспорта глюкозы и аминокислот, обратного транспорта нейромедиаторов в нервных окончаниях, а также для функционирования различных систем ионного обмена и котранспорта, обеспечивающих сопряженный с натрием перенос ионов (ТГ, Са2+, СГ). Таким образом, Na-Hacoc является важным звеном в регуляции функции клеток, влияя на которое, можно регулировать эти процессы.

Физиологическая регуляция активности №,К-АТФазы осуществляется различными способами. Кроме стероидных и тиреоидных гормонов, активирующих транскрипцию генов Na, К-АТФ азы, активность этого фермента в различных тканях существенно зависит от катехоламинов и других гормонов, влияющих на систему вторичных посредников (Bertorello, Katz, 1993; Ewarts, Klip, 1995). Имеется информация о том, что G-белки принимают непосредственное участие в передаче гормонального сигнала к №,К-АТФазе (Danilenko et al., 1990). Полученные в настоящее время экспериментальные данные свидетельствуют, что регуляция активности №,К-АТФазы может осуществляться за счет вовлечения этого фермента в классические пути передачи сигнала в клетке, а именно: за счет фосфорилирования протеинкиназами. Выяснение того, как фосфорилирование влияет на активность ЫаД-АТФазы, а также как оно зависит от действия различных эндогенных факторов

позволит представить, каким образом может регулироваться активность этого фермента, от которого зависит функциональная активность многих тканей.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Общая характеристика Na,K-AT<Da3bi.

Na,K-ATOa3a (Na,K-активируемая, Mg-зависимая аденозинтрифосфогидролаза, КФ 3.6.1.3) была впервые описана в 1957 году Йенсом Скоу (Skou, 1957), получившим за это открытие Нобелевскую премию. Фермент присутствует в плазматической мембране всех клеток животных, но содержание его в мембране и активность сильно варьируют в зависимости от типа ткани. Количество Na,K-АТФазы изменяется от нескольких сотен молекул на клетку (например, в эритроците может быть всего лишь 200-250 молекул №,К-АТФазы (Erdmann, Hasse, 1975) до нескольких тысяч молекул на квадратный микрометр мембраны (Jorgensen, 1982). В больших количествах этот фермент содержат ткани, осуществляющие выведение NaCl (наружный медуллярный слой почек млекопитающих, ректальные железы акулы, солевые железы морских птиц и ткани с высокой электрической активностью, например, электрические органы рыб) (Jorgensen, 1982). В меньших, но значительных количествах Ма,К-АТФаза присутствует в возбудимых тканях: в мозге, периферических нервах и мускулатуре различного типа. И, наконец, минимальная концентрация Na,К-АТФазы характерна для невозбудимых тканей.

№,К-АТФаза, или Na-Hacoc, поддерживает высокую концентрацию К+ и низкую концентрацию Na+ внутри клетки (Garrahan, Glynn, 1967), используя для транспорта ионов энергию, запасенную в терминальной фосфатной связи АТФ.

Фермент принадлежит к семейству ион-транспортирующих АТФаз Р-типа -гомологичных ферментов, обнаруженных как у эукариот, так и у прокариот, сходных между собой по структуре и механизму функционирования (Inesi, Kirley, 1992; Lutsenko, Kaplan, 1995; Moller et al., 1996). Эукариотические АТФазы животных включают кроме ЫаД-АТФазы, родственную ей Н,К-АТФазу, ответственную за секрецию Н1" в желудке и, по-видимому, реабсорбцию К+ в тонком кишечнике и собирательных трубочках почек, Са-АТФазы плазматических мембран и сарко(эндо)плазматического ретикулума (SERCA АТФазы), обеспечивающие

регуляцшо внутриклеточной концентрации Са (последние обнаружены также у растений). Кроме того, у растений и дрожжей имеется Н-АТФаза, участвующая в Независимом поглощении метаболитов. Представителями прокариотических АТФаз Р-типа являются Kdp-АТФаза Escherichia coli, обеспечивающая аккумуляцию К+ (Altendorf, Epstein, 1994), Mg -АТФаза Staphylococcus typhimurium, участвующая в выведении Mg2+ (Smith et al., 1993), Cd^-АТФаза (Silver et al., 1993) и Си+-АТФаза (Solioz et al., 1994), обнаруженные соответственно у Staphylococcus aureus, и Escherichia hirae и обеспечивающие поглощение этих катионов микроорганизмами. АТФазы, участвующие в аккумуляции некоторых тяжелых металлов, в частности, Си+, обнаружены также у человека, их дефицит приводит к развитию патологий (болезнь Вильсона, болезнь Менке) (Solioz et al., 1994).

Гидролиз АТФ АТФазами Р-типа происходит с образованием промежуточного фосфорилированного интермедиата ЕР, который возникает вследствие переноса терминального фосфорильного остатка АТФ на остаток аспарагиновой кислоты активного центра фермента (отсюда и название - АТФазы Р-типа). Кроме того, в процессе каталитического акта эти ферменты связывают, окклюдируют и транспортируют ионы, последовательно пребывая в двух основных конформациях Е1 и Е2, значительно отличающихся друг от друга (отсюда второе название этих ферментов - АТФазы Е1-Е2 типа).

2. Структура N а, К-АТФ азы.

2.1 Субъединичный состав фермента.

Ка,К-АТФаза в очищенном виде была получена в середине 70-х годов в виде мембранных фрагментов, содержащих два типа субъединиц (Jorgensen, 1974), которые получили название а- и Р-субъединиц фермента. а-Субъединица имеет молекулярную массу около 112 кДа, а р-субъединица представляет собой гликопротеид, и в зависимости от степени гликозилирования ее молекулярная масса в различных тканях составляет от 40 до 60 кДа. а-Субъединица №,К-АТФазы в процессе каталитического цикла подвергается фосфорилированию-дефосфорилированию, содержит участок связывания АТФ, участок связывания уабаина (строфантина G), специфического ингибитора фермента, и катион-связывающие центры (Pedemonte, Kaplan, 1990; Mercer, 1993; Lingrel, Kuntzweiler,

1994). В препаратах фермента два этих белка обнаруживаются в соотношении 1:1 (Liang, Winter, 1977; Craig, Kyte, 1980).

а-Субъединица способна полностью выполнять каталитическую функцию (Blanco et al., 1994). ß-Субъединица является существенным компонентом функциональной 1ч1а,К-АТФазы (McDonough et al., 1990; Blanco et al., 1994; Chow, Forte, 1995) она, по-видимому, вовлечена в окклюзию К+ (Lutsenko, Kaplan 1993). Хотя непосредственного участия в катализе эта субъединица не принимает, она влияет на транспортные функции фермента, изменяя сродство к ионам К+ и Na+ (McDonough et al., 1990; Blanco et al., 1994; Eakle et al., 1994; Hasler et al., 1998). ß-Субъединица №,К-АТФазы в клетках позвоночных может выполнять роль шаперона: она стабилизирует активный aß-комплекс и облегчает адресную доставку вновь синтезированной №,К-АТФазы из эндоплазматического ретикулума к мембране (Geering, 1990; McDonough et al., 1990; Noguchi et al., 1990; Chow, Forte, 1995; Shainskaya, Karlish, 1996; Beggah et al., 1997).

Присутствие в препаратах Na,K-ATOa3bi кроме а- и ß-субъединиц протеолипидного компонента с молекулярной массой 8-14 кДа, который называют у-субъединицей, было впервые обнаружено Форбушем (Forbush et al., 1978). Он показал, что у-субъединица ассоциирована с №,К-АТФазой как в очищенных препаратах, так и в микросомальной фракции. Установлено, что эта субъединица присутствует в препаратах фермента в количествах, эквимолярных количеству aß-димера (Reeves et al., 1980; Hardwicke, Freytag, 1981), и способна взаимодействовать с фотоактивными аналогами уабаина (Forbush et al, 1978; Lowndes et al., 1984). Другим указанием на то, что у-субъединица является компонентом ИаД-АТФазы, служит то, что она обнаруживается совместно с а-субъединицей фермента в сегментах нефронов и соосаждается с aß-комплексом (Mercer et al., 1993). Уровень экспрессии у-субъединицы определяется уровнем экспрессии aß-комплекса (Béguin, et al., 1997). В последнее время появились работы, в которых обсуждается возможная роль протеолипида в функционировании Ш,К-АТФазы: было показано, что при экспрессии у-субъединицы Ка,К-АТФазы человека в клетках ооцитов Xenopus laevis, она активирует ион-селективные каналы (Minor, et al., 1998). Но поскольку роль этого белкового компонента в обеспечении работы №,К-АТФазы недостаточно изучена, считают, что для обеспечения нормального функционирования этого

фермента достаточно двух больших субъединиц (Pedemonte, Kaplan, 1990; Me Donough et al., 1990).

2.2. Структурная организация а-субъединицы.

Первичная структура, изоформы. С использова�